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[硕士论文] 张雪丽
病原生物学 华北理工大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 焦蓓蕾
动物遗传育种与繁殖 西北农林科技大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 司丽炜
生物工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)对骨骼肌生长具有负调控作用,抑制骨骼肌过度生长,其基因突变或蛋白功能的缺失会促进肌细胞增殖和肌纤维肥大。动物消化道菌群参与消化代谢、影响血液生化,与动物的生长发育有着密切关系。为了解MSTN基因编辑后是否影响消化道菌群组成,及其与血液生化和生长性状之间的关联性,本实验分别选用MSTN基因编辑牛(MSTN组)和对照牛各6头(公母各3头),分别检测其1月龄、3月龄、6月龄和12月龄时的消化道菌群,并测量和分析体重体尺等生长指标和血液生化指标。结果表明:(1)1月龄、3月龄、6月龄和12月龄MSTN组体重、体斜长、体高和十字部高等体尺指标均显著或极显著高于同月龄对照组,且公牛差异更为明显。(2)血液生化指标中,MSTN组3月龄和6月龄血清碱性磷酸酶含量显著高于同月龄对照组(P<0.05);1月龄、3月龄和6月龄公牛血糖含量显著低于同月龄对照组(P<0.05);MSTN组1月龄和6月龄母牛和6月龄公牛血液尿素氮含量显著低于同月龄对照组(P<0.05);3月龄MSTN组血清肌酐含量极显著高于同月龄对照组(P<0.01);1月龄血清球蛋白含量MSTN组母牛极显著(P<0.01),公牛显著高于同月龄对照组(P<0.05)。表明MSTN组牛血糖分解能力、蛋白质分解代谢水平高于对照组。(3)消化道菌群分布和聚类分析结果显示,各月龄MSTN组和对照组菌群分布有所不同;母牛消化道菌群分布相似,而两组犊牛1月龄菌群分布差异明显,表明母牛消化道菌群对犊牛影响不明显;随着月龄的增加,菌群组成明显增多,其中1月龄菌群组成最少;3月龄与其他组有明显差异,6月龄和12月龄没有明显的差异。Lactobacillus johnsonii、Oscillibacter valericigenes和Lactobacillus reuteri为犊牛主要的优势菌群,而且在MSTN组,这些有益生作用的菌种丰度高于对照组。另外两种益生菌Bifidobacterium bifidum和Butyricicoccus pullicaecorum为MSTN组1月龄特有的菌种。Eubacterium callanderi和Bacteroides coprophilus为6月龄和12月龄共同的优势菌种。Oscillibacter ruminantium为MSTN组3月龄、6月龄和12月龄优势菌种。MSTN基因编辑影响部分消化道菌群组成,血液相关指标和生长指标也有显著差异。这些有差异的消化道菌种与其血液生化指标和生长性状的关联性及其作用机理和相关通路仍需要进一步验证。
[硕士论文] 刘华振
遗传学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:为了适应因地球自转而导致的光照、温度、湿度等环境因素周期性变化,在自然界几乎所有的生物都有近24小时的昼夜节律,即生物钟。生物钟在分子、生化、细胞、生理及行为等各种水平上调节生物体生命活动。
  生物钟的分子机制是一个转录-翻译-负反馈调节环路。在哺乳动物中,该环路由一对正向调节因子和一对负向调节因子组成:首先CLOCK和 BMAL可以形成异二聚体,结合到PER和CRY启动子区域的E/E’-box从而激活它们的转录。随后,PER和CRY蛋白在细胞质结合形成异二聚体进入到细胞核内,通过作用于CLOCK:BMAL异二聚体,从而反馈抑制其本身的转录活性。
  在斑马鱼中存在三个clock基因,clock1a、clock1b和clock2。clock2又名npas2。Npas2是哺乳动物维持机体正常生物节律所必需的基因,在生物钟调控,并在细胞生长、分化凋亡、肿瘤生长抑制等诸多方面发挥重要作用。但是,至今关于clock2基因的在斑马鱼中具体功能和调控机制还不清楚。
  为了研究斑马鱼clock2基因的调控机制,我们克隆了clock2基因的启动子,细胞转染实验和荧光素酶报告实验发现Clock1a-Bmal1b异二聚体不能激活clock2启动子的活性;细胞转染实验发现Tefa可以激活clock2启动子的活性,ChIP实验发现 Tefa可以直接结合到位于clock2基因启动子区域的D-box上;细胞转染实验也发现Rev-erbα可以抑制clock2启动子的活性。
  为了探究 clock2基因在斑马鱼生物钟中的作用,本研究分析了先期利用CRISPR-Cas9技术构建的斑马鱼clock2突变体。行为实验表明,在正常光照条件下,从受精后第五天开始,斑马鱼 clock2纯合突变体运动量和运动速度降低;在持续黑暗条件下,斑马鱼依然保持行为节律,但其周期缩短了0.6个小时,相位后移了3.5个小时;在持续光照条件下,clock2突变体周期延长1.4个小时,相位后移了0.5个小时。实时定量PCR显示,在纯合clock2突变的斑马鱼幼体中,在持续黑暗和持续光照条件下,生物钟基因 per1a、per1b、per2、per3、cry1aa、cry1ab、cry1ba和cry1bb的表达都显著改变。在正常光照条件下,在clock2的突变体幼鱼中,clock1a、clock1b的表达量升高;在持续黑暗条件和光照条件下,在clock2的突变体中,clock1a、clock1b的表达量降低。这些结果表明Clock2对于保持斑马鱼生物钟的节律起到重要作用。
  斑马鱼clock2纯合突变体,相对于野生型其生长变慢,雌雄比降低。为了深入研究clock2的调节功能,我们通过转录组测序分析clock2突变体胚胎在ZT0(120hpf)基因表达图谱。与野生型相比,clock2突变体有277个基因上调,144个基因下调。其中tyr、prkacbb-2、ednaba与黑素原生成相关,gadd45a、anapc5、cadm1b与细胞周期/黄体酮调节卵母细胞成熟这一过程有关,说明clock2基因除了在生物钟系统中发挥重要作用之外,可能在斑马鱼的黑素原形成、生长发育和细胞周期调节上也有一定的作用。
  本研究阐述了斑马鱼 clock2基因不但直接受到生物钟调控,也在斑马鱼生物钟调节中起到了重要作用,初步探究出了 clock2敲除对斑马鱼核心生物钟基因表达、发育以及行为的影响;这些发现完善了斑马鱼生物钟环路以及 clock2的功能研究,为后续的研究提供了基础。
[硕士论文] 王晋
海洋科学 哈尔滨工业大学 2017(学位年度)
摘要:生物体寿命调控的研究是现今生命科学学科的重点研究课题。生物体寿命调控的机理极为复杂,由内因与外因共同调节,既取决于基因有关的遗传特性又受到外界环境的影响。近些年的研究发现诸如营养素的摄入、饮食限制等诸多外界因素均可不同程度影响生物寿命的长短。此外一些信号转导通路以及相关基因已经被证明能够影响寿命的长短,然而各类营养代谢通路与衰老调控之间的相互作用尚未明确。本论文以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C.elegans)作为模式生物,通过喂食不同浓度的亮氨酸(Leucine, Leu)、异亮氨酸(Isoleucine, Ile)以及缬氨酸(Valine, Val)观测支链氨基酸对线虫寿命及其生理活性的调控作用,并对其分子调控机制进行深入探究。
  本论文通过喂食秀丽隐杆线虫不同浓度梯度(0.1mM、1mM、10mM)的三种支链氨基酸,观察其对秀丽隐杆线虫寿命的影响。结果发现中浓度(1mM)和高浓度(10mM)亮氨酸能够显著延长线虫寿命。为了进一步的了解亮氨酸对线虫的影响作用,我们分别测定产卵量和身体长度两项指标,发现喂食亮氨酸的线虫体长测量值显著大于对照组线虫(P<0.05)。而在抗逆性检测中,亮氨酸能够显著提高线虫在高温、强氧化与紫外照射等环境下的生存能力(P<0.05)。
  为了更好的理解亮氨酸对线虫寿命调控作用的分子机制,本文运用局部基因网络技术将氨基酸酸代谢通路成功联入雷帕霉素受体信号转导通路。并通过使用 age-1,daf-2和 daf-16缺陷性线虫检测亮氨酸对线虫延寿作用是否依赖于上述基因,明确氨基酸与衰老调控通路之间的相互关系。结果为,上述缺陷型线虫在喂食亮氨酸后无法重现与野生型线虫相同的增寿效果。
  由已知与寿命相关的基因可以构建一个局部基因网络。我们进一步探究了亮氨酸对局部基因网络中部分基因表达的影响。分别采集按照常规方法培养以及喂食1mM亮氨酸5天、10天以及15天的线虫样本。并利用实时荧光定量PCR技术(qPCR)检测相关基因表达量的改变。结果显示,除经典雷柏霉素受体信号通路与胰岛素信号通路中的若干基因外,与秀丽隐杆线虫寿命调控通路偶联的sgk-1、skpt-1、raga-1基因的表达也受到亮氨酸摄食的影响,其中sgk-1与raga-1的基因表达量显著下降(-70%、-59%),skpt-1的基因表达量显著上升(+156%)。但是这些基因表达的变化如何进一步影响寿命需要将来进一步研究。
[硕士论文] 王小青
神经生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:胰岛素抵抗是组织对胰岛素敏感性降低,导致胰岛素介导的组织对葡萄糖的利用率下降,是肥胖和2型糖尿病早期重要的发病机制。线粒体是机体进行能量代谢的枢纽,其数量和形态的改变及代谢系统的紊乱不但会影响能量产生,还会改变机体胰岛素敏感性。早期研究发现,冷应激可对中枢神经系统、心脏及脑血管造成一定的损害,但近期我们发现慢性寒冷暴露可降低胰岛素抵抗指数、增加线粒体数量,此现象促使我们继续探究发现表观遗传修饰及转录辅激活因子PGC-1α可能在其中起到了重要的调控作用。表观遗传修饰是在 DNA序列不变的情况下,通过DNA自身化学修饰在转录水平使基因功能发生可逆的、可遗传的改变,而PGC-1α是线粒体生物合成的关键调控子,两者可能为预防和治疗肥胖和2型糖尿病提供新的靶点。
  目的:建立慢性寒冷暴露模型,观察冷应激对胰岛素敏感性、线粒体数量、能量代谢相关蛋白的影响,探讨表观遗传修饰及PGC-1α在其中的调控作用,为预防和治疗能量代谢性疾病提供更多的理论依据。
  方法:选取8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠46只,随机分为对照组和寒冷组。对照组一直饲养于20-25 oC室温中,寒冷组于-1~4℃环境中饲养4周建立慢性寒冷暴露模型。采用血糖仪测定小鼠空腹血糖值及酶学法检测血清胰岛素浓度,并计算胰岛素抵抗指数;利用MitoTracker在体标记小脑皮质颗粒细胞线粒体的方法统计线粒体的数量;采用免疫荧光染色法观察胰岛素受体底物(IRS2, insulin receptor substrate2)、瘦素受体(Ob-R, a leptin receptor)、电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1, voltage-dependent anion channel protein1)、细胞色素C(Cytc, cytochrome C)、5-甲基胞嘧啶(5-mC,5-methylcytosine)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC1,Histone deacetylase1)、DNA甲基化相关酶、线粒体分裂、融合蛋白及PGC-1α的表达情况,并利用Western blot检测上述相关蛋白。
  结果:①慢性寒冷暴露降低胰岛素抵抗指数(P<0.01),增加海马 IRS2和OB-R阳性细胞数(P<0.01)。②免疫组织化学染色和Western blot显示, 寒冷组线粒体能量相关蛋白VDAC1及Cytc的表达量明显多于对照组(P<0.01)。③慢性寒冷暴露增加 DNA甲基化和组蛋白去乙酰化,诱导组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)和DNA甲基相关酶的表达(P<0.01)。④与对照组相比,寒冷组线粒体数量增多(P<0.01),线粒体分裂、融合蛋白及转录辅激活因子PGC-1α表达水平均显著增多(P<0.01)。
  结论:⑴慢性寒冷暴露能改善机体胰岛素敏感性,DNA甲基化和组蛋白去乙酰化参与调控线粒体能量代谢,表观遗传学可能是冷应激减缓胰岛素抵抗的根本机制。⑵慢性寒冷暴露可能通过诱导PGC-1α的高表达增强线粒体生物合成,增加线粒体数量;活化的PGC-1α协同冷应激促进线粒体形态学调控蛋白表达,构建了新的分裂和融合的动态平衡,为机体适应低温环境提供了高效率的产能机制。
[硕士论文] 秦海棠
生化与分子 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:SIP,即类固醇受体共激活因子相互作用蛋白,是一种含有新型的锚蛋白重复序列的蛋白,也是编码KN基序和锚蛋白重复结构域蛋白质家族中的一员。SIP通过调节肌动蛋白的聚合在细胞骨架形成中起作用,SIP蛋白还能通过与一些类固醇受体共激活因子和其他蛋白质在细胞质中结合,从而阻止类固醇受体共激活因子和其他蛋白质进入细胞核,目前SIP蛋白在生物钟领域的研究还没有报道。雌激素受体ERα可以通过CK2磷酸化SIP,雌激素受体ERα还可以促进PER2的表达从而调节生物钟的节律。本课题发现SIP和雌激素受体ERα能抑制哺乳动物生物钟蛋白BMAL1和CLOCK的转录活性。结果表明SIP不仅能与 BMAL1和CLOCK相互作用并且能促进BMAL1蛋白的磷酸化和降解。雌激素受体不仅能直接磷酸化BMAL1而且还能促进SIP磷酸化BMAL1。免疫共沉淀实验证明雌激素受体ERα能够与BMAL1,CLOCK,SIP以及CK2相互作用,并且能通过CK2途径促进BMAL1蛋白的磷酸化。SIP对生物钟蛋白BMAL1和CLOCK的转录活性的影响与BMAL1的磷酸化正相关。另外,SIP不仅在生物钟的主反馈回路中起作用,SIP还能促进ROR?对Bmal1的激活作用,但是具体的机制需要进一步的研究。这些研究结果表明SIP和雌激素在哺乳动物生物钟信号通路中发挥一定的作用。
[硕士论文] 袁学燕
发育生物学 杭州师范大学 2017(学位年度)
摘要:舌头是一个复杂的肌肉器官,主要由横纹肌,颅神经嵴细胞来源的间充质和分层的、鳞状的、无角质的上皮组成。但是,在舌头发育过程中各个组织的发育调控是如何紧密联系的还有待研究。Wnt信号通路在组织器官发育和组织稳定维持等生物过程中都起重要作用,在舌头表皮有多种Wnt配体表达,然而,这些Wnt配体对舌头发育的作用还没有被研究过。Gpr177是一个高度保守的Wnt信号调节蛋白,可以调控Wnt配体的分泌运输。本实验室已发表的论文显示,Gpr177在小鼠舌头发育过程中的表皮和间充质中都有表达,并且使用Shh-Cre敲除舌头表皮的Gpr177会导致舌头背面的菌状乳突发育受到抑制。此外,Gpr177的敲除还会导致舌头整个发育畸形,然而,这个研究的重点在味觉器官的发育上,对舌头的发育缺陷型的性状分析以及形成原因并没有进行下一步分析。因此,本课题以这个Gpr177敲除导致的发育畸形作为研究对象,系统的研究了舌头表皮Gpr177介导的Wnt信号通路对舌头发育的作用以及潜在的调控机制。我们发现Gpr177敲除的突变体小鼠具有舌头表皮发育缺陷、固有层(lamina propria)和上层纵向肌肉(superior longitudinal muscle)缺失缺陷型;我们进一步研究发现,突变体小鼠中这些表型的缺失是由于结缔组织缺失,肌肉细胞的增殖和分化受到抑制导致的。此外,在Gpr177突变小鼠中,Wnt配体分泌抑制导致的Wnt信号通路下调也会导致Notch信号通路活性下调,进而影响Notch下游靶基因Pax7的表达,最终影响了肌肉前体细胞的增殖。最后,我们还发现Notch信号通路在舌头发育过程中也可以反馈抑制Wnt信号通路的活性。综上所述,我们发现在舌头发育过程中存在一种Wnt/Notch/Pax7级联信号调节方式,参与组织与组织之间的相互作用,来调控舌头肌肉的发育,以保证舌头的发育能够正常进行。
[硕士论文] 王丹
发育生物学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:在大自然之中,低温、氧化、高温、土壤盐碱化和干旱等都会对动植物的生长发育和生存产生不利的影响,例如长势弱小瘦弱,数量明显减少,严重的还有可能造成绝种。
  根据以往的研究成果得知,转录因子和调节基因是介导动植物响应逆境胁迫的主要因素。转录辅激活因子跟转录因子的活性有着密切关系,目前对它的定义基本上都是,通过增强转录因子和顺式作用元件(例如通用转录因子TBP)的结合,从而能够达到增强转录活性的作用。
  核受体转录辅激活因子MBF1是一个在进化上高度保守的序列,其基因序列从古细菌到人都是相当保守的,并且它参与了内皮细胞分化、激素调节、中枢神经系统的发育、脂类代谢和组氨酸新陈代谢等不同生物过程。
  MBF1首次被提纯是从蚕的后部丝腺抽提物中,在不同生物体里的MBF1蛋白通过与GCN4、c-Jun、ATF1或其他核受体相互作用而与通用转录因子TBP连接,最后激活基因的转录。mbf1基因不仅是在进化上高度保守,在功能上也是高度保守的,能参与到多种逆境胁迫反应中,可以通过调节多种信号途径以提高对不良环境的抵抗力。
  本研究以模式生物果蝇为研究材料,采用提取 RNA,反转录,PCR的方法从野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中克隆得到了全基因组的mbf1序列,其大小为4574bp,并将其命名为gmbf1。
  我们构建了表达载体CaSpeR-gmbf1,通过显微注射法,将CaSpeR-gmbf1质粒转入野生型果蝇中,获得了 P[gmbf1]转基因果蝇。通过染色体置换方法,获得了拯救品系P[gmbf1];mbf1-。分别对野生型、突变体、拯救品系和过表达品系的果蝇进行冷胁迫处理,观察其成活率情况,结果表明mbf1基因在冷胁迫中发挥了重要功能。并且在响应冷胁迫过程中,通过荧光定量PCR实验发现mbf1基因的表达量升高。免疫荧光染色实验揭示了转录辅激活因子 MBF1在低温胁迫的过程里能够从细胞质中转移到了细胞核中,进一步说明MBF1能够在这一过程中发挥作用,从而实现调控目标基因活性的目的,增强其抗寒性。
  利用Microarray实验鉴定出相比于野生型果蝇,mbf1突变体果蝇里有哪些基因的表达发生改变,从中选取与代谢相关的几个基因,通过荧光定量 PCR实验鉴定哪些基因与mbf1基因相关,并且参与抗寒性。在mbf1突变体中,Nmdmc和CG5804的表达量降低,CG14893和CG11598的表达量升高。果蝇受到冷处理后,Nmdmc和CG5804的表达量升高,CG14893和CG11598的表达量降低。这些结果表明:MBF1可能通过调节这些与脂代谢相关的基因的表达来参与冷胁迫响应。
[硕士论文] 赵真坚
动物遗传育种与繁殖 四川农业大学 2016(学位年度)
摘要:本研究通过实时荧光定量PCR、基因克隆、双荧光素酶报告实验等方法,研究了prestin基因在各组织中的表达和差异,对该基因不同转录变异体对应的不同启动子转录活性进行了深入分析,并结合生物信息学的方法预测了相关顺式调控元件和调控因子,获得以下结果:
  (1)通过实时荧光定量对prestin基因在大脑、睾丸和耳蜗中总体表达量进行检测,发现prestin除了在耳蜗中特异性高表达外,在小鼠睾丸和大脑中也有表达。随后检测了prestin基因转录变异体1表达量,发现除了耳蜗外,大脑和睾丸中同样存在着不同的转录变异体表达,转录变异体1在耳蜗、大脑和睾丸组织中分别占总表达量的58.08%、43.77%、62.91%。
  (2)通过分析prestin基因已知的3种mRNA序列,针对不同转录变异体设计了特异性片段扩增,定性的研究该基因不同转录变异体的表达,发现耳蜗、大脑、睾丸、GC-1spg细胞中prestin基因均有转录本1的表达,在耳蜗中也扩增出转录变异体2或3。结合5'RACE实验扩增出睾丸中prestin基因mRNA的5'端序列,发现prestin基因在睾丸中表达转录变异体2或3,但没有发现其他未知的转录变异体。
  (3)通过克隆prestin基因5'端DNA序列,构建了启动子1和启动子2缺失片段载体,运用双萤光素酶报告系统,检测启动子区转录活性变化规律,发现启动子1在GC-1spg小鼠精原细胞中转录活性较低,而启动子2的转录活性较高。第一外显子上游-280bp到-765bp以内存在转录激活的转录调控元件,-765bp到-1096bp内存在转录抑制的调控元件,第二外显子上游-952bp内存在转录激活的调控元件,-952bp到-1954bp内存在转录抑制的调控元件。
  (4)结合生物信息学分析预测了上述调控区潜在的大量转录因子结合位点,发现转录调控因子GATA-3,-2,-1潜在的结合位点,结合已有报道,推测其可能在小鼠精原细胞中调控prestin基因的表达。
  本研究分析了prestin基因在耳蜗、睾丸和大脑中的表达,检测了启动子各区域的转录活性,为下一步阐明该基因的特异性表达调控模式奠定了基础。
[硕士论文] 王乐乐
生物学;遗传学 河南师范大学 2016(学位年度)
摘要:发育成熟的个体在受损后可以在原有组织基础上重建已丢失的组织,这种现象称为再生。所有生物体对组织损伤会做出相应的生理反应,同时与疾病的发生又密切相关,因此研究再生的过程和机制具有重要的意义。哺乳类动物再生能力非常有限,而以蝾螈为代表的有尾两栖类和以斑马鱼为代表的硬骨鱼能够在附肢及鱼鳍截断后通过割处再生完成结构和功能的重建。但两栖类繁殖速度慢,实验室不易饲养,且缺乏相应的遗传操作技术,不能成为理想的研究动物。鱼鳍在切断后却能够完整的恢复原有结构,并且相对简单,易获得,损伤后不危害机体生命,更具意义的是硬骨鱼鱼鳍与人类在内的四足动物肢体早期发育极其相似,但二者再生能力却大不相同,因此鱼鳍可以作为解析分子再生机制的良好体系。
  本研究先是从已经建立的抑制性消减杂交文库中筛选得到两个鱼鳍再生差异表达明显很大的ESTs,在这两个ESTs的基础上,采用RACE的方法进行扩增,得到两个cDNA全长序列。通过Blast比对后,其中一个基因认为是Gig2基因,另一个Blast结果并未发现有与高度同源的,认为是一个新基因,将其命名为Frr2基因。随后利用DNAMAN,MEGA6.0,sigmaplot等软件对这两个基因进行生物学分析,还测定了这两个基因在不同组织中的表达。
  Gig2基因是草鱼出血性病毒诱导的基因2,它首先是从紫外失活的GCHV处理的鲫鱼囊胚细胞中鉴定获得的一个新基因。它在鱼类干扰素抗病毒反应中起着重要作用,而在再生中能够调节再生则可能是一个新发现。它cDNA全长是712bp,共编码156个氨基酸,相对分子质量为17.324KDa,等电点(pI)8.69。46个极性氨基酸,71个非极性疏水氨基酸,18个酸性氨基酸,21个碱性氨基酸。蛋白质二级结构发现α-螺旋占23.72%,延伸链占27.56%,β-转角占16.03%,无规卷曲占32.69%。通过半定量以及荧光定量检测发现:在再生后4d表达达到最高水平,在胚胎发育时期的出膜期表达量最高,还发现在精巢组织表达也是最大的。根据Gig2的表达模式我们首次发现了该基因参与到了鱼鳍再生的过程,它可能在鱼鳍结构形成过程中起着调控作用。同源度结果分析发现Gig2基因与其他物种的同源度相对并不是很大,这也使得研究其进化关系引起很大兴趣。
  Frr2(fin regeneration related gene2)基因是一个未知基因,它是一个与鱼鳍再生相关的一个基因。cDNA全长为1036bp,编码了有88个氨基酸,二级结构发现其中α螺旋占46.59%,β-转角占9.09%,无规卷曲占32.95%,延伸链占11.36%。半定量以及荧光定量检测发现在再生不同时期(0dpa,2dpa,3dpa,4dpa,5dpa,6dpa)的第四天表达最高,在不同组织(肝、心、脑、精巢、肾、卵巢)中心脏表达水平较高,胚胎不同发育时期(囊胚期,原肠胚,神经胚,尾芽期,出膜期)原肠胚期的基因表达水平最高。冰冻切片把处于再生不同时期的尾鳍进行原位杂交。原位杂交结果显示:发现在鱼鳍内部成骨细胞中有表达,在4dpa表达信号最强。我们推测Frr2基因可能参与到了成骨细胞的增殖和分化过程中,与鳍条的形成有关。
  这两个基因在尾鳍再生过程中表达量发生变化并在再生后期表达量最高,预测在大鳞副泥鳅尾鳍再生过程中起着一定作用,它们可能调控再生过程中鱼鳍结构的形成,而对于他们更多的功能研究仍需进一步的深入研究。
[硕士论文] 苏洋
法律 重庆大学 2016(学位年度)
摘要:生命权是一个人的最高人格法益,法律赋予人诸多权利,但是人们却无法完全掌握与生死密切相关的生命权,因为人对于个人的出生不能表示拒绝,同样也不能对死亡做出自由选择。但是随着社会文明的进步,对于这一权利,出生不必多说,但是如何死亡、何时死亡的问题人们争论至今,其中最引人关注的也是最具争议的便是“安乐死”。每个人对于生命、死亡有着不同的见解,对于安乐死便也有着不同的观点,即人是否有权放弃自己的生命。国外早已对此问题有着长久的研究,而我国起步相对较晚,还没有形成较为完整的理论体系。但是作为世界上人口大国、最大的发展中国家来说,“安乐死”是个无法回避的问题。因此,每年都有许多相关的新闻报道,而我国学者也对其投入大量的关注。
  本文首先从安乐死的概述入手,对安乐死进行界定,解决其概念问题,只有完整准确地定义了安乐死,才能让大众了解什么是安乐死,也才能结合我国的基本国情对其展开深入的讨论与研究,为我国安乐死合法化奠定理论基础;其次是对安乐死的现状进行详细介绍,在详细分析国内外安乐死现状的基础上了解目前世界上的不同人群、不同团体对于安乐死的基本态度,并总结出我国在安乐死立法上所存在的困境;再次是鉴于国外安乐死合法化的经验探讨目前我国对安乐死立法的必要性和正当性,以满足当前的社会需求,规范混乱的社会实践活动,明晰我国在安乐死合法化的问题上所应当重视的要点;最后提出关于安乐死合法化的立法设想,严格规范实施程序,建立有效的监督机制,为安乐死合法化的法律程序和规定提供合理有效的建议,以严厉打击妄图利用安乐死而实施故意杀人的违法行为。
[硕士论文] 王斯佳
生物化学与分子生物学 东华大学 2016(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度大约为22nt的非编码小RNAs,它能通过靶向结合mRNA3'端非编码区(3'UTR)调控大量生物学过程包括细胞增殖与凋亡、神经元分化、肿瘤产生以及个体发育。本实验室之前的研究通过比较C3H/HeJ和C57BL/6两种近交系雌鼠间阴门开启时间的差异定位到了与性发育相关的基因:miR-505。此外,有研究表明miR-29基因家族成员中的miR-29a在哺乳动物大脑中高度表达,并且随着幼年个体生长发育,其在大脑中的表达量有着明显的波动,表明miR-29a可能在哺乳动物神经系统中发挥重要作用从而调控个体的生长发育。基因敲除技术是目前研究miRNA生物学功能的主要反向遗传学方法之一。而CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)作为一种来源于细菌和古细菌免疫系统的新型基因编辑工具,能够有效地引发靶基因突变进而导致基因功能丧失。
  目的:本研究尝试利用miR-505基因敲除小鼠,研究miR-505敲除对雌鼠性发育和生殖力的影响;利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a进行基因敲除,检测miR-29a基因敲除GT1-7细胞的表型变化,探索miRNAs与性发育之间的联系。
  方法:在动物实验方面,通过sgRNA/Cas9进行胚胎注射获得miR-505基因修饰小鼠,通过与野生型C57BL/6小鼠三代回交得到稳定遗传的基因修饰小鼠。通过进一步自交,获得三种基因型的子代,最后比较不同基因型雌鼠miR-505表达量情况、性发育和生殖力表型。在细胞实验方面,构建C as9基因稳转的G T1-7细胞,并构建sgRNA29a-EGFP质粒转染上述GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后对阳性单克隆细胞分别进行miR-29a表达量检测、表型分析和靶基因预测与验证。
  结果:在动物实验方面,胚胎注射获得了16只miR-505基因工程小鼠,其中有两只基因工程小鼠分别具有17bp和23bp的碱基缺失。荧光定量PCR结果显示,大片段缺失的基因工程小鼠的miR-505表达量有了显著的下降。虽然不同基因型雌鼠间miR-505表达量的显著差异没有引起性发育和生殖能力的统计学显著性变化,但是总体平均值显示雌鼠miR-505表达的缺失具有使阴门开启时间提前和增强部分生殖指标的趋势。在细胞实验方面,成功构建了稳定表达C as9蛋白的GT1-7细胞模型,并利用该细胞模型完成了多种基因编辑。此外,流式富集后的表达绿色荧光蛋白阳性GT1-7细胞,其miR-29a突变率和表达量都发生了明显的变化。通过流式细胞仪获得了一个miR-29 a基因修饰GT1-7单克隆细胞,它在miR-29a基因区段有2 bp的碱基缺失。此外,miR-29a的表达量下降程度较富集细胞更高,而且miR-29a表达量的显著下降导致了GT1-7细胞生长速率的减缓和表型的变化。靶基因验证结果发现,DCX基因受到了miR-29a表达量变化的影响。
  结论:利用CRIPSR-Cas9系统对miRNAs基因进行编辑能够有效降低miRNAs的表达量,即使CRISPR-Cas9系统造成的碱基缺失主要发生在miRNAs的加工区域。而Cas9稳转GT1-7细胞显著提高了基因编辑效率,并有利于后续利用流式细胞仪进行富集细胞。通过构建miR-505基因敲除小鼠模型发现,miR-505敲除对雌鼠性发育和生殖能力没有产生统计学显著的影响,但是总体平均值显示miR-505敲除雌鼠阴门开启的时间和部分生殖指标具有一致性的变化趋势。相比之下,miR-29a在GT1-7细胞中具有比较明显的生物学功能,并且可能通过调控DCX基因来实现。
[硕士论文] 莫依梦
动物学 扬州大学 2014(学位年度)
[硕士论文] 庞达
衰老生物学 杭州师范大学 2015(学位年度)
摘要:本文对FBW7与端粒的互作进行了研究。端粒(Telomeres)是保护染色体末端的DNA-蛋白复合物,它防止了染色体末端的核酸降解和融合,但由于末端复制问题,细胞每分裂一次端粒缩短50-200bp,当缩短到一定长度时,染色体就不再复制,细胞分裂终止继而衰老,所以端粒与人类的衰老有很大的联系。端粒对染色体末端的保护维护了基因组的稳定性,而这种稳定性的维持很大程度上由端粒结合蛋白执行。通过研究发现FBW7与端粒结合蛋白有互作。在此基础上研究FBW7是否对端粒有影响,端粒相关蛋白是否能作为FBW7的底物具有很重要的意义。实验采用了CO-IP,CHIP-Dotblot和Flow-FISH的方法来研究FBW7与端粒相关蛋白是否有结合作用以及对端粒的影响。实验结果显示FBW7与端粒相关蛋白有直接结合作用,并且能够引起端粒DNA的损伤和端粒的缩短。这种结果对端粒以及衰老调控的研究有很重要的意义。
[硕士论文] 李传阳
动物遗传育种与繁殖 上海海洋大学 2015(学位年度)
摘要:为了解不同种类鳜鱼生长差异的生理基础与机制,比较研究了鳜(Siniperca chuatsi)、斑鳜(Siniperca. scherzeri)和杂交鳜(斑鳜♀×鳜♂)幼鱼30d内的生长速率与日摄食量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶原(PGA1、PGA2、PGC)基因相对表达量间关系。结果表明,鳜、杂交鳜和斑鳜体重日增重率分别是(1.171±0.180)g/d,(1.019±0.104)g/d,(0.433±0.078)g/d,生长速率快慢次序是鳜>杂交鳜>斑鳜。鳜、杂交鳜和斑鳜平均日摄食量分别为(6.1±0.31)g/d、(5.26±0.33)g/d、(4.24±0.23)g/d。胃蛋白酶比活力最高部位是胃,实验前期,三种鳜鱼胃蛋白酶比活力差异不显著;后期,鳜、杂交鳜和斑鳜胃蛋白酶比活力分别为(347.8±13.3)U/g、(303.4±12.1)U/g、(272.1±10.9)U/g。胃蛋白酶原基因表达量随生长阶段缓慢增加,PG C:PG A1:PG A2基因相对表达量比例是1.1:1.0:0.7;鳜胃蛋白酶原基因的相对表达量均为最高,杂交鳜相对表达量略高于斑鳜(P<0.05)。结果表明,3种鳜鱼的生长速率快慢与它们的摄食量大小间呈正相关,摄食量大小与其消化能力间也具有相对应的关系。
  利用石蜡切片技术比较了鳜、斑鳜和杂交鳜(斑鳜♀×鳜♂)胃、幽门盲囊、肠道结构特征。三种鳜鱼胃壁均由粘膜层、粘膜下层、肌层组成,粘膜层包括固有层;其中,鳜、杂交鳜胃粘膜层相对厚度约为0.30±0.09和0.30±0.11,斑鳜相对较薄,约为0.21±0.13。肠道由绒毛层、粘膜层、粘膜下层和肌层组成,内壁有褶皱,绒毛层含有杯状细胞;鳜与杂交鳜褶皱数、杯状细胞密度间差异不显著,但明显大于斑鳜(P<0.05)。鳜、斑鳜和杂交鳜幽门盲囊平均数目分别为213.8±17.3,79.3±13.2和109.8±21.8。幽门盲囊结构与肠道相似,三种鳜鱼的褶皱数目差异不显著,但斑鳜杯状细胞密度明显小于鳜和杂交鳜(P<0.05)。同时,利用原位杂交技术比较了三种鳜鱼胃中泌酸胃酶细胞的分布特征,三个胃蛋白酶原(PGA1,A2,C)基因探针均出现紫色杂交信号,且都位于胃粘膜层。同种鱼中,不同基因探针(PGA1,A2,C)杂交信号细胞密度差异不显著(P>0.05);不同种类间,相同基因探针杂交信号细胞密度大小顺序均为:鳜=杂交鳜>斑鳜,且相互间差异显著(P<0.05)。消化道结构与泌酸胃酶细胞分布差异为鳜鱼消化生理学比较研究提供了基础资料。
[硕士论文] Rukhsar Ahmad
普外科 江苏大学 2014(学位年度)
摘要:背景:
  衰老是一个机体逐渐退化的过程,其中一个重要特征就是骨骼肌质量逐渐丢失,肌肉力量逐渐降低。在过去数十年间,人类对于衰老的原因一直在进行不断地探索,早在二十世纪五十年代,Harman就开始寻找引起衰老和死亡的因素,提出了衰老的自由基学说。在之后的几十年中,衰老的自由基理论逐渐延伸为衰老的线粒体学说。线粒体在细胞的能量代谢中起到至关重要的作用,它最重要的功能是通过内膜上数量众多的酶进行氧化磷酸化产生ATP提供能量。肌肉中存在数量众多的线粒体,有研究显示肌肉衰老和线粒体功能下降之间存在密切关系。尽管如此,线粒体电子传递中关键酶和胞质中某些重要酶的数量在衰老肌肉中的变化仍不明确。本实验拟比较年轻人肌肉与老年人肌肉中线粒体电子传递链中的关键酶和胞质中一些重要酶的差异,探寻线粒体相关酶在衰老过程中的意义。
  目的:
  通过比较年轻人与老年人肌肉中某些线粒体酶的表达情况,初步探讨年轻人与老年人肌肉中线粒体电子传递链和胞质中某些关键酶的表达差异及其在衰老中的作用。
  方法:
  (1)肌肉标本的收集
  共收集79例甲状腺瘤切除术患者的颈部肌肉标本。根据世界卫生组织提出的年龄分段,其中年轻患者(<44岁)23例,中老年患者(>45岁)56例。这些标本来自于江苏大学附属人民医院。本研究方案获本院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。
  (2)透射电镜观察线粒体形态
  手术取出的新鲜肌肉立即切成1mm3大小的小块,用5%戊二醛固定,送至南京医科大学分析测试中心用透射电镜观察线粒体形态。
  (3) RQ-PCR
  肌肉切成小块之后加液氮研磨,提取RNA后进行逆转录反应。RQ-PCR检测两组肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC的表达情况。
  (4) Western-blot
  肌肉切成小块之后加液氮研磨,之后加入RIPA裂解。Western-blot检测两组肌肉中NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC的表达情况。
  (5)免疫组织化学染色
  新鲜肌肉用4%福尔马林固定,石蜡包埋,切成4μm切片。切片60℃烘烤30mm,二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,pH6.0柠檬酸盐缓冲液抗原修复。山羊血清封闭,滴加相应的一抗,PBS洗3次之后滴加生物素化二抗。滴加链霉亲和素-生物素-酶复合物试剂,DAB显色(镜下掌握显色程度)。苏木素复染,盐酸酒精分化。梯度酒精脱水,二甲苯透明,封片镜检。用Image J软件对切片进行图像分析,分析结果以平均灰度值作为统计指标。
  结果:
  (1)电镜结果显示与年轻人相比,老年人肌肉中线粒体体积和形态变化较大。
  (2)免疫组化结果显示与年轻肌肉相比NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H在老年人肌肉中明显下降,有显著性差异(P<0.05)。MDH及HADHSC在两组中表达无明显差异。
  (3) western-blot证实了相似的结果。
  结论:
  肌肉组织线粒体形态随年龄老化出现明显改变,NDUFA1、SDHB、Cytb、COX、V-ATPase H、MDH、HADHSC这些线粒体呼吸链及胞质中某些关键酶的变化可能在衰老中起到重要的作用。
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