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[硕士论文] 张满
免疫学 郑州大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 杨婕
病原生物学 重庆医科大学 2018(学位年度)
[博士论文] 杜奎
化学工程与技术 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:Zn2+和H2PO4-离子作为重要的生命活动相关的离子,在如金属酶调控、基因转录和临床疾病诊断等方面起到关键性作用。近年来,尽管大量的Zn2+和H2PO4-离子荧光探针被报道和应用,但是设计制备出高选择性串联识别Zn2+和H2PO4-离子的比率计量型荧光探针,对于实现荧光探针在生物活体成像、环境检测等方面的高效利用具有重要意义。本文基于分子内电荷转移机理(ICT),结合理论计算设计制备了一系列新型串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针,研究了这一类探针在中性溶液中的离子识别能力和荧光性质,以及在肿瘤细胞成像造影中的应用。主要内容如下:
  1.通过在喹啉酰胺上引入杂环片段,基于光诱导转移机理(PET),设计合成了一类新型串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针识别基团(2a-1)。该类荧光探针识别基团具有离子选择性高、“off-on-off”荧光特点明显和可改造能力强等优点。荧光探针2a-5表现出较好的生物相容性,被成功用于HeLa细胞中Zn2+离子荧光造影成像。
  2.基于分子内电荷转移机理(ICT),结合理论计算,提出了三氮唑和炔烃作为电子给体(Donor)提高识别基团2a-1荧光检测性能的策略。开展了一锅法制备这两类荧光探针新方法的研究,通过对反应催化剂、反应底物和反应条件的设计和优化,简单、快速制备了一系列串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针(3a-1~3a-6,4a-1~4a-7)。研究发现,三氮唑和炔烃作为电子给体时,相比于识别基团2a-1,荧光发射光谱发生较大红移、荧光量子产率明显提高和双波长比率计量特点得到明显改善。3a-1和4a-1表现出较好的生物相容性,被成功用于肿瘤细胞A549、HuH7和HepG2中Zn2+离子细胞成像造影,表现出明显的双波长荧光成像效果。
  3.在前期不同电子给体修饰的荧光探针的合成方法和荧光性能研究的基础上,通过引入埃罗替尼和半乳糖这两类靶向分子,设计合成了具有细胞靶向的新型串联识别Zn2+和H2PO4-离子的荧光探针。结果表明,埃罗替尼靶向基团的引入,探针5a-1表现出对表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)高度特异性结合能力,能够较好的在A549细胞中实现Zn2+离子荧光成像,而在HuH7细胞中几乎观察不到荧光信号。半乳糖靶向基团的引入(5a-2,5a-3),极大的提高的第三章和第四章中荧光探针的水溶性,可以很好的实现纯水中串联识别Zn2+和H2PO4-离子。同时,荧光探针5a-2和5a-3表现出对细胞膜表面的ASGP受体很好的特异性结合能力,能够较好的实现HepG2细胞中Zn2+离子荧光成像,而在A549细胞中几乎观察不到荧光信号。
[硕士论文] 魏东东
农产品加工及贮藏工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)具有抑菌谱广、对热稳定、不易产生耐药性等优点,有望成为化学防腐剂的替代品,在食品加工、贮藏等方面具有广阔的应用前景。然而在实验室研究、生产实践及安全性评价过程中,抗菌肽还存在定量测定方法不统一,结果重复性差,缺乏比较依据,与抗生素不易区分等一系列问题。
  以琼脂扩散法为基础,对相关因素进行优化,确定了抗菌肽定量测定方法的最优条件。本研究以硫酸多黏菌素B为代表,以铜绿假单胞菌ATCC9027为指示菌,采用琼脂扩散法建立了抗菌肽浓度对数值与抑菌圈直径之间的线性关系(以下简称“线性关系”)。以代表线性关系重复性的斜率、截距和代表线性关系精密度的决定系数R2为指标,对指示菌菌龄、菌浓,琼脂浓度和培养基厚度等影响因素进行优化,确定琼脂扩散法测定抗菌肽效价的最佳测定条件为:指示菌的最佳培养时期为稳定期,浓度为106cfu/mL,培养基厚度为3.15mm(Φ90mm,20mL),琼脂浓度为1.5%。在此条件下,选用其它抗菌肽和指示菌进行验证,结果重复性好,精密度高(R2=0.997)。
  通过多种抗菌肽与指示菌的相互作用,确定抗菌肽与指示菌之间存在相关性。本研究以杆菌肽、硫酸多粘菌素B、乳酸链球菌素(Nisin)为抗菌肽,以大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单孢菌ATCC9027、蜡样芽孢杆菌ATCC10876为指示菌,采用抗菌肽定量试验中确定的试验条件,进行琼脂扩散试验,探究线性关系中斜率和截距的变化情况。研究发现当抗菌肽相同而指示菌不同时,其斜率和截距均存在显著性差异;当指示菌相同而抗菌肽不同时,斜率和截距也不相同,即线性关系中斜率和截距能够反映抗菌肽与指示菌间的相关性。故当指示菌及影响因素一致时,线性关系中斜率和截距可作为抗菌肽性质变化的评价指标;当抗菌肽的性质发生变化时,斜率和截距的变化规律可作为抗菌肽定性方法的判别依据。
  通过对影响抗菌肽与指示菌相关性因素进行研究,探讨了区分抗菌肽与抗生素的相关方法。以硫酸多粘菌素B为抗菌肽,以铜绿假单孢菌ATCC9027为指示菌,采用抗菌肽定量试验所确定的方法,以线性关系中斜率、截距的变化情况为分析对象,对影响抗菌肽性质的相关因素,如溶剂pH、盐离子的种类及浓度、热处理时间以及酶处理对抗菌肽定性试验的影响进行研究。结果表明,抗菌肽在经过不同时间热处理和不同种类酶处理后,对抗菌肽定性试验影响较小、干扰少,能够反映抗菌肽性质的变化情况。在定性方面,将抗菌肽(硫酸多粘菌素B、杆菌肽)和抗生素(氨苄青霉素、卡那霉素)分别热处理不同的时间和经不同种类的酶处理。结果显示抗生素在热处理过程中,斜率没有显著性变化(p>0.05),截距变化显著或不发生变化;酶处理对斜率和截距均无显著性影响(p>0.05)。抗菌肽使用热处理斜率无显著性变化(p>0.05),截距有下降趋势;部分酶处理后斜率和截距均无显著性(p<0.05)。
  本研究确定了基于琼脂扩散法的抗菌肽定量测定方法的最优条件,同时以所发现的抗菌肽与指示菌的相关性规律为依据,对抗菌肽定性相关工作进行研究。为抗菌肽的实际应用提供了参考和依据,为相关标准的制定提供了数据支持。
[硕士论文] 李春雨
发酵工程 哈尔滨商业大学 2018(学位年度)
摘要:过氧化物酶(POD)可用于催化过氧化氢氧化有机化合物。天然POD在处理工业废水、分析食品中微量酚、医学临床分析和合成酚类聚合物等许多领域被广泛应用。目前应用最广泛的是辣根过氧化物酶(HRP),天然HRP价格昂贵,而且容易失活,由于其分子较大,所以在酶联免疫分析过程中,抗原和抗体很难结合,难以被标记。因此在酶催化反应中,寻找一种模拟酶和催化体系来代替HRP,并提高模拟酶催化反应灵敏度是当代科学家们关注的焦点。本论文借助甲烷氧化菌素(Mb)的铜配合物具有过氧化物酶活性及纳米金大的比表面积和高的电子翻转速度等特点,采用甲烷氧化菌素功能化纳米金的铜配位组装来设计合成高效POD模拟酶。主要研究内容如下:
  利用甲基弯菌IMV(Methylosinus trichosporium IMV3011)产生的Mb,通过Cu(Ⅱ)添加过程中Mb的UV-可见光谱及荧光光谱变化,发现配合物中的配体4-羟基-5-硫酰咪唑(HTI)和4-硫酰-5羟基咪唑(THI)可能在金属配合物的高氧化态Mbn-Cu*稳定性中起着至关重要的作用,推测Cu(Ⅱ)与Mb可能存在Mb-Cu、Mb2-Cu和Mb4-Cu三种不同的配位形式,并对三种配位形式的催化能力进行研究,结果发现三种Mb/Cu配合物都具有较强的过氧化物酶活性,而且Mb/Cu不同配位形式影响其酶活性,Kobs分别为6.11×10-4s-1,8.28×10-4s-1和4.16×10-4s-1,不同配位的反应速率常数提高了400~800倍。其中过氧化物酶活性最高的是二配位,这可能是因为Mb2-Cu配合物结构可能更有利于在氧化剂作用下形成过渡态Mb2-Cu*,因此它活性表现为最高,由此确定Mb/Cu的最佳配位方式为Mb2-Cu。
  利用Mb和Cu之间的不同金属配位作用介导Mb功能化纳米金粒子的组装,构建纳米酶复合体系。向Mb修饰的纳米金中加入适量Cu(Ⅱ)或Mb-Cu诱导,发现Cu(Ⅱ)和Mb-Cu都在AuNPs表面形成了Mb2-Cu配位,这可能是由于Mb2-Cu形式的Cu(Ⅱ)和Mb之间具有高亲和力。对两种组装形式进行过氧化物酶活性的检测,结果发现它们的Kobs比直接加入Cu(Ⅱ)或Mb-Cu时分别快3个和1个数量级,这说明纳米金的高电子传递能力和纳米簇中多活性中心产生的协同效应可以大大提高模拟酶的催化效率。在此基础上,对Mb2-Cu稳定的纳米簇结构进行动力学研究,确定了最佳反应条件:最适pH为7.0,最适过氧化氢浓度为6×10-3mol/L,对苯二酚最适浓度为4×10-4mol/L,反应温度最适为70℃。实验结果表明构建的纳米酶比天然POD稳定性更高,符合一般生物催化剂的催化规律,可以用来作为天然POD的替代物。
  主要对甲烷氧化菌素功能化纳米金粒子的铜配位组装进行直接电化学研究,讨论了扫速、pH、修饰时间等因素对酶修饰电极的影响,确定最佳电化学反应条件。研究结果表明对于Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极,当扫速在100mV/s,pH7.0,修饰时间16h时是修饰电极的最适组装条件。对Mb2-Cu稳定的纳米金和Mb2-Cu介导的纳米金簇修饰电极进行计时电流响应测试,结果发现两种修饰电极在5.0×10-5~5.0×10-4mol/L浓度范围内,电流与H2O2浓度之间线性关系良好,表观米氏常数分别为0.805mmol/L和0.793mmol/L,该数值较小,说明两种自组装电极对于H2O2的还原都具有高亲和力,对H2O2的检出限分别为1.1×10-5mol/L和0.9×10-5mol/L。综上所述,有理由认为Mb2-Cu介导的纳米金簇比Mb2-Cu稳定的纳米金具有更高的过氧化物酶催化活性,该结果与溶液中得到的结论一致。
[硕士论文] 张伟
食品科学 哈尔滨商业大学 2018(学位年度)
摘要:通过光谱法和电化学方法分析甲烷氧化菌素(Methanobactin,Mb)与铜的配合物模拟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,并进一步应用于电化学生物传感器。
  Mb是由甲烷氧化菌分泌到细胞外捕获和运输Cu2+的小分子荧光肽,它具有配合Cu2+等金属离子的能力,其铜配合物(Mb-Cu)可以清除超氧阴离子。实验第一部分从ethylosinus trichosporium3011发酵液中提取Mb并与Cu2+配合成Mb-Cu,分别采用紫外光谱和荧光光谱考察了邻苯三酚自氧化的线性时间以及有Mb-Cu参与的荧光激发波长,确定邻苯三酚的自氧化线性时间是90s,荧光激发波长为446nm。进一步考察了不同条件(EDTA-Na2的浓度、缓冲溶液的pH值、Tris-HAc缓冲溶液浓度、邻苯三酚浓度、温度和Mb-Cu浓度)对邻苯三酚自氧化的影响,从而评价Mb-Cu模拟SOD的活性。讨论认为,当EDTA-Na2的浓度为2mmol/L,溶液的pH值为8.2,Tris-HAc缓冲溶液浓度为0.05mol/L,温度为20℃,邻苯三酚浓度为0.363mmol/L时,浓度为0.8mg/L的Mb-Cu表现出良好的SOD生物活性,能有效抑制超氧阴离子(O2-)。在此光谱分析条件下Mb-Cu模拟SOD活性稳定。
  实验第二部分按照柠檬酸钠还原法制备了粒径大小在10~50(11.5、15、35、42、50)nm的纳米金(AuNps),并对其进行了TEM扫描,可以观察到制得的纳米金颗粒表面光滑、大小均匀。将粒径为15nm的AuNps依次组装Mb和Cu2+并进行了红外光谱的表征,证明Mb与Cu(Ⅱ)是通过Mb结构中的-OH或酚-OH配合。又将15nm的AuNps与具有不同类型官能团的交联剂缔合,并利用紫外光谱、荧光光谱、红外光谱和TEM透射电镜表征,其中β-巯基乙胺可与AuNps与Mb-Cu之间建立更紧密的结合,形成树状纳米簇结构。分别考察了AuNps粒径、AuNps∶Mb-Cu摩尔比、交联剂种类和Mb-Cu.交联剂摩尔比对邻苯三酚自氧化的影响,并通过光谱分析认为当AuNps粒径为15nm、AuNps Mb-Cu摩尔比为1∶150、交联剂选择β-巯基乙胺、Mb-Cu·β-巯基乙胺摩尔比为1∶3时,Mb-Cu-Au模拟酶活性最高。改变SOD活性测定体系发现,与黄嘌呤氧化酶法相比,模拟酶活性基本一致且方法稳定。
  实验最后一部分在01M的Fe(CN)63-/Fe(CN)64-的探针溶液中对空白、Au/β-巯基乙胺/AuNps、Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb和Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极进行了比较,通过循环伏安(CV)和交流阻抗(EIS)扫描得出Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极是以单层膜组装到金电极上,AuNps的存在可以加速异相电子传递,Cu2+反之。在研究SOD模拟酶自组装膜时,分别讨论了邻苯三酚自氧化基质作为探针溶液时,不同电解质、电解质浓度、邻苯三酚反应时间、邻苯三酚添加量和扫速对电极感应电流的影响,讨论认为当电解质KCl的浓度为0.3mol/L、超氧阴离子积累时间为3min、邻苯三酚添加量为20μL及扫速为300mV/s时,电极对电流的感应程度最高。并考察了不同模拟酶及组装方式、不同交联剂种类对模拟酶在电化学中对抑制邻苯三酚自氧化的影响,认为以β-巯基乙胺作为交联剂,以层层组装的形式组装的Au/β-巯基乙胺/AuNps/Mb/Cu电极的SOD模拟酶活性最强。该自组装膜检验测定电流的重现性较好,且有良好的稳定性和使用寿命。
  本文利用Mb-Cu模拟SOD,通过光谱法和电化学方法确定了模拟酶的活性。建立的SOD模拟酶自组装体系具有良好的重现性、稳定性,在检验O2-浓度方面有较好的应用前景。
[硕士论文] 王俊美
软件工程 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:蛋白质是生命活动的物质基础,对其功能的预测至关重要。目前主要有两种方法测定蛋白质功能:生物实验方法和基于数据的计算方法。生物实验法存在耗时长,成本高的问题,因此基于数据的方法是目前对蛋白质功能预测的研究热点。本课题使用基于数据的方法对蛋白质功能进行预测,研究内容主要包括以下三个方面:
  (1)构筑基于结构域和改进MIMLSVM的蛋白质功能预测模型。针对现有MIML算法预测精度不高的问题,设计一种基于改进MIMLSVM预测蛋白质功能模型。首先,采用改进的Hausdorff方法计算包之间的空间距离,并结合K-Medoids方法将MIML(多示例多标签)问题退化为多标签问题,以提高预测精度;然后,利用SVM算法将多标签问题转化为多个独立的二分类问题,结合蛋白质数据的特点,建立蛋白质功能预测模型,并利用粒子群算法优化模型参数;最后,通过对七种生物蛋白质功能预测的实验,证明所建模型的优越性。
  (2)设计基于AVC-SVM的芋螺毒素离子通道类型预测模型。针对现有方法对离子通道预测中存在的信息冗余问题,设计一种基于AVC(Analysis of Variance and Correlation)和SVM的芋螺毒素离子通道类型预测模型。首先用F值衡量特征对于结果的显著性影响水平,通过粗选的方式过滤F值较小的属性;然后引入Pearson Correlation Coefficient衡量属性间互相的冗余度,通过设置阈值过滤相关性较强的属性得到细选的结果;最后使用SVM预测芋螺毒素的离子通道类型。对比实验表明:AVC-SVM模型在交叉验证下得到总体预测精度91.98%和平均预测精度92.17%,使用氨基酸组合和二肽组合作为特征的个数为68,与其它模型相比,保证较高精度的情况下运行时间由8至11秒缩短为0.085s。
  (3)实现芋螺毒素离子通道类型的在线预测。为方便其他研究者进行芋螺毒素的相关研究,使用C#和matlab混合编程技术,在AVC-SVM模型的基础上开发芋螺毒素离子通道类型的在线预测系统。该系统输入是芋螺毒素蛋白质的氨基酸序列,输出是对应的离子通道类型。同时,该系统提供容错提示功能。当输入特殊字符、代表模糊不清的氨基酸残基的不合法字符、标点符号或者氨基酸序列长度小于3bp时,可以返回错误提示,方便用户及时改正输入。此外,该系统提供下载功能,供其他研究者下载相关论文和实验数据。
[博士论文] 王祥
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:蛋白质的三维结构决定了其功能,解析蛋白质的三维结构是揭示其功能的基础。本研究利用X射线晶体学解析了细胞质雄性不育蛋白WA352以及甲基转移酶复合体METTL3-METTL14复合体的晶体结构,对其功能的深入研究奠定了基础。
  野败型细胞质雄性不育是三系杂交水稻育种中应用最广泛的不育系,对其不育机理研究具有重大理论价值和生产意义。已有研究表明WA352是野败型细胞质雄性不育的不育基因。WA352通过与COX11互作引起活性氧的爆发,并最终导致花粉败育,然而WA352与COX11互作的机制尚不清楚。本文解析了WA3521.3(A)的高分辨率晶体结构,结构对比发现WA352是一种全新的折叠形式。综合结构与序列保守性分析,发现两个WA352三维空间上的保守区域。通过分子动力学模拟,本研究构建了WA352与COX11复合体的结构并提出了WA352影响COX11铜离子转运的模型。以上研究加深了对WA352结构和功能的理解,为进一步研究细胞质雄性不育奠定了基础。
  在细胞中,RNA的化学修饰了发挥许多重要的功能。m6A是mRNA和lncRNA中丰度最高的一种修饰,m6A分布非常广泛,在病毒,细菌,酵母,植物和哺乳动物中都能检测到m6A的存在。通过影响如前体mRNA加工,mRNA翻译,mRNA降解以及miRNA的产生等方面,m6A调控了生殖发育、细胞周期、细胞命运、热激反应等众多生命过程。m6A可以分别被RNA甲基转移酶和去甲基酶动态修饰或去除。在人类中,METTL3和METTL14两个甲基转移酶形成稳定的异源二聚体来催化甲基转移。但关于RNA甲基转移酶METTL3-METTL14复合体的催化机制还不清楚。本研究报道了METTL3-METTL14不含配体、结合AdoMet、AdoHcy的三个晶体结构。分析结构可知,METTL3和METTL14的构象属于第一类甲基转移酶。METTL3和METTL14由大量的氢键形成了稳定的相互作用,在相互作用区包含一个富含正电荷的沟槽。有意思的是,AdoMet仅存在METTL3的活性口袋中,而不在METTL14的活性口袋。综合生物化学实验结果,我们认为在m6A甲基转移酶复合物中,METTL3亚基是催化中心,而METTL14主要起到稳定结构和结合RNA的作用。METTL3-METTL14复合体晶体结构为m6A的功能研究奠定了基础。
[博士论文] 崔锡平
化学工程与技术 广东工业大学 2018(学位年度)
摘要:甘胆酸(glycocholic acid,GCA),属于二级胆酸,是类固醇酸的衍生物,由胆酸和甘氨酸在肝脏中结合生成的结合型胆酸,是胆汁酸的主要成分之一。GCA具有促进脂类乳化,加速脂类物质的消化和吸收的作用。GCA在血液和尿液中的浓度高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。因此,建立GCA的检测方法对其进行有效监测可以为各类肝脏疾病的鉴别、诊断、治疗和预后分析提供重要的依据。
  目前,GCA的检测方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、免疫学分析法等等。免疫分析法基于抗体和抗原之间特异性结合,具有灵敏度高、特异性强、简单、快速和便宜等优点,特别适用于大批量样本的筛查。抗体是影响免疫分析方法特异性和灵敏性的重要因素之一。传统的抗体包括多克隆抗体(polyclonal antibodies,pAb)和单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAb);然而,这两种抗体存在着某些缺点,例如在多克隆抗体制备中批次与批次之间的差异;在单克隆抗体制备中耗时、生产成本高和步骤复杂等等。通过噬菌体展示技术,可以从抗体文库中淘选到具有高亲和力的重组抗体,并可通过测序获得抗体的编码序列。单链抗体(single-chian variable fragment,scFv)是最常见的重组抗体之一,是能够保持与抗原有效结合的最小单位,由轻链和重链可变区通过一段编码连接肽基因拼接后表达的重组蛋白。ScFv抗体具有易于原核表达和基因工程改造等优点,目前已广泛应用于医疗诊断、疾病治疗、环境监测和食品安全分析等领域。本研究以GCA为靶标,通过噬菌体展示技术筛选到了高亲和力的scFv抗体,主要研究结果如下:
  1噬菌体展示单链抗体文库的构建和淘选
  11通过完全抗原GCA-BSA对母鸡进行免疫,构建了库容量为3.34×107cfu的噬菌体scFv抗体文库。利用GCA标准品竞争洗脱的方式,进行了四轮条件苛刻的淘选后,通过phage-ELISA的方法对淘选后的抗体文库进行鉴定,对筛选到的阳性克隆子进行DNA测序分析,共获得4种具有高亲和力scFv的序列。
  2抗GCA特异性单链抗体的原核表达及应用
  21将灵敏度最高的噬菌粒scFv-G11进行原核表达和纯化,建立了基于scFv抗体检测尿液中GCA的间接竞争ELISA,灵敏度(IC50)为0.06μg/mL,线性范围(IC20~IC80)为0.02~0.18μg/mL,最低检测限(limit of detection,LOD)为0.01μg/mL,与TCA的交叉反应率为40%,与其它结构类似的胆酸的交叉反应率均低于058%。在尿液中的添加回收率为86~123%,并将检测结果与LC-MS/MS进行比对,结果显示两者具有良好的相关性(R2=0.99)。
  3生物素化单链抗体的制备及应用
  31分别通过化学法和酶催化法,将生物素标记scFv抗体。结果显示,酶催化生物素法标记scFv抗体所建立的ELISA具有更高的灵敏性。利用酶催化法标记的scFv抗体建立了间接竞争BA-ELISA,IC50值为0.42μg/mL,线性范围(IC20~IC80)为0.14~1.24μg/mL,检测限LOD为0.07μg/mL,与TCA的交叉反应率为43.75%,与其它结构类似的胆酸的交叉反应率均低于1.88%。在尿液中的添加回收率为110.8~125.6%,检测结果与LC-MS/MS进行比对,结果显示两者相关性良好(R2=099)。
  综上所述,本研究利用噬菌体展示技术筛选到了4个高灵敏度的scFv抗体。此外,将具有较高灵敏度的scFv抗体,通过酶催化法,将生物素标记到scFv抗体。通过scFv抗体和生物素化的scFv抗体,分别建立了ELISA和BA-ELISA检测方法。本研究建立的免疫学分析方法可以对GCA进行有效的检测,对肝功能的监控具有重要的意义。
[硕士论文] 张苹苹
分析化学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)对DNA中尿嘧啶特异性识别和移除,属于尿嘧啶损伤修复蛋白,它通过识别DNA中的尿嘧啶并切断尿嘧啶与脱氧核糖之间的N-糖苷键来移除尿嘧啶(U)碱基,产生无碱基或无嘧啶(AP)位点,启动碱基切除修复路径,然后结合其他蛋白酶完成整个DNA损伤修复过程。它在碱基切除修复路径中具有重要的作用,可维持基因组完整性。鉴于以上分析,本文利用碱基切除修复的荧光生物传感方法对UDG活性进行灵敏、准确检测。本文共分为三章:
  第一章为绪论,概述了碱基切除的产生原因和机理、UDG的结构和功能、研究意义以及分析归纳了目前关于UDG活性的传统检测方法和新型生物传感检测方法,并指出检测方法中存在的问题。
  第二章构建了一种基于自引物自模板循环滚环扩增(Self-RRCA)策略用于UDG活性的灵敏和准确检测。首先,设计了含有一个U的不成熟的模板链,它与引物链部分互补,形成一个前体扩增子识别探针。经UDG和内切酶Ⅳ(endoⅣ)作用后,前体扩增子探针发生构象转变,进而形成一个RCA扩增子。然后RCA扩增子被用于触发RCA反应,经Nt.BbvCI切刻酶作用,新的扩增子被释放来触发下一轮RCA,这就构成了一个Self-RRCA。在这个方法中,设计的不成熟模板与引物在连接部分不完全互补,这可有效地避免非特异性连接,最终有效地避免非特异性扩增。相比线性RCA,Self-RRCA展现了更高的扩增效率。由于以上优势,本方法实现了UDG的灵敏和准确检测,检测限低至5×10-5UmL-1。而且,这个方法用于筛选UDG抑制剂和分析HeLa细胞裂解液中的UDG活性。这个方法将会提供一种有前景的分析工具用于进一步的UDG生物研究和临床诊断。
  第三章构建了一种基于内源性酶触发的DNA walker用于胞内检测UDG活性。首先,金纳米颗粒上修饰有3'端标记荧光团FAM的且含有U碱基的底物链(SR)和DNA walker链(DW)。由于荧光共振能量转移,金纳米颗粒将SR上荧光淬灭掉。其次,DW上有一部分与SR碱基互补,在目标物UDG作用下,尿嘧啶碱基被移除,产生AP位点。紧接着在AP内切酶(APE1)作用下,将AP位点切割,底物链被切断后荧光恢复。随后,DW继续与下一条SR杂交,产生增强的荧光信号。此策略中,首先,DNAwalker的运行是由胞内内源性酶触发的,无需外加蛋白酶或其他任何物质,保证了DNA walker在胞内的正常运行。其次,由于金纳米颗粒上DNA局部浓度增大,可进一步促进酶切反应和底物链的卸载,这有利于DNA walker的快速反应和荧光释放,最后,由于DNA负载到金纳米颗粒上可有效避免胞内核酸酶对DNA链的降解。本文提出的这一策略将为胞内检测其他DNA修复酶提供一个重要的工具。
[硕士论文] 郝俊
生物工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:介观层次的描述方法已经越来越广泛被用于研究实际的生化反应系统。已有研究表明,细胞内的许多生化反应过程存在大量不可避免的噪声,介观尺度上的系统噪声会使得具有相同基因的细胞变现出复杂的多样性,进而对生命过程的发生起到积极的作用。因此重新考量这类介观层次上的系统行为就成为一个重要的科学问题。
  已有实验和理论研究表明,在介观层次与宏观层次上系统的双稳行为表现出明显差异。但已有工作主要着眼于单一的整体系统,并未具体讨论生化反应系统空间不均匀性对其行为的影响。而已有实验表明,生化反应发生的随机性和反应系统的群体结构(包括系统体积、形状、空间分布等),都是细胞内生物过程中噪声的主要来源。所面对的实际的细胞内生物过程更与其所在的空间结构密切相关。所以,本文引入系统的空间结构,详细讨论了空间结构因素对介观层次上生化反应系统自组织行为的影响,以及自组织临界特征的变化情况。
  首先通过定义距离函数,讨论了系统体积、维度、扩散系数等空间因素对系统稳定性的影响。实验结果表明,对于不存在空间异质性的系统,随着系统体积的增大,双稳性质越来越清晰,系统状态逐渐趋于宏观确定性方程得到的结果。当系统具有非均匀的空间结构时,由于受到空间各点的涨落的影响,存在一个最合适的体积范围,使系统涌现出显著的双稳现象,而且该体积范围与系统维度和扩散系数等因素密切相关。
  然后对空间不均匀的生化反应系统,研究了双负反馈回路的典型系统在分支点附近的行为特征和统计规律,对这些特征和规律的研究有可反过来用于衡量介观系统的临界行为。我们的统计结果显示,由双向负反馈回路产生的双稳系统,其分子聚团规模分布均为指数分布。
[硕士论文] 李铭
化学工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:硒是一种对人类健康极为重要的微量营养物质,在人体内主要以硒蛋白的形式存在,具有抗氧化保护、细胞氧化还原平衡、预防癌症和其他疾病等多种功能和作用。由于生物样品的组成成分比较复杂,硒蛋白占总蛋白的比例非常小(<10-5),因此,建立高灵敏的硒蛋白分离检测方法十分具有挑战性并对开展硒蛋白组学研究具有非常重要的意义。
  本论文建立了一种低温等离子体诱导化学蒸气发生的新型样品引入技术,该技术具有样品进样效率高、有效实现待测元素与复杂基质的分离、避免化学试剂使用、绿色经济等诸多优点。与高灵敏度的原子荧光光谱仪联用,建立了溶液中As、Te、Sb和Se含量的定量分析方法,完成了水系沉积物、紫菜和海带3种国家标准物质的方法学验证,成功应用于富硒酵母粉中总Se含量的测定。
  基于该技术,本论文研制了一款用作Se含量测定的固体样品进样系统的实验设备。利用H2和He放电产生的氢等离子体诱导硒蛋白中硒元素的化学蒸气发生,建立了通过原子荧光光谱仪检测硒含量来间接定量硒蛋白的检测方法,成功完成了牛红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的定量检测。同时,对富硒酵母水溶性蛋白提取液经电泳分离后转印,利用基于低温等离子体技术固体样品进样系统与原子荧光光谱仪的联用系统,对转印膜上蛋白条带进行扫描分析,从而实现了硒蛋白的空间分布分析研究。
[博士论文] 李伟
药物分析学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:蛋白质是一类重要的生物大分子,是生命功能的主要承担者。当具有某种特定功能的蛋白质发生表达异常或功能异常时,可能导致机体发生病变甚至癌变。蛋白质的表达研究能够揭示细胞的生理或病理状态,揭示药物或环境等因素对细胞的影响,帮助我们深入地了解生理和病理现象,了解疾病的发生、发展和治疗效果。而生物样本中特定蛋白质的检测对于疾病的诊断、治疗和药物筛选等也具有十分重要的意义。
  具有诊断和治疗意义的蛋白质通常在体液中的含量极低,加上生物体内源性物质的干扰,这就使得这些蛋白质的检测方法必须具有较高的灵敏度和特异性。目前,常用的蛋白质检测方法包括酶联免疫吸附测试(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、电泳法、质谱法、电化学法和荧光法等。其中,荧光法具有灵敏度高、特异性强和操作简单的优势。
  近年来,以纳米材料扩增技术和核酸扩增技术为基础构建的蛋白质灵敏检测方法为生物样本中蛋白质的分析提供了有利手段。本论文以滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)、杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)和催化发夹自组装(Catalytic hairpin assembly,CHA)等扩增策略为基础,选择血小板源生长因子BB(Platelet-derived growth factor,PDGF-BB)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、干扰素γ(Interferonγ,IFN-γ)和酪氨酸蛋白激酶7(Tyrosine protein kinase7,PTK7)为分析模型,构建了用于生物样本中或细胞膜表面蛋白质检测的新型荧光生物传感方法。本论文主要分为六章:
  第一章为绪论部分,主要概述了蛋白质的功能、检测意义和蛋白质的灵敏检测方法,以及本论文解决的科学问题和主要研究内容。
  第二章,构建了一个新型“自封闭”适体探针,该探针包含两个功能区域:(1)适体序列,位于探针的3'末端,具有目标物识别的功能;(2)信号转导序列,位于探针的5'末端,具有信号转导的功能。另外,探针的适体序列与信号转导序列可部分杂交,具有“自我封闭”的功能。在相同碱基数目的情况下,分子内杂交较分子间杂交更稳定,因此,该“自封闭”适体探针较已报道的阻滞链封闭的适体探针更稳定,有利于降低探针非特异性折叠产生的背景信号。结合链取代扩增反应(Strand displacement amplification,SDA)和双重指数型滚环扩增反应(Dual exponential rolling circle amplification,DE-RCA),我们构建了一个“自封闭”适体探针介导的级联扩增策略,实现了PDGF-BB的超灵敏检测,检测限为0.38fM,线性范围超过6个数量级,优于阻滞链封闭的适体探针介导的相同扩增策略的结果。通过替换探针中的适体序列,本方法还实现了对小分子腺苷的灵敏、特异检测,说明该策略能够拓展用于多种目标物的灵敏分析,在生物检测领域具有较大的应用潜力。
  第三章,构建了一个DNA发夹结构催化组装驱动的三维DNA walker。该walker以核酸修饰的磁纳米颗粒(Magnetic nanobeads,MNBs)为运行轨道,以单纯的DNA杂交反应为驱动力,能够在核酸或蛋白质的触发下自发进行。与酶驱动的三维DNA walker相比,该催化组装驱动的DNA walker更加简单和通用,通过更换识别元素,可用于核酸和蛋白质等生物分子的分析。以Smallpox gene为核酸分析模型,本方法的检测限达4.1fM;以PDGF-BB为蛋白分析模型,检测限达2.3fM,说明该walker体系可用于多种特定目标物的检测,在生物传感领域具有较大的应用价值。
  第四章,构建了一个基于双条码策略和单分子计数的细胞因子多重检测方法。IFN-γ和TNF-α与一系列生理和病理过程如肺结核、HIV感染和黑色素瘤等密切相关,因此被选为分析模型。本方法中,通过抗体-抗原-磁纳米探针复合物的形成引入一级条码链;通过一级条码链触发的多分枝HCR反应产生二级条码链;通过二级条码链捕获荧光探针,产生荧光;通过分别清点荧光点的数目,对目标物进行定量,实现了IFN-γ和TNF-α的同时、灵敏检测,检测限均为5fM。本方法中的条码策略与经典的条码分析方法不同,无需对条码链进行解离和再固定,避免了条码链的损失和交叉杂交。此外,我们利用该方法对人血浆中的IFN-γ和TNF-α进行了同时定量,说明该方法在疾病的早期临床诊断中具有较大的应用潜力。
  第五章,构建了一个结合诱导的切刻酶位点重构策略,用于活细胞表面膜蛋白的定量分析。本方法中,首先,我们设计了一个含有适体序列、触发序列和切刻酶识别位点的适体探针;没有目标物时,适体探针以发夹结构的形式存在,此时,切刻酶识别位点的两段互补序列相互分离,因而不能被切刻酶识别和切割;有目标物时,适体探针与目标物结合绑定诱导探针发生构象转变,同时使切刻酶识别位点发生重构,触发序列暴露;接着,切刻酶识别该位点并进行切割反应,释放触发序列;最后,游离的触发序列在均相条件下触发级联的RCA和HCR反应,生成一条含有多个G-四倍体结构的多分枝DNA聚合物,实现信号的级联放大。本方法实现了PTK7的超灵敏检测,检测限为0.3fM。此外,本也实现了对活细胞表面PTK7的定量分析,并可区分正常细胞和肿瘤细胞以及不同肿瘤细胞之间PTK7的表达差异,说明本方法为活细胞表面膜蛋白的定量检测提供了一个可靠的手段。
  第六章为结论和展望部分,对本论文的研究成果进行了总结和展望。
[硕士论文] 杨世庶
化学;分析化学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:蛋白质磷酸化在调控生命活动中发挥重要作用。利用蛋白组学技术大规模分析磷酸化蛋白的主要障碍在于复杂样品中痕量磷酸化蛋白的高效富集。针对这个问题,研究工作者发展了“自下而上”样品预处理和质谱(MS)分析方法,将蛋白酶解后的磷酸化肽段进行富集,利用质谱实现磷酸化蛋白的检测。此方法的关键在于磷酸化肽段的高选择性富集。目前,已有许多材料和方法策略用于磷酸化肽段的高效富集。但在选择性富集特定磷酸化肽方面进展不多。本论文将二维片层材料应用于富集磷酸化肽,开展了基于埃及蓝和金属有机骨架纳米片的研究工作。具体的研究内容和取得的研究进展如下:
  1、基于剥离的二维埃及蓝纳米片对多磷酸化肽的特异性富集方法研究
  从复杂生物样品中富集低丰度的磷酸化肽对于研究磷酸化蛋白具有重要的意义。但是选择性地富集多磷酸化肽却有很少报道。在本体系中,合成了三种二维纳米片,包括CaCuSi4O10纳米片,SrCuSi4O10纳米片和BaCuSi4O10纳米片,它们是首次应用于富集磷酸化肽。二维CaCuSi4O10纳米片有富集多磷酸化肽的特异性效果,并且在酸度以及有机溶剂比例改变的条件下,这种特异性富集效果不会改变。二维CaCuSi4O10纳米片用于与阿尔茨海默症有关的Tau蛋白的磷酸化蛋白质组分析中,并得到了良好的实验结果。二维CaCuSi4O10纳米片不仅展示了特异性的选择吸附,并且显示了更低的检测限(检测限4×10-7M)。
  2、基于二维金属有机骨架纳米片对磷酸化肽富集方法研究
  蛋白磷酸化参与着许多细胞反应过程,其在调控蛋白活性和功能方面发挥着重要作用。基于质谱(MS)的蛋白质组学是一种有效的检测磷酸化蛋白/磷酸化肽的手段。但是,磷酸化肽的浓度很低(低于1×10-9M),因此从复杂生物样品中检测磷酸化肽面临着巨大的挑战。在本体系中,选取四个基于Ti的三维MOFs(MIL-125和NH2-MIL-125),基于Ti的二维NTU-9纳米片和基于Zr的二维Zr-BTB纳米片。将具有高价态的金属Ti(Ⅳ)和纳米片所具有的特点结合起来是富集磷酸化肽的一种新的研究方法。通过实验得出,NTU-9纳米片展现出高效地富集能力(1∶10000)和极低的检测限(1×10-10M)。最后,运用稳定同位素二甲基标记的方法,将此NTU-9纳米片应用于检测2型糖尿病人血清中磷酸化肽的相对含量测定,并最终用于富集小鼠大脑皮层和脊髓样品中的磷酸化肽段。
[硕士论文] 常玉洁
化学;分析化学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是一种高通量的分析技术,是组学研究的有力工具。近年来,这种技术在快速、高通量筛选生物标志物、药物或污染物等小分子(<700Da)方面受到了关注。但是由于传统有机基质的背景干扰,应用MALDI-TOF MS分析小分子信噪比低、数据重复性差,为了解决上述科学问题,亟需发展背景干扰低、重现性好的新颖质谱基质。在本论文中,开展了二维金属有机骨架纳米片的MALDI-TOF MS基质研究,具体研究内容和主要进展如下:
  1.二维金属有机骨架纳米片基质在高盐度下解吸电离小分子和监测酶促反应
  稳定的二维Zn2(bim)4纳米片(him=苯并咪唑)被用作MALDI-TOF MS的基质。用于分析氨基酸、碱基、神经递质、激素和分子污染物等。二维MOF纳米片提供单层结构稳定、合适的颗粒大小、较大的表面、呈现均一性基质悬浮液。在双离子模式下分析小分子,高覆盖率的质谱图被获得,二维MOF纳米片表现出良好的稳定性、重现性和干净的背景。这优于传统的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质和其他MOF基质。这种基质通常能耐受1000mM的NaCl和NH4HCO3的盐溶液和被成功运用于乙酰胆碱酶活性的监测。
  2.剥离金属有机骨架为纳米片用于超高效检测糖类
  基质辅助激光解吸电离质谱用于快速、准确、高通量检测糖类是必要的,但由于碳水化合物低的电离效率对其是一个挑战。在这项工作中,提出了一个筛选和有针对性的剥离策略,以一系列不同的金属和配体制备的水稳定的MOF作为基质在阳离子模式下检测糖类。此后,选定的NTU-9MOF进一步剥离成二维纳米片。结合材料和二维纳米材料的特点,NTU-9纳米片显示超高电离效率,无背景干扰,良好的分散性和均匀的共结晶特征。在极端的酸性条件下,基质也显示出高的激光解吸电离性能。NTU-9纳米片基质在正离子和负离子的模式下分析了各种小分子。此外,超高效NTU-9纳米片基质被成功应用于血清中的葡萄糖的定量测定。
[硕士论文] 郑康乐
化学工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本研究以蛋白质健康标志物准确定量为目的,将蛋白质定量问题归为总蛋白定量、无需考虑活性的特定靶标蛋白定量及活性靶标蛋白定量三类,分别提出解决方案,较为系统的形成了蛋白质健康标志物准确定量方法体系。
  首先,针对由不同蛋白质混合物作为健康标志物的定量体系,以血清总蛋白测定为例,采用国际公认参考方法进行准确定量。国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)将双缩脲法作为血清总蛋白浓度测定的参考方法,其本身具有操作简单、抗干扰能力强、准确性高等优点。但即使在实验参数以及实验流程都被严格规定的情况下,不同实验室得出的实验数据仍然可能存在较大差异。因此,如何严格的执行参考方法获得准确、可靠的结果具有重要意义。本研究通过对参考方法中各参数进行校准、建立计量溯源性来保证参考方法被准确、严格的执行。在实验过程中,按照参考方法对各参数的要求,使用滤光片标准物质(GBW(E)130225、GBW(E)130226)逐一对实验中使用的紫外-可见分光光度计波长、吸光度进行校准,使用纯水称重法对移液器进行校准;使用蛋白标准品牛血清白蛋白(SRM927)作为血清总蛋白含量溯源依据,以蛋白标准物质牛血清白蛋白(BW3627-1)和冻干人血清白蛋白(GBW09187)作为样品,对双缩脲法的准确性、重复性、再现性、检出限、定量限等方法学数据进行了评价,从而建立准确可靠的血清总蛋白定量方法。并对国际参考实验室室间质量评价活动(RELA)的国际对比血清样品A、B进行了定量测定和不确定度评价。国际比对反馈的结果表明,我们的结果和其它实验室具有很好的一致性,表明了测定方法的准确以及测定技术的可靠性。
  其次,针对由无需考虑活性的单一蛋白健康标志物的准确定量问题,以血清中人心脂肪酸结合蛋白(H-FABP)测定为例,采用同位素稀释质谱法进行准确定量。心肌脂肪酸结合蛋白作为心肌损伤标志物的一种,对其进行准确定量对于心血管疾病诊断治疗具有重要意义。采用质量平衡法和同位素稀释质谱法对心肌脂肪酸结合蛋白进行了纯品含量测定,测定结果分别为0.795g/g和0.781g/g,并对同位素稀释质谱方法的准确性、重复性、不确定度等方法学参数进行了评价。最后,建立了血清中心肌脂肪酸结合蛋白的同位素稀释质谱测定方法,测定结果为2.56ng/g,与ELISA试剂盒的测定结果2.34ng/g具有良好的一致性,同时对该方法的准确性、重复性、加标回收率、检出限以及定量限进行了评价。心肌脂肪酸结合蛋白纯品同位素稀释质谱方法以及血清中心肌脂肪酸结合蛋白同位素稀释质谱方法都可以溯源到SI单位,可以作为心肌脂肪酸结合蛋白纯品标准物质、血清中心肌脂肪酸结合蛋白标准物质的测定方法,对于心肌脂肪酸结合蛋白的测定准确性、互通性具有重要意义。
  最后,针对活性靶标蛋白定量问题,以大豆转基因G2蛋白为例,采用PCR蛋白定量方法进行定量。现今大部分蛋白质的检测方法都需要标准品做标准曲线来进行相对定量,因而无法对活性靶标蛋白进行准确的绝对定量。利用抗原抗体的特异性结合来捕捉活性靶标蛋白质,再利用数字PCR仪作为测定仪器,就可以实现对蛋白质活性靶标蛋白浓度的绝对定量。基于以上设想,在荧光PCR以及数字PCR上进行了蛋白质的相对定量实验以保证绝对定量方法的可行性。本文使用大豆转基因G2蛋白以及G2蛋白的两个不同结合位点的单抗mbA1、mbA2为基础,使用TaqMan(@)蛋白系列试剂盒成功地建立了荧光PCR G2蛋白定量方法以及数字PCR G2蛋白定量方法。并使用G2蛋白标准物质为检测样品,对两种方法的准确性、重复性、再现性、检出限以及定量限进行了评价。并把两种方法的方法学参数和所建立的ELISA法的方法学参数进行了对比,结果表明PCR蛋白定量方法具有较高的准确性和重复性。同时,数字PCR G2蛋白定量方法由于其使用仪器为数字PCR,其结果的准确性和稳定性要比荧光PCRG2蛋白定量法的结果好。另外,由于数字PCR仪能直接给出样品的拷贝数而不依赖于标准曲线,所以对数字PCR蛋白定量方法进行了G2蛋白活性靶标蛋白浓度的绝对定量探究。
[硕士论文] 英晓莉
生物学;遗传学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一种序列上高度保守的蛋白,广泛存在于动物、植物以及真菌体内,具有多种生物功能,包括调节细胞周期的进程和恶性转移、钙结合蛋白、细胞外组胺释放蛋白、抗凋亡等。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)因其清晰的遗传背景以及便捷的实验操作,被广泛应用于生物化学、分子生物学和发育生物学等研究领域,是遗传学研究的重要模式生物。
  我们实验室前期实验发现,小菜蛾的溴氰菊酯抗性品系中TCTP的表达水平与敏感品系相比明显提高,但是TCTP是否与溴氰菊酯抗性相关,目前还没有文献报道。本研究对TCTP在溴氰菊酯、对硫磷和西维因应激中的作用及其与溴氰菊酯耐受的关系进行了初步探索,主要结果如下:
  1)用不同浓度的溴氰菊酯、对硫磷和西维因分别处理果蝇细胞48 h,RT-PCR测定果蝇Kc细胞中TCTP的表达水平。结果表明:在不同种类杀虫剂的处理下,细胞内TCTP基因的表达水平均有升高,其中溴氰菊酯的影响最明显。接着选取适宜浓度的溴氰菊酯,分别将果蝇细胞处理0h,12h,24 h,36 h,48 h,60 h,结果发现,在处理24 h时TCTP的表达量最高。
  2)为了进一步验证TCTP在溴氰菊酯应激下对细胞的保护作用,我们克隆TCTP基因的全长并转染进果蝇细胞,使用RT-PCR技术和Western blot来检测其转染率,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果表明:成功过表达的果蝇细胞与对照组细胞相比细胞的凋亡率明显下降,即对溴氰菊酯的抗性有明显的提高;而用dsRNA敲低TCTP在果蝇细胞中的表达,细胞的凋亡率显著上升,说明对溴氰菊酯的抗性明显下降。
  3)将溴氰菊酯抗性和敏感性品系小菜蛾幼虫分别提取RNA,并解剖头、中肠、脂肪体和肌肉四种组织提RNA,用RT-PCR检测TCTP基因的表达量,结果显示抗性品系整体TCTP表达量高于敏感品系,且头和脂肪体的TCTP基因表达量明显高于敏感性品系,抗性品系中TCTP呈现组成型高水平表达。
  上述结果表明:TCTP基因表达水平与昆虫对杀虫剂耐受之间存在一定的联系。TCTP基因的高表达能增强果蝇Kc细胞对溴氰菊酯的抗性能力,抗溴氰菊酯品系小菜蛾细胞中TCTP组成型高表达。因此,我们推论TCTP基因可能是与溴氰菊酯抗药性相关的候选基因,但是关于TCTP在溴氰菊酯抗药性中的作用机理仍需要深入的探究。
[博士论文] 齐恩凤
应用数学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:随着高通量技术在蛋白质组学中的应用,越来越多的蛋白质在被蛋白酶断裂之后,通过质谱鉴定出来。在这个过程中,需要预先对蛋白质组中的所有蛋白进行模拟酶切,如何选择合适的蛋白酶来对蛋白质进行裂解是非常重要的。用来酶切的蛋白酶要具有很强的特异性,这种特异性通常是在活性位点中通过酶与底物的相互作用来表现的。蛋白酶对裂解底物的特异性是研究蛋白酶的生化性质中很重要的一步,对于理解蛋白酶在新陈代谢以及疾病中所发挥的作用是非常重要的。而随着蛋白酶的底物信息量的增加,如何更全面地获取数据中有用的信息来分析蛋白酶的底物特异性,是生物信息学面临的一大挑战。
  目前,在蛋白酶的特异性研究中,无论是实验方法还是量化分析,通常都是基于这样的假设,即蛋白酶的活性中心区与底物序列上每个氨基酸残基的结合均是一个完全独立的过程。事实上,蛋白酶活性中心某个位点上结合的底物氨基酸残基经常会对别的位点上氨基酸残基的结合起到积极地促进或者消极地抑制作用。现有的量化方法,通常是针对于底物序列中单个位点上的氨基酸信息进行计算,无法反映出位点之间的相互影响。而目前在探讨位点之间关系的文献中,也仅仅是通过实验方法研究了个别蛋白酶在部分位点之间的作用,并没有给出量化的方法来衡量这种合作关系。
  了解位点之间的合作关系是全面理解蛋白酶的活性位点的作用以及怎样确定蛋白酶的活性的基础,同时也有助于开展相关的研究,如鉴定新的底物序列以及设计新的肽段来抑制蛋白酶的活性等。为此,我们首先从MEROPS数据库获取了底物序列信息,为避免假阳性,利用了贪婪算法除去冗余的底物序列,再对有效底物序列信息展开分析,建立了位点之间的组合模型,并给出了分析蛋白酶特异性的算法。另外,在基于底物序列信息的基础上,还提出了量化蛋白酶相似性的一个新方法。
  我们首先针对在底物序列断裂键附近连续位点的氨基酸,提出了一个基于块的量化的方法。结果发现,该数据集中大部分的蛋白酶在其底物断裂键附近常存在有显著性的氨基酸组合。这些组合表明了蛋白酶底物在距离断裂中心比较近的位点比距离断裂中心比较远的位点上具有更强的合作关系。
  在底物序列中的众多位点组合中,以底物的断裂键为中心,我们又提出了一种新的量化方法。我们给出三种类型的位点组合模型,分别是二元组、三元组和四元组。结果发现,在各类型的位点组合中均可以识别出偏好的氨基酸组合。结合了单位点特异性的三种类型的位点组合模型,能够更好的反应蛋白酶的位点组合特性。而且,我们的方法也可以推广到三种类型以外的其他位点组合。
  块的模型和多元位点组合模型主要分析了蛋白酶在底物中偏好的氨基酸组合。我们在分析了蛋白酶底物序列信息的基础上,提出了一个量化方法,首次对各位点之间可能不合作的氨基酸组合进行分析。与其它方法相比,该方法可以明确地找到每个位点上的每个氨基酸对其他位点上氨基酸的不合作性,为蛋白酶的特异性研究提供了一种新的思路。
  利用底物序列数据信息,我们还给出了一个新的衡量蛋白酶的相似性的量化方法。基于每个蛋白酶结合位点上的底物信息,构造出一个L×20维的向量,其中L是位点长度。为了使这个向量尽可能地反映出蛋白酶之间的关系,我们将向量中的元素进行排序,得到一个秩向量。根据秩向量计算得到蛋白酶之间的相似性,用可视化方法将蛋白酶之间的差异性用进化树表现出来。与其它方法相比,在我们构建的进化树中,几乎所有同源的蛋白酶都聚在小分支中,而且属于同一种催化类型的蛋白酶也较为集中的聚在一起,可以更好地反映蛋白酶家族成员之间的亲缘关系。
  综上,在基于底物序列信息的基础上,本文在位点组合模型以及蛋白酶相似性的量化分析中都得到了很好的结果,而且这些方法都具有可推广性,为蛋白酶特异性的研究做出了一定的贡献。同时,这些量化方法将为预测蛋白酶的断裂底物及蛋白酶相关的靶向药物的设计和研发提供理论基础。
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