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[博士论文] 程肖宁
发育生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:Wnt信号通路,无论是经典的Wnt/β-catenin信号还是非经典的Wnt/PCP信号,调控许多生物学过程,贯穿所有动物的早期胚胎发育和成体时期,并且对疾病的发生也具有重要的作用。在这两个信号途径中,Frizzled(Fz)受体和Dishevelled(Dvl)相互作用转导信号的传递,调控细胞增殖、细胞分化、细胞极性和干细胞自我更新等多种重要的细胞过程。在胚胎发育过程中,Fz和Dvl介导的Wnt信号途径对调节细胞的定向运动和细胞分化具有重要的作用,但这两个Wnt信号途径的关键成分在这些发育过程中的调控机制还有待进一步的研究。我们以斑马鱼原肠胚形成过程中的集中延伸运动和视网膜发育为例,分别研究了Dvl在Wnt/PCP途径中调节细胞极性和Fz8a在Wnt/β-catenin途径中影响视网膜细胞分化的作用机制。
  Wnt/PCP信号通路是调节集中和延伸运动的关键信号通路。Wnt/PCP信号通路中包含PCP核心蛋白Fz受体和Dvl。Dvl是一个衔接体蛋白,作为该通路的保守核心成员,将Wnt/PCP信号从细胞膜受体传递到下游的效应分子,调节细胞骨架的极性组装。Dvl有三个保守的结构域-DIX、PDZ和DEP。DIX调节Dvl的聚合作用。PDZ直接与Fz以及其他细胞内蛋白相互作用。位于C端的DEP也含有与其他蛋白相互作用的位点。因此,这三个结构域分别与不同的因子结合,进而介导不同的效应信号。功能研究表明,PDZ和DEP结构域对于激活Wnt/PCP信号通路以及建立和维持原肠胚形成过程中的细胞极性是必需的。但是Dvl蛋白活性的调节机理到目前仍然不清楚。
  我们发现了一个新的Dvl结合蛋白Lurap1(Leucine-repeat adaptor protein1)。该蛋白在各种脊椎动物中具有高度的保守性,通过其C末端的PDZ结合基序与Dvl的PDZ结构域直接结合,特异地参与调节Wnt/PCP通路的活性,而对Wnt/β-catenin通路没有影响。利用活体成像观察,我们发现在斑马鱼的lurap1母源合子突变体(MZlurap1)中,侧部细胞向背中线的集中以及背中线细胞沿前后轴方向的延伸发生紊乱,因此导致集中和延伸运动缺陷。进一步的研究显示,Lurap1调节未来脊索细胞形成丝状和片状伪足的能力和方向。更深入的机制研究发现,Lurap1很可能通过调节运动细胞中微管组织中心的定位,进而影响细胞极化和定向运动所需的细胞骨架重排。功能互作研究证明,Lurap1抑制Dvl在Wnt/PCP途径中对JNK的激活。这些结果表明Lurap1很可能通过阻止Dvl的细胞膜招募,进而在原肠胚形成过程的细胞极性和运动行为中负调节Wnt/PCP通路的活性,促使该通路的局部激活。
  在脊椎动物早期发育过程中,眼睛的形成是一个高度协调的过程。从早期眼区的特化到各个眼组织的发育都需要多种转录因子和信号通路的调控。其中Wnt信号通路在眼发育的不同方面具有重要的作用。已有的研究表明Wnt/β-catenin信号通路在视网膜有丝分裂细胞中被激活,调节和维持视网膜前体细胞的增殖。虽然一些Fz受体蛋白也参与眼的发育,但它们调节眼发育的机制还不清楚。fz8a基因在斑马鱼发育早期表达在眼区,随后表达在视网膜。利用TALENs基因编辑技术敲除fz8a后,我们发现fz8a的纯合突变体中产生了小眼表型。在组织、细胞和分子水平上的分析显示,视网膜前体细胞不能正常的退出细胞周期而进入有丝分裂后的分化状态。因此导致了视网膜细胞分化的延迟并伴随着细胞凋亡的增加,最后引起视网膜细胞核层分层的异常,视网膜细胞的逐渐减少和小眼表型。这些结果暗示了在视网膜前体细胞分化过程中Fz8a在调控细胞周期的进程中具有特异的功能。
  Wnt信号通路在所有动物的整个生命过程中起着至关重要的作用。Wnt信号通路的异常引起众多的人类疾病。Dvl作为一个分支点,接收来自Fz受体的信号,转导不同的Wnt信号通路。进一步鉴定和分析新的Dvl作用蛋白的功能有助于我们深入了解调节不同Wnt信号通路活性的机制。众多的Wnt受体Fz既具有信号转导也具有组织表达的特异性。确定Fz受体的组织特异性功能有助于我们深入认识Wnt通路调节的发育过程。Fz8a缺失所导致的视网膜细胞分化异常对人类眼科疾病的认识具有明显的理论意义和潜在的应用前景。
[硕士论文] 高亚平
发育生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:半胱氨酸组织蛋白酶cathepsin B主要存在于溶酶体中,是一种嗜酸性蛋白酶,能够水解胞内破损细胞器和蛋白质等,并且能够随小泡分泌到细胞外降解胞外基质中组分。斑马鱼中cathepsinb基因存在两种基因亚型,cathepsin ba(ctsba)和cathepsin bb(ctsbb)。
  本论文利用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼cathepsin ba基因,并在子一代筛选获得cathepsin ba杂合突变体。通过ctsba杂合突变体互交获得子二代,部分胚胎在50%下包期胚胎发育出现停滞,其中一部分死亡,死亡数占全部胚胎的6.9%左右。另一部分胚胎在停滞约1-2h后恢复迟缓的发育,在咽囔期出现明显的形态畸形,包括心包囊肿、尾部折叠和弯曲等,发育至2-3天后死亡,这部分胚胎占全部胚胎数量的19.3%,经基因鉴定结果显示这些死亡胚胎均为纯合突变体。胚胎死亡率大概占全部胚胎数量的四分之一,符合孟德尔遗传定律,说明ctsba基因存在隐性致死效应。RT-PCR检测ctsba-/-突变体中发生非编码的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD),说明ctsba基因敲除成功。利用RT-PCR技术和原位杂交技术分析表明,cathepsin ba为母源性和合子表达的基因,集中表达于动物极,在斑马鱼胚胎中广泛表达,且在卵黄合胞体层与神经管中表达量较高。利用背、腹部标记基因chordin和gata2进行原位杂交,发现在ctsba杂合体和纯合突变体shield期chordin、gata2基因并未出现异常表达,但75%下包期chordin在ctsba-/-突变体背中线表达量减少。50%下包期是斑马鱼原肠胚期的开始,是三胚层分化形成的关键时期,利用内、中、外三胚层标记基因sox17、eve1、gsc在ctsba杂合突变体自交后代中进行原位杂交,根据原位杂交结果和基因型鉴定结果分析,在ctsba-/-胚胎中sox17、eve1、gsc均出现异常表达:sox17在75%下包期开始表达出现扩散现象,并且bud期内胚层前体细胞明显减少;eve1在咽囔期胚胎尾部出现表达异常;gsc表达量从75%下包期开始比野生型明显降低。实验结果提示ctsba基因可能参与了斑马鱼背部发育,在斑马鱼原肠胚时期可能参与了细胞运动和三胚层形成,ctsba基因缺陷可能因此而导致广泛的胚胎畸形和致死效应。
  本论文还利用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼cathepsin bb基因,并筛选获得cathepsin bb突变体。
[硕士论文] 吴汗
发育生物学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:动物模型是生命科学领域研究使用的重要工具之一,由于存在多种CRE工具鼠可以方便实现条件性敲除等优势,小鼠受到研究者们的青睐。
  随着基因编辑技术的快速发展,将其运用于各种细胞系和动物中的研究与日俱增。其中,最受瞩目的基因编辑技术是CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9)系统,它具有设计简单、效率高等优势。因此,本论文利用该系统开展了以下两方面的研究工作:
  首先,我们利用CRISPR/Cas9系统获得了Ndufs4基因敲除小鼠。临床研究发现在多例亚急性坏死性脑脊髓病(Leigh Syndrome,LS)病人中存在Ndufs4基因突变,我们研究发现敲除小鼠的运动能力比野生型小鼠显著低下,该表型与LS病人类似。我们进一步发现,敲除小鼠3周出现脱毛的现象,体重比野生型小鼠轻,大多数小鼠活不到成年,幸存的小鼠生殖能力弱,无法自然交配获得子代,随后的切片染色显示敲除小鼠的卵巢中能见各级卵母细胞,睾丸中能见成熟精子,其后我们使用了胞浆内单精子注射法(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)发现纯和敲除小鼠的子代在早期胚胎发育过程中受到了阻碍。
  其次,我们尝试利用PITChs系统及HMEJ系统两种基因敲入策略获得STRA8-eGFP转基因小鼠。STRA8被认为是减数分裂起始的标志蛋白:当生殖细胞进入减数分裂,Stra8基因启动表达,随后下降。因此,建立STRA8的荧光报告小鼠对于生殖发育的研究具有重要意义。本文运用PITChs法可以获得敲除胚胎,但注射后的胚胎大部分发育停滞在囊胚期;而采用HMEJ法获得的在囊胚阶段有较高的整合效率,且胚胎发育较好,目前该方面的研究工作还在继续开展。
  综上所述,本论文主要利用CRISPR/Cas9技术获得生殖发育研究相关的转基因小鼠,成功获得Ndufs4基因敲除小鼠和STRA8-eGFP基因敲入胚胎,这对生殖细胞发育进一步研究有促进作用。
[博士论文] 高晗
遗传学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:果蝇是一种研究发育生物学的重要模式生物,通过对参与细胞囊泡运输蛋白进行RNA干扰筛选实验,我们发现VAMP7和EMC3对形态发生因子Wingless(Wg)的运输和信号转导有调节作用,同时我们还发现SH3PX1在果蝇精子发生过程中的个体化过程早期起作用。VAMP7是一种SNARE蛋白,SNARE蛋白家族在细胞内囊泡运输中调节囊泡融合。我们观察到在果蝇翅膀成虫盘发育过程中,VAMP7可以调节含有Wg的囊泡运输通路。当VAMP7缺失时,Wg增多并积累在Rab4标记的快速循环内体中,而Wg在其他囊泡中的含量并未发生显著变化,这表明VAMP7突变后,囊泡中Wg的增加并不是一种随机任意的变化,而有可能和Wg的囊泡运输过程相关联。我们还观察到与Wg发生相互作用,调节Wg运输的膜蛋白Dally-like(Dlp)的分布也出现变化:在果蝇翅膀成虫盘上皮细胞的顶部区域Dlp增多,并且和Wg一样Dlp也集中于Rab4标记的循环内体中。Dlp除了参与Wg运输以外,过量的Dlp会抑制Wg的信号的下游靶基因senseless(sens)表达,Dlp是Wg的一种负反馈调节分子,Dlp的双重功能限制sens只表达在Wg分泌细胞旁。以往的研究发现无论是Dlp蛋白量变化还是运输方式变化都会引起Wg信号下游Sens表达的变化。在我们的研究中,当VAMP7缺少时,Sens减弱。此外,我们也对参与Wg运输的其他膜蛋白膜蛋白和其他形态发生因子进行了检查,发现除磷脂酰肌醇锚钉蛋白外,其他分子无显著变化,这说明VAMP7对磷脂酰肌醇锚钉蛋白运输有一定的特异性。综上所述,我们推测VAMP7可能参与调节Wg和Dlp的运输,两VAMP7的缺失导致Wg和Dlp在Rab4依赖的循环内体中聚集,这种运输通路的改变可能影响到Wg浓度梯度的形成,并且影响到Wg的信号传导。此外,我们还发现了位于内质网的蛋白Reticulum Membrane Complex3(EMC3)突变时,Wg会积累在分泌细胞的内质网中,但是与VAMP7突变时情况不同,其他多种类型的蛋白也出现积累,说明EMC3在运输通路中的作用不如VAMP7特异。在RNA筛选实验中,我们还观察到SH3PX1缺失的果蝇雄性不育,而在进一步的研究中,通过对果蝇精子发生各阶段的分析,我们发现SH3PX1突变果蝇个体化过程无法完成,精子个体化早期一些细胞器移动不同步,我们推测SH3PX1可能参与个体化早期囊泡移动。以往的研究多集中于基因表达层面对发育过程的调节,近年来蛋白运输在发育过程中的调节作用越来越受重视,而我们的发现三个与囊泡运输相关的蛋白参与调节果蝇发育过程,我们的研究为信号分子如何通过改变空间位置调控细胞进一步分化提出一种可能的模式。
[博士论文] 魏青
发育生物学 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:体外培养的胚胎干细胞具有无限增殖、自我更新和多能性的特点。这些特点不仅为干细胞体外发育和分化提供了研究模型,也为再生医学和损伤性疾病治疗提供了希望。然而,体外培养的胚胎干细胞很容易受到各种环境因素影响,从而丧失自我更新的能力,这严重影响了胚胎干细胞的临床应用。SC1作为一种RasGAP和Erk1/2蛋白的双重抑制剂,已被证实在小鼠胚胎干细胞的自我更新中发挥重要作用。在无LIF、血清和饲养层的条件下,加入SC1能够有效的维持胚胎干细胞的自我更新。自SC1发现以来,虽然已有一些研究报道了SC1的功能,但其发挥作用的深层分子机理仍未见报道。为此,本研究采用基因表达谱芯片、小RNA深度测序、免疫染色、Western blot等方法,全面检测了SC1处理后小鼠胚胎干细胞等的基因和蛋白表达影响,并深入探究了SC1维持胚胎干细胞自我更新的分子机理。主要研究结果如下:
  1. SC1处理(6h)可以显著提高小鼠胚胎干细胞和F9细胞中多能性因子的表达水平。AP染色实验发现SC1处理可以显著提高小鼠胚胎干细胞和F9细胞的碱性磷酸酶活性。说明SC1在维持小鼠干细胞多能性上发挥重要作用。
  2. SC1拮抗维甲酸(Retinoic acid, RA)诱导的细胞分化。RA可以诱导胚胎干细胞和F9细胞的分化,显著下调多能性基因Nanog,Oct4,Sox2和Klf4的表达。在RA诱导F9细胞分化过程中添加SC1,能够显著改变F9细胞的形态,形成“克隆样生长”。这暗示SC1可以抑制RA诱导的F9细胞分化。
  3. SC1拮抗RA诱导分化的分子机理。与单独添加RA相比,在F9xibaozhong同时添加SC1和RA6 h后,多能性因子Nanog,Oct4和Klf4的表达显著上调;同时添加SC1和RA24h后,Klf4的表达继续显著增加,而Nanog和Oct4的表达则无显著变化。此外,通过Western blot检测发现,同时添加SC1和RA时可显著抑制Erk1/2蛋白的磷酸化,并且随着添加SC1作用时间和浓度的增加,Erk1/2蛋白磷酸化的抑制效果愈加显著。由此可见,SC1是通过增加Klf4的表达和抑制Erk1/2蛋白的磷酸化,进而抑制RA诱导F9细胞的分化。
  SC1抑制RA诱导分化过程中影响F9细胞整体甲基化水平。免疫荧光染色结果显示,单独添加SC1和同时添加SC1和RA均可以显著下调F9细胞的整体DNA甲基化水平。单独添加SC1不影响F9细胞整体DNA羟甲基化水平,但同时添加SC1和RA可显著上调细胞整体DNA羟甲基化水平。在RA诱导分化的F9细胞中,添加SC1引起的DNA甲基化水平的变化,可能也是其能够拮抗RA诱导分化的原因之一。
  4.利用全基因组表达谱芯片分析了SC1处理(6h)对小鼠J1胚胎干细胞基因表达的影响。与加入等体积DMSO的J1胚胎干细胞相比,SC1处理显著上调248个基因表达,显著下调212个基因的表达(FC≥2,P≤0.01)。KEGG通路分析显示这些差异表达基因主要富集在PI3K-Akt通路,Ras信号通路,干细胞多能性调节信号通路以及细胞粘附等代谢通路。
  5.利用小RNA深度测序分析了SC1处理(6h)对小鼠J1胚胎干细胞中miRNAs表达的影响。结果显示SC1处理能显著上调14个miRNAs,显著下调176个miRNAs的表达(FC≥1.5,P≤0.05)。在J1细胞中过表达显著上调表达的miR124-3p,可以显著促进Nanog蛋白的表达,下调Erk1和抑制Erk1/2蛋白的磷酸化。通路报告实验发现miR124-3p能显著抑制MEK/ERK通路。进一步的qPCR、Western blot和双荧光素酶报告实验证实了miR124-3p可通过靶向Grb2,Sos2和Egr1来高效抑制MEK/ERK通路。因此,SC1可以通过上调miR124-3p的表达来协助其有效抑制MEK/ERK通路。
  6.研究分析SC1处理对细胞形态的影响。促进细胞聚集有利于胚胎干细胞维持自我更新,SC1能显著促进细胞形成克隆样结构。糖原染色实验发现SC1处理糖蛋白总量显著增加,这暗示SC1能促进细胞粘附分子表达量增加。qPCR和Western blot检测证明, SC1处理可显著上调F9细胞中细胞粘附分子E-cadherin和Alcam的表达。然而单独过表达粘附分子Alcam并不能显著改变细胞形态。此外,蛋白合成抑制实验证明SC1主要是通过提高细胞粘附分子的表达来促进细胞形成克隆样结构。
  综上所述,SC1能通过有效抑制分化相关的MEK/ERK通路,以及增强细胞之间粘附来维持干细胞自我更新的能力。
[博士论文] 高策
发育生物学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:有机体的正常发育依赖于各种类型的细胞精确地完成细胞分化和细胞增殖等过程。一个细胞的命运是如何决定的?这是遗传发育生物学领域的基本问题之一。针对细胞谱系和细胞命运调控因子的研究可以帮助我们找到这个问题的答案。
  同源异形盒家族的Hhex是一个转录调控因子,在肝脏早期发育过程中非常重要。在斑马鱼中,hhex基因高水平地表达于肝脏芽基、胰腺芽基和肝胰胆管系统的细胞中。然而,Hhex在肝脏胰腺胆管系统中扮演的角色尚不清楚。
  为了了解Hhex在肝脏胰腺胆管系统发育过程中扮演的角色,我们利用CRISPR/Cas9技术获得了斑马鱼hhex基因突变体。利用免疫荧光染色、探针原位杂交和荧光素酶分析等细胞分子生物学方法,我们对斑马鱼hhex基因突变体进行了一系列的观察和研究。
  我们发现斑马鱼hhex基因突变体的胆管系统发育出现严重障碍。此外,突变体斑马鱼肝脏内部出现一个导管结构,该导管结构中的细胞具有肠上皮细胞的特征。探针原位杂交显示在突变体胚胎发育早期,同源异形盒基因cdx1b和pdx1在肝脏芽基与消化道之间出现异位表达。最后我们发现斑马鱼Hhex蛋白可以显著抑制斑马鱼cdx1b和pdx1基因启动子的转录活性。我们推测Hhex蛋白发挥转录抑制功能,进而保证胆管细胞的正常分化和发育。我们的研究显示Hhex和Sox9b、Cdx1b及Pdx1共同组成了一个调控肝胰胆管系统发育和形态发生的信号通路。
  许多研究者认为,肝脏利用肝脏干细胞,又被称为卵圆细胞,完成各种损伤后的再生过程。然而相关的研究结果仅仅是在体外细胞系实验或细胞移植实验中获得的,这一观点存在争议。此外,一些体内实验表明胆管上皮细胞在肝脏受到严重或长期损伤时能够成为再生肝实质细胞的细胞来源,但没有针对肝脏手术后再生的相应研究报道。肝脏部分切除手术(PH)是肝脏疾病临床医学中的重要治疗手段,了解肝脏部分切除手术后再生过程中的细胞命运和细胞谱系对转化医学具有重要的意义。
  在这里,我们利用了一系列细胞分子生物学及遗传发育生物学手段,观察和分析了斑马鱼肝脏部分切除手术后肝脏再生过程中的细胞行为和谱系。利用CreErt2/LoxP系统,我们对斑马鱼肝实质细胞和胆管上皮细胞进行了谱系追踪实验。此外,我们还制备了两种肝实质细胞特异性表达的蛋白所对应的抗体Anti-Bhmt和Anti-Fabp10a。我们发现成年斑马鱼的肝实质细胞均来自胚胎期表达Fabp10a的肝实质细胞的自我增殖。在对成年斑马鱼肝脏进行部分切除手术后,我们发现手术伤口处出现表达Bhmt,但不表达Fabp10a的细胞。谱系示踪实验证明这些细胞在手术后7天成为表达Fabp10a的肝实质细胞;这些新生细胞并非来自手术前已存在的肝实质细胞,它们有一部分来源于胆管上皮细胞的转分化。
[硕士论文] 王超群
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:自噬是一个高度保守的生理过程,通过囊泡结构将细胞质内的组分进行隔离、包裹,进而与溶酶体融合降解。自噬作为细胞内一个主要的降解和回收途径,在个体发育过程和细胞稳态维持中都起到非常关键的作用。线粒体自噬是细胞内功能异常或者多余的线粒体通过自噬途径降解的过程,对于细胞内线粒体的质量控制发挥着重要作用。在细胞内线粒体主要通过产生ATP为细胞提供能量,但当线粒体受到损伤的时候,就会产生过多的压力信号,从而导致细胞损伤并且最终引起细胞程序性死亡的发生。因此,受损线粒体的识别和降解也是细胞体内稳态维持中非常重要的组成部分。
  干细胞具有自我更新和多向分化潜能,在疾病模型建立、细胞治疗修复、再生医学方面,有着广阔的应用前景。线粒体作为多能干细胞重要的细胞器,其质量控制和稳态维持对于多能性的影响还不是很清楚。这里我们研究了Pink1调控的线粒体自噬对多能性获得和多能性调控的影响。
  我们发现多能干细胞中将线粒体自噬介导蛋白Pink1敲除能够引起多能干细胞中线粒体数量会发生积累,线粒体的膜电势降低,ATP产量降低,而细胞中ROS的含量增加。这些结果表明,当多能干细胞中Pink1介导的线粒体自噬缺失后,会导致多能干细胞中功能异常的线粒体发生积累。进一步,我们发现当敲除Pink1后,多能干细胞的自我更新能力显著降低。通过实时荧光定量PCR检测多能性基因的表达情况后发现,Pink1的缺失会显著降低多能性基因的表达,并且体内分化形成的畸胎瘤体积和重量均较野生型的小。
  重编程过程中,我们发现Pink1敲减会导致细胞内线粒体不能有效清除,从而降低重编程效率。这些结果都表明了Pink1参与了多能性诱导和维持中的线粒体调控。
  使用Parkin基因敲除的MEF细胞进行体细胞重编程并未发现重编程中线粒体的累积和重编程效率的降低,这些结果表明Pink1并不是通过激活Parkin而调控重编程及胚胎干细胞多能性的。未来的工作我们将筛选Pink1下游作用分子,进一步阐明Pink调控多能性的分子机理。
[硕士论文] 张辉
生物学 哈尔滨工业大学 2017(学位年度)
摘要:胎盘是保证胎儿在子宫内正常发育所必须的?器官,联系母体环境和胎儿环境,在母体-胎儿间氧气、营养物质和代谢废物的交换中发挥重要作用。母体妊娠过程中,胎盘绒毛外滋养层细胞(EVT)可侵入子宫脱膜层并深入子宫肌层1/3处。滋养层侵袭是妊娠成功的关键,因为侵入子宫肌层的滋养层细胞可重塑螺旋动脉并舒张血管,从而保证充足的营养物质的供给。
  MarvelD1是课题组前期研究发现的一个候选肿瘤抑制基因,主要定位于细胞核内。在小细胞肺癌中,MarvelD1可通过维持Itgb1和Itgb4表达平衡抑制上皮间质转化。由于MarvelD1基因及其编码蛋白在人、小鼠间具有较高的保守性,提示该基因在小鼠发育中发挥作用。
  为研究MarvelD1在小鼠发育中的作用,本研究首先对课题组前期获得的MarvelD1敲除鼠数量量遗传学数据进行了了收集,并初步观测了了其一般表型。通过统计分析MarvelD1敲除鼠(MarvelD1-/-)出生率,发现MarvelD1敲除鼠自交子代数目显著低于野生型(MarvelD1+/+)。MarvelD1杂合子(MarvelD1+/-)自交子代各基因型比例例分析发现敲除鼠比例例显著低于野生型。进而,本研究分析了了MarvelD1敲除鼠出生前后子代数目,结果显示新生鼠数目显著低于E18.5胚胎数目。以上数据表明敲除MarvelD1基因可导致小鼠出生异常,并降低小鼠出生率。
  进一步研究发现,在难产鼠中存在胎盘滞留留子宫的现象,且胎盘紧密黏连在母体子宫内膜上,即胎盘植入表型。本研究利利用HE和IHC染色方法分析了了E18.5野生型和敲除型胎盘的发育特征及胎盘滋养层侵袭状态。HE结果显示MarvelD1敲除鼠胎盘存在异常子宫黏连。用抗细胞角?蛋白18抗体进行IHC染色,结果表明难产敲除鼠胎盘蜕膜层中存在大量量侵袭性滋养层细胞。
  最后,本研究利利用HTR8/SVneo作为体外模型,研究并发现MarvelD1可结合到It gb4基因启动子上,促进It gb4表达,进而通过促进滋养层细胞与细胞外基质的粘附而抑制滋养层细胞的侵袭和转移。
  本课题对MarvelD1基因在胎盘发育中的功能进行了了阐释,在完善人们对于EVT侵袭相关分子机制的研究的同时,对阐释胎盘植入的分子机制奠定了了一定的分子基础。
[博士论文] 江龙
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的性染色体是从祖先的常染色体进化而来,在整个进化过程中经历了复杂的变化。例如,X染色体上的基因数量在真兽亚纲哺乳动物中还有两次爆发性的增长。基因的转移和重新分配赋予了X染色体的特殊功能。大量研究表明起源于X染色体的逆转座基因在基因组中所占的比例远远高于起源于常染色体的比例,这类基因往往定位于常染色体并且具有睾丸特异表达的特点。科学家们也提出了一些基于进化选择的假说用于解释这种现象,包括性别对抗驱动X染色体失活假说以及减数分裂性染色体失活补偿假说等。然而,这些假说都缺乏直接的实验证据。尽管有几个X染色体起源的逆转座基因已被证实对精子发生至关重要,但这些基因与其前提基因的进化、表达及功能相关性仍未见报道。
  RPL10L是一个位于常染色体并在睾丸中特异表达的逆转座基因,它的前体是X染色体上一个核糖体蛋白编码基因RPL10,它的进化发生在真兽亚纲和后兽亚纲分支后不久的真兽亚纲哺乳动物中。我们选择RPL10L和RPL10作为模型,详细研究它们的表达模式、分子功能及作用方式,以期深入了解X染色体来源的逆转座基因存在的意义及其进化机制。
  首先,我们利用CRISPR/Cas9的方法制作了Rpl10l敲除小鼠,并发现雄性个体的精子发生障碍并且完全不育,具体表现为绝大多数精母细胞发育停滞在减数第一次分裂前期向中期的转换,没有减数分裂后的生殖细胞产生。其次,RPL10L蛋白特异地参与睾丸细胞中的核糖体组装,缺失它的粗线期及双线期精母细胞中的核糖体生成减弱并且大量蛋白的含量发生变化。再次,Rpl10在雌雄小鼠不同组织以及精子发生的精原细胞、前细线期精母细胞、细线期及偶线期精母细胞中广泛表达,但在粗线期及双线期精母细胞和圆形精细胞中的表达量急剧下降;有趣的是,Rpl10l在精子发生的粗线期及双线期精母细胞和圆形精细胞中特异地高表达。最后,RPL10敲低的细胞中核糖体生成受阻并伴随细胞周期停滞,RPL10敲除的细胞无法增殖和存活;而外源导入RPL10L表达载体能够补救RPL10敲除细胞的增殖和存活;更重要的是,Rpl10l启动子驱动的Rpl10转基因能够重建Rpl10l敲除小鼠的精子发生和生育力。综上所述,我们的研究证实Rpl10l能够补偿MSCI导致的Rpl10转录沉默以保证正常的精子发生,为基于MSCI的逆转座基因补偿假说提供了直接的实验证据,也为X染色体起源的逆转座基因的进化机制以及其在雄性生殖过程中的作用提供了新的理论依据和见解。
[硕士论文] 沈自慧
海洋生物学 广东海洋大学 2017(学位年度)
摘要:乙醇俗称酒精,是酒精饮料的主要成分,是世界范围内被普遍滥用的物质之一。过量饮酒会引起酒精中毒、酒精依赖及相关疾病的发生,对机体各系统均有损伤,乙醇也是常见的致畸源,母体在孕期饮酒会导致胎儿酒精综合征,其症状主要有头面部畸形、发育迟缓、运动不协调、学习能力障碍等,这部分患儿给社会和家庭造成很大的负担。国内外就乙醇的毒性机制做了很多研究,其中乙醇引起的发育异常是研究的热点。本文旨在研究乙醇对斑马鱼胚胎发育的毒性作用机制,从乙醇对胚胎的氧化损伤、DNA甲基化和致畸致癌作用等多个方面进行阐述。通过观察在不同浓度、不同时间的乙醇暴露下,斑马鱼胚胎死亡率、孵化率、畸形率,建立斑马鱼异常发育模型;通过观察氧化应激相关蛋白的酶活力水平及mRNA表达水平,明确乙醇对斑马鱼胚胎的氧化损伤作用;通过荧光定量PCR,筛选乙醇毒性作用相关差异表达基因,通过蛋白质组学研究方法,筛选和鉴定斑马鱼胚胎与乙醇相关的特异性蛋白,探讨蛋白与乙醇表达调控之间的关系。
  本研究获得的主要结果如下:
  1、乙醇对斑马鱼胚胎有毒性效应且存在剂量依赖关系,其对斑马鱼胚胎的96hpf的LD50为0.333mol/L。乙醇对斑马鱼胚胎发育有明显的抑制作用,可造成胚胎发育过程延滞,且剂量越高抑制作用越明显,乙醇可导致斑马鱼胚胎发育畸形,主要表现为头部畸形、心脏畸形、躯干畸形等。
  2、乙醇暴露能诱导胚胎产生氧化损伤,使细胞SOD活力和CAT含量显著上升;引起斑马鱼胚胎氧化损伤相关基因(cat、sod1)的mRNA表达异常。乙醇暴露能引起斑马鱼胚胎DNA甲基化相关基因DNMT1表达下调、 MeCP2和tet3表达上调,引起内分泌生殖相关基因Sox9a和KISS2表达上调,以及胚胎发育多能性因子sox2的表达水平下调,以上结果差异均有统计学意义。
  3、通过双向荧光差异电泳和质谱技术,筛选并鉴定出hnRNPab、eef1b2、Pentraxin等表达差异蛋白。Western-blot验证hnRNPab蛋白,其表达量上调,且具有剂量依赖关系,与对照组相比,差异具有统计学意义。
  综上所述,乙醇对斑马鱼胚胎有一定的毒性作用,包括致死作用和致畸作用。乙醇能干扰对斑马鱼胚胎氧化-抗氧化系统平衡,造成氧化损伤,干扰斑马鱼胚胎DNA甲基化过程,对胚胎造成DNA损伤,影响胚胎早期发育多能性因子的表达,引起多个系统发育异常,并且具有一定的生殖毒性。hnRNPab蛋白可能是乙醇对斑马鱼胚胎发育的毒性效应分子之一。
[博士论文] 王乐韵
生物学;发育生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:早期胚胎发育是一个精细而又严格的调控过程,在早期胚胎发育过程中涉及组蛋白修饰的变化、雌雄基因组互作,甲基化的调控与变化等。研究早期胚胎发育机制对发育生物学以及生殖生物学乃至再生医学都具有深远的意义,因此早期胚胎发育一直都是人们研究的热点。因为早期胚胎材料的特殊性,因此人们对于早期胚胎发育的研究是长久以来的难点,缺乏一种良好的研究工具。
  单倍体胚胎干细胞(haESCs)是近年来兴起的一种新型的胚胎干细胞。其特点是只含有一套染色体组,并且拥有正常胚胎干细胞的特性,具有体外无限增殖以及分化的能力。单倍体胚胎干细胞分为孤雌单倍体胚胎干细胞和孤雄单倍体胚胎干细胞,由于其单倍体来源的多样性,因此其成为可以模拟单套雌雄基因组的良好细胞系。同时其多能性以及体外无限增殖的特点,为其在体外进行基因操作提供了很多有利的条件,为基因功能研究提供了一种良好的工具。同时,单倍体胚胎干细胞系的建立为研究动物遗传修饰以及改造提供了新的渠道。
  从精子与卵母细胞结合形成受精卵,在整个早期胚胎发育过程中雌雄基因组互作以及表观修饰变化一直处于动态变化之中。但对其基因组互作以及表观修饰的研究由于早期胚胎操作的难度很高,缺乏有效的研究手段。单倍体胚胎干细胞为这种雌雄基因组互作提供了一种新的研究手段。
  基因组印记的变化是整个生命过程中最重要的生物学现象之一。印记基因是个体发育的重要保证,对于印记基因的研究由于其材料的特殊性难于收集,也造成了印记基因的研究方式单一,且研究困难。单倍体胚胎干细胞便于基因操作,因此成为研究印记基因的良好素材。
  本研究通过孤雌激活的方法获得孤雌单倍体胚胎干细胞,同时利用精子克隆的办法获得孤雄单倍体胚胎干细胞,随后对孤雌和孤雄胚胎干细胞进行检测,发现其具有正常的单倍体核型,同时也具有正常的胚胎干细胞的多能性特征。随后我们利用孤雌和孤雄单倍体胚胎干细胞作为工具进行早期胚胎发育的研究。
  首先,利用孤雌孤雄单倍体胚胎干细胞进行细胞融合,进行四倍体补偿实验,来研究早期胚胎囊胚期前雌雄基因组互作对动物到期发育是否必要。成功地获得了孤雌与孤雄融合的胚胎干细胞细胞系。该细胞系具备正常二倍体核型,同时其具有体外分化成三胚层以及二倍体种系嵌合的能力,证明其具备正常的ES细胞的多能性。最后利用四倍体补偿实验,获得四倍体到期小鼠,该实验是细胞多能性最高级别验证的黄金标准,同时该实验也证明了在囊胚期前,雌雄基因组互作对动物到期发育不是必需的。
  其次,发现孤雌单倍体胚胎干细胞具有随着细胞代次增高DNA甲基化修饰不断降低的特性,尤其是其印记调控区也存在这样的现象,同时孤雌单倍体胚胎干细胞胞质注射小鼠由于印记异常等原因只能发育到E13.5天。孤雌单倍体胚胎干细胞的这些特性为印记基因的功能性研究提供了一种良好的工具,通过对孤雌单倍体胚胎干细胞不同印记区域进行修饰,来进行印记对早期胚胎发育的影响。通过对IGDMR的印记DMR区域的同源打靶获得了IGDMR区域基因沉默的孤雌单倍体胚胎干细胞,该细胞支持动物到期发育,但影响其成活。随后,在IGDMR区域修饰的基础上,对H19区域进行同源重组,通过对H19转录起始位点上游-4kb到+1kb以及-10kb到+4kb区域敲除我们发现,在IGDMR/△5kbH19敲除的单倍体胚胎干细胞胞质注射后不能获得到期成活的小鼠,但IGDMR/△15kbH19敲除的单倍体胚胎干细胞胞质注射不仅动物到期率有所提高而且动物可以成活到成年,但是其体重及行为学与野生型相比依旧有所异常。最后,我们通过在IGDMR/△15kbH19敲除的单倍体胚胎干细胞的基础上进行IGF2过表达形成IGDMR/△15kbH19/IGF2细胞系进行胞质注射,该策略使得到期小鼠的行为学旷场试验的运动能力有所改善,但仍未改善完全。
  本研究通过构建单倍体胚胎干细胞这种独特的新型细胞类型用来研究早期胚胎发育过程中基因组互作以及印记调控等现象。不仅仅回答了早期胚胎发育中一些难以研究的问题,同时为早期胚胎发育的研究提供了一种新的思路。单倍体胚胎干细胞在线粒体模型制备、异种基因组互作以及生殖生物学领域将发挥其他重要的作用。
[硕士论文] 郭峥
生物学·发育生物学 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:非肌肉肌球蛋白Ⅱ是一类不存在于肌肉细胞中的肌球蛋白,肌球蛋白不只是存在于肌肉细胞中,存在于非肌肉细胞中的肌球蛋白称为非肌肉肌球蛋白,肌球蛋白与非肌肉肌球蛋白在结构上相似但不相同。在功能上,肌球蛋白存在于肌肉细胞中,主要是在肌肉运动的过程中起重要作用。非肌肉肌球蛋白存在于非肌肉细胞中,参与细胞的多种生理活动,与细胞迁移、细胞粘附、细胞分裂、细胞凋亡、细胞分泌、细胞修复、病毒入侵、信号转导、器官发育、干细胞都有着密切的关系。非肌肉肌球蛋白Ⅱ现如今是国内外研究的热点,但大多非肌肉肌球蛋白Ⅱ的研究实验都是在细胞水平进行的,很少的实验涉及到哺乳动物胚胎层面。本实验在小鼠胚胎早期发育过程中初步研究了抑制非肌肉肌球蛋白Ⅱ对小鼠囊胚发育的影响,为进一步研究小鼠胚胎早期发育过程中非肌肉肌球蛋白Ⅱ的功能提供了具有参考意义的实验数据。
  目的:探讨抑制非肌肉肌球蛋白Ⅱ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ)对体外培养的小鼠早期胚胎发育过程中囊胚形成以及干性相关基因表达的影响。
  方法:从怀孕2.5天(E2.5)的孕鼠体内分离子宫取胚,将此时收集到的桑椹胚(morula)随机分为对照组与25μM(-)-Blebbistatin药物处理过的实验组,分别在体外培养24h后,囊胚的发育情况用体视显微镜观察,并且运用免疫荧光标记技术检测干性相关基因nanog,oct4,sox2,ssea1,estrogen的表达情况。
  结果:(-)-Blebbistatin处理后的桑椹胚无法继续发育形成囊胚腔(blastocoel),并且相对于对照组,药物处理后的胚胎中干性基因的表达也明显减弱(P<0.05)。
  结论:抑制非肌肉肌球蛋白Ⅱ后会阻滞小鼠囊胚的发育并降低干性相关基因的表达。
[硕士论文] 张泽前
养殖 延边大学 2017(学位年度)
摘要:硫辛酸在医学界被成为万能抗氧化剂,有研究表明,硫辛酸可以清除小鼠肾脏内的活性氧,硫辛酸的抗氧化作用已在体细胞培养上得到证实,但在小鼠胚胎体外发育上还没有相关的研究。
  本实验的目的:1.筛选出硫辛酸体外培养的最佳浓度。2通过H2O2建立氧化损伤模型,对氧化损伤胚胎探讨硫辛酸对于相关抗氧化酶表达的影响。结果表明:
  1.各处理组2-细胞率无明显差异性(P>0.05),1.25uM处理组的发育率是最好的,其中8-细胞率和囊胚率均显著高于对照组(P<0.05)。
  2.氧化损伤胚胎内CAT、Cu-Zn SOD、Prx1、Prx3的mRNA表达水平明显降低(P<0.05),但Prx5的mRNA表达水平明显升高(P<0.05);当氧化损伤胚胎经硫辛酸处理以后,CAT、Mn SOD、GPX-4、Prx1的mRNA表达水平明显上升(P<0.05),但Prx5明显下降(P<0.05),Cu-Zn SOD无明显变化(P>0.05)。
  结论:1.1.25μ M硫辛酸为小鼠体外培养的最适宜浓度。2.在H2O2氧化损伤胚胎中,硫辛酸可以提升特定抗氧化酶的mRNA的表达量。
[博士论文] 刘文博
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:精子发生是一个非常动态和复杂的过程,主要经历三个阶段:精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形,最终产生单倍体长形精子。精子发生的每个阶段都需要基因表达的精确调控。可变剪接作为非常重要的基因转录后调控方式,极大的增加了高等真核生物和复杂器官中转录和翻译产物的多样性。大量研究数据显示可变剪接调控了精子发生相关基因的表达和功能;此外,很多剪接因子在睾丸中呈现细胞或发育阶段特异性表达模式,这都说明可变剪接可能在精子发生过程中发挥着重要的调控功能。BCAS2(breast carcinoma amplifiedsequence2)是Prp19相关复合体的核心组分,参与了前体RNA的剪接等重要生命活动。我们前期的研究发现BCAS2在雄性生殖细胞中具有特异性表达模式。本课题采用精原干细胞特异性敲除BCAS2的小鼠模型,研究BCAS2是否参与精子发生过程中的剪接。
  通过对BCAS2在睾丸发育过程中的免疫染色观察和生精细胞的富集,发现BCAS2在小鼠睾丸的精原干细胞中相对高表达。Vasa-Cre介导生殖细胞特异性敲除BCAS2的雄性小鼠生长正常,具有正常的交配行为,但不能生育后代;进一步检测发现,BCAS2缺失导致精子发生明显异常,表现为减数第一次分裂前期的生殖细胞数目明显下调,并且基本观察不到减数分裂的关键事件(重组和联会)。通过对精原干细胞的数量、定位、增殖和凋亡进行染色和统计发现,BCAS2缺失的睾丸中精原干细胞发育基本正常,但减数第一次分裂前期的精母细胞大量缺失,减数分裂启动的关键因子STRA8的表达也明显下调,说明BCAS2缺失的睾丸无法正常启动减数分裂。为了进一步解析BCAS2的作用机制,我们对出生后第9天(P9)的正常和BCAS2敲除的小鼠睾丸进行了RNA深度测序分析。结果发现BCAS2缺失的睾丸转录组水平的基因表达基本正常。但是作为剪接目标基因tubulin的表达明显变化,提示BCAS2可能通过剪接发挥功能。为了研究BCAS2在pre-mRNA剪接方面的功能,我们进一步研究了BCAS2缺失睾丸中的可变剪接的变化。结果显示,在BCAS2缺失的睾丸中有245个基因的可变剪接发生了异常,其中包括6个在精子发生中具有重要功能的基因(Dazl、Ehmt2、Hmga1、Cit、Hsf1和Bcl2l11)。利用半定量RT-PCR和real-time RT-PCR,我们成功验证出Dazl、Ehmt2和Hmga1的可变剪接异常。此外,BCAS2的缺失会导致“减数分裂促进因子”DAZL不同转录本的表达异常:全长形式的转录本显著性下调,而缺失8号外显子的转录本表达量明显上升。而且DAZL蛋白总体的表达量明显下调。
  总之,本研究证明了BCAS2参与小鼠精原干细胞中的可变剪接,并对减数分裂启动和雄性生育力的维持至关重要。该研究首次揭示了可变剪接在精子发生过程中调控减数分裂启动这一重要事件,为研究哺乳动物减数分裂启动提供了新的思路,并为可变剪接的生理功能研究提供了重要理论依据。
[硕士论文] 朱毅宁
光学工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:动物组织类别繁多,对其进行分类识别具有重要的意义。传统动物组织分类检测通常采用基于DNA和蛋白质检测的方法。然而此类方法需进行样本处理、且DNA或蛋白质的萃取往往需要专业的人员操作,过程复杂、耗时,不适合实时原位检测。激光诱导击穿光谱(Laser-induced Breakdown Spectroscopy,简称LIBS)技术的出现为动物组织实时、在线诊断提供了一种可能,它可以通过结合化学计量学方法分析物质的成分组成来对不同组织进行快速识别。基于此,本论文以常见肉类组织和人体肿瘤组织为实验对象,探索采用 LIBS技术对动物组织进行分类识别。具体研究内容如下:
  首先对鲜肉组织的制样和采集方式进行了研究。以常见4种猪肉组织为研究对象,对其分别进行了不同的预处理和光谱采集:石蜡包埋处理(定点采集)、玻璃压制(定点采集)、玻璃压制(扫描采集)、自动切片(扫描采集)。使用基于径向基映射核函数的支持向量机算法(Support Vector Machine,SVM)对4种组织进行了分类研究,对比分析了4种不同的预处理方法和光谱采集方式对分类结果的影响。研究发现玻璃压制(扫描采集)的样品处理方式可获得最佳的动物组织识别效果,其平均预测识别率可达93%。
  其次对不同的分类识别算法进行了对比研究。使用玻璃压制和扫描采集方式对6种不同的鲜肉组织(猪肉、牛肉、鸡肉等)进行简单的样品处理和 LIBS光谱数据采集,分别使用常见有监督算法(支持向量机、随机森林、偏最小二乘判别分析、线性判别分析、朴素贝叶斯分类器和神经网络、K近邻)和无监督算法(主成分分析和K均值)对6种鲜肉组织进行了分类识别,对比了采用不同算法的识别结果。结果表明,采用支持向量机算法可以获得最佳的识别精度,其平均预测识别率为88.44%。
  然后以 SVM算法为研究对象,通过与其他算法组合以及内核优化进一步改进算法以提高识别精度。以6种鲜肉组织研究对象,使用SVM与主成分分析相结合的算法对组织进行了分类识别。通过主成分的降维、降噪,提高了 SVM模型的建模效率和算法识别率,建模时间从94.63 s降至57.00 s,平均预测识别率从88.44%提高至89.11%。并通过优化SVM的映射内核,进一步提高识别率至90.22%。另外,为了解决分类过程中人工选线耗时的困扰,使用小波变换结合信背比、信噪比阈值自动对谱峰进行挑选,使得分类算法更加自动智能化。
  最后将研究的模型和算法运用到医学肿瘤组织的识别中。结果表明,使用SVM以及与主成分分析相结合的算法对正常组织和肿瘤组织的光谱平均预测识别率分别达到93.06%、94.44%,同时使用主成分降维使得建模时间从21.55 s大幅度降低为1.97 s。
  综上所述,LIBS结合化学计量学分类算法可用于对动物组织乃至医学组织分类识别,这为LIBS在线应用于组织识别提供了一定的参考。
[硕士论文] 任婧
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:绵羊是非常重要的经济型家畜,为人们提供肉、奶、皮毛等产品。运用卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)、体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)和胚胎移植(Embryo Transfer, ET)技术对优质家畜进行良种扩繁,能有效提高家畜生产力。卵母细胞的发育与成熟是这些技术的基础,因此,卵母细胞成熟的品质好坏直接影响子代能否成活及存活后代的健康状况。从卵母细胞成熟到早期胚胎发育的过程中,除内源性基因的表达调控作用之外,培养环境中的信号分子作用也影响其能否正常发育。通过旁分泌因子发挥调控作用是这种调控最常见、最直接的方式之一。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)、基质细胞衍生因子-1(Stromalcell-derived factor-1,SDF-1)、神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是卵巢旁分泌因子。研究发现CTGF能促进小鼠、大鼠卵泡发育,SDF-1能增加颗粒细胞存活和提高胚胎质量,NGF能以剂量依赖的方式增强山羊初级卵泡的体外生长,HGF能诱导牛的颗粒细胞增殖。但这四种旁分泌因子是否能够作用于绵羊卵母细胞,并提高卵母细胞体外成熟率、受精率和早期胚胎发育率,尚未做过充分研究。因此,我们利用绵羊卵母细胞作为实验材料,研究CTGF、SDF-1、NGF和HGF单独添加和组合添加对绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育的作用。
  本研究主要内容包括:⑴在绵羊卵母细胞成熟液中分别单独添加不同浓度梯度的CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子,统计绵羊卵母细胞成熟率,找到单独添加CTGF、SDF-1、NGF和HGF因子的最佳浓度。接着将这四种因子组合添加到绵羊卵母细胞成熟液和早期胚胎发育液中,统计绵羊卵母细胞成熟率、卵子激活率和早期胚胎发育率。以卵丘扩散指数(cumulus expansion index,CEI)、细胞膜表面早期细胞凋亡信号和胚胎的囊胚细胞数作为评价卵母细胞成熟和早期胚胎发育潜能的指标,并且检测了凋亡基因Bax、Bcl-2、P53和PTGS2的基因表达量。⑵在四种旁分泌因子单独使用的实验中,添加30.0 ng/mLCTGF因子,10.0 ng/mL SDF-1因子,3.0 ng/mL NGF因子,100.0 ng/mL HGF因子能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎发育;在四种旁分泌因子组合使用的实验中,添加30.0 ng/mL CTGF+10.0ng/mL SDF-1+3.0 ng/mL NGF+100.0 ng/mL HGF时,卵母细胞成熟率、激活率以及早期胚胎各个时期的发育率都优于单独添加单一因子组和不添加因子组;组合因子对CEI、抑制卵子凋亡率和提高囊胚细胞数有显著作用;组合因子的使用能降低卵丘细胞、卵母细胞和囊胚细胞中凋亡基因的表达量。⑶旁分泌因子CTGF、SDF-1、NGF和HGF能促进卵母细胞成熟;四种因子组合使用能促进绵羊卵母细胞成熟和早期胚胎的发育。
[硕士论文] 张祥
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物胚胎体外培养体系影响着早期胚胎的发育潜能。在目前模拟体内输卵管及子宫的低氧环境的培养系统中,活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是影响胚胎发育的一个重要因素。胚胎合子基因组激活(zygotic geneactivation,ZGA)是早期胚胎正常发育的关键,研究认为ZGA的延迟或失败与早期胚胎发育阻滞有关。为探究ROS对小鼠早期胚胎发育阻滞的影响,本研究比较了不同品种小鼠在不同培养液中发生阻滞的情况,检测了ZGA相关基因、胞质ROS浓度及ROS相关基因的表达;同时利用2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵建立ROS引起阻滞的细胞模型,对线粒体机能相关的线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态、mtDNA的拷贝数进行了检测;另外,检测了线粒体相关基因Grm2、Drd2、Polg2、TFAM的表达变化及其调节区的DNA甲基化的调节。
  本研究主要内容包括:⑴利用实时荧光定量PCR的方法检测了小鼠2-细胞胚胎中ZGA相关基因(Zscan4、MuERV-L、Eif-1a、Hsp70.1)及ROS相关基因(Nox1、Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表达,并利用ROS特异性染料DCFH-DA对胚胎胞质内ROS水平进行检测。首先比较了阻滞品系小鼠KM与非阻滞品系小鼠BDF1受精卵在M16培养液中发生阻滞的情况,结果表明,在M16培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞发育率为44.2%,而BDF1小鼠受精卵的发育率为90.3%,KM小鼠2-细胞胚中ZGA相关基因MuER V-L、Eif-1a的表达量显著低于BDF1小鼠2-细胞胚(P<0.05)。KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平明显低于BDF1胚胎,ROS相关基因Gpx6和Prdx2的表达显著高于BDF1小鼠。以上研究表明,小鼠胚胎发育阻滞与ZGA相关基因表达有关,ROS水平的差异反映出不同品系小鼠胚胎对ROS的耐受性不同。⑵利用M16培养液和KSOM培养液比较了阻滞品系KM小鼠胚胎在不同培养液条件下的发育。结果显示,在KSOM培养液中,KM小鼠受精卵的4-细胞率为90.8%,不发生2-细胞阻滞。KSOM培养液中培养的KM小鼠2-细胞胚胎Eif-1a、Hsp70.1表达量显著高于M16培养液中培养的2-细胞胚胎。两种培养液中的KM小鼠2-细胞胚胎的胞质内ROS水平和ROS相关基因表达无明显差异。以上研究表明,小鼠胚胎体外培养液成分的不同影响ZGA相关基因表达的变化,对小鼠胚胎发育阻滞产生影响。⑶探究了ROS在小鼠体外发育2细胞阻滞胚胎中对线粒体相关机能的影响。使用AAPH处理昆明白小鼠体外受精卵,通过荧光探针检测处理组和对照组中线粒体膜电位、线粒体ROS(mtROS)及线粒体分布状态的变化,并利用实时荧光定量PCR检测ROS相关基因、线粒体相关基因(Grm2、Drd2、Polg2、TFAM) mRNA的表达量及mtDNA的拷贝数,利用重亚硫酸盐测序(BSP)检测了线粒体四个相关基因的甲基化变化。研究结果显示,使用1.0 mmol/L浓度的AAPH分别处理的胚胎,具有较高的阻滞率(66.16%)和较低的损伤率(24 h畸形率9.09%,48 h死亡率10.39%),ROS染色实验结果显示,AAPH处理能够使胚胎内胞质ROS水平明显升高,所检测的ROS相关基因mRNA表达量升高。1.0 mmol/L处理后二细胞期胚胎线粒体膜电位及mtROS水平明显高于对照组,mtDNA的拷贝数增加,实时荧光定量PCR结果显示,处理组与对照组的Grm2、Drd2、Polg2、TFAM基因表达量呈现显著性差异,处理组Grm2、Drd2表达显著低于对照组,处理组Polg2、TFAM表达显著高于对照组。利用亚硫酸盐测序(bisulfite genomic sequencing,BSP)方法检测DNA甲基化的结果,AAPH处理之后的胚胎中基因调节区DNA甲基化水平升高;Polg2、TFAM甲基化水平降低。以上研究表明,AAPH处理引起的氧化应激反应及发育阻滞的胚胎中,线粒体活性升高,线粒体数目增加,线粒体相关基因表达变化,表明线粒体参与调节细胞内ROS的动态平衡,ROS可能通过影响线粒体相关基因启动子区DNA甲基化的变化调控线粒体相关基因的时序性表达。
[硕士论文] 吴雪臣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:从出生到青春期,作为雌性配子的卵母细胞一直停滞在第一次减数分裂的前期,又称生发泡(Germinal Vesicle,GV)期。只有在青春期后,受到激素刺激的卵母细胞才会发生生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD),进而开始恢复减数分裂,而只有恢复减数分裂并发育成熟的卵母细胞,才有可能与精子结合形成受精卵。哺乳动物卵母细胞中,磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)水平的变化引起的环腺苷酸(cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)水平的下降被认为是引起GVBD的主要原因。cAMP相关抑制剂如PDEs抑制剂和cAMP激活剂等,能可逆地抑制GVBD。
  本研究选用PDEs抑制剂Milrinone(Mil)、3-Isobutyl-1-Methylxanthine(IBMX)和cAMP激活剂Forskolin、dibutyryl cAMP(dbcAMP)四种药物分别进行单独或组合使用,以便于我们摸索出一套对卵母细胞成熟抑制效果最佳、对卵母细胞毒性最小的抑制剂配方。结果表明,在单独使用每种抑制剂的实验中,Mil,IBMX,Forskolin和dbcAMP能够达到抑制GVBD的最小浓度分别为3.0μM、30.0μM、450.0μM和150.0μM。为了进一步验证将各类抑制剂组合使用,能否获得更佳的配方,我们将不同种类和浓度的抑制剂进行组合,结果发现50.0μM Forskolin+0.3μM Mil,50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX,50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil,50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX四种组合能够获得更好的抑制GVBD效果。在此基础上,以不含任何抑制剂的培养液为对照组,含有不同种类抑制剂的培养液作为实验组,对卵母细胞的GVBD进程进行了检测,结果发现,含有抑制剂的实验组与对照组相比,GVBD进程不完全一致,但各组的最终GVBD率没有显著差异。比较了不同抑制剂对卵母细胞第一极体(First Polar Body, PB1)排放的影响,结果显示,三个实验组在PB1排放速率和最终排放率上与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μMdbcAMP+10.0μM IBMX;另有三个实验组只在最终PB1排放率上和对照组没有显著差异,包括:150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil。此外,我们比较了各组之间排放的PB1体积,结果发现,经50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μMIBMX或50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX三组处理过的卵母细胞所排放的PB1体积较小,并且与对照组没有显著差异。检测了抑制剂对卵母细胞早期凋亡、DNA损伤和线粒体分布的影响,结果发现,经五种抑制剂处理卵母细胞后,其早期凋亡率与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。经三种抑制剂处理卵母细胞后,其DNA损伤程度与对照组没有显著差异,包括:50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0.μM IBMX。在线粒体分布指标方面,只有50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX组与对照组没有显著差异。研究表明:不同种类抑制剂经过浓度调整和组合使用,可以更好的将卵母细胞阻滞在GV期,并且对卵母细胞的毒性作用最小。由此,我们摸索出了新一代最佳抑制剂组合,即50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。这一配方可为日后研究卵母细胞成熟机理提供有效帮助。
[硕士论文] 翁雷
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:X染色体失活是雌性哺乳动物早期胚胎发育的重要事件,而非编码基因Xist是X染色体失活的关键调控因子。Xist RNA通过包被即将失活的X染色体并使其发生沉默。而在分化细胞的重编程过程中,失活的X染色体伴随着Xist的下调而发生重活化,在ESC中,多能性因子(如NANOG,SOX2和OCT4等)结合到Xist基因的第一内含子区,以稳定ESC的多能性状态。但有研究报道,Xist的表达不会因为敲除第一内含子而受到影响,也不能提高诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的制备效率。而结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物的抑制性体外转录因子(Transcriptional-activator-likeeffectors based designer Transcription Factors, Tale-dTFs)Repressor6(以下称R6)显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)向iPSC的诱导效率。本研究利用Xist抑制性Tale-dTF R6成功制备了R6-MEF细胞系,并通过细胞生长曲线制备、免疫荧光染色、实时定量PCR及流式细胞仪筛选分析等技术手段,证明了该R6-MEF细胞系具有不同于野生型MEF细胞系的特点。
  本研究主要内容包括:⑴利用脂质体转染法制备的R6-MEF细胞形态类似于低代次的野生型MEF细胞系,呈短梭状,而生长速率明显高于野生型MEF细胞系;R6-MEF细胞系可传至50代以上,且未见明显异常。⑵实时定量PCR结果显示,R6-MEF中的多能性基因Nanog、Sox2、Oct4及生殖相关基因Prdm14均有不同程度的上调;但R6-MEF中NANOG的免疫荧光染色结果呈阴性;而雌性R6-MEF中H3K27me3的免疫荧光染色结果显示,R6在一定程度上降低了该表观遗传修饰的印迹水平。⑶流式细胞分选结果显示,野生型MEF细胞系中的GOF-GFP呈阴性,而R6-MEF细胞系中的GOF-GFP呈弱阳性。⑷核型分析结果显示,R6-MEF细胞与野生型小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的染色体均为40条,未见明显异常。
[硕士论文] 栗前
人体解剖与组织胚胎学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:本文对小鼠胚胎心脏房室管发育及Lef1的表达规律进行了研究,本研究分为两个部分:
  第一部分:小鼠胚胎心脏房室管发育及Lef1的表达规律。
  目的:探讨小鼠胚胎心脏房室管分隔、重塑过程以及Le f1在房室管发育过程中的表达规律。
  方法:25只胚龄10~15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片,用抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱa单克隆抗体(MLC2a)、抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱ多克隆抗体(MLC-2)、抗Tbx3多克隆抗体(Tb x3)、抗淋巴增强因子1单克隆抗体(Le f1)进行免疫组织化学染色和免疫荧光化学染色。
  结果:胚龄10~15d,房室管心肌呈MLC2a阳性、MLC-2阴性,同时表达Tbx3、Le f1。胚龄10d,心内膜垫形成。胚龄11~12d,房室管心内膜垫内细胞 Le f1强表达,心外膜形成。胚龄12~13d,背腹侧房室管心内膜垫相互靠近且融合形成房室瓣,心外膜来源间充质细胞数量增加,部分表达 Le f1。胚龄13d开始,部分心外膜来源间充质细胞穿过心肌延伸入壁侧房室瓣。胚龄15d,房室瓣膜基部直接与MLC2a阳性的房室管心肌相连。
  结论:小鼠胚胎房室管心肌发育为成体心脏房室环瓣膜基部的心肌;在小鼠胚胎心内膜垫融合、房室瓣形成过程中,Le f1在心肌和心外膜来源间充质细胞均有表达。
  第二部分:转录因子Tbx3与小鼠胚胎第二生心区发育。
  目的:探讨转录因子Tbx3在小鼠胚胎SHF的时空表达模式及其对SHF的调节作用。
  方法:30只胚龄9~15d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片,用抗胰岛素增强子结合蛋白1多克隆抗体(isl1)、抗心肌肌球蛋白重链单克隆抗体(MHC)、抗心肌肌球蛋白轻链Ⅱa单克隆抗体(MLC2a)、抗 Tbx3多克隆抗体(Tbx3)进行免疫组织化学染色和免疫荧光化学染色。
  结果:胚龄10~12d,咽腹侧间充质细胞is l1阳性表达逐渐增多,此期Tb x3的表达在咽腹侧内胚层减弱,在邻近腹侧内胚层的间充质细胞逐渐开始表达。胚龄9~11d,咽腹侧间充质is l1阳性细胞经动脉囊壁、心包腔背侧壁延续至流出道远端壁,Tb x3在这些部位均呈阴性。而流出道远端壁 M HC呈弱阳性表达。在静脉端,咽腹侧的is l1阳性细胞经心背系膜延伸至DMP内,DMP内可见Tb x3散在表达。胚龄12~13d,SHF is l1呈阳性表达的细胞在动脉端延伸进入分隔后的动脉壁,该部位缺乏 Tbx3表达;在静脉端,DMP逐渐开始心肌化,同时可见Tb x3阳性细胞分布。胚龄15d,DMP心肌化完成,Tb x3阳性细胞与室间隔顶部的房室束的阳性细胞相延续。
  结论:Tbx3并未对 SHF前体细胞的迁移与分化进行直接的调节,但可能对其存在与增殖具有调节作用,且在 pSHF的调节作用与动脉端SHF不同。
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