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[硕士论文] 李鸣
兽医学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:GnIH是日本科研团队在鹌鹑的脑内发现的一种C端具有RF酰胺结构的新型神经肽。后来,在哺乳动物上也发现具有RF酰胺结构的神经肽,这种RF酰胺肽被命名为RF相关肽(RFRP),其中RFRP-3与鸟类的GnIH生理作用一致。目前,在附睾水平研究RFRP-3对雄性动物生殖功能影响的相关研究还很少。本研究通过检测了不同发育阶段大鼠附睾中RFRP-3和GPR147mRNAs的表达情况;然后通过体内实验,检测不同剂量RFRP-3对大鼠附睾形态学、凋亡和自噬相关蛋白表达的影响,探究RFRP-3对大鼠附睾生殖功能的影响。
  本研究可分为三个部分:(1)检测20、40、60、80日龄大鼠的附睾中RFRP-3和GPR147mRNAs表达的变化(分别对应P20、P40、P60和P80)。结果显示,RFRP-3和GPR147mRNAs的表达水平随着大鼠附睾发育呈现波动性变化,在P60处RFRP-3和GPR147mRNAs的表达水平最高,提示RFRP-3及其受体可能参与大鼠附睾的发育并调控其生殖活动。(2)通过体内实验,观察RFRP-3对大鼠附睾组织形态的影响。将大鼠分为对照组和0.1μg,1μg和10μg/天不同剂量组,每组6只。连续7天对大鼠睾丸内注射RFRP-3后,摘除一侧的附睾制作石蜡切片、HE染色,在显微镜下进行观察。结果显示,RFRP-3能呈剂量依赖性的导致附睾上皮细胞发生异常,并使附睾内精子数量显著降低,提示RFRP-3诱导附睾呈现功能性衰退。(3)通过对大鼠附睾中凋亡、自噬的水平进行检测,研究RFRP-3引起大鼠附睾功能性衰退的机制。一方面,我们检测到RFRP-3可以诱导附睾组织中Caspase-3的活性增加。另一方面,通过Western blot检测发现不同剂量的RFRP-3引起附睾中凋亡、自噬标志蛋白质的表达出现相互矛盾的结果,这提示细胞凋亡和自噬之间有着复杂的相互作用。
  综上所述,RFRP-3对雄性大鼠附睾的生殖功能起着重要的调控作用,可能是因为RFRP-3介导了附睾的细胞凋亡和自噬。
[硕士论文] 周利娟
细胞生物学 安徽师范大学 2018(学位年度)
摘要:组织器官的内稳态是生物机体正常运行的基本保障,成体干细胞(adult stem cells,ASCs)是一类具有自我更新和潜在分化能力的细胞,自我更新与分化之间的动态平衡直接影响有机体内稳态的维持。研究表明,来自干细胞的内源因子以及干细胞周围的微环境分泌的外源因子都可以调节这种平衡。生殖干细胞(Germline Stem Cells,GSCs)是ASCs的一种类型,它在生殖细胞发生及种族绵延等生命过程中承担重要功能。果蝇(Drosophila melanogaster)作为一种重要的模式生物,其卵巢为生殖干细胞调控机制的研究提供了优秀的模型。周期蛋白(cyclin)作为调节因子,可以激活周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的活性,从而调节细胞周期的进程。研究显示,cycB3(cyclin B3)基因对雌性果蝇的育性是必需的,而且能够影响胚胎期细胞有丝分裂的进程等。我们的早期研究发现,与野生型果蝇(Oregon)相比,cycB3基因突变的果蝇卵巢GSC的数量有减少的趋势。由此,我们设计实验,借助免疫组织化学、转基因显微注射及有丝分裂重组等技术,研究了cycB3基因调控果蝇卵巢GSC的命运暨影响包囊母细胞(cystoblast,CB)的分化的初步机制,本研究成果将对干细胞和生殖生物学的调控领域作出贡献。
  首先,本研究通过免疫组化特异性标记GSCs,统计并分析了五组cycB3突变类型(cycB32/cycB32、cycB32/cycB3L6540、ycB32/cycB3EY08012、ycB3L6540/cycB3EY08012、cycB32/Df)羽化后不同天数每个原卵区内GSC的数量。结果显示:野生型果蝇原卵区通常包含2-3个GSC,并且随时间推移无明显变化。而五组cycB3基因突变果蝇正常原卵区的比例从1天的89.1%、86.6%、94.3%、80.8%和85.0%降到14天的22.6%、28.2%、27.6%、18.4%和20.4%。其中,cycB32/cycB32组的表型变化最明显,约74.6%的原卵区发生GSC数量减少现象,表明cycB3基因突变严重影响了GSCs的维持。
  然后,选取其中三组和Oregon进行rnRNA相对量检测,QPCR(Realtime Quantitative PCR)的分析结果显示:和对照组相比,突变体组cycB3基因的转录水平极显著下降。此结果表明cycB3基因突变导致了cycB3基因的转录严重不足。通过GFP报告系统,对CycB3-GFP融合蛋白的定位分析表明:cycB3仅在生殖系细胞核中表达,暗示了cycB3基因发挥着内源性的调控GSC维持的功能。基于此,我们利用镶嵌体分析技术标记cycB3基因突变的GSC,确证cycB3基因内源性调控GSC命运。结果显示,与对照组相比,实验组的标记GSC随时间的推移逐渐丢失,充分支持cycB3基因是GSC命运调控的内源性因子这一推论。
  为进一步确证cycB3基因的功能,我们利用转基因手段在cycB3突变的背景下补充cycB3基因,进行了一系列的挽救试验。本试验选择羽化后第14天果蝇的正常原卵区作为统计分析的对象。结果显示,广谱挽救组cycB3P-cycB3和两组内源挽救组(nosP-cycB3;cycB32/cycB32和UASp-cycB3/nosP-gvp;cycB32/cycB32)的比例分别恢复至正常水平,表明仅内源补充cycB3即可挽救突变表型。而外源性挽救组(C587-gal4;UASp-cycB3;cycB32/cycB32)果蝇的正常原卵区比例与突变体无明显差异,表明挽救失败。综合上述结果,充分表明cycB3内源性的发挥着调控GSC命运的功能。
  cycB3缺失导致GSC数量减少,为探讨GSC的去向问题。首先,我们采用TUNEL技术检测了cycB3突变GSC的凋亡情况。结果显示,突变GSC未出现明显的凋亡(与对照组相比),表明cycB3突变没有导致GSC凋亡。其次,分析并统计了GSC中细胞器——“spectrosome”的形态学,对cycB3是否影响GSC有丝分裂的各时相进行了研究。结果显示,突变体和野生型果蝇之间无明显分裂时相上的差异,表明cycB3突变没有影响GSC有丝分裂的进程。然后,运用EdU细胞增殖(脱氧尿嘧啶标记DNA)法检测基因突变对细胞增殖活性的影响。结果表明:GSC增殖并不受cycB3基因突变的影响。总之,上述结果显示cycB3突变不影响GSC的分裂和增殖,也没有促使GSC走向凋亡,而是促使GSC提前发生了分化。
  为了揭示cycB3与BMP信号通路的关系,研究了cycB3与该信号通路的重要组分bam的上下位关系。首先,利用bam-GFP报告基因系统结合免疫荧光染色技术检测了cycB3突变背景下bam基因的表达模式。结果显示:实验组(cycB32/cycB32;bam-GFP)中bam的表达模式与对照组(bam-GFP)无明显差异,该结果表明cycB3基因不是位于bam的上游发挥作用。其次,分析比较了bam突变和cycB3&bam双突变条件下GSC/CB的数量变化。结果发现:bam单突变和cycB3&bam双突变果蝇羽化后第10天的卵巢原卵区中均充满生殖干细胞样细胞(GSC-like cells),无明显差异,表明bam缺失抑制了cycB3突变导致的GSC丢失表型。综合上述结果,我们提出假说,cycB3可能通过依赖于bam的方式调控GSC的维持。
  此外,我们还研究了cycB3与GSC内源性调控因子Dad的遗传互作关系。Dad基因属于BMP下游的靶基因,其表达受控于BMP信号;同时,Dad蛋白又能反作用于BMP受体,降低BMP信号的效应。利用Dad-GFP报告基因系统结合免疫组化技术检测了cycB3突变背景下Dad基因的表达模式。结果显示:实验组(cycB32/cycB32;Dad-GFP)中Dad的表达模式与对照组(Dad-GFP)无明显差异,该结果表明cycB3基因不参与Dad介导的BMP信号通路。
  前面工作表明cycB3缺失导致了GSC数量减少,那么cycB3缺失是否影响包囊母细胞(CB)向卵母细胞的分化呢?研究表明卵母细胞中Orb基因的表达情况可以作为卵母细胞正常分化的标志。鉴于此背景,本课题利用Orb抗体检测了卵母细胞内Orb蛋白的表达。结果显示:与对照组相比,cycB3突变的卵母细胞中Orb表达无明显下调,表明CB到卵母细胞的过渡不受cycB3基因突变的影响。
  既然cycB3缺失导致了GSC提前分化,那么,过表达cycB3基因是否会促进GSC的增殖和抑制CB的分化?结合卵巢中bam的表达模式,我们分别统计了卵巢原卵区中GSC和CB两类细胞的数量。结果表明过表达cycB3没有促进卵巢GSC的增殖,但明显延滞了CB的分化。
  综合上述研究结果,cycB3基因内源性调节果蝇卵巢生殖干细胞的命运,cycB3基因突变导致GSC的自我更新和分化失衡,促使GSC提前走向分化。此外,cycB3依赖“BMP/Dpp-bam”信号通路发挥功能,在GSC中,cycB3基因不参与bam基因的沉默,通过抑制GSC的分化使其维持干性;在CB中,cycB3基因位于bam的上游,通过抑制Bam蛋白的活性而抑制CB的分化。
[硕士论文] 谈烨明
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:m6A(N6-methyladenosine)是真核生物messager RNA(mRNA)和long non-coding RNA(lncRNA)最为普遍的修饰。早在上个世纪七十年代,m6A修饰就已经被发现。而它的生物学意义并不清楚。过去曾一度认为m6A修饰是不可被逆转的,以致没有得到足够的重视。随着去甲基转移酶FTO(fat mass and obesity-associated protein)的发现,以及高通量测序等先进的技术的应用后,又掀起了m6A的研究热。近些年来,对m6A的生理功能方面取得了重要的研究成果,然而,m6A表观修饰如何影响生物个体的生殖细胞分化过程并不清楚。本研究利用经典模式生物果蝇作为模型,深入探索m6A调控果蝇早期生殖细胞分化的机制,揭示其分子基础,对于整个表观遗传研究领域和不孕不育等相关疾病发病机的理论研究具有重大意义。
  我们利用Me-RIP技术对果蝇卵巢细胞中的m6A进行了测序分析,得到了与生殖发育密切相关的mRNA上的m6A信息。总共检测到了4442个m6A peak位点。m6A peak在5’UTR和3’UTR均有富集。与已报道的体外细胞中m6A的分布相比,果蝇生殖细胞中的m6A在5’UTR的富集程度更高。这提示,果蝇卵巢细胞中的mRNA上的m6A修饰可能参与转录和翻译调节。聚类分析则显示,mRNA上的m6A在卵子发生、卵巢滤泡细胞发育等生殖过程中显著富集。
  对测序数据进一步分析发现,vasa、sxl(sex leathal)、orb(oo18 RNA-binding protein)、nanos、oskar、pumilio等与早期生殖发育密切相关的基因mRNA上均有m6A修饰。其中sxl的m6A修饰已有报道,也佐证了此次m6A测序的可靠性。通过MeRIP-qPCR,我们先确定了卵巢中vasa、sxl、orb、bam四个基因的mRNA存在m6A修饰,其中orb的m6A富集比例较高,可能有较高的m6A修饰比例。
  应用CRISPR/Cas9系统构建的m6A甲基转移酶复合物组分ime4、dMETTL14突变体果蝇。其中,得到了ime4插入突变体,dMETTL14缺失突变体。二者发生的突变均发生在第二个外显子中。ime4和dMETTL14两种基因的纯合突变体果蝇羽化后存活时间较短,无法建立稳定系产生后代。育性统计发现,ime4突变体果蝇生育能力减弱。16.67%的 ime-/-突变雌性果蝇无法产生后代,dMETTL14突变体果蝇也有类似情况。免疫荧光观察发现,ime-/-突变体果蝇卵巢germarium形态异常,spectrosome数量增多,CB等早期生殖细胞分化异常,滤泡细胞不能正常包裹Cyst。但未观察到dMETTL14-/-突变体果蝇有相应的表型。
  荧光定量PCR显示,在ime-/-纯合突变果蝇中,vasa和bam的mRNA水平降低,sxl的变化不大,而orb的mRNA提高了30%。以此为基础,进一步分析并确认突变体表型发现,与杂合突变体相比,纯合突变体中Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。
  故我们得到以下结论:
  (1)通过果蝇卵巢m6A甲基化修饰Me-RIP测序,筛选到了orb等与早期生殖细胞分化密切相关的基因mRNA上的m6A位点;
  (2)m6A甲基转移酶纯合突变体果蝇育性下降;
  (3)甲基转移酶纯合突变体果蝇卵巢早期生殖细胞分化出现异常;
  (4)纯合突变体果蝇中orb mRNA表达量升高,与之相对应的,Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。总之,本实验表明了,mRNA m6A修饰与果蝇早期生殖细胞的分化密切相关。这将有助于我们揭示mRNA上的m6A的在体生物学功能,亦可为生殖相关疾病的诊断和治疗提供线索。
[硕士论文] 何六一
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是生殖系细胞最早在个体体内出现的,具有精子或卵子发生两个方向的分化潜能。小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)在体外,经上胚层样细胞(epiblast like cells,EpiLCs)阶段,分化成小鼠原始生殖细胞样细胞(mouse PGC-like cells,mPGCLCs),利用唯支持细胞综合征的新生小鼠睾丸细胞与分化得到的mPGCLCs混合培养,在视黄酸、睾酮促性腺激素及垂体提取物等的刺激下,完成减数分裂得到球形精子。虽然可以通过体外分化得到球形精子,但目前的小鼠生殖细胞体外分化系统分化效率低,不能解决目标细胞的大规模获得问题。
  三维细胞培养技术因其在细胞培养过程中更类似体内微环境,能够增大目标细胞的获得量和获得效率,是近年来细胞培养研究的趋势。在哺乳动物生殖细胞分化的过程中尚无关于三维细胞培养技术的相关报道。本实验主要在传统分化体系基础上,在培养基中添加甲基纤维素(methylcellulose,MC),因其粘稠特性减慢了细胞球沉降速率,而形成简单的三维细胞培养状态,并在此基础上优化了分化实验过程,为实现mPGCLCs的大量获得做了初步探索,为进而建立一个体外三维细胞分化体系奠定了重要基础。
  本课题选用共表达BPT(同时有Blimp1、Prdm14和Tfap2c三个转录因子)的转基因mESCs进行体外分化,在EpiLCs和mPGCLCs诱导分化阶段的培养阶段加入0.3%的MC进行三维培养,并优化了EpiLCs阶段的分化培养基。EpiLCs阶段的免疫荧光染色结果显示Oct4的表达符合这一阶段的特征,之后对比传统培养方法,流式细胞荧光分选技术(fluoresvemce activated cell sorting,FACS)分析结果显示改良后的mPGCLCs分化效率未有提高。更进一步的Real-time PCR对day4的mPGCLCs的关键基因表达谱分析,多能性基因和PGCs阶段基因的表达mPGCLCs状态正常,分化效率未有提高,但是水平与传统培养体系的结果相吻合。上述结果说明优化实验流程后得到的统计发现,相同量培养基的条件下mPGCLCs的获得率有4倍左右提高。虽然本项目没有做进一步的功能实验,但是实验结果对体外三维分化体系得到大量目的细胞,提供了最初的方法和技术支持。
[博士论文] 黄鑫
生物学;生物化学与分子生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:乳是雌性哺乳动物哺育其初生幼仔生长和发育的天然营养品,同时也是人类生存必不可少的重要食品。乳合成的调控机理是生命科学的重要基础问题之一。探究乳合成相关信号转导途径,寻找调控乳合成的关键信号分子将会为奶牛乳产量和乳品质的提高提供重要的实验依据。营养素和激素通过调控基因的表达,在乳合成方面发挥重要的调节作用,特别是氨基酸在调控乳蛋白合成方面已成为近年来的研究热点。目前,氨基酸和激素调控乳合成方面的研究已经取得一定的成果,但对其调控乳合成分子机制的研究还不够深入。因此,进一步探究乳合成的分子调控机制,完善其分子调控网络是泌乳生物学领域的重要研究内容。
  核因子κB(NFκB)作为真核细胞中重要的转录因子,广泛参与多种基因的表达调控,在细胞增殖与分化、细胞凋亡、免疫应答和炎症反应等方面发挥重要作用,但在泌乳生物学领域的相关研究鲜有报道。本课题以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为研究基础,通过系统全面的研究,揭示了NFκB1通过PI3K信号途径接受外源信号氨基酸(蛋氨酸)和激素(雌激素),正向调节下游靶基因mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1的表达。此外,本研究进一步揭示甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)能够介导蛋氨酸(Met)和雌激素(E)信号,促进NFκB1磷酸化进而调控BMECs的乳合成和细胞增殖。本研究进一步丰富和完善了乳合成的分子调控网络,为营养素和激素调控乳合成的作用机理提供重要的实验依据。
  本研究使用的BMECs由组织块培养法分离和纯化获得。用免疫荧光染色法检测BMECs中角蛋白18(Cytokeratin18)和β-酪蛋白(β-casein)的表达以鉴定细胞纯度及泌乳能力。在培养液中添加Met(0.6 mmol/L)或E(2.72×10-2μg/L),qRT-PCR和Western blot结果显示,NFκB1的表达量显著上升,p-NFκB1水平显著提高。免疫荧光结果显示,Met和E还能够促进NFκB1入核及磷酸化。研究结果表明,NFκB1可能是介导Met和E促进BMECs乳合成的重要调节因子。
  对NFκB1基因进行过表达和干扰。qRT-PCR和Western blot结果表明,NFκB1能够正向调控与乳合成和细胞增殖相关的重要信号分子mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的表达,以及提高β-casein和β4Gal-T2的表达水平。进一步研究结果显示,NFκB1基因过表达能够显著促进BMECs甘油三酯和乳糖的合成与分泌以及细胞增殖;而NFκB1基因干扰后,细胞合成与分泌甘油三酯和乳糖的水平及细胞增殖能力显著降低。此外,对NFκB1基因过表达和干扰后BMECs中合成的脂滴进行BODIPY染色,实验结果显示,NFκB1能够促进细胞内脂滴的合成,与上述结果一致。以上研究结果表明,NFκB1能够正向调控BMECs的乳合成及细胞增殖。
  采用生物信息学手段,对mTOR、SREBP-1c、β4Gal-T2、Cyclin D1转录起始位点上游2000 bp的启动子区域进行分析,发现这些基因的启动子区域均可能含有NFκB1结合位点(κB序列)。染色质免疫共沉淀(ChIP)结果证实NFκB1与这些基因的启动子存在结合。ChIP-qPCR结果显示,添加Met和E后,NFκB1与靶基因启动子的结合显著升高。以上研究结果表明,Met和E能够激活NFκB1并通过提高其与靶基因启动子的结合,在转录水平上调控乳合成和细胞增殖相关基因的表达。
  为了探究NFκB1接受Met和E信号的分子机制,实验进一步检测了在添加PI3K抑制剂(wortmannin)和mTOR抑制剂(rapamycin)分别抑制PI3K和mTOR信号途径后,NFκ1的表达与激活情况。结果显示,抑制PI3K途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平显著下降,而抑制mTOR途径后NFκB1和p-NFκB1的蛋白水平无显著变化。进一步研究发现,在添加Met或E同时抑制PI3K途径后,Met和E对NFκB1表达的促进作用被明显削弱。研究结果表明,Met和E通过PI3K途径激活NFκB1。
  此外,对GlyRS介导Met和E信号促进NFκB1磷酸化的分子机制进行了研究。观察过表达GlyRS及同时利用siRNA干扰NFκB1后,对下游靶基因mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1表达的影响;以及观察添加Met或E同时利用siRNA干扰GlyRS后,对NFκB1磷酸化的影响。研究结果表明,GlyRS介导了Met和E促进NFκB1磷酸化的作用,以及GlyRS主要通过NFκB1调节mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1信号通路。进一步观察利用siRNA干扰GlyRS同时干扰GCN2对NFκB1基因表达和磷酸化的影响。研究结果表明,GlyRS促进NFκB1磷酸化的作用与GCN2途径及NFκB1基因表达无关。本实验室其它研究工作表明GlyRS直接结合和促进NFκB1磷酸化,与本研究结果一致。
  综上所述,NFκB1作为重要的转录因子能够正向调控BMECs的乳合成和细胞增殖。Met和E通过PI3K途径和GlyRS激活NFκ B1。p-NFκB1通过与靶基因mTOR、SREBP-1 c、β4Gal-T2和Cyclin D1启动子的结合,在转录水平上调控这些靶基因的表达。
[硕士论文] 杨洋
生态学 南昌大学 2017(学位年度)
摘要:为研究镉对SD大鼠性腺Bcl-2和Caspase-9基因甲基化水平的影响,将104只健康清洁级SD雄性大鼠随机分为A、B、C、D组,每组26只,对照组每天腹腔注射生理盐水,试验组每天分别用含0、0.3、0.6和1.2mg/kg剂量的CdCl2溶液腹腔注射大鼠,期间观察、记录大鼠活动情况及体重变化,喂养28天后,取性腺、肝脏、肌肉、肾脏组织,测定组织中镉含量、SOD、CAT、GPX酶活性及MDA含量等相关指标,取性腺、肝脏组织行病理切片,HE染色。提取性腺、肝脏、肌肉、肾脏组织RNA,采用实时荧光定量RT-PCR法检测bcl-2、caspase-9、Caspase-3、BAX、AIF和CYCS基因在大鼠各组织中mRNA的表达量变化。提取性腺组织DNA,采用MSP法检测检测模型组大鼠性腺组织中Bcl-2和Caspase-9基因甲基化变化。采用MassArray甲基化检测Bcl-2和Caspase-9基因CPG岛甲基化程度。用单因素方差分析及卡方检验对统计数据进行分析。
  1.试验组大鼠的体重增长速度慢于对照组,具有显著性差异(P<0.05)。
  2.试验组大鼠性腺和肝脏组织富积镉的量均显著高于对照组,具有显著性差异(P<0.05)。
  3.随着镉剂量的增大,与对照组相比,实验组大鼠各组织中MDA含量升高,GPX、SOD、CAT活性都有不同程度的先上升后下降的趋势,试验组与对照组差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)
  4.病理组织切片结果显示,试验组大鼠肝脏和性腺组织均出现不同程度的损伤。
  5.bcl-2基因甲基化水平受镉浓度的影响而明显增高,实时荧光定量表达量显著降低。而caspase-9基因甲基化水平受镉浓度影响不大,但比对照组有所升高,同时实时荧光定量表达量随着镉浓度升高显著增高。
[硕士论文] 杨猛
动物生物化学与分子遗传学 河南科技学院 2017(学位年度)
摘要:FOXL2基因是在脊椎动物中最先发现的与卵巢分化有关的的性别二态性标记,同时也是人类常染色体基因中第一个被认定在促进人的眼睑的早期发育、卵巢发育和维持卵巢功能方面具有重要作用的因子。随着人们对于相关研究的不断加深,发现在人的眼睑、胚胎及成体卵巢颗粒细胞中FOXL2基因均呈现出特异性的表达,与人的卵巢早衰、卵巢肿瘤、不孕不育、性别决定以及小眼睑裂综合征等病症有关。FOXL2基因在抑制卵泡凋亡和促进卵巢储备功能方面发挥着重要作用,其正常表达对鸡产蛋性能高低和卵巢发育程度很重要。但FOXL2基因在不同时期的产蛋鸡体内各组织器官中的表达情况以及与蛋鸡卵巢发育不同时期的相关性仍未见报道。
  本研究首先通过HE染色法观察不同时期海兰褐蛋鸡卵巢的发育情况和组织学结构,并通过进行卵泡数量的统计学分析,研究蛋鸡卵巢卵泡的具体发育状况。根据GenBank上收录的红原鸡的FOXL2基因序列(登录号:JF_708868),通过生物信息学分析其保守序列及酶切位点,利用 Primmer_5.0设计并合成3对引物。通过琼脂糖凝胶电泳试验,筛选出最优引物。采集30日龄,60日龄,90日龄,120日龄、160日龄、220日龄、330日龄、480日龄共8个时期的蛋鸡的下丘脑、眼睑、肌肉、心脏、胸腺、肝脏、脾脏、肾脏组织样品,进行qR T-PCR试验。对比不同时期卵巢中FOXL2基因相对表达量的差异,分析FOXL2基因与鸡卵巢发育及其与产蛋性能的相关性;对比FOXL2基因在不同时期和不同组织中相对表达量的变化,分析FOXL2基因与蛋鸡机体发育的相关性。HE染色和统计学分析结果表明,220日龄卵巢的体积和重量最大,之后卵巢逐渐萎缩,重量减少;随日龄增加,总卵泡数逐渐减少,初级卵泡数呈现先增加后减少趋势,60日龄的初级卵泡数最高,然后逐渐减少;120日龄的次级卵泡数最高,并且明显高于其他日龄产蛋鸡;从30日龄开始,随日龄增加,卵泡闭锁率逐渐增多。qRT-PCR试验结果表明,120日龄鸡卵巢中FOXL2基因的相对表达量高于其他日龄。FOXL2的表达与蛋鸡卵巢发育存在相关性,产蛋鸡不同组织中FOXL2基因相对表达量伴随着产蛋鸡组织器官的发育而变化,说明FOXL2基因与产蛋鸡其他组织的发育也存在一定的关系。本研究有助于进一步认识FOXL2基因在调控蛋鸡卵巢发育和产蛋性能方面的作用,为深入研究该基因的生物学特性和功能奠定了基础。
[硕士论文] 邹乾兴
神经生物学 南昌大学 2017(学位年度)
摘要:人成熟精子进入女性生殖道后,需经历一系列生理生化变化过程包括获能、超活化运动和顶体反应等,最终才能与卵细胞完成受精。精子这些生理过程受到女性生殖道内多种生理因子的调控。其中,胞外ATP(ATPe)作为一种重要的生理调节因子被报道存在于女性生殖道中,并且体外研究表明其对人成熟精子超活化运动、顶体反应和受精能力均具有显著促进作用。然而,ATPe作用人成熟精子生理功能的具体机制目前尚未阐明。
  基于胞内Ca2+信号在成熟精子功能调控中的核心作用,因此我们首先利用多功能酶标仪检测ATPe对人精子胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响。结果显示ATPe(0.05,0.1,0.2,0.5,1,2.5,5mM)浓度依赖的增加[Ca2+]i,并且在2.5mM时达到饱和。通过利用BAPTA将精子胞外溶液中Ca2+螯合之后,发现ATPe不再引起精子[Ca2+]i增加,表明ATPe增加的[Ca2+]i来自于外Ca2+内流。
  ATPe的效应主要由细胞膜上的P2受体介导。我们选择两种广谱的P2受体抑制剂PPADs和suramin,发现它们能显著抑制ATPe诱导的人精子[Ca2+]i增加。为验证具体是哪种P2受体介导ATPe对人精子的效应,western-blot揭示多种P2受体包括P2X(2,3,4,7)和P2Y(1,2)在人成熟精子中有表达。由于小鼠精子中的ATPe效应被认为是由P2X2受体通道介导,但我们利用膜片钳技术在人精子中并未检测到ATPe激活的P2X2电流。另外,抗体阻断实验结果显示在P2X(2,3,4,7)和P2Y(1,2)这些抗体中,只有P2Y1抗体显著抑制ATPe增加的[Ca2+]i,表明ATPe对人精子的效应通过作用于P2Y1受体。
  由于P2Y1是一种G蛋白偶联受体,而ATPe诱导的人精子[Ca2+]i来自于外Ca2+内流,因此我们猜想受ATPe激活后的P2Y1可能作用于细胞膜上的Ca2+通道。精子特异的CatSper通道,因其在调控胞内Ca2+信号以及精子功能中的重要作用,而成为最可能的候选Ca2+通道。确实,我们发现ATPe能增加CatSper电流,并且CatSper抑制剂mibefradil和AR720均显著抑制ATPe增加的[Ca2+]i和CatSper电流,说明CatSper介导了ATPe诱导的人精子外Ca2+内流。此外,ATPe增加的CatSper电流能被P2Y1抗体抑制;并且P2Y1和CatSper在人精子中有相似的定位,均定位在精子尾部;以及在精子胞内增加GTP浓度可以加强ATPe对CatSper电流的增加效应;表明ATPe激活CatSper是一种由P2Y1受体介导的间接作用。
  我们进一步分析了P2Y1与人精子运动的关系,结果发现P2Y1蛋白的表达水平在正常人精子中显著高于弱精症患者精子中。另外,正常人精子[Ca2+]i对ATPe的响应也显著高于弱精症患者精子[Ca2+]i对ATPe的响应。人精子中P2Y1蛋白表达和ATPe诱导[Ca2+]i与人精子运动相关的一致性,表明P2Y1的表达和功能与人精子运动呈正相关。
  综上所述,ATPe通过作用于人精子质膜上P2Y1受体,继而激活CatSper通道,引起Ca2+内流,导致胞内[Ca2+]i增加。本研究一定程度的阐明了ATPe作用人成熟精子的分子机制;首次揭示了P2Y1受体在人成熟精子中的功能;并且在人精子CatSper通道的激活机制中提出了一种新的作用方式。
[博士论文] 殷实
遗传学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:卵泡发育的正常进行对于雌性生育能力的维持十分重要。卵泡发育是一个复杂的生物学过程,其间涉及到细胞的生长、增殖及分化等方面,需要基因的精确调控。组蛋白乙酰化是一种重要的基因调控方式,乙酰化转移酶和去乙酰化酶能够通过改变组蛋白与DNA的结合能力改变染色质的状态,进而对基因的转录进行调控。
  赖氨酸(K)乙酰化转移酶KAT8,作为果蝇中X染色体剂量补偿系统中的重要组成部分,负责组蛋白H4第十六位赖氨酸大部分的乙酰化。我们发现Kat8在小鼠卵母细胞及颗粒细胞中均有所表达,并且高表达于生发泡期卵母细胞胞核。接下来我们进一步利用条件性敲除小鼠模型研究了Kat8在小鼠卵泡发育过程中的功能,结果表明卵母细胞特异敲除Kat8后小鼠不育,次级及腔前卵泡的发育受阻,闭锁卵泡数目增多,大量卵母细胞出现严重的DNA损伤和凋亡,而颗粒细胞的增殖并未受到明显影响。Kat8敲除的卵母细胞组蛋白H4第十六位赖氨酸乙酰化的水平显著下调,细胞内异染色质的形态明显异常,卵母细胞中抗氧化基因Prdx1、Prdx、Gpx1及Gpx4的表达显著下调,活性氧水平明显升高。向敲除小鼠注射抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可以促进敲除鼠的卵子发生和卵泡发育,同时降低卵母细胞活性氧、DNA损伤及凋亡水平。KAT8可以直接结合在抗氧化基因的启动子区域,调控这些基因表达。而颗粒细胞敲除Kat8对小鼠的生育力及卵泡发育并无明显影响。
  综上所述,我们的研究结果表明卵母细胞内KAT8通过调控细胞内抗氧化基因的表达降低了卵母细胞的活性氧水平,进而减少了卵母细胞的凋亡,提高了卵泡的存活能力,维持了雌性的正常生育力。KAT8是迄今为止首个报道的在小鼠卵泡发育过程中所必需的乙酰化转移酶,同时本研究为卵泡发育障碍引起的不孕症的诊断、治疗提供了重要的科学依据。
[硕士论文] 袁诗宇
药理学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的 CLOCK基因对生物节律的调控和生殖功能方面起着非常重要的作用。然而,Clock在斑马鱼生物钟及生殖中的作用尚未被探索。
  在本文中我们发现clock1a敲除的斑马鱼性成熟较野生型斑马鱼晚,并且产卵量也远小于野生型。在实验室条件下,野生型斑马鱼通常以7天周期产卵;而clock1a突变体则不能以7天为周期产卵。当我们延缓这个7天的周期到10天时,我们发现突变体的产卵量有所增高,而且与野生型的产卵量相近。通过石蜡切片和 H&E染色观察卵巢形态,我们也发现了在斑马鱼交配后,clock1a突变体卵巢中不成熟的卵细胞很多,直到10天后其成熟卵细胞才大量出现。为了寻找生物钟的调控机制,我们在先前我们进行的转录组分析结果中发现在细胞分裂中起作用的激酶plk1在clock1a突变体中是下调的。我们假设生物钟通过减数分裂的过程某一环节在生殖中起到关键性的作用。我们发现plk1是由生物钟通过E’-box介导调控。Rec8蛋白也是减数分裂中的关键性蛋白,它决定着减数分裂过程的结束并且可被Plk1磷酸化并降解。Clock1a的缺失导致plk1下调,进而造成Rec8不能降解而使得减数分裂不能正常进行。其次,往野生型雌性斑马鱼腹腔注射Plk1的抑制剂 BI2536也能导致卵巢中Rec8的积累和产卵量的下调。综上所述,这些结果表明了,在斑马鱼中Clock1a对生殖功能方面起着非常重要的作用, Clock1a是通过调控 plk1介导的对减数分裂关键性蛋白 Rec8磷酸化降解作用来延缓其产卵周期的。
[硕士论文] 陈龙
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:排卵是雌性哺乳动物中非常重要的生理活动,而这一过程受到许多因素的协同调控,其中,由于激素调节广泛性和容易引起级联反应的特点被认为是排卵期主要的调控因素之一。排卵的正常发生除了要受到促卵泡激素,黄体化激素的调节,还会受到雌激素和孕酮的调节。哺乳动物体内雌激素和孕酮发挥生理作用几乎都要与其特异性受体结合才能实现。在对孕酮受体敲除型小鼠的各项研究中发现,当孕酮受体表达异常时,可直接影响雌性哺乳动物的诸多生殖功能的正常进行,特别是在排卵这一生理过程中,孕酮受体的正常表达变得十分重要。近年来,通过RNA-Seq和CHIP-Seq实验已经筛选出了大量孕酮受体的下游基因,其中,过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1被认为是孕酮受体在卵巢中介导排卵过程的关键信号分子。此外,排卵过程中,雌激素和孕酮的血液内含量呈现一定的相关性,是否彼此调控对方的分泌尚未清楚。同时,雌激素能够影响细胞内孕酮受体的表达已得到证实,但具体的分子机制还有待研究。
  随着雌性生殖研究的深入,大量研究结果发现,雌激素含量变化会导致部分miRNA出现差异性表达。此外,也有实验证实 miRNA是调控孕酮受体表达的诸多要素之一。miR-26a/b是一类常见的哺乳动物miRNA,测序数据显示在卵泡发育期间的颗粒细胞中,miR-26a/b维持高水平表达且在卵泡发育不同时期存在表达差异,这一现象说明miR-26a/b可能作为一种重要的调节因子参与排卵过程。本实验拟探究在排卵过程的正常进行,是否要依赖于颗粒细胞中miR-26a/b介导雌激素对孕酮受体的调控作用。研究结果显示,在小鼠原代颗粒细胞中,经雌激素处理24h后,通过RT-PCR检测pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,通过RT-PCR和Western Blot检测发现孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调。通过生物信息学分析miRNA调控孕酮受体3’-UTR序列的靶位点序列,构建双荧光报告载体以及位点突变载体。荧光数据显示,miR-26a/b可特异性结合到孕酮受体3’-UTR序列,并引起蛋白水平的下调。为了进一步证实miR-26a/b可介导雌激素对孕酮受体表达的调控,实验选取了人颗粒细胞系(KGN)作为实验对象。KGN细胞在经雌激素处理24h之后,细胞内pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著下调(p≤0.05),此外,孕酮受体及其下游基因过氧化物酶体增生激活受体γ和基质金属蛋白酶1的mRNA和蛋白表达均发生显著上调,结果与小鼠原代颗粒细胞处理组一致。通过采用雌激素受体拮抗剂,它莫西芬和雌激素受体干扰RNA,shER阻断雌激素信号通路,结果显示,细胞内pri-miR-26a/b, pre-miR-26a/b, miR-26a/b的表达量都显著上调(p≤0.05),同时孕酮受体及下游基因在mRNA和蛋白水平显著下调。为了进一步证实miR-26a/b对于下游基因的调控,实验中采用miR-26a/b minics和miR-26a/b inhibitors分别处理KGN细胞,结果显示,miRNA minics处理后,孕酮受体及下游基因的表达受到阻遏;当用miRNA inhibitors处理细胞后,孕酮受体及下游基因的表达发生显著性上调趋势。为更加精确模拟miRNA在细胞内的成熟过程,实验通过构建pre-miR-26a/b表达载体以实现miRNA在细胞中长期稳定表达。瞬时转染miRNA表达载体,可抑制雌激素对孕酮受体的调控。
  综上,研究结果显示,在雌性哺乳动物颗粒细胞中,孕酮受体响应雌激素信号分子有可能是由miR-26a/b介导来实现的,这说明孕酮受体调控雌性哺乳动物排卵时并不单纯依靠孕酮的调控。这为进一步探索激素协同调控雌性哺乳动物排卵过程提供新的视角。
[硕士论文] 杨芳
生物学 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物排卵在雌性生殖活动中发挥重要作用,孕酮是开启排卵的关键因子,其主要通过孕酮受体(Progesterone receptor,PGR)产生生理作用,用PGR抑制剂或将其条件性敲除后均降低卵母细胞的数目,甚至出现不育现象。此外,在该过程中,因脉管脱落和重塑而形成间断的低氧环境,也能影响排卵事件的正常进行。因此孕酮和低氧在排卵过程中至关重要。近年来通过大数据分析筛选出大量的PGR下游基因,但在已知的基因中却很少发现孕酮响应元件,如参与排卵过程中卵泡破裂和炎症反应的Edn2、PPARγ。这两个基因是否受PGR和低氧的调控,如何进行调控,以及如何协调参与排卵过程等,这些问题均有待阐明。
  本实验以未性成熟的雌性昆明小鼠和人源KGN细胞为研究对象。1)用PMSG/hCG构建小鼠超排卵模型,联用PGR抑制剂RU486,收集小鼠卵泡中的颗粒细胞检测Edn2和PPARγ的mRNA的表达情况;2)在此基础上,辅以低氧模拟物CoCl2,探究低氧对颗粒细胞中Edn2和PPARγ的影响;3)进一步地,在KGN中超表达PGR、HIF1,以探究PGR、HIF1对Edn2和PPARγ的影响;4)为确认HIF1α的调控作用,采用CRISPR-Cas9技术在KGN细胞中构建HIF1α特异性敲除细胞系,辅以CoCl2处理,研究HIF1α介导PGR调控Edn2和PPARγ的机制;5)利用生物信息学分析孕酮调节信号中的网络节点。
  结果发现:1)PPARγ和Edn2在PMSG处理48h,hCG处理11h后表达量显著性增加,但经RU486处理后表达量却显著下降;2)经CoCl2处理12h后显著提高Vegfa、PPARγ和Edn2的表达量;3)在KGN细胞中超表达HIF1各载体发现其主要通过HIF1α调控下游基因,且可通过低氧响应元件调控Edn2;4)缺失HIF1α后Edn2和PPARγ的mRNA与蛋白本底水平在CoCl2刺激下均显著下降;而且超表达PGR致Vegfa、Edn2和PPARγ的表达升高因HIF1α缺失后受阻;5)通过芯片数据分析探索并初步证实孕酮调节信号网络通路中存在4个关键网络节点,并发现9个潜在受PGR调控的基因。
  总的来说,在排卵过程中PGR和低氧能够调节PPARγ、Edn2,且PGR对二者的调控依赖于HIF1α。孕酮调节信号网络通路分析为我们进一步了解在排卵过程中孕酮、低氧等因素如何通过基因调控来影响排卵进程奠定基础,而且也为理解哺乳动物排卵过程及相关疾病的发生机理提供一定的理论知识。
[硕士论文] 崔馨元
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景与目的:
  孕激素(Progesterone,P)在胚胎发育成熟和着床过程中起重要作用,孕激素不足可导致胚胎发育不良,及妊娠终止引起流产。孕激素通过调节与着床有关分子的表达促进胚胎的增殖和黏附能力。多种病理和生理过程受到蛋白质糖基化的影响,其中包括了胚胎发育与着床过程。O-糖基化和 N-糖基化是蛋白质糖基化的主要形式。蛋白质的O-岩藻糖基化受蛋白质O-岩藻糖基转移酶(poFUTs,protein-fucosyltransferases)的催化,而poFUTs在促进胚胎发育与着床过程中的作用未见报道。激活蛋白-1(AP-1)是一种转录因子,转录因子家族由Jun和Fos的细胞同源物组成,参与细胞增殖、分化、和侵袭过程和内分泌基因的调节。研究发现,AP-1(c-Jun/c-Fos)广泛表达于人胎盘中,活化的AP-1具有调控胎盘的形成和胎儿发育的作用。本研究拟探讨孕激素对蛋白质 O-岩藻糖基化的调控作用及影响胚胎增殖和着床过程。研究结果表明 JAR细胞经孕激素作用,增加AP-1(c-Jun/c-Fos)的磷酸化表达,上调poFUT1的基因表达,并促进胚胎细胞的黏附能力与增殖能力。实验有助于揭示岩藻糖在着床糖生殖生物学中的作用及其机制,为临床医学提供研究及诊断治疗的新思路。
  方法:
  1.利用ELISA和Western blot检测健康未孕、早孕和流产妇女血清中孕激素和poFUT1的蛋白表达水平。通过免疫荧光的方法验证人绒毛组织中poF UT1的定位和表达。
  2.利用Wester n blot,免疫荧光和Real-ti me PCR等方法,观察孕激素对胚胎滋养层细胞中poFUT1基因和蛋白表达水平的影响,以及孕激素与米非司酮联合应用对poFUT1基因和蛋白表达水平的影响。
  3.利用Wester n blot,免疫荧光和Real-ti me PCR等方法,观察孕激素影响poFUT1的表达及对细胞增殖黏附功能的改变。
  4.为了探讨孕激素是如何调控poFUT1表达,我们采用Western blot、EMSA和免疫荧光方法确定孕激素可激活转录因子AP-1的转录活性。
  5.利用染色质免疫沉淀技术检测转录因子AP-1直接作用在poF UT1的启动子区域,促进poFUT1转录,并且通过Western blot和Real-time PCR检测瞬时转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒和AP-1抑制剂(TIIA)处理后poFUT1基因和蛋白表达的变化。
  6.体外着床模型是在荧光显微镜下,观察和统计黏附率,检测了包括正常组、孕激素组、孕激素联合米非司酮组、转染 c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒组,AP-1抑制剂(TIIA)组以及分别联合孕激素等9组的胚胎黏附率。并且利用Western blot、免疫荧光和CCK-8检测JAR细胞增殖能力。
  结果:
  1.收集临床样品包括健康未孕、正常早孕和先兆流产女性血清进行 ELISA检测发现:正常早孕妇女血清中,孕激素和poF UT1的含量均高于先兆流产患者和健康未孕的女性;而先兆流产患者血清中,孕激素和poF UT1的含量比早孕妇女低。孕激素和poF UT1在血清中的表达变化呈正相关。通过免疫荧光确定人早孕绒毛中poFUT1的定位和表达。
  2.孕激素促进 poFUT1的基因和蛋白水平的表达。经过不同浓度的孕激素和不同作用时间处理后,通过Real-time PCR和Western blot等方法检测发现,孕激素能显著促进JAR细胞 poFUT1基因和蛋白的表达;Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果表明,联合应用米非司酮(RU486)可抑制孕激素的效用;瞬时转染poFUT1 siRNA后,poFUT1表达明显降低,联合孕激素处理后可回调poFUT1的表达。
  3.孕激素促进 poFUT1的表达并调节 JAR细胞的增殖与黏附的能力。Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果发现,干扰poFUT1的JAR细胞中合并应用孕激素可以恢复poFUT1的表达。通过Western blot、CCK-8和免疫荧光等方法分析发现孕激素调控poFUT1的表达影响JAR细胞的增殖和黏附能力。
  4.孕激素激活转录因子AP-1的转录活性。Wester n blot、EMSA和免疫荧光结果发现,孕激素(10-5mol/L)可上调转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos)的表达水平,并促进其在核中的积累。
  5. AP-1直接影响靶基因poFUT1的转录,Real-time PCR、Western blot结果显示,与对照组相比,抑制了AP-1的转录激活能力可降低poF UT1的表达水平。通过CHIP实验进一步确定了AP-1直接作用在poFUT1启动子区域,引起下游靶基因poFUT1转录并调控其表达变化。
  6.孕激素通过激活转录因子 AP-1上调 poF UT1表达水平。孕激素可调控poFUT1的表达,poFUT1的表达变化可影响胚胎细胞增殖能力。通过 Western blot、CCK-8和免疫荧光分析发现,与对照组相比,孕激素能提高JAR细胞的增殖能力;c-Jun/c-Fos siRNA能降低JAR细胞的增殖能力;联合孕激素处理可一定程度的回调由c-Jun/c-Fos siRNA引起JAR细胞增殖能力降低的现象;同时,孕激素也能够回调由AP-1抑制剂(TIIA)引起J AR细胞低的增殖能力;研究发现,孕激素可提高胚胎细胞的增殖能力。
  7.利用体外黏附模型,观察胚胎细胞的体外黏附率。孕激素可提高JAR细胞的黏附率;瞬时转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒可降低JAR细胞的黏附率;同时,孕激素能够恢复c-Jun/c-Fos siRNA预处理的JAR细胞的低黏附率;孕激素也能够恢复预处理AP-1抑制剂TIIA的JAR细胞低黏附率;进一步的研究发现孕激素可恢复 poFUT1 siRNA导致的胚胎较低的黏附率。孕激素通过促进poFUT1的表达提高了胚胎的黏附能力。
  结论:
  1.正常早孕时期女性血清中孕激素和 poFUT1的含量较先兆流产患者高,且呈正相关性。人绒毛组织上有poFUT1的表达。
  2.孕激素促进poFUT1基因与蛋白的表达水平。
  3.孕激素激活转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos),并上调poFUT1的表达。
  4.孕激素促进胚胎细胞增殖能力。
  5.孕激素通过激活转录因子 AP-1(c-Jun/c-Fos)的转录活性,进而调控靶基因poFUT1的转录,促进胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附。
[硕士论文] 吴瑜
生物学·发育生物学 兰州大学 2016(学位年度)
摘要:印记基因是一类亲本来源特异性表达的基因,大部分印记基因在胚胎发育、胎盘形成以及个体生活过程中扮演着重要角色。P57是周期蛋白激酶抑制剂,是一个典型的抑癌基因,同时也是一个父本印记、母本表达的印记基因,其缺失会带来胚胎致死。P57免疫荧光染色显示其蛋白在乳腺组织中广泛表达,RT-PCR结果表明它在乳腺形态变化的4个时期中表达量呈下降趋势。为了研究P57在乳腺发育过程中是否起到了作用,本文在乳腺细胞中设计了两种shRNA的对P57进行了敲除,发现P57通过影响乳腺上皮细胞的干性来影响增殖,RT结果显示其干细胞信号通路的相关基因表达水平明显降低,然而周期检测发现其G1期的细胞比例下降。通过对临近LncRNA Kcnq1ot1进行敲除可以使P57的表达量显著上调,但对PRC2复合物成员Suz12敲除虽然可以降低Kcnq1ot1的表达,但P57的变化趋势却不稳定。在对P57进行敲除后,RT检测到另外15个印记基因的表达水平也发生显著变化,验证了乳腺细胞中印记基因网络的存在。
[博士论文] 顾小伟
生物化学与分子生物学 汕头大学 2016(学位年度)
摘要:子宫内膜基质细胞蜕膜化对胚泡植入、胎盘的形成和妊娠的维持至关重要。蜕膜化异常是导致早期妊娠失败的主要原因之一。当细胞不能正确地折叠、修饰和组装分泌蛋白或跨膜蛋白时,未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网内积累会引起内质网应激。细胞为了恢复蛋白折叠能力和内质网的平衡,起始一系列的信号转导通路称为未折叠蛋白反应。但目前内质网应激和未折叠蛋白反应在蜕膜化中的作用及其潜在的机制仍不清楚。
  实验结果显示,在小鼠正常蜕膜化和人工诱导蜕膜化中,内质网应激激活的未折叠蛋白反应中的GRP78/IRE/XBP1信号通路被激活。用内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸钠(TUDCA)和IRE特异性抑制剂STF-083010处理,可抑制体内及体外蜕膜化的进程。用内质网应激的诱导剂衣霉素(TM)处理小鼠子宫内膜基质细胞时,随时间的延长和剂量的增加,其作用由促增殖向促凋亡过渡。高浓度的TM显著抑制体内外蜕膜化的发生,而低浓度TM对蜕膜化有益。在小鼠蜕膜化过程中,存在DNA损伤与基质细胞多倍化。用TM诱导内质网应激后, DNA损伤增加。而拓扑异构酶抑制剂CPT处理小鼠子宫基质细胞诱导DNA损伤后,基质细胞中内质网应激减弱,说明由内质网应激诱发的DNA损伤可能参与了对内质网应激的负调控,防止应激反应的过度化。转录因子E2F8可促进小鼠蜕膜细胞多倍化。用高浓度TM和STF-083010处理,可抑制基质细胞蜕膜化中E2F8的表达,说明内质网应激反应过度抑制了蜕膜化过程中的多倍化。
  综上,内质网应激反应中 IRE-XBP1信号通路在小鼠蜕膜化中起主导作用,在蜕膜化过程中内质网应激是一把双刃剑,过度应激对蜕膜化不利,适度的内质网应激有助于蜕膜化。
[硕士论文] 朝鲁蒙
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2016(学位年度)
摘要:受精作用因单倍体精子和卵子融合创造出新的基因不同的二倍体有机体而对物种的延续和发展有着重要的意义。精卵融合是完成受精作用的关键,是由多分子参与的复杂过程,但目前为止还尚不明确其分子机制。研究精卵融合过程中的蛋白间相互作用,对了解并解决其中存在的问题有着不可估量的价值。IZUMO1-JUNO间相互作用是精卵融合过程中最为关键的蛋白相互作用,缺少其中任何一个都无法正常的受精。因此本实验选择JUNO蛋白作为研究对象,筛选除IZUMO1外与其相互作用的蛋白。
  1、大鼠睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建
  本实验通过采用SMARTTM cDNA合成技术构建了大鼠睾丸的酵母双杂交文库。构建的文库库容为1.5×106 cfu,滴度为8×107 cfu/mL,重组率为78%,插入片段平均长度为0.7 kb,有较高的进行蛋白相互作用筛选的价值。
  2、pGBKT7-juno诱饵载体的构建
  以实验室克隆并保存的pMD19T-juno为模板,去掉信号肽扩增后连接到pGBKT7载体上,并对其进行鉴定、自激活检测和细胞毒性检测。通过利用载体上c-Myc抗原标签,western blot检测了pGBKT7-juno诱饵载体在酵母细胞中表达情况。使用生物信息学分析常见哺乳动物的JUNO氨基酸序列,绘制了系统发生树,分析了在进化过程中的亲缘关系。
  3、酵母双杂交筛选与JUNO相互作用蛋白
  使用构建好的大鼠睾丸酵母双杂交cDNA文库和pGBKT7-juno诱饵载体进行杂交。共筛选出5个特异性基因(mkrn1,rps21,irgc,wdr54和rnaseh2a),并分别予以分析。本实验初步筛选出了精子上与JUNO蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究精卵融合过程提供了候选分子。
[硕士论文] 邵东梅
渔业资源 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本文对口虾蛄Oratosquilla oratoria的繁殖生物学特征进行如下探究:⑴利用酶联免疫吸附技术(ELISA),研究了水温和体重对卵巢发育中雌二醇(E2)和孕酮(P)激素含量的影响。设置5℃、15℃、25℃、30℃4个实验组,选择实验时间60天,结果表明:温度对雌二醇、孕酮激素浓度的影响显著。在25℃时,卵巢处于成熟期或成熟前期,其E2含量值达到最高,为0.957 ng/g;在5℃即卵巢发育初期最低,含量为0.434 ng/g。卵巢中孕酮激素含量在5℃与25℃孕酮含量差异不显著。其最高值出现在30℃,此时卵巢处于排卵期,其含量为1.062 ng/g,此时雌二醇含量相对偏低,其值为0.626 ng/g;另外取性腺发育状态一致的口虾蛄,其体重分别为10.0±1.5 g、20.0±1.5 g、30±1.5 g,实验表明,卵巢内雌二醇含量随着体重的增加呈上升趋势。经多重比较,除20±1.5 g的口虾蛄,各组间差异显著。在体重10±1.5 g的虾蛄群体中,其雌二醇含量最低,为0.431 ng/g。在20±1.5 g的口虾蛄体内,其雌二醇含量为0.456 ng/g,。在体重为30±1.5 g的口虾蛄群体中,其雌二醇含量最高,为0.555 ng/g。⑵对雄性口虾蛄促雄腺的结构和功能进行了初步探究。在解剖镜下观察发现:口虾蛄促雄腺1对,乳白色,大小约为5-10mm3,位于第三步足的交接肢基部内侧,包埋于肌肉、肝胰腺之间,通过组织膜附着在输精管表面。利用组织切片和透射电镜技术,观察发现腺体的发育主要分为增殖期、合成期、分泌期。增殖期腺细胞嗜碱性强,腺泡间隙明显;合成期腺细胞嗜碱性减弱,腺细胞增大且排列规则,其细胞核也规则的排列在细胞外围,核仁1-3个;分泌前期腺细胞染色深,嗜碱性强,细胞质含量少,腺细胞细胞核固缩,位于腺细胞中央,分泌后期腺泡内腺细胞数量减少,腺泡内出现大量滤泡。腺体分泌方式为全浆式分泌。
[硕士论文] 王桂萍
细胞生物学 山东师范大学 2016(学位年度)
摘要:雌性哺乳动物生殖生物学研究内容包括:卵巢发育、卵子发生、受精、胚胎发育和着床以及妊娠维持等多个过程,这些过程受到多个基因和信号分子的严密调控。非洲爪蟾激活素信号转导者1(Xenopus forkhead activin signal transducer1,xFAST1)是发现的第一个Smad蛋白转录协助者。FAST2是FAS相关蛋白在小鼠中的同系物,属于叉头框(forkhead box,Fox)蛋白家族,由foxh1基因编码。FAST2主要在胚胎发育的早期阶段表达,在原肠胚形成、前脑和心脏等发育过程中发挥重要功能。foxh1缺失小鼠的胚胎中线结构、前端原条、节点、脊索中胚层、脊索和内胚层等无法正常形成。但是对于FAST2在小鼠卵巢及着床前胚胎发育中的功能还不甚了解。在本实验中,我们以新生雌性小鼠卵巢、外源促性腺激素诱导的未成熟雌性小鼠卵巢、美洛昔康(meloxicam,MEL,前列腺素合成酶2活性抑制剂)处理的外源促性腺激素诱导的未成熟雌性小鼠卵巢、GV期卵母细胞和着床前胚胎为研究对象,利用免疫组织化学技术和免疫印迹等实验方法,研究FAST2在小鼠卵巢卵泡和着床前胚胎发育过程中的表达。
  免疫组化结果显示,FAST2表达在出生后1天小鼠卵泡卵母细胞和出生后第8天卵母细胞和膜细胞中,并且在随后不同时间点卵泡卵母细胞和膜细胞中持续表达,但是在颗粒细胞中表达为阴性。在外源促性腺激素(PMSG和hCG)诱导卵泡成熟和排卵过程中,FAST2定位在PMSG24 h和PMSG48 h有腔卵泡和成熟卵泡卵母细胞、膜细胞以及hCG24 h排卵后形成的新生黄体中。伴随着黄体退化(hCG48 h和hCG72 h),FAST2表达量降低。免疫印迹分析显示,FAST2在PMSG24 h到hCG24 h阶段(卵泡成熟排卵并黄体形成阶段)维持高水平表达,在hCG48 h和hCG72 h黄体退化阶段表达量显著减少,这与免疫组化结果相符。用美洛昔康处理外源促性腺激素诱导的未成熟雌性小鼠卵巢, HE染色结果显示,在hCG注射后的18 h、24 h和36 h,对照组中形成许多黄体,而MEL处理组排卵受到抑制,在完整卵泡中出现黄体化颗粒细胞和滞留的卵母细胞。免疫组化结果显示,FAST2定位在对照组黄体和MEL处理组卵泡膜细胞、黄体化颗粒细胞和滞留的卵母细胞中。免疫印迹结果显示,FAST2在两组中的表达量没有显著性差异。共聚焦结果显示,FAST2在除核仁以外的整个GV期卵母细胞中表达,在胚胎早期1-8细胞阶段的表达模式和GV期卵母细胞相似。在随后发育阶段中,FAST2表达在桑椹胚和囊胚内细胞团的细胞质中。
  综上所述,FAST2可能在卵泡发育成熟、排卵、黄体化及着床前胚胎发育过程中发挥重要作用。
[硕士论文] 丁晓萌
生物学;发育生物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:下丘脑弓状核中合成的神经肽Y(Neuropeptide Y)是一种强摄食物质,它参与调节食物的摄取、心率、血管收缩、呼吸运动、平滑肌舒缩以及下丘脑神经内分泌等重要生命活动功能。有研究表明,NPY除了参与调节以上重要活动的能量代谢,也参与了生殖活动的调控。NPY蛋白不仅表达于下丘脑与生殖调控相关区域,在垂体水平也有报道参与LH峰的形成。另有研究发现在性腺、生殖管道均有NPY神经纤维的分布,在卵泡液中也能检测到NPY mRNA的表达,说明NPY广泛地分布在HPG轴中,并参与生殖功能的调控。
  研究目的:本研究试图探究NPY在动情周期中的表达与分布的规律,并研究探讨NPY对于动情周期的维持、各级卵泡的发育与排卵的影响。
  研究方法:本研究以C57BL/6雌性小鼠为研究对象,每日定时通过阴道涂片确定动情周期,并称量子宫湿重来验证动情周期划分的准确性。取相同动情时期的卵巢组织,Real-time PCR技术检测NPY在不同动情时期中的转录水平,并提取组织蛋白用Western Bolt的方法检测蛋白水平的表达。对卵巢进行固定包埋后,通过免疫组织化学技术检测NPY在卵巢动情期的分布。腹腔注射NPY2R受体拮抗剂BIIE0246,并连续15天监测动情周期的变化是否随着NPY受体的拮抗而改变。统计卵泡计数结果,观察拮抗NPY2R受体组与对照组相比是否影响各级卵泡的发育,同时检测卵巢组织中卵泡发育相关基因的变化。超排抑制试验中,每只雌鼠注射10IU PMSG的同时注射BIIE0246(0.2ug/g),44小时后注射10IU hCG,8小时后处死小鼠眼球取血用于激素检测并计数排卵个数,药物处理组在第一次打药后每隔12小时注射BIIE0246,对照组则用等量生理盐水替代BIIE0246溶液。
  结果与结论:NPY的转录水平在动情期的表达量较其他时期有显著性差异,Western Blot的结果与Real-time PCR结果基本一致。免疫组织化学检测结果表明:动情期中,NPY除了在卵巢组织间质中表达之外,还分布在卵泡膜细胞与黄体中,这些结果提示NPY在卵巢组织中的表达受动情周期的影响。NPY在动情期中的高表达,同时分布在膜细胞中,所以我们推测NPY有可能参与了卵泡的发育和排卵。BIIE0246处理后发现,小鼠的动情周期与对照组并无差异,而卵泡计数结果显示:窦状卵泡(早期)与Graffin卵泡较对照组显著减少,闭锁卵泡显著增加,而原始卵泡、初级卵泡的数量无显著性差异。检测卵泡发育相关基因发现:c-kit、AMH、GDF-9、CD-2均显著减少、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas显著减少。超排抑制实验结果显示:BⅡE0246处理组排卵数较对照组正常超排的小鼠显著减少,检测排卵相关基因发现:Cox-2、HA-2、TSG-6、ADAMTS-1、EP-2、Egr1基因显著减少。
  所以得出结论:1.NPY随着动情周期的变化而发生变化,在动情期时表达水平最高;但是NPY不能影响动情周期。2.拮抗NPY Y2受体可以使晚期卵泡发育的成熟受阻。3.拮抗NPY受体可以导致获卵数下降。基于以上结果说明NPY与初级卵泡到次级卵泡的发育和窦状卵泡的形成相关、促进卵泡的闭锁并参与排卵的过程,NPY的受体拮抗并不改变雌性小鼠的动情周期,也不参与卵泡早期发育过程。
[硕士论文] 李媛媛
细胞生物学 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院 2016(学位年度)
摘要:目的:
  哺乳动物的精子发生是一个高度复杂的细胞分裂与分化过程,许多生精细胞特异性基因的表达和调控具有发育阶段特异性的特征,任一阶段的异常都有可能导致雄性不育,因此,研究精子发生过程中起重要作用的睾丸特异性基因,并对这些基因的表达特征及其在精子发生过程中所起的生物学功能进行深入研究,对理解精子发生的内在机理、防治精子发生异常引起的男性不育、研制男性避孕药及保健药等具有重要意义。Speedy/Ringo基因是一类新发现的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)激活因子,在精子发生过程中起重要作用。利用四环素(tetracycline,Tet)基因调控表达系统可以在时间和空间上实现对基因的可控性表达,为基因功能的研究提供有效的解决途径。本文旨在建立基于Tet-On系统诱导表达的Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,研究Speedy A基因表达下调对精子发生的影响,并且探讨Tet-On系统在研究精子发生相关基因中的应用。
  方法:
  利用生物信息学软件,按照RNA干扰序列设计原则设计RNA干扰靶点序列,构建质粒后转染大肠杆菌,筛选阳性菌并验证插入序列,慢病毒包装干扰片段后感染精母细胞,Real-time PCR检测下调Speedy A基因表达的有效干扰片段;Gateway技术构建包含有效干扰片段和四环素反应元件(TRE)的质粒,建立转基因小鼠并筛选到纯合子,然后与四环素调控的反式激活子(rtTA)转基因小鼠杂交,筛选TRE和rtTA双阳性的小鼠,喂食强力霉素(Dox)诱导小鼠体内RNA干扰片段的表达,下调SpeedyA基因的表达水平,建立可控性SpeedyA基因RNA干扰转基因小鼠模型,以Real-time PCR及Western Blot分别检测模型组小鼠与对照组小鼠在mRNA水平以及蛋白水平Speedy A基因的表达差异;HE染色初步观察睾丸组织形态学变化,TUNEL法检测小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况。
  结果:
  实验设计了4个RNA干扰靶点序列,通过体外实验筛选下调Speedy A基因表达的有效干扰片段,Real-time PCR检测到精母细胞中最佳干扰片段对Speedy A基因表达的敲减程度达75%(P<0.01),为有效靶点;成功构建了PDOWN-shSpdya入门克隆及pRP.EX2d-TRE>shSpdya表达克隆;成功建立了四环素诱导的SpeedyA-RNA干扰转基因小鼠模型,诱导RNA干扰片段表达后,实时荧光定量PCR及Western Blot结果显示模型组小鼠与对照组小鼠相比SpeedyA基因的表达量明显下降;HE染色及TUNEL法检测到模型组小鼠睾丸组织的精母细胞发生大量凋亡。
  结论:
  本实验成功建立了基于Tet-On系统诱导表达的可控性Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,说明可以基于Tet-On系统活体研究精子发生相关基因的功能;初步分析发现Speedy A基因表达下调使生精细胞发生异常凋亡。模型的成功建立为进一步系统分析SpeedyA基因在雄性生殖系统中的功能及其作用机制打下了基础。
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