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[硕士论文] 王超群
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:自噬是一个高度保守的生理过程,通过囊泡结构将细胞质内的组分进行隔离、包裹,进而与溶酶体融合降解。自噬作为细胞内一个主要的降解和回收途径,在个体发育过程和细胞稳态维持中都起到非常关键的作用。线粒体自噬是细胞内功能异常或者多余的线粒体通过自噬途径降解的过程,对于细胞内线粒体的质量控制发挥着重要作用。在细胞内线粒体主要通过产生ATP为细胞提供能量,但当线粒体受到损伤的时候,就会产生过多的压力信号,从而导致细胞损伤并且最终引起细胞程序性死亡的发生。因此,受损线粒体的识别和降解也是细胞体内稳态维持中非常重要的组成部分。
  干细胞具有自我更新和多向分化潜能,在疾病模型建立、细胞治疗修复、再生医学方面,有着广阔的应用前景。线粒体作为多能干细胞重要的细胞器,其质量控制和稳态维持对于多能性的影响还不是很清楚。这里我们研究了Pink1调控的线粒体自噬对多能性获得和多能性调控的影响。
  我们发现多能干细胞中将线粒体自噬介导蛋白Pink1敲除能够引起多能干细胞中线粒体数量会发生积累,线粒体的膜电势降低,ATP产量降低,而细胞中ROS的含量增加。这些结果表明,当多能干细胞中Pink1介导的线粒体自噬缺失后,会导致多能干细胞中功能异常的线粒体发生积累。进一步,我们发现当敲除Pink1后,多能干细胞的自我更新能力显著降低。通过实时荧光定量PCR检测多能性基因的表达情况后发现,Pink1的缺失会显著降低多能性基因的表达,并且体内分化形成的畸胎瘤体积和重量均较野生型的小。
  重编程过程中,我们发现Pink1敲减会导致细胞内线粒体不能有效清除,从而降低重编程效率。这些结果都表明了Pink1参与了多能性诱导和维持中的线粒体调控。
  使用Parkin基因敲除的MEF细胞进行体细胞重编程并未发现重编程中线粒体的累积和重编程效率的降低,这些结果表明Pink1并不是通过激活Parkin而调控重编程及胚胎干细胞多能性的。未来的工作我们将筛选Pink1下游作用分子,进一步阐明Pink调控多能性的分子机理。
[硕士论文] 任婧
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:绵羊是非常重要的经济型家畜,为人们提供肉、奶、皮毛等产品。运用卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)、体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)和胚胎移植(Embryo Transfer, ET)技术对优质家畜进行良种扩繁,能有效提高家畜生产力。卵母细胞的发育与成熟是这些技术的基础,因此,卵母细胞成熟的品质好坏直接影响子代能否成活及存活后代的健康状况。从卵母细胞成熟到早期胚胎发育的过程中,除内源性基因的表达调控作用之外,培养环境中的信号分子作用也影响其能否正常发育。通过旁分泌因子发挥调控作用是这种调控最常见、最直接的方式之一。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)、基质细胞衍生因子-1(Stromalcell-derived factor-1,SDF-1)、神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是卵巢旁分泌因子。研究发现CTGF能促进小鼠、大鼠卵泡发育,SDF-1能增加颗粒细胞存活和提高胚胎质量,NGF能以剂量依赖的方式增强山羊初级卵泡的体外生长,HGF能诱导牛的颗粒细胞增殖。但这四种旁分泌因子是否能够作用于绵羊卵母细胞,并提高卵母细胞体外成熟率、受精率和早期胚胎发育率,尚未做过充分研究。因此,我们利用绵羊卵母细胞作为实验材料,研究CTGF、SDF-1、NGF和HGF单独添加和组合添加对绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育的作用。
  本研究主要内容包括:⑴在绵羊卵母细胞成熟液中分别单独添加不同浓度梯度的CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子,统计绵羊卵母细胞成熟率,找到单独添加CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子的最佳浓度。接着将这四种因子组合添加到绵羊卵母细胞成熟液和早期胚胎发育液中,统计绵羊卵母细胞成熟率、卵子激活率和早期胚胎发育率。以卵丘扩散指数(cumulus expansion index,CEI)、细胞膜表面早期细胞凋亡信号和胚胎的囊胚细胞数作为评价卵母细胞成熟和早期胚胎发育潜能的指标,并且检测了凋亡基因Bax、Bcl-2、P53和PTGS2的基因表达量。⑵在四种旁分泌因子单独使用的实验中,添加30.0 ng/mLCTGF因子,10.0 ng/mL SDF-1因子,3.0 ng/mL NGF因子,100.0 ng/mL HGF因子能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育;在四种旁分泌因子组合使用的实验中,添加30.0 ng/mL CTGF+10.0ng/mL SDF-1+3.0 ng/mL NGF+100.0 ng/mL HGF时,卵母细胞成熟率、激活率以及早期胚胎各个时期的发育率都优于单独添加单一因子组和不添加因子组;组合因子对CEI、抑制卵子凋亡率和提高囊胚细胞数有显著作用;组合因子的使用能降低卵丘细胞、卵母细胞和囊胚细胞中凋亡基因的表达量。⑶旁分泌因子CTGF、SDF-1、NGF和HGF能促进卵母细胞成熟;四种因子组合使用能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎的发育。
[硕士论文] 张祥
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能。在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。胚胎合子基因组激活(zygotic geneactivation,ZGA)是早期胚胎正常发育的关键,研究认为ZGA的延迟或失败与早期胚胎发育阻滞有关。为探究ROS对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响,本研究比较了不同品种小鼠在不同培养液中发生阻滞的情况,检测了ZGA相关基因、胞质ROS浓度及ROS相关基因的表达;同时利用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵建立ROS引起阻滞的细胞模型,对线粒体机能相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态、mtDNA的拷贝数进行了检测;另外,检测了线粒体相关基因Grm2、Drd2、Polg2、TFAM的表达变化及其调节区的DNA甲基化的调节。
  本研究主要内容包括:⑴利用实时荧光定量PCR的方法检测了小鼠2-细胞胚胎中ZGA相关基因(Zscan4、MuERV-L、Eif-1a、Hsp70.1)及ROS相关基因(Nox1、Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达,并利用ROS特异性染料DCFH-DA对胚胎胞质内ROS水平进行检测。首先比较了阻滞品系小鼠KM与非阻滞品系小鼠BDF1受精卵在M16培养液中发生阻滞的情况,结果表明,在M16培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞发育率为44.2%,而BDF1小鼠受精卵的发育率为90.3%,KM小鼠2-细胞胚中ZGA相关基因MuER V-L、Eif-1a的表达量显著低于BDF1小鼠2-细胞胚(P<0.05)。KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平明显低于BDF1胚胎,ROS相关基因Gpx6和Prdx2的表达显著高于BDF1小鼠。以上研究表明,小鼠胚胎发育阻滞与ZGA相关基因表达有关,ROS水平的差异反映出不同品系小鼠胚胎对ROS的耐受性不同。⑵利用M16培养液和KSOM培养液比较了阻滞品系KM小鼠胚胎在不同培养液条件下的发育。结果显示,在KSOM培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞率为90.8%,不发生2-细胞阻滞。KSOM培养液中培养的KM小鼠2-细胞胚胎Eif-1a、Hsp70.1表达量显著高于M16培养液中培养的2-细胞胚胎。两种培养液中的KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平和ROS相关基因表达无明显差异。以上研究表明,小鼠胚胎体外培养液成分的不同影响ZGA相关基因表达的变化,对小鼠胚胎发育阻滞产生影响。⑶探究了ROS在小鼠体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响。使用AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理组和对照组中线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用实时荧光定量PCR检测ROS相关基因、线粒体相关基因(Grm2、Drd2、Polg2、TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数,利用重亚硫酸盐测序(BSP)检测了线粒体四个相关基因的甲基化变化。研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高。1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,实时荧光定量PCR结果显示,处理组与对照组的Grm2、Drd2、Polg2、TFAM基因表达量呈现显著性差异,处理组Grm2、Drd2表达显著低于对照组,处理组Polg2、TFAM表达显著高于对照组。利用亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing,BSP)方法检测DNA甲基化的结果,AAPH处理之后的胚胎中基因调节区DNA甲基化水平升高;Polg2、TFAM甲基化水平降低。以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体相关基因表达变化,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡,ROS可能通过影响线粒体相关基因启动子区DNA甲基化的变化调控线粒体相关基因的时序性表达。
[硕士论文] 吴雪臣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:从出生到青春期,作为雌性配子的卵母细胞一直停滞在第一次减数分裂的前期,又称生发泡(Germinal Vesicle,GV)期。只有在青春期后,受到激素刺激的卵母细胞才会发生生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD),进而开始恢复减数分裂,而只有恢复减数分裂并发育成熟的卵母细胞,才有可能与精子结合形成受精卵。哺乳动物卵母细胞中,磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)水平的变化引起的环腺苷酸(cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)水平的下降被认为是引起GVBD的主要原因。cAMP相关抑制剂如PDEs抑制剂和cAMP激活剂等,能可逆地抑制GVBD。
  本研究选用PDEs抑制剂Milrinone(Mil)、3-Isobutyl-1-Methylxanthine(IBMX)和cAMP激活剂Forskolin、dibutyryl cAMP(dbcAMP)四种药物分别进行单独或组合使用,以便于我们摸索出一套对卵母细胞成熟抑制效果最佳、对卵母细胞毒性最小的抑制剂配方。结果表明,在单独使用每种抑制剂的实验中,Mil,IBMX,Forskolin和dbcAMP能够达到抑制GVBD的最小浓度分别为3.0μM、30.0μM、450.0μM和150.0μM。为了进一步验证将各类抑制剂组合使用,能否获得更佳的配方,我们将不同种类和浓度的抑制剂进行组合,结果发现50.0μM Forskolin+0.3μM Mil,50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX,50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil,50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX四种组合能够获得更好的抑制GVBD效果。在此基础上,以不含任何抑制剂的培养液为对照组,含有不同种类抑制剂的培养液作为实验组,对卵母细胞的GVBD进程进行了检测,结果发现,含有抑制剂的实验组与对照组相比,GVBD进程不完全一致,但各组的最终GVBD率没有显著差异。比较了不同抑制剂对卵母细胞第一极体(First Polar Body, PB1)排放的影响,结果显示,三个实验组在PB1排放速率和最终排放率上与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μMdbcAMP+10.0μM IBMX;另有三个实验组只在最终PB1排放率上和对照组没有显著差异,包括:150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil。此外,我们比较了各组之间排放的PB1体积,结果发现,经50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μMIBMX或50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX三组处理过的卵母细胞所排放的PB1体积较小,并且与对照组没有显著差异。检测了抑制剂对卵母细胞早期凋亡、DNA损伤和线粒体分布的影响,结果发现,经五种抑制剂处理卵母细胞后,其早期凋亡率与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。经三种抑制剂处理卵母细胞后,其DNA损伤程度与对照组没有显著差异,包括:50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0.μM IBMX。在线粒体分布指标方面,只有50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX组与对照组没有显著差异。研究表明:不同种类抑制剂经过浓度调整和组合使用,可以更好的将卵母细胞阻滞在GV期,并且对卵母细胞的毒性作用最小。由此,我们摸索出了新一代最佳抑制剂组合,即50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。这一配方可为日后研究卵母细胞成熟机理提供有效帮助。
[博士论文] 江龙
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的性染色体是从祖先的常染色体进化而来,在整个进化过程中经历了复杂的变化。例如,X染色体上的基因数量在真兽亚纲哺乳动物中还有两次爆发性的增长。基因的转移和重新分配赋予了X染色体的特殊功能。大量研究表明起源于X染色体的逆转座基因在基因组中所占的比例远远高于起源于常染色体的比例,这类基因往往定位于常染色体并且具有睾丸特异表达的特点。科学家们也提出了一些基于进化选择的假说用于解释这种现象,包括性别对抗驱动X染色体失活假说以及减数分裂性染色体失活补偿假说等。然而,这些假说都缺乏直接的实验证据。尽管有几个X染色体起源的逆转座基因已被证实对精子发生至关重要,但这些基因与其前提基因的进化、表达及功能相关性仍未见报道。
  RPL10L是一个位于常染色体并在睾丸中特异表达的逆转座基因,它的前体是X染色体上一个核糖体蛋白编码基因RPL10,它的进化发生在真兽亚纲和后兽亚纲分支后不久的真兽亚纲哺乳动物中。我们选择RPL10L和RPL10作为模型,详细研究它们的表达模式、分子功能及作用方式,以期深入了解X染色体来源的逆转座基因存在的意义及其进化机制。
  首先,我们利用CRISPR/Cas9的方法制作了Rpl10l敲除小鼠,并发现雄性个体的精子发生障碍并且完全不育,具体表现为绝大多数精母细胞发育停滞在减数第一次分裂前期向中期的转换,没有减数分裂后的生殖细胞产生。其次,RPL10L蛋白特异地参与睾丸细胞中的核糖体组装,缺失它的粗线期及双线期精母细胞中的核糖体生成减弱并且大量蛋白的含量发生变化。再次,Rpl10在雌雄小鼠不同组织以及精子发生的精原细胞、前细线期精母细胞、细线期及偶线期精母细胞中广泛表达,但在粗线期及双线期精母细胞和圆形精细胞中的表达量急剧下降;有趣的是,Rpl10l在精子发生的粗线期及双线期精母细胞和圆形精细胞中特异地高表达。最后,RPL10敲低的细胞中核糖体生成受阻并伴随细胞周期停滞,RPL10敲除的细胞无法增殖和存活;而外源导入RPL10L表达载体能够补救RPL10敲除细胞的增殖和存活;更重要的是,Rpl10l启动子驱动的Rpl10转基因能够重建Rpl10l敲除小鼠的精子发生和生育力。综上所述,我们的研究证实Rpl10l能够补偿MSCI导致的Rpl10转录沉默以保证正常的精子发生,为基于MSCI的逆转座基因补偿假说提供了直接的实验证据,也为X染色体起源的逆转座基因的进化机制以及其在雄性生殖过程中的作用提供了新的理论依据和见解。
[博士论文] 王乐韵
生物学;发育生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:早期胚胎发育是一个精细而又严格的调控过程,在早期胚胎发育过程中涉及组蛋白修饰的变化、雌雄基因组互作,甲基化的调控与变化等。研究早期胚胎发育机制对发育生物学以及生殖生物学乃至再生医学都具有深远的意义,因此早期胚胎发育一直都是人们研究的热点。因为早期胚胎材料的特殊性,因此人们对于早期胚胎发育的研究是长久以来的难点,缺乏一种良好的研究工具。
  单倍体胚胎干细胞(haESCs)是近年来兴起的一种新型的胚胎干细胞。其特点是只含有一套染色体组,并且拥有正常胚胎干细胞的特性,具有体外无限增殖以及分化的能力。单倍体胚胎干细胞分为孤雌单倍体胚胎干细胞和孤雄单倍体胚胎干细胞,由于其单倍体来源的多样性,因此其成为可以模拟单套雌雄基因组的良好细胞系。同时其多能性以及体外无限增殖的特点,为其在体外进行基因操作提供了很多有利的条件,为基因功能研究提供了一种良好的工具。同时,单倍体胚胎干细胞系的建立为研究动物遗传修饰以及改造提供了新的渠道。
  从精子与卵母细胞结合形成受精卵,在整个早期胚胎发育过程中雌雄基因组互作以及表观修饰变化一直处于动态变化之中。但对其基因组互作以及表观修饰的研究由于早期胚胎操作的难度很高,缺乏有效的研究手段。单倍体胚胎干细胞为这种雌雄基因组互作提供了一种新的研究手段。
  基因组印记的变化是整个生命过程中最重要的生物学现象之一。印记基因是个体发育的重要保证,对于印记基因的研究由于其材料的特殊性难于收集,也造成了印记基因的研究方式单一,且研究困难。单倍体胚胎干细胞便于基因操作,因此成为研究印记基因的良好素材。
  本研究通过孤雌激活的方法获得孤雌单倍体胚胎干细胞,同时利用精子克隆的办法获得孤雄单倍体胚胎干细胞,随后对孤雌和孤雄胚胎干细胞进行检测,发现其具有正常的单倍体核型,同时也具有正常的胚胎干细胞的多能性特征。随后我们利用孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞作为工具进行早期胚胎发育的研究。
  首先,利用孤雌孤雄单倍体胚胎干细胞进行细胞融合,进行四倍体补偿实验,来研究早期胚胎囊胚期前雌雄基因组互作对动物到期发育是否必要。成功地获得了孤雌与孤雄融合的胚胎干细胞细胞系。该细胞系具备正常二倍体核型,同时其具有体外分化成三胚层以及二倍体种系嵌合的能力,证明其具备正常的ES细胞的多能性。最后利用四倍体补偿实验,获得四倍体到期小鼠,该实验是细胞多能性最高级别验证的黄金标准,同时该实验也证明了在囊胚期前,雌雄基因组互作对动物到期发育不是必需的。
  其次,发现孤雌单倍体胚胎干细胞具有随着细胞代次增高DNA甲基化修饰不断降低的特性,尤其是其印记调控区也存在这样的现象,同时孤雌单倍体胚胎干细胞胞质注射小鼠由于印记异常等原因只能发育到E13.5天。孤雌单倍体胚胎干细胞的这些特性为印记基因的功能性研究提供了一种良好的工具,通过对孤雌单倍体胚胎干细胞不同印记区域进行修饰,来进行印记对早期胚胎发育的影响。通过对IGDMR的印记DMR区域的同源打靶获得了IGDMR区域基因沉默的孤雌单倍体胚胎干细胞,该细胞支持动物到期发育,但影响其成活。随后,在IGDMR区域修饰的基础上,对H19区域进行同源重组,通过对H19转录起始位点上游-4kb到+1kb以及-10kb到+4kb区域敲除我们发现,在IGDMR/△5kbH19敲除的单倍体胚胎干细胞胞质注射后不能获得到期成活的小鼠,但IGDMR/△15kbH19敲除的单倍体胚胎干细胞胞质注射不仅动物到期率有所提高而且动物可以成活到成年,但是其体重及行为学与野生型相比依旧有所异常。最后,我们通过在IGDMR/△15kbH19敲除的单倍体胚胎干细胞的基础上进行IGF2过表达形成IGDMR/△15kbH19/IGF2细胞系进行胞质注射,该策略使得到期小鼠的行为学旷场试验的运动能力有所改善,但仍未改善完全。
  本研究通过构建单倍体胚胎干细胞这种独特的新型细胞类型用来研究早期胚胎发育过程中基因组互作以及印记调控等现象。不仅仅回答了早期胚胎发育中一些难以研究的问题,同时为早期胚胎发育的研究提供了一种新的思路。单倍体胚胎干细胞在线粒体模型制备、异种基因组互作以及生殖生物学领域将发挥其他重要的作用。
[硕士论文] 翁雷
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:X染色体失活是雌性哺乳动物早期胚胎发育的重要事件,而非编码基因Xist是X染色体失活的关键调控因子。Xist RNA通过包被即将失活的X染色体并使其发生沉默。而在分化细胞的重编程过程中,失活的X染色体伴随着Xist的下调而发生重活化,在ESC中,多能性因子(如NANOG,SOX2和OCT4等)结合到Xist基因的第一内含子区,以稳定ESC的多能性状态。但有研究报道,Xist的表达不会因为敲除第一内含子而受到影响,也不能提高诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的制备效率。而结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物的抑制性体外转录因子(Transcriptional-activator-likeeffectors based designer Transcription Factors, Tale-dTFs)Repressor6(以下称R6)显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)向iPSC的诱导效率。本研究利用Xist抑制性Tale-dTF R6成功制备了R6-MEF细胞系,并通过细胞生长曲线制备、免疫荧光染色、实时定量PCR及流式细胞仪筛选分析等技术手段,证明了该R6-MEF细胞系具有不同于野生型MEF细胞系的特点。
  本研究主要内容包括:⑴利用脂质体转染法制备的R6-MEF细胞形态类似于低代次的野生型MEF细胞系,呈短梭状,而生长速率明显高于野生型MEF细胞系;R6-MEF细胞系可传至50代以上,且未见明显异常。⑵实时定量PCR结果显示,R6-MEF中的多能性基因Nanog、Sox2、Oct4及生殖相关基因Prdm14均有不同程度的上调;但R6-MEF中NANOG的免疫荧光染色结果呈阴性;而雌性R6-MEF中H3K27me3的免疫荧光染色结果显示,R6在一定程度上降低了该表观遗传修饰的印迹水平。⑶流式细胞分选结果显示,野生型MEF细胞系中的GOF-GFP呈阴性,而R6-MEF细胞系中的GOF-GFP呈弱阳性。⑷核型分析结果显示,R6-MEF细胞与野生型小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的染色体均为40条,未见明显异常。
[博士论文] 刘文博
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:精子发生是一个非常动态和复杂的过程,主要经历三个阶段:精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形,最终产生单倍体长形精子。精子发生的每个阶段都需要基因表达的精确调控。可变剪接作为非常重要的基因转录后调控方式,极大的增加了高等真核生物和复杂器官中转录和翻译产物的多样性。大量研究数据显示可变剪接调控了精子发生相关基因的表达和功能;此外,很多剪接因子在睾丸中呈现细胞或发育阶段特异性表达模式,这都说明可变剪接可能在精子发生过程中发挥着重要的调控功能。BCAS2(breast carcinoma amplifiedsequence2)是Prp19相关复合体的核心组分,参与了前体RNA的剪接等重要生命活动。我们前期的研究发现BCAS2在雄性生殖细胞中具有特异性表达模式。本课题采用精原干细胞特异性敲除BCAS2的小鼠模型,研究BCAS2是否参与精子发生过程中的剪接。
  通过对BCAS2在睾丸发育过程中的免疫染色观察和生精细胞的富集,发现BCAS2在小鼠睾丸的精原干细胞中相对高表达。Vasa-Cre介导生殖细胞特异性敲除BCAS2的雄性小鼠生长正常,具有正常的交配行为,但不能生育后代;进一步检测发现,BCAS2缺失导致精子发生明显异常,表现为减数第一次分裂前期的生殖细胞数目明显下调,并且基本观察不到减数分裂的关键事件(重组和联会)。通过对精原干细胞的数量、定位、增殖和凋亡进行染色和统计发现,BCAS2缺失的睾丸中精原干细胞发育基本正常,但减数第一次分裂前期的精母细胞大量缺失,减数分裂启动的关键因子STRA8的表达也明显下调,说明BCAS2缺失的睾丸无法正常启动减数分裂。为了进一步解析BCAS2的作用机制,我们对出生后第9天(P9)的正常和BCAS2敲除的小鼠睾丸进行了RNA深度测序分析。结果发现BCAS2缺失的睾丸转录组水平的基因表达基本正常。但是作为剪接目标基因tubulin的表达明显变化,提示BCAS2可能通过剪接发挥功能。为了研究BCAS2在pre-mRNA剪接方面的功能,我们进一步研究了BCAS2缺失睾丸中的可变剪接的变化。结果显示,在BCAS2缺失的睾丸中有245个基因的可变剪接发生了异常,其中包括6个在精子发生中具有重要功能的基因(Dazl、Ehmt2、Hmga1、Cit、Hsf1和Bcl2l11)。利用半定量RT-PCR和real-time RT-PCR,我们成功验证出Dazl、Ehmt2和Hmga1的可变剪接异常。此外,BCAS2的缺失会导致“减数分裂促进因子”DAZL不同转录本的表达异常:全长形式的转录本显著性下调,而缺失8号外显子的转录本表达量明显上升。而且DAZL蛋白总体的表达量明显下调。
  总之,本研究证明了BCAS2参与小鼠精原干细胞中的可变剪接,并对减数分裂启动和雄性生育力的维持至关重要。该研究首次揭示了可变剪接在精子发生过程中调控减数分裂启动这一重要事件,为研究哺乳动物减数分裂启动提供了新的思路,并为可变剪接的生理功能研究提供了重要理论依据。
[硕士论文] 栗前
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:本文对小鼠胚胎心脏房室管发育及Lef1的表达规律进行了研究,本研究分为两个部分:
  第一部分:小鼠胚胎心脏房室管发育及Lef1的表达规律。
  目的:探讨小鼠胚胎心脏房室管分隔、重塑过程以及Le f1在房室管发育过程中的表达规律。
  方法:25只胚龄10~15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片,用抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱa单克隆抗体(MLC2a)、抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱ多克隆抗体(MLC-2)、抗Tbx3多克隆抗体(Tb x3)、抗淋巴增强因子1单克隆抗体(Le f1)进行免疫组织化学染色和免疫荧光化学染色。
  结果:胚龄10~15d,房室管心肌呈MLC2a阳性、MLC-2阴性,同时表达Tbx3、Le f1。胚龄10d,心内膜垫形成。胚龄11~12d,房室管心内膜垫内细胞 Le f1强表达,心外膜形成。胚龄12~13d,背腹侧房室管心内膜垫相互靠近且融合形成房室瓣,心外膜来源间充质细胞数量增加,部分表达 Le f1。胚龄13d开始,部分心外膜来源间充质细胞穿过心肌延伸入壁侧房室瓣。胚龄15d,房室瓣膜基部直接与MLC2a阳性的房室管心肌相连。
  结论:小鼠胚胎房室管心肌发育为成体心脏房室环瓣膜基部的心肌;在小鼠胚胎心内膜垫融合、房室瓣形成过程中,Le f1在心肌和心外膜来源间充质细胞均有表达。
  第二部分:转录因子Tbx3与小鼠胚胎第二生心区发育。
  目的:探讨转录因子Tbx3在小鼠胚胎SHF的时空表达模式及其对SHF的调节作用。
  方法:30只胚龄9~15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片,用抗胰岛素增强子结合蛋白1多克隆抗体(isl1)、抗心肌肌球蛋白重链单克隆抗体(MHC)、抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱa单克隆抗体(MLC2a)、抗 Tbx3多克隆抗体(Tbx3)进行免疫组织化学染色和免疫荧光化学染色。
  结果:胚龄10~12d,咽腹侧间充质细胞is l1阳性表达逐渐增多,此期Tb x3的表达在咽腹侧内胚层减弱,在邻近腹侧内胚层的间充质细胞逐渐开始表达。胚龄9~11d,咽腹侧间充质is l1阳性细胞经动脉囊壁、心包腔背侧壁延续至流出道远端壁,Tb x3在这些部位均呈阴性。而流出道远端壁 M HC呈弱阳性表达。在静脉端,咽腹侧的is l1阳性细胞经心背系膜延伸至DMP内,DMP内可见Tb x3散在表达。胚龄12~13d,SHF is l1呈阳性表达的细胞在动脉端延伸进入分隔后的动脉壁,该部位缺乏 Tbx3表达;在静脉端,DMP逐渐开始心肌化,同时可见Tb x3阳性细胞分布。胚龄15d,DMP心肌化完成,Tb x3阳性细胞与室间隔顶部的房室束的阳性细胞相延续。
  结论:Tbx3并未对 SHF前体细胞的迁移与分化进行直接的调节,但可能对其存在与增殖具有调节作用,且在 pSHF的调节作用与动脉端SHF不同。
[硕士论文] 张泽前
养殖 延边大学 2017(学位年度)
摘要:硫辛酸在医学界被成为万能抗氧化剂,有研究表明,硫辛酸可以清除小鼠肾脏内的活性氧,硫辛酸的抗氧化作用已在体细胞培养上得到证实,但在小鼠胚胎体外发育上还没有相关的研究。
  本实验的目的:1.筛选出硫辛酸体外培养的最佳浓度。2通过H2O2建立氧化损伤模型,对氧化损伤胚胎探讨硫辛酸对于相关抗氧化酶表达的影响。结果表明:
  1.各处理组2-细胞率无明显差异性(P>0.05),1.25uM处理组的发育率是最好的,其中8-细胞率和囊胚率均显著高于对照组(P<0.05)。
  2.氧化损伤胚胎内CAT、Cu-Zn SOD、Prx1、Prx3的mRNA表达水平明显降低(P<0.05),但Prx5的mRNA表达水平明显升高(P<0.05);当氧化损伤胚胎经硫辛酸处理以后,CAT、Mn SOD、GPX-4、Prx1的mRNA表达水平明显上升(P<0.05),但Prx5明显下降(P<0.05),Cu-Zn SOD无明显变化(P>0.05)。
  结论:1.1.25μ M硫辛酸为小鼠体外培养的最适宜浓度。2.在H2O2氧化损伤胚胎中,硫辛酸可以提升特定抗氧化酶的mRNA的表达量。
[硕士论文] 葛磊
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:亚硝酸钠是一种工业化学制剂,常被作为食品添加剂用于肉制品的防腐,增加与保持色泽度。同时,许多地区地下水中亚硝酸盐与硝酸盐含量超标从而导致人们过量摄入。许多研究表明,摄入大剂量亚硝酸钠会增加癌症风险、导致高铁血红蛋白症、氧化应激甚至死亡。然而,亚硝酸盐对女性生育力或胎儿发育影响研究甚少。
  本研究以5周龄的ICR品系雌性小鼠为实验对象,探究亚硝酸钠对雌性小鼠生殖力的影响。实验分为三组连续灌胃21天,分别为:不含有亚硝酸钠的生理盐水作为对照组,低剂量亚硝酸钠组60 mg/kg/天,高剂量亚硝酸钠组120 mg/kg/天。我们检测了灌胃后小鼠卵母细胞形态、纺锤体染色体复合体动力学、线粒体分布、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平、细胞早期凋亡、DNA损伤、组蛋白H3K4me2与H3K9me3修饰、活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、产仔情况。实验结果表明,亚硝酸钠导致GV期与MⅡ期卵母细胞数量减少,并抑制卵母细胞极体的排出,增加GV期卵母细胞透明带厚度。同时,亚硝酸钠引发了MⅡ期卵母细胞纺锤体紊乱、线粒体分布异常、ATP水平降低、ROS水平升高、组蛋白H3K4me2甲基化水平上升、早期细胞凋亡增加和DNA损伤,更重要的是,亚硝酸钠的灌胃使雌性小鼠产仔数明显减少。综合上述实验结果,我们认为亚硝酸钠影响雌性小鼠的生殖机能,造成生殖毒性。这些数据为日后亚硝酸盐在食品和其他工业生产中的应用所引起的人类生殖障碍提供了理论基础。
[硕士论文] 付贺
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:角蛋白是一种外胚层结构蛋白,是硬蛋白家族成员之一。据报道,角蛋白对生殖过程特别是对早期胚胎发育起着至关重要的作用,被作为滋养层上皮细胞的标记物。目前有关角蛋白的研究甚少,已知的角蛋白主要在表皮细胞以及简单上皮细胞中表达,具有高度的上皮细胞类型和组织分化的特异性。其中细胞角蛋白18(KRT18)属于Ⅰ型(等电点为4.9-5.4)酸性角蛋白,不仅在稳定细胞结构、形态以及细胞的完整性与功能性方面有着重要的作用,而且在细胞周期、胞内信号通路、细胞凋亡、有丝分裂、早期胚胎着床等细胞内生理过程中也发挥着重要的作用。
  本研究针对牛角蛋白18(KRT18)基因设计并构建了CRISPR/Cas9表达载体,称为Cas9/gRNA。实验选用的质粒载体具有新霉素抗性基因(Neor),通过对基础框架载体进行去除CAG启动子的改造(命名为pGlrkt-2)和KRT18基因5'及3'同源臂的插入,构建了针对CRISPR/Cas9切割位点的同源打靶载体,并命名为pKlrkt.其外源基因为人源化的EGFP,在EGFP上游包含长995bp的5'同源臂,在pKlrkt表达框架下游包含长946bp的3'同源臂。经限制性酶切片段分析及序列测定分析的结果表明,所构建载体含有正确的KRT18同源片段和EGFP基因。通过脂质体转染的方法将构建的载体转入牛子宫上皮细胞中,可以观察到绿色荧光蛋白的表达,由此可确定,pKlrkt载体可指导GFP的正常表达。为了获得GFP基因在KRT18基因位点定点整合的细胞系,通过电转染的方法将CRISPR/Cas9、pKlrkt同时导入到牛胎儿成纤维细胞中,经过G418筛选,流式分选及人工挑取获得的单克隆细胞株共计47株,其中经跨臂PCR扩增鉴定确定有3株单克隆细胞为GFP基因定点整合细胞,打靶效率为6%,所获的细胞对进一步研究KRT18在牛早期胚胎发育过程中的作用具有重要意义。
[硕士论文] 关利南
应用数学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:沿着脊椎动物胚胎的前后轴连续形成的周期模式称为体节发生,它是胚胎发育过程中节段性模式过程的显著例子,同时也是发育生物学中一个主要的悬而未解的问题.在本文中,我们主要研究一个可以解释胚胎中体节模式形成过程的二维模型.这一模型既可以探索体节发生的设计空间,也可以解释体节发生过程中之前模型不能解释的许多方面.我们首先应用Hopf分岔定理、中心极限定理等来研究其在没有扩散发生时的动力学行为,然后运用平衡点的线性稳定性分析得出扩散发生时Hopf分岔、图灵分岔、以及不稳定振荡边界发生的条件,同时运用弱非线性多尺度分析和泰勒展开,得出固定模式的振幅方程.通过分析振幅方程,我们了解到系统具有复杂动力学特征,会产生点状斑图,条状斑图,点状和条状混合的斑图,迷宫斑图等.最后,我们进行数值模拟,来验证我们理论分析的正确性.由于体节发生在生物发育过程中占据重要位置,而且也可作为研究胚胎发育中斑图形成的模式过程,所以我们的研究对胚胎发育、基因表达、细胞分化等过程有极大帮助.更重要的是,它对研究与骨骼相关的先天性疾病有很大帮助.所以,通过研究模式生物学获得的相关知识对人类疾病的诊断和治疗具有重要指导意义.
[硕士论文] 荆婷
海洋生物学 辽宁师范大学 2017(学位年度)
摘要:糖原合成酶激酶3β(glycogen synthesis kinase3β,GSK3β)是一种CMGC家族的古老的多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶。GSK3β在细胞代谢调节,细胞存活和胚胎发育过程中作为PI3K/AKT和Wnt信号通路的效应分子起这作用。中国卤虫在经历高盐或低温等不良环境时,会产生滞育卵,进入胚胎滞育过程,当遇到某种特定条件滞育又会终止。GSK3β在中国卤虫滞育终止和胚胎发育中的作用还是未知的。
  在本研究中,我们获得了As-gsk3β的cDNA全长,为1801bp,共编码422个氨基酸。原位杂交实验结果显示As-gsk3β在中国卤虫身体各部分都有表达,表达没有组织特异性。尽管Real-time qPCR的实验结果显示As-gsk3βmRNA水平在发育到3天时有显著的增加,但是蛋白印迹实验结果显示As-GSK3β蛋白的表达量在不同发育阶段没有明显的变化。特别令人关注的是,As-GSK3β-Ser9p蛋白的表达水平在不同发育时期显示出显著不同。揭示As-GSK3β可能通过磷酸化丝氨酸9位点来调节并参与胚胎发育。中国卤虫海藻糖酶的表达模式可能和胚胎发育中海藻糖含量和糖原合成的变化相对应。As-GSK3β-Ser9p,As-GSK3ɑ-Ser21p和As-TREH表达的下调可能促进卤虫在高盐或低温条件下的存活。并且,As-GSK3β-Ser9p在5℃条件下表达增加可能会导致中国卤虫促存活机制的启动。总之,在中国卤虫早期胚胎发育,低温或高盐胁迫中,As-GSK3β和As-TREH相关蛋白表达水平的结果显示这些蛋白可能在糖原代谢调节、抗逆以及胚胎重启动发育过程起着重要作用。
[硕士论文] 张爽
海洋生物学 辽宁师范大学 2017(学位年度)
摘要:细胞凋亡抑制因子5(apoptosisi inhibitor5,API5),具有显著的抗凋亡功能。本研究在中国卤虫API5现有研究成果的基础上,对As-API5的基因全长序列进行了更加深入的生物信息学分析,发现其理论PI为9.24,As-API5蛋白为无信号肽结构的亲水性非分泌蛋白,磷酸化位点预测As-API5可能含有27个磷酸化位点,20个丝氨酸位点,4个苏氨酸位点及3个酪氨酸位点。通过原位杂交技术方法发现As-api5 RNA探针信号在中国卤虫各发育时期的不同部位均可被检测到,说明此基因表达部位广泛,没有组织、器官的特异性表达。利用小RNA干扰技术,敲低了As-api5的mRNA表达水平后,卤虫胚胎出现了发育缓慢、畸形等非正常状况。通过原核表达技术,发现API5以包涵体的形式存在的。将纯化后的蛋白利用免疫印迹技术对其相对表达量进行检测,发现在胚胎滞育解除后(0h-10h),细胞的分化和增殖活动旺盛,As-API5蛋白的相对表达量整体呈现出上调的趋势,在发育后期(15h-3d),随着卤虫破壳,生命体征逐渐处于平稳时期,As-API5蛋白的相对表达量开始下调,最终维持在趋于平稳的水平。研究中还发现随着卤虫胚胎发育的持续进行,相关周期蛋白As-E2F1、As-CyclinE、As-CyclinA和As-CDK2及凋亡相关蛋白As-APAF1、As-Caspase9的相对表达量也表现出了相类似的表达趋势。而在高盐和低温的胁迫下,As-API5的相对表达量均呈现出显著上调的趋势,在同等试验条件下,周期调控转录因子As-E2F1及凋亡调控蛋白As-APAF1、As-Caspase9同样表现出了相类似的表达趋势。因此,研究结果表明API5在中国卤虫滞育胚胎重启动的过程中发挥着十分重要的作用,尤其是在调控细胞周期和抑制细胞凋亡方面。通过相对表达量的变化间接的调控细胞周期,从而保证了细胞增殖与凋亡之间的平衡性,更好的抵抗外界不良的生存环境。
[硕士论文] 徐帅
生物化学与分子生物学 浙江工业大学 2017(学位年度)
摘要:动物胚胎期更容易受到环境毒素如有机磷农药的影响,为探讨这一问题,我们在小鼠胚胎期E7.5~11.5暴露有机磷农药毒死蜱(chlorpyrifos,CPF),用药剂量为0,1,5mg/kg/day,创建胚胎早期染毒模型。对染毒鼠的性别和脑内乙酰胆碱酯酶活力进行测定;对重要的认知行为中枢海马脑区的神经元与胶质细胞进行统计,测定时间选取为E12、E15和E18三天;通过连续组织切片与计算机三维重构方法对海马脑区的立体形态进行重塑。
  研究结果表明:在胚胎早期E7.5~11.5天暴露CPF,在两种CPF处理剂量下的胚胎脑胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)活力受到了一定的影响。在E12天,1mg/kg与5mg/kg CPF处理后雌性胚胎脑AChE分别降至对照组的77.88±6.55%(p<0.05)和62.95±6.45%(p<0.05);雄性胚胎脑AChE降至对照组的80.48±6.85%(p<0.05)和66.52±5.96%(p<0.05),5mg/kg CPF暴露毒性作用明显强于1mg/kg组,但两种性别之间无明显统计学差异(p>0.05)。在E15天,1mg/kg与5mg/kg CPF处理后雌性胚胎脑AChE降至对照组的87.10±8.70%(p>0.05)和78.00±5.69%(p>0.05);雄性胚胎脑AChE活力分别降至对照组的87.10±8.70%(p>0.05)和78.00±5.69%(p>0.05),两种性别之间无明显统计学差异(p>0.05)。在E18天,1mg/kg与5mg/kg CPF处理后雌性胚胎脑AChE为对照组的99.79±13.78%(p>0.05)和85.46±9.03%(p>0.05);雄性胚胎脑AChE为对照组的95.06±23.31%(p>0.05)和87.73±8.56%(p>0.05),两种性别之间无明显统计学差异(p>0.05)。即胚胎期暴露毒死蜱造成脑AChE活力抑制,这种抑制作用随时间延伸可以恢复,在胚胎脑这种毒性作用没有性别差异。
  对胚胎脑海马神经元和胶质细胞数量的研究结果发现,1mg/kgCPF暴露,造成E12天海马原基胶质细胞(p<0.05)和神经元数量(p<0.05)均有降低;E15天海马CA1的胶质细胞(p<0.05)和神经元(p<0.05)均有降低,CA3的胶质细胞降低(p<0.05)而神经元无明显统计学差异(p>0.05);E18天,海马CA1、CA3和DG区胶质细胞(p>0.05)和神经元(p>0.05)数量均无统计学差异。5mg/kg CPF暴露,使E12天海马原基胶质细胞(p<0.05)和神经元数量(p<0.001)明显减少;在E15天,海马CA1和CA3区胶质细胞(p<0.01)和神经元(p<0.01)数量明显减少。在E18天,海马CA1、CA3和DG区胶质细胞(p<0.05)和神经元数量(p<0.05)仍有减少。
  对E18脑海马区域进行连续切片,经3D-doctor软件处理,重构出三维立体脑结构。数据分析表明,Control组海马和截面coronal7-coronal19体积分别为0.36.μm3和5.31μm3,CPF组海马和截面coronal7-coronal19体积分别为0.35μm3和5.24μm3。
  综合研究结果表明,(1)CPF造成的胆碱酯酶活力抑制有一定的可恢复性;(2)CPF的毒性作用无明显胚胎性别间的差异;(3)CPF对胚胎海马的胶质细胞和神经元数量均有抑制作用,这种作用可持续至已停止染毒的E18天;(4)CPF处理下,海马宏观结构没有明显影响。
[硕士论文] 毕雪薇
生物学 哈尔滨工业大学 2016(学位年度)
摘要:LncRNA是指长度大于200bp的无蛋白编码能力的RNA分子,与编码基因有着相似的结构,且存在着转录后的剪接现象。LncRNA的时空特异性表达说明此类RNA与多种生命活动相关,并且其功能往往通过调控其他已知基因的表达来实现,目前主要通过基因敲除或过表达研究LncRNA的功能。
  本课题基于RNA-seq数据预测的与小鼠胚胎生长发育相关的长非编码RNA,并对其存在进行初步的验证分析,然后选取表达量相对较高的Lnc-H13作为最终研究对象。Lnc-H13位于小鼠2号染色体上,生物信息学预测全长7122bp,只含有一个外显子区。Hic数据表明,Lnc-H13作用于Mcts2和H13。因此,本课题分析了Lnc-H13基因在小鼠胚期的表达模式并对其功能进行了初步的探究。
  首先,采用qRT-PCR及原位杂交技术分析了Lnc-H13在小鼠胚胎时期的定量及定位情况。结果显示,在全胚胎中Lnc-H13的表达水平随着胚胎的发育逐渐升高,并在E15.5天达到表达量的峰值。E10.5天全胚胎原位杂交结果显示,Lnc-H13对胚胎发育早期的神经系统的形成有着紧密的联系,E12.5天胚胎切片原位杂交显示Lnc-H13表达于脑组织和肺脏中。随着胚胎发育至中期,Lnc-H13广泛表达于脑、舌、心、肺、肾等重要组织器官。基于Lnc-H13持续高表达于脑组织这一结果,我们对胚胎时期小鼠脑不同发育阶段中Lnc-H13的表达进行了定量分析,结果显示,随着胚胎的发育Lnc-H13在脑中的表达量呈现先升高后降低的形式,并在小鼠出生前有了轻微的波动,基于此现象,我们对在出生后小鼠脑中的定位情况进行了分析,结果显示,Lnc-H13基因普遍表达于P0、P10和P30脑组织中的嗅球和小脑部位。综合上述结果,我们可以得出结论:Lnc-H13基因参与了小鼠胚胎的发育过程,并且对神经系统功能的发育有着重要的作用。最后,在NIH3T3细胞中我们采用CRISPR/Cas9技术敲除Lnc-H13基因后,检测到当Lnc-H13基因显著下调时,靶基因表达水平没有发生统计学意义上的变化。
  综上所述,本研究分析了Lnc-H13基因在小鼠胚胎中的表达情况并对Lnc-H13在小鼠出生后脑中的定位和调控功能进行了初步的探究。
[硕士论文] 刘柏岐
生物学 哈尔滨工业大学 2016(学位年度)
摘要:LncRNAs是近年来发现的一类在生物体中普遍存在的,对生物体生长发育有重要调控作用的RNA分子,其不具有翻译成蛋白质的功能,以RNA分子的形式参与基因表达调控。随着高通量测序技术的不断进步,越来越多的LncRNAs被发现,但其功能注释还有待进一步研究。
  利用已有的RNA-Seq数据,预测得到了一个位于小鼠2号染色体上,在小鼠胚胎脑中特异表达的LncRNA-Scrt2。半定量验证LncRNA-Scrt2确实在小鼠胚胎E15.5天的脑中表达。利用3’和5’RACE扩增得到了LncRNA-Scrt2长度为1582bp的转录本序列。随后利用获得的基因序列对预测的LncRNA-Scrt2进行进一步LncRNA的证明,利用ORF Finder查找转录本中ORF的长度,所有ORF都小于300bp,说明LncRNA-Scrt2不具有编码能力;利用细胞RNAFish定位LncRNA-Scrt2表达位置,其表达在F9细胞的细胞核中,从基因表达方式角度说明LncRNA-Scrt2是LncRNA。
  随后,对LncRNA-Scrt2在小鼠胚胎发育过程中表达谱进行了研究。定量PCR的结果显示,LncRNA-Scrt2在小鼠胚胎E12.5天到E18.5天的脑中存在表达的动态变化,并且在E15.5天表达最高。原位杂交的结果显示LncRNA-Scrt2在E10.5天、E12.5天、E15.5天的胚胎中都特异性表达在脑组织中,并且随着发育的进行,脑中的表达位置也发生变化。进一步观察E15.5天脑中表达位置,发现LncRNA-Scrt2表达主要集中在前脑的脑室区和脑室亚区,并且从内层到外层表达依次降低。
  综上所述,本研究发现了一个与小鼠胚胎脑发育相关的新的LncRNA-Scrt2,获得了其转录本的序列,并对转录本序列进行分析证明其确实是一个LncRNA。通过小鼠胚胎发育阶段表达谱分析证明了其特异性表达在小鼠胚胎的脑组织中,并且表达存在规律性变化。本研究加深了对脑中LncRNAs的认识,同时为LncRNA-Scrt2进一步的功能研究提供了良好的实验依据。
[硕士论文] 李亚丽
农业昆虫与害虫防治 西南大学 2016(学位年度)
摘要:桔小实蝇 Bactrocera dorsalis(Hendel)隶属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae,广泛分布于热带和亚热带地区。由于极强的环境适应和扩散入侵能力,桔小实蝇被多个国家和地区列为检疫性害虫,对国际贸易造成了诸多限制;同时由于其寄主范围广、繁殖力强、造成的经济损失严重,因此该虫是果蔬上的危险性害虫。桔小实蝇一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育阶段,其成虫将卵产于果皮之下,幼虫孵化后取食果肉,造成果实脱落或失去经济价值。变态发育作为桔小实蝇重要的生理过程,具有重要的研究意义。在昆虫中,蜕皮激素和保幼激素协同作用,共同参与调控昆虫的蜕皮和变态发育。相对于蜕皮激素信号通路,保幼激素(Juvenile hormone,JH)分子作用机制还远未清楚。
  本学位论文基于桔小实蝇基因组及转录组数据库信息,运用RT-PCR技术,从桔小实蝇体内克隆获得了JH信号通路基因Met和Kr-h1的开放阅读框(ORF),并对其特征序列进行了注释;利用qPCR技术解析了桔小实蝇Met和Kr-h1的时空表达模式,同时明确和记录了外源激素(JH III和烯虫酯Methoprene)处理后桔小实蝇幼虫及蛹的应激表达模式及其表型变化;在此基础上,利用RNAi探索了Met和Kr-h1在桔小实蝇变态发育过程中的功能。研究结果不仅有助于了解昆虫生长发育机理,还有利于寻找新的杀虫靶标,为实蝇类害虫的持续防控提供新的思路和方法。主要研究结果如下:
  1.桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因的克隆与序列分析
  基于桔小实蝇基因组和转录组数据库,克隆获得了JH信号通路Met和Kr-h1基因的ORF,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP4.1以及TMHMM等生物信息学软件分析了Met、Kr-h1基因推导的蛋白质的保守序列、跨膜结构等潜在的生理功能。
  2.桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因的时空表达模式
  2.1 桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因在不同发育阶段的表达模式
  利用qPCR技术解析了JH信号通路Met、Kr-h1基因在桔小实蝇卵、幼虫、蛹及成虫1日龄的mRNA表达模式。结果表明,Met基因在桔小实蝇整个发育阶段持续表达,但幼虫期的表达量明显高于蛹期。幼虫期呈现不规律的波浪形起伏,在末龄期的第9日龄达到高峰,之后在蛹期持续低表达,推测该基因在桔小实蝇变态发育的过程中起着重要作用。
  Kr-h1基因变化更为显著,其在卵期有较高的相对表达量,而在幼虫第3、4日龄有明显的下调现象,在进入3龄幼虫期的第5日龄开始出现持续上调直至蛹期第1日龄,同样在即将化蛹的幼虫第9日龄出现高峰。此外,Met、Kr-h1基因均在蛹-成虫的转变过程中出现上调。Kr-h1基因在响应桔小实蝇JH变化过程中发挥了极大的作用,是桔小实蝇变态发育的重要调控因子。
  2.2 桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因在幼虫不同组织的表达模式
  利用qPCR技术解析了JH信号通路Met、Kr-h1基因在桔小实蝇3龄幼虫脂肪体、马氏管、中肠、气管和表皮组织中的表达模式。结果表明,2个基因均在桔小实蝇幼虫马氏管中表达量最高,其次为脂肪体,而分别在幼虫气管、中肠中表达量最低。
  3.JH III和Methoprene对桔小实蝇Met和Kr-h1基因表达的影响
  3.1 JH III和Methoprene对桔小实蝇幼虫Met和Kr-h1基因表达的影响
  利用点滴法分别对桔小实蝇4日龄幼虫施用JH III和Methoprene。于处理后的6h、10h和24h,分别检测桔小实蝇Met、Kr-h1基因的表达量。qPCR结果表明,两种化合物均对Met基因无明显的刺激作用;两种激素处理后的24h,Kr-h1基因表达量均出现显著性上调,最终导致幼虫在化蛹后形态上出现了介于幼虫和蛹之间的“中间形态”。此外,相对JH III,Kr-h1基因对Methoprene更敏感。
  3.2 JH III和Methoprene对桔小实蝇蛹Met和Kr-h1基因表达的影响
  利用点滴法分别对桔小实蝇初蛹(12 h)施用JH III和Methoprene。于处理后的1d、3d、5d、7d,分别检测桔小实蝇Met和Kr-h1基因的表达量。qPCR结果表明,两种激素处理对Met基因表达量无显著影响;而Kr-h1基因表达水平在激素处理下显著上调,其中Methoprene处理后的第7天,Kr-h1上调倍数达到79.5,最终导致桔小实蝇蛹由于不能正常羽化而死亡。
  4.桔小实蝇Met和Kr-h1基因的功能初探
  分别将合成好的Met、Kr-h1基因dsRNA混入染料胭脂虫红,对桔小实蝇4日龄幼虫进行饲喂法RNA干扰,并通过qPCR技术检测目的基因的沉默效果。结果表明,在iMet处理24h后,与对照相比,Met基因表达水平显著下调56.2%,同时Kr-h1基因表达量也受到显著抑制,分别下调了71.1%(24h)和42.3%(48h);在iKr-h1处理24h和48h后,Kr-h1基因表达水平分别显著下调78.9%和40%。上述沉默效率表明饲喂法对桔小实蝇幼虫RNA干扰是切实可行的。此外,RNA干扰的试虫在化蛹时间上并没有提前,即没有出现幼虫龄期缩短的现象,但相较于对照PBS,有一定的发育滞后现象。
[硕士论文] 赵静
生物学;发育生物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:脱氧核糖核酸(DNA)是生命遗传信息的载体。DNA分子的完整性和稳定性对于细胞的存活和正常的生命活动具有重要意义。DNA聚合酶β(Polβ)是碱基切除修复途径中的关键酶,在维持基因稳定性和完整性的过程中起着重要作用。PolβR137Q位点是将Polβ的第137位精氨酸替换成谷氨酰胺,实验室前期研究已经发现该位点突变会降低DNA碱基切除修复效率,而降低DNA碱基切除修复效率的分子机制目前还不清楚。
  本研究通过经典的基因打靶的方法成功获取了R137Q突变的转基因小鼠。研究发现,R137Q突变的纯合小鼠的出生率显著低于野生型对照小鼠,对孕鼠进行解剖后发现,R137Q小鼠E15.5,E17.5和E19.5天的胚胎体型和体重都显著低于野生型小鼠胚胎。免疫组化实验表明,R137Q小鼠胚胎增殖显著低于野生型小鼠。胚胎成纤维细胞(MEFs)的细胞生长曲线进一步证实了免疫组化实验的结果。对磷酸化细胞周期检验点蛋白pCHK1进行检测后发现,pCHK1在R137Q细胞中的表达量显著高于对照组,表明R137Q细胞周期检验点被激活。同时,TUNEL凋亡测定发现,R137Q细胞存在更高的凋亡比例。
  R137Q细胞增殖较慢并且凋亡增加同时细胞周期检验点被激活,而只有当细胞周期异常时检验点才会被激活,基于此我们观察DNA结构是否发生变化。通过核型分析发现,R137Q细胞内存在更多的染色体断裂。考虑到Polβ是碱基切除修复中的关键酶,Polβ位点突变可能会影响DNA碱基切除修复能力。于是采用组织裂解液和原代胚胎成纤维细胞裂解液来重构短片段碱基切除修复(SP-BER)和长片段碱基切除修复(LP-BER)过程。实验结果显示,与WT相比,R137Q小鼠的组织和细胞裂解液均不能有效修复DNA损伤,R137Q细胞BER修复效率明显降低,提示细胞内的DNA损伤修复系统出现障碍。伴随着R137Q细胞碱基切除修复效率的降低,细胞进行DNA修复时产生大量的DNA中间产物如DNA断裂,免疫印迹和免疫荧光实验结果显示R137Q细胞存在着更多的DNA双链断裂。之前体外的研究已经表明,R137位点的突变导致了Polβ聚合酶活性的降低和碱基切除修复效率的下降。该结果表明体内的R137Q突变影响了聚合酶活性和碱基切除效率,进而导致了DNA双链断裂和染色体异常。
  此外,通过烷化剂和氧化剂处理细胞来模拟正常生理条件下细胞所受的各类DNA损伤刺激。结果发现,当用MMS和双氧水分别处理纯合子的R137QMEFs,杂合子WT/R137Q MEFs和野生型WT MEFs之后,R137Q纯合子MEFs的生存率大大降低,磷酸化的组蛋白H2AX表达量显著增加,这一结果表明,R137Q突变增加了细胞对DNA损伤试剂的敏感性,诱发了更多的DNA损伤。
  综上,实验通过R137Q的转基因小鼠,用体内的实验结果证明,R137是Polβ的关键位点,R突变成Q导致了Polβ功能受损,DNA修复能力下降以及基因组的不稳定,最终引起了细胞和小鼠整体的生理功能异常。我们的结果再次证实了Polβ结构和功能的完整性对于维持生物体正常生命活动的重要作用。本研究不仅有助于我们对于Polβ在肿瘤和其他相关疾病中作用机制的理解,同时为预防和治疗DNA修复相关疾病提供新的理论依据及新的靶点。
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