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[硕士论文] 邢玲玲
光学工程 江苏大学 2015(学位年度)
摘要:细胞作为生命体最基本的组成单元,其形态结构和动力学信息能够直观的反映出生命体的状态。血细胞的分类分选以及识别是疾病判断和探索生命体的重要手段之一。近几十年来,细胞研究得到了广泛的发展,其中流式细胞术和细胞成像技术成为中流砥柱的方法。流式细胞术的优点在于快速的进行细胞分选分析,而成像技术则专注于细胞的形态结构以及内容物的研究。
  流式细胞术是针对细胞、细胞内遗传物质、病毒、微粒等物质的快速分选分析方法。本文以双光源光学系统为例简要介绍了血细胞分类的方法,并且基于血细胞的双层椭球核式的光散射模型,有效采集了相关散射研究理论数据,着重分析了在模型内外折射率参数变化、模型内核直径变化、模型形态因子变化下的光散射分布,在此基础上对血细胞模型的前向、侧向以及后边散射光进行了区域划分,并且对其中部分数据进行了仿真计算以及补充,建立了血细胞模型下的全域光散射谱图,通过对图散射点的离散化特征分析,建立了在该区域内的血细胞模型特征与血细胞类别的关系,进而提出了基于全域光散射下的血细胞亚类识别方法。
  近十几年以来,定量相位显微技术得到了飞速发展。定量相位显微技术可以实现细胞的相位信息采集,通过计算出形成该相位图像的全息状况,获得样品完整的相位信息,进而反演出细胞的真实形态。本文以课题组提出的改进后的相位恢复微分法为理论基础,编制了微分法的运算程序,并且以红细胞厚度灰度图作为实验图,叙述了程序的运算过程。在此基础上,采用LabVIEW虚拟实验室软件构建了人机交互的“血细胞相位显微系统”软件,该软件采用状态机结构作为主要结构,采用了MATLAB节点调用微分法运算程序,实现了MATLAB软件和LabVIEW软件混编处理图像目的,得到了良好的反馈。
  在上述内容的探索过程中,通过分析流式细胞仪和定量相位成像技术的光路设置图,提出了一种基于光散射与相位成像下的血细胞联合检测系统。该系统采用流式细胞仪中的光路检测系统,其中包括前向散射光检测系统和侧向散射光系统,和定量相位成像光路中的改进后的马赫增德尔光路系统。
  本文的研究从流式细胞仪的光散射分析方法到定量相位显微技术的相位恢复程序编制,最终通过两者的研究,得到了血细胞联合检测系统的设计方法。该方法为血细胞研究提供一定的基础。
[博士论文] 阳大海
生物化工 华东理工大学 2015(学位年度)
摘要:宿主免疫细胞能够通过一种或多种病原谱识别受体(PRRs)来识别一类被称为病原模式分子(PAMPs)的微生物组分,如:细菌鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)和多聚核苷酸等,从而激活宿主先天免疫炎症反应信号通路。细胞的模式识别受体家族包括:Toll样受体(Tolllike receptors)、C型凝集素(C-type lectin)、NOD样受体(NOD like receptors)、识别RNA的RIG样解旋酶受体(RIG like receptors)、DNA识别受体和最新发现的细胞质LPS识别受体(Caspase-11)等。在这些细胞受体中,有一部分模式识别受体同时也能够识别死亡细胞产生的细胞损害模式分子(DAMPs),如热休克蛋白(HSPs)、硫氧还蛋白(TRX)、三磷酸腺苷(ATP)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)等。由于PRRs不仅是机体识别病原的第一道防线,还是促发适应性免疫应答过程的重要信号,并且在多层面控制CD4+、CD8+T细胞的发生、分化和记忆细胞的形成和抗体的产生。尽管PAMPs作为主要的外源抗原蛋白能够被PRRs识别,并介导抗原加工递呈信号通路,从而将“非自我”信号传递给下游淋巴细胞,激活适应性免疫应答,但是,对于其详细的信号通路仍然有待进一步解析。
  LPS,俗称为内毒素,是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分,同时也是病原菌最为重要的模式识别分子之一。LPS结合TLR4后能够诱导细胞因子和炎症因子转录,介导严重的免疫反应,是败血症和内毒素休克最主要的诱因。然而,最近在细胞模型上的研究表明:进入细胞内的LPS能够直接被Caspase-11识别,并激活其介导的非典型炎症小体信号通路,导致细胞炎症性坏死,并在许多病原感染并导致小鼠内毒素休克性模型中扮演重要角色,但是,关于细胞内LPS激活Caspase-11导致下游细胞死亡信号通路还有待证实。同时,Caspase-11激活介导的非典型炎症小体激活还能够间接的导致NLRP3炎症小体的激活,从而促进成熟IL-1β的分泌,但是,关于Caspase-11激活如何导致NLRP3炎症小体的激活机理仍有待解析。
  一方面,本论文以一株缺失毒力效应分泌蛋白、但具有鞭毛结构的迟钝爱德华氏菌减毒株作为感染病原,以斑马鱼作为感染模式动物,采用高通量测序技术(RNA-seq)研究了斑马鱼在迟钝爱德华氏菌刺激后的差异转录谱,重点关注了斑马鱼的模式识别信号通路激活情况及后续的免疫应答变化。主要内容包括:(1)通过DESeq软件对RNA-seq测序结果进行分析,在免疫后斑马鱼肝脏组织中,共发现4565个显著差异表达基因;(2)通过GO和KEGG功能聚类对差异表达基因进行免疫信号通路富集发现,在细菌感染斑马鱼早期阶段,斑马鱼病原模式识别受体TLR5介导的炎症反应信号通路、内质网蛋白加工过程、吞噬小体通路和抗原加工呈递信号通路具有显著的差异表达;(3)高倍率表达的TLR5信号通路与主要组织相容性复合物分子(MHC)1分子介导的信号通路相关基因呈现显著共上调表达,而MHCⅡ分子介导的信号通路相关基因呈现显著的共下调表达。上述研究工作表明,迟钝爱德华氏菌感染后,斑马鱼模式识别受体TLR5信号通路显著激活,并伴随急性期免疫应答、MHCⅠ抗原加工递呈过程及细胞毒T细胞免疫应答的显著激活;该结果显示迟钝爱德华氏菌感染所激活的斑马鱼TLR5信号通路,可能通过级联信号转导激活先天性免疫应答,并进一步通过桥梁作用启动适应性免疫应答。
  在迟钝爱德华氏菌刺激斑马鱼免疫应答的转录谱分析的基础上,我们将减毒爱德华氏菌注射接种斑马鱼,接种4周后,用野生型的迟钝爱德华氏菌对斑马鱼进行攻毒处理后,连续考察1周,建立了一个为期5周的“免疫-攻毒”模型。基于上述模型,我们在接种后不同时间点,重点考察了斑马鱼适应性免疫应答相关基因的转录变化情况,从而进一步阐释了减毒迟钝爱德华氏菌介导的斑马鱼适应性免疫应答过程。研究发现:(1)在减毒株接种斑马鱼后一周内,病原模式识别受体TLR5信号通路被显著激活;(2)在感染后的早中期阶段,MHCⅠ介导的抗原加工递呈信号通路处于激发状态;(3)在感染晚期阶段,CD8+T淋巴细胞介导的细胞毒T细胞效应被显著激活;(4)斑马鱼适应性免疫应答的激活可以针对野生株的注射攻毒产生较好的免疫保护力。
  另一方面,本论文研究了细菌病原模式分子LPS在宿主细胞内通过模式识别受体Caspase-11的识别,激活并导致细胞炎症性坏死的信号通路。我们主要以一系列基因缺陷型小鼠骨髓分化巨噬细胞作为细胞筛选模型,通过LPS转染巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞,建立非典型Caspase-11炎症小体激活模型。研究结果发现,当细胞内Caspase-11被LPS激活后,Caspase-11能够切割并激活Pannexin-1通道,释放ATP,促发P2X7受体激活,介导细胞焦亡;并通过动物活体实验模型发现该过程对于小鼠内毒素休克模型具有重要意义。同时,本论文还发现非典型Caspase-11炎症小体激活介导的Pannexin-1依赖的K+外流,能够激活典型NLRP3炎症小体这一重要支路信号通路,介导IL-1β的成熟和分泌,并且从细胞模型到动物活体模型阐明了非典型NLRP3炎症小体激活并不依赖P2X7受体信号通路。在临床上,内毒素休克是一个高度复杂的病症,并且由很多因素参与了内毒素休克病症的产生。本论文通过使用Pannexin-1通道和P2X7受体抑制剂注射小鼠后,发现其应对于内毒素休克具有明显的保护效率,该结果为临床使用Pannexin-1通道和P2X7受体抑制剂来治疗革兰氏阴性细菌感染导致的内毒素休克病症提供了重要理论支持。
[硕士论文] 左焕桢
化学工程与技术;应用化学 南京工业大学 2015(学位年度)
摘要:对于生物体的研究,大多以细胞为基本单元展开。前期,人们对细胞的研究大多局限于细胞群体的分析,很难获得单个细胞的信息,从而使很多生物学研究受到限制,而且细胞之间存在个体差异性,所以单细胞的研究显得非常重要。同时,鉴于在单细胞层面研究磷脂和胆固醇相互作用的重要生物学意义,以及目前缺乏对细胞表面分子全面分析手段的现状,所以本文基于电化学发光及扫描离子电导显微技术深入研究了单细胞表面胆固醇及磷脂。研究工作如下:
  (1)在单细胞膜表面利用鲁米诺电致化学发光同时检测活化和非活化胆固醇,从而决定活化膜胆固醇组成。当加入胆固醇氧化酶与活化胆固醇反应,细胞仍能保持其完整性,因此,在低离子溶液中浸泡可以激活非活化胆固醇再与胆固醇氧化酶反应,我们可以看到活化和非活化胆固醇与胆固醇氧化酶反应产生过氧化氢后,鲁米诺发光信号增强,这两个信号增强比例显示了活化膜胆固醇组成。同时,活化膜胆固醇组成较小的相对偏差表明细胞中胆固醇活性分布均匀。
  (2)鲁米诺电致化学发光分析单细胞膜表面卵磷脂,主要是通过特定的磷脂酶D与卵磷脂反应生成胆碱,加入胆碱氧化酶,产生过氧化氢。在正电位下,鲁米诺作为发光试剂存在,诱导过氧化氢发光。根据这个方案,在电极表面培养细胞,加入磷脂酶D、胆碱氧化酶和鲁米诺,能够观察到发光信号增强,从而检测到细胞膜表面卵磷脂。利用(1)制备的微电极,实现对单个细胞表面卵磷脂的电致化学发光分析。对于单细胞分析,每个细胞在加入PLD和胆碱氧化酶前后的发光比率表现了较大偏差,表明细胞之间的差异性比较大,加上之前单细胞胆固醇信息的搜集,成功分析单细胞表面卵磷脂,从而为证实细胞膜上磷脂-胆固醇的相互作用提供更多的信息。
  (3)在上面胆固醇和磷脂分析的基础上,我们利用SICM技术对单细胞表面活化胆固醇的分布进行显微成像,用一根超微探针作为工作电极,探针接触样品表面使得电阻增加,通过反馈系统记录得到电阻(或电导)的变化,对非导电样品表面,实现超高分辨率成像。基于该仪器对活细胞非接触式、无损伤、高分辨的特点,对单个细胞表面活化胆固醇进行显微成像。同时,我们对该仪器的重复性及高分辨率进行了一系列探索(如标准样、细胞表面高分辨扫描)。
[博士论文] 李燕
应用数学 东南大学 2016(学位年度)
摘要:本文研究了几类描述细胞在自身分泌的化学物质刺激下进行趋向性运动的偏微分方程组,包含单种群趋化模型和多种群趋化模型.论文研究了这几类趋化模型解的整体存在性与有限时刻爆破.
  本文主要内容包含五部分:
  第一章概述了所研究趋化模型的生物背景,国内外的发展现状并简要介绍本文的主要工作.
  在第二章中,我们研究了两种群趋化方程组{ut=Δu-▽·(u▽w),x∈Ω,t>0,vt=Δv-▽·(v▽w),x∈Ω,t>0,wt=Δw+u-w-vw,x∈Ω,t>0的Neumann边值问题,其中Ω(C)R2为光滑有界区域,我们得到了小初值条件下方程组解的有界性与渐近性态.具体来说,我们证明了存在ε0>0,对于任何满足‖u0‖L1(Ω)<ε0和‖▽w0‖L2(Ω)<ε0的初值(u0,u0,w0),方程组的解都整体存在并且一致有界.此外,该问题的解(u,v,w)渐近趋向于(m1,m2,m1/1+m2),这里m1=1/|Ω|∫Ωu0,m2=1/|Ω|∫Ωv0.
  第三章考虑完全抛物型两种群趋化方程组{ut=Δu-x1▽·(u▽w),x∈Ω,t>0,vt=Δv-x2▽·(v▽w),x∈Ω,t>0,wt=Δw-γw+α1u+α2v,x∈Ω,t>0的Neumann边值问题.其中Ω是RN(N≥3)中的球,x1,x2,γ,α1,α2均为正实数.我们考虑了更一般的情形x1≠x2,证明了对于任何的mi>0(i=1,2),都存在径向对称的初值(u0,v0,w0)∈(C0((Ω)))2×W1,∞(Ω)满足mi=∫Ωui0,(i=1,2),使得问题对应的解发生有限时刻爆破,即limt→T‖u1‖L∞(Ω)+‖u2‖L∞(Ω)=∞,这里T∈(0,∞).
  第四章我们讨论了单种群与两种化学物质的趋化-排斥方程组{ut=Δu-x▽·(u▽v)+ξ▽·(u▽w),x∈Ω,t>0,0=Δv+αu-βv,x∈Ω,t>0,0=Δw+γu-δw,x∈Ω,t>0的Neumann边值问题,这里Ω为R2中的光滑有界区域.x,ξ为非负实数,α,β,γ,δ为正实数.我们研究了该问题的解在条件xα-ξβ>0且β≠δ时的有限时刻爆破.
  第五章研究了非线性扩散趋化-趋触模型{ut=▽·(D(u)▽u)-x▽·(u▽v)-ξ▽·(u▽w)+μu(1-u-w),x∈Ω,t>0,ut=Δv-v+u,x∈Ω,t>0,wt=-vw x∈Ω,t>0的Neumann边值问题,其中Ω为RN中的光滑有界区域.N=2,3,4,x,ξ,μ≥0.扩散系数D(u)满足D(u)≥δum-1,u>0,其中δ>0.我们得到了m>2-2/N时,如果初值具有一定的正则性,则该问题存在整体有界的解.对于非退化情形(即D(0)>0),我们得了整体有界的古典解;对于可能退化的情形(即D(0)≥0),我们得到了整体一致有界的弱解.
[博士论文] 刘宇晨
生物学 南京大学 2016(学位年度)
摘要:细胞外囊泡(Extracellular vesicle,EV)是一种由细胞分泌的直径在30-100nm之间的双层膜包被的囊泡,通常也被称为微囊泡(Microvesicle,MV)或外泌体(Exosome)。EV通过介导细胞间的信号交流参与到很多生理过程及病理过程中。研究表明,细胞分泌的EV中包含miRNA,这些miRNA可以被运送至受体细胞并通过改变靶基因的表达调控受体细胞的功能。因此,越来越多的研究开始关注EV是否能够成为一种有效的体内核酸药物递送载体。
  为了从理论上确定细胞分泌的EV具备作为药物运送载体的可能性,我们首先对细胞分泌的EV的生物及物理性质做了分析。人胚肾细胞293T细胞系是目前常用的一种体外包裹分泌小核糖核酸的细胞系,因此我们首先对293T细胞的EV作为药物运送载体的可能性进行了分析。首先我们对293T细胞来源的外泌体中蛋白质,mRNA和miRNA的表达谱进行了鉴定。然后我们对这些数据进行了基因本体(GO)分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。生物信息学的分析结果表明293T细胞来源的外泌体中蛋白质,mRNA和miRNA组成不会显著影响受体细胞的生物学功能,也没有明显的组织特异性。我们定量对比分析了293T细胞转染功能性小RNA分子是否会改变外泌体蛋白质的表达,实验结果表明转染功能性小RNA分子基本不会影响293T来源的外泌体的蛋白表达水平。我们的研究结果从理论上表明293T来源的外泌体适合作为一种体内药物递送载体。
  在此基础上,我们开始对EV作为药物载体的可行性进行研究。我们发现肿瘤个体内,EV包裹的miR-150可以被递送至肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通过上调其表达血管内皮生长因子(VEGF)从而促进肿瘤的生长。这一现象说明miR-150在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用。为了证实miR-150可以作为肿瘤治疗的靶点,我们对体内miR-150的水平进行干预并观察小鼠肿瘤生长情况。在治疗过程中,我们制备包裹着miR-150反义序列的293T EV并对植瘤小鼠进行尾静脉注射。结果显示,EV包裹的miR-150反义序列(anti-miR-150)可以有效降低循环系统和肿瘤中miR-150和VEGF的表达水平,从而通过抑制肿瘤的血管新生抑制了肿瘤的生长。综上所述,我们不仅发现了miR-150在肿瘤生长过程中的作用,同时还提出了一种潜在的治疗癌症的新方法,即通过注射EV包裹的反义RNA序列来降低关键miRNA的表达从而达到治疗肿瘤的效果。
  为了进一步证实EV做为核酸药物体内运送载体的可能性,我们利用EV包裹siRNA来治疗阿片类药物的成瘾。在这一部分实验中,我们通过基因工程手段在EV表面表达了乙酰胆碱受体的肽段RVG,使得改造后的EV获得穿过血脑屏障、特异性到达中枢神经系统的能力。利用这种改造过的EV,我们有效的将介导阿片成瘾的关键蛋白OPRM的siRNA运送至脑中。结果显示RVG修饰的包裹的siRNA的EV可以有效降低小鼠脑中OPRM的蛋白质和mRNA的表达水平,并且在成瘾小鼠模型中强烈抑制了成瘾小鼠的复吸行为。我们的实验结果提供了一种治疗毒品成瘾复吸的新策略。
  综上所述,细胞分泌的EV可以作为一种有效的药物运送载体。并且和其他己知的药物运送载体相比,它具有毒性小、无免疫排斥等优势。目前基于siRNA等手段的基因治疗成为一种很有潜力的治疗方式,但是siRNA的运送问题一直是制约siRNA治疗的瓶颈。我们的发现为siRNA药物递送提供了新的思路,并且通过改造EV,可以使EV具有靶向性,更有效更特异的进行靶向治疗。
[硕士论文] 郎丰超
生物化学与分子生物学 中国科学院大学;中国科学院研究生院 2011(学位年度)
摘要:C型凝集素受体(C-Type Lectin Receptors,CLRs)是一类重要的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor,PRR),可以识别广泛的病原体,在树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)表面有大量表达。而DC前体细胞在不同刺激下表达不同的CLR,对HIV-1能否建立感染及其体内播散具有决定性的作用。因此,通过分析DC表达CLR的类别和水平,可以评价粘膜投送载体对HIV-1感染和播散的直接影响,可为粘膜疫苗、佐剂和药物的体外研究和安全评价,提供新的模式和指标。
   本论文之前的研究表明,女性生殖道特有的共生菌能够刺激DC前体细胞THP-1表达Cdla、CD324、CCR6等与Langerhans细胞(LC)相关的表面标志。而Langerin/CD207是LC特有的、更为特异的CLR,能够以高亲和力与HIV-1结合,从而捕获和灭活病毒,遏止其感染和传播。因此,本研究拟针对实验室已分离鉴定的6种生殖道共生菌对Langerin/CD207的诱导表达进行探讨。
   结果表明,L.crispatus可以刺激THP-1细胞高水平表达Langerin/CD207,伴有吞噬能力的明显上调及Th1类细胞因子的表达,提示L.crispatus能够诱导具有功能的LC,可以通过Langerin/CD207及免疫调控作用遏止HIV-1病毒感染和体内播散。因此,女性生殖道特有的共生菌可以作为粘膜免疫疫苗递送载体菌株进行进一步的深入研究。
   在此基础上,我们进一步分析比较了其它5个菌株对THP-1的作用和影响,发现在不同菌株刺激后,THP-1细胞的形态、5种凝集素分子、DC相关表面分子的表达和吞噬功能等多方面均有差异,提示不同菌株能否作为递送系统需要进一步评价和筛选。
   综上,本研究在THP-1体系中筛选出能够促进Langerin/CD207表达及免疫调控功能的菌苗,为筛选和评价女性生殖道定点递送体系以及在单核细胞中进行验证奠定了基础,同时也有助于根据已知的机理建立恰当的体外评价体系、从而前瞻性地判断粘膜免疫递送系统本身对病毒感染和播散的直接作用。
[硕士论文] 钱蓉
测试计量技术及仪器 华东理工大学 1997(学位年度)
摘要:该论文利用显微光学及图象处理方法进行了细胞病理切片分析的计算机系统的研制,即细胞免疫组织化学和核浆比定量分析系统的研制.该系统通过对细胞免疫组织化学和核浆比这两种病理诊断方法的定量分析来诊断肿瘤等疾病,它克服了传统病理分析方法中无法定量、主观性较大的弱点.该系统进行细胞免疫组织化学和核浆比分析,不但速度快、操作方便,而且准确性高.该论文详细说明了系统硬件构成及软件实现方法,并着重讨论了系统研制中所遇到的几个技术难题,最后利用该系统进行了实际应用测试,取得了良好的效果.
[博士论文] 李德玲
生物化学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 1996(学位年度)
摘要:细胞调亡或称程序性死亡是目前许多领域中的研究热点.研究中有一个基本问题还不清楚,即PCD中细胞质与细胞核的关系.Bcl-2基因的表达产物可阻遏PCD的发生.为探讨这一问题,作者构建了Bcl-2高表达细胞株Hbc17及其对照株H1,并以此为实验对象,在完整细胞、去核细胞及非细胞体系层次上研究顺铂诱导的PCD中细胞质与细胞核的关系.实验结果显示,顺铂可以引起去核细胞程序性死亡的改变,且在去核细胞中Bcl-2高表达株也具有抗PCD能力,说明引起PCD的物质及对抗PCD的物质在细胞质中都存在,说明细胞质在顺铂诱导的PCD中占有重要位置.虽然非细胞体系中细胞核的PCD改变是由细胞质中什么成分引起的,尚无法定论,但上述结果对于作者认识顺铂诱导的PCD中细胞质与细胞核的关系,重新认识顺铂的作用机理带来很多启发.
[博士论文] 丁昱
生物化学与分子生物学 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;中国科学院上海生命科学研究院;中国科学院上海生命科学院生化与细胞研究所 2008(学位年度)
摘要:Wnt信号转导途径通过激活胞内信号调节控制了许多生命过程,是目前已知的胚胎发育所必须的信号转导途径,控制和调节了体轴建立、神经诱导、器官发生和细胞命运决定等重要的发育生物学事件。同时wnt信号转导途径与肿瘤的发生也有着极为密切的联系。 在经典Wnt信号从细胞外向胞内传递的过程中,细胞膜上的受体frizzled和LRP5/6起到重要的桥梁作用。这一部分的工作发现了一个参与wnt信号调节的新成员Caprin-2。本研究证明Caprin-2和LRP5/6在体内/体外有直接相互作用,Caprin-2还可以结合wnt信号途径中的其它关键分子,如Axin,Dv1,GSK3。过表达Caprin-2或者降低内源Caprin-2会影响Wnt相关报告基因活性和下游靶基因的表达,提示Caprin-2可能作为正向调节子参与经典Wnt信号转导途径。 本研究还发现Caprin-2能够增强GSK3介导的LRP5/6的磷酸化,进而增强LRP5/6与Axin的相互作用。同时还发现Caprin-2能够增强Axin向细胞膜转运。利用斑马鱼胚胎发育系统确认Caprin-2参与调节了Wnt信号。根据这些发现,本研究提出了Caprin-2具有调节共受体LRP5/6向下游传递经典Wnt信号的功能,并简要揭示了该作用的分子机制。
[博士论文] 刘丰
神经生物学 上海交通大学 2014(学位年度)
摘要:研究目的:电压门控钙离子通道(voltage-gated calcium channel,Cav)对于维持可兴奋细胞钙稳态及其正常结构和生理功能具有重要作用。Cav膜表达的调控正日益受到关注,其孔道结构成分α1亚单位的膜转运及在缺乏Cav辅助亚单位的条件下其膜转运的变化和机制,目前仍不清楚。本研究探讨了14-3-3蛋白在Cav2.2通道膜转运过程中的作用及其机制。
  研究内容:14-3-3蛋白是否调控及如何调控Cav2.2通道膜转运,探索14-3-3蛋白对Cav2.2通道膜转运的影响及其转运途径和相关的可能机制。
  研究方法:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测tsA-201细胞和小鼠脑中各类内源性Cav通道辅助亚单位mRNA的表达情况;免疫印迹、免疫共沉淀方法研究14-3-3蛋白与Cav2.2钙通道孔道结构成分α1B亚单位C末端片段之间的相互作用;细胞免疫荧光染色及激光共聚焦技术,观察Cav2.2α1B以及Cav2.2α1BC末端片段的质膜表达情况,探索14-3-3蛋白对Cav2.2α1B膜转运的影响及可能作用机制;单细胞膜片钳电生理技术检测tsA-201细胞上转染的Cav2.2α1B通道电流密度及原代培养的海马神经元上的Cav2.2道电流密度,从功能角度进一步观察14-3-3蛋白对Cav2.2α1B膜表达的影响以及Cavβ亚单位与14-3-3蛋白协同调控Cavα1膜表达的可能性。
  结果:在缺乏Cav辅助亚单位条件下,14-3-3τ增强Cav2.2α1B膜表达水平,而表达14-3-3蛋白抑制肽(pSCM138)阻断14-3-3蛋白与Cav2.2α1B之间的相互作用,则会抑制14-3-3蛋白增强Cav2.2α1B膜表达水平效应;Cav2.2α1B C末端存在一段内质网滞留信号,14-3-3蛋白能够影响包含此内质网滞留信号序列的Cav2.2α1B C末端片段(CT1,aa1706-1940)而改变其膜表达水平,却不影响无此信号序列的CT2(aa2102-2220);14-3-3蛋白屏蔽内质网滞留信号从而增强CT1膜表达水平这一现象在被pSCM138阻断两者之间的相互作用时消失;无论在细胞系还是在培养的海马神经元,14-3-3蛋白与Cavβ亚单位均能够协同调控Cav2.2膜表面表达水平。
  结论:14-3-3蛋白通过屏蔽Cav2.2α1B C末端近端的内质网滞留信号来促进Cav2.2通道膜转运,且其能够与Cavβ辅助亚单位协同调控Cav2.2通道膜表达。
[博士论文] 曹进国
生物学;遗传学 东南大学 2012(学位年度)
摘要:G蛋白偶联受体(GPCRs)是一类具有七次跨膜结构的细胞表面受体,它们介导了许多细胞外信号向胞内传导,例如光、气味、激素、局部介质和神经递质等信号的传递。GPCRs介导了体内80%以上的生理事件,目前药物研发中50-60%的目标蛋白是GPCRs。GPCRs在翻译后通常会被糖基化修饰,其中N-糖基化修饰是最主要的一种修饰形式。修饰的寡糖链在GPCRs成熟过程中还将经历一个非常复杂的修剪过程。对于大多数GPCRs来说,其寡糖链修剪的分子机制和生物学意义目前还不清楚。果蝇的视质红质(Rhodopsin)是经典的GPCR。本论文以果蝇的Rhodopsin1(Rh1)为模型,研究了Rh1寡糖链修剪的过程和分子机制,解析了Rh1寡糖链修剪的生物学意义。
   论文首先利用免疫组化和密度梯度离心的方式详细描述了Rhodopsin寡糖链修剪的过程。结果显示翻译后的Rh1先在内质网中被N-糖基化修饰,随后其寡糖链在内质网中被初步修剪,接着被转运到高尔基体内被进一步修剪,最后Rh1被定位到感光细胞的Rhabdomere上发挥功能。
   我们发现果蝇金属磷酸酯酶(dmppe)突变体的Rh1寡糖链的修剪过程存在明显缺陷,该缺陷可以被感光细胞中特异表达dMPPE所恢复。这些结果说明dMPPE介导了Rh1寡糖链的修剪过程。我们接着阐明了dMPPE主要定位于感光细胞的Golgi中,并且与未成熟的Rh1共定位。通过在体和离体的生化和遗传学实验,我们揭示了dMPPE具有Mn2+/Zn2+依赖的磷酸酯酶活性,并且该酶活性是Rh1寡糖链的修剪所必需的。利用质谱分析方法和遗传学方法,我们发现了dMPPE是可以直接介导α-Man-Ⅱ的脱磷酸化从而调节α-Man-Ⅱ的糖苷酶活性;而α-Man-Ⅱ突变体具有与dmppe突变体一样的Rh1寡糖链修剪的缺陷表型,并且体外重组表达的α-Man-Ⅱ可以直接对Rh1寡糖链的进行修剪。这些研究结果充分说明dMPPE是通过直接介导α-Man-Ⅱ的脱磷酸化调节α-Man-Ⅱ的糖苷酶活性,从而介导Rh1寡糖链的修剪。
   在此基础上,论文明确剖析了寡糖链修剪对于Rh1功能的影响。利用电生理学、免疫组化和生化相结合的方法,我们研究发现寡糖链修剪的缺陷并不影响Rh1的正常定位和生理功能;但会影响Rh1向rhabdomere的转运速度,并且使得内吞后的Rh1稳定性降低,致使Rh1被迅速降解导致视网膜退变。
   最后我们通过遗传学和生化方法筛选了其他参与Rh1寡糖链修剪过程的分子。结果结果显示α-Man-Ⅱ b也参与了Rh1的寡糖链修剪过程,并且作用于α-Man-Ⅱ的下游。
   这一系列研究对阐明膜蛋白寡糖链修剪的过程、分子机制及其生物学意义具有重要的价值;对于针对GPCR的药物开发具有潜在的参考和借鉴价值。
[硕士论文] 祝一凡
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2009(学位年度)
摘要:Ca2+是细胞信号转导中重要的第二信使,几乎所有的生理活动都受Ca2+的调控。钙振荡是兴奋细胞和非兴奋性细胞的胞质游离钙离子的一种普遍运动形式。钙振荡的频率、振幅、时相等特征编码了钙信号的特异性。通过表面受体引发的钙振荡在细胞间和单个细胞不同时间点上的频率和振幅都各不相同,致使刺激波形很复杂,难以分析。人工诱导细胞产生同步化钙振荡有助于人们对钙信号编译特性的潜在机制进行深入研究。
   透明的平版式几何构型的微流控芯片更适于观察、检测,而且芯片的微通道结构设计灵活多样,微通道的尺寸可与细胞尺寸相比拟,能精确控制流体,具有集成化、自动化的特点,非常适合用不同试剂处理细胞然后检测细胞相应信号的研究。本文设计制作了微通道结构为类Y型的微流控芯片,在优化了快速切换溶液的方法后,在芯片上培养HeLa细胞,并用毒胡萝卜素处理细胞,通过快速切换溶液控制胞外钙离子浓度,同时检测HeLa细胞的胞质游离钙离子的信号。实验结果表明,本文人工诱导HeLa细胞群产生了频率一致,振幅相对恒定的同步化钙振荡,同时发现细胞群同步化钙振荡的振幅随胞外钙离子浓度的增加而增加。
   本文发展的诱导细胞产生同步化钙振荡的方法可应用于研究细胞信号转导过程中各种与钙离子有关的分子的作用。例如,在多种信号转导途径中腺苷酸环化酶起到催化ATP转化为环腺苷酸(cAMP)的作用,而胞质游离钙离子浓度可调节腺苷酸环化酶的活性,如能检测同步化钙振荡细胞的cAMP的浓度,将对揭示Ca2+和cAMP这两种重要的第二信使在信号转导网络中的相互作用有重要的意义。
[博士论文] 王迪
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及国内外研究进展
  昆虫是世界上种类最多的生物类群,其发育大多数经历蜕皮和变态两种主要的生理过程。昆虫的生长发育主要由蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)控制。在昆虫幼虫阶段JH滴度较高,虫体维持其幼虫状态;在蜕皮变态期JH滴度逐渐降低,而此时20E滴度逐渐升高,最终起始昆虫的蜕皮变态。这两种激素协调控制昆虫的蜕皮与变态过程。研究这一过程的分子调控机制不仅可以为害虫防治提供科学依据,而且可以为研究人类疾病的分子机制提供参考。
  先前研究发现蜕皮激素主要是通过核受体ecdysone receptor(EcR)途径转导信号起始昆虫的变态。近些年,随着分子生物学技术水平的日趋提高,研究人员发现了20E激素信号通路存在非基因组途径。许多信号通路中的蛋白质会发生快速的磷酸化修饰及移位现象。20E也可动员细胞内钙离子的释放及内流。与此同时,20E非基因组途径的膜受体也成为研究的热点。目前在许多物种中都发现了G蛋白偶联受体(GPCR)参与动物类固醇激素的非基因组信号通路,但是具体的机制尚不清楚。
  钙离子是细胞内的第二信使,调控多种生理过程,包括基因转录、细胞增殖和细胞凋亡等。类固醇激素20E在昆虫变态过程中促进程序性细胞死亡,而保幼激素JH拮抗20E的功能来阻止变态的发生。20E和JH都能诱导细胞内钙离子水平的增加。然而,这两种功能相互拮抗的激素诱导钙离子水平增加的分子机制及生理结果仍不明确。在这项研究中,我们筛选到在鳞翅目昆虫棉铃虫中的ErGPCR-2作为靶标基因,研究GPCR在20E非基因组途径中的功能,以及钙离子作为第二信使在20E调控的细胞凋亡中的分子机制。丰富和完善了20E信号途径及昆虫生长发育的理论知识。同时为害虫防治及人类疾病治疗提供靶标基因和科学依据。
  研究结果
  1.G蛋白偶联受体2在细胞膜上控制蜕皮激素信号通路
  在这项研究中,我们筛选到了鳞翅目昆虫棉铃虫中的一个GPCR,命名为ErGPCR-2,在细胞膜上控制类固醇激素20-羟基蜕皮酮信号通路。ErGPCR-2在棉铃虫的蜕皮和变态时期具有较高的表达。20E通过ErGPCR-2调控棉铃虫表皮细胞系中钙离子水平快速变化、有关蛋白质的磷酸化、相关基因的转录以及虫体的变态发育过程。ErGPCR-2定位于细胞膜上,在20E的诱导条件下,ErGPCR-2会被G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)所磷酸化,磷酸化修饰后的ErGPCR-2被内吞入细胞质中。内吞入细胞质后的ErGPCR-2被蛋白酶所降解,最终脱敏20E信号通路。细胞系干扰ErGPCR-2减少了20E的类似物[3H] ponasterone A([3H]Pon A)进入细胞的量。细胞系过表达ErGPCR-2和干扰GRK2阻止ErGPCR-2的内吞,都会增加[3H]Pon A进入细胞的量。然而,我们没有检测到ErGPCR-2蛋白直接结合于[3H]Pon A。结果表明ErGPCR-2在细胞膜上传导类固醇激素20E信号并且控制20E进入细胞。
  2.蜕皮激素促进钙离子动员并引起细胞凋亡
  20E通过GPCR诱导细胞内较强的钙离子水平升高,而JH通过受体酪氨酸激酶(RTKs)诱导较小的钙离子水平增加。钙释放激活钙通道1(Orai1)和瞬时受体电位通道(TRPs Channel),对20E诱导快速钙离子内流是必需的。相对于JH,20E处理细胞会引起钙离子维持在长时间的高水平状态,并且提高了更多的钙通道相关基因的表达,包括Orai1和TRP通道等。20E会激活Caspase3/7和促凋亡基因的表达,而JH不能。JH可以抑制20E诱导的钙内流、Caspase3/7的激活和凋亡相关基因的表达。高水平的钙离子诱导细胞凋亡。这些结果表明,20E和JH通过不同的途径调节细胞内钙并且维持钙离子在不同的稳态水平,因此导致不同的基因表达和细胞生理反应。
  研究结论及科学意义
  1.ErGPCR-2在细胞膜上控制20E进入细胞
  ErGPCR-2定位于细胞膜上控制[3H]PonA进入细胞。ErGPCR-2在细胞膜上调控20E信号通路。这一研究完善了20E非基因组途径的科学知识,建立了基因组途径与非基因组途径的连接,为今后研究20E信号途径提供了全新的理论依据。
  2.蜕皮激素促进钙离子动员引起细胞凋亡
  20E通过GPCR动员细胞内较强的钙水平升高,而JH通过RTKs动员较弱的钙水平增加。20E处理细胞会引起钙离子在细胞质中维持在长时间的高水平状态,20E上调更多钙通道相关基因的表达。20E诱导Caspase3/7活化水平、促进细胞细胞死亡和上调促凋亡基因的表达,高水平的钙离子诱导细胞凋亡。钙离子作为细胞中重要的第二信使,在细胞增殖凋亡过程中发挥重要的功能。20E通过GPCR途径动员钙离子使其维持高水平的稳态,最终细胞中高水平的钙离子诱导了细胞凋亡。这一研究证实了钙离子在细胞凋亡中的功能,不仅为完善昆虫凋亡的分子机制做出贡献,也为癌症治疗中促进癌细胞凋亡提供科学依据。
[博士论文] 王盛
生物化学与分子生物学 南京大学 2013(学位年度)
摘要:荧光共振能量转移(FRET)是两个荧光分子间的一种非放射性的能量转移形式,由于FRET产生时对两个荧光基团间的距离的强烈依赖性,因而特别适用于在活细胞中检测分子间或者分子内的相互作用。基于光学显微镜平台的荧光共振能量转移技术已被广泛地应用于活细胞内蛋白质时空相互作用的检测、蛋白质分子构象变化的监测、生物探针的研制等研究中。
  为了更好地研究活体内蛋白质的时空相互作用,我们基于OlympusⅨ-81倒置荧光显微镜自行搭建了用于活细胞成像的三通道荧光共振能量转移技术显微镜成像平台。基于此平台,我们运用青绿色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)定量测定了系统中的荧光渗漏系数。利用蛋白相互作用阳性对照CFP-YFP嵌合体,和蛋白相互作用阴性对照CFP和YFP,我们根据敏化FRET测量方法(Sensitized-emission FRET)定量测定了该系统在蛋白相互作用检测上的可行性。研究结果表明,我们成功搭建了活细胞三通道荧光共振能量转移技术显微镜平台,并成功利用敏化FRET测量方法定量检测了阳性和阴性对照的蛋白质相互作用活细胞FRET荧光信号。
  三通道敏化FRET测量方法在活细胞蛋白质相互作用检测方面虽然有巨大优势,但也有其致命的弱点,比如荧光供受体在光谱学上的窜扰,以及活细胞中荧光供体和荧光受体的摩尔比例的不同会造成活细胞中局部荧光分布的异质性,这种异质性很大程度上影响了集群FRET(ensemble FRET)信号的定量测量。为了探寻荧光供受体的化学计量(Stoichiometry)对定量FRET测定上的影响,从而为一些经典敏化FRET检测公式确定合适供受体比例的适用范围,我们利用c-Fos/c-Jun为异源蛋白相互作用数学模型,定量研究了不同供受体比例对经典敏化FRET检测公式在FRET测定及计算上的影响。我们首先通过阳性对照CFP-YFP建立了分子内FRET数学模型,并以此测定了显微镜G参数,之后基于测定的G参数,我们还原了活细胞内的真实CFP-Jun和YFP-Fos蛋白化学计量比例。通过还原的供受体蛋白浓度比例对经典FRET公式NFRET、FRETN、FR、FRETR、Eapp和EEFF作图,我们系统研究了供受体浓度比例对FRET定量计算公式的影响,并最终确定了这些公式的适用条件。
  FADD是凋亡信号中的一类接头蛋白,在死亡受体介导的细胞凋亡中发挥重要作用。在经典的配体受体依赖的细胞凋亡信号途径中,如果凋亡受体Fas被激活,FADD通过其C末端死亡结构域(deathdomain)与Fas的胞内区结合,而其N末端死亡效应结构域(deatheffector domain)可以作为招募平台来招募caspase8,从而使得caspase8自激活,并激活下游caspase3,从而介导细胞死亡配体依赖的细胞外凋亡信号。FADD除了作为接头蛋白介导外界凋亡诱导信号外,在细胞中过表达FADD蛋白还会诱导FADD的非经典细胞凋亡途径。即FADD蛋白的自身聚集,形成特殊的死亡效应纤维(DEF)结构,DEF上可以招募caspase8,从而引起非死亡配体受体依赖的细胞凋亡。虽然FADD蛋白自身聚集形成DEF的现象已被前人研究所报道,但究竟FADD在活细胞内如何形成DEF导致细胞凋亡,FADD蛋白分子的哪些结构区域决定了FADD蛋白自身的聚集,以及各区域是否能调控FADD自身相互作用的内在机制还不是很清楚。基于以上建立的活细胞FRET检测平台,我们对FADD蛋白在活细胞中的自身相互作用进行了定量测定和荧光成像。首先,我们通过定性荧光光谱实验发现FADD自身相互作用由其DED介导,活细胞数据验证了前期报道的DED结构中F25决定了其自身相互作用。其次我通过定量FRET成像实验首次发现了FADD的C末端“尾巴”具有调控FADD自身聚集强度的功能,去除FADD的C末端“尾巴”,FADD蛋白在活细胞内更容易形成聚集体,并诱导更多比例的细胞发生凋亡,所以我们认为FADD蛋白C末端的“尾巴”具有稳定FADD蛋白的功能。
  相对于分子间FRET(inter-molecular FRET)敏化方法测定的复杂性,分子内FRET(intra-molecular FRET)的测量则简单得多,所以分子内FRET的模型更多被人们用于设计和构建FRET分子探针。我们自主设计了一种基于钙调素(CaM)和其相互作用蛋白c-FLIPL的新的钙离子成像探针,并通过调整c-FLIPL的区段初步优化了探针的动态范围。我们的实验表明,利用c-FLIPL(197-260)构建的探针具有更好的动态范围。活细胞实验证实了该类探针用于钙离子成像上的可行性。虽然相比于现有的经典钙离子成像探针YC3.60在动态范围上还有差距,但我们初步验证了c-FLIPL作为构建钙离子探针的可行性,并提供了一种新的钙离子成像探针构建方式,后续的探针动态范围上的提升还有赖于CaM与c-FLIPL相互作用的更多结构学数据。
  此外,我们还成功设计并构建了锌离子活细胞FRET探针,其基本原理是利用MT2A蛋白的αdomain作为锌离子感受区,并利用circularly permuted GFP技术优化出高动态范围的锌离子探针,体外和体内试验都表明我们设计出的锌离子探针具有高特异性和高灵敏度的特点。我们研制出的锌离子探针为研究活细胞中锌离子信号提供了初步基础。
[博士论文] 曹灿
生物化学与分子生物学 中国科学院大学 2017(学位年度)
摘要:血小板激活因子受体PAFR(platelet-activating factor receptor)是一种脂类家族的G蛋白偶联受体,可以被其激动剂血小板激活因子PAF(platelet-activating factor)激活。PAFR的激活会引起包括哮喘、过敏、血小板聚集和动脉粥样硬化在内的多种疾病。而PAFR拮抗剂可以阻断PAFR的激活,并抑制相关疾病的发生。目前市场上有多种针对PAFR的药物来治疗相关疾病,但大部分药物来自于天然提取,受限于低亲和力和比较差的药物代谢,这些药物的效果十分有限。我们对PAFR的结构解析,有助于从结构水平上阐释药物与受体的作用机制,并为后续的药物研发提供结构基础
  经过一系列的蛋白改造和配体筛选,我们分别解析了PAFR与反向激动剂Ligand4的2.9(A)复合物结构以及PAFR与拮抗剂Ligand5的2.95(A)复合物结构,并阐释了PAFR配体的一种保守结合模式。此外,在PAFR-Ligand5的结构中展现出了一种非常特别的胞内侧螺旋排列方式,其TM2和TM4的胞内侧末端相比PAFR-Ligand4结构有着超过10(A)的外移。通过smFRET实验,我们对PAFR结构中观察到的TM2和TM4的构象变化进行了验证。结合PAFR在Ligand4、Ligand5以及激动剂PAF作用下的G蛋白激活实验结果,我们发现TM2和TM4胞内侧螺旋的外移程度与配体对PAFR的激活能力呈正相关的关系,其构象变化可能和PAFR的激活有关。最后,PAFR-Ligand5结构中的helix8伸展进ICL1和ICL2之间,呈现出一种从未被观察到的特殊构象。通过helix8突变体的G蛋白激活实验,我们发现helix8可能参与了PAFR对下游G蛋白的招募过程。
  综上所述,我们对PAFR结构研究不仅阐释了PAFR对配体的识别模式,而且还发现了PAFR展现出一种可能与受体激活和G蛋白招募相关的特殊的胞内螺旋排列方式,这对研究GPCR的激活机制有着重大的意义。
[硕士论文] 彭赞国
生物化工 天津大学 1999(学位年度)
摘要:该文和超声、高压匀浆和化学渗透法破碎重组大肠杆菌,以释放重组人白细胞介素-6融合蛋白包含体.研究了超声功率、菌体体积、菌体浓度对超声破碎的影响.选择破碎条件为菌体体积100mL,菌体浓度150g/L,在缓冲液50mmol/L Tris-HCl,pH8.0,50mmol/L EDTA,0.2mol/L NaCl中,用480J s<'-1>的功率超声15min,包含体的回收率为41.5%.并确定超声破碎临界功率为34.25J s<'-1>.研究了匀浆压力、匀浆次数对高压匀浆破碎的影响.用超声法结合尿素对包含体进行变性,研究了超声功率和时间,缓冲液体系和包含体浓度对变性的影响.选择适宜的变性条件为0.1mol/L Gly-NaOH,pH9.0,4mol/L尿素,50mmol/L β-ME,70J s<'-1>超声15min.此条件下的变性效果与用8mol/L尿素变性的效果相当.
[硕士论文] 毕强
生物化学与分子生物学 中国医科大学 2010(学位年度)
摘要:目的:
   大量的研究表明适度的卡路里限制(Calorie Restriction,CR)能延缓衰老,延长生命周期[1,2]。和CR相关的信号通路主要有三条:Akt/PKB,Tor,Ras。降低Akt/PKB,Tor,Ras的活性能在多种有机体内延长生命周期,这说明长寿的潜在机制在多种真核生物中的保守性[3,6]。
   cyr1是编码腺苷酸环化酶(AC)的基因,AC催化ATP产生cAMP,从而激活cAMP依赖的蛋白激酶活性。与营养信号、细胞周期、细胞生长、孢子形成、压力抵抗和长寿有关。cyr1突变之后,AC/cAMP/PKA途径被阻断而引起压力抵抗转录因子Msn2/4的增强,进而导致长寿。Ras/cAMP/PKA也调节细胞骨架Actin的稳定,细胞骨架的稳定是细胞维持正常的生命周期的必要条件。细胞骨架Actin通过cAMP通路调节着酵母细胞中线粒体功能,导致ROS的累集和凋亡等[4]。
   PIL1是eisosome的主要成分,和Pkh1/2共同定位内吞点。PIL1是LCB敏感的蛋白激酶抑制剂。PIL1是由PHK激酶介导的LCB的靶蛋白。PKH过表达,PIL1高度磷酸化,eisosome解聚,从而影响到细胞的内吞。既然PIL1和细胞骨架都与内吞都有联系[5],而细胞骨架的集聚又可以使RAS信号通路过度活化而引起酵母细胞的一系列衰老现象[4]。因此我们假设PIL1在cyr1突变菌中影响了生命周期的延长。本实验以cyr1突变菌为材料来集中研究PIL1在Ras/cAMP/PKA通路中的作用。
   材料与方法
   酵母菌:
   以DBY746为背景菌,WT
   单突变菌cyr1::mTn ras2△ pill△
   双突变菌cyr1::mTn pill△ ras2△ pill△
   质粒:
   将质粒YCplac22-PIL1(含PIL1蛋白开放阅读块和启动子)转入双突变菌组内,得到cyr1::mTn pill△/PIL1和ras2△ pill△/PIL1。
   将质粒YCplac22-CYR1(含CYR1蛋白开放阅读块和启动子)转入cyr1::mTn内,得到cyr1::mTn/CYR1。
   培养基:
   采用Longo’s Aging medium[5]以2%的葡萄糖作为碳源。首先挑选新鲜的克隆,以2ml的Aging培养基得到SONC(saturated overnight culture)。以起始OD=0.1组成25ml的培养液,放入125ml的培养瓶中,220rpm进行培养。3天后,细胞达到稳定期并停止分裂,但是仍然存活,我们视之为第一天(Day 1)。
   CLS测定:Chronological life span assay[3]
   从第一天开始,每隔2-3天取50微升的菌液稀释10000倍后涂抹于YPD培养板上,30℃培养2天后,计克隆数。
   过氧化氢抵抗:
   取1OD细胞用135mM H2O2在室温下处理一小时,做10倍系列稀释,涂在YPD板上(1% yeast extract,2%peptone,1.5%agar和2%glucose)30℃培养2-3天。拍照观察克隆稠密情况。
   Caspase活性测定:
   CaspACE-FITC-VAD-FMK定位,以终浓度5-10μM避光染色20min,PBS洗3次后进行流式细胞术(488nm,452-450nm)。
   误差控制:
   所有培养瓶规格,操作均统一,设置3组平行对照,以减少误差。
   结果
   pil1的敲除对cyr1突变菌的影响是显著地:在cyr1突变菌中敲除pil1基因,则原本长寿型的cyr1突变菌的生命周期缩短,对过氧化氢的抵抗能力下降,且原本较低的半胱天冬酶活性维持在高水准,凋亡指标与WT野生型酵母类似。而在ras2的突变菌中没有发现类似的现象。
   结论
   PIL1与cyr1突变菌的长寿现象有关;但对ras2△菌种无显著影响。
[硕士论文] 张妮佳
分析化学 华中师范大学 2014(学位年度)
摘要:白介素21(IL-21)是一种可免疫调控多种细胞分化和功能的多效性细胞因子,在体液免疫和细胞免疫中均发挥重要的作用。蛋白质的空间结构是实现其强大生物功能的基础,而残基突变是提高蛋白质活性的有效途径之一。本论文从hIL-21突变体的建立和生物学实验两个方面研究hIL-21突变体,分以下两部分:
  1.hIL-21突变体的建立
  通过对同源性较高的白介素进行多序列比对、IL-21/IL-21Rα复合物结构进行构象分析以及软件辅助预测来确定突变位点,得到hIL-21的三个突变体。根据野生型(WT)hIL-21结构采用同源模建的方法构建了三个突变体的空间结构,与野生的IL-21相比,发现空间结构没变,说明选择的突变位点以及突变后的氨基酸没有破坏蛋白质空间构象;之后用Fold(X)来分析突变前后ΔG的变化,以kcal/mol为单位,结果显示ΔΔG(突变体1、3)<0,0<ΔΔG(突变体2)<0.5;随后对IL-21的三个突变体运用受控分子动力学(SMD)分析每个残基的骨架顺从性,发现IL-21的突变体3中Helix A上“stability patch”数目增加,这与高活性的IL-2的突变体D10及IL-21的突变体hIL-21/hIL-4的SMD分析结果一致,所以推测突变体3与受体结合亲和力增加,活性更高,结合Fold(X)的分析结果,可认为突变体3是三种突变体中最好的。
  2.获得高产量hIL-21突变体蛋白实验条件的优化
  通过MODELLER同源模建方法得到hIL-21的三个突变体的结构,为了用实验验证hIL-21突变体的生物活性,本部分选取hIL-21突变体3重组蛋白进行研究。首先对hIL-21突变体3重组蛋白进行表达,利用营养丰富的LB培养基进行细胞培养,短时间就可以获得高细胞密度的大肠杆菌,而且细菌细胞仍处于增长状态,之后将细胞转入无机盐培养基M9中,不断优化其在M9培养基中的培养条件,使菌体在优化过的温度下培养1-1.5h,再加入IPTG诱导蛋白表达,以获得最高表达量的蛋白,以便在后续实验中对目标蛋白进行活性研究。
[硕士论文] 宁晓卿
生物化学与分子生物学 华东理工大学 2011(学位年度)
摘要:二硫键的形成在蛋白质的合成和功能中发挥重要作用,是蛋白质结构和稳定必不可少的。在线粒体和内质网中都能形成二硫键,但它们的机制不太相同。二硫键的形成与许多重要的生命过程相关,例如,凋亡,老化和呼吸链的调节。为了研究细胞内的二硫键,我们利用了氧化还原敏感的绿色荧光蛋白(roGFP)。 roGFP能够实时观察细胞内的二硫键形成势。为了在亚细胞水平研究二硫键的形成,我们在细胞内稳定表达了roGFP,将细胞器信号肽和roGFP融合表达,使roGFP定位在不同的细胞器中,测定这些细胞器形成二硫键的氧化还原势。我们发现胞浆最还原,内质网,高尔基体最氧化,能够形成蛋白质的二硫键。
   生命过程十分复杂,因此我们希望能够多重标记细胞。我们将细胞器的信号肽构建到Halotag基因上,使其能够在定位于不同细胞器。Halotag是一种新的细胞成像技术。它的反应底物可以更换成不同的荧光染料。蛋白标签和染料的共价结合是高特异性的,在生理条件下,反应速率很快,而且是不可逆的。
   为了研究含有二硫键的蛋白质的相互作用,我们发明了一种依赖于SNAP的蛋白片段互补技术。在我们的实验中,报告蛋白SNAP(衍生于hAGT)被拆分成两个没有活性的片段,相互作用的两个蛋白分别和拆分的两个片段融合表达。蛋白的相互作用,促使拆分片段靠近,发生重装配,恢复SNAP的活性,SNAP的活性可以通过含有荧光基团的SNAP的底物检测。最后,我们确定了一对SNAP拆分片段,它们可以通过融合的相互作用的蛋白,互补装配,形成完整的蛋白,恢复可以被检测到的完整蛋白的活性。这项技术拥有PCA和共价标记融合蛋白SNAP的优点。
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