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[硕士论文] 高凡
生物物理 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:秀丽线虫作为一种常见的模式生物,通体透明,便于观察。其神经系统解剖结构简单,神经环路连接的物理图谱已被完全解析,是进行神经环路研究的理想模型之一。GCaMP是一种钙离子荧光指示剂,可将神经元细胞内钙离子浓度的变化转换为荧光蛋白荧光亮度的变化。现今对秀丽线虫神经环路的研究多以固定或半固定线虫为研究对象,但若能观察完全自由移动下神经环路的活动,则可得到更接近真实情况的结果。本课题的内容即研究如何组建一套硬件设施及配套的硬件控制、数据分析的软件系统,以达到实时观察秀丽线虫在自由移动的情况下头部神经元的钙荧光变化,进而得知各神经元与线虫活动状态的关系,以及这些神经元之间功能上的联系。
  为采集得到该钙荧光变化,使用压电陶瓷控制物镜上下周期性移动,扫描不同高度处的神经元活动,并通过共聚焦显微镜成像。同时,为实时跟踪线虫的自由移动,通过对红外成像或荧光成像进行分析,并将结果分析反馈给平台,平台可在水平方向移动,使线虫实时处于物镜的视野中心。
  采集得到图像后,使用基于光流法及高斯混合模型的算法,对图像中的神经元荧光进行半自动识别分析,得到线虫神经元的活动变化,配合对红外录像中线虫运动状态的分析,最终得到神经环路在线虫运动中的作用。
[博士论文] 夏文龙
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:在生命发育的过程中,中枢神经系统的正常有序的构建是形成高级生命所必须的。以小鼠为模型,在胚胎时期,位于大脑皮层内侧侧脑室周围区域的神经干细胞通过不断的增殖,分化,迁移等过程以“inside-to-outside”的方式形成了包含6层不同类型神经元结构的高度复杂的初级大脑结构。
  神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)被定义为能够生成神经组织或者是来源于神经系统中,可以自我更新的多能性干细胞,其在胚胎发育过程中产生多种类型的神经元和神经胶质细胞。一些神经干细胞在成年脊椎动物的大脑中持续存在,在整个生命进程中持续产生新生的神经元。干细胞区别于其他成体细胞的特征在于其分化成多种细胞类型的能力。干细胞经历对称或不对称细胞分裂成两个子细胞。在对称细胞分裂中,两个子细胞也是干细胞。在不对称分裂中,干细胞产生一个干细胞和一个走向分化方向的细胞。在发育的过程中,神经干细胞主要分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。具体而言,在小鼠胚胎发育时期,神经干细胞主要位于皮层区域两个发生区域,侧脑室区域(Ventricular zone,VZ)和侧脑室下区域(Subventricular zone,SVZ),而且处于不同位置的神经干细胞的种类是不一样的。在侧脑室区域的放射状胶质细胞(Radial glial cells,RGs)通过对称分裂完成神经干细胞的自我更新,形成新的子代RGs,或者通过不对称分裂形成神经系统的中间祖细胞(Intermediate Progenitor cells,IPs)细胞;位于侧脑室下区域的IPs细胞通过对称分裂形成神经元,这些神经元沿着RG细胞的放射状突起不断地向上迁移成熟到达特定的区域形成完整的大脑皮层。在这一系列的变化过程中,不同的转录因子按照时间和空间的先后顺序不断地激活(Pax6-Tbr2-Tbr1-Cux1-Satb2),精确地调控神经干细胞的命运。大脑皮层构建过程中的任何一个步骤发生问题都会导致严重的发育疾病,比如精神分裂症,自闭症等。但是,目前对于神经干细胞增殖,分化,迁移的深入机制还不十分清楚,需要进一步地探究。
  在胚胎大脑皮层发育的过程中,各种形式的表观遗传调控发挥着重要的功能,比如组蛋白的甲基化,乙酰化,磷酸化;DNA的甲基化;microRNA等等。在这些表观遗传修饰中,组蛋白变异体是一个很大的家族,包含H2A.Z,H2A.X,macroH2A,H3.3等。在实验体系中,重点关注了H3.3这种非常关键的组蛋白变异体对神经发生过程的影响。真核生物的核小体由不同种类的组蛋白构成,包含H1,H2A,H2B,H3和H4。在基因转录激活或是抑制的过程中核小体中的组蛋白构成会发生变化,比如在转录活化时,H2A.Z和H3.3会替换到核小体内,形成一种染色体活化的标志物,影响蛋白和DNA在染色质水平的可接近性,从而促进转录的进行。组蛋白变异体在基因组中的特定区域发挥对基因的表达的调控功能。对这些复杂的有组蛋白变异体参与的转录调控的研究有助于更深入了解基因的表达过程。同时,将对组蛋白变异体的探索引入到胚胎早期神经干细胞相关的研究中,可以帮助人们从一个新的角度揭示它们在发育过程中的重要作用。以往的研究表明H3.3可以通过替换H3来调控基因的转录,这时染色体处于一种转录活性状态。H3.3上包含丰富的表观遗传修饰位点,可以发生不同的表观遗传修饰,进一步调控不同生命发育过程。研究结果表明H3.3在胚胎早期神经干细胞中有表达:在体内和体外,H3.3都会和神经干细胞的标志物共标,而且H3.3的表达在时间和位置上有一定的特异性。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,H3.3敲降后会导致神经干细胞增殖的比例减少,分化的神经元的比例增加。通过进一步的探索,发现H3.3的减少会导致另一种组蛋白修饰H4K16ac的减少,而这是因为H3.3表达量的降低会减少其对H4K16位点特异性乙酰化转移酶的招募,从而降低了H4K16ac的水平并且影响了基因的转录活化。这提示在神经干细胞发育的过程中H3.3和H4K16ac这两种组蛋白密码相互协同,调控神经干细胞的命运。通过转录组测序,发现在H3.3敲降影响了大量神经发生相关的生物过程。进一步分析数据后发现,GLI(GLI-Kruppel)家族的所有基因都是降低的,而其中GLI1减少的最多。通过进一步的Western和小鼠体内胚胎电转的实验证明GLI1是H3.3的下游基因,其在神经干细胞增殖分化的过程中发挥重要的功能。
  在大脑皮层发育的过程中谷氨酸是一种必不可少的氨基酸,发挥着重要的生物学功能。在哺乳动物体内,谷氨酸的受体分为离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体。代谢型谷氨酸受体被报道与神经疾病相关,是一些神经疾病的靶点,可以调控神经递质的释放和神经元的兴奋性。不同的代谢型的谷氨酸受体主要因为其蛋白序列,功能,配体的不同被区分为3类。其中包括Ⅰ(GRM1and GRM5),Ⅱ(GRM2and GRM3),和Ⅲ(GRM4,GRM6,GRM7,and GRM8)。在分析了以往的报道后,发现代谢型谷氨酸受体7(GRM7)作为一种仅在神经元突触前膜上特异性表达的G蛋白偶联受体,在接收到谷氨酸的刺激时会产生抑制性的作用。而且有报道称GRM7可能与新生儿自闭症(Autism Spectrum,ASD)和注意力缺陷(Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)相关。但是GRM7是否会影响胚胎时期大脑皮层的发育还是未知的。
  在实验中,通过在胎鼠大脑皮层内过表达和敲降GRM7的方法来研究GRM7在神经干细胞发育过程中的重要作用。结果发现,GRM7在神经干细胞中有表达:在体内或体外的染色结果都表明GRM7和神经干细胞的标志物共标,而且GRM7在不同发育时期的表达是动态的。进一步体内胚胎电转的实验结果表明,GRM7敲降会导致神经干细胞增殖的比例增加,而神经元分化的比例减少,而且神经元的形态发育也会受到影响。在机制上的研究表明,在GRM7的表达受到影响后会改变CREB(cAMP Responsive Element Binding Protein)蛋白的磷酸化水平,而p-CREB作为一种转录调控因子会影响下游基因的表达。后续的实验证明YAP(Yes Associated Protein)作为GRM7和p-CREB的下游发挥调控神经干细胞增殖和分化的功能。
[博士论文] 郭文炎
生物医学工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:神经元是大脑结构和功能的基本单元。众多的神经元通过从胞体发出的突起,构成神经回路并相互联系。基因表达、蛋白活动等分子事件,在神经元及其回路上不断发生。神经元的投射和分子活动,共同构成了脑结构和功能的基础。基因表达分析结合神经元单细胞形态,有利于更好地理解神经元的类型和功能。然而,针对组织整体目前没有研究报道在一个样本上同时获取了神经元单细胞完整形态和基因表达信息。
  fMOST系统的发展,为全脑尺度下神经元连接图谱和分子图谱的获取奠定了成像上的基础。GFP及其pH敏感衍生物的化学层析成像,使fMOST同时具备了宽场成像的速度和共聚焦成像的分辨率。然而,双色化学层析成像既是需求又是挑战。针对小鼠全脑这种整体生物组织,在化学层析成像获取神经元形态投射时,如何同时获取基因表达信息也存在方法上的困难。
  围绕全脑尺度下同时获取神经元单细胞完整形态及其基因表达信息的需求,针对这两方面研究在标记方法上的具体问题,本文的主要贡献如下:
  (1)确定了红色荧光蛋白pHuji兼容树脂包埋和化学层析成像,并将之与EGFP或 EYFP联合,实现了双色化学层析。本文根据树脂包埋和化学层析对荧光蛋白的要求,选择了可能满足这些要求的pH敏感红色荧光蛋白pHuji并将其编码基因构建到AAV病毒载体上,实现了稀疏高亮标记神经元完整形态。通过结合EGFP进行双色标记,实现了双色化学层析成像。
  (2)基于EGFP和pHuji的双色标记,实现了神经元形态和突触结构的同时高亮度标记,为fMOST双色化学层析同时获取神经元单细胞完整形态和突触分布奠定了基础。本文通过AAV介导pHuji标记神经元形态,完整的EGFP融合Synapsin标记突触前,完整的EGFP融合PSD95标记突触后,实现了突触的高亮度与高准确度标记。
  (3)基于iDISCO的组织通透方法与杂交链式反应的信号放大方法,建立了小鼠全脑荧光原位杂交的方法。以中高丰度内源或者外源基因的mRNA为靶标,设计多个寡核苷酸探针作为一级探针,荧光染料标记的发夹对作为二级探针,实现了特定mRNA的准确标记。这一整体原位杂交方法结合fMOST断层成像时核酸染料(PI或者 DAPI)实时复染,在同一个样本上同时获取了 mRNA分布信息和细胞构筑背景,从而发展了一种简单、快速、精确确定mRNA在全脑中表达位置的方法。
  (4)利用非甲醇依赖的iDISCO组织通透方法对 Thy1-EGFP-M小鼠脑块进行通透,然后进行组织整体原位杂交,既获得了基因表达信息,又保留了荧光蛋白标记的神经元形态投射信息,从而证明了基于iDISCO的整体原位杂交方法与荧光蛋白标记神经元形态投射的方法具有较好的兼容性。
[硕士论文] 吴生礅
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:在大脑皮层中,神经元放电在时间上具有高度不规则性。这种神经元的不规则放电与大脑的许多重要的认知相关功能如注意、感知觉、工作记忆等有着密切关系。展开神经元不规则放电调节方面的研究,有助于增加对神经信息加工机制的理解。在本文中,我们采用计算模型方法,探究了突触传输对神经元放电不规则性的调节作用。本文的主要内容和结论概述如下:
  1、我们详细探究了突触前轰击与神经元的不规则放电的关系。我们利用扩散近似方法,推导了在大量突触前神经脉冲轰击条件下,单个神经元接受到突触电流的解析表达式,发现突触电流呈现为Ornstein–Uhlenbeck(OU)噪声形式。并通过计算模型方法,我们发现突触前轰击具有非单调地调节神经元放电规则性的作用,并在最优的轰击强度下诱发神经元产生具有最优时间相干性的放电,即产生了相干共振现象。另外,通过与独立突触前输入相比,我们还发现具有相关性的突触前输入会降低神经元放电的规则性。我们的结果显示突触前输入在形成和调节神经元不规则放电方面,发挥着重要的作用。
  2、我们研究了自突触对神经元不规则放电的调控作用。通过计算仿真和进行数据的统计分析发现,自突触参与对神经元放电规则性的调控,主要是通过调节神经元产生簇放电的频率实现。其中,兴奋性自突触和电自突触能够提高神经元产生簇放电的频率,从而降低神经元放电的规则性;而抑制性自突触能抑制神经元簇放电的发放,从而改善神经元放电的规则性。随后,我们进行了放电触发平均和簇放电触发平均分析,发现正是由于自突触电流与神经元放电的时间关联性,使得自突触具有高效调节神经元簇放电的作用。另外,我们的结果不依赖于特定的神经元放电类型以及突触前输入相关。在相关输入条件下或者在其他放电类型的突触后神经元模型中,同样发现了类似的结果。我们的研究从计算神经科学角度为自突触调控神经元不规则放电提供了一种解释机制,并说明自突触在调节神经元放电动力学方面具有重要的功能性的作用。
  总之,我们的结果为突触传输参与形成和调控神经元的不规则放电提供了一种内在的理解机制。并且,因为神经元不规则放电在生物神经系统中的重要的功能作用,我们的工作也将有助于增加对神经系统的信息加工机制的理解。
[硕士论文] 何六一
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是生殖系细胞最早在个体体内出现的,具有精子或卵子发生两个方向的分化潜能。小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)在体外,经上胚层样细胞(epiblast like cells,EpiLCs)阶段,分化成小鼠原始生殖细胞样细胞(mouse PGC-like cells,mPGCLCs),利用唯支持细胞综合征的新生小鼠睾丸细胞与分化得到的mPGCLCs混合培养,在视黄酸、睾酮促性腺激素及垂体提取物等的刺激下,完成减数分裂得到球形精子。虽然可以通过体外分化得到球形精子,但目前的小鼠生殖细胞体外分化系统分化效率低,不能解决目标细胞的大规模获得问题。
  三维细胞培养技术因其在细胞培养过程中更类似体内微环境,能够增大目标细胞的获得量和获得效率,是近年来细胞培养研究的趋势。在哺乳动物生殖细胞分化的过程中尚无关于三维细胞培养技术的相关报道。本实验主要在传统分化体系基础上,在培养基中添加甲基纤维素(methylcellulose,MC),因其粘稠特性减慢了细胞球沉降速率,而形成简单的三维细胞培养状态,并在此基础上优化了分化实验过程,为实现mPGCLCs的大量获得做了初步探索,为进而建立一个体外三维细胞分化体系奠定了重要基础。
  本课题选用共表达BPT(同时有Blimp1、Prdm14和Tfap2c三个转录因子)的转基因mESCs进行体外分化,在EpiLCs和mPGCLCs诱导分化阶段的培养阶段加入0.3%的MC进行三维培养,并优化了EpiLCs阶段的分化培养基。EpiLCs阶段的免疫荧光染色结果显示Oct4的表达符合这一阶段的特征,之后对比传统培养方法,流式细胞荧光分选技术(fluoresvemce activated cell sorting,FACS)分析结果显示改良后的mPGCLCs分化效率未有提高。更进一步的Real-time PCR对day4的mPGCLCs的关键基因表达谱分析,多能性基因和PGCs阶段基因的表达mPGCLCs状态正常,分化效率未有提高,但是水平与传统培养体系的结果相吻合。上述结果说明优化实验流程后得到的统计发现,相同量培养基的条件下mPGCLCs的获得率有4倍左右提高。虽然本项目没有做进一步的功能实验,但是实验结果对体外三维分化体系得到大量目的细胞,提供了最初的方法和技术支持。
[硕士论文] 谈烨明
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:m6A(N6-methyladenosine)是真核生物messager RNA(mRNA)和long non-coding RNA(lncRNA)最为普遍的修饰。早在上个世纪七十年代,m6A修饰就已经被发现。而它的生物学意义并不清楚。过去曾一度认为m6A修饰是不可被逆转的,以致没有得到足够的重视。随着去甲基转移酶FTO(fat mass and obesity-associated protein)的发现,以及高通量测序等先进的技术的应用后,又掀起了m6A的研究热。近些年来,对m6A的生理功能方面取得了重要的研究成果,然而,m6A表观修饰如何影响生物个体的生殖细胞分化过程并不清楚。本研究利用经典模式生物果蝇作为模型,深入探索m6A调控果蝇早期生殖细胞分化的机制,揭示其分子基础,对于整个表观遗传研究领域和不孕不育等相关疾病发病机的理论研究具有重大意义。
  我们利用Me-RIP技术对果蝇卵巢细胞中的m6A进行了测序分析,得到了与生殖发育密切相关的mRNA上的m6A信息。总共检测到了4442个m6A peak位点。m6A peak在5’UTR和3’UTR均有富集。与已报道的体外细胞中m6A的分布相比,果蝇生殖细胞中的m6A在5’UTR的富集程度更高。这提示,果蝇卵巢细胞中的mRNA上的m6A修饰可能参与转录和翻译调节。聚类分析则显示,mRNA上的m6A在卵子发生、卵巢滤泡细胞发育等生殖过程中显著富集。
  对测序数据进一步分析发现,vasa、sxl(sex leathal)、orb(oo18 RNA-binding protein)、nanos、oskar、pumilio等与早期生殖发育密切相关的基因mRNA上均有m6A修饰。其中sxl的m6A修饰已有报道,也佐证了此次m6A测序的可靠性。通过MeRIP-qPCR,我们先确定了卵巢中vasa、sxl、orb、bam四个基因的mRNA存在m6A修饰,其中orb的m6A富集比例较高,可能有较高的m6A修饰比例。
  应用CRISPR/Cas9系统构建的m6A甲基转移酶复合物组分ime4、dMETTL14突变体果蝇。其中,得到了ime4插入突变体,dMETTL14缺失突变体。二者发生的突变均发生在第二个外显子中。ime4和dMETTL14两种基因的纯合突变体果蝇羽化后存活时间较短,无法建立稳定系产生后代。育性统计发现,ime4突变体果蝇生育能力减弱。16.67%的 ime-/-突变雌性果蝇无法产生后代,dMETTL14突变体果蝇也有类似情况。免疫荧光观察发现,ime-/-突变体果蝇卵巢germarium形态异常,spectrosome数量增多,CB等早期生殖细胞分化异常,滤泡细胞不能正常包裹Cyst。但未观察到dMETTL14-/-突变体果蝇有相应的表型。
  荧光定量PCR显示,在ime-/-纯合突变果蝇中,vasa和bam的mRNA水平降低,sxl的变化不大,而orb的mRNA提高了30%。以此为基础,进一步分析并确认突变体表型发现,与杂合突变体相比,纯合突变体中Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。
  故我们得到以下结论:
  (1)通过果蝇卵巢m6A甲基化修饰Me-RIP测序,筛选到了orb等与早期生殖细胞分化密切相关的基因mRNA上的m6A位点;
  (2)m6A甲基转移酶纯合突变体果蝇育性下降;
  (3)甲基转移酶纯合突变体果蝇卵巢早期生殖细胞分化出现异常;
  (4)纯合突变体果蝇中orb mRNA表达量升高,与之相对应的,Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。总之,本实验表明了,mRNA m6A修饰与果蝇早期生殖细胞的分化密切相关。这将有助于我们揭示mRNA上的m6A的在体生物学功能,亦可为生殖相关疾病的诊断和治疗提供线索。
[硕士论文] 张洋明
生物物理学 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:动物对环境信号的正确应答是物种延续的保障,其中关注最多的是躲避行为。该行为大多是发生在分子水平、细胞水平以及环路水平的多种层次整合的结果。秀丽隐杆线虫以其身体透明,生长周期短,以及相对简单的神经系统被广泛的应用在功能研究。已有的研究说明秀丽线虫对伤害性刺激的躲避反应是多种层级神经元的调控的结果。而在参与调控的神经元中,感觉神经元特别是在感觉水平的相互调控研究的相对较少。
  秀丽线虫感觉神经元ASI是一对多模式的感觉神经元,其介导着重要的生理功能。例如:其通过daf系列通路调控线虫的休眠功能;通过离子通道负反馈调控温度感受;通过微调节躲避环路实现局部搜索行为以及代偿特定神经元的对刺激物的感受等。感觉神经元ADF是一对释放5-HT多模式的感觉神经元,其因释放5-HT水平的不同调控着不同的行为。已有的研究表明,在伤害性感受过程中秀丽线虫的感觉神经元ASI对ADF神经元活性具有促进作用,但是对其调控的分子机制我们是知之甚少。
  因此,我们以秀丽线虫感觉神经元ASI和ADF作为研究对象,以分子生物学、在体钙成像、光遗传、定量行为学等技术为手段,研究在 CuSO4感受过程中,ASI对ADF的调控分子机制。实验结果表明:阻断ASI神经递质释放和光抑制ASI的活性,ADF神经元的呈现明显的兴奋延迟;通过对合成神经肽前体egl-3和egl-21的筛选,我们发现神经肽介导ASI对ADF的调控;进一步的对神经肽的大规模筛选以及分子遗传实验,我们发现神经肽nlp-3、ins-1共同介导ASI对ADF的伤害性感受,最后通过行为学实验也进一步论证了这个结论。这些结果表明,神经肽介导神经元间的微调控,并且这种调控可能是以协同方式作用。
[硕士论文] 徐莹
理论物理 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:神经系统是由神经元组成的,神经元之间通过各种耦合方式来实现信号传递。由于靶波和螺旋波可以像“节拍器”一样,调节神经系统电活动的集体行为,因此斑图动力学理论能够预测网络群体振荡行为的稳定性。当正常信号传播受到干扰或出现非自发的神经疾病时,网络中呈现混沌状态。本文基于Hindmarsh-Rose神经元网络模型构造了最近邻连接下的规则神经元网络,通过利用自适应控制、调节系统参数、改变边界条件以及实验条件等方法实现对神经元网络稳定性控制。针对该课题做了以下研究:
  1.通过三种不同的方法产生靶波,研究靶波在易激发介质中出现的潜在机制。并加入与结构有关的人工缺陷观察对靶波的影响。证实了缺陷对靶波的影响取决于靶波的内禀属性(产生靶波的方式)。
  2.神经系统缺陷可以发射连续波或脉冲,扰乱正常神经系统的信号传播。通过对外部激励产生波及其传播过程的研究,分析缺陷的形成机制。发现在外部激励下可以产生缺陷,且外部激励产生的波与缺陷诱发的波可以共存。
  3.网络边界上的结点选取随机初始值,通过观察神经元网络各结点膜电位的空间分布,来研究初始值对神经元放电模式的影响。发现适当的耦合强度下,网络中可以观察到螺旋波。
  4.研究规则神经元网络中同时施加局部周期激励和噪声时的动力学行为。发现螺旋波和平面波可以共存于神经元网络中,即使施加的噪声和外界周期激励位置不同,二维规则神经元网络中仍会出现随机共振行为。
  5.对网络少数结点的输出信号进行动态实时检测,利用非线性分析方法诊断网络细微涨落引发的相变行为,以及通过各个采样检测点的关联度,确定故障和崩溃的位置和范围。把该方法扩展到多体系统安全性检测和诊断,为消除故障、减少事故损害提供依据。
[博士论文] 黄鑫
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:乳是雌性哺乳动物哺育其初生幼仔生长和发育的天然营养品,同时也是人类生存必不可少的重要食品。乳合成的调控机理是生命科学的重要基础问题之一。探究乳合成相关信号转导途径,寻找调控乳合成的关键信号分子将会为奶牛乳产量和乳品质的提高提供重要的实验依据。营养素和激素通过调控基因的表达,在乳合成方面发挥重要的调节作用,特别是氨基酸在调控乳蛋白合成方面已成为近年来的研究热点。目前,氨基酸和激素调控乳合成方面的研究已经取得一定的成果,但对其调控乳合成分子机制的研究还不够深入。因此,进一步探究乳合成的分子调控机制,完善其分子调控网络是泌乳生物学领域的重要研究内容。
  核因子κB(NFκB)作为真核细胞中重要的转录因子,广泛参与多种基因的表达调控,在细胞增殖与分化、细胞凋亡、免疫应答和炎症反应等方面发挥重要作用,但在泌乳生物学领域的相关研究鲜有报道。本课题以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为研究基础,通过系统全面的研究,揭示了NFκB1通过PI3K信号途径接受外源信号氨基酸(蛋氨酸)和激素(雌激素),正向调节下游靶基因mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1的表达。此外,本研究进一步揭示甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)能够介导蛋氨酸(Met)和雌激素(E)信号,促进NFκB1磷酸化进而调控BMECs的乳合成和细胞增殖。本研究进一步丰富和完善了乳合成的分子调控网络,为营养素和激素调控乳合成的作用机理提供重要的实验依据。
  本研究使用的BMECs由组织块培养法分离和纯化获得。用免疫荧光染色法检测BMECs中角蛋白18(Cytokeratin18)和β-酪蛋白(β-casein)的表达以鉴定细胞纯度及泌乳能力。在培养液中添加Met(0.6 mmol/L)或E(2.72×10-2μg/L),qRT-PCR和Western blot结果显示,NFκB1的表达量显著上升,p-NFκB1水平显著提高。免疫荧光结果显示,Met和E还能够促进NFκB1入核及磷酸化。研究结果表明,NFκB1可能是介导Met和E促进BMECs乳合成的重要调节因子。
  对NFκB1基因进行过表达和干扰。qRT-PCR和Western blot结果表明,NFκB1能够正向调控与乳合成和细胞增殖相关的重要信号分子mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的表达,以及提高β-casein和β4Gal-T2的表达水平。进一步研究结果显示,NFκB1基因过表达能够显著促进BMECs甘油三酯和乳糖的合成与分泌以及细胞增殖;而NFκB1基因干扰后,细胞合成与分泌甘油三酯和乳糖的水平及细胞增殖能力显著降低。此外,对NFκB1基因过表达和干扰后BMECs中合成的脂滴进行BODIPY染色,实验结果显示,NFκB1能够促进细胞内脂滴的合成,与上述结果一致。以上研究结果表明,NFκB1能够正向调控BMECs的乳合成及细胞增殖。
  采用生物信息学手段,对mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1转录起始位点上游2000 bp的启动子区域进行分析,发现这些基因的启动子区域均可能含有NFκB1结合位点(κB序列)。染色质免疫共沉淀(ChIP)结果证实NFκB1与这些基因的启动子存在结合。ChIP-qPCR结果显示,添加Met和E后,NFκB1与靶基因启动子的结合显著升高。以上研究结果表明,Met和E能够激活NFκB1并通过提高其与靶基因启动子的结合,在转录水平上调控乳合成和细胞增殖相关基因的表达。
  为了探究NFκB1接受Met和E信号的分子机制,实验进一步检测了在添加PI3K抑制剂(wortmannin)和mTOR抑制剂(rapamycin)分别抑制PI3K和mTOR信号途径后,NFκ1的表达与激活情况。结果显示,抑制PI3K途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平显著下降,而抑制mTOR途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平无显著变化。进一步研究发现,在添加Met或E同时抑制PI3K途径后,Met和E对NFκB1表达的促进作用被明显削弱。研究结果表明,Met和E通过PI3K途径激活NFκB1。
  此外,对GlyRS介导Met和E信号促进NFκB1磷酸化的分子机制进行了研究。观察过表达GlyRS及同时利用siRNA干扰NFκB1后,对下游靶基因mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1表达的影响;以及观察添加Met或E同时利用siRNA干扰GlyRS后,对NFκB1磷酸化的影响。研究结果表明,GlyRS介导了Met和E促进NFκB1磷酸化的作用,以及GlyRS主要通过NFκB1调节mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1信号通路。进一步观察利用siRNA干扰GlyRS同时干扰GCN2对NFκB1基因表达和磷酸化的影响。研究结果表明,GlyRS促进NFκB1磷酸化的作用与GCN2途径及NFκB1基因表达无关。本实验室其它研究工作表明GlyRS直接结合和促进NFκB1磷酸化,与本研究结果一致。
  综上所述,NFκB1作为重要的转录因子能够正向调控BMECs的乳合成和细胞增殖。Met和E通过PI3K途径和GlyRS激活NFκ B1。p-NFκB1通过与靶基因mTOR、SREBP-1 c、β4Gal-T2和Cyclin D1启动子的结合,在转录水平上调控这些靶基因的表达。
[硕士论文] 王凤娟
系统理论 北京交通大学 2017(学位年度)
摘要:非线性动力学是研究非线性系统运动规律的一门学科.其主要研究内容包括系统中的结构的稳定性、轨道的稳定性、分岔、混沌等.对非线性动力系统的研究不仅在理论上具有重要的价值,而且在科研应用方面也具有广泛的应用前景.非线性系统几乎涉及自然科学和社会科学的各个领域.它的理论和方法已经被广泛地应用到物理、化学、生物、生态、医疗以及经济学等领域.本文主要考虑非线性系统理论在神经系统中的应用.
  本文首先基于Chialvo神经元模型,研究系统在不同参数组合下的二维参数平面图的分岔结构,给出Neimark-Sacker分岔曲线的表达式,讨论系统吸引子的最终状态,包括周期吸引子、无界吸引子、拟周期和混沌吸引子,并且详细分析嵌入拟周期或混沌中的周期吸引子的分岔规律和动力学特征.
  其次,建立由混沌峰放电(chaotic spiking)的Chialvo神经元构成的网络模型,定性分析和数值模拟当数目众多的无规则的个体通过线性耦合方式紧密联系在一起形成的高维数的神经网络表现出的动力学行为,验证了随着耦合强度的改变,形成的网络系统有可能会表现为稳定的同步不动点,并且达到完全相同步.
  最后,总结本文的工作,为全面分析单个离散神经元模型以及神经元网络系统的动力学行为奠定基础.
[硕士论文] 张云翔
神经生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:癫痫是一种大脑神经元异常放电导致的突发性疾病。失神癫痫是癫痫中的常见类型,在失神癫痫发作过程中常常伴有2~4 Hz棘慢波(Spike and wave discharges, SWDs)的发放,并伴随短暂的意识丧失。研究表明大脑基底节(Basal ganglia,BG)神经环路在调控失神癫痫发作的过程中发挥重要作用,其中黑质网状部(Substantia nigra pars reticulate,SNr)作为重要的信息中转站,通过丘脑间接与大脑皮层相连接,进而调控大脑皮层的兴奋性。解剖学上,BG神经环路中外侧苍白球(Globus pallidus externa,GPe)可以通过两种不同的神经通路调节SNr兴奋性,即GPe-SNr神经通路和GPe-底丘脑核-SNr通路,这些神经通路使得GPe能够参与皮层神经元兴奋性的调控。新近研究发现从GPe到前额叶皮层运动区还存在一条直接的伽马氨基丁酸(GABA)能神经通路,本课题组基于计算仿真模型的研究发现这条苍白球-前额叶皮层通路也对前额叶皮层区的失神癫痫发作具有调控作用。但是,苍白球-前额叶皮层通路对失神癫痫调控作用目前尚缺乏足够的动物或临床实验证据。
  本论文中,我们通过腹腔注射伽马丁内酯(?-Butyroladone,GBL)建立失神癫痫模型,通过GPe注射GABA受体阻断剂Gabazine,以及电损毁SNr,采集不同干预条件下失神癫痫发作的脑电数据,并用时频分析、大尺度方差识别统计算法、信息熵以及功率谱对失神癫痫发作时的 SWDs进行分析,以期从实验角度为理解苍白球-前额叶皮层通路对失神癫痫调控提供依据。主要研究结果如下:
  1、通过在GPe注射Gabazine增强GPe神经元的活性,可以有效抑制前额叶皮层失神癫痫SWDs发放,表明GPe与前额叶皮层区之间存在直接或间接的通路,从而对前额叶皮层区域失神癫痫的发作具有重要的调控作用。
  2、通过电毁损黑质网状部或同时药物干预GPe增强神经元的活性,均可有效抑制前额叶皮层区的失神癫痫发作。表明除了经典的GPe-SNr-皮层间接神经通路外,GPe-前额叶皮层的直接通路是另一条控制大脑皮层区失神癫痫发作的重要神经通路。
  3、通过对失神癫痫大鼠在不同时间段SWDs发作次数和平均每次发作时间进行对比分析,发现在不同干预条件下,SWDs发作次数可能存在明显变化,而每次SWDs的平均发作时间没有明显变化,提示不同干预条件下,SWDs总的发作减少是由于干预导致SWDs的发放次数减少所致。
  4、在GBL诱发的失神癫痫大鼠模型中,药物干预GPe或电毁损SNr均可有效抑制前额叶皮层区的失神癫痫SWDs发放时间。在失神癫痫发作的15~35 min内,GPe和SNr对抑制皮层运动区失神癫痫SWDs贡献度分别平均为47.2%和34.6%。因此,相比SNr,GPe对前额叶运动皮层区失神癫痫发作具有更强的调控能力。
  5、通过对GBL诱发的失神癫痫大鼠在不同实验干预条件下,SWDs在不同时间段EEG信号的信息熵进行分析,发现当SWDs发放减少时,对应EEG信号的信息熵会降低;SWDs发放增加时,对应EEG信号的信息熵也会增加,提示信息熵可以表征失神癫痫SWDs的发放过程。
  6、通过对不同实验干预条件下,与SWDs相关的低频EEG信号的功率谱和同步性分析发现,失神癫痫发作后1-8 Hz频段EEG功率谱与同步性显著增加,干预 GPe或损毁 SN后,可以降低由于癫痫发作所致的脑电功率谱和同步性,并且同时干预对EEG功率谱与同步性影响更明显。
  通过以上的研究,我们从电生理实验角度证明了外侧苍白球-前额叶皮层直接通路是一条重要的抑制性神经通路,而且在调控前额叶皮层运动区失神癫痫发作的过程中GPe可能比SNr发挥更重要的作用。研究结果有助于增加对皮层失神癫痫发作和调控机制的理解,同时也验证了计算仿真模型的结果。
[硕士论文] 张赟
动物学 河南农业大学 2017(学位年度)
摘要:瘦素是来源于脂肪组织的调节动物能量代谢的重要因子,其在中枢的作用主要是抑制动物的食欲并促进动物的能量消耗。瘦素作用于下丘脑上的受体,激活OB-Rb信号通路,发挥其生理调节作用。在瘦素抵抗的情况下,瘦素信号通路受阻,动物表现为肥胖等代谢障碍。有研究显示,动物下丘脑中FoxO1(Forkhead box O1)的增多是导致瘦素抵抗的原因之一。实验室对不同的FoxO1突变体的功能进行了前期研究。其中,敲除了DNA结合结构域(DNA Binding Domain,DBD)的FoxO1,在细胞水平的实验中有促进瘦素信号通路的效应。为了验证其在动物体内的作用,实验室构建成质粒pEF1α-Myc-FoxO1△DBD,利用显微注射法,以C57BL/6为背景,构建了突变型FoxO1转基因小鼠,总共获得了10个转基因首建鼠(Founder)。本论文的目的主要是检测转基因小鼠中目的基因表达的组织分布及其对动物生理的影响。首先,对转基因小鼠进行了基因型鉴定工作,将10个转基因首建鼠与野生型C57BL/6杂交各自扩增成系。作者为建立可靠的基因型鉴定方法,通过更换PCR体系等多方尝试克服了目的基因GC含量高不易扩增的问题,同时在采集鼠尾样本的过程中不断更换手套和清洗灼烧剪刀,并且使用含有滤芯的无菌枪头在超净台中进行加样克服了基因型鉴定易污染的问题,避免了假阳性结果的出现。根据此法,作者已将转基因小鼠鉴定到F5代,其中第8、9两只首建鼠无法繁殖后代,第1、2、3、4、5、6、10系的转基因小鼠根据后续的实验结果只做少量保种,第7系转基因小鼠作为实验对象目前保留500只左右;第二,利用荧光定量PCR的方法检测目的基因在转基因小鼠各组织中的表达水平。结果显示,肝脏中只有第7系小鼠目的基因有高水平表达;大脑中只有第3、7系小鼠目的基因有高水平的表达;白色脂肪组织中只有第7系小鼠目的基因有高水平表达,第3系小鼠目的基因有较低水平表达。下丘脑中第7系小鼠目的基因有高水平表达,第2、3系小鼠目的基因有中等水平表达,第1、10系小鼠目的基因有较低水平表达;棕色脂肪组织和腓肠肌中第7系小鼠目的基因同样有高水平表达;第三,利用Western Blotting检测目的蛋白在第7系转基因小鼠下丘脑中的表达。结果显示,目的蛋白有表达但是水平较低;第四,第7系小鼠的体重与采食量的检测。结果显示,阳性小鼠体重略低于阴性小鼠但差异并不显著,阳性小鼠与阴性小鼠采食量上没有显著差异,但是采食量比体重的比值,呈现显著差异且阳性鼠大于阴性鼠;第五,利用荧光定量定量PCR和Western Blotting检测第7系小鼠瘦素信号通路下游抑制食欲的POMC(Proopiomelanocortin)神经肽和促进食欲的AGRP(Agouti gene-related protein)神经肽的mRNA表达和瘦素敏感性。结果显示,常规条件下POMC和AGRP的表达差异不显著,饥饿小鼠一段时间对小鼠颈静脉注射瘦素并作用一段时间后,检测到阳性小鼠STAT3(Signal transducer and activator of transcription3)磷酸化水平高于阴性小鼠,而POMC的表达实验组相对于对照组没有显著升高;第六,利用荧光定量PCR检测第7系小鼠棕色脂肪中UCP1、2、3(Uncoupling protein1、2、3)的表达。结果显示,UCP1在阳性小鼠的表达明显升高(P<0.01),UCP2、UCP3则无显著变化。
[博士论文] 龙治良
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:人类大脑是迄今最为复杂精细的系统之一。大脑的某项认知功能是由神经元活动同步的脑区共同协调完成。静息态功能核磁共振成像技术是一项探索脑功能静息活动强有力的分析工具。它可以描述脑区间低频功能活动特征的相似性,即静息态功能连接。弥散张量成像技术则是一项通过组织中水分子各向异性来探测脑微观组织结构的成像方法。它可以描述大脑神经突触连接,即白质纤维结构连接。静息态功能连接和白质纤维结构连接已分别应用于许多神经精神疾病的研究中。然而大脑的结构和功能并不是独立存在,而是相互依赖。因此,本论文将以静息功能连接和白质结构连接为基础,围绕多模态分析方法,利用神经影像的多维特征来探测情感障碍和运动障碍患者内在的脑异常连接。本文的工作主要有以下几部分内容。
  1.采用弥散张量成像以及白质纤维束追踪技术,通过图论分析方法分析创伤后应激障碍患者脑结构连接网络拓扑属性。结果发现患者保留了小世界拓扑组织结构。但是我们观察到患者显著降低的最短路径长度和标准化最短路径长度。另外,异常改变的节点中心性的脑区主要在显著性网络、前扣带回、苍白球和海马。该研究揭示了创伤后应激障碍是一种脑网络疾病,为理解该患者功能失常和临床症状提供了结构上的证据。
  2.利用白质纤维束追踪技术,构建未用药抑郁症患者结构连接网络,然后使用图论分析方法,探测抑郁症患者的结构网络拓扑属性是否异常。进一步采用基于网络的统计(NBS)方法来探究该患者是否有异常改变的子网络。我们发现未用药抑郁症患者结构网络的全局拓扑属性有异常变化,比如异常降低的最短路径长度和异常升高的聚类系数。除此之外,NBS方法揭示了抑郁患者在眶额叶与皮下结构、梭状回、颞下回以及枕叶部分脑区间有异常的结构连接。该研究揭示了眶额叶连接在抑郁症患者病理机制中的重要作用。同时为该患者的功能异常提供了结构上的基础。
  3.利用静息态功能连接分析方法,我们研究了处于抑郁期的抑郁症患者和双相障碍患者的丘脑皮层网络,进一步探测特定的丘脑皮层连接是否能够有效辨别这两种情感障碍疾病。结果发现抑郁症和双相障碍的丘脑-眶额叶功能连接都异常降低,丘脑-运动连接都异常升高。双相障碍患者特有的异常连接是丘脑-顶下小叶连接。而抑郁患者特有的异常连接是丘脑-颞叶、丘脑-躯体感觉皮层连接。并且丘脑枕下部和左侧顶下小叶间的功能连接能有效的区分抑郁症和双相障碍。本研究表明即使抑郁症和双相障碍的临床症状很相似,我们仍然发现了它们之间影像学的差异,为临床诊断提供了一种生物学标记。
  4.融合白质纤维结构连接和静息态功能连接技术,我们探究了阵发性运动源性运动障碍患者的丘脑皮层结构连接和功能连接。我们发现该患者在腹外/前侧丘脑核团与运动皮层的结构连接和功能连接异常升高。患者的功能连接值与病程呈显著的正相关关系,表明了该运动障碍患者是一种复杂的发展性疾病。另外,我们还发现PRRT2基因突变患者在背内侧核团与前额叶间的功能连接异常降低,表明了PRRT2基因突变降低了丘脑到前额叶的功能整合,阐明了丘脑皮层连接失常在该患者病理机制中的重要作用。最后,我们还探究了该患者基底节-皮层连接,发现PRRT2基因未突变患者在壳核/苍白球与运动皮层间功能连接异常升高,揭示了PRRT2基因突变和PRRT2基因未突变患者间不同的发病机制。
  5.采用静息态功能连接分析技术,我们探究了阵发性运动源性运动障碍患者异质性问题。首先我们利用主成分分析方法提取患者功能连接特征,然后使用基于密度的聚类算法对该患者进行亚组分类。结果发现该患者有两种疾病亚型。一种亚型在小脑-丘脑-基底节-运动皮层环路异常升高,而另一种亚型在小脑-顶上回连接环路异常降低。并且,第一种亚型的全脑功能连接网络的拓扑属性异常改变。而第二种亚型的网络拓扑属性则保持不变。该研究为神经精神疾病的亚型分类提供了一种基于影像数据驱动的分析方法。
[硕士论文] 张琴
生理学 中南林业科技大学 2017(学位年度)
摘要:近年,糖尿病已经成为严重危害人类生存和生活质量的重要疾病,其发病率逐年攀升,成为重大的公众健康问题。已知糖尿病有两个关键发病因素,一个是胰岛β细胞的数目减少和功能衰竭,另一个则是胰岛素抵抗。由于现有糖尿病研究模型都存在β细胞生成效率低、细胞不成熟等问题,无法完全满足研究需要;并且在已有的肥胖动物模型上只有局限性的物种选择,因此建立起一个新型研究糖尿病的替代动物模型极为迫切。翼手目(Chiroptera)种类众多,分布广泛,是仅次于啮齿目的第二大哺乳类动物,其生态、食性多种多样。狐蝠科(Pteropodidae)是翼手目中以取食高糖食物(如水果汁液或者花蜜)为主的特化类群之一。长期的高糖食性适应性进化使得旧大陆果蝠有着快速降血糖的表型特征,避免取食大量简单碳水化合物后持续高血糖,因此高糖食性的旧大陆果蝠是研究降血糖机制的理想动物模型。本研究选择食果的犬蝠(Cynopterus sphinx)和食虫的大蹄蝠(Hipposideros armiger)作为实验对象,从激素水平和生理解剖水平探索其大量摄食高糖食物餐后快速降血糖机制,为哺乳动物血糖稳态研究提供帮助和补充,以期为人类的糖尿病治疗提供借鉴。
  首先,在空腹状态下,进行葡萄糖耐量(GTT)和胰岛素耐量(ITT)实验。结果表明食性不同的蝙蝠的降血糖速率存在差异(P<0.05),但都是依赖胰岛素降血糖的。较之大蹄蝠,犬蝠具有更高效的降血糖能力。
  其次,酶联免疫分析(ELISA)测定蝙蝠血清胰岛素浓度。结果显示空腹状态下(禁食12h)犬蝠(Mean±SE,39.10±4.46 mIU/L,n=9)的血清胰岛素浓度显著高于大蹄蝠(26.30±0.74 mIU/L,n=11)(P<0.05)。我们认为,犬蝠经长期进化已适应高糖食物,血液中高的胰岛素浓度与其快速降低餐后血糖的表型一致,从而避免犬蝠机体受到高血糖的损伤。
  接着,对蝙蝠进行解剖发现犬蝠的胰腺组织结构是紧密的,而大蹄蝠的胰腺组织是弥散的。对胰腺组织进行石蜡切片制作、脱蜡至水后,进行HE染色、免疫组化染色和分析。研究发现,犬蝠(n=4)的胰岛α细胞、胰岛β细胞和胰岛δ细胞分别占胰岛的比例为29.72±2.08%、48.41±4.59%和14.73±2.04%,大蹄蝠(n=4)分别为22.19±3.24%、50.28±5.99%和21.74±2.85%;犬蝠的胰岛与胰腺的面积之比为22.77±0.90%,大蹄蝠的胰岛与胰腺的面积之比之比为5.28±0.33%,犬蝠胰岛组织占胰腺组织的比例显著高于大蹄蝠。其次,犬蝠胰岛面积比大蹄蝠显著大,β细胞分布在犬蝠中贯穿整个胰岛,而大蹄蝠主要分布在胰岛核心。结果表明,犬蝠无论是胰岛大小还是β细胞数量和大小上都要比大蹄蝠大或者多,这些生理结构变化增强了犬蝠β细胞产生和分泌胰岛素功能,这可能是犬蝠血清胰岛素显著高于大蹄蝠的原因。
  最后,利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记增殖细胞以及其胰腺组织做免疫荧光实验鉴定蝙蝠胰岛β细胞的增殖。结果显示,相同时间内,成年犬蝠(n=4)的胰岛β细胞增殖的数目多于成年大蹄蝠(n=5)(P<0.05)。这表明犬蝠胰岛β细胞更新速率要比大蹄蝠快,这与犬蝠应对餐后高血糖对β细胞损伤得到充分修复有关,保持其高效的生产和分泌胰岛素功能。
  综上所述,葡萄糖耐量实验定量的描述了犬蝠降血糖速率显著的大于大蹄蝠,证明食果的犬蝠糖代谢能力高于食虫的大蹄蝠,并且从胰岛素浓度、胰岛结构和β细胞特征以及β细胞增殖生理层面揭示犬蝠高效的降血糖能力。暗示因食性的分化,旧大陆果蝠发生了适应性进化,获得快速降血糖表型。
[博士论文] 马文涛
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的肝再生是在损伤刺激下肝脏进行的代偿性生长。在这个过程中,肝脏中的固有免疫系统,尤其是Kupffer细胞和NK细胞具有非常重要的调节作用。近年来的研究表明,Kupffer细胞在肝脏损伤时释放的细胞因子TNF-α和IL-6能够激活肝实质细胞内的Stat3信号通路,从而促进肝实质细胞的增殖。此外,Kupffer细胞也能够通过激活肝脏前体细胞促进肝再生。在另一方面,NK细胞对肝再生具有很强的抑制作用。NK细胞分泌的IFN-γ通过活化肝实质细胞的Stat1并因此抑制Stat3信号通路,从而抑制肝实质细胞的增殖。近期的一项研究表明,NK细胞是肝再生过程中最为重要的IFN-γ来源;在小鼠肝再生过程中,NK细胞上的一种共抑制性受体TIGIT的缺失将引起NK细胞的过度活化,从而抑制肝再生的进行。
  PTEN是一种重要的肿瘤抑制蛋白。在多种类型肿瘤的发生过程中,Pten基因的突变都能被检测到。PTEN可以负向调节维持细胞存活及增殖的PI3K-Akt信号通路,从而抑制多种细胞的增殖。另外,PTEN对免疫细胞的活化同样具有重要的调节作用。一项有关小鼠腹腔巨噬细胞的研究表明,PTEN能够正向调控LPS诱导的TLR4信号通路的活化,进而影响巨噬细胞炎性细胞因子的分泌。除此之外,PTEN也能够通过抑制巨噬细胞M2型极化所需的一些重要基因从而调控腹腔巨噬细胞的极化和炎性细胞因子的分泌。但是,PTEN是否参与了肝再生过程的调控未见报道。
  我们认为,阐明肝脏中Kupffer细胞和NK细胞的相互作用对于研究肝再生的分子学机制具有重要的意义。为了更好地探究肝脏中Kupffer细胞和NK细胞对肝再生的影响,我们主要利用PTEN在髓系细胞中特异性缺失的LysMcre/+PTENf/f小鼠(PTENmKO小鼠)及对照鼠PTENf/f鼠展开研究。我们的研究结果如下:
  正常小鼠肝再生过程中Kupffer细胞的特征。
  我们发现,同以往的研究报道一致,使用氯磷酸盐脂质体清除小鼠肝脏Kupffer细胞后,小鼠肝再生的速度将明显减慢。由于我们使用的Kupffer细胞清除方法同样能清除腹腔里的巨噬细胞,为了排除腹腔巨噬细胞在肝再生中的影响,我们在使用氯磷酸盐脂质体处理小鼠之前对其进行了腹腔清洗处理,该结果同样表明Kupffer细胞的清除抑制了小鼠的肝再生。以上结果表明小鼠肝脏Kupffer细胞在正常的肝再生过程中具有不可或缺的作用。进一步,我们发现将正常小鼠进行2/3肝切除后,Kupffer细胞的数量与对照鼠相比并没有显著的变化,但是 Kupffer细胞内PTEN蛋白的水平有明显的上调,并且伴随着PTEN的上调,Kupffer细胞呈现出显著的M1型极化的特征,这可以通过Kupffer细胞下调CD206以及上调CD11c、MHC-Ⅱ和CD80的表达得以体现。
  髓系细胞PTEN缺失的小鼠肝再生速度明显加快。
  我们利用PTENmKO小鼠及PTENf/f对照鼠进行了进一步的研究。通过PCNA和Ki-67免疫组化染色表征的细胞增殖情况、HE染色显示的细胞有丝分裂指数以及肝脏重量与体重的百分比等分析,我们发现PTENmKO小鼠的肝再生速度比对照鼠明显加快。
  髓系细胞PTEN缺失小鼠的Kupffer细胞表现为M2型极化的特征,从而对NK细胞的活化能力降低。
  进一步的研究表明,PTENmKO小鼠的Kupffer细胞通过激活细胞内的Akt并抑制FoxO1信号通路,使其自身倾向于M2型的极化特征。此外,PTENmKO小鼠肝脏NK细胞的活化程度明显降低,这主要表现为IFN-γ分泌能力的降低以及活化相关分子表达水平的下降。进一步的实验结果表明,PTENmKO小鼠的Kupffer细胞降低了其表面与NK细胞活化相关的多种分子的表达,减少了其IL-12的分泌水平,这是这类小鼠肝脏NK细胞活化程度降低的主要原因。
  髓系细胞PTEN缺失小鼠的Kupffer细胞分泌生长因子的能力增强。
  在2/3 PHx后48 h时,荧光定量PCR分析结果显示,PTENmKO鼠的Kupffer细胞表达更高水平的pdgf, hgf以及osm。这些生长因子通常能活化其下游的Stat3信号通路。与之一致的是,PTENmKO鼠肝脏中Stat3的磷酸化水平明显升高。我们进一步证明了Kupffer细胞对肝实质细胞的这种直接的增殖促进作用,因为PTENmKO鼠Kupffer细胞来源的条件培养液具有更强的促进小鼠肝实质细胞系体外增殖的能力。
  综上所述,PTEN蛋白抑制了Kupffer细胞的M2极化,从而使其更容易活化NK细胞,抑制肝再生的过程。另外,PTEN也能抑制Kupffer细胞分泌多种生长因子。因此,Kupffer细胞中PTEN蛋白的总体作用便抑制了肝再生的进行。考虑到Kupffer细胞的强吞噬能力以及由此开发的Kupffer细胞靶向药物,我们的结果表明,对Kupffer细胞中PTEN表达的干预有望为临床上肝脏部分切除病人的肝脏功能恢复提供新的治疗靶点。
[博士论文] 张莹
生理学 延边大学 2017(学位年度)
摘要:研究表明,磷脂酶A2(phopholipase A2,PLA2)促使心脏未脂质化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)的累积,进而衍生前列腺素(prostaglandins,PGs)。各种PGs以不同亲和力结合不同的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR),参与调节心肌肥大、纤维化、梗死等多种心脏疾病的病理过程。
  PGD2是1973年被发现的PGs一员,造血型前列腺素D合成酶(hematopoieticPGD synthase,H-PGDS)和载脂蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-type PGDsynthase,L-PGDS)是催化PGH2生成PGD2的两种酶。PGD2可通过其代谢产物15-deoxy-△12,14-PGJ2(15d-PGJ2)激活过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activate receptorγ,PPARγ),从而发挥抗炎、抗凋亡和镇定动脉粥样硬化的作用。PGD2也具有抵制缺血、缺氧和保护心脏的作用。
  作为内分泌腺的心房合成和分泌心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),其分泌受较多因素的调控,但血容量增加导致心房壁的牵张是调节ANP分泌的主要因素。研究表明,心房牵张、缺血、内皮素等因素最终能通过影响AA代谢并生成多种PGs调节心房ANP的分泌,如PGF2α和PGE2促进大鼠心房ANP的合成和分泌;PGF2α,PGE2和PGI2浓度依赖性地促进ANP分泌。虽然也有研究报道,PGD2促进ANP的分泌,但其作用机制尚不清楚。
  因此,本研究利用大鼠离体搏动的心房灌流模型,采用放射免疫技术检测心房ANP的含量,利用蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)分析心房肌组织PPARγ蛋白含量,观察PGD2对大鼠心房ANP分泌及其机械活动的影响,并探讨PPARγ、促分裂元活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路对PGD2促进心房ANP分泌的作用。
  本研究结果如下:
  1.不同剂量的PGD2(0.1,1.0和10.0μmol/L)明显增加ANP的分泌和心房搏动压(与对照组相比,均P<0.05),并呈现一定的时间依赖性特征(1.0μmol/L的PGD2;与对照循环比较,P<0.05)。
  2.PGD2受体抑制剂AH6809(1.0μmol/L)可完全阻断PGD2促进心房ANP分泌及其正性肌力作用(与对照循环比较,均P>0.05)。而且PGF2α受体抑制剂AL8810(1.0μmol/L)也可完全消除PGD2对心房ANP分泌和机械活动的作用(与对照循环比较,P>0.05)。
  3.PGD2的代谢产物15d-PGJ2(0.1μmol/L)也显著增加心房ANP的分泌(与对照循环相比,P<0.05),该作用与PGD2的作用相似。另外,15d-PGJ2明显抑制心房搏动压(与对照循环相比,P<0.05)。PGD2受体抑制剂AH6809不仅能完全阻断15d-PGJ2促进心房ANP分泌的效应,而且还可完全解除15d-PGJ2对心房的负性肌力作用(与对照循环比较,均P>0.05)。
  4.PPARγ抑制剂GW9662(0.1μmol/L)可完全阻断PGD2及其代谢产物促进心房ANP分泌的效应(与对照循环相比,均P>0.05),而且也可完全解除PGD2及其代谢产物对心房机械活动的作用(与对照循环相比,均P>0.05)。另外,PGD2能显著增加心房肌组织PPARγ蛋白含量(与对照组相比,P<0.05),该作用可被GW9662所完全阻断(与PGD2组相比较,P<0.05)。
  5.MAPK/ERK的抑制剂PD98059(10.0μmol/L)明显减缓PGD2促进心房ANP分泌的作用(与对照循环相比,P<0.05),同时完全阻断PGD2对心房的正性肌力效应(与对照循环相比,P>0.05)。另外,PI3K/Akt的抑制剂LY294002(1.0μmol/L)与PD98059的作用类似,也明显抑制PGD2促进心房ANP分泌的作用(与对照循环比较,P<0.05),但未能改变PGD2的正性肌力效应(与对照循环比较,P<0.05)。
  以上结果提示:
  1.PGD2通过激活PPARγ信号通路促进离体搏动大鼠心房ANP的分泌,并发挥正性肌力作用;
  2.MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路可部分地参与调节PGD2的作用过程。
  第二部分:HIF-1α-L-PGDS-PPARγ对缺氧诱导心房ANP分泌的影响
  载脂蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-type prostaglandin D synthase,L-PGDS)是一种低分子糖蛋白。研究发现,L-PGDS在心脏中有表达,而且被认为是评价心血管疾病风险的新型生物标志物。
  缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是异二聚体的转录因子,也是激活缺氧易感基因的核心调控因子。研究证实,缺氧强烈促进ANP的分泌,并促使细胞适应缺氧环境和保护缺血性心脏。另外有研究报道,在人和鼠类肥大的心肌组织中HIF-1α和过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activate receptorγ,PPARγ)的含量均明显增加,而且HIF-1α可直接激活PPARγ的转录使其发挥关键的下游效应。由于L-PGDS可催化PGH2生成PGD2,而PGD2的代谢产物15-deoxy-A12,14-PGJ2(15d-PGJ2)是PPARγ内源性配体,所以对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用。然而,在缺氧条件下HIF-1α-PPARγ信号通路是否参与调节缺氧诱导的心房ANP分泌尚不甚清楚,而且缺氧诱导的心房L-PGDS是否参与调节HIF-1α对PPARγ的转录过程也不清楚。
  本研究假设,急性缺氧时HIF-1α通过激活心房L-PGDS的途径激活PPARγ信号通路,从而参与调节缺氧诱导心房ANP分泌的过程。因此,本研究利用离体搏动的大鼠心房灌流装置制备急性缺氧模型,采用放射免疫、Western blot技术和生理学及药理学等方法,选用相应抑制剂探讨并证明上述假设,为研究和阐明HIF-1α调控缺氧诱导心房ANP分泌的作用及其机制提供必要的理论和实验数据。
  本研究结果如下:
  1.缺氧以时间依赖性地强烈促进心房ANP的分泌,其分泌在缺氧第四循环末(约在缺氧后48 min)达到峰值(与对照循环比较,P<0.05),并伴随心房搏动压的显著抑制(与对照循环比较,P<0.05)。
  2.缺氧明显增加心房肌组织HIF-1α的含量(与对照组比较,P<0.05),并显著增加心房ANP的分泌(与对照循环比较,P<0.05)。而HIF-1α的抑制剂rotenone(0.5μmol/L)不仅可完全阻断缺氧增加HIF-1α含量的作用(与单纯缺氧组比较,P<0.05),而且也可明显减缓缺氧增加心房ANP分泌的效应(与对照和第四单纯缺氧循环比较,均P<0.05)。
  3.缺氧明显增加心房肌组织L-PGDS含量(与对照组比较,P<0.05)。L-PGDS的两种抑制剂AT56(5.0μmol/L)和HQL49(5.0μmol/L)可显著减缓缺氧增加心房肌组织L-PGDS含量的效应(与对照组比较,均P<0.05;与缺氧组比较,均P<0.05);同时也显著减缓缺氧诱导心房ANP分泌的作用(与对照和第四单纯缺氧循环比较,均P<0.05)。
  4.PPARγ抑制剂GW9662(0.1μmol/L)明显减缓缺氧增加心房ANP分泌的效应(与对照循环比较,P<0.05;与单纯缺氧比较,P<0.05)。该作用与HIF-1α的抑制剂rotenone和L-PGDS的抑制剂AT56对缺氧诱导ANP分泌的作用类似(与对照循环比较,P<0.05;与单纯缺氧比较,P<0.05;与rotenone和AT56比较,均P>0.05)。
  5.缺氧显著增加心房肌组织PPARγ的含量(与对照组比较,P<0.05)。而rotennone不仅可完全阻断缺氧增加心房肌组织L-PGDS含量的作用,也可完全解除缺氧对PPARγ的效应;AT56则可模仿rotennone对缺氧心房PPARγ的抑制作用(与对照组比较,均P>0.05;与缺氧组比较,P<0.05)。另外,将rotennone和AT56联合预处理时,其对PPARγ,的阻断效应要比各自的效应呈现微弱的叠加趋势,但与各自比较未呈现显著性差异(与rotenone和AT56比较,均P>0.05)。
  以上结果提示:
  1.急性缺氧可通过HIF-1α激活L-PGDS并参与调节离体搏动大鼠心房PPARγ的活性;
  2.HIF-1α-L-PGDS-PPARγ通路是缺氧促进心房ANP分泌的重要机制之一。
  
[硕士论文] 苏秀婷
应用数学 浙江师范大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,耦合神经元系统的同步动力学已经成为各国学者研究的一个中心问题.通过构建符合实际生物神经系统的神经元网络,研究神经元网络的同步具有重要的生理意义.本文以随机的Hodgkin-Huxley方程为基础,构建不同的神经元网络模型.通过计算机仿真实验,探讨了网络拓扑结构、突触延迟、突触类型等对神经元网络同步产生的影响.
  首先,在没有突触延迟时,耦合抑制性神经元网络的同步性很差,随着连接概率的增加神经元发放率减少.此外,随着膜面积增加,耦合抑制性神经元网络越来越不同步,且神经元发放率减少.若进一步加入适当的突触延迟会促进耦合抑制性神经元网络的同步.
  其次,在没有突触延迟时,耦合兴奋性神经元网络与耦合抑制性神经元网络相比同步性较好,随着连接概率的增加,神经元发放率增加.若进一步加入适当的突触延迟也会促进耦合兴奋性神经元网络的同步.
  再次,我们考虑了由抑制性和兴奋性两个神经元集群相互耦合组成的神经元网络.在无突触延迟时,耦合抑制性和兴奋性神经元网络的相干发放性较好.随着膜面积增加,耦合抑制性和兴奋性神经元网络越来越同步且发放率减少.另外,兴奋性突触有助于促进耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步,而抑制性突触会抑制耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步,但随着膜面积的增加,抑制性突触对耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步影响逐渐变小.若进一步加入突触延迟,当膜面积较小时,突触延迟对耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步影响较小;当膜面积适中时,突触延迟会引起耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步振荡;当膜面积较大时,随着突触延迟的增大耦合抑制性和兴奋性神经元网络的同步性越来越好,最后趋于稳定.
  最后,我们进一步考察了兴奋性神经元集群E1、E2以及抑制性神经元集群I所组成的神经元网络,并研究了网络拓扑结构对这种神经元网络动力学的影响.在兴奋性神经元集群E1和兴奋性神经元集群E2不构成回路的连接方式下,当膜面积适当大且E2集群有抑制性输入时,三个神经元集群之间不会出现同步发放.若在兴奋性神经元集群E1和兴奋性神经元集群E2构成回路的连接方式下,三个神经元集群之间就会出现同步发放.
[硕士论文] 袁蓉蓉
神经生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:一、研究目的及背景
  肌球蛋白(Myosin)家族属于马达蛋白超家族,可以将细胞内的机械能转化为化学能,进而参与生物体内一系列生理生化反应。目前已发现超过20种肌球蛋白分子,在结构和功能上具有差异,但都可以通过头部结合ATP酶水解ATP沿actin进行移动。目前研究最多是MyosinⅡ,即肌球蛋白Ⅱ。MyosinⅡ最早在肌肉中被发现,通过水解ATP产生的能量介导肌肉收缩。随着研究的深入,发现在非肌肉组织,如神经元中也存在MyosinⅡ的表达,称为非肌肉型MyosinⅡ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ)。MyosinⅡ是一个六聚体,包含一对高分子量的重链(MHC)及结合在重链颈部的两对小分子量的轻链(MLC),其中包含两条调节型轻链和两条必要型轻链。中枢神经系统中MyosinⅡ有较高的表达,并起着重要的调控作用,主要参与神经元的迁移、突起的生长及导向、微管在神经元生长锥内的状态与转运、肌动蛋白(actin)的动态变化、树突棘spines的形成等过程。NMⅡ的活性主要受其轻链MLC2的激活调控,参与的激酶主要有肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)及Rho亚家族(RhoA)激酶。NMⅡ作为细胞内基础的马达蛋白也参与到脑的高级功能中。文献报道MyosinⅡ在早期长时程增强(Long Term Potentiation,LTP)的维持过程发挥作用;并且通过不同信号激活,分别参与到长时程条件性恐惧记忆的整合阶段,及缘下回(infralimbic cortex,IL)脑区味觉厌恶记忆的消退中。目前的报道多以直接干扰重链的形成从而影响MyosinⅡ功能为主,但是MyosinⅡ活性上游受到哪些因素调控,并没有详细的报道。
  脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是脑中广泛存在的神经营养因子,通过与膜上两种不同亲和力的受体-高亲和力酪氨酸激酶受体B(Tropomyosin receptor kinase B,Trk)和低亲和力神经营养因子受体(The Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor,P75NTR)结合,激活下游信号通路。BDNF除了能够促进神经元的存活及分化、突起的生长,还在突触可塑性的调节中发挥重要功能。突触的可塑性也被广泛认为是学习记忆的分子基础,调控神经元之间的信息传递。在体外培养的海马神经元中,BDNF能够诱导LTP的产生并维持LTP的稳定。BDNF还可以通过调控肌动蛋白(actin)的动态变化促进树突棘的形成。BDNF是否对MyosinⅡ的活性存在调控作用,具体的信号通路又是什么?
  本文采用分子生物学及细胞生物学的多种方法,证实BDNF/TrkB信号通路可以上调调节型轻链MLC2的磷酸化水平,从而上调MyosinⅡ活性。进一步证明这一过程并不依赖TrkB下游经典的三条信号通路,而是通过SRC家族的LYN激酶实现的。本研究可更好的帮助我们了解MyosinⅡ的功能及作用机制。
  二、实验方法
  1、构建各种小干扰片段。
  2、特异性MLCK短肽
  3、海马神经元的培养及其转染。
  4、Western Bolt及CO-IP
  三、实验结果
  1、BDNF通过高亲和性受体TrkB调节MLC2磷酸化。
  首先通过蛋白免疫印迹的方法发现,给予体外培养的海马神经元BDNF刺激30min时,p-MLC2灰度值较con组明显增加(p<0.05,而且随时间增加(2h时)灰度值持续增加(p≤0.01)。在给予BDNF刺激前加入抑制P75NTR功能的短肽(TAT-Pep5)、Trk激酶抑制剂(K252a)预处理30min,与对照组相比较,K252a+BDNF组p-MLC2灰度值并无明显增加。同样的给予老鼠海马脑区注射BDNF、K252a结果发现,BDNF组p-MLC2明显增加(p<0.05)。
  2、BDNF通过激活MLCK调控MLC2磷酸化
  我们发现分别给予体外培养的海马神经元磷酸酶抑制剂(CalA)、ROCK激酶抑制剂(Y27623)、MLCK激酶抑制剂(ML-7)预处理30min后,BDNF刺激2h,ML-7+BDNF组p-MLC2没有明显升高。在体外培养的海马神经元中加入特异性短肽抑制MLCK与MLC2结合后,BDNF刺激2h,TAT MLCK+BDNF组p-MLC2并无明显变化。
  3、SRC通路参与BDNF调控MLC2磷酸化水平变化
  之前发现BDNF对p-MLC2的调控依赖TrkB的激活,我们分别给予体外培养的海马神经元TrkB下游三条经典信号通路抑制剂U0126(MAPK信号通路抑制剂),U73122(PLCY信号通路抑制剂),LY294002(PI3K信号通路抑制剂)30min预处理后,BDNF刺激2h,与BDNF组相比较,U0126+BDNF、U73122+BDNF、LY294002+BDNF组p-MLC2灰度值无明显变化(p>0.05),这提示我们BDNF对p-MLC2的调控不是通过三条经典信号通路发挥作用。接下来给予TrkB下游SRC信号通路抑制剂PP130min后,BDNF刺激2h,与BDNF组相比较,PP1+BDNF组p-MLC2灰度值显著降低(p≤0.05)。分别干扰SRC家族成员,发现干扰掉LYN激酶后加BDNF刺激时p-MLC2无明显升高。
  4、LYN作为上游蛋白调节MLCK磷酸化水平
  我们通过免疫共沉淀的方法,检测LYN-Myc与MLCK-HA是否存在结合,结果发现LYN与MLCK存在相互作用。接下来干扰捧LYN的表达,BDNF刺激2h,p-MLCK的灰度值显著下降(p<0.05),同时过表达LYN后p-MLCK显著增加(p<0.05)。
  结论:
  通过一系列的细胞及分子生物相关实验,我们证明了BDNF通过激活SRC信号通路上调MLCK磷酸化水平从而增加MLC2的磷酸化水平。
[硕士论文] 金霞
发育生物学 杭州师范大学 2017(学位年度)
摘要:神经系统是以神经元为单位构建起来的复杂而又精密的网络。神经系统由初期状态向成熟状态发育的过程中,具有广泛的重塑现象,其中包括神经元轴突的修剪,新的突触的产生,旧的突触的消除等。这有别于成体的神经可塑性,发育中的神经可塑性给神经连接带来的变化是不可逆的。目前我们对于神经发育可塑性的调控机制并不清楚。
  线虫DD神经元在发育过程中存在着一个有趣的突触重塑现象,即DD神经元的轴突和树突在功能分支上会发生彻底的反转,但是神经元分支形态没有明显的变化。这就提供了一个有力的遗传学模型去深入探究突触重塑的机理。
  本课题组前期工作鉴别出一个myrf-1的突变体ju1121,该突变体的DD神经元突触重塑受到阻断。详细分析MYRF-1蛋白发现,它全长定位于内质网上,被剪切后其氮端入核,行使调控突触重塑的功能。过表达氮端MYRF-1可以有效促进DD神经元突触重塑提前。但是前期工作又表明,myrf-1的基因缺失突变体的突触重塑能够正常发生。这样myrf-1(ju1121)是否是一个功能缺失突变体,而对于突触重塑起了一个怎样的作用是个未解决的重要问题。
  我们用CRISPR基因编辑方法构建了myrf-1无效突变体,发现在这样的突变体中突触重塑没有出现大的缺陷。我们设想,可能有对于myrf-1功能冗余的基因也能够推动突触重塑。myrf-1有一个横向同源基因myrf-2,他们有很高的序列相似性。我们用CRISPR技术构建了myrf-2无效突变体,发现myf-2功能缺失也不影响突触重塑。但是,在myrf-1和myrf-2的双突变体中突触重塑被阻断,这暗示了myrf-1和myrf-是位于同一条遗传途径中,两者共同促进突触重塑的发生。为了进一步探究myrf-2(ju1121)的机制,我们在DD神经元中过表达MYRF-1(G274R即ju1121)能够抑制突触重塑,并且抑制表型依赖于野生型MYRF-1的表达量。当MYRF-1和MYRF-2共同表达在细胞系中,MYRF-1和MYRF-2可以互相免疫共沉淀,意味着二者共同存在于一个蛋白复合体中。myrf-1和myrf-2是首次发现的能够促进线虫DD神经元突触重塑发生的基因,对于进一步研究突触重塑提供了遗传学通路的框架。
[硕士论文] 袁红瑾
药理学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:皮层与海马的信息处理依赖于谷氨酸能兴奋性投射神经元与γ-氨基丁酸(GABA)能抑制性神经元之间复杂的相互作用。两种神经元之间协调的相互作用对于维持大脑兴奋与抑制信号之间微妙的平衡关系至关重要,这种平衡受到很多神经调节物质如不同的神经肽、一氧化氮(NO)等的动态调节。平衡的破坏会导致很多病理性的障碍如癫痫、自闭症、精神分裂症等。
  NO参与了神经传递、突触可塑性、血管舒张、炎症等很多生理过程,是一个非常重要的信号分子,NO产生或释放功能的缺陷会导致神经元死亡以及癫痫等疾病。NO由一氧化氮合酶(NOS)合成,根据最初被发现时所在的部位,NOS又可分为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经元型一氧化氮合酶(nNOS)以及可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。在神经元中NO主要由nNOS合成,在幼稚和成熟的海马与皮层中nNOS主要表达在GABA能中间神经元上。GABA能中间神经元主要来源于三个不同部位:中间神经节隆起(MGE)、外侧/尾部神经节隆起(LGE/CGE)以及视前区(POA),每个神经上皮前体细胞部位都会产生不同的中间神经元亚型。通过在转基因鼠上运用遗传谱系追踪技术发现,皮层Ⅰ型nNOS主要来源于MGE,Ⅱ型nNOS则是MGE、LGE/CGE以及POA的混合来源,也就意味着皮层大部分的nNOS来源于MGE。
  MGE细胞移植到成年鼠的脑内可以扩散、迁移并且分化成GABA—主要的抑制性神经递质。很多假说认为移植MGE的前体细胞可以增加局部的抑制,运用于临床治疗具有非常重要的意义。近几年来分离、移植MGE来源的中间神经元前体细胞方面研究有很多,皮质中间神经元的前体细胞移植到一系列的中枢神经系统组织后可以广泛的迁移并且与宿主神经元网络形成突触联系。MGE细胞移植后可以进行整合的能力被广泛运用到细胞疗法上,从而治疗一系列中枢神经系统疾病:癫痫、神经性疼痛、帕金森以及阿尔兹海默病等。因此运用MGE前体细胞进行的细胞移植在治疗神经和精神疾病中是一个非常有潜能的临床途径。
  恐惧是一种与适应能力相关的基本情绪,是面对外界可知或不可知的威胁时激发的学习能力。适度的恐惧反应能警示动物面对类似于先前经历的有害环境,及时评估潜在的危险并做出保护反应,而病理性恐惧记忆的产生将会导致创伤后应激综合征(posttraumatic stress disorder,PTSD)、惊恐障碍(panicdisorder)、恐惧症(phobia)等恐惧相关疾病。基于巴甫洛夫条件反射原理建立的经典的条件性恐惧(Cued-fear conditioning)以及在此基础上发展出的背景关联恐惧(Contextual fear conditioning)是最常见研究恐惧相关疾病的动物模型,广泛应用于恐惧学习和记忆的神经、分子机制研究。
  海马是大脑边缘系统结构之一,在情感和认知功能中具有重要作用。既往研究表明,海马与PTSD发生、发展及治疗密切相关,海马DG区是认知功能和情绪调控的神经基础,包含DG区的海马三突触通路对于背景关联型恐惧记忆至关重要。
  由于目前对于nNOS前体细胞来源鲜有报道,且大部分研究着眼于皮层nNOS细胞。因此,我们希望能通过培养MGE细胞来研究nNOS。本课题设计研究三部分内容:1)通过培养不同部位前体细胞来确证nNOS细胞最主要的胚胎来源是MGE,并改进获取MGE的方法,从而获得状态较好的nNOS细胞;2)对nNOS细胞进行体外培养与鉴定,并尝试多种方法来提高其中nNOS细胞的比例;3)将较高nNOS比例的MGE前体细胞体外培养成神经球,并移植到海马DG区,研究nNOS细胞以及GABA能中间神经元在小鼠恐惧记忆获得中发挥的作用。
  第一部分为了探究nNOS的胚胎来源,结合已有的文献报导以及对不同时间点nNOS阳性率的研究,我们选取了E12.5的胎仔,在体视显微镜下取其整脑,并于多聚甲醛中固定24h,随后蔗糖梯度脱水6天后进行冠状冰冻切片,并于载玻片上贴片免疫组化,用免疫标记物PAX6、FOXG-1、Meis-2、Nkx2.1分别标记皮层、前脑、LGE和MGE,对E12.5天胚胎各个部位的形态及范围有个确切的认识。此后,我们就进行E12.5天胎仔的原代培养,在体视显微镜下,分离出同一只胎仔的皮层、POA、CGE、LGE和MGE,体外培养10天后,通过细胞免疫组化鉴定其中nNOS细胞的比例,发现MGE部位nNOS细胞比例最高,即确证了MGE是nNOS细胞主要的胚胎来源。
  由于MGE细胞获取方法以及分离的时间长短均会影响原代培养后细胞的状态,因此我们希望能够通过改进现有的MGE获取方法,使得原代培养后的细胞状态更好。综合对比多种方法后,我们尝试了琼脂糖凝胶包埋整脑后Chopper冠状切片、缓冲液中分离MGE的方法以及体视显微镜下于缓冲液中直接分离MGE的方法,后者无论是操作时长、细胞状态以及nNOS细胞阳性率均优于前者。因此第一部分的实验,我们确定了MGE是nNOS细胞主要的胚胎来源,并通过对比改进了MGE获取的方法,便于之后的研究。
  第二部分为了了解MGE来源的nNOS细胞的形态和性质,我们进行了E12.5天胎仔的原代培养,10天后通过免疫组化进行了nNOS细胞鉴定。发现培养的MGE细胞中90%为GAD67+细胞,99.97%为Tuj-1+细胞,大部分的nNOS细胞可以与GAD67共标,但也有部分nNOS细胞是GAD67阴性的。由于MGE细胞大部分是GABA能中间神经元,且在体能分化形成各种亚型,鉴于体外培养,因此我们也进行了其它亚型的鉴定,发现体外培养的MGE细胞中确实有表达生长抑素(somatostatin,SST)、小清蛋白(parvalbumin,PV)、钙结合蛋白(Calbindin,CB)、鈣网膜蛋白(Calretinin,CR)等其它亚型的中间神经元。体外培养的nNOS细胞形态多样,大小不一,且同一玻片上免疫组化的荧光强度也有所差别。
  由于体外培养的nNOS细胞阳性率较低,因此我们尝试了多种方法来提高其中nNOS的比例。结果表明选取MGE不同部位以及神经营养因子(NGF)的诱导并不能提高nNOS细胞的阳性率。而在不同胚胎期(E11.5-E14)分离MGE,胚胎以及MGE的大小和形态有很大的差别。其中nNOS比例确有差异,E12.5天阳性率最高,其次是E13天。结果表明MGE来源的nNOS经过体外培养,其细胞形态以及性质与体内培养差异不大,且E12.5天获取的MGE细胞nNOS比例最高。
  第三部分为了进一步探索MGE来源的nNOS在小鼠背景关联型近期恐惧记忆获得中所扮演的角色,我们首先将体外培养3天成神经球的GFP鼠的MGE细胞浓缩,并通过玻璃导管注射到野生型鼠海马DG区,移植2个月后与注射GFP鼠的MGE死细胞相比较,发现野生型鼠中移植MGE细胞并没有恐惧记忆获得值的改变。接下来,我们又将GFP鼠MGE神经球移植到nNOS-/-鼠海马DG区,与注射死细胞相比,发现nNOS-/-鼠移植GFP+MGE细胞后,其背景关联型近期恐惧记忆获得显著提高,且nNOS-/-鼠不论雌雄。以上结果表明,野生型鼠海马DG区移植MGE细胞,背景关联型近期恐惧记忆造模后,其恐惧获得的学习能力无改善,而nNOS-/-鼠海马DG区移植MGE细胞,造模后,不论雌雄,其获得恐惧记忆的学习能力提高。
  为了进一步探究MGE细胞对nNOS-/-鼠行为学的改善作用是否由MGE来源的nNOS细胞主导。我们取B6或nNOS-/-鼠的MGE细胞,体外培养3天成球后浓缩液转染GFP病毒1.5小时,然后悬瓶培养4-6天后,将神经球移植到nNOS-/-鼠海马DG区。2个月后,发现移植B6和nNOS-/-鼠的MGE对比,nNOS-/-鼠恐惧记忆获得值没有改变,且与宿主的性别无关。为了确证,我们又选取了雌性nNOS-/-鼠进行分析,结果表明nNOS-/-鼠移植B6鼠的MGE与移植死细胞相比,获得值增加,nNOS-/-鼠移植nNOS-/-鼠的MGE与移植死细胞相比,获得值也增加,但nNOS-/-鼠移植B6或nNOS-/-鼠的MGE细胞之间无差异。以上结果表明nNOS-/-鼠移植MGE后恐惧记忆学习能力的提高源于MGE细胞中非nNOS的其它GABA能中间神经元。
  结论:(1) MGE是nNOS细胞主要的胚胎来源,并通过对比改进了MGE获取的方法,便于之后的研究(2) MGE来源的nNOS经过体外培养,其细胞形态以及性质与体内细胞差异不大,且E12.5天获取的MGE细胞nNOS比例最高。(3)野生型鼠海马DG区移植MGE细胞,背景关联型近期恐惧记忆造模后,其恐惧获得的学习能力无改善,而nNOS-/-鼠海马DG区移植MGE细胞,造模后,不论雌雄,其获得恐惧记忆的学习能力提高。nNOS-/-鼠移植MGE后恐惧记忆学习能力的提高源于MGE细胞中非nNOS的其它GABA能中间神经元。
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