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[硕士论文] 陈凯
电气工程 兰州交通大学 2018(学位年度)
摘要:在生物神经系统中,神经元之间是通过突触相互连接的,神经突触的传递作用主要在于实现神经元之间的信息交流,其中传递过程复杂且占主导地位的传递方式则是化学突触传递。本文以兴奋性化学突触为主要研究对象,采用用于描述神经元动作电位产生和传导机制的Hodgkin-Huxley模型作为突触前和突触后神经元,以基于不同机制的化学突触模型连接两个HH神经元模型构成简单的化学突触单向耦合结构,对五种化学突触模型进行建模仿真和硬件实现。
  首先,生物神经元和突触的基本理论及其数学模型。描述了生物神经元和神经突触的基本结构,并且说明了神经元的电生理活动以及突触的电生理特征。对所采用的神经元数学模型,即HH神经元模型和五种不同的化学突触数学模型进行了描述。
  其次,神经突触的数值模拟研究。对基于不同机理的五种化学突触模型进行了Simulink建模仿真,探究了其化学突触传递特性,并且采用相关系数法对五种化学突触的仿真模拟结果进行了比较研究,分析出了五种化学突触模型中最接近于生物学实际的模型。此外,以其中一种化学突触模型为研究对象,分析了在突触间隙神经递质的浓度和耦合强度不同的因素下对突触响应结果的影响和突触后神经元活动的影响,结果表明在突触间隙神经递质的浓度和耦合强度较小的情况下,突触后神经元活动是产生兴奋性突触后电位,而当突触间隙神经递质的浓度和耦合强度较大时,突触后神经元活动是产生动作电位,并且随着突触间隙神经递质的浓度和耦合强度的增大,突触后神经元动作电位的上升相变快。
  最后,采用硬件的方法实现化学突触。对五种化学突触模型运用FPGA(FieldProgrammable Gate Array,现场可编程门阵列)和DSP Builder相结合的技术分别进行了硬件实现。对五种化学突触模型中的突触前神经元施加了相同的电流刺激,得到了五种化学突触的硬件结果,并且硬件结果很好地再现了化学突触的传递特性,通过将硬件结果与其仿真模拟结果进行对比,验证具有生物性的化学突触模型的硬件结果的正确性。
[硕士论文] 徐密
生物学;动物学 牡丹江师范学院 2018(学位年度)
摘要:睡眠是动物机体对于损伤的重要调节方式,也是动物生命活动的重要组成部分。动物很多自我修复活动都是在睡眠中完成的,如果干扰或阻拦动物的睡眠,会导致机体产生很多不可逆的伤害。本文采用了小平台水环境法,模拟睡眠剥夺环境,以大林姬鼠为实验动物,探究了不同时长的睡眠剥夺对动物机体的影响,结论如下:睡眠剥夺会使大林姬鼠取食频次呈现先上升后下降的趋势,上升多发生在睡眠剥夺2d左右,下降则发生在睡眠剥夺4~5d左右;在睡眠剥夺后,大林姬鼠会有一段代偿性补眠导致的活动量减少,但是这种活动量减少的现象一般不会超过48h,并且与睡眠剥夺的时间不成正比;睡眠剥夺还会使大林姬鼠取食频次体现先增加后减少的趋势,但同时,体重却一直在减少,即使取食频次增多,体重也依然是减少的状态;睡眠剥夺对于大林姬鼠雌雄间差异的影响不大,不同时长的睡眠剥夺影响下,大林姬鼠雌雄间的差异并没有显著差异;通过观察心电图,则显示出T波上抬,S-T段逐渐延长,P-R间期延长,QRS波群延迟,这种变化程度与睡眠剥夺时间成正比;同时,睡眠剥夺还会影响大林姬鼠肝脏的健康,严重时可能引发急性肝脏损伤或不可逆肝脏损伤。
[硕士论文] 薛妍
应用心理学 浙江理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:机体受到应激之后,海马体积与神经元凋亡率发生偏侧化改变,可能与应激对神经元自噬的影响有关,但是不同应激源对神经元自噬造成的影响以及是否具有左右脑差异并未进行深入研究,因此本研究通过建立慢性心理应激大鼠模型和慢性疼痛应激大鼠模型,考察①两种应激模型是否造成大鼠行为改变,②两种应激模型作用下,大鼠左右海马自噬信号是否会发生改变,③自噬水平是否存在左右脑不对称性改变以及激活的信号通路。
  方法:将雄性Sprague-Dawley‘大鼠随机分配为空白组、心理应激组,假手术组与疼痛应激组,在建立慢性心理应激模型以及慢性疼痛应激模型后,测量体重,并进行糖水偏好测试和痛敏测试。进一步,通过透射电镜观察四组大鼠左右双侧海马自噬体的形成并进行蛋白免疫印迹实验,检测两种慢性应激后,大鼠左右双侧海马自噬标记蛋白(LC3-Ⅱ,p62)以及磷酸化moTOR信号蛋白(p-mTOR)的表达水平是否发生偏侧化改变,并深入探究两种应激模型对大鼠海马自噬影响的不同之处。
  结果:①慢性心理应激造成大鼠体重下降和糖水偏好下降,并且与慢性疼痛应激均降低大鼠机械性疼痛阈限。②慢性心理应激造成大鼠右侧海马LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著性下降,p62蛋白表达水平下降,这些变化在左侧海马并未发生显著性改变。慢性疼痛应激同样引起大鼠右侧海马p62蛋白表达量显著上升,但LC3-Ⅱ蛋白在双侧均未发生显著变化。③慢性心理应激造成大鼠右侧海马p-moTOR蛋白表达量显著性下降,但是在左侧并未发生显著性改变。而慢性疼痛应激并未造成大鼠双侧海马p-mTOR蛋白表达量发生显著性改变。
  结论:①慢性心理应激和慢性疼痛应激均会造成大鼠机械性疼痛阈限下降,表明发生一般适应性改变,可将共同的行为变化作为慢性应激损伤的行为指标。②慢性心理应激和慢性疼痛应激对大鼠海马自噬过程影响具有差异在慢性心理应激模型中,mTOR激活受到抑制,自噬通量增强,发生自噬过量;而在慢性疼痛应激模型中,自噬通量受损。③在两种慢性应激模型中,自噬的变化存在左右脑差异,从自噬过程受到的影响方面来看,右脑更易受到应激事件的影响。
[硕士论文] 司丽炜
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)对骨骼肌生长具有负调控作用,抑制骨骼肌过度生长,其基因突变或蛋白功能的缺失会促进肌细胞增殖和肌纤维肥大。动物消化道菌群参与消化代谢、影响血液生化,与动物的生长发育有着密切关系。为了解MSTN基因编辑后是否影响消化道菌群组成,及其与血液生化和生长性状之间的关联性,本实验分别选用MSTN基因编辑牛(MSTN组)和对照牛各6头(公母各3头),分别检测其1月龄、3月龄、6月龄和12月龄时的消化道菌群,并测量和分析体重体尺等生长指标和血液生化指标。结果表明:(1)1月龄、3月龄、6月龄和12月龄MSTN组体重、体斜长、体高和十字部高等体尺指标均显著或极显著高于同月龄对照组,且公牛差异更为明显。(2)血液生化指标中,MSTN组3月龄和6月龄血清碱性磷酸酶含量显著高于同月龄对照组(P<0.05);1月龄、3月龄和6月龄公牛血糖含量显著低于同月龄对照组(P<0.05);MSTN组1月龄和6月龄母牛和6月龄公牛血液尿素氮含量显著低于同月龄对照组(P<0.05);3月龄MSTN组血清肌酐含量极显著高于同月龄对照组(P<0.01);1月龄血清球蛋白含量MSTN组母牛极显著(P<0.01),公牛显著高于同月龄对照组(P<0.05)。表明MSTN组牛血糖分解能力、蛋白质分解代谢水平高于对照组。(3)消化道菌群分布和聚类分析结果显示,各月龄MSTN组和对照组菌群分布有所不同;母牛消化道菌群分布相似,而两组犊牛1月龄菌群分布差异明显,表明母牛消化道菌群对犊牛影响不明显;随着月龄的增加,菌群组成明显增多,其中1月龄菌群组成最少;3月龄与其他组有明显差异,6月龄和12月龄没有明显的差异。Lactobacillus johnsonii、Oscillibacter valericigenes和Lactobacillus reuteri为犊牛主要的优势菌群,而且在MSTN组,这些有益生作用的菌种丰度高于对照组。另外两种益生菌Bifidobacterium bifidum和Butyricicoccus pullicaecorum为MSTN组1月龄特有的菌种。Eubacterium callanderi和Bacteroides coprophilus为6月龄和12月龄共同的优势菌种。Oscillibacter ruminantium为MSTN组3月龄、6月龄和12月龄优势菌种。MSTN基因编辑影响部分消化道菌群组成,血液相关指标和生长指标也有显著差异。这些有差异的消化道菌种与其血液生化指标和生长性状的关联性及其作用机理和相关通路仍需要进一步验证。
[硕士论文] 叶凤江
动物遗传育种与繁殖 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:肝脏在维持机体糖脂代谢平衡中扮演着重要角色。本研究室前期在细胞水平的研究表明,葡萄糖和果糖诱导鹅肝细胞脂质沉积的能力不同,提示不同类型糖诱导肝细胞脂质沉积能力不同。CPT1A、MTP是脂质代谢中脂肪酸氧化和脂质转运途径上起关键作用的基因。本研究以天府肉鹅母系为研究对象,克隆鹅CPT1A、MTP基因的CDS区序列,并进行生物信息学分析;采用半原位二步胶原酶灌注法分离培养鹅原代肝细胞,通过葡萄糖、果糖和蔗糖分别处理体外培养的鹅原代肝细胞并分别转染CPT1A、MTP干扰质粒,采用MTT检测细胞活力,荧光定量PCR法、Elisa试剂盒检测法以及油红O染色法检测脂肪酸合成,VLDL-TG分泌转运以及脂肪酸合成、脂肪酸氧化和脂质转运途径的相关指标来反映脂质代谢的变化,初步探讨CPT1A、MTP干扰对三种糖诱导的鹅肝细胞脂质沉积的影响,能够更为清晰的了解糖诱导肝脂质沉积的机理。主要结果如下:
  1.通过设计分段引物进行PCR扩增并拼接获得鹅CPT1A、MTP基因CDS区序列。鹅CPT1A、MTP基因的CDS区序列分别编码770、893个氨基酸。
  2.分别转染CPT1A、MTP干扰质粒24小时后,Q-PCR检测显示CPT1A、MTP干扰效率分别达51.3%、62.6%,表明CPT1A、MTP干扰鹅肝细胞成功。
  3.转染CPT1A干扰质粒后,FAS、ACCαmRNA表达量无显著变化,SREBP1mRNA表达量显著下降(P<0.05),FAS、ACCα激酶含量显著升高(P<0.05);CPT1A、ACOX1、PPARαmRNA表达量显著下降(P<0.05),CPT1A激酶含量显著降低(P<0.05);MTP、APOB、DGAT1mRNA表达量显著下降(P<0.05),MTP、APOB激酶含量无显著变化。油红O染色显示鹅肝细胞干扰CPT1A使细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时细胞内外TG含量增加,而胞外VLDL含量减少。
  4.转染MTP干扰质粒后,FAS、ACCαmRNA表达量显著升高(P<0.05),SREBP1mRNA表达量显著降低(P<0.05),FAS、ACCα激酶含量显著升高(P<0.05);CPT1A、ACOX1、PPARαmRNA表达量无显著变化,CPT1A激酶含量无显著变化;MTP、APOB mRNA表达量显著降低(P<0.05),DGAT1mRNA表达量无显著变化,MTP激酶含量显著降低(P<0.05),APOB激酶含量无显著变化。油红O染色显示鹅原代肝细胞干扰MTP后,细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时胞内外TG和胞内VLDL含量增加,而胞外VLDL含量减少。
  5.与单独葡萄糖或单独蔗糖处理相比,葡萄糖或蔗糖处理同时干扰CPT1A后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量升高,CPT1A、ACOX1基因表达量降低,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。与单独果糖处理相比,果糖处理同时干扰CPT1A后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量降低,CPT1A、ACOX1基因表达量降低,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。油红O染色显示三种糖分别处理同时干扰CPT1A使细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时细胞内TG和胞内VLDL含量增加。
  6.与单独葡萄糖或蔗糖处理相比,葡萄糖或蔗糖处理同时干扰MTP后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量升高,脂肪酸氧化途径上的重要基因表达量及其蛋白激酶含量无显著变化,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。与单独果糖处理相比,果糖处理同时干扰MTP后,FAS、ACCα、SREBP-1基因表达量及FAS、ACCα蛋白激酶含量降低,CPT1A、ACOX1基因表达量升高,MTP、APOB基因表达量及MTP蛋白激酶含量降低。油红O染色显示分别三种糖处理同时干扰MTP使细胞内脂滴颗粒增多,脂质沉积明显,同时细胞内外TG和胞内VLDL含量增加。
[博士论文] 方升林
动物营养与饲料科学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:铁元素是动物机体不可或缺的微量元素,然而缺铁却普遍影响着动物生产和人类健康。外源补铁能够有效地预防和改善缺铁,但是铁极易诱导活性氧自由基的产生,并诱导氧化损伤。
  1、饲喂过量铁对断奶仔猪的生长和氧化应激的影响
  在仔猪生产中,饲料中往往添加高于营养需求量的铁元素,是否对生产造成影响未得到有效评估。因此,该试验以40头断奶仔猪为研究对象,随机分为四组,研究饲喂基础日粮(100mg/kg铁)、实际生产水平日粮(400mg/kg铁)以及高出生产实际水平日粮(4000mg/kg铁,10000mg/kg铁)28天对断奶仔猪生长和氧化应激的影响。结果表明,尽管实际生产水平日粮中的铁元素高于营养需求,但对断奶仔猪生长无显著影响,然而饲喂高出生产实际铁水平日粮容易诱导肠道和肝脏出现氧化应激,暗示400mg/kg铁可能对仔猪生产存在潜在危害。
  2、过量铁诱导大鼠机体损伤效应和机理研究
  大量研究表明了过量铁和氧化还原代谢之间的关系,然而过量铁诱导毒副作用的病因学尚未得到全面的研究,过量铁诱导氧化损伤的组织病理学变化以及对肠道屏障功能的影响也未得到系统的研究。因此,本研究通过试验一,40只雄性SD大鼠分为四组,对照组灌胃1ml不含铁的溶液,其余分别灌胃含8mg、16mg、24mg铁的溶液30天,以研究过量铁的氧化损伤效应,并以16S rRNA基因测序研究对肠道微生物菌群的影响;通过试验二,20只大鼠分为两组,分别灌胃不含铁和含24mg铁的HCl溶液30天,以体内和离体Ussing Chamber试验研究肠道屏障功能。结果表明,过量铁能够导致显著的肠道和肝脏损伤,并出现组织病理学改变,线粒体膨胀和细胞死亡等现象;过量铁能够破坏肠道屏障功能,改变肠道菌群结构,后肠段损伤和通透性的增加对整个肠道健康存在不利影响。
  3、过量铁诱导细胞损伤和死亡的机制研究
  除外源补铁造成的损伤外,铁代谢基因突变能够诱导以肝脏为主的脏器损伤。过量铁是否导致特定的细胞死亡,以及其导致特定细胞死亡的具体机制尚不明确。因此,本研究主要选用小鼠肝脏细胞AML12及铁死亡敏感的HT-1080细胞研究过量铁诱导细胞死亡的具体机制。通过柠檬酸铁铵(FAC)和8-羟基喹啉铁(Fe-8HQ)分别构建慢性和急性细胞内铁过载诱导的死亡模型,运用细胞生物学手段研究过量铁诱导细胞死亡的方式和机制。结果发现,FAC诱导的慢性铁过载导致HT-1080细胞铁死亡,鞘脂信号通路可能参与到铁死亡过程当中,同时筛选到了一个有效的铁死亡抑制剂GSK2334470;Fe-8HQ诱导的急性胞内铁过载能够部分激活依赖性死亡,最终诱导不可调控的细胞死亡,酚类化合物能够有效地抑制该细胞死亡。
[博士论文] 王阳
动物营养与饲料科学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:氧化应激是机体在遭受有害刺激时,体内活性氧产生过多,氧化程度超出氧化物的清除,导致多种形式组织损伤的过程。本研究首先利用过氧化氢(H2O2)诱导的仔猪肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cell-1,IPEC-1)氧化应激模型筛选出一株抗氧化功能较好的芽孢杆菌菌株——解淀粉芽孢杆菌SC06。随后通过动物试验研究了SC06对仔猪生长、肠道抗氧化状态和自噬水平的影响,并通过研究SC06对IPEC-1的保护作用,揭示了SC06改善机体抗氧化功能的作用机理,最后用高脂日粮诱导小鼠氧化应激和脂肪肝,以探究SC06改善小鼠氧化应激、肝脏脂肪变性和心理福利的作用,初步揭示SC06调控宿主抗氧化能力和提高动物健康水平的分子机理。本研究共包括以下5部分试验:
  试验一 体外氧化应激模型的建立及具抗氧化功能芽孢杆菌的筛选
  (1)IPEC-1氧化应激模型的建立:采用不同浓度H2O2处理IPEC-1不同时间,IPEC-1细胞活力测定结果显示:当用300μmol/LH2O2处理细胞12h时,细胞活力下降一半。概率单位法计算结果为,当用H2O2处理细胞12h时,H2O2的半数致死剂量为323.59μmol/L。因此,后续试验可用300μmol/LH2O2处理细胞12h以诱导氧化应激。
  (2)IPEC-1氧化应激指标的筛选:使用300μmol/LH2O2分别处理细胞0、1.5、3、6、9、12和18h,处理结束后测定多种抗氧化和凋亡相关基因的表达。结果显示:在所有测定的基因中,人血红素加氧酶基因(heme oxygenase,HO-1)对H2O2的刺激最敏感。通过相关性分析,发现HO-1的基因表达和H2O2的处理时间呈正相关(R2=0.9641)。所以,在本试验中,HO-1基因的表达可用作IPEC-1氧化应激的主要指标,而其他抗氧化及凋亡基因可作为辅助指标。
  (3)具抗氧化功能芽孢杆菌菌株的筛选:将IPEC-1分为四组:G1(对照组)、G2(H2O2组)、G3(益生菌组)、G4(益生菌预处理+H2O2组)。用枯草芽孢杆菌SC02、解淀粉芽孢杆菌SC06、纳豆芽孢杆菌SC07、地衣芽孢杆菌SC08、多粘芽孢杆菌SC10、凝结芽孢杆菌SC12和解淀粉芽孢杆菌SC33以及H2O2依据组别分别处理细胞,测定凋亡及抗氧化基因,特别是HO-1基因的表达情况。结果发现:与H2O2组相比,SC06预处理可显著降低HO-1表达量41%,在所研究的七株益生菌中效果最显著。此外,SC06单独处理显著增加过氧化氢酶基因(catalase,CAT)和谷胱甘肽硫转移酶基因(glutathione S-transferase,GST)的表达,而与H2O2组相比,SC06预处理不仅能下调超氧化物岐化酶(superoxidase-1,SOD-1、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase-2,GPX-2)和硫氧还原蛋白(thioredoxin-1,TRX-1)的基因表达,也可提高GST基因的转录水平。此外,SC06单独添加时可显著降低凋亡基因caspase3的表达,其预处理还能够显著上调抗凋亡基因的转录并下调促凋亡基因的表达。因此,SC06被确定为具有较好抗氧化调节功能的芽孢杆菌菌株,并在后续试验中探究其抗氧化作用及机理。
  试验二 解淀粉芽孢杆菌SC06对仔猪生产性能和抗氧化功能的影响
  将90头体重相近的40日龄杜洛克×长白猪×大白猪(杜×长×大)仔猪随机平均分为三组:G1(基础日粮中含有150mg/Kg饲料金霉素)、G2(基础日粮中含有75mg/Kg饲料金霉素及1×108cfu/Kg饲料SC06)、G3(基础日粮中含有2×108cfu/Kg饲料SC06,且不含有任何抗生素),研究SC06对仔猪生长和抗氧化功能的影响及其作用机制。结果表明:SC06替代抗生素后能够显著提高仔猪的日增重和采食量,并能通过激活Nrf2-Keap1信号通路提高仔猪空肠的抗氧化功能。此外,当用SC06替代抗生素后,仔猪空肠自噬水平提高、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平下降,而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达量增加。综上,SC06替代饲料中抗生素可通过调控抗氧化信号通路和肠道自噬来提高仔猪的抗氧化功能并促进仔猪生长。
  试验三 解淀粉芽孢杆菌SC06提高IPEC-1细胞抗氧化功能的机理
  根据试验一所述方法研究SC06对IPEC-1保护作用的分子机理。结果发现:SC06处理细胞3h可以通过激活Nrf2-Keap1信号通路提高细胞的抗氧化酶活性,同时SC06预处理还可降低NADPH氧化酶(NOX)活性和p47phox的表达来减少活性氧(ROS)的含量,从而提高线粒体膜电位(Δψm)。此外,SC06预处理还可缓解氧化应激导致的细胞凋亡和坏死。
  试验四 解淀粉芽孢杆菌SC06对小鼠肥胖相关氧化应激及肝脏损伤影响
  本试验以高脂日粮饲喂的小鼠为实验材料,通过测定小鼠肝脏抗氧化通路、ROS含量、脂肪变性以及肠道菌群等指标以探明饲料中添加SC06减轻小鼠氧化应激及脂肪肝的可能机制。试验将60只6周龄的C57BL/6J雄性小鼠平均随机分成4个组,饲喂基础日粮(NC)适应一周后,再分别饲喂NC日粮,NC+SC06日粮、高脂日粮(HFD)、HFD+SC06日粮。饲喂周期为8周。
  (1)SC06对小鼠肥胖和胰岛素抵抗的影响:与对照组相比,NC+SC06对小鼠体重无显著影响,而HFD显著提高小鼠的平均体增重。此外,HFD+SC06可有效降低小鼠的体重。与HFD组日能量摄入量相比,NC组显著降低,而HFD+SC06组略有降低。与对照组相比,HFD组小鼠肾周脂肪及皮下脂肪重量显著提高,而HFD+SC06组皮下脂肪重明显降低。脂肪组织HE切片发现,与NC及HFD组小鼠相比,SC06的处理有降低小鼠脂肪组织脂滴大小的趋势。此外,SC06还有助于缓解高脂引起的胰岛素抵抗。
  (2)SC06对小鼠肝脏损伤的影响:结合油红O染色及HE染色切片发现,HFD可诱导肝脏脂肪变性并提高血清中谷丙转氨酶(GPT)活性,而HFD+SC06组肝脏中脂肪的积累减少,GPT活性略有降低。TUNEL和透射电镜切片结果显示,SC06会降低HFD诱导的肝脏细胞凋亡和线粒体损伤。
  (3)SC06对小鼠炎症因子和脂肪因子分泌的影响:HFD可显著提高血清肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor,TNF-α)、白介素1β(interleukin,IL-1β)、IL-6和瘦素(leptin)的含量,而添加SC06可明显降低TNF-α、IL-6和leptin的分泌。
  (4)SC06对小鼠肝脏抗氧化功能的影响:与NC组相比,NC+SC06组小鼠肝脏CAT活性显著提高,HFD组小鼠肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量显著提高;与HFD组相比,HFD+SC06组小鼠肝脏MDA含量降低。此外,NC+SC06和HFD显著增加Nrf2表达量和磷酸化水平,而HFD+SC06显著下调Nrf2的磷酸化。Keap1的表达在各组中没有明显变化。冰冻切片结果显示,HFD可明显提高肝脏中ROS水平,而添加SC06能降低ROS含量。
  (5)SC06对小鼠肠道菌群的影响:HFD与SC06均能够显著改变小鼠肠道菌群的结构。与HFD组相比,HFD+SC06组小鼠肠道拟杆菌门相对丰度提高、厚壁菌门及TM7菌门降低,在第8周时S24-7某些菌种的丰度恢复到正常水平。
  试验五 解淀粉芽孢杆菌SC06对高脂诱导的氧化应激小鼠心理福利的影响
  高脂日粮诱导的肥胖及氧化应激能够影响大脑功能,造成动物心理和行为异常,从而影响动物的心理福利。根据前述研究结果,推测SC06同样也能够改善高脂引发的小鼠行为异常。将36只6周龄的C57BL/6J雄性小鼠平均分为3个组,饲喂NC适应1周后,再分别饲喂NC、HFD、HFD+SC06日粮,饲喂周期为6周。从第3周开始,HFD明显造成小鼠的肥胖,而用SC06处理5周后,小鼠体重明显下降。对能量摄入量进行分析,发现饲喂HFD能显著提高日能量摄入。此外,HFD显著提高小鼠肝脏及附睾脂肪重量,而SC06有效降低肝脏重及附睾脂肪重。高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)和旷场实验(OFT)表明,HFD组中小鼠表现出明显焦虑行为,而SC06处理能有效缓解焦虑。对社交行为的分析也发现,HFD能够损害小鼠的正常社交行为,而添加SC06显著增强其社交能力。同时,与HFD组相比,HFD+SC06组海马体和大脑皮层中脑源性神经营养因子(BDNF)的表达显著上调,N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NR)下调。此外,SC06还可通过激活大脑Nrf2-Keap1信号通路、降低ROS浓度及改善线粒体形态降低大脑氧化应激水平。对炎症水平的测定发现,HFD显著提高系统炎症,而SC06的添加可以降低促炎因子的表达并提高抗炎因子水平。同时,SC06还可促进空肠紧密连接蛋白ZO-1和Claudin的表达从而提高肠道屏障功能。综上,SC06的摄入能够通过调控BDNF和NR的表达、提高抗氧化功能、增强肠道屏障功能、降低机体炎症来改善肥胖相关氧化应激造成的行为异常。
[硕士论文] 李鸣
兽医学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:GnIH是日本科研团队在鹌鹑的脑内发现的一种C端具有RF酰胺结构的新型神经肽。后来,在哺乳动物上也发现具有RF酰胺结构的神经肽,这种RF酰胺肽被命名为RF相关肽(RFRP),其中RFRP-3与鸟类的GnIH生理作用一致。目前,在附睾水平研究RFRP-3对雄性动物生殖功能影响的相关研究还很少。本研究通过检测了不同发育阶段大鼠附睾中RFRP-3和GPR147mRNAs的表达情况;然后通过体内实验,检测不同剂量RFRP-3对大鼠附睾形态学、凋亡和自噬相关蛋白表达的影响,探究RFRP-3对大鼠附睾生殖功能的影响。
  本研究可分为三个部分:(1)检测20、40、60、80日龄大鼠的附睾中RFRP-3和GPR147mRNAs表达的变化(分别对应P20、P40、P60和P80)。结果显示,RFRP-3和GPR147mRNAs的表达水平随着大鼠附睾发育呈现波动性变化,在P60处RFRP-3和GPR147mRNAs的表达水平最高,提示RFRP-3及其受体可能参与大鼠附睾的发育并调控其生殖活动。(2)通过体内实验,观察RFRP-3对大鼠附睾组织形态的影响。将大鼠分为对照组和0.1μg,1μg和10μg/天不同剂量组,每组6只。连续7天对大鼠睾丸内注射RFRP-3后,摘除一侧的附睾制作石蜡切片、HE染色,在显微镜下进行观察。结果显示,RFRP-3能呈剂量依赖性的导致附睾上皮细胞发生异常,并使附睾内精子数量显著降低,提示RFRP-3诱导附睾呈现功能性衰退。(3)通过对大鼠附睾中凋亡、自噬的水平进行检测,研究RFRP-3引起大鼠附睾功能性衰退的机制。一方面,我们检测到RFRP-3可以诱导附睾组织中Caspase-3的活性增加。另一方面,通过Western blot检测发现不同剂量的RFRP-3引起附睾中凋亡、自噬标志蛋白质的表达出现相互矛盾的结果,这提示细胞凋亡和自噬之间有着复杂的相互作用。
  综上所述,RFRP-3对雄性大鼠附睾的生殖功能起着重要的调控作用,可能是因为RFRP-3介导了附睾的细胞凋亡和自噬。
[硕士论文] 周利娟
细胞生物学 安徽师范大学 2018(学位年度)
摘要:组织器官的内稳态是生物机体正常运行的基本保障,成体干细胞(adult stem cells,ASCs)是一类具有自我更新和潜在分化能力的细胞,自我更新与分化之间的动态平衡直接影响有机体内稳态的维持。研究表明,来自干细胞的内源因子以及干细胞周围的微环境分泌的外源因子都可以调节这种平衡。生殖干细胞(Germline Stem Cells,GSCs)是ASCs的一种类型,它在生殖细胞发生及种族绵延等生命过程中承担重要功能。果蝇(Drosophila melanogaster)作为一种重要的模式生物,其卵巢为生殖干细胞调控机制的研究提供了优秀的模型。周期蛋白(cyclin)作为调节因子,可以激活周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的活性,从而调节细胞周期的进程。研究显示,cycB3(cyclin B3)基因对雌性果蝇的育性是必需的,而且能够影响胚胎期细胞有丝分裂的进程等。我们的早期研究发现,与野生型果蝇(Oregon)相比,cycB3基因突变的果蝇卵巢GSC的数量有减少的趋势。由此,我们设计实验,借助免疫组织化学、转基因显微注射及有丝分裂重组等技术,研究了cycB3基因调控果蝇卵巢GSC的命运暨影响包囊母细胞(cystoblast,CB)的分化的初步机制,本研究成果将对干细胞和生殖生物学的调控领域作出贡献。
  首先,本研究通过免疫组化特异性标记GSCs,统计并分析了五组cycB3突变类型(cycB32/cycB32、cycB32/cycB3L6540、ycB32/cycB3EY08012、ycB3L6540/cycB3EY08012、cycB32/Df)羽化后不同天数每个原卵区内GSC的数量。结果显示:野生型果蝇原卵区通常包含2-3个GSC,并且随时间推移无明显变化。而五组cycB3基因突变果蝇正常原卵区的比例从1天的89.1%、86.6%、94.3%、80.8%和85.0%降到14天的22.6%、28.2%、27.6%、18.4%和20.4%。其中,cycB32/cycB32组的表型变化最明显,约74.6%的原卵区发生GSC数量减少现象,表明cycB3基因突变严重影响了GSCs的维持。
  然后,选取其中三组和Oregon进行rnRNA相对量检测,QPCR(Realtime Quantitative PCR)的分析结果显示:和对照组相比,突变体组cycB3基因的转录水平极显著下降。此结果表明cycB3基因突变导致了cycB3基因的转录严重不足。通过GFP报告系统,对CycB3-GFP融合蛋白的定位分析表明:cycB3仅在生殖系细胞核中表达,暗示了cycB3基因发挥着内源性的调控GSC维持的功能。基于此,我们利用镶嵌体分析技术标记cycB3基因突变的GSC,确证cycB3基因内源性调控GSC命运。结果显示,与对照组相比,实验组的标记GSC随时间的推移逐渐丢失,充分支持cycB3基因是GSC命运调控的内源性因子这一推论。
  为进一步确证cycB3基因的功能,我们利用转基因手段在cycB3突变的背景下补充cycB3基因,进行了一系列的挽救试验。本试验选择羽化后第14天果蝇的正常原卵区作为统计分析的对象。结果显示,广谱挽救组cycB3P-cycB3和两组内源挽救组(nosP-cycB3;cycB32/cycB32和UASp-cycB3/nosP-gvp;cycB32/cycB32)的比例分别恢复至正常水平,表明仅内源补充cycB3即可挽救突变表型。而外源性挽救组(C587-gal4;UASp-cycB3;cycB32/cycB32)果蝇的正常原卵区比例与突变体无明显差异,表明挽救失败。综合上述结果,充分表明cycB3内源性的发挥着调控GSC命运的功能。
  cycB3缺失导致GSC数量减少,为探讨GSC的去向问题。首先,我们采用TUNEL技术检测了cycB3突变GSC的凋亡情况。结果显示,突变GSC未出现明显的凋亡(与对照组相比),表明cycB3突变没有导致GSC凋亡。其次,分析并统计了GSC中细胞器——“spectrosome”的形态学,对cycB3是否影响GSC有丝分裂的各时相进行了研究。结果显示,突变体和野生型果蝇之间无明显分裂时相上的差异,表明cycB3突变没有影响GSC有丝分裂的进程。然后,运用EdU细胞增殖(脱氧尿嘧啶标记DNA)法检测基因突变对细胞增殖活性的影响。结果表明:GSC增殖并不受cycB3基因突变的影响。总之,上述结果显示cycB3突变不影响GSC的分裂和增殖,也没有促使GSC走向凋亡,而是促使GSC提前发生了分化。
  为了揭示cycB3与BMP信号通路的关系,研究了cycB3与该信号通路的重要组分bam的上下位关系。首先,利用bam-GFP报告基因系统结合免疫荧光染色技术检测了cycB3突变背景下bam基因的表达模式。结果显示:实验组(cycB32/cycB32;bam-GFP)中bam的表达模式与对照组(bam-GFP)无明显差异,该结果表明cycB3基因不是位于bam的上游发挥作用。其次,分析比较了bam突变和cycB3&bam双突变条件下GSC/CB的数量变化。结果发现:bam单突变和cycB3&bam双突变果蝇羽化后第10天的卵巢原卵区中均充满生殖干细胞样细胞(GSC-like cells),无明显差异,表明bam缺失抑制了cycB3突变导致的GSC丢失表型。综合上述结果,我们提出假说,cycB3可能通过依赖于bam的方式调控GSC的维持。
  此外,我们还研究了cycB3与GSC内源性调控因子Dad的遗传互作关系。Dad基因属于BMP下游的靶基因,其表达受控于BMP信号;同时,Dad蛋白又能反作用于BMP受体,降低BMP信号的效应。利用Dad-GFP报告基因系统结合免疫组化技术检测了cycB3突变背景下Dad基因的表达模式。结果显示:实验组(cycB32/cycB32;Dad-GFP)中Dad的表达模式与对照组(Dad-GFP)无明显差异,该结果表明cycB3基因不参与Dad介导的BMP信号通路。
  前面工作表明cycB3缺失导致了GSC数量减少,那么cycB3缺失是否影响包囊母细胞(CB)向卵母细胞的分化呢?研究表明卵母细胞中Orb基因的表达情况可以作为卵母细胞正常分化的标志。鉴于此背景,本课题利用Orb抗体检测了卵母细胞内Orb蛋白的表达。结果显示:与对照组相比,cycB3突变的卵母细胞中Orb表达无明显下调,表明CB到卵母细胞的过渡不受cycB3基因突变的影响。
  既然cycB3缺失导致了GSC提前分化,那么,过表达cycB3基因是否会促进GSC的增殖和抑制CB的分化?结合卵巢中bam的表达模式,我们分别统计了卵巢原卵区中GSC和CB两类细胞的数量。结果表明过表达cycB3没有促进卵巢GSC的增殖,但明显延滞了CB的分化。
  综合上述研究结果,cycB3基因内源性调节果蝇卵巢生殖干细胞的命运,cycB3基因突变导致GSC的自我更新和分化失衡,促使GSC提前走向分化。此外,cycB3依赖“BMP/Dpp-bam”信号通路发挥功能,在GSC中,cycB3基因不参与bam基因的沉默,通过抑制GSC的分化使其维持干性;在CB中,cycB3基因位于bam的上游,通过抑制Bam蛋白的活性而抑制CB的分化。
[硕士论文] 白宇
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:毛发对于生物体主要起到保护的作用,可用于抵御皮肤损伤、感染和脱水,也可以调节皮肤温度。毛囊作为皮肤的一种衍生物,毛发由其发育而来。β族胸腺素属于极性蛋白质分子家族。迄今为止已经发现的β族胸腺素共有15种,本文研究的Tβ4即为其中一种。有研究表明Tβ4对毛囊的生长和发育有促进作用。Notch信号通路对于毛囊生长的调控作用始于胚胎中毛囊的形成后期,待个体出生后,对于维持毛囊生长的动态平衡也有一定的作用。有实验证实Notch信号通路中关键因子缺失的小鼠毛发较细、短而且卷曲。JNK信号通路对于毛囊的调控作用表现在参与调控毛囊的生长方向,同时也参与对毛囊周期的调控。由此可知JNK信号通路和Notch信号通路对于毛囊的生长都具有重要的作用,本研究主要探索Tβ4对于毛囊的调控作用是否与上述两条信号通路相关。
  一、Tβ4在毛囊周期中的表达
  本实验通过对小鼠出生后2d、6d、15d和30d的皮肤进行实时定量PCR检测,检测Tβ4的mRNA表达情况,出生15d和30d小鼠的表达量较高,分别为对照组的26.9倍和48.3倍,说明在第一个毛囊周期中,Tβ4在退行期和静止期的表达量较高。
  二、探究Tβ4与Notch和JNK信号通路的关系
  通过以野生型小鼠和Tβ4基因敲除小鼠的皮肤组织作为样本,对于JNK信号通路和Notch信号通路相关的四个基因Grb2、MKK7、Hes5、Notch1进行实时定量PCR检测。在Tβ4敲除小鼠中与JNK信号通路相关的两个基因Grb2和MKK7的mRNA表达量分别是对照组的0.17倍和0.84倍,Notch信号通路的两个基因Hes5和Notch1的mRNA表达量分别是对照组的0.97倍、0.72倍;然后对其进行Western blot检测,四个基因分别是对照组的0.47倍、0.10倍、0.53倍、0.9倍。说明JNK信号通路受到Tβ4基因的调控,而在Notch信号通路中,它的上游基因Notch1不受Tβ4的调控,而下游的Hes5受到Tβ4的调控。
  三、探究Notch信号通路和JNK信号通路的关系
  本实验是为了进一步探究Tβ4和两条信号通路的上下游关系,从而进一步确定Tβ4在信号通路网络中的作用位点,分别对Notch信号通路和JNK信号通路使用相应的信号通路抑制剂(DAPT和sp600125)处理野生型的小鼠胎儿成纤维细胞。使用浓度为1μM/L的抑制剂处理细胞48h后收样,qRT-PCR法检测两条信号通路的四个基因Grb2、MKK7、Hes5、Notch1。在经DAPT处理的成纤维细胞中MKK7、Grb2、Hes5、Notch1的表达量分别是对照组的0.13倍、0.23倍、0.08倍、0.59倍,在蛋白质水平,这四个基因的相对表达量分别为对照组的0.2倍、0.14倍、0.36倍、0.08倍。在JNK信号通路抑制剂处理的成纤维细胞中MKK7、Grb2、Hes5、Notch1的相对表达量分别0.20倍、0.49倍、0.09倍、1.02倍,在蛋白质水平,这四个基因的表达量分别为对照组的0.2倍、0.14倍、0.36倍、1.04倍。结果说明JNK信号通路的两个基因位于Notch信号通路两个基因Notch1和Hes5之间,由此可以推知Tβ4的作用位点位于Notch1和MKK7之间。
  以上实验结果证实:Tβ4在第一个毛囊发育周期的退行期和静止期的表达量最高,说明其在退行期和静止期对毛囊的调控作用最为显著。敲除Tβ4基因对于JNK信号通路的表达量有着直接的抑制作用;在Notch信号通路中,其上游基因Notch1调控Tβ4的表达,而Tβ4基因的敲除使得其下游基因Hes5的表达量下调。综上所述,Tβ4和两条信号通路的四个关键基因的上下游关系为:Notch1→Tβ4→MKK7→Grb2→Hes5。通过本研究确定了两条与Tβ4对于毛囊产生影响相关的信号通路,同时也初步确定了Tβ4在两条信号通路中的作用位点,这为进一步探索Tβ4促进毛囊生长的调控提供了实验依据。
[硕士论文] 刘旭
动物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor21,Fgf21)作为一种重要的调控因子,对毛囊发育及生长周期具有重要作用。本实验室通过CRISPR-Cas9系统构建Fgf21基因敲除小鼠(Fgf21-/-),并通过实验证明Fgf21基因参与毛发生长速度及毛囊直径的调控作用。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,以碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同诱导沉默复合体降解或阻遏靶mRNA的翻译。最新研究发现,miRNA对毛囊发育调控有重要作用。Fgf21基因在生物化学和遗传学上与miRNA虽然存在一定联系,但是Fgf21、miRNA以及毛囊生长发育机制的相互作用关系尚待明确。
  1Fgf21-/-小鼠模型的繁育及表型分析
  利用不同杂合子互交、杂合子与纯合子正反交以及纯合子互交的方式进行Fgf21-/-小鼠模型的繁育,经过基因鉴定最终成功获得45只Fgf21-/-小鼠。表型分析发现,Fgf21-/-小鼠的产仔数目显著减少(p<0.05),产仔雌雄比例、产仔初生重,整体及雌雄体重生长变化等生理指标均无显著差异(p>0.05);通过表达谱分析,生理解剖学分析发现,与WT小鼠相比,Fgf21-/-小鼠的各组织内脏均正常,尤其是Fgf21高表达的胰脏组织并无异常;通过石蜡切片及H&E染色后进行的毛干数目统计发现,Fgf21-/-小鼠的毛干数目显著少于WT小鼠(p<0.05)。2Fgf21-/-小鼠表皮组织的miRNA测序
  以Fgf21-/-小鼠和WT小鼠表皮组织为材料,miRNA测序共检出1249个不同长度miRNAs。差异miRNA表达分析的数据统计发现,差异显著的miRNAs共134个(p<0.05),其中83个表达水平上调,51个下调;结合文献参考,从测序结果共筛选得到10个与毛囊生长发育调控相关的miRNAs,分别为miR-377-3p、miR-335-5p、miR-214-5p、miR-148a-3p、miR-410-3p、miR-411-5p、miR-376b-3p、miR-376c-3p、miR-136、miR-221-3p,之后利用荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,RT-qRCR)进行验证,与测序结果相一致。
  3miRNA靶基因预测及生物信息学分析
  利用TargetScan、miRanda两款软件对显著性差异的134个miRNAs(p<0.05)分别进行靶基因预测后取其交集共得到105,886,298个靶基因。对显著差异miRNA的靶基因进行GO和KEGG富集性分析,最终GO功能注释共得到20,557个靶基因,KEGG注释得到7,881个靶基因。通过GO富集性分析发现有1023个差异显著(p<0.05)的基因功能属性,其中主要参与Protein binding、nucleus、integral component of membrane、cytoplasm和biological-process的5个功能属性过程;KEGG注释发现202条显著差异(p<0.05)的信号通路被富集,其中164条信号通路差异极显著(p<0.01),同时发现与毛囊发育相关的PI3K-AKT signaling pathway、P53signaling pathway、Notch signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、TNF signaling pathway5条差异极显著(p<0.01)的信号通路。最终利用Cytoscape软件分别构建得到以验证成功的10个显著差异miRNAs为核心,集中调控与预测到的与毛囊发育调控相关靶基因的GO/KEGG-miRNA-靶基因的关联图。
  以上结果中异常表达的miRNA可能参与了Fgf21对毛囊发育的调控。同时上述结果为梳理Fgf21、差异miRNA、靶基因在毛囊生长发育中的相互作用及其关系提供实验数据。
[博士论文] 王靖
动物学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:声时程(sound duration)是听觉信号的基本参数之一,也是恒频-调频(constantfrequency-frequency modulation, CF-FM)蝙蝠在回声定位过程中主动做出改变的声参数之一。听觉中枢——下丘(inferior colliculus,IC)单反应(single-on, SO)和双反应(double-on,DO)神经元如何识别声时程并做出选择性反应,以及神经抑制在反应模式的形成中的作用均不清楚。针对这些问题,在普氏蹄蝠(Hipposiderospratti) IC采用自由声场刺激和在体细胞外记录,对两类神经元做了研究。
  1.共获得314个神经元(N=314),根据他们对CF-FM声刺激的反应,将它们分为SO和DO神经元。用最小阈强度(minimum threshold,MT)以上10和20 dB(MT+10 dB、MT+20 dB)的CF和CF-FM声测定了其中140(N=140/314)个神经元的反应模式和时程选择性,其中91个为SO(N=91,65%)神经元,49个为DO(N=49,35%)神经元。SO神经元在CF声刺激条件下的时程选择性类型分为短通型(short pass,SP)、长通型(long pass,LP)、带通型(band pass,BP)、全通型(all pass,AP)或非时程选择型、不规则型(irregular);当用CF-FM声刺激时,具有时程选择型的SO神经元的比例从60%(N=55/91)上升至79%(N=72/91),说明FM声成分在神经元时程选择性形成方面发挥了重要作用,有可能由两种声成分所引起的输入汇聚性地投射到记录神经元上时产生的相互作用所致。DO神经元在CF声刺激条件下的时程选择性的类型除了具有与上述SO神经元相同的类型外,还有反带通型(band-reject, BR);当用CF-FM刺激时,总的时程选择性比例从CF刺激下的51%(N=25/49)上升至61%(30/49),说明FM成分的加入可有效地提高DO神经元的时程选择性。
  2.比较和分析SO和DO神经元中SP和BP型神经元的最佳时程(best duration,BD)和达到最佳反应的50%时的时程调谐宽度(duration-tuning width,DW)发现,在CF转变到CF-FM声刺激时,时程选择性不改变的神经元中的BP型SO神经元的平均BD值由16.0±7.3降低到8.8±4.5 ms(p<0.05),提示神经元对行为相关的CF-FM声刺激的时程选择性更加精确。另外,在CF-FM刺激条件下,DO中的SP型神经元的BD也显著地小于SO中的SP型神经元的BD(5.6±4.0 vs.8.5±2.4 ms; p<0.05);而DO中的SP和BP型神经元的DW要比SO中同类型神经元的DW值大(SP:23.3±8.4 vs.34.9±4.1 ms; BP:21.1±6.6 vs.33.0±6.0 ms);而且在CF刺激下获得的DW值小于CBFM刺激(SP:21.1±4.7±8.4 vs.34.9±4.1 ms; BP:14.1±8.5 vs.33.0±6.0ms)。这些结果提示两类神经元的功能可能各不相同。
  3.当将CF和CF-FM声刺激强度从MT+10 dB增加到MT+20 dB时,SO中时程选择性神经元的比例大幅下降,而SP和BP型的平均BD也显著减小(p<0.0001)。对于DO神经元,具有时程选择性的比例仅在CF声强度增加时才大幅下降,且SP和BP型的平均BD并不随强度的增加而发生显著改变(p>0.05);对CF-FM声刺激的强度耐受性也高于CF声刺激。这些结果说明具有时程选择性的DO神经元对CF-FM声刺激强度增加的耐受性高于SO神经元。
  4.测定了声时程对SO和DO神经元的第一次反应发放潜伏期(first-spike latency, FSL)的影响,结果提示巧合或反巧合假说以及FM成分的作用,均可能参与了两类神经元的时程选择性的形成。
  5.在所记录到的198个神经元中的71(N=71/198)(SO,N=55; DO,N=16)个神经元上测定了电泳导入γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid,GABA)受体A拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline, Bic)期间神经元对CF和CF-FM声刺激的反应,结果发现:(1)65%(N=26/55)SO神经元在两种声刺激条件下其发放时间和发放数均显著增加;6%(N=3/55)的SO神经元对CF-FM声刺激的反应模式转变成DO模式。部分DO神经元对CF-FM声的CF成分的反应模式从相位型变为持续型(N=5/12)或相位爆发型(N=7/12);而它们(N=12/12)对FM声成分反应模式均从相位型变为相位爆发型;且它们对两种声成分反应的发放数均显著增加。另外,有29%(N=16/55)的SO神经元的反应模式、反应时间和发放数以及FSL基本不受Bic的影响。这些结果提示GABA能抑制参与了绝大多数的SO和DO神经元的时程选择性和反应模式的形成。(2)71%(N=39/55) SO和44%(N=7/16)的DO神经元对CF及CF-FM声刺激的FSL均显著缩短;另有31%(N=5/16) DO神经元仅对CF声刺激的FSL在Bic期间显著缩短。这些结果提示GABA能抑制有可能先于兴奋性输入到达,不同程度地减慢这些神经元的去极化速度并延迟动作电位爆发。(3)75%(N=12/16)的DO神经元对CF声成分的发放数增加显著高于FM声成分;而有25%(N=4/16)的DO神经元在对FM声成分的发放数增加的同时发放模式产生改变,但FSL无明显变化。因此,提示GABA能抑制在这部分神经元中对CF和FM成分的影响可能不同。(4)总的GABA能抑制对SO神经元的效应要强于DO。
  6.超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)在听觉系统被证明与动物IC的年龄相关性功能下降有关。通过Meta分析研究了超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase2,SOD2)基因C47T多态性与噪声性听力损失(noise-induced hearing loss,NIHL)之间的关系,在按种族划分的亚组分析中,中国人群的隐性模型中观察到SOD2 C47T多态性与NIHL显著相关。
[硕士论文] 董永慧
控制理论与控制工程 郑州大学 2018(学位年度)
摘要:动物目标导向行为的神经信息编码机制是神经科学研究的热点,而鸽子具有较强的空间导航能力,是目标导向行为研究理想的动物模型。已有研究表明,鸽子NCL脑区在目标导向行为中发挥重要作用,但其神经编码机制尚待阐明。因此,本文以鸽子为研究对象,从神经信息流分析角度,研究鸽子NCL脑区局部场电位信号的时空信息编码模式。
  本文设计了鸽子目标导向行为实验范式,检测了三种典型目标导向行为(左转、右转、直行)发生时NCL脑区的神经信号;首先去除了环境与行为干扰噪声,继而确定了目标导向行为相关的特征频段;在此基础上,选择出相关性高且包含主要信息的通道以构建局部因果网络;最后利用定向传递函数的信息流方法分析局部网络的信息流,并对三种典型行为下局部因果网络的信息流方向和强度差异进行比较。主要完成的研究内容如下:
  (1)设计了基于灯光指示和食物诱导的鸽子Y迷宫目标导向行为实验范式,开展了行为学实验同步记录了神经信号。考虑到信息流分析对信号质量的要求,分别用独立成分分析和公共平均参考滤波的方法,去除了局部场电位信号中存在的50Hz工频干扰和鸽子运动产生的共同参考。
  (2)确定了目标导向行为相关的特征频段并完成了对有效通道的选择。对三种典型行为的局部场电位信号进行了叠加时频分析,确定了行为相关的γ特征频段并通过零相位数字滤波器完成了频段提取。针对神经信号在各通道间存在的多重共线性问题,结合皮尔逊相关和偏最小二乘回归,确定了在特征频段,真实相关且信息权重占比大的通道。
  (3)基于定向传递函数的信息流分析方法分析了目标导向行为中的信息流变化。首先利用定向传递函数在仿真数据集上的信息流变化分析结果,验证了算法的有效性;随后分别从信息流方向和强度两个方面,对鸽子目标导向实验记录的数据进行信息流分析,结果表明在部分通道,三种典型行为之间的信息流以及与安静状态对比时,均存在显著性差异。
[博士论文] 胡兵兵
神经生物学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:哺乳动物中枢神经系统轴突损伤后非常难再生,其结果往往导致运动和感觉永久损伤。相比之下,斑马鱼中枢神经系统中的许多轴突在损伤后,仍具有很好的再生能力,能够精确地和功能性地重新支配它们的靶位点。斑马鱼幼鱼通体透明,我们可以活体在位的情况下实时观察斑马鱼幼鱼中枢神经系统的轴突变性和再生的过程,因此斑马鱼是研究中枢神经系统轴突变性和再生的一个极好的模型。之前的研究显示斑马鱼毛特纳细胞在脊髓机械损伤后再生能力很弱,然而不同于这些结果,我们发现当使用双光子激光毁损轴突后,毛特纳细胞表现出极强的轴突再生能力。我们使用蔡司LSM710双光子显微镜,对Tol-056品系斑马鱼幼鱼中被绿色荧光标记的单侧毛特纳细胞轴突实施精确位点的轴突切断手术。我们的结果显示,激光损伤后24小时远心端的轴突几乎降解完毕。之后,近心端的轴突开始了强劲的再生,很多轴突在损伤后4天时几乎再生完全。不仅如此,当我们结合单细胞电转方法,针对红色荧光染料标记Tg(mbp:EGFP-CAAX)转基因品系幼鱼中的毛特纳细胞实施激光轴突切断术后,我们还观察到再生出的轴突会被髓鞘重新包裹。据我们所知,这是活体斑马鱼中枢神经系统中再生轴突髓鞘再生的首次描述。更进一步我们发现,当我们用单细胞电转方法将Syp:EGFP和DsRed2两种质粒导入毛特纳细胞以同时标记轴突和突触,激光损伤轴突后,我们观察到轴突再生过程中伴随着突触的重建。因此,我们的结果提供了斑马鱼中枢神经系统突触重建的首个活体证据。最后,我们证明了微管解聚药物诺考达唑的给药处理完全剥夺了毛特纳细胞轴突再生的能力。综合这些结果表明,毛特纳细胞激光轴突损伤后的活体成像研究为理解中枢神经系统轴突再生的细胞和分子机制提供了强大的分析模型。
[硕士论文] 孙涛
概率论与数理统计 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:神经振子集群同步振荡现象是神经信息处理的基本机制。基于神经元集群的振荡性同步放电行为,使用全局耦合相位振子网络模型来研究神经系统的同步动力学行为是一种简单且有效的方法。在本文中分别描述了无STDP机制和基于STDP机制下,提出在外部周期刺激和噪声共同作用下全局耦合神经振子集群的相位演化模型,导出了描述神经振子集群整体活动的平均数密度的演化方程。数值模拟结果表明神经振子群同步活动的大小取决于STDP耦合机制和外部刺激强度以及刺激频率。基于STDP耦合机制的神经振子集群的同步活动要大于无STDP耦合机制的。刺激对神经振子群同步活动的影响取决于刺激强度和刺激频率。当系统特征频率大约是刺激频率的3倍时,神经振子集群的数密度呈现出周期性振荡行为;在相同的刺激频率下,神经振子集群的同步程度与刺激强度有关,刺激强度越强同步程度越高。
[硕士论文] 毛姗姗
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:在胸腺中,T细胞的增殖和分化需经过一系列具有特异性表达和调节的基因的多重检查点的严格调控。胸腺细胞分为以下几个阶段:DN(CD4-CD8-Double-negative,双阴性)阶段,DP(CD4+CD8+Double-positive,双阳性)阶段和CD4SP(CD4+CD8-single-positive,CD4单阳性)和CD8SP(CD4-CD8+single-positive,CD8单阳性)阶段。其DN阶段又根据复杂的调控,并且最终以CD44和CD25为细胞表面标志进行具体的划分,包括DN1(CD25-CD44+),DN2(CD25+CD44+),DN3(CD25+CD44-)和DN4(CD25-CD44-)阶段。TCR(T cell receptor,T细胞受体)能够诱导胸腺细胞存活、增殖和分化的不依赖配体的激活信号的活化。TCR在胸腺细胞的分化发育过程中同样也发挥了重要的作用。TCR是富含核心岩藻糖基化的糖蛋白。Fut8(core fucosyltransferase,核心岩藻糖基转移酶)介导的核心岩藻糖基化是一种重要的翻译后修饰过程,并且已显示了其修饰对于细胞表面上各种糖蛋白分子的功能和稳定性是必需的。Fut8通过核心岩藻糖基修饰能改变底物蛋白的构象、表达及定位,在哺乳动物细胞中发挥了重要作用。
  目的:利用Fut8基因敲除(Fut8-/-)小鼠与正常(Fut8+/+)小鼠,探究Fut8在小鼠胸腺中T细胞的分化发育的调节作用,主要探究TCR的核心岩藻糖基化对于胸腺DP阶段发育的重要性。
  方法:将4~8周龄的Fut8+/+小鼠的胸腺细胞进行分选,利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter,流式细胞仪)检测不同发育阶段的细胞表面的核心岩藻糖基化。
  利用同窝出生的Fut8+/+和Fut8-/-小鼠为对象,通过流式细胞仪分选出各个阶段DN1、DN2、DN3、DN4、DP CD4SP及CD8SP的细胞,然后进行计数,并探究核心岩藻糖基化的缺失对小鼠胸腺细胞发育不同阶段的细胞数目的影响。
  利用IP(Immunoprecipitation,蛋白免疫沉淀),Western Blot(蛋白质免疫印迹)和FACS检测DP细胞TCR及TCR上核心岩藻糖基化的差异。在利用Western Blot检测DP细胞磷酸化的水平后,为了进一步探究TCR核心岩藻糖基化在DP阶段的作用,我们利用特异性切割核心岩藻糖糖苷键(β1-6)的糖苷酶处理TCR特异性转基因OT-Ⅰ和OT-Ⅱ小鼠的DP细胞,再利用Western Blot检测TCR的核心岩藻糖基化的改变对信号转导的影响,同时也利用MTT和细胞克隆形成实验检测细胞的增殖能力。最后利用Q-PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,荧光实时定量聚合酶链式反应)检测与胸腺发育相关的转录因子的变化。
  结果:通过流式结果分析发现核心岩藻糖基化在胸腺细胞不同发育阶段的表达是一个动态变化的过程,其在胸腺细胞在由DN阶段向DP阶段转变过程中显著增多。
  核心岩藻糖基化的缺失导致胸腺中DP细胞数目明显减少。
  对DP胸腺细胞的研究结果表明,与Fut8+/+DP细胞相比,Fut8-/-DP细胞的增殖能力及磷酸化水平明显减弱。并且我们发现,TCR上核心岩藻糖基化的缺失,会使TCR的信号转导能力下降,并且细胞增殖也减弱。Q-PCR结果显示,Fut8-/-DP细胞中与胸腺细胞分化密切相关的转录因子Id2及E2a的表达异常。
  结论:在小鼠胸腺中,核心岩藻糖基化修饰在T细胞的正常分化中发挥重要调节作用,并且发现TCR的核心岩藻糖基化对调节DP阶段的胸腺发育至关重要。
[硕士论文] 马志强
生理学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:促肾上腺皮质激素释放激素CRF(Corticotropin-releasing factor,CRF or CRH)是HPA轴的核心应激调节肽,通过受体CRFR1和CRFR2发挥其功能。尿皮素UCN(Urocortin)为CRF基因家族新成员。低氧应激时,HPA轴激活,下丘脑分泌CRF,通过垂体ACTH细胞膜上的CRFR1受体促进其分泌促肾上腺皮质激素ACTH(Adreno-corticotropic hormone,ACTH),继而促进血浆皮质酮水平增加,从而调节动物一系列低氧反应。高原小哺乳动物长期生长在高原寒冷和低氧环境中,其中高原鼢鼠(Myospalax Baileyi)居住在高原3000-4500m的地下洞穴中,而甘肃鼢鼠(Myospalax Cansus)也是生活在地下,其海拔高度为800-1500m的地区,这几种动物都面临着不同程度的低氧和高CO2环境。
  我们实验室前期研究发现这几种高原动物HPA轴对低氧应激呈低反应性,为了深入阐述这几种高原小哺乳动物的高原环境适应机制,本研究采用分子生物学,细胞生物学,酶联免疫吸附实验等手段,获得如下结果:
  1.克隆甘肃鼢鼠的CRF、UCN和CRFR1编码区序列,并和高原鼢鼠相应的基因进行分析比较。甘肃鼢鼠CRF成熟肽序列与高原鼢鼠、大鼠、小鼠、根田鼠、北美草原田鼠及人类的完全一致;甘肃鼢鼠UCN成熟肽序列与高原鼢鼠、大鼠及小鼠的完全一致,但它们与人类相比,都有N末端,第2位和第4位的2个氨基酸不同(Asp2Asn,Pro4Ser);根田鼠与甘肃鼢鼠相比,N末端有第1、37和38位共3个氨基酸的不同(AsplAsn,Phe37Leu,Asp38His);甘肃鼢鼠CRFR1受体与高原鼢鼠的相似度最高,仅在第71位和第379位有2个氨基酸的不同(Leu71Phe,Arg379His),分别位于受体的胞外域和胞内域。甘肃鼢鼠CRFR1受体与人类相比有第3、4、23、29、62、65、71、114、117、132、218和379位共12个氨基酸的不同,这些位点差异在胞外域、跨膜区和胞内域都有分布。
  2.比较脑组织CRF、UCN及CRFR1mRNA表达变化。低氧(7000m,8h)应激显著上调实验室SD大鼠大脑前额叶皮层的CRF、UCN及CRFR1mRNA表达;甘肃鼢鼠大脑前额叶皮层CRF、Ucn和CRFR1mRNA表达水平高于高原鼢鼠。
  3.利用CHO细胞研究配体-受体结合后的第二信使cAMP和Ca2+浓度变化,分析不同受体及突变位点的差异。CRF孵育CHO细胞(转染了大鼠、高原鼢鼠、甘肃鼢鼠以及突变型甘肃鼢鼠CRFR1受体)20min,CRF诱导产生的cAMP呈剂量依赖性,其半数有效剂量EC50分别为:14.46,23.36,17.79和21.04nM。高原鼢鼠CRFR1受体(M.b-CRFR1)的EC50最高,其次是突变型甘肃鼢鼠受体的(mM.c-CRFR1),然后是野生型甘肃鼢鼠CRFR1受体(M.c-CRFR1),大鼠CRFR1受体(Rat-CRFR1)最低。
  4.应用生物信息学分析方法及ChIP-PCR实验探讨了CRFR1受体的启动子区的低氧下的转录机制,证明小鼠CRFR1受体启动子上分别存在5个AP-1和8个NF-kB结合位点。
  5.利用ELISA试剂金分析检测了暴露于高原环境(3860m)后的血清和唾液中的配体CRF的水平变化,其中急性高原反应(AMS)组,唾液及血清中CRF浓度均明显高于健康对照组人群,而高原脑水肿+肺水肿组又高于急性高原反应组。
  结果提示,GPCR受体-CRFR1基因编码区的位点突变可能是高原鼢鼠低氧低反应性的分子机制之一,高原动物可以通过多水平精细调节配体分泌,受体基因表达,以及不同的转录因子的结合等生理反应以适应极端环境。配体CRF水平的升高可能可以预警急性高原反应及其严重程度。
[硕士论文] 张小燕
神经生物学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:秀丽隐杆线虫拥有十分简单但又完整的神经系统,神经元是神经系统的重要成员之一,而神经胶质细胞作为神经系统另一个组成部分,也有着多种作用,包括支持、营养、保护神经元等。神经元和胶质细胞之间也会通过一定的机制相互作用,进而调控生物体的生命活动,目前对于胶质细胞的功能以及与神经元之间的互作机制都知之甚少。
  线虫头部具有发达的化感系统,可以感知各种感知各种外界刺激。而嗅觉适应是线虫的一项重要生理机能,可以保护自身细胞免受过度刺激,更好的应对嗅觉刺激强度的变化。本研究利用分子遗传的技术,特异性标记线虫AMsh glia和ASH神经元,并通过光遗传学和化学遗传学的方法激活或抑制AMsh胶质细胞,记录ASH神经元的钙信号变化及线虫的回避行为。初步证明激活AMsh胶质细胞能够抑制ASH神经元的兴奋性,进而降低线虫对厌恶性气味的敏感性,从而介导嗅觉适应。
  本研究首次发现线虫AMsh glia参与嗅觉适应,为进一步深入研究神经胶质细胞在神经系统中的作用有很好的借鉴。
[博士论文] 龚倩
神经生物学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:本文分为以下两个部分进行探讨:
  第一部分 早年应激与nectins分子调控海马环路发育和可塑性的机制研究
  早年环境因素与个体遗传背景共同调控大脑神经环路发育与功能。有害环境因素,尤其是早年应激,显著和持久的损害神经环路发育与可塑性,是多种精神疾病的重要风险因素。因此,明确早年应激影响神经环路的分子机制至关重要。我们已经发现早年应激通过改变海马的促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)的表达水平,持续过度激活CRH受体型1(CRH recepeter1,CRHR1),进而下调nectin-3水平,使nectin-1和nectin-3介导的突触黏附出现异常,导致突触不稳定,使树突棘结构萎缩甚至消除,导致海马神经元形态改变与认知损害。但早年应激小鼠发育过程中nectin-1和nectin-3分子的表达和功能,及其本身在发育中的特点尚不明确。在本研究中,我们结合nectins分子敲低病毒、免疫染色、高尔基染色及行为学测试,研究了早年应激与nectins分子调控海马环路发育和可塑性的机制。我们发现,早年应激迅速而持久的下调了内侧内嗅皮层(medial entorhinal cortex,MEC)和海马CA1区nectin-1和nectin-3蛋白的表达水平,诱导MEC-CA1环路特异性的树突发育障碍,损害了成年后的学习和记忆能力。在幼年期敲低小鼠MEC的nectin-1水平,同样也损害了环路特异性的记忆功能;而nectin-3敲低则不具有此作用。此外早年应激和幼年期MEC nectin-1敲低都影响了MEC锥体神经元的发育。综上,早年应激通过下调nectin-1损害了MEC-CA1环路的发育、功能和可塑性。
  第二部分 慢性应激对成年小鼠旁嗅皮层细胞黏附分子表达及树突棘可塑性的影响
  成年期持续暴露于应激事件可显著影响突触可塑性和认知功能。既往研究提示,慢性应激损害旁嗅皮层依赖的物体识别记忆。然而,应激对旁嗅皮层的分子表达以及结构可塑性的作用及机制仍未明确。在本研究中,我们运用慢性社交挫败应激模型,采用条件性前脑促肾上腺皮质激素释放激素1型受体(CRHR1)敲除小鼠和野生型小鼠,检测了旁嗅皮层nectin-1、nectin-3和neurexin-1的mRNA表达水平。结果表明,慢性应激减少野生型小鼠旁嗅皮层nectin-1的mRNA表达水平,而未影响条件性前脑CRHR1敲除小鼠nectin-1的水平。在条件性前脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)过表达小鼠中,旁嗅皮层的nectin-1 mRNA水平也出现降低。这些结果提示慢性应激通过CRH-CRHR1系统调节旁嗅皮层nectin-1的表达。此外,慢性应激损害了旁嗅皮层第Ⅴ层锥体神经元顶树突主干的树突棘形态,并减少了树突分支的树突棘密度。我们的结果表明,慢性应激损害旁嗅皮层的细胞黏附和树突棘形态,这可能是慢性应激所致旁嗅皮层依赖性记忆障碍的分子与结构基础。
[硕士论文] 高凡
生物物理 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:秀丽线虫作为一种常见的模式生物,通体透明,便于观察。其神经系统解剖结构简单,神经环路连接的物理图谱已被完全解析,是进行神经环路研究的理想模型之一。GCaMP是一种钙离子荧光指示剂,可将神经元细胞内钙离子浓度的变化转换为荧光蛋白荧光亮度的变化。现今对秀丽线虫神经环路的研究多以固定或半固定线虫为研究对象,但若能观察完全自由移动下神经环路的活动,则可得到更接近真实情况的结果。本课题的内容即研究如何组建一套硬件设施及配套的硬件控制、数据分析的软件系统,以达到实时观察秀丽线虫在自由移动的情况下头部神经元的钙荧光变化,进而得知各神经元与线虫活动状态的关系,以及这些神经元之间功能上的联系。
  为采集得到该钙荧光变化,使用压电陶瓷控制物镜上下周期性移动,扫描不同高度处的神经元活动,并通过共聚焦显微镜成像。同时,为实时跟踪线虫的自由移动,通过对红外成像或荧光成像进行分析,并将结果分析反馈给平台,平台可在水平方向移动,使线虫实时处于物镜的视野中心。
  采集得到图像后,使用基于光流法及高斯混合模型的算法,对图像中的神经元荧光进行半自动识别分析,得到线虫神经元的活动变化,配合对红外录像中线虫运动状态的分析,最终得到神经环路在线虫运动中的作用。
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