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[博士论文] 田甜
结构生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:在有丝分裂的过程中,偶联的姐妹染色单体准确平均分配到两个子细胞中,完成遗传物质的传递,对于维持遗传稳定性和物种连续性至关重要。姐妹染色单体的平均分离主要依赖于动粒在着丝粒区的组装。着丝粒是染色质上一段结构和功能都高度特化的区域,在该区域H3被其变体CENP-A所替代。动粒是在着丝粒区组装的一个大的蛋白复合体,负责为姐妹染色单体与纺锤体微管的连接建立承载区。动粒主要包括:内层CCAN蛋白质网络和外层KMN蛋白质网络。CCAN蛋白网络又可划分成五组亚复合物:CENP-C、CENP-LN、CENP-HIKM、CENP-TWSX和CENP-OPQUR。其中,CENP-N能够特异性识别CENP-A核小体,招募CENP-L,完成CENP-A所携带遗传信息的解码和起始动粒蛋白的招募。
  在本文第一篇中,我们解析了CENP-LN/CENP-A-NCP复合物的冷冻电镜结构,整体分辨率为5.8(A)。CENP-N通过其C端约100个氨基酸与CENP-L相互作用,形成一个异二聚体,与溶液中聚集状态相吻合;通过其N端约200个氨基酸与CENP-A核小体直接相互作用,其中,CENP-A L1 loop上的R80、G81和D83对CENP-N特异性识别CENP-A核小体具有重要作用,另外,CENP-N氨基端的碱性氨基酸还可以与核小体DNA上的四个位点的磷酸骨架直接相互作用,进一步稳定两者的结合。DNA上的这四个位点分别为:第+37/+36位核苷酸、第-32/-31位核苷酸、第+26/+25位核苷酸和第-22/-21位核苷酸。我们通过体外结合实验验证了CENP-N上与DNA结合的关键氨基酸残基有K10A、R11A、R44A和H77A。在体内,与DNA相互作用的关键氨基酸位点的突变,显著减弱了CENP-N自身及CENP-L等动粒蛋白的定位,说明CENP-N与核小体DNA的结合,对CENP-N在动粒上的定位和其他动粒蛋白的招募至关重要。而且,在不同物种中,为了维持这种“解码”机制的保守性,CENP-N可与CENP-A共同进化。
  糖酵解过程是所有生物体进行葡萄糖代谢产生ATP供能的必经阶段。在糖酵解过程中,己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶被认为是关键酶,有它们催化的反应是不可逆的。其中,磷酸果糖激酶的催化效率较低,是最为重要的调控关键酶,功能单位为四聚体,以ATP为磷酸供体,催化F6P转变为FBP,并产生一分子ADP。它是一种经典的别构酶,通过R-state和T-state的构象转变来调节自身的催化活性。
  在本文的第二篇中,我们利用E.coli表达了金黄色葡萄球菌的Pfk,它在溶液中存在二聚体和四聚体两种状态,且蛋白浓度越高四聚体越多,而且这种四聚体状态可以被低pH,或ADP,或ATP,或AMP-PNP诱导解离为二聚体形式,但是也可以被其底物F6P所稳定。我们通过解析Pfk及其与不同配体复合物的结构发现:Sa_ Pfk、Sa_Pfk/ADP、Sa_Pfk/ATP和Sa_Pfk/AMP-PNP的结构为二聚体,Sa_Pfk/F6P和Sa_Pfk/F6P/AMP-PNP的结构为四聚体。通过结构分析,我们认为Sa_Pfk所特有的G150-L151 motif的柔性赋予了α7-helix“开关”的功能,在F6P的协同作用下,调节自身二聚体-四聚体间的转换,从而调控酶的催化活性。
[硕士论文] 赵雅君
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:2006年日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)首次利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入体细胞中,成功建立小鼠诱导多能性干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)。实验证明iPSCs已经可以分化为心肌细胞、视网膜细胞以及造血细胞等,对临床研究具有极大意义。本研究室以自主开发的新型干细胞诱导技术为基础[1],将小鼠iPSCs放入添加四种生物活性因子ABCL(Activin A,BMP4,CHIR99021和mLif)的基础培养液中,使其诱导为一种更具多能性的新型干细胞(iPSC-advanced pluripotent stem cells,iPSC-ASCs)。
  实验结果如下:
  1、通过脂质体将六种转录因子Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Rarg及Lrh1的组合转入小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),使其成功转化为iPSCs。两种不同iPSCs系在ABCL中培养,诱导出iPSC-ASCs,其AP染色均为阳性,与iPSCs无显著差异。
  2、免疫荧光染色检测了胚层分化基因Cdx1、Sox17、以及细胞周期调控因子c-Myc在蛋白水平的表达。结果显示所用的两种iPSC-ASCs细胞系的Cdx1和c-Myc蛋白表达均比对照组iPSCs高。
  3、RT-qPCR结果显示,iPSCs和iPSC-ASCs的多能性基因Oct4,Sox2,Nanog表达与MEF相比均显著提高。而且在形态扁状的Flat-iPSCs(F-iPSCs)诱导出的F-iPSC-ASCs中,发现Oct4,Sox2,c-Myc,T,K18,Gata4基因与iPSCs相比表达均上升,而在形态圆状的Round-iPSCs(R-iPSC)及R-iPSC-ASCs中未得到同样的结果。
  4、通过嵌合体制备检测iPSC-ASCs的发育潜能。实验结果显示iPSC-ASCs细胞系可贡献到10.5天的胎儿和卵黄囊,又可贡献到胎盘,而且iPSC-ASCs细胞系可进入13.5天胚胎的生殖嵴。
  5、把iPSC-ASCs和iPSCs直接培养在基础培养基N2B27中,观察其分化状态。在培养到第六天,iPSC-ASCs和iPSCs基本全部分化,相对于iPSCs,iPSC-ASCs更容易向中胚层分化。
  综上所述,本实验利用化学成分明确的培养条件建立了的iPSC-ASCs与iPSCs相比,在基因表达水平和发育潜能等方面,iPSC-ASCs更具有多能性,是一种新型诱导多能性干细胞系。
[硕士论文] 何爱华
养殖 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究拟以小鼠肌肉C2C12细胞系为研究材料,构建骨骼肌细胞热应激模型,通过两个试验:1)考察热应激对小鼠肌肉C2C12细胞分化的影响,并考察在此过程中硒蛋白表达的变化;2)比较两种不同硒源对小鼠肌肉C2C12热应激的缓解效应并探索其可能机制。主要内容及结果如下:
  实验一:热应激对小鼠C2C12成肌细胞分化及硒蛋白表达的影响。
  选择小鼠C2C12成肌细胞作为试验材料,构建肌肉细胞热应激模型,考察热应激对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响,同时考察硒蛋白表达的变化。采用单因子试验设计:C2C12细胞首先于37℃二氧化碳培养箱中培养2~3d至铺板率达到80%;然后分成2组进行成肌分化诱导:对照组于37.0℃培养4、6、8d;热应激组于41.5℃培养4、6、8d,采用定量PCR技术考察24个硒蛋白基因、2个分化相关基因、2个能量调控基因和2个凋亡基因表达,采用Western-blot考察了HSP70、MYOGENIN蛋白及5个硒蛋白的表达。
  研究结果表明:(1)热应激抑制了C2C12细胞分化和损伤了肌肉肌管的发育,下调了(P<0.05)C2C12细胞MYOD、MYOGENIN基因和MYOGENIN蛋白的表达,同时上调(P<0.05)HSP70、BCL-2/BAX基因和蛋白表达;(2)热应激4、6和8d后分别上调了(P<0.05)C2C12细胞中18、11和8个硒蛋白基因,热应激6和8d后仅下调(P<0.05)了DIO2基因表达;(3)热应激6d上调了(P<0.05)C2C12细胞GPX1、GPX4和SELENON蛋白的表达,下调了(P<0.05)SELENOS蛋白的表达。热应激对骨骼肌细胞成肌分化造成损伤的同时伴随着大量的硒蛋白基因和蛋白的上调表达,这预示着硒蛋白在热应激条件下可能对分化的骨骼肌细胞起着某种保护作用。
  试验二:不同硒源对小鼠C2C12成肌细胞热应激的缓解效应及机制研究
  考察不同硒源(硒代蛋氨酸SeMet和亚硒酸钠SS)的添加对分化的小鼠C2C12成肌细胞热应激缓解作用及细胞中硒蛋白表达的影响。C2C12细胞在37℃完全培养液中培养至80%融合时,换2%马血清诱导培养基进行分化诱导,细胞四个处理组:CK组在37℃培养;HS组:在41.5℃培养;HS+SS组:添加终浓度为0.50μmolSe/L的SS后,在41.5℃培养;HS+SeMet组:添加终浓度为0.50μmol Se/L的SeMet后,在41.5℃细胞。处理4、6、8天后收集样品,采用定量PCR技术考察24个硒蛋白基因、2个分化相关基因、2个能量调控基因和2个凋亡基因表达,采用Western-blot考察了HSP70、MYOGENIN蛋白及3个硒蛋白的表达。
  研究结果表明:(1)热应激抑制C2C12成肌细胞分化,并伴随着MYOD和MYOGENIN基因,以及MYOGENIN蛋白表达的降低,同时上调了HSP70基因和蛋白的表达;(2)热应激4、6和8d分别上调(P<0.05)14、10和14个硒蛋白基因的表达,分别下调(P<0.05)1、4和3个硒蛋白基因的表达;(3)与HS组相比,添加SS和SeMet后在不同的时间段均不同程度恢复上调了AMPK、MYOGENIN和MYOD基因以及MYOGENIN蛋白的表达,降低了HSP70基因和蛋白表达、总体而言SeMet组缓解效果优于SS组;(4)与HS组相比,添加SS和SeMet后不同程度恢复上述变化的硒蛋白的表达,硒蛋白基因的表达丰度更接近CK组,总体而言SeMet组与SS组相比硒蛋白基因表达模式更接近CK组;(5)添加SS和SeMet均显著上调(P<0.05)了热应激4d对蛋白SELENON表达,而添加SeMet在热应激6d时SELENON蛋白表达接近正常组。
  综上所述,热应激抑制了小鼠C2C12成肌细胞分化,降低了小鼠肌肉C2C12细胞分化相关基因和蛋白表达,上调了HSP70基因和蛋白表达,与此同时众多硒蛋白基因的表达受到影响,预示这些硒蛋白与细胞热应激的调控之间存在密切的关系;添加SS和SeMet后均可在一定程度上缓解热应激对HSP70和分化相关基因(MYOD和MYOGENIN)和蛋白的影响;SS和SeMet可能是通过调控硒蛋白基因的表达进而发挥缓解细胞热应激的作用。总体而言,在小鼠成肌细胞中有机硒(SeMet)对热应激的缓解作用优于无机硒(SS)。
[硕士论文] 刘悦石
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠上胚层干细胞(mouse epiblast stem cells,EpiSCs)是一种来源于5.5-7.5胚龄(E5.5-7.5)的着床后的胚胎上胚层(epiblast)组织的多能性干细胞。EpiSCs的自我更新能力和多能性的维持主要依赖激活素Activin A(Nodal)/Smad和促成纤维细胞生长因子(FGF/ERK)信号对细胞多能网络进行调控。相比小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,ESCs)的原始(na?ve)状态,EpiSCs被视为一种初发(prime)状态。EpiSCs无论在细胞形态、发育潜能和多能性维持分子机制上都与ESCs具有本质上的区别。
  本研究利用化学成分明确的培养条件,即只添加Activin A和bFGF两种生物活性因子(AF培养条件),在无血清无饲养层细胞的条件下培养小鼠着床后胚龄6.5天(E6.5)的原肠期的上胚层(epiblast)建立AF-EpiSCs细胞系,并对所建立的细胞系进行鉴定。此外,利用本实验室已成熟的诱导体系ABCL,即:Activin A,骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP4),CHIR99021和小鼠白血病抑制因子(mouse leukaemiainhibitoryfactor,mLIF)进一步诱导AF-EpiSCs,建立更具多能性的干细胞,命名为post-ASCs(post-Advanced Stem Cells)。并从蛋白水平、分子水平和发育潜能等方面检测post-ASCs的多能性。
  1.建立AF-EpiSCs细胞系
  通过观察AF培养条件下建立的AF-EpiSCs细胞形态学变化、检测细胞生长、染色体核型、免疫荧光、实时荧光定量PCR和体内畸胎瘤分化能力等一系列实验结果,发现利用无血清无饲养层细胞的条件下建系获得的AF-EpiSCs与传统方法建立的EpiSCs的特性基本相同,既具有多能性又具备无限自我更新能力。
  2.post-ASCs多能性检测
  由AF-EpiSCs诱导获得的post-ASCs克隆形态呈圆球状;与ESCs相比,post-ASCs细胞增殖速度更快;碱性磷酸酶染色呈阳性;诱导后染色体数目未出现异常;表达Oct4,Sox2,Nanog,Klf4等多能性基因,且表达水平与ESCs相似。
  3.post-ASCs发育潜能检测
  畸胎瘤实验结果显示,post-ASCs在体内能分化形成内中外三胚层组织;通过制备嵌合体的技术,证明post-ASCs能贡献到E13.5的胎儿及生殖嵴,且能产生健康的嵌合体;更重要的是与ESCs相比,post-ASCs还能贡献到胎盘和卵黄囊组织。
  综上所述,本实验利用化学成分明确的培养条件建立了AF-EpiSCs,并进一步诱导形成post-ASCs。与ESCs相比,在基因表达水平和发育潜能等方面,post-ASCs更具有发育潜能,是一种新型多能性干细胞系。但是关于post-ASCs发育潜能及多能性维持的机理仍需进一步研究。
[硕士论文] 刘子辉
应用化学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:细胞是生命的基本组成单位。在科学技术不断进步的今天,研究细胞的结构、功能与行为依然是科学工作者们不断探索的重要课题。传统的研究大多针对整个细胞群体,将细胞群体中每个细胞的平均水平作为研究依据,忽略了细胞与细胞之间的差异。这类差异是由细胞自身的差异及其所处于的微环境的差异所引起的,对于充分理解生理条件下组织微环境的细胞特异性和复杂性具有重要意义,因此,从单细胞水平对细胞进行研究是当前细胞研究工作中的重要发展方向。微量元素作为生命活动中的重要组成部分,能够影响生命活动中的各个环节,也是单细胞分析的研究对象之一。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)作为目前元素分析最为重要的手段之一,具备优异的元素检测能力。能够在单细胞水平检测细胞自身元素含量,同时也能够分析外源性元素(如药物吸收,元素标记等)在单个细胞上的水平。利用ICP-MS进行单细胞分析的研究近年来取得了长足的进步,有望在化学、生物领域发挥重要作用。
  本论文的研究目的在于考察单细胞分析过程中各条件参数对于单细胞分析结果的影响;将单细胞ICP-MS(Single cell ICP-MS,SC-ICP-MS)方法分别应用于酵母、猪精子细胞,对细胞本身的元素含量水平进行了考察,同时分别考察了两种细胞对外源性元素的吸附情况。本文的研究主要包含以下内容:
  (1)以酵母细胞为研究对象,建立了单细胞元素分析方法,实现了单个酵母细胞水平上的Mg、K、Mn、Cu、Zn的定量分析。并考察了积分时间(dwell time)为0.1-10ms间的单细胞信号差异,信号-背景比的变化趋势、检出限、及细胞计数能力。以标准溶液对单细胞信号进行定量,并确立了短积分时间条件下定量方式。结果表明:单细胞信号持续时间约为0.8~1ms;定量结果同酸消解定量较为一致;短积分时间下能够得到较高的细胞信号-背景比值,同时得到更低的检出限。
  (2)在酵母ICP-MS单细胞分析的基础上,将该方法应用于猪精子细胞分析。考察了猪精子细胞经雾化后的细胞完整性、细胞破碎前后元素信号的差异、以及对肿瘤药物顺铂的吸收情况。实验结果表明细胞由雾化器雾化后仍保有完整的细胞结构;细胞经破碎后,不同元素单细胞信号的变化呈现出不同趋势。同时从单细胞水平考察了精子细胞对抗肿瘤药物顺铂的摄入情况,结果表明,猪精子细胞中Pt含量同顺铂的孵育浓度及时间都呈正相关,同时单细胞水平上的Pt含量随着孵育浓度及时间的增加均为达到饱和,体现出顺铂通过自由扩散进入胞内的特点。
[硕士论文] 孔祥菲
微生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:减数分裂是真核生物有性生殖的必经过程。通过一轮的DNA复制和两轮的染色体分离,形成染色体数目减半的配子。双方的配子结合形成合子,使子代的染色体数目最终与亲本相同,维持物种的遗传稳定。同时由于减数分裂过程中非姊妹染色单体的自由组合和同源重组,产生的子代具有不同于亲本的新性状,是物种适应环境变化、不断进化的重要机制。人类减数分裂缺陷会造成包括唐氏综合征在内的多种疾病,甚至严重影响人类生命。深入研究减数分裂的分子机制,对于临床研究治疗和促进人类健康具有重要意义。
  减数分裂第一次分裂(MI)前期分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期五个时期,其中同源重组修复起始于细线期的双链断裂,之后经过链入侵、Double Holiday Junction等过程,最终产生CO。CO是减数分裂染色体正确分离的重要保证,研究减数分裂前期的关键事件是研究整个减数分裂进程的重要切入点。
  R-loop是一种三链核酸结构,包括RNA和它的模板DNA缠绕形成的杂合双链和一条非模板DNA单链,主要产生于转录过程。研究表明,R-loop的非模板单链裸露在外、易受破坏,进而造成基因组的不稳定性。细胞体内的R-loop结构在DNA复制、基因转录、基因表达调控等多种生物过程中具有重要作用。细胞中R-loop受多种途径的精密调控。其中最重要的是核糖核酸酶RNH1和RNH2对R-loop的降解作用。RNH1和RNH2具有功能冗余,两者都能够特异性的识别R-loop中的RNA链并对其进行切割从而去除R-loop。细胞中的THO复合物能够及时运输新转录出的RNA至细胞质中,从而降低R-loop形成的几率;SEN1解旋酶可以特异性的打开DNA∶RNA双链。多种途径协调作用将细胞体内的R-loop控制在合理的范围内。
  本文采用的实验材料为真核生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,该生物具有生长快、遗传操作简单、单倍体和二倍体细胞稳定并且四分体孢子易分离等特点,被广泛应用于诱变、重组、染色体分离、表达调控等遗传学研究的各个领域。我们构建了R-loop相关的rnh1Δ、rnh2Δ、hpr1Δ等突变体,发现单突变体减数分裂R-loop含量与野生型相比无明显变化,从DNA复制、减数分裂过程及最终的孢子存活率来看,均未对减数分裂造成明显影响。而在双突变菌株中,R-loop含量明显上升,孢子存活率显著降低。多突变菌株减数分裂前DNA复制时间增加。由此可知,R-loop含量的变化对减数分裂有重要影响。该发现对我们进一步研究R-loop对减数分裂的调控以及有丝分裂和减数分裂过程中R-loop的功能差异提供了重要借鉴。
[硕士论文] 贾为宾
化学工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:细胞是生物体的最小结构单元,细胞膜则是细胞最重要的组成部分之一。细胞膜由双亲性磷脂分子、胆固醇以及膜蛋白等组成,这种特殊的膜结构在细胞活动中发挥着重要作用,如在信号传导和物质运输等过程。在真实的生物体系中,细胞膜的作用机理非常复杂,在时间和空间上尺度有很大跨度,以至于现有的实验条件和技术水平很难确定细胞膜的作用机理。
  近些年,随着计算机水平的发展和生物模型的不断优化,使用计算机模拟生物体系的研究成为热点。本文主要采用分子动力学模拟方法,以磷脂膜、多肽、抗菌分子和膜蛋白为研究对象对细胞膜进行了研究。主要研究内容为以下两个方面:
  1.磷脂膜与抗菌肽、抗菌分子之间的相互作用。研究包括:抗菌肽在水中和磷脂膜表面的结构变化,细胞环境对抗菌肽形成膜孔的影响,以及抗菌分子对磷脂尾链的扰动及对膜结构的破坏。
  (a)采用全原子分子动力学模拟方法研究爪蛙素抗菌肽和CM15抗菌肽的结构变化在磷脂膜表面的成孔机理,从而实现穿膜。模拟发现CM15抗菌肽在水中会两两聚集,同时螺旋结构解螺旋为折叠结构。爪蛙素抗菌肽在水中和膜表面都会聚集。在水中时爪蛙素抗菌肽会解螺旋成无序结构,在膜表面时会先解螺旋成无序结构再转变为折叠结构。在单膜模型中加入外加电场时,抗菌肽更加容易的在膜上成孔,电场强度越大越容易形成膜孔。在双膜模型加入离子对形成跨膜电势后,抗菌肽的存在也会增加跨膜电势,所以抗菌肽在外加离子对的情况下也是更容易形成膜孔。这一结论证明了细胞环境以及抗菌肽结构对于其形成膜孔都有重要影响。
  (b)采用全原子分子动力学模拟方法研究抗菌分子对磷脂膜的扰动。将主体为吡咯二吡咯和季胺化结构的抗菌分子分别以水平和垂直方式放置到膜中心。抗菌分子在膜中心会以两种形式保持稳定结构,分别为跨膜结构和U型结构。抗菌分子形成跨膜结构之后会影响磷脂膜厚度,链长为6和8个碳原子的抗菌分子使膜变薄。跨膜结构的抗菌分子还会使磷脂尾链的有序度降低,破坏膜结构。由于季胺化结构氮原子带正电荷,还会与POPG磷脂头基相互作用,影响磷脂分布。模拟结果可以为以后设计抗菌分子提供指导。
  2.磷脂膜分相现象研究。主要研究多组分磷脂膜的相分离机理,以及膜蛋白对磷脂分相的影响。通过模拟发现磷脂分相主要由两个条件控制,分别为磷脂尾链的不饱和度以及磷脂尾链相对长度。当磷脂尾链不饱和程度差异较大时,磷脂会自发的分相为由饱和磷脂与胆固醇形成的有序相以及不饱和磷脂形成的无序相,而且随着胆固醇浓度的增高,分相程度也越高。当饱和磷脂尾链与不饱和磷脂尾链长度差异较大时会形成错位式分相,差异较小时则会形成对位式分相。由于有序区域排列紧密而无序区域排列稀疏,所以膜蛋白会分布在无序相中。而且膜蛋白的存在会影响分相结构,从而使其周围由错位式分相变化为对位式分相。
[硕士论文] 刘滨
物理化学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:原始细胞膜为原始生命的形成提供了“区隔”,使得原始细胞与环境间的物质交换和能量交换、代谢、生长-分裂自复制等过程成为可能,在生命起源中扮演着至关重要的角色。目前作为原始细胞膜的模型体系有:脂质体、脂肪酸囊泡、无机纳米颗粒团聚物、团聚体液滴和油滴等。
  粘土矿物具有荷电性、高比表面积和选择吸附性,可屏蔽紫外线,并且能够提供一个发生聚合反应的模板来催化氨基酸、多肽、蛋白质等关键生物分子的合成。由于粘土颗粒的特殊结构和性质,它有可能为原始生命的起源提供场所。本文以人工合成的阴离子粘土(LDHs)作为粘土矿物的模型体系,研究了LDHs与蛋黄卵磷脂脂质体的相互作用,考察了LDHs在双层膜表面吸附以及迁移(跨膜动力学)微观过程,提出了可能的跨膜机理。
  单一单链双亲分子囊泡体系在原始地球环境相关性、渗透性、易制备性和自复制能力等方面逐渐被认为是更为合理的原始细胞膜模型。本文合成了至今鲜有报道的十二烷基硫酸(DHS),并将其作为原始细胞膜模型的构筑单元。研究了DHS水溶液的相行为,表征了DHS囊泡的物理化学性质,考察了其作为原始细胞膜模型的原始生物膜特性,如选择渗透性、快速交换能力、生长-分裂自复制能力、原始地球极端环境条件下的稳定性等。此类新型原始细胞膜模型的构筑,帮助我们了解原始生物膜的本质特征,为早期地球环境中细胞的诞生和生命的起源提供信息。
  本文主要研究内容和结果:
  (1)制备并选取了粒径约为2μm的蛋黄卵磷脂质体(EYL)作为原始细胞膜模型,研究了EYL膜对钙黄绿素和尼罗红荧光染料的渗透性。研究了不同粒径(100nm、500nm)的阴离子粘土(LDHs)与EYL双层膜的相互作用(吸附、跨膜、双层膜形貌变化等)以及形成的LDHs/EYL的时间稳定性等,探讨了LDHs颗粒与脂质体双层膜相互作用的机理,以期初步认识LDHs颗粒与原始细胞膜模型之间的相互作用规律,为它们在生命起源中扮演的角色提供线索。
  (2)合成了具有原始地球环境相关性的简单单链双亲分子十二烷基硫酸(DHS),系统地研究了DHS水溶液的相行为。通过表面张力法、浊度法、荧光探针法以及摩尔电导率的测定,结合目测法、电子显微镜以及动态光散射等方法,确定了DHS的临界聚集浓度(CAC)为0.4mM,室温下DHS的溶解度为10mM。在不添加任何助表面活性剂的条件下,当体系pH值接近其表观pKa(3.11)时,DHS在水溶液中自发形成囊泡。DSC测试以及荧光染料的包覆与释放实验证明,DHS囊泡形成机理是质子化的DHS与去质子化的DHS之间形成了氢键二聚体,进而组装为囊泡结构。
  将制得的DHS囊泡体系作为一种新型的原始细胞膜模型,并考察了其原始生物膜特性:(i)选择渗透性。细胞膜能够透过小分子染料(如钙黄绿素、尼罗红)及离子(如K+、Cl-),然而不能透过大分子(牛血清蛋白);(ii)快速交换和自复制能力。在过量十二烷基硫酸钠胶束存在下,胶束(←→)单体(←→)囊泡由于快速交换的存在会重新建立平衡,表现为DHS囊泡的生长-分裂自复制过程;(iii)极端条件下的稳定性。DHS囊泡表现出优越的时间稳定性(>1年),并且能够在强酸性(pH=3.0)以及极稀浓度(0.5mM)下形成并稳定存在。
[硕士论文] 丁萍
生物学;微生物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:线粒体基因组(mtDN A)编码氧化磷酸化(OXPHOS)系统中的一小部分跨膜成分。这些基因的正常表达确保了OXPHOS系统中的成分的合成。线粒体中的翻译起始是由两个通用的起始因子mIF2和mIF3协助的,细菌中mIF2和mIF3的同源蛋白对于蛋白合成和菌株的生长是不可缺少的。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,缺失mIF3/Aim23并没有取消线粒体翻译,而是使得蛋白含量不平衡。
  在本文中,我们研究了粟酒裂殖酵母(Schizosacchwomyces pombe)中,mIF2/Mti2(SPBC1271.15c)和mIF3/Mti3(SPBC18E5.13)蛋白对线粒体翻译的影响。首先,构建△mti2菌株和△mti3菌株。表型实验的结果表明,在发酵型培养基以及非发酵型培养基上,相对于yHL6381野生型菌株,△mti2菌株的生长受到了显著的抑制;△mti3菌株的生长没有受到抑制。Western Blot实验结果表明,Mti2和Mti3蛋白定位于线粒体基质;mti2基因的缺失使得mtDNA编码的Cob1、Cox1、Cox2、Atp6的稳定水平剧烈降低,而核基因编码的Cox4蛋白的稳定水平几乎不受影响。mti3的缺失并没有影响mtDNA编码的蛋白质的稳定水平。通过在体内用同位素标记由mtDNA编码的蛋白质的实验,我们发现,在△mti2菌株中,除了Cob1和Atp6以外,其它的由mtDNA编码的蛋白质的合成均受到了影响。敲除mti2基因后,mtDNA编码的蛋白质的合成受到了显著的影响,并且Cob1和Atp6蛋白也变得非常不稳定。因此,mti2基因与mtDNA的翻译紧密相关。它是通过影响mtDNA编码的蛋白质的合成,使组成电子传递链的复合体受到破坏,导致线粒体不能正常发挥功能。除此之外,通过蔗糖密度梯度离心分离线粒体核糖体大小亚基,初步的结果表明,Mti2与核糖体大亚基(LSU)的分布类似,Mti3与核糖体小亚基(SSU)的分布类似。
[硕士论文] 陈洁
生物学;生物技术 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:线粒体是真核生物中重要的细胞器,参与了许多细胞功能,包含通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸和脂肪酸合成、动物凋亡和衰老过程。粟酒裂殖酵母是研究线粒体基因表达的有吸引力的模式生物。
  在粟酒裂殖酵母中,线粒体基因组(mtDNA)是紧凑的,~19kb的线性DNA。它编码了OXPHOS复合体的主要亚基,如细胞色素b-c1复合体(复合体Ⅲ)亚基3(Cob1也称Cob或Cytb),细胞色素c氧化酶(复合体Ⅳ或COX)亚基1,2,3(Cox1,2,3)和ATP合酶(复合体Ⅴ)亚基(ATP6,8,9)。除此之外,S.pombe mtDNA编码了线粒体核糖体蛋白(Var1),线粒体核糖体的大小亚基(rnl和rns),25tRNAs和RNase P的RNA亚基。
  Mrz1蛋白是一个功能未知的蛋白,在本文中,我们主要研究了粟酒裂殖酵母中Mrz1蛋白在细胞中的定位与功能。通过构建Δmrz1菌株,发现mrz1基因缺失后在发酵型培养基上能够正常生长,在半乳糖或甘油的非发酵型碳源培养基上表现出生长缺陷,意味着Mrz1蛋白与线粒体的功能密切相关。通过提取线粒体后进行定位实验,发现Mrz1蛋白是一个线粒体外膜蛋白。通过实时荧光定量PCR,可以得出mrz1基因的缺失没有影响线粒体基因组编码的mRNA的积累。另外,利用[35S]-methionine/cysteine mix标记和Western blot实验检测Mrz1蛋白对线粒体基因组编码的蛋白水平的影响。我们发现mrz1基因缺失后线粒体基因组编码的蛋白能够正常合成,而线粒体基因组编码的蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Cox3的稳定性受到了严重的影响,意味着Mrz1蛋白对于线粒体基因组编码的蛋白的稳定性有着重要作用。mrz1基因缺失后,线粒体基因组编码的蛋白正常合成后由于不稳定而随之被降解,从而影响了线粒体呼吸链复合体的组装,导致了线粒体氧化磷酸化不能正常进行,使得线粒体功能受损。
[硕士论文] 李燕
生物学;生物技术 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:线粒体通过氧化磷酸化产生能量,并且通过呼吸链复合体电子传递链产生ATP。线粒体是一种半自主性细胞器,拥有自身的基因组。在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中,线粒体基因组(mtDNA)的表达对线粒体功能的发挥至关重要,并且线粒体基因组编码氧化磷酸化复合物的7个关键亚基。
  Mtf2蛋白(系统名:SPAC5D6.12)在芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中存在同源蛋白Nam1。已有文献报道,Nam1是一个定位于线粒体基质的蛋白,参与线粒体基因组编码的COX1,CYTB1以及ATP6的mRNA加工与稳定,Nam1对于COX1和CYTB内含子的剪接也是必要的,并且Nam1对线粒体基因组编码的蛋白合成的影响是全局的。
  通过实验室成员的前期实验,我们发现△mtf2菌株在非发酵型培养基上的生长受到强烈的抑制,由此我们推测mtf2基因与线粒体功能密切相关。在本论文中,我们主要研究了Mtf2蛋白在线粒体中发挥的具体功能。首先,我们发现Mtf2蛋白定位于线粒体基质,是一个可溶性蛋白。其次,通过qRT-PCR以及Northern blot实验,在含有线粒体内含子的背景下,敲除mtf2导致cox1mRNA水平显著性下降,并且引起cob1的mRNA的累积量明显减少,说明Mtf2蛋白对于cox1和cob1mRNA的累积是必不可少的。在不含有线粒体内含子的背景下,敲除mtf2不影响cox1和cob1的mRNA水平,但仍然强烈影响Cox1的合成,说明Mtf2蛋白对Cox1蛋白合成至关重要,是Cox1蛋白翻译的激活因子。最后,通过western blot实验分析,我们发现在不含有线粒体内含子的背景下,mtf2缺失菌株中几乎检测不到Cox1和Cox3蛋白,Cob1和Cox2的蛋白稳态水平也是显著性的降低,而核基因编码的蛋白Cox4稳态水平只有轻微的下降,说明mtf2缺失导致组成线粒体呼吸链上的复合体不能正常组装,最终导致线粒体功能受损。我们推测,在含有线粒体内含子的背景下,mtf2缺失对mtDNA中内含子剪接的影响可能是由于Cox1蛋白合成受损导致不能正常合成cox1内含子编码的成熟酶。
[硕士论文] 苏茹月
生物学;微生物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:线粒体是普遍存在于真核生物的一种细胞器,它不仅与ATP的合成有关,而且还参与细胞物质代谢以及细胞凋亡等生理过程。线粒体疾病的产生大多数是由于线粒体功能受损引起的,因此线粒体与人类健康有着密切的关联。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)在进化上与人类更为接近,在研究线粒体功能方面是一种优良的模式生物,因此线粒体也越来越受到研究者的青睐与关注。
  粟酒裂殖酵母线粒体是一种半自主型细胞器,其自身基因组能够编码25个tRNAs,2个rRNA,1个RNase P RNA,核糖体蛋白(Var1)和7个线粒体呼吸链复合体亚基包括复合体Ⅲ的Cob1亚基,复合体Ⅳ的3个大亚基(Cox1,Cox2,Cox3),复合体Ⅴ的3个亚基(Atp6,Atp8,Atp9)。粟酒裂殖酵母线粒体蛋白的翻译过程包括起始、延伸、终止,此过程需要多种蛋白因子共同参与调控。Mti2和Mti3是预测与线粒体翻译起始有关的蛋白,Mti2的发现是通过前期免疫共沉淀实验中Ppr10与Mti2有相互作用,因此,本文主要探究粟酒裂殖酵母中Mti2,Mti3的主要功能。
  首先构建mti2,mti3基因敲除菌,发现mti2基因敲除菌在以甘油为唯一碳源的非发酵型培养基上表现出生长缺陷,而mti3基因的缺失不表现出生长缺陷,由此推测mti2基因的缺失可能导致线粒体呼吸链功能受损。其次,通过改变培养温度以及培养时间,发现△mti2菌株在稳定期后期细胞出现了一定的死亡并且△mti2菌株在37℃下生长受到更加严重的抑制,说明△mti2菌株功能受到了影响。然后,将芽殖酵母线粒体翻译起始因子IFM1回补到△mti2菌株中,发现mti2基因敲除菌在非发酵型培养基上能够正常生长,这说明IFM1蛋白与Mti2蛋白具有功能保守性。实时荧光定量PCR发现mti2基因的缺失影响了线粒体基因组编码的mRNA水平以及稳定期后期线粒体基因组的拷贝数。最后,通过BN-PAGE和Western blot实验发现mti2基因的缺失严重影响了线粒体呼吸链上各复合体及超复合体的组装。这些实验结果表明,Mti2是裂殖酵母线粒体翻译起始因子,并基于△mti2△mti3双敲菌株在非发酵型培养基上出现了更加严重的生长缺陷,因此推测Mti3蛋白很有可能协助Mti2蛋白完成线粒体蛋白的翻译起始功能,这些结果对了解线粒体的转录调控与功能有很重要的意义。
[硕士论文] 郭蒙蒙
生物学;微生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)是从早期囊胚中的内细胞团(Inner cell mass,ICM)细胞分离而得到的。在适宜的体外培养个条件下,能够无限制的进行自我复制式的增值即自我更新,通过合适的诱导条件还能够分化成来源于内、中、外三个胚层的各种类型细胞的能力,即多项分化的潜能[1-3]。由于小鼠胚胎干细胞具有的这些特性,使其成为研究发育生物学的理想原材料和疾病模型构建的重要材料。因此,具有重大的经济和社会价值。早期分离得到的小鼠胚胎干细胞需要培养在灭活的饲养层细胞(Mouse embryonicfibroblasts,MEFs)上,并添加含胎牛血清的培养基[1]。对于胚胎干细胞的研究,其中一个重要的内容就是在体外培养的条件下如何去维持其处在多能性的状态。经过大量研究人员的不断探索目前已经建立起了LIF/血清(FBS)培养体系,无血清的N2B27培养体系以及2i[3]培养体系等适合不同胚胎干细胞的体外培养体系。研究胚胎干细胞在体外培养的条件下如何能够维持在自我更新的状态而不分化,就要对其维持自我更新的分子机制进行研究。经过研究人员的不懈努力,已经筛选和鉴定出了一些维持小鼠胚胎干细胞自我更新的关键调节基因[4]如:Tfcp2l1,Nanog, Esrrb,Sox2等,信号通路如:LIF/STAT3,WNT/β-catenin等。虽然这些信号通路和基因已经筛选出来,但是胚胎干细胞的调节是各种基因和信号通路相互作用的复杂过程。目前对于胚胎干细胞如何维持自我更新而不出现分化的分子机制仍然不清楚。因此,需要将细胞学和生物化学以及分子生物学相结合,进一步对胚胎干细胞进行研究,探究其自我更新和分化的调节机制[5]。
  前期已经有文献报道,Id基因家族的成员在无血清的N2B27培养条件下是BMP4/SMAD信号通路的下游基因,过表达后可以部分的代替BMP4的作用来维持小鼠胚胎干细胞的干性[6]。但是,Id基因家族维持mESCs自我更新的机制仍然不清楚。先前有文献报道Id1基因在含血清的培养基中能够部分的代替LIF的作用,通过上调Nanog基因的表达来维持mESCs的自我更新,同时对于中胚层的标志基因T的表达也具有一定的抑制作用[7]。但是,对于Id基因家族的另外两个成员Id2,Id3在mESCs中所发挥的作用并没有报道。因此,本课题主要研究Id2和Id3在mESCs的作用。Id家族表达的蛋白具有螺旋-环,螺旋(helix-loop-helix,HLH)结构域,对于细胞的迁移与周期发生具有促进的作用,同时又能够抑制多种前体的分化,延缓细胞的衰老[8]。因此,其对于胚胎干细胞干性的维持可能具有一定的作用。
  为了研究Id2和Id3这两个基因在mESCs中的作用,我们首先过表达这两个基因,利用相关的生物学软件设计引物并大量扩增所需要的基因片段。验证结果正确后,借助脂质体的特性将重组质粒转染到mESCs中。经过筛选与验证,确定正确的能够稳定遗传的过表达细胞系。我们将建立的过表达细胞系培养在不含有LIF的血清培养体系中进行培养。一段时间后发现过表达的细胞株仍然具有胚胎干细胞的形态,而对照组细胞出现死亡或者已经分化。接着我们对胚胎干细胞的标志性基因(如:Nanog、Oct4、Esrrb、Tfcp2l1等)进行验证。结果显示:过表达Id2或者Id3的细胞系Nanog和Oct4的免疫荧光呈阳性,且多能性的标志碱性磷酸酶染色(AP)也成阳性,而对照组均为阴性。通过对检测结果的分析,过表达后的细胞仍然维持在多能性的状态,而且Id2过表达的细胞与Id3过表达的细胞相比,产生更多的AP阳性克隆,说明其促进自我更新的作用优于Id3。因此,我们后续主要对Id2基因进行研究。接着我们通过shRNA的方法下调Id2基因的表达。结果显示:下调后的细胞出现了分化,不能维持胚胎干细胞的形态,说明Id2对mESCs干性的维持是非常重要的。随后,我们使用转录组测序技术筛选Id2调控的下游靶基因。测序结果显示:实验组和对照组进行比较,有许多基因的表达量发生了变化。通过进一步的筛选,我们发现与胚胎干细胞多能性维持具有相关作用的c-Myc和n-Myc这两个转录因子的表达上调。接着我们通过在转录水平和翻译水平对测序结果进行验证,结果与测序一致。最后,我们对经过分析后所选择的靶基因进行功能性验证。在过表达Id2的细胞系中,下调c-Myc和n-Myc的表达,结果显示:下调后胚胎干细胞出现了分化。在下调Id2表达的细胞系中,分别过表达c-Myc和n-Myc,结果显示:过表达c-Myc和n-Myc后能够对下调Id2后导致的细胞分化具有一定的削弱作用。
  综上所述,我们的研究结果表明,过表达Id2和Id3后的mESCs在不含LIF的血清培养条件下均能够维持在胚胎干细胞的状态。且Id2的作用强于Id3,Id2通过调节c-Myc和n-Myc的表达发挥促进mESCs自我更新的作用。本研究结果进一步揭示了维持胚胎干细胞干性的调控网络和分子机制,有利于以后对干细胞的基础研究和应用。
[硕士论文] 王曼曼
细胞生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)是分离自着床前囊胚期内细胞团的细胞(Inner cell mass,ICM),在体外培养具有无限自我复制式增殖的能力,简称自我更新(Self-renewal),以及多向分化的潜能,简称多能性(Pluripotency)。小鼠的ESCs注射到囊胚中具有形成嵌合体动物的能力,这种发育状态称为Na(i)ve或者Ground多能性状态。而小鼠的上胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)与人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)在注射到囊胚后不能形成完整的嵌合胚胎。hESCs和mEpiSCs的这种相似的发育状态称为Primed多能性状态。小鼠和人的ESCs需要不同的培养条件来维持其多能性状态。通过在培养体系中加入相应地小因子、生长因子或细胞因子来激活或抑制细胞内的信号通路,从而能够维持ESC的自我更新和多能性。
  无饲养层培养体系中加入血清(serum)和细胞因子LIF(Leukemia Inhibitory Factor)可以在体外长期维持mESCs的自我更新和多能性。LIF作为胞外信号,主要通过激活细胞内的JAK(Janus kinase)/STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription3)信号通路,从而激活下游相关转录因子表达来维持mESCs的Naive多能性状态。一些LIF/STAT3信号通路的下游靶基因己被筛选并鉴定出来,例如Gbx2,Klf4,Sps和5和Tfcp2l1等。然而,这些基因在促进mESC自我更新方面的机制仍不清楚。
  转录因子Gbx2(Gastrulation brain homeobox2),即原肠胚形成和脑特异性同源蛋白框2,被证明是LIF/STAT3信号通路的直接下游靶基因。过表达Gbx2的小鼠胚胎干细胞能够在无LIF的血清培养基质中长期维持自我更新和多能性;并且过表达Gbx2还能够促进mEpiSCs重编程为类似于小鼠胚胎干细胞(mESCS-like)的Na(i)fve多能性状态。但是,关于过表达的Gbx2如何替代LIF维持胚胎干细胞自我更新和多能性的分子机制,目前在国内外并未有相关报道。也就是说,LIF/STAT3信号通路中,Gbx2激活哪些关键的下游基因来发挥作用呢?为探究该问题,本课题首先进行了Gbx2靶基因的筛选和鉴定。利用PiggyBac(PB)载体系统转染的方法,在46C小鼠胚胎干细胞中过表达Gbx2(PB-Gbx2),对照组转染PB空载体,然后通过RNA-Seq结合生物信息学分析的方法对Gbx2候选靶基因进行初步筛选,包括显著性基因表达聚类分析、GO(Gene Ontology)功能分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析干细胞多能性信号通路相关的基因。qRT-PCR初步验证结果显示,相比于对照组PB mESCs,PB-Gbx2mESCs中Klf4,Nanog的mRNA表达水平增加了约2.0fold以上。为了进一步探宄Gbx2对Nanog和Klf4表达的调控作用,我们从以下三个方面入手。首先,正常LIF/serum培养PB和PB-Gbx2mESCs,撤掉LIF1h到24h,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示:过表达的Gbx2能够抑制LIF的撤除所导致的Klf4下调,却不能抑制Nanog下调。其次,加入4-OHT(4-hydroxytamoxifen)诱导Gbx2-ERT2mESCs中Gbx2的激活,qRT-PCR结果显示:随着4-OHT加入时间的增加(0-120minutes),Klf4的表达也明显上调,而Nanog的表达无明显趋势。最后,在mESCs中下调Gbx2的表达,qRT-PCR结果显示只有Klf4的表达显著降低。以上结果表明,Klf4是Gbx2调控的下游基因。为了进一步证明Klf4是否为Gbx2直接调控的靶基因,本课题从JASPAR核心数据库(the JASPAR CORE database)在线分析和预测Gbx2在Klf4启动予(Promoter)上的结合位点(binding motifs)。之后通过对PB-Gbx246C mESCs进行染色质免疫共沉淀(ChIP)并检测Klf4启动子序列所控制且由Gbx2所激活的荧光素酶的活性,数据证明了Klf4是Gbx2的直接靶基因。
  以上结果验证了Klf4是Gbx2的直接靶基因,那么Gbx2在功能上是否依赖靶基因Klf4的表达呢?因此,本课题后期主要针对靶基因Klf4对Gbx2促进自我更新和重编程功能两方面的影响进行探究。该部分研究结果如下:1.碱性磷酸酶染色及多能性标志基因NANOG蛋白的免疫荧光染色等数据显示,在过表达Gbx2的小鼠46C胚胎干细胞中将Klf4的表达敲低,Gbx2的过表达维持mESC自我更新和多能性的功能显著降低,即:靶基因Klf4介导了Gbx2的促自我更新效应。2.在CD1mEpiSCs中过表达Gbx2,并knockdown靶基因Klf4的表达,与对照组相比,该细胞克隆出现明显的死亡或分化。因此,Klf4的下调消除了Gbx2促进mEpiScs重编程的效应。由此我们得出结论:对于Gbx2促进mEpiSCs重编程为Na(i)ve多能性状态效率的能力,靶基因Klf4也是至关重要的。
  综上所述,本课题揭示了LIF/STAT3信号通路中转录因子Gbx2维持和诱导小鼠胚胎干细胞Na(i)ve多能性状态的分子机制:Gbx2直接调控靶基因Klf4的转录表达来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新以及促进小鼠上胚层干细胞重编程到类似小鼠胚胎干细胞的状态。这一发现不仅扩大了我们对多能性调控网络的认识和理解,也为进一步探究和优化小鼠甚至人胚胎干细胞的体外培养和分化条件提供了线索。
[硕士论文] 汪凤宇
材料物理与化学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:膜融合是所有活细胞生命过程中的重要进程。包膜病毒通过与细胞膜的融合完成入侵宿主细胞的第一步,受精作用首先需要精子和卵子的膜融合,还有细胞内部的膜融合如胞吐、蛋白质转运和线粒体重塑等。因而,膜融合的研究尤其是其分子机理的研究是许多学科关注的重要课题。
  为了实现膜融合,要先拉近原本独立的两个膜,然后在膜上产生局部的扰动和变形,最后融合成单个膜,整个过程需要克服巨大的能量势垒。在生物系统里,膜融合蛋白负责克服这些能量势垒。许多对膜融合蛋白的研究发现,膜融合时膜蛋白会发生构型转变,伴随着融合蛋白的重排会暴露出一段融合多肽,融合多肽会靠近靶向的磷脂双分子层引发融合反应。融合多肽是一个短的,相对疏水的多肽,它可以实现和融合蛋白一样的膜融合功能。
  毋庸置疑,膜融合对细胞生命体有着至关重要的影响。但是目前人们对于膜融合在分子层面上的机理知之甚少。由于活细胞的复杂性,对于观察到的情况难以进行详尽的解释。因此,为了深入了解融合过程,需要开发组分简单的人工膜融合体系。在这种情况下,简单的融合多肽相比于复杂的融合蛋白显然是一个更好的选择。在这之中,有许多工作是借助源自天然融合蛋白的融合多肽来研究膜融合,如流感病毒的融合多肽。也有人工开发的合成融合多肽,如被广泛研究的GALA是由谷氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸的重复单元组成的结构。
  但是,相比于膜融合蛋白,大部分融合多肽都有一个缺点,即它们在诱导囊泡融合时,都会伴随着囊泡内物质的外泄。尤其是,目前膜融合体系在药物输送和基因转染等方面的应用发展也受到很多关注,pH敏感的GALA多肽诱导的泄漏融合可以帮助破坏细胞膜,甚至杀死细胞,但是并非所有的治疗都需要破坏细胞膜,比如基因运输。众所周知,破坏细胞膜的完整性会导致细胞坏死,释放出细胞内物质从而引起炎症。所以不管是为了探究融合蛋白的融合机制,还是寻找药物输送需要的非泄漏融合多肽,都迫切需要开发非泄漏的融合多肽。
  在本课题的研究工作中,介绍了两种融合多肽ORB-KK和ORB-KKopen,目前尚未见文献报道。它们源自臭蛙皮肤分泌的一种抗菌肽ORB的衍生多肽。其中ORB-KK是一种发卡状多肽,通过一个分子内二硫键固定,序列为LKGCWTKSIPPKPCFK。ORB-KKopen是基于ORB-KK的开环形式。它们可以在不同pH下诱导大的单层脂质体囊泡发生pH选择性的不泄露的完全膜融合。
[硕士论文] 刘奎升
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:哺乳动物的发育起始于精子(sperm)与卵子(oocyte)的结合,两者形成受精卵(zygote)后启动发育程序,此后受精卵会经历一系列的卵裂(cleavage),细胞数量不断增多,细胞功能形态差异化。1981年由Evans和Kaufman从小鼠着床前囊胚内细胞团中成功分离了小鼠的胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs),由此建立了最早的胚胎干细胞系。之后人们又陆续分离了人、大鼠等的胚胎干细胞。由于胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的生物学特性,所以无论是在生物发育研究方面还是临床医学应用方面都具有非常重要的研究价值。经过前人的大量工作,现在人们已经找到能够在体外长期维持部分胚胎干细胞自我更新状态的方法。但是由于胚胎干细胞维持自我更新是一个极其复杂的生物学过程,因此全面深入的研究胚胎干细胞维持自我更新及分化的调控机制,有利于其广泛而安全的应用。
  目前体外培养胚胎干细胞的培养基主要有两种:一种是LIF/serum培养基;一种是无血清的2i/N2B27培养基:在N2B27中添加CHIR和PD03两种小分子抑制剂(2i)。这两种培养基通过不同的信号通路维持胚胎干细胞的自我更新,LIF/serum主要是通过LIF/STAT3信号通路。本课题组成员之前的研究发现:在众多的LIF/STAT3信号通路的靶基因中,Tfcp2l1是唯一下调之后导致LIF/serum培养条件下的小鼠胚胎干细胞出现分化的基因。这说明了在LIF/STAT3信号通路促进mESCs自我更新的过程中Tfcp2l1占有极其重要的位置。并且人们后来又发现同时过表达Tfcp2l1和klf2可以替代2i维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态,所以Tfcp2l1作为多条通路的共同靶基因扮演了十分特殊的角色,但是Tfcp2l1作用的具体机制还不是很清楚。
  为了探究Tfcp2l1在mESCs中调控自我更新的具体机制,我们首先在细胞中下调Tfcp2l1的表达量,检测各个胚层的基因表达,查看其影响了向哪些胚层的分化。结果发现内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)和滋养层(trophectoderm)的基因发生了明显的上调。为了反向验证这个结果,我们使用可经DOX诱导过表达Tfcp2l1的细胞株i-Tfcp2l1进行了拟胚体(EB)分化,结果显示:在EB形成过程中,诱导Tfcp2l1的表达可以抑制mESCs向内胚层、中胚层和滋养层方向分化。这些研究结果表明Tfcp2l1抑制mESCs向中内胚层以及滋养层细胞方向分化。
  TFCP2L1蛋白结构是其发挥作用的基础,于是我们通过实验分析了TFCP2L1蛋白不同结构域在维持mESCs自我更新方面的作用。首先我们在前人研究的基础上把TFCP2L1蛋白划分成了四个结构域:N-terminus(aa1-20)、CP2-like domain(aa21-242)、SAM domain(aa310-376)和C-terminus(aa377-480)。我们把这些片段一一缺失,构建了四个过表达缺失突变蛋白的mESCs细胞株(△NT、△CP2、△SAM、△CT)进行分化实验。结果显示△NT和△CP2细胞株不能在无LIF条件下维持自我更新。紧接着我们也进行了mEpiSCs(mouse epiblast stem cells,mEpiSCs)重编程回到na(i)ve多能性状态的实验。发现△NT和△CP2突变体不能或极少的使mEpiSCs重编程回na(i)ve状态。以上实验结果说明了N-terminus和CP2-like domain对于Tfcp2l1维持mESCs的na(i)ve多能性非常重要。
  我们在培养缺失突变细胞株的过程中发现△NT和△CP2细胞株在正常LIF/serum培养条件下出现了微分化,进一步的qRT-PCR检测发现△CP2细胞株存在比较高的内胚层基因(Gata4和Gata6)的表达;△NT细胞株则表达了较高的中胚层(T和Mixl)和滋养层的基因(Cdx2和Gata3)。于是我们便寻找导致细胞分化的原因,借以探究Tfcp2l1抑制mESCs向中胚层和滋养层分化的机制。经过一系列的实验我们证明了△NT细胞株向中胚层和滋养层方向分化是由Lef1上调表达引起的,即Tfcp2l1通过抑制Lef1的表达来抑制中胚层和滋养层基因的出现。
  那么Tfcp2l1对于内胚层基因的调节又是通过怎样的途径呢,我们查找资料后发现,MTA家族基因或许起着非常重要的作用。我们通过实验发现MTA家族基因中只有Mta1的下调可以导致过表达Tfcp2l1的mESCs分化,并且是向内胚层方向分化。反之,过表达Mta1能够延缓mESCs分化。免疫共沉淀进一步证明两者蛋白之间存在相互作用。由此我们得到初步的结论,即TFCP2L1通过与MTA1蛋白之间的相互作用调节mESCs内胚层基因的表达。
[博士论文] 周永刚
细胞生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从探究生长促进因子在NK细胞组织特异性功能和促进NK细胞发育和成熟过程中的作用机制和转录调控机制方面展开研究,获得如下结果:
  本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 NK细胞产生生长促进因子促进胚胎发育
  本研究通过高通量基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞,筛选鉴定子宫trNK细胞组织特异性功能分子。通过荧光定量PCR、免疫荧光和流式内标技术检测分析子宫trNK细胞产生生长促进因子(Growth-promoting factors,GPFs)的能力,包括多效生长因子(Pleiotrophin,PTN)、骨生成诱导因子(Osteoglycin,OGN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)。通过绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系研究子宫trNK细胞产生GPFs的调控机制。最后通过检测临床反复流产病人的子宫trNK细胞分泌GPFs能力确定其与胚胎早期发育相关性,进一步通过Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠确认子宫trNK细胞分泌生长促进因子促进胚胎早期发育的重要生理意义。通过上述研究方案取得了如下结果:
  1.基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞
  差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞的基因芯片数据,结果显示子宫trNK细胞与外周血NK细胞功能分子存在显著差异,子宫trNK细胞特异性高表达PTN、OGN和OPN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。
  2.子宫trNK细胞分泌生长促进因子PTN,OGN和OPN
  定量PCR、免疫荧光、流式内标检测结果均验证基因芯片结果,子宫trNK细胞相较于外周血NK细胞特异性产生生长促进因子PTN、OGN和OPN。
  3.HLA-G诱导NK细胞分泌生长促进因子
  建立绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系模拟体内子宫trNK细胞微环境,结果显示绒毛外滋养层细胞可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。细胞干扰和抗体阻断实验及721.221-HLA-G细胞系共培养实验结果均提示,绒毛外滋养层细胞过表达的HLA-G分子可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。
  4.反复流产病人NK细胞分泌生长促进因子能力显著降低
  分析反复流产病人子宫trNK细胞,结果显示病人该细胞数量以及产生生长促进因子能力相较正常人均显著减少。该结果提示,子宫trNK细胞产生生长促进因子能力与正产妊娠密切相关。进一步研究发现发育异常的胚胎相较于正常发育胚胎的HLA-G分子表达显著降低。
  5.Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限
  分析Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育情况,结果显示生长促进因子联合缺陷小鼠子宫trNK细胞产生生长促进因子能力缺陷后,孕鼠胚胎发育受限,体重、体长值均显著降低。该结果提示子宫trNK细胞可以产生PTN、OGN等生长促进因子促进胚胎早期发育。
  综上所述,该研究通过人转录组基因芯片,比较了子宫NK细胞和外周血NK细胞的功能基因差异,发现早期妊娠中CD11b-CD27-子宫NK细胞高表达PTN、OGN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。胚胎来源的绒毛外滋养层细胞表达的HLA-G与子宫trNK细胞相互作用,诱导NK细胞大量表达生长促进因子,促进胚胎发育。反复流产病人中子宫trNK细胞表达生长促进因子的能力显著下降,不能支持胚胎早期的正常发育。该研究不仅丰富了NK细胞的功能,而且为临床治疗胚胎生长受限和反复流产等相关疾病提供新的思路。
  第二部分 PBX1通过调控生长促进因子转录促进NK细胞在骨髓发育成熟
  本研究从NK细胞进化中关键分子保守性的角度筛选鉴定调控NK细胞发育和成熟的关键转录因子PBX1,并且通过定量PCR,Western blotting,流式内标技术方法检测分析人NK细胞体外分化扩增体系不同时间点的细胞和骨髓NK细胞的关键转录因子PBX1和其潜在靶基因生长促进因子PTN和OGN的表达情况。为了研究关键转录因子PBX1的调控机制,通过电核转技术构建NK细胞基因干扰体系,以及通过慢病毒感染构建NK细胞体外分化扩增过程中基因过表达体系,验证PBX1与生长促进因子的潜在调控相关性。为了进一步研究PBX1调控PTN和OGN的作用机制,利用NK细胞CHIP-Seq技术,荧光素酶报告体系和DNA-pulldown体系确认PBX1转录调控PTN和OGN的机制。接下来为了鉴定PBX1对NK细胞发育和成熟的调控作用,通过构建小鼠骨髓嵌合体模型及条件型Pbx1敲除小鼠模型检测分析NK细胞的发育和成熟情况。最后构建Ptn-/-Ogn-/-小鼠模型验证PBX1-PTN/OGN轴对NK细胞发育和成熟的关键作用机制。
  本研究通过上述研究方案取得了如下结果:
  1.PBX1是NK细胞高度保守的转录因子
  分析NK细胞关键分子基因在不同物种中的保守性,发现PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。多种实验技术检测结果显示,人骨髓NK细胞相对T细胞特异性高表达PBX1,而且PBX1在NK细胞发育早期和成熟期均有较高表达。
  2.PBX1调控NK细胞表达PTN和OGN
  生物信息学预测分析结果显示,PTN和OGN基因启动子区富含多个转录因子PBX1结合位点。NK细胞干扰和过表达PBX1基因后,流式内标检测生长促进因子PTN和OGN结果显示,在NK细胞中PBX1上调生长促进因子PTN和OGN的表达。为了进一步研究PBX1调控机制,在NK细胞中用抗PBX1抗体富集DNA序列的CHIP-Seq分析结果显示在PTN和OGN基因启动子区中分别存在转录因子PBX1的特异性结合峰。PTN和OGN基因启动子区的荧光素酶报告实验结果和特异性序列的DNA-pulldown实验结果均验证PBX1可以识别特异性序列,并直接结合PTN和OGN基因启动子区。
  3.Pbx1缺陷小鼠NK细胞数量严重减少
  对比分析小鼠骨髓嵌合体模型中Pbx1基因被干扰的骨髓细胞和未被干扰的骨髓细胞中NK细胞的比例和数量,结果显示干扰Pbx1基因表达显著降低骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量。分析Pbx1条件型缺陷小鼠,Vav1-Cre小鼠介导的造血前体期Pbx1条件型缺陷严重影响NK细胞的发育,导致小鼠骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量显著下降,与骨髓嵌合体小鼠模型结果一致。Ncr1-Cre小鼠介导的NK细胞成熟期Pbx1条件型缺陷同样显著减少成熟NK细胞在骨髓和外周的比例和数量。该结果提示,PBX1不仅可以调控NK细胞的早期发育而且对于NK细胞的成熟具有关键调控作用。
  4.PBX1促进骨髓NK细胞末端成熟
  进一步分析发现Vav1-Cre小鼠和Ncr1-Cre小鼠介导的Pbx1条件型缺陷均可以导致小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量显著减少,从而导致外周CD11b+单阳性NK细胞同样比例和数量显著减少。重组表达的生长促进因子PTN和OGN体内和体外恢复实验结果显示,补充的PTN和OGN可以恢复条件型Pbx1缺陷小鼠CD11b+NK细胞的比例和数量。该结果提示,PBX1通过上调PTN和OGN促进NK细胞自身的末端成熟。
  5.PBX1-PTN/OGN轴参与NK细胞库的维持
  分析Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量,发现与Pbx1条件型缺陷小鼠结果一致,细胞的比例和数量均显著减少。分析小鼠骨髓NK细胞生长促进因子受体的表达,结果显示小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞高表达PTN受体RPTP-β。野生小鼠骨髓细胞和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓细胞混合转输实验结果显示,少量的野生型小鼠骨髓细胞即可恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周中成熟NK细胞的比例和数量。重组表达的PTN和OGN体内恢复实验结果也显示,补充PTN和OGN可以恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周成熟NK细胞的比例和数量。该结果提示PBX1通过促进PTN/OGN自分泌支持NK细胞在骨髓的发育和成熟,即PBX1-PTN/OGN轴参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。
  6.PBX1-PTN/OGN轴上调T-bet表达
  分析Pbx1条件型缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞增殖和存活以及迁出骨髓的能力,结果显示PBX1-PTN/OGN轴可以促进骨髓NK细胞的增殖和迁出骨髓的能力,但不影响NK细胞存活。T-bet作为控制NK细胞末端成熟和迁出骨髓能力的重要检查点转录因子,T-bet表达检测结果显示在条件型Pbx1缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞中T-bet表达显著降低,重组表达的PTN和OGN可以显著恢复缺陷小鼠骨髓NK细胞T-bet的表达。该结果提示,PBX1-PTN/OGN轴通过上调T-bet表达促进NK细胞在骨髓的成熟。
  综上所述,本研究鉴定PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。在NK细胞中PBX1可以直接分别结合生长促进因子PTN和OGN启动子区调控其转录。PBX1-PTN/OGN轴上调T-bet表达促进骨髓NK细胞终末成熟,参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。该研究不仅对于深入理解NK细胞的发育和成熟具有重要意义,而且对于进一步完善基于NK细胞过继转输的免疫治疗方案也有深远影响。
[硕士论文] 弓红岩
数学 大连海事大学 2018(学位年度)
摘要:抗原-抗体间的相互关系在体液免疫反应当中扮演着非常重要的角色,在特异性位点抗原与抗体结合与抗原决定因子保持一致,B细胞表位作为抗原决定因子之一在B淋巴细胞表面被受体(膜结合抗体)识别和结合。B细胞表位,又称抗原决定因子,是位于抗原表面的一些氨基酸片段。表位能够诱导免疫反应,并且能够被特异性抗体识别,一般来说,基于它的结构特性,B细胞表位可分为两类:线性B细胞表位和构象性表位。线性B细胞表位在生物化学、病毒学、免疫学以及疫苗的研究中起着很重要的作用,因此,对于线性表位预测的计算方法的研究与进展在生物信息和计算生物方面仍的一个很大的挑战。
  特征选择是从总的特征集中选择出能够满足某一种评价标准并且使评价标准达到最优的特征子集。它的目的是根据选择出的子集让分类的性能与进行特征选择之前相比能够达到近似或者更优。经过特征选择之后,一些无关或冗余特征通过机器学习方法被剔除,从而利用剔除多余特征后的特征子集建立一个更加精确的模型。然而如何使用特征选择方法剔除无用或冗余的特征已成为一种挑战。
  目前常用的线性B细胞表位预测的方法大多数是单纯的对于B细胞中提取的特征处理,没有考虑冗余特征的存在。本文主要是提出将特征选择方法与线性B细胞表位预测结合起来,进而将无关特征剔除,最终使得预测精度提高。另外本文还通过支持向量机分类器实验验证不同的特征提取方式对应最优的的特征选择方法是不同的,每一种特征提取方法对应的预测效果也是不一样的。
[硕士论文] 韦杰
航天工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,有关细胞内主动机械力在细胞生理过程中扮演重要角色的报道不断增加。研究细胞内主动机械力的产生,不仅是生物力学的根本问题,对生理学和生物医学也具有重大意义。
  细胞内主动机械力的产生涉及到许多蛋白质种类和多种潜在机制,本文关注主要成分为肌动蛋白和肌球蛋白的两种亚细胞结构:肌节和应力纤维。结合有限元方法与蒙特卡罗方法,本文建立了亚细胞结构的机械一化学耦合模型,用数值模拟方法探索细胞内主动力的产生机制。主要研究内容有:
  (1)通过模拟不同ATP浓度下肌节的收缩,研究ATP浓度对肌节收缩的影响。模拟所获得的ATP浓度与肌节收缩速度的关系,同实验结果高度一致。分析不同状态分子马达的受力,发现处于僵直状态分子马达会产生阻碍收缩的阻力。在过高的阻力下,与细肌丝结合的分子马达数目不能随着肌节载荷线性变化,分子马达的受力调控不再有效。较高的ATP浓度可以降低阻力,从而提高肌节收缩速度,并使得分子马达受力得到比较精确的调控。模拟结果还表明肌节的正常收缩需要细肌丝的抗拉刚度高于一定数值。
  (2)通过模拟交联分子与反平行纤维对之间的相互作用,研究各种物理化学参数对纤维力加载过程的影响。模拟结果表明,交联分子依靠结合或解离过程中的极性,可以产生与分子马达可比的机械力,是一种不同于分子马达的主动机械力产生机制。模拟结果还显示,这种机制的力加载过程中力的数值可能会发生剧烈波动,这种不稳定性可能有助于细胞快速响应外部环境变化。
[博士论文] 王小滔
生物信息学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:染色质三维结构在基因表达调控、细胞发育以及疾病发生过程中起着重要作用。在过去,人们主要依赖显微技术来研究染色质的空间组织模式。近年来,染色质构象捕获技术,特别是能够在全基因组范围捕获染色质交互的Hi-C技术,极大地提高了研究染色质结构的精度和通量,推动了人们对染色质层次化结构的认识。染色质拓扑相关结构域(topologically associating domains,简称TADs)是染色质高阶结构中重要的结构单元,它广泛存在于各个物种中,其位置在细胞发育甚至进化中都是非常保守的。在功能上,TADs限定了增强子与启动子的空间交互范围,是基因表达、DNA重组、基因组复制调控的基本单元。传统上,人们对TADs内部结构认识较少,本文深入研究了TADs内部染色质交互的分布特征,分别提出了TADs总体结构度量指标和层次化结构域识别算法,用于研究TADs内部结构特征和功能。
  首先,本文分析了TADs内部显著性交互的聚集模式,定义了一种能够衡量TADs内部总体结构特征的量化指标—聚集偏好指数(aggregation preference,简称AP)。接着,本文使用AP指数对TADs进行结构注释,将TADs内部结构与功能相关联。具体地讲,我们分析了来自人类和小鼠9个细胞系的11组传统Hi-C和原位Hi-C数据,发现AP值较为均匀地分布在0-1之间,说明TADs具有较强的结构异质性。通过整合DNA序列特征、表观修饰以及基因表达数据,我们发现AP值与染色质活跃状态呈现出显著的正相关关系。最后,细胞系间的比较结果表明,不同细胞系中TADs内部结构的重排与基因表达调控的改变密切相关。
  其次,TADs并不是单一层次的结构,它们常常是以一种层次化的形式组织起来的,因此开发层次化结构域的识别算法对分析不同层次结构域在染色质结构组织和功能上的差异具有重要意义。针对这个问题,本文综合利用染色质局部和远程交互,在传统定义的基础上进一步将TADs精细定义为“在指定目标函数下能够最佳分割染色质内交互的结构域集”,并递归地将其内层结构域定义为“在指定目标函数下最佳分割上一层次结构域内染色质交互的结构域集”。通过新的TADs定义,我们开发了HiTAD算法来识别层次化结构域,并使用来自人类和小鼠7个细胞系的传统Hi-C和原位Hi-C数据从多个角度对其进行了交叉验证。计算结果表明,HiTAD在敏感性、可重复性以及细胞系间的保守性方面均优于现有软件Arrowhead和TADtree;HiTAD识别的不同层次结构域均表现出与传统单一层次TADs类似的属性,如“边界绝缘性”、“边界信号富集”以及“转录因子CTCF结合DNA序列的方向性”等。为方便不同结构域集合之间的比较,我们开发了层次化结构域比对算法,并利用此算法定义了多种结构域边界以及结构域变化模式。以边界为基础,我们研究了不同层次结构域在关联染色质区室(compartments)和基因组复制上的差异,发现TADs而非Sub-TADs是染色质区室和基因组复制调控的基本单元;以结构域为基础,我们发现TADs和Sub-TADs在基因调控中亦扮演着截然不同的角色。
  综上所述,本文提出了能够反映TADs内染色质交互聚集程度的AP指数和识别TADs内部层次化结构域的HiTAD算法,进而从不同角度研究了TADs内部结构和生物功能之间的联系。
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