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[博士论文] 孙福生
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:天然淀粉来源丰富、种类繁多,是主要的可再生和可生物降解的天然高分子化合物。我国是农业大国,淀粉资源非常丰富,但是目前国内的现代淀粉工业技术发展相对较为落后,且产品种类有限;而且,天然的淀粉具有透光率低、冻融稳定性差、对pH值变化过度敏感以及易于老化等缺点,这极大地限制了天然淀粉在现代食品和非食品加工行业的应用。为了解决这些难题,人们根据淀粉的结构和理化性质,运用化学、物理或生物工程等方法对天然淀粉进行处理,使其具有适合某种特殊用途的性质。经过改性之后的淀粉,克服了天然淀粉在实际的应用中所存在的一系列问题。故而要提高天然淀粉的工业化使用价值和经济效益,充分发挥我国淀粉的资源优势,必须对淀粉进行多层次的深加工改造。因此,加快淀粉深加工研究具有十分重要的意义。本研究利用新型添加剂植酸钠和环保型的氧化剂过氧化氢处理淀粉,以求证明植酸钠作为新型小麦淀粉改良剂的可行性,进而阐明植酸钠和过氧化氢对小麦淀粉的影响与作用机理,为植酸钠在改良淀粉方面的应用奠定理论基础,本研究的主要内容和研究结果如下:
  1)本研究以小麦淀粉为原料,利用植酸钠和过氧化氢处理小麦淀粉样品,在交联和氧化两种化学改性方法的基础上,通过复合改性方式制备了四种改性淀粉:交联淀粉(CLWS),氧化淀粉(OWS)以及交联氧化(COWS)和氧化交联(OCWS)的双改性小麦淀粉。首先,确定了植酸钠交联小麦淀粉的最佳工艺条件:在单因素实验中包括温度、交联时间、交联pH值、淀粉乳浓度和植酸钠添加量五个因素,确定反应体系最适温度为50℃、交联时间6 h、交联pH值7、淀粉乳浓度30%和交联剂加入量为2%时,能够达到各因素水平的高结合磷含量交联小麦淀粉。其次,通过正交组合实验,确定影响交联小麦淀粉结合磷含量主要因素的主次顺序为:交联pH值>植酸钠添加量>淀粉乳浓度>交联反应时间>反应温度。第三,通过二次通用旋转正交实验,得到磷含量和各影响因素之间的多元线性回归方程:Y=-0.12+0.049X1+0.023X2+0.3778X3+0.00013X1X2+0.063X1X3+0.0063X2X3-0.089X12-0.00172X22-10.8X32;方差分析显著水平下剔除不显著项后的简化方程式:Y=0.0241X2+0.432X3-0.00172X22-10.8X32-0.0477。
  2)通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、差示扫描量热法(DSC)、快速粘度分析仪(RVA)和扫描电子显微镜(SEM)研究改性后的小麦淀粉在理化性质和功能特性方面的变化。傅里叶红外光谱(FT-IR)分析表明植酸钠和过氧化氢成功的引入了小麦淀粉分子中。XRD检测结果显示,植酸钠的交联反应主要发生在淀粉颗粒的无定形区。DSC分析表明,COWS的峰值温度(TP)为64.41℃,是几种淀粉样品中最高的,说明经过植酸钠交联和过氧化氢氧化的复合改性之后,淀粉分子间的联系更加紧密,需要借助更多的热量来破坏结合力,从而导致峰值温度升高。RVA粘度分析结果表明,CLWS和其它四种样品相比,粘度系数得到了显著提高;三种氧化淀粉样品由于氧化反应作用粘度参数显著降低。在扫描电子显微镜下观察发现,A型和B型小麦淀粉颗粒发生交联反应后颗粒之间的联结更加紧密。
  改性后的小麦淀粉与天然小麦淀粉从溶解度、膨胀势、透光率、冻融稳定性(FTS)等特性方面比较发现,植酸钠交联淀粉具有最大的膨胀势为12.63(g/g)。其中,双改性淀粉 COWS由于氧化程度更高具有最高的溶解度(0.57),并且其透明度(47.72%)远远高于原淀粉(7.54%)。在冻融稳定性的分析中,COWS的失水率为21.62%,是五种样品中最低的,展现了优良的冻融稳定性,这一特性有利于速冻食品的生产。以上研究结果表明,通过添加植酸钠和过氧化氢实现双改性的淀粉样品可以显著改变小麦淀粉的功能特性,在不改变淀粉颗粒内部结构的情况下增强A型和 B型淀粉颗粒之间的连接,本研究为双改性小麦淀粉在工业上的潜在应用奠定了理论基础。
  3)目前,以塑料制品为材料的包装产品对环境造成了严重污染,而应用具有良好的生物降解性并且安全无毒的食品包装材料逐渐成为现代食品包装行业的研究热点。为此,本研究利用得到的五种小麦淀粉样品,通过添加甘油、山梨醇和羧甲基纤维素钠,获得了五种小麦淀粉成膜样品。首先,确定了制备小麦淀粉膜样品的最佳工艺条件:小麦淀粉浓度6.0 g/100 mL,甘油添加量为5.0 g/100 mL,羧甲基纤维素钠(CMC-Na)添加量为0.3 g/100 mL,山梨醇添加量为0.5 g/100 mL。其次,对得到的淀粉膜样品的膜厚度、溶解度、透水性和拉伸应力等理化性质进行研究时发现,双改性交联氧化淀粉膜表现出低厚度、低溶解度、抗拉伸应力强的优良特性,为后期的双改性淀粉的综合利用开辟了新途径。
[硕士论文] 郭宵
发酵工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:小麦芽富含阿拉伯木聚糖(AX),AX及酶解产物分子大小及结构会对麦汁及啤酒的粘度、浊度、过滤速度等产生重要影响,还具有抗肿瘤、提高免疫力等保健作用。β-1,4-木聚糖内切酶是降解AX主链改变AX溶解度、粘度、浊度等特性的关键酶。本文对小麦芽中β-1,4-木聚糖内切酶进行了分离纯化,并研究了β-1,4-木聚糖内切酶对植物源阿拉伯木聚糖的降解作用。主要研究结果如下:
  (1)经硫酸铵沉淀(ASI)、阴离子交换层析、疏水交换层析(HICIII)、凝胶过滤层析,获得了分子量为27.8 kDa,SDS-PAGE电泳条带单一的β-1,4-木聚糖内切酶(E-WMA)。纯化倍数为12.08倍,比活力为4.47 u/mg,回收率为1.45%。
  (2)液相串联质谱分析发现分子量为14.0 kDa的 SDS-PAGE电泳条带也存在与β-1,4-木聚糖内切酶相匹配的肽段,小麦芽中可能存在分子量为14.0 kDa的β-1,4-木聚糖内切酶。
  (3)在40 ℃将硫酸铵沉淀后的β-1,4-木聚糖内切酶(简称ASI)作用于纯小麦芽麦醪,与对照相比,麦汁浊度明显降低,在30 min、90 min、120 min分别降低了7.16%、38.01%和22.22%;水溶性阿拉伯木聚糖(WEAX)含量增高;重均分子量为1.85×103 Da的组分含量变化最显著,作用时间低于30 min时将水不溶的阿拉伯木聚糖(WUAX)转化为重均分子量为1.85×103 Da的WEAX的速率占主导,高于30 min降解1.85×103 Da的WEAX的速率占主导作用。
  (4)在纯小麦芽协定糖化初始阶段加入 ASI,降低了终麦汁过滤时间;但麦汁粘度没有明显变化;ASI使浊度降低30.36%~50.00%。ASI添加量低于0.9 mg/mL时,将WUAX转化为重均分子量1.92×103 Da的WEAX的速率占主导;添加量高于0.9 mg/mL时,降解1.92×103 Da的WEAX的速率占主导。
  (5)疏水层析后得到的β-1,4-木聚糖内切酶(简称HICIII)可将玉米芯中WUAX转化成WEAX,主要产物分子量为1.54×106 Da。HICIII对甘蔗渣中AX有显著降解作用,可将甘蔗渣中WUAX转化为WEAX,还可将WEAX中组分1.20×106 Da降解为组分2.81×104 Da和组分2.18×103 Da。
  (6)E-WMA对低中高粘度的小麦源WEAX都有降解作用,对高粘度的WEAX降解效果最为显著。三种WEAX溶液的浓度为2 mg/mL,高粘度WEAX粘度为2.42 mPa·s,酶解后粘度下降9.92%,Mw由2.07×106 Da的组分降解为3.37×105 Da的组分;低粘度和高粘度WEAX粘度分别为1.77 mPa·s和2.09 mPa·s,酶解后粘度分别下降了5.65%和8.13%。此外,E-WMA可将小麦源的WUAX转化成WEAX,体系粘度增高了1.89%;E-WMA还可以将转化成的WEAX进一步降解,其Mw下降20.77%。
[博士论文] 于康
有机化学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:糖类化合物是地球上结构最为丰富的一类有机物质,广泛地分布于自然界各种动植物以及微生物中,与核酸、蛋白质一起并称为生命体三大基本物质。糖通常与蛋白质或脂类物质缀合,以糖蛋白或糖脂等糖缀合物的形式存在。糖类化合物作为生命体所必需的物质,在生物合成、细胞识别、细胞黏附等生命活动中发挥着重要的作用,与疾病的发生、发展关系密切。
  目前,临床上治疗细菌感染的方式主要是使用抗菌药物,特别是抗生素。但随着抗生素及抗菌药物的长期使用和不合理应用,细菌耐药性问题已变得日益突出。为寻找和发展新的治疗和预防方法,疫苗作为一种预防细菌感染的重要手段以及控制耐药菌扩散的重要措施之一,开始备受人们的重视。
  长期的研究发现,细菌细胞表面被一层糖质所覆盖,被称作细胞糖萼。糖类分子作为细菌表面结构的重要组成物质,在细菌的生存、生长、感染、致病及宿主免疫反应过程中都发挥着重要作用。同时,细菌细胞表面的糖类分子暴露在细胞表面,并具有高度的保守性和一定的免疫原性,因此成为了疫苗研制的理想靶标抗原。
  然而,糖类物质的免疫原性通常较弱,且不能刺激T细胞发生免疫应答,只能与B细胞作用诱导出较弱的免疫应答反应,且不具有免疫记忆效应。这些问题严重阻碍了以细菌表面多糖为靶标抗原的糖疫苗的研发。随着科学技术的发展和研究的深入,上述一些问题得到了有效的解决。例如,研究发现将多糖分子与具有较强免疫原性的蛋白进行共价链接所得到的糖缀合物,能刺激机体产生T细胞依赖的免疫反应,从而发挥良好的免疫效果。目前临床上使用的糖类疫苗多为多糖蛋白缀合物疫苗。
  目前用于制备糖缀合物疫苗的糖分子大多是从细菌的细胞提取获得的。其结构的微观不均一性和杂质的不确定性为糖类缀合物疫苗的构效关系研究、质量控制和安全性研究都带来了困难。此外,天然多糖往往需要通过化学降解方法活化之后,才能与载体分子结合,这进一步提高了用于制备糖缀合疫苗的糖分子的结构不均一性。为克服上述问题,化学合成法已成为一种获得糖抗原的有效途径。本论文对23F血清型肺炎链球菌荚膜多糖和艰难梭菌细胞表面磷酸酯多糖LTA重复单元及其衍生物进行了设计与合成,以便进一步研究这些多糖的结构-免疫学活性之间的关系,以利于寡糖缀合疫苗的研发。论文主要包括以下三部分内容:
  一、首先简要介绍了肺炎链球菌和艰难梭菌的流行病学研究、诊断、治疗和疫苗研发的现状,并对它们细胞表面多糖重复单元的具体化学结构以及其重复单元的衍生物的合成与性能研究工作进行了详细的综述。
  二、23F血清型肺炎链球菌荚膜多糖生物学重复单元的3-氨基丙基寡糖苷的化学合成。目标化合物SP-2由一个分支四糖和一个磷酸甘油侧链组成。首先,我们应用连续糖苷化法策略构建得到了重要四糖中间体SP-5,即:以SP-6作为受体,依次与单糖供体SP-7、SP-8和SP-9进行糖基化反应,从而构建得到四糖骨架。在四糖SP-5的合成过程中,分子内的β-鼠李糖苷键的构建是通过2-甲基萘基(NAP)参与的分子内糖苷配基转移反应来实现的;同时利用苯甲酰基在糖基化过程中的邻基参与作用来实现1,2-trans糖苷键的高效构键。接着,我们又应用亚磷酸三酯法将磷酸甘油侧链SP-4链接到四糖骨架SP-5上,得到全保护四糖SP-3。最后,脱除SP-3分子内的苄基和苄叉基,并将叠氮基还原为氨基,得到目标产物SP-2。目标化合物SP-2的还原端基上含有一个游离氨基,为后续基于SP-2糖缀合物制备及生物学研究提供了便利。
  三、艰难梭菌细胞表面磷酸酯多糖脂磷壁酸(LTA)衍生物的化学合成。基于艰难梭菌细胞表面磷酸酯多糖LTA的具体结构,我们设计了[2+3]和[2+2+3]的合成策略来高效地构建两个LTA目标衍生物,即LTA五糖CD-1和七糖CD-2。其中,重复单元二糖CD-5和CD-6中α-氨基葡萄糖苷键都是通过使用2-叠氮基取代的葡萄糖胺三氯乙酰亚胺酯作为供体与相应的受体反应得到;而在还原端三糖CD-7的合成中,分别尝试了连续糖苷化法和预活化一锅法来合成CD-7,其分子内的β-糖苷键是通过苯甲酰基的邻基参与作用实现的。目标分子中不同寡糖模块间的磷酸二酯键的构建是经由H-膦酸酯法实现的。同样,目标化合物CD-1和CD-2的还原端三糖末端含有一个游离氨基,为后续制备基于CD-1和CD-2的寡糖缀合物奠定了基础。
[硕士论文] 李子强
食品加工与安全 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:枸杞(lycium barbarum)营养成分丰富,糖类作为枸杞中含量最为丰富的营养物质,对它的利用却更多的停留在直接食用阶段,产品种类单一。本实验验证枸杞低聚糖对双歧杆菌的促进作用,目前关于低聚糖开展的研究有:金丝小枣低聚糖、牛蒡低聚糖、大豆低聚糖、大蒜低聚糖对双歧杆菌促进作用,尽管采用植物源性糖促进益生菌研究较多,但关于枸杞低聚糖对双歧杆菌促进作用暂无报道,主要研究结果如下:
  1、以枸杞为原料,经过热水浸提、醇沉、酶解、纯化后所得到的枸杞低聚糖通过气相色谱法进行分析,结果可得:枸杞低聚糖中含有的6种单糖,其中阿拉伯糖、半乳糖含量较高,分别为46.21%、35.21%,枸杞低聚糖通过酶解枸杞多糖的方法获得枸杞低聚糖。与文献结果含量少有少量差距,单糖种类一致。
  2、以枸杞果为原料,通过氨基酸自动分析仪,对枸杞中氨基酸进行测定,共检出16种氨基酸,总氨基酸含量为11g/100g,其中必需氨基酸有7种,人体必需的8种氨基酸中仅有色氨酸未检出。
  3、以枸杞低聚糖及葡萄糖为碳源,通过对活菌数测定,研究不同浓度枸杞低聚糖对双歧杆菌增殖的影响,结果发现:随着浓度增加活菌数也随之增加,当枸杞低聚糖完全代替葡萄糖时活菌数最高,当糖浓度继续增加时,由于渗透压影响,活菌数开始降低,从而得到最适浓度为20g/100m1。
  4、以不同种类糖为碳源,通过对活菌数测定,研究双歧杆菌碳源代谢情况进行探究:分别以20种不同的糖作为双歧杆菌代谢过程中唯一碳源进行培养,发现双歧杆菌可以在其中14种糖中生长,其对碳源利用较乳杆菌更为丰富。
  5、以不同种类糖为碳源,通过对活菌数及吸光值测定,研究枸杞低聚糖对双歧杆菌的体外增殖作用,结果表明:通过对枸杞低聚糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、木糖中生长的双歧杆菌进行生长曲线绘制,在枸杞低聚糖中生长的双歧杆菌有更长的对数期,增殖速率更快,反应结束后菌体浓度更高,并测定增殖过程中溶液的pH变化,发现枸杞低聚糖中生长的双歧杆菌处于对数期时,短链脂肪酸积累更多,pH下降更快,说明枸杞低聚糖提高了双歧杆菌发酵力
  6、以不同种类糖为碳源,对乳糖酶活力进行测定,每6h进行一次乳糖酶活力测定,结果可知:实验中乳糖酶活力最高时为18h,在18h时在枸杞低聚糖中生长的双歧杆菌具有最高的乳糖酶活力。
  7、以枸杞低聚糖及葡萄糖为碳源,对双歧杆菌耐受性测定。模拟胃液pH3.0情况下,枸杞低聚糖对提高双歧杆菌肠道耐受性方面效果明显;在模拟肠液环境下,3h内枸杞低聚糖对双歧杆菌胰蛋白酶耐受性提高显著;在3mg/mL的牛胆盐浓度下,由于双歧杆菌有较强的耐受性,枸杞低聚糖在提高牛胆盐耐受性效果不明显。
  本实验将以枸杞为原料制备低聚糖,探究枸杞低聚糖对双歧杆菌增殖的促进作用。丰富枸杞功能学研究,拓展枸杞产业应用。
[博士论文] 郑芳林
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是由葡萄糖单元通过β-(1,4)糖苷键聚合而成的大分子多糖,是植物和藻类利用光能和二氧化碳进行光合作用的产物。作为植物细胞壁的主要组份,纤维素是地球上含量最丰富的碳水化合物之一。因此,其生物降解不仅构成了自然界碳循环的重要环节,而且也是生物质燃料及大宗生物基产品生产的重要原料。在自然界中存在着众多具有纤维素降解能力的微生物,丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是其中的杰出代表。里氏木霉是一种十分高效的纤维素降解真菌,在纤维素存在的条件下,能迅速做出响应诱导表达大量的纤维素酶基因,以实现对纤维素的高效降解。由于其具备强大的纤维素酶表达能力,因此被开发为重要的纤维素酶工业生产菌株,在生物能源生产领域具有十分重要的价值和地位。虽然经过数十年的诱变育种和研究,已经获得了多个里氏木霉纤维素酶高产菌株,其产酶性能也得到了极大的提高。但是目前纤维素酶的高成本依然是制约生物能源及大宗生物基产品工业化生产的一个瓶颈。因此进一步提升里氏木霉纤维素酶的表达水平和水解效率是解决该问题的根本。
  经过几十年的研究,人们对里氏木霉纤维素酶系的组成、理化性质、水解纤维素的作用机制等均有了较为深入的研究和认识,并且在里氏木霉中也鉴定了多个参与纤维素酶基因表达调控的转录因子,其中包括转录激活因子Xyr1。虽然遗传学分析表明Xyr1控制着几乎所有的纤维素酶基因和半纤维素酶基因的诱导表达,但Xyr1如何激活纤维素酶基因表达的具体作用机制目前尚不清楚。因此,对Xyr1作用机制的深入研究不仅能够使我们更深入地了解里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达调控机制,而且可以为里氏木霉菌株的遗传改良和进一步提高纤维素酶工业生产水平提供理论支持。
  本论文的研究工作围绕Xyr1如何启动纤维素酶基因表达这一问题展开,以Xyr1相互作用蛋白为切入点,同时对可能参与Xyr1转录激活过程的两个复合物的重要亚基的功能进行了深入研究。主要研究结果如下:
  1.通过酵母双杂交筛选,鉴定了一个新的Xyr1相互作用蛋白MATa1。对其功能研究发现,MATa1参与光照下的纤维素酶基因诱导表达调控,并且以依赖Xyr1的方式被募集至纤维素酶基因启动子区参与Xyr1对纤维素酶基因表达的调控。
  为了鉴定参与Xyr1调控纤维素酶基因表达过程的辅因子,我们构建了里氏木霉cDNA表达文库,并通过酵母双杂交筛选获得了一个注释为接合型座位转录因子(mating tpye locus transcription factor)MATa1。细胞定位分析表明,MATa1和Xyr1共定位于细胞核中。通过构建mata1基因敲除菌并分析其纤维素酶诱导表达情况发现,MATa1缺失会降低光照条件下纤维素酶的诱导表达水平,而在黑暗条件下则几乎不影响纤维素酶的表达。与敲除菌株表型相反,MATa1过表达菌株中的纤维素酶诱导受到明显的抑制,暗示过高的胞内MATa1水平可能会干扰Xyr1的功能。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)分析发现,MATa1只有在纤维素诱导条件下才可结合到纤维素酶基因启动子区,而其对信息素前体基因hpp1和信息素受体基因hpr2启动子区的结合则不受碳源的影响。进一步研究发现,在Xyr1缺失背景下,MATa1无法结合纤维素酶基因启动子,表明MATa1在诱导下与纤维素酶基因启动子的结合依赖于转录因子Xyr1。综上所述,我们通过筛选相互作用蛋白的方法并结合体内功能研究鉴定了一个Xyr1相互作用蛋白MATa1,并发现其以Xyr1依赖的方式被招募至纤维素酶基因启动子区参与纤维素酶基因诱导表达调控。
  2.发现里氏木霉乙酰转移酶复合物GCN5/ADA2/ADA3在纤维素酶基因诱导表达过程中发挥重要作用。
  真核生物中,组蛋白乙酰化修饰通常与基因的转录激活相关。本课题组前期鉴了里氏木霉乙酰转移酶GCN5并发现其对于纤维素酶基因诱导表达十分关键。然而GCN5的缺失会对菌体造成很大的影响,如严重影响生长、生孢等基本生命活动,也不便于后续遗传操作和菌种保藏。为了解决这一问题,本研究构建了一个基于铜离子响应、可控表达的启动子置换系统,即通过一步同源双交换的方法将目的基因的启动子置换为铜离子响应的tcu1启动子,通过外源添加铜离子来实现对目的基因表达的控制。通过构建GCN5的启动子置换菌株并进行分析发现,加入铜离子关闭表达呈现与缺失菌一样的表型,这表明该系统是成功的。我们进一步通过生物信息学的方法鉴定了乙酰转移酶复合物的另外两个亚基,Ada2和Ada3,并利用该系统对两者的功能进行了研究。结果发现,关闭Ada2的表达导致纤维素酶诱导表达受到十分严重的影响,说明Ada2在纤维素酶基因表达过程中发挥十分重要的作用。同样地,关闭Ada3的表达对生长造成较大影响,同时也导致纤维素酶表达水平明显下调。综上所述,GCN5/Ada2/Ada3乙酰转移酶复合物参与里氏木霉生长、生孢和纤维素酶表达等生理学过程并在其中发挥着十分重要的作用。
  3.Xyr1通过靶向募集组蛋白乙酰转移酶复合物至纤维素酶基因启动子区调控纤维素酶基因表达。
  通过ChIP分析发现,在纤维素诱导下,纤维素酶基因启动子区的H3K9、H3K14乙酰化修饰同时依赖于GCN5和Xyr1,暗示两者在功能上存在一定程度的关联。通过酵母双杂交分析发现Xyr1与GCN5和Ada3存在相互作用。通过构建ProA-GCN5重组菌株并进行ChIP分析发现,在纤维素诱导下,GCN5能被招募至纤维素酶基因启动子区。进一步分析发现,在Xyr1过表达背景下,即使在非诱导条件,GCN5也能被招募至纤维素酶基因启动子区。由此可见Xyr1很可能通过靶向募集GCN5/Ada2/Ada3乙酰转移酶复合物来介导纤维素酶基因启动子区进行乙酰化修饰促进纤维素酶基因的表达。然而对OExyr1_Ptcu1-gcn5菌株的表型进行分析发现,在Xyr1过表达条件下,无论在诱导下还是非诱导下,关闭GCN5的表达并不影响纤维素酶基因的表达。由此可见,当Xyr1过量表达的情况下,可以摆脱对GCN5的依赖。综上所述,在里氏木霉纤维素酶基因诱导表达过程中,GCN5一方面调控Xyr1的表达,另一方面在纤维素诱导下,表达出来的Xyr1会招募GCN5复合物对纤维素酶基因启动子区进行乙酰化修饰,进一步促进纤维素酶基因的表达。因此,Xyr1表达水平的调控是纤维素酶基因转录表达的一个重要开关。
  4.发现里氏木霉Mediator复合物Gal11亚基差异调控纤维素酶基因的诱导表达。
  在真核生物基因表达过程中,Mediator复合物在基因的转录激活过程中发挥着十分重要的作用,其中尾部模块(Tail module)的Gal11是很多转录激活激活因子结合的靶标。我们通过生物信息学方法鉴定了里氏木霉Mediator复合物亚基的Gal11亚基。通过构建gal1缺失突变体并对其表型进行分析发现,Gal11缺失并不影响菌体在固体和液体培养基中的生长和对多种碳源的利用,但是Gal11缺失突变株基本不产生分生孢子,并且不再产生色素,表明Gal11对于有性生殖和次级代谢具有非常重要的调控作用。对纤维素诱导下的突变体表型进行分析发现,Gal11缺失导致胞外的内切纤维素酶和外切纤维素酶酶活均大幅度降低,但β-葡萄糖苷酶基因的表达并不受Gal11缺失的影响。进一步的转录分析结果表明,上述差异调控现象发生在转录水平,并且Gal11缺失会导致xyr1的转录水平急剧降低。综合上述研究,我们发现里氏木霉Gal11在分生孢子形成、次级代谢过程发挥十分关键的作用,并且差异调控纤维素酶基因的诱导表达,其对外切纤维素酶和内切纤维素酶基因的充分诱导表达是必须的,但不参与β-葡萄糖苷酶基因的诱导表达。
  5.Gal11通过参与对RNA聚合酶Ⅱ的募集和影响Xyr1的稳定性来调控纤维素酶基因表达。
  通过染色质免疫共沉淀技术对Gal11缺失菌中纤维素酶基因启动子调控区的相关因子的募集分析发现,Gal11的缺失导致外切纤维素酶基因和内切纤维素酶基因核心启动子区RNA聚合酶Ⅱ的募集水平急剧降低,然而β-葡萄糖苷酶基因核心启动子区的结合水平则不受影响。进一步分析发现,Gal11缺失后,虽然xyr1转录水平显著降低,但纤维素酶启动子区的Xyr1结合水平反而高于对照菌株,由此可见Gal11缺失导致结合于启动子调控区的Xyr1更加稳定。在Xyr1过表达菌株中缺失Gal11并分析其表型发现,Xyr1的过表达并不能恢复Gal11缺失造成的纤维素酶下调效应。对该菌株在非诱导条件下的表型进行分析发现,Xyr1过表达菌株在缺失Gal11后在葡萄糖培养基中同样几乎无法启动纤维素酶基因的表达。ChIP分析发现,在此条件下,该菌株中Xyr1在纤维素酶基因启动子区的结合水平也要高于出发菌株OExyr1,而RNA聚合酶Ⅱ的募集水平却急剧降低。由此可见,Gal11对于过表达Xyr1菌株在非诱导下高水平激活纤维素酶基因表达是必须的。综合上述结果,我们发现,Gal11在里氏木霉纤维素酶基因的完全诱导表达过程中发挥重要作用,这种作用很大程度上是通过影响RNAPolⅡ的募集来实现的,并且Gal1对Xyr1在启动子上的结合水平具有重要的调控作用,在过表达Xyr1所介导的非诱导条件下纤维素酶基因的高水平表达是必须的。
  6.过表达Xyr1导致纤维素酶基因非诱导依赖的差异化表达。通过转录组测序分析发现过表达Xyr1在非诱导条件下可激活绝大多数的纤维素酶和半纤维素酶基因的表达,同时也造成占全基因组约40%基因的表达下调,其中包括很多基础代谢途径的基因。
  我们之前研究发现,在里氏木霉中过表达Xyr1会造成纤维素酶组成型高水平表达。本研究在里氏木霉QM9414Δxyr1菌株中构建了定点过表达Xyr1的菌株(OExyr1)。该菌株在葡萄糖培养基中的纤维素酶表达速率和总酶活水平均要高于QM9414在诱导下的水平。进一步分析发现,相比较于内切纤维素酶和外切纤维素酶的表达,过表达Xyr1对β-葡萄糖苷酶的激活作用较弱,要显著低于QM9414在诱导条件下的水平。通过染色质免疫共沉淀技术分析发现,在非诱导条件下,过表达Xyr1会导致纤维素酶基因启动子区的核小体占据水平急剧降低,这种核小体丢失的现象在野生型纤维素酶基因诱导表达过程中也同样存在。关闭Xyr1表达后则又能恢复到野生型的水平。这一结果表明Xyr1在激活纤维素酶基因表达过程中的伴随的一个重要事件便是对核小体进行重排和染色质结构进行调控使之变得更为开放。
  为了进一步分析过表达Xyr1对整个基因组基因表达谱式的影响,我们对该菌株在葡萄糖条件下以及QM9414对照菌株在纤维素诱导与葡萄糖非诱导下的转录本样品进行了转录组测序(RNA-Seq)分析。结果表明,在葡萄糖培养条件下,Xyr1过表达菌株下相比QM9414有589个基因表达上调,3637个基因表达下调;在纤维素诱导条件下,QM9414分别有897和1012个基因表达上调或下调。进行聚类分析发现,两个菌株中有334个基因上调基因重叠,其中包括绝大多数的纤维素酶基因和半纤维素酶基因,而参与诱导下纤维素酶基因表达调控的转录因子包括Ace2、Ace3、Clr1、Clr2等,在Xyr1过表达菌株中几乎均未呈现出表达上调现象。由此可见,单独过表达转录因子Xyr1可能便足以启动纤维素酶系基因和半纤维素酶系基因的表达。在QM9414菌株中大多数纤维素诱导表达上调的转运蛋白在OExyr1菌株中均未呈现上调趋势,包括对纤维素酶诱导表达所必须的一个主要协助转运超家族(major facilitator superfamily, MFS)转运蛋白Crt1,这表明Xyr1的过表达可以在某种程度上绕过上游的碳源感应和传导信号途径启动纤维素酶表达。在蛋白折叠分泌途径中发挥重要作用的一些基因如Bip1、Pdi1/2/3、Cne1等,在OExyr1菌株中的表达水平发生明显上调,并且要高于QM9414在诱导下的水平,可见Xyr1的过表达也促进了菌体对纤维素酶的折叠分泌。综合上述转录组数据分析结果可知,在里氏木霉中单独过表达Xyr1在很大程度上摆脱了野生型中纤维素酶基因诱导表达过程中对上游诱导碳源转运和信号传导以及对其他转录因子作用的依赖,并且一定程度上促进了蛋白折叠分泌途径相关蛋白的表达,使该菌株适应持续高水平表达的纤维素酶基因并将胞内大量合成的纤维素酶分泌至胞外。
[博士论文] 王森
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是地球上最丰富的可再生资源,对纤维素的开发利用是人类解决资源能源危机的重要途径之一。纤维素是由β-D-吡喃葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键连接形成的无分支长链,它含有结晶区和非结晶区结构。由于纤维素大分子间、纤维素大分子内部以及纤维素和水分子问氢键的存在,纤维素的结晶区结构难以被降解。纤维素结晶区的破坏被认为是纤维素利用的第一步和限速的关键步骤。微生物对纤维素的降解和转化是自然界碳循环的主要环节,并形成了不同的纤维素降解策略。目前,有两种研究得较清楚的纤维素降解机制:游离纤维素酶机制和纤维小体机制。多数的好氧纤维素降解微生物降解纤维素通过游离纤维素酶机制,其中很多的纤维素酶含有碳水化合物结合结构域(carbohydrate bindingmolecule,CBM)。多数的厌氧微生物降解纤维素通过纤维小体机制,每个纤维小体都含有一个支架蛋白,而每个支架蛋白上都有一个CBM结构域。CBM结构能够结合并增溶结晶纤维素,起到破坏纤维素结晶区的作用。除了CBM外,已发现的能够破坏纤维素结晶区的蛋白还有expansins,expansin-like protein,swollenins, lytic polysaccharide monooxygenases(LPMOs)等。
  Cytophaga hutchinsonii是一种广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌,能够高效地降解结晶纤维素,如滤纸和棉纤维等。分析C.hutchinsonii的基因组序列发现它没有外切纤维素酶,并且内切纤维素酶都不含CBM结构。C.hutchinsonii降解纤维索需要与纤维素底物直接接触,且大多数的纤维索酶活都是细胞偶联的。基因组分析显示它也不含有编码纤维小体特征的锚定(dockerin)或粘附(cohesion)结构域。因此,C.hutchinsonii可能采用一种全新的且未知的纤维素降解机制,其小同于已知的游离纤维素酶机制和纤维小体机制。C.hutchinsonii能够利用葡萄糖、纤维寡糖和纤维素作为底物生长,然而,在以纤维素为唯一碳源生长时在其培养基上清中未检测到还原糖产物的积累。推测C.hutchinsonii可能的纤维素降解机制:在它的细胞表面可能存在一个蛋白复合体能够将单个的纤维素链从纤维素上剥离并转运到周质空问,在周质空问中纤维素链被纤维素酶降解。C.hutchinsonii能够降解结晶纤维素,然而,除了CBM,它也不含有expansins,expansin-like protein,swollenins和LPMOs等能够破坏纤维素结晶区的蛋白,其破坏纤维素结晶区结构的机制未知。
  近几年,随着C.hutchinsonii遗传操作技术的不断发展,其纤维素降解机制的研究有了一定的进展。本文首先尝试了对C.hutchinsonii遗传操作技术的改进,获得了一种基于FLP/FRT重组系统的外源DNA插入整合到基因组特定位点上的方法;同时,利用转座子插入突变方法筛选到2个参与C.hutchinsonii纤维素降解的关键基因,并分别对其基因功能进行了深入研究。在此基础上,也探讨了C.hutchinsonii降解纤维素结晶区的影响因素。这些工作对揭示C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制有重要的意义。具体内容如下:
  1.建立了一种基于FLP/FRT重组系统的外源DNA插入整合技术
  目前,在C.hutchinsonii中表达外源基因常用质粒作为载体,然而质粒存在不稳定、需要添加抗生素维持其存在等缺点。前期,实验室也利用线性DNA双交换同源重组的方法成功地将外源DNA片段整合到C.hutchinsonii的基因组上,但是较长的同源片段限制了外源DNA片段的大小,不利于大片段DNA的整合。来源于Saccharomyces cerevisiae的FLP/FRT位点专一性重组系统是最有效的遗传工具之一,广泛应用于基因敲除、基因重组等领域。实验室前期成功地将FLP/FRT重组系统改造应用于C.hutchinsonii中,实现了基因的无标记敲除。
  本文利用FLP重组酶可以识别基因组上的和环形片段上的FRT位点,使得环形片段整合到基因组上的特点,建立了一种可以将外源DNA片段插入整合到C.hutchinsonii基因组上的技术。首先,我们在C.hutchinsonii的一个假基因(chu_3328)位置插入一个FRT位点,构建了一个含有单一FRT位点的出发菌株。同时也构建了一个含有单一FRT位点的自杀质粒,通过FLP重组酶的作用可以将自杀质粒整合到chu3328位置。我们用此方法成功地将lacZ基因整合到了C.hutchinsonii基因组上并表达。此方法将外源 DNA片段整合到C.hutchinsonii的基因组的特定位点,不需要额外添加抗生素维持其稳定,遗传背景清晰明确;仅需要FRT位点的存在就可以完成整合,不需要较长同源臂的存在。实验室前期建立的基于FLP/FRT重组系统的无标记敲除技术在敲除目的基因后会存在一个FRT位点,而我们也可以利用此FRT位点成功实现基因的原位回补,此方法比质粒回补或双交换回补操作更简单,结果更稳定。
  2.chu3220基因功能研究
  C.hutchinsonii基因组含有3790个开放阅读框,其中仅1986个通过预测进行了功能注释。前期,实验室建立了转座子插入突变的方法筛选与纤维素降解相关的基因。我们利用转座子HimarEm3插入突变的方法筛选到一株纤维素降解缺陷菌株。反向PCR确定转座子插入位点为chu3220。敲除chu3220后获得突变株Δ3220,验证其纤维素降解表型与插入突变缺陷菌株一致。RT-PCR显示Δ3220中chu3220的临近基因的转录未受到chu3220敲除的影响,说明chu3220是结晶纤维素降解的关键基因。
  分析△3220在不同碳源中的生长情况,发现突变株在葡萄糖、纤维二糖和无定型纤维素中生长速率和最大生物量都不低于野生型,但是在Avicel中的生长速率和最大生物量都明显低于野生型,说明了chu3220的缺失影响C.hutchinsonii对纤维素结晶区的降解。X光衍射(X-ray diffraction, XRD)检测Avicel的结晶度发现野生型处理后的Avicel结晶度降低,而突变株处理后的Avicel结晶度升高。扫面电子显微镜(SEM)检测Avicel表面形态,发现Avicel表面粗糙不规则,而野生型处理后的Avicel表面光滑整齐,推测C.hutchinsonii通过一种“剥皮”方式降解纤维素的结晶区和非结晶区。观察突变株处理后的Avicel表面时发现它和未处理的Avicel表面类似,都比较的粗糙且不规则。通过检测突变株的生长、Avicel结晶度变化和表面形态变化说明了chu3220是C.hutchinsonii降解纤维素结晶区的关键基因。
  CHU_3220的分子量为205 kDa,是一个未知功能蛋白,含有一个CHU_C结构域和15个PbH l结构域。实验发现CHU_3220的CHU C结构与其蛋白定位相火,而 PbHl推测与蛋白的相互作用相关。CHU_3220定位于细胞外表面,是一个纤维素结合蛋白,其表达水平受到纤维素的诱导。chu3220敲除后突变株的细胞表面内切纤维素酶酶活明显降低,然而,这些内切纤维素酶的转录水平也明显的降低。CHU_3220与已知的纤维小体的支架蛋白有很多的相似性,但并未找到CHU_3220与内切纤维素酶相互作用的证据。综合以上结果,我们推测CHU_3220可能是C.hutchinsonii细胞表面的蛋白复合体的组成成分,起到剥离单个纤维素链,破坏纤维素结晶区的作用。
  同时,本文也使用了离子色谱检测C.hutchinsonii的纤维素降解产物。野生型在Avicel中培养5h后,检测其培养基上清发现了葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖,说明C.hutchinsonii细胞表面的纤维素酶能够部分降解纤维素。然而,随着时问延长,培养基中的还原糖逐渐减少,在24 h时检测不到还原糖的存在。同时,我们也检测了C.hutchinsonii在24 h时的胞内还原糖,发现了葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖的存在,说明了C.hutchinsonii能够将纤维寡糖转运到周质空间进行降解。检测突变株的胞内还原糖时也发现了纤维寡糖的存在,说明了CHU_3220的缺失不影响纤维寡糖的转运。
  除了破坏纤维素氢键相关的蛋白外,C.hutchinsonii破坏纤维素结晶区结构还需要ATP的供应和完整细胞结构的存在。在培养基中添加NaN3后,C.hutchinsonii不能降解结晶纤维素,但是能够降解无定型纤维素,说明结晶区的破坏需要能量。TritonX-100能够破坏细胞的膜结构,但不影响蛋白间的相互作用。使用Triton X-100处理C.hutchinsonii细胞后发现其处理后的纤维素结晶度升高,说明纤维素的无定型区被降解。与已知的纤维素结晶区利用方式不同,C.hutchinsonii降解纤维素结晶区不仅依靠参与纤维素结晶区破坏的相关蛋白,还需要完整的细胞结构和能量的供应。
  3.chu_1557基因功能研究
  chu_1557是通过HimarEm3转座子筛选到的另一个影响C.hutchinsonii纤维素降解相关的基因。chu_1557基因定点敲除(Δ1557)后,RT-PCR检测发现chu_1557的缺失未影响前后基因的转录。CHU_1557的分了量为391.4kDa,是一个未知功能蛋白,含有一个N-端信号肽和C-端保守结构域(C-terminaldomain,CTD),可能通过Ⅸ型分泌系统(typeⅨ secretion system.T9SS)穿越外膜并锚定于细胞外膜的A-LPS上。通过Western blot定位CHU_1557,发现其位于细胞外膜的外表面,且是一个纤维索结合蛋白。检测野生型在葡萄糖培养条件下的chu_1557表达水平变化,发现chu_1557在延滞期表达水平明显上调,而在对数期表达水平下降,说明chu1557可能与C.hutchinsonii的启动生长相关。而在纤维素培养条件下,其对数期表达水平仍然上调,说明其与纤维素降解密切相关。
  检测△1557的生长时发现突变株的延滞期与葡萄糖浓度相关。在高浓度葡萄糖(0.4%,w/v)培养条件下突变株的延滞期和野生型相差不大,而在低浓度葡萄糖(0.1%,w/v)培养条件下突变株的延滞期比野生型长60 h。将突变株分别用不同的葡萄糖浓度培养,发现随着葡萄糖浓度的升高,突变株的延滞期降低,在达到0.4%(w/v)时突变株的延滞期最短。同时,将低浓度葡萄糖培养后的突变株再接种到低浓度葡萄糖条件下培养,发现突变株的延滞期明显缩短。在以无定型纤维素和结晶纤维素为碳源的培养基中,突变株的延滞期比野生型长约72 h,而低浓度葡萄糖预培养的突变株其延滞期也明显缩短,和野生型相差不大。低浓度和高浓度葡萄糖预培养的突变株在结晶纤维素中的最大生物量分别为野生型的33%和62%,说明突变株能够利用部分的结晶纤维素。
  检测突变株的葡萄糖吸收情况时发现CHU_1557影响C.hutchinsonii对低浓度葡萄糖的吸收,但不影响对高浓度葡萄糖的吸收,且低浓度预培养的突变株其对低浓度葡萄糖的吸收速率与野生型相似。纤维素结晶区的破坏需要能量,CHU_1557的缺失导致葡萄糖的吸收速率降低,影响了突变株破坏纤维素结晶区的能量供应。检测突变株的胞内ATP水平时发现明显少于野生型的,而在测定其ATP合成酶组分的转录水平时发现均无下降,说明了CHU_1557的缺失导致突变株需要更多的能量供其生长。由此推测CHU1557的两方面作用:一是影响了胞外低浓度葡萄糖的吸收,导致合成的ATP减少;二是CHU_1557作为细胞表面蛋白复合体的组分消耗能量参与破坏纤维素结晶区的降解,突变株的生长需要消耗更多的ATP,导致突变株胞内ATP水平明显小于野生型。突变株因无充足的能量供应导致其降解结晶纤维素效率降低,而在提供更多的能量如添加葡萄糖或低浓度葡萄糖预培养时会有助于突变株降解结晶纤维素。
  本文首先在C.hutchinsonii中建立了基于FLP/FRT重纰系统的外源DNA插入整合技术,此方法消除了质粒遗传不稳定性的特点,且能够利用基于FLP/FRT重组系统构建的无痕敲除所产生的的单一FRT位点,实现敲除基因的原位回补和目的基因的表达。C.hutchinsonii能够高效地降解结晶纤维素,但是具体机制并不清楚。本文通过分析胞内和胞外的纤维素水解产物发现C.hutchinsonii能够通过胞内降解和细胞表面降解两条途径降解纤维素。纤维素结晶区的破坏是纤维素降解的限速步骤,本文通过插入突变的方法首次筛选到两个影响纤维素结晶区降解的关键基因chu_3220和chu_1557。研究发现CHU_3220和CHU_1557可能是细胞表而的蛋白复合体的重要组分,而此蛋白复合体可能负责纤维素结晶区纤维素链的剥离。我们发现纤维素结晶区的破坏除需要结晶区降解相关蛋白参与外,还需要完整的活细胞提供能量。C.hutchinsonii的纤维素降解机制明显不同于已发现的游离纤维素酶降解系统和纤维小体降解系统,本文对C.hutchinsonii降解纤维素结晶区的研究,促进了我们对C.hutchinsonii新型纤维素降解机制的了解,也将对纤维素资源的高效转化利用具有积极的推动作用。
[硕士论文] 陈玉
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:植物生物质作为地球上最丰富的可再生资源之一,实现它的快速降解转化,对于保证地球碳素的正常循环至关重要。植物生物质主要由木素、半纤维素、纤维素、果胶、植物糖蛋白等多种化合物构成,其中结晶纤维素形成细胞壁的骨架结构。为了加速植物生物质的有效利用,必须充分了解天然纤维素抗降解屏障的结构层次;抗降解屏障是如何影响物化、生物等处理过程;微生物分泌的多种纤维素酶系在天然纤维素降解中的功能。本文借助超微分析可视化手段,从生物大分子结构层次探究了不同纤维素处理方式的降解效率及其对底物结构的影响;结合生物信息学方法,分析了T.reesei三种主要内切纤维素酶降解天然纤维素的主要过程。本文主要内容及研究结果如下:
  (1)天然纤维素抗降解屏障结构层次探究表明结晶纤维素的降解是由表及里的非均相过程,微纤丝聚集结构层次的破坏是结晶纤维素降解的关键步骤
  采用稀盐酸、T.reesei胞外游离酶系、C.thermocellum LQR1三种常用的纤维素降解方法对CF11棉花纤维进行降解,超微结构显示CF11底物表面微纤丝结构被破坏,内部微纤丝聚集紧密。稀盐酸降解后微纤丝内部聚集出现较明显变化,即微纤丝束间出现间隙;酶解和菌解微纤丝内部完整,但经过菌解后底物纤维直径大幅减小。再次利用纤维素酶/菌降解上述预处理底物,发现稀盐酸预处理底物的酶解转化率提高,暗示稀盐酸预处理破坏纤维素四级聚集结构,打开了酶分子进入内部的降解通道;C.thermocellum LQR1再水解四种处理底物的转化率仍保持80%左右,各处理底物再水解转化率没有显著差异,推测C.thermocellum LQR1能够直接降解天然纤维素的微纤丝,预处理技术可以省略,但是适当的纤维素酶预处理可以进一步提高纤维素降解菌的降解效率。
  (2)T.reesei三种主要EGs所在GH家族活性架构、异源表达EGs理化性质及协同性分析
  利用大肠杆菌异源表达系统表达T.reesei三种主要内切纤维素酶EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ,对其生物学性质包括内切纤维素酶活性、最适反应条件等进行了测定,结果显示异源表达得到的内切纤维素酶理化性质、生物学活性与野生型内切纤维素酶基本一致。利用生物信息学手段对比分析了三种内切纤维素酶所在GH家族活性架构关键AA种类、数目和保守性,对EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ结构差异进行归纳。另外,结合可溶性纤维素底物降解实验发现三种内切纤维素酶能够协同降解可溶性底物,底物结构的变化对不同内切酶降解效率、内切酶协同性产生不同影响,猜测不同内切纤维素酶的活性中心具有适合降解的特定底物扭曲构象,而这些构象存在于天然纤维素中。
  (3) EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ降解纤维素底物特异性的超微结构分析
  利用异源表达的EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ对不溶性天然纤维素进行降解处理,结合超微分析可视化手段观察底物表面结构特征。以CF11为底物时酶解后底物表面出现凸起颗粒,经鉴定是未降解的微纤丝片段。测量发现凸起的长度分布范围在三种内切纤维素酶降解底物中存在特异性,EGⅠ产生片段长度最大,EGⅡ、EGⅢ之间没有显著差异。EP-CF11经过降解后表面没有产生明显的谷粒状凸起,而是形成了一些短的微纤丝片段,同样对这些片段长度统计发现结果与CF11作为底物时类似,推测同一来源的纤维素其非晶区和结晶区纤维素具有相同的扭曲构象。另外根据图像分析,EGⅠ应该具备较强的结晶纤维素润涨能力
[硕士论文] 吴敏
生物物理 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:我国光皮木瓜资源丰富,其果实不仅是传统的中药,经过加工后制成的罐头、果汁、果酒等深受消费者喜爱。但是长期以来,人们对光皮木瓜成分的研究局限于多酚、黄酮类物质上,鲜有对其中的多糖类物质的报道。本论文以预处理过的光皮木瓜为原料,以对高压水热法初步分离产物的研究为起点,对光皮木瓜中水溶性多糖和木聚糖的结构及其应用价值进行研究,旨在为光皮木瓜的综合利用提供理论指导和数据支持,主要结论如下:
  (1)采用高压水热法(HCW)提取光皮木瓜多糖,研究温度、时间、料液比对得率的影响,并进一步研究温度对各部分结构的影响。结果表明,适当的高温、适当延长提取时间和减少料液比有利于醇沉多糖PA的获取;在120-150℃范围内,固体残渣(SR)和醇沉多糖(PA)具有相似的结构;高温有利于半纤维素的溶解,但并不能使半纤维素和木聚糖成分有效的降解。
  (2)利用经过在135℃,料液比为1:10条件下,提取45 min后醇沉制得的PA为原料,进一步经过DEAE-52纯化后得到一个中性糖片段CSP-1和两个酸性多糖片段CSP-2、CSP-3,并利用FT-IR、NMR、GC-MS、AFM、SEM、TGA等技术对三种多糖的初级结构、形貌和热稳定性分析。由结果可知,CSP-1的主要单糖成分为阿拉伯糖(Ara),摩尔百分含量占45.4%,CSP-2和CSP-3主要为GlaA,摩尔百分含量分别为53.23%和73.62%;红外结果显示三种多糖同时存在吡喃糖和呋喃糖形式,主要为α-糖苷键;CSP-1为分子量不均一多糖,CSP-2和CSP-3分子量均一,其分子量分别为59.1 kDa和57.9 kDa;扫描电子显微镜(SEM)观察到CSP-1结构疏松,带有孔洞和连接微球的细丝,CSP-2和CSP-2由于大量糖醛酸的存在紧密堆积成片层状;在原子力显微镜(AFM)下观察,三种多糖链相互缠绕、卷曲成球形。
  (3)利用甲基化及核磁共振(NMR)技术进一步研究CSP-2中的糖苷键连接,发现 CSP-2骨架由光滑区( Homogalacturon, HG)和须状区-I(rhamnogalaturonan-I,RG-I)构成。HG区域的GalpA部分甲酯化或在C-2/C-3位置发生乙酰化取代,在须状区域中的Rha全部发生O-4取代;侧链主要由半乳聚糖、阿拉伯糖和阿拉伯半乳聚糖构成,同时含有少量的葡萄聚糖和甘露糖。
  (4)利用梯度乙醇法(30%、50%、70%和90%)对光皮木瓜中木聚糖进行了分级纯化,依次得到UPX30、UPX50、UPX70和UPX90;以经过HCW处理的SR为原料,用同样的方法依次得到PX30、PX50、PX70和PX90。研究结果表明:较低浓度乙醇能够沉淀出线性聚合度高且分子量较大的木聚糖,经过高压水热处理后得到的木聚糖整体分子量偏大,并且木糖(Xyl)含量较高;利用化学法和红外、二维核磁波谱对UPX30和PX30的一级结构进行解析,推测两种木聚糖均以1,4-β-D-Xylp为主链,部分Xyl在O-2位置被4-O-甲基-D-GluAp取代,同时还含有Ara和Gal的侧链。
  (5)光皮木瓜多糖的抗氧化活性表现出浓度依赖性,糖醛酸的存在能够提高多糖的羟自由基清除能力;经过DEAE-52纯化过的多糖的总还原能力明显弱于纯化前;CSP和CSP-1能够清除DPPH能力强于酸性多糖。通过化学交联丙烯酸单体制备的木聚糖水凝胶,在偏中性以及较低的离子浓度中,吸水率较高,其在蒸馏水中吸水率最高可达59.5倍。
[硕士论文] 付玄
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)是哺乳动物中普遍存在的天然杂多糖,结构上由二糖重复单元连接而成,以蛋白聚糖或游离形式存在。糖胺聚糖的重要生理功能及其与重大疾病的密切关系近年来受到国内外科学家的广泛关注。透明质酸(hyaluronan,HA)是结构最简单的糖胺聚糖,由二糖重复单位[-D-glucuronic acid-β1,3-N-acetyl-D-glucosamine-β1,4-]连接而成,不同于其他糖胺聚糖,透明质酸没有硫酸化修饰且不与蛋白共价结合,以游离形式存在。
  HA广泛存在于动物组织及某些微生物中,由于其良好的保水性、粘弹性和生物相容性,已经广泛应用于保健品、化妆品及医药等领域。近年来研究发现,HA除了作为细胞外基质的结构组成外,还参与了细胞识别、信号转导等重要生理过程,在肿瘤的发生、发展及炎症反应过程中发挥了多重生物效应。代谢异常是肿瘤的重要特征,肿瘤微环境中,HA合成和降解的动态平衡发生异常,糖链长度变化是一个重要体现,也是肿瘤恶性程度的评价指标之一。肿瘤细胞表面存在大量HA特异性受体和结合蛋白,HA通过与受体或结合蛋白的相互作用,激活细胞内多条信号通路,参与肿瘤发生发展和炎症反应等生物效应过程。尤为值得关注的是,有别于其它生物效应分子的合成后修饰过程,HA的生物活性受其糖链长度的调控,不同糖链长短的HA表现出截然不同的生物效应。受生物体内多糖合成过程的影响,商品化HA具有高度不均一性(分子量分布范围较宽且呈弥散性分布),严重阻碍了HA生物学功能的正确表述。
  目前,商品化HA的生产方法主要有两种。一是动物组织提取,这种技术产量较低,且存在动物原料受限和动物病毒残存问题。二是微生物发酵,用这种方法生产HA成本低、规模大且不受原料的限制,但存在细菌内毒素、核酸、蛋白质及重金属污染的风险。上述方法在商品化HA的制备方面得到了较大发展,但在均一化HA的精细化制备方面还极具挑战性。
  本论文围绕均一HA的制备这一科学问题,对巴斯德氏菌来源的透明质酸合酶(PmHAS)的催化反应机理进行了深入研究,采用逐步酶法合成HA寡糖片段和一步法同步化合成均一HA,发展了均一HA的两步偶联酶法合成策略。论文第二章节通过深入研究PmHAS的催化反应机理,发现PmHAS催化新生HA糖链合成过程中存在起始限速步骤,造成了产物的高度不均一性。通过对PmHAS的底物选择性分析,发现透明质酸三糖是PmHAS催化合成均一HA所必需的最小受体底物;进一步研究发现,催化反应体系中受体与供体的摩尔浓度比例是影响HA糖链长度的关键因素,通过对反应体系中受体/供体摩尔浓度进行化学计量控制,实现了均一HA的糖链长度可控酶法合成。随后进一步拓展了均一HA酶法合成策略在化学结构明确、HA糖链长度可控的HA缀合物制备领域的应用。制备了生物素标记的透明质酸(HA-biotin conjugates)以及透明质酸-药物缀合物(HA-oroxylin conjugates)。HA-biotin conjugates能够作为分子探针,对外源HA的细胞内代谢过程进行可视化检测;HA-oroxylin conjugates作为模式药物,为HA修饰抗肿瘤靶向药物的研发奠定了基础。
  论文第三章开展了透明质酸一硫酸软骨素(HA-CS)嵌合型糖胺聚糖的合成。由于HA与CS结构的相似性及PmHAS灵活的底物适应性,通过逐步反应的方法合成了CS2HA2-N3、 HA2CS2HA2-N3、CS2HA4-N3和CS4HA4-N3四种HA-CS嵌合型糖胺聚糖,用于研究微观结构改变对HA生物功能的影响。该方法也可应用于其他不同嵌合型糖胺聚糖的合成中,为嵌合型糖胺聚糖的生物功能研究奠定了基础。
  论文第四章节中,结合本实验室在糖核苷酸酶法合成方面的工作基础,建立了一种以单糖为起始的多酶偶联的HA合成策略。以廉价单糖GlcNAc和GlcA为起始底物,将糖核苷酸的酶法合成与透明质酸的聚合反应相偶联,一锅多酶催化高效合成HA。并利用此方法成功合成了HA衍生物,用于交联HA的制备和应用研究,具有十分广阔的应用前景。
[硕士论文] 刘桐桐
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:GDP-岩藻糖是在细胞质内合成的。而后被GDP-岩藻糖转运体转运至高尔基体内,在岩藻糖基转移酶的催化下,完成岩藻糖基化修饰。岩藻糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式之一,其对糖蛋白功能发挥重要调节作用。
  在本研究以成熟B细胞受体(BCR)转基因细胞模型(3-83细胞)作为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统,设计含有两个GDP-岩藻糖转运体基因(Slc35c1)敲除gRNA序列的pGS-U6-gRNA载体,通过凝集素印记等实验,筛选最佳gRNA干扰序列。利用脂质体转染技术,把载体导入至3-83细胞后经过G418筛选,挑选单克隆并扩大培养,经免疫印迹技术鉴定稳定遗传的Slc35c1基因敲除3-83细胞模型(Slc35c1-3-83-KO)。为建立GDP-岩藻糖转运体基因恢复细胞模型,将Slc35c1基因导入基因敲除细胞中,并连接至另一种病毒载体(pLHCX),通过梭华试剂将其导入到Slc35c1-3-83-KO细胞中,经过200μg/ml潮霉素筛选,获得Slc35c1基因恢复模型(Slc35c1-3-83-KO-Re)。利用3-83细胞、Slc35c1-3-83-KO细胞及Slc35c1-3-83-KO-Re细胞,通过MTT及细胞粘附实验,从细胞整体水平上检测比较三种细胞的细胞增殖及细胞粘附能力,从而探究GDP-岩藻糖转运体对成熟B细胞生物学功能的调节作用。结果显示,Slc35c1-3-83-KO的整体岩藻糖基化及核心岩藻糖基化水平、细胞增殖、细胞粘附能力显著低于正常3-83细胞,而在Slc35c1-3-83-KO-Re细胞中其功能得到恢复,提示GDP-岩藻糖转运体介导的岩藻糖基化修饰对成熟B细胞粘附及增殖具有重要调控作用。
[硕士论文] 王波
中药学 西北大学 2017(学位年度)
摘要:糖类物质有着重要的生物学功能,如参与细胞识别、信号转导及与受体的相互作用等。质谱(MS)已在生物大分子的分析检测中得到广泛应用。但是由于生物来源糖链结构高度复杂、表达具有微观不均一性,具有多羟基,有的含唾液酸,极性大,影响其在MS分析时的离子化效率和检测灵敏度。通过化学衍生法改善糖链疏水性或电离特性,可提高样品在MS检测分析中的离子化效率和分析灵敏度。但现有衍生化反应一般需要多个步骤和处理过程(唾液酸易丢失),样品用量较大,需纯化富集才能进行MS分析,不利于微量生物来源寡糖链的分析和检测。因而,已有研究利用MALDI-TOF-MS分析样品时基质(含三氟乙酸)作催化剂,在靶板上对还原性糖链与氨基类试剂在室温条件下进行标记,待靶板干燥,即可直接进行后续MALDI-TOF-MS分析。但是,该类方法存在衍生化效率低、唾液酸易丢失等缺陷。基于此,本研究选用肼基衍生化试剂,在生理条件下与还原性糖链进行标记,拟建立还原性糖链靶板直接衍生化用于提高MALDI-TOF-MS灵敏度的分析方法,解决现有靶板衍生化效率低,唾液酸易丢失的缺陷。结果如下:
  (1)以乳糖为标准,优化了吉拉德T(Girard's T,GT)靶板衍生化条件。建立了靶板直接衍生化用于提高还原性糖MALDI-TOF-MS灵敏度分析的方法。以Maltodextrin为标准糖链,经GT衍生化后,MALDI-TOF-MS检测衍生化效率为95%。对方法的线性范围、检测限、重复性和稳定性进行了评估。结果表明:在128倍浓度范围内(0.78nmol/mL-10.00μmol/mL)方法稳定(R2=0.9992);重复性良好(RSD=3.06%);在10天之内,检测稳定性良好(RSD=2.95%),最低检测限为0.15ng。采用内标法定量,结果显示乳糖、来源于Ovalbumin和RNase B的N-糖链衍生化后质谱检测灵敏度分别提高了22.92、10.20和9.17倍。将方法应用于羊乳总蛋白N-糖链和人乳游离寡糖链靶板衍生化分析。结果显示,衍生化后可以同时检测中性糖和唾液酸化糖链,未发现唾液酸丢失现象;并且可以检测出低丰度糖链(未衍生化时检测不到),提高了质谱分析灵敏度。
  (2)本研究选用不同电荷性质的8种肼基试剂(吉拉德P、吉拉德T、苯肼、苯磺酰肼、苯甲酰肼、氨基硫脲、4-苯基-3-氨基硫脲、4-肼基苯甲酸),对还原性糖链靶板衍生化效率和后续质谱效果进行比较分析。以Maltodextrin和胎牛血清N-糖链为标准糖链进行衍生化效率对比。结果表明:在等摩尔量衍生化试剂条件下,对于中性糖Maltodextrin靶板衍生化后,试剂的靶板衍生化效率由高到低依次为:GP=GT>PNH>BZH=TSC>PTSC=HBA>BSH;对于唾液酸化N-糖链(胎牛血清)靶板衍生化后,试剂的衍生化效率由高到低依次为GP>GT>PNH>BSH>PTSC>HBA>BZH>TSC。结果表明,GP适宜于中性和酸性糖的靶板衍生化,且不引起唾液酸丢失。胎牛血清N-糖链经GP衍生化后检测灵敏度提高了14.00倍,最低检测限为75.00 pg。该方法已成功应用于微量样品(大豆总蛋白、鸡蛋蛋黄糖肽、人体血清)N-糖链的检测分析中,未发现唾液酸丢失,一些低丰度糖链经过衍生化可被检测到,提高了糖链的MALDI-TOF-MS分析灵敏度,提高了生物来源微量糖链检测的覆盖度。
[硕士论文] 狄艳冰
工业催化 大连理工大学 2016(学位年度)
摘要:葡萄糖作为生物质的基本结构单元,将其转化为高附加值化学品具有非常重要的现实意义,葡萄糖的选择氢解或氧化是具有潜在应用前景的转化路径。本论文研究了固体碱MgO负载的铜镍双金属催化剂上葡萄糖氢解性能,对1,2-丙二醇、乙二醇等低碳多元醇的生成表现出了优异的性能。此外,初步探究了Pt/CNTs催化葡萄糖脱氢制葡萄糖酸盐和氢气的反应性能。
  首先采用共沉淀法制备了不同Ni/Cu比的NiCu/MgO双金属催化剂,并通过N2物理吸附、X射线衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)、程序升温还原(H2-TPR)等方法对NiCu/MgO催化剂进行了表征。结果表明,Cu、Ni之间的协同作用降低了NiCu/MgO催化剂的还原温度;NiMgO2固溶体的形成抑制了其表面镍物种的还原;焙烧温度的增加,促使CuO颗粒的团聚和表面更多的Ni元素进入NiMgO2固溶体,从而导致催化剂表面的金属含量和Ni0/(Cu0+Cu+)原子比以及MgO载体碱性的降低。以葡萄糖氢解反应为探针反应,考察了Ni/Cu比、焙烧温度、H2压力、反应温度、反应时间等因素对NiCu/MgO催化性能的影响。相对于Cu/MgO和Ni/MgO单金属催化剂,NiCu/MgO双金属催化剂对葡萄糖氢解生成C2-C4和1,2-丙二醇具有较高的催化活性,这与铜、镍之间的协同作用有关;当Ni/Cu=1/4时,1,2-丙二醇和C2-C4的收率达到最大,分别为23.4%和46.9%;葡萄糖氢解最佳的反应条件是压力为6 MPa,第一段温度为413K,时间为2h,第二段反应温度493 K,反应时间5h。反应后NiCu/MgO催化剂的表征结果表明,氢解反应过程中MgO载体与水作用导致其分解,出现Mg的流失。循环实验结果表明,葡萄糖氢解反应是由载体MgO和催化剂的活性组分(Ni和Cu)共同作用的结果。
  此外,采用浸渍法、乙二醇还原法、尿素沉淀法制备了2 wt% Pt/CNTs催化剂,以葡萄糖脱氢反应为探针,考察制备方法、葡萄糖的构型、浓度、溶剂等因素对Pt/CNTs催化性能的影响。研究表明,尿素沉淀法制备的2 wt% Pt/CNTs催化剂具有较高的脱氢活性;L-葡萄糖的存在抑制了Pt/CNTs催化剂的脱氢活性;D-葡萄糖脱氢反应存在溶剂效应。这为后续的葡萄糖脱氢反应的工业化应用提供了实验依据。
[硕士论文] 董青青
食品科学与工程 哈尔滨工业大学 2016(学位年度)
摘要:高真空、微重力、强电离辐射、极端的温度等是空间环境的特点。除了微重力这个因素外,其它因素可以通过飞行器座舱设计和必要生命保障系统调节以达到舱内温度的稳定、屏蔽辐射和氧气充足的条件,减少对生物体的伤害。微重力会使倚靠重力的生物体系统发生紊乱,引发骨质疏松症、肌肉萎缩、空间运动病等,改变细胞骨架、影响生物体的信号转导通路和细胞的增殖分化等。一直以来宇航员们都是采用物理锻炼、药物防护和营养补充来缓解微重力带来的负面影响。而小分子营养物质的补充对微重力下的秀丽隐杆线虫在分子水平上是否会产生影响一直未有文献报道。
  本文以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)作为地面模拟微重力效应的试验模型,以小分子营养素葡萄糖为C.elegans在模拟微重力下的补充剂,通过Illumina HiSeq平台对处理组和地面空白对照组进行有参考基因组转录组测序,在转录组水平上得到不同处理组的差异表达基因,分析葡萄糖在分子水平上对微重力下的C.elegans产生的影响。
  结果显示,葡萄糖的浓度与C.elegans的生存率呈负相关,模拟微重力对C.elegans的存活率影响并不显著,而葡萄糖可显著减少模拟微重力下的C.elegans的存活率。在转录组测序的差异基因分析中,模拟微重力相对于对照组的差异表达基因有354个,其中141个上调,213个下调;葡萄糖对模拟微重力下C.elegans的差异表达基因有426个,391个上调基因,35个下调基因。经过GO分析和KEGG pathway富集分析后可知,在微重力下有显著性上调的酶和蛋白有GST和TUBA,显著下调的有SCD、ACO、UGT、ACSL、ACOX1、ACOX3、DYNC2H、GGA等,由此可以得出微重力处理使C.elegans体内的活性氧自由基和氧化物失衡,C.elegans体内的GST表达上升有利于体内氧化还原处于平衡状态;DYNC2H表达的下降可能会引起线虫运动神经元的发育以及减弱对体内细胞有丝分裂提供动力;SCD、ACO、UGT、ACSL、ACOX1和ACOX3都是与脂肪酸代谢合成和氧化过程中有关的酶,其表达的下调减弱了线虫的脂代谢过程,减少了能量的产生。葡萄糖对模拟微重力下的C.elegans的影响主要是与脂代谢相关的差异基因,SCD是差异基因中富集最显著的一个酶,正向调控的转录因子SBP-1、NHR-49、MDT-15的靶基因均是SCD表达基因(fat-5和fat-7),insulin/IGF-1信号通路通过daf-16的靶基因是fat-5、fat-6和fat-7正向调控SCD的表达,而sbp-1、nhr-49、mdt-15和daf-16基因表达量均为上调,促进了SCD的高表达,使得线虫体内的MUFAs对SFAs的比例升高,会使细胞膜的通透性增强;HADH和ACO表达上调均为脂肪酸氧化过程中的重要酶,促进了氧化的过程,产生了能量代谢的波动,对线虫的寿命和产卵量有一定的损伤。
  虽然葡萄糖对模拟微重力下的C.elegans产生了一定的损害作用,但其在一定程度上修复了模拟微重力对动力蛋白的影响,还原了模拟微重力对线虫中一些酶的表达。可以此为基础,对其他小分子营养素如氨基酸、矿物质、脂肪酸等进行添加和分析,进一步研究小分子营养素对在空间微重力环境中生物体生存的影响,为后续的生物学研究提供分子水平的依据。
[硕士论文] 欧阳瑞
食品加工与安全 华南农业大学 2016(学位年度)
摘要:水解类鞣质1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-Penta-O-Galloyl-Beta-D-glucose,PGG),广泛存在于果蔬、中草药植物中,具有多种生物活性,对人体有免疫调节、营养保健作用。本团队前期研究从桉树叶中提取分离出PGG,也证明了其抗氧化、抗肿瘤、抗衰老作用,但是PGG在人体中的消化情况、降解途径及降解产物尚不明确,有待进一步研究。本文首先对PGG抗氧化和抗肿瘤进行研究;然后拟采用人体肠道菌群对PGG进行体外厌氧发酵,分离纯化和结构鉴定它的降解中间产物和终端产物,明确降解途径;通过制备色谱等方法将PGG重要的降解产物分离纯化,对其进行初步抗氧化活性评价,为深入探索PGG生物活性作用机理提供基础。本论文的研究内容和所得结果如下:
  (1)PGG的体外抗氧化活性化学研究。本文采用清除 DPPH、ABTS自由基及ORAC-FL法评价其抗氧化能力。结果表明:PGG具有良好的抗氧化活性,能有效、快速地抑制溶液中 DPPH和 ABTS自由基,且其抗氧化活性明显优于 Vc和 Trolox,说明PGG具有较强的抗氧化活性。
  (2)PGG的体外抗氧化活性细胞研究。本文建立了PC12细胞氧化损伤模型,探究PGG对PC12细胞增殖的影响及降低H2O2损伤PC12细胞的效果。结果表明:在25~100μg/mL浓度范围内,PGG对PC12细胞没有毒性;经PGG处理的PC12损伤细胞存活率提高,因此,PGG对细胞损伤具有明显的保护作用。
  (3)PGG的抗肿瘤活性研究。选用HCT-116细胞作为研究对象,用不同浓度的PGG处理HCT-116细胞,采用MTT法测定细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡。研究发现,经不同浓度PGG处理的HCT-116的增殖受到了抑制,并且有剂量依赖性;同时结肠癌S期细胞数量有所增加,说明PGG可引起S期阻滞。此外,早期凋亡的数量大幅上升,说明PGG可以有效地引起结肠癌细胞的凋亡。
  (4)PGG的制备与其在模拟胃肠道环境中的稳定性研究。将在实验室制备得到的PGG,通过HPLC检测纯度,然后加入到人工胃液pH=1.2及人工肠液pH=7.4中,确定PGG在人工胃肠液中的稳定性。结果表明:分离纯化的PGG高效液相色谱检测其纯度>95%,可用于后续试验。在0~6h中,PGG在模拟胃液pH缓冲液中的稳定性良好,在模拟肠液pH环境中稍微降解,但2h后也趋于稳定。结果表明,PGG在酸性环境弱碱性环境中均较稳定。
  (5)PGG在肠道菌群的厌氧降解研究。配制培养液进行肠道菌群的体外厌氧培养,将一定浓度PGG加入肠道菌群培养液中,在37℃下厌氧培养一定时间。取不同时间段的发酵液,通过离心分离菌,上清用乙酸乙酯提取,干燥提取液,用HPLC检测提取物。所得结果如下:主要为7种化合物,按照降解的先后顺序依次命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。PGG发酵24h后完全降解为P7,即降解终端产物,且随PGG浓度增加,P7的浓度也增加。在1h-24h之间随时间的增长P1-P6(降解中间产物)及P7(终端产物)的量也随之变化。
  (6)PGG的单宁酶酶解结果验证。为了验证PGG在肠道菌群中的降解可能与肠道菌群释放的酶有关,用可以酶解PGG的单宁酶进行酶解,乙酸乙酯提取,干燥提取液,用HPLC检测提取物,液相图谱与PGG肠道菌群发酵液的液相图谱进行对比。结果显示:单宁酶酶解PGG和PGG发酵液的液相对比图显示,PGG酶解产物与PGG发酵降解产物的液相对比图中的P1-P6出峰顺序一致,出峰时间均相同,单宁酶酶解PGG的终端产物为P6,由此分析,PGG的肠道菌群降解可能与菌群分泌的单宁酶有关,而菌群发酵产物中P6属于中间产物,P7才是终端产物,因此菌群发酵液中不只有单宁酶作用于PGG降解,还可能能存在其他酶的作用。
  (7)PGG降解产物的分离纯化和结构鉴定。采用制备色谱分离富集7个PGG降解产物,以ESI-MS检测产物,得到各物质的分子量,推测可能的分子结构。用制备高效液相色谱对PGG降解产物进行分离纯化和富集,采用ESI-MS确定分离纯化出来的各化合物分子量,结果显示:PGG降解产物的分子量依次为788、636、484、332、170、126,其中P2和P3的分子量均为636,二者可能为同分异构体,而P1和P2(3)、P4、P5之间分子量依次相差一个没食子酸残基(152),由此推测可能的化合物名称依次为为TGG(4GG)、TriGG(3GG)、DGG(2GG)、MGG(1GG);P6和P7均符合没食子酸和邻苯三酚的分子量大小,经与标准物质比较,确定P6为没食子酸(GA),P7为邻苯三酚(PGA)。P1到P5的物质结构还有待进一步确定。
  (8)PGG降解产物的抗氧化活性检测。用清除DPPH、清除ABTS自由基和ORAC法进行降解产物的抗氧化活性评价,结果显示:清除DPPH自由基法中,清除率达50%时,各化合物所需浓度TriGG>DGG>PGG>TGG>GA>MGG>PGA,DGG与TriGG的IC50值差异不大。在清除ABTS自由基中,所有降解产物IC50均小于PGG。ORAC法显示,自由基吸收能力GA>PGG>PGA>MGG,而TGG、TriGG、DGG均与PGG活性相似。三种抗氧化活性评价方法测定PGG各降解产物均有较强的抗氧化能力,有些产物甚至比PGG本身抗氧化能力更强。说明PGG在肠道菌群发酵降解后产物可能会提升其抗氧化活性。
[硕士论文] 王聪
食品加工与安全 河北农业大学 2016(学位年度)
摘要:壳聚糖(chitosan,简称CTS),是由自然界中的几丁质经过脱乙酰作用而得到的白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体,在稀酸溶液中溶解后的壳聚糖可以加工成多种形态,如薄膜、微球等。壳聚糖微球主要应用于水体污染治理,其对于吸附除去某些色素有非常好的效果。β-环糊精因为其独特的上宽下窄中空的环筒状大分子结构,也可以包合一定形状和大小分子,通常会与壳聚糖混合使用。目前,已经有大量研究人员对壳聚糖微球以及固定化的β-环糊精的性质和作用进行研究。而胭脂红作为目前我国在食品中用量最大的一种单偶氮类人工合成色素,它的安全性始终引人关注。所以,本文对壳聚糖微球制备的工艺条件,微球对胭脂红的吸附行为以及在食品样品检测中的应用进行了研究,结果如下:
  取一定量的脱乙酰度为92%的壳聚糖粉末(β-环糊精)于100mL体积分数为1%的冰乙酸水溶液中充分搅拌溶解,使用氢氧化钠-乙醇溶液作为固定剂,通过手工滴制的方法制备出形态均匀的壳聚糖微球,使用扫描电子显微镜观察两种微球的表征结构。对比了含有β-环糊精和不含β-环糊精的壳聚糖微球对胭脂红的吸附规律;考察了固定液浓度配比及干燥微球活化时间对微球吸附胭脂红能力的影响。发现固定液中无水乙醇的体积分数对微球的固定效果影响显著、干燥微球的活化时间对溶液中胭脂红的吸附效果影响显著,使用中心合成设计法(Central Composite Design,CCD)对实验进行二因素五水平的响应面设计,优化了微球的制作及活化条件。结果表明:无水乙醇体积分数为44.14%并且活化时间为38.49h时不含β-环糊精的单壳聚糖微球对胭脂红的吸附效果最优秀。
  首先,采用优化后的制作活化条件下得到的壳聚糖微球对胭脂红溶液进行吸附温度、吸附时间、胭脂红溶液初始浓度的单因素静态吸附实验。得到最佳吸附条件为壳聚糖微球用量1g/L,胭脂红溶液体积100mL,吸附温度为室温,吸附平衡时间40min,壳聚糖微球-胭脂红溶液的吸附体系酸碱度为中性。同时,对实验数据进行吸附热力学分析以及对Langmuir模型、Freundlich模型、吸附动力学模型和分子内部扩散等经典模型的拟合,Langmuir模型和Freundlich模型的拟合系数均达到了0.99;吸附动力学中一级吸附动力学方程和准二级吸附动力学方程的拟合系数也分别达到了0.9091和0.9883;同时壳聚糖对胭脂红的吸附过程并不符合分子内扩散模型。说明壳聚糖微球对胭脂红的吸附为化学吸附,壳聚糖微球在对溶液中胭脂红进行吸附的过程中同时发生单分子层吸附和多分子层吸附的复杂吸附反应过程,吸附热力学和吸附动力学反应较为复杂。最后,通过对食品样品中胭脂红色素的吸附实验证明,壳聚糖微球可以用来对食品中的色素进行吸附。
[硕士论文] 陆云龙
分析化学 延边大学 2016(学位年度)
摘要:糖链具有结构多样化的特点,对于糖链的研究具有现实意义。糖链携带复杂的生物信息,与遗传、病理及人类生命活动有直接联系。糖基化过程与生理生化过程密切相关,也与癌症等多发疾病的发生及病变有关,本文选用两种糖苷内切酶Endo M和Endo M-N-175Q建立一种分析N-糖链的方法。Endo M-N-175Q作为Endo M的突变体,在保留转糖基活性的同时几乎丧失了水解活性,因此在延长酶反应时间的同时具有更高的转糖基效率。同时介绍了脱盐技术的发展情况,重点说明了采用石墨碳柱进行纯化和富集的简便性、高效性,本文通过对石墨碳柱富集寡糖洗脱方式的选择、酶切糖蛋白的酶的选择来建立一种分析糖蛋白中N-糖链的方法,成功将此方法应用于复杂糖蛋白卵清蛋白的分析实验当中,成功检测到八种寡糖。根据报导,恶唑啉无论是在化学糖基化法和化学酶糖基化法上面是已知的非常好的糖基供体。在以恶唑啉为底物时,使用Endo M-N-175Q进行转糖基反应转移率可达到90%以上。以此为前提,为了进一步提高酶反应的转移率,通过合成糖恶唑啉探索提高酶反应转移率的方法。
  本文通过四组实验对N-糖链进行分析研究。首先,唾液酸糖肽经链霉蛋白酶E酶解,酶解产物通过石墨碳柱富集后进行Endo M-N-175Q酶反应,通过LC-ESI-MS检测产物生成与否最终从三种不同的洗脱方式选择中性洗脱方式作为富集寡糖的方法,将此方法应用于后续实验。其次,两组标准糖蛋白牛胰核糖核酸酶B分别经链霉蛋白酶E和N-糖苷酶F酶解,酶解得到的寡糖通过石墨碳柱富集后进行Endo M-N-175Q酶反应,经LC-ESI-MS检测。前者得到一种寡糖M5N2,后者得到三种寡糖M5N2、 M6N2、 M8N2且含量高于前者,选用N-糖苷酶F酶解糖蛋白。接着,将前文方法应用于复杂糖蛋白卵清蛋白中N-糖链的分析上,用N-糖苷酶F酶解卵清蛋白,酶解产物通过石墨碳柱富集,进行Endo M-N-175Q酶反应后经LC-ESI-MS检测得到M5N2等八种寡糖。最后,使用氮乙酰葡糖胺成功合成糖恶唑啉,将这一方法应用到唾液酸糖肽上,合成糖恶唑啉后进行EndoM-N-175Q酶反应。反应结果与唾液酸糖肽直接进行Endo M酶反应的结果对比,前者的积分峰面积是后者的14.2倍,以糖恶唑啉为底物时进行Endo M-N-175Q酶反应将显着提高酶反应转移率。
[硕士论文] 张银
制药工程 青岛科技大学 2016(学位年度)
摘要:菊粉,作为天然的功能性多糖,是一种低聚果糖和多聚果糖的混合物,低聚果糖和多聚果糖在国内外分别具有很好的市场前景。但是菊粉中各聚合度果聚糖因具有非常相似的化学结构,分离难度大。所以想要实现低聚果糖和多聚果糖的推广和应用,菊粉的分离纯化是关键。
  在本文中,我们先后探讨了有机溶剂沉淀法、单柱色谱分离法和连续色谱分离法。有机溶剂沉淀法中,利用低/多聚果糖在水(或二甲基亚砜或二甲基甲酰胺)-醇(或酮)溶液中溶解度存在差异,获得了纯度为88.25%的多聚果糖,该提取方法便捷,生产成本低廉,原料来源丰富。然后使用单柱色谱分离法确定了分离纯化中树脂的类型和离子型号,再由单柱色谱放大到中试连续色谱,采用田口方法对连续色谱4个区域流速进行优化,实验结果表明1区流速对低聚果糖纯度的影响最大,田口设计优化后的最佳洗脱流速为1区流速:60ml/min,2区流速:40ml/min,3区流速:40ml/min,4区流速:55ml/min,在此条件下获得的低聚果糖的纯度为92.34%,此法操作简便,且可用于工业化大规模生产。
[硕士论文] 杨旭
食品工程 宁波大学 2016(学位年度)
摘要:作为非特异性免疫增强剂,肽聚糖的研究引起了国内外学者的重视并成为近年来研究的热点。但肽聚糖的难溶特性严重影响其深入的研究和免疫特性的发挥。本文以嗜酸乳杆菌肽聚糖为研究对象,优化了肽聚糖的提取工艺,并对其分子结构进行硒化修饰,最后对硒化肽聚糖进行抗氧化及抗肿瘤特性的研究,并对硒化肽聚糖-壳聚糖微胶囊进行了制备。
  本研究主要内容包括:⑴比较嗜酸乳杆菌肽聚糖的六种提取方法,得到提取肽聚糖的最适方法并对此方法下提取的肽聚糖进行初步评价。最适提取方法步骤如下:三氯乙酸脱磷壁酸,乙醚脱脂,十二烷基磺酸钠结合胰蛋白酶去除蛋白质,此方法下肽聚糖的平均得率为16.48%。溶菌酶实验及肽聚糖结构测定结果显示提取的肽聚糖为高纯度肽聚糖且电镜下成片状,并保持完整的菌体形态。氨基酸分析结果表明肽聚糖的主要氨基酸组成为丙氨酸,谷氨酸,赖氨酸,天冬氨酸和亮氨酸。⑵研究了硒化肽聚糖的修饰方法并进行结构的测定。以硝酸催化肽聚糖与亚硒酸钠制备硒化肽聚糖,以产物硒含量为指标,反应温度,硒化剂添加量和反应时间为变量进行正交实验优选。紫外和红外光谱进行结构扫描并对硒化前后总抗氧化性进行了测定。结果显示,反应温度为80℃,反应时间为10 h,硒添加量为2.5 mL,产物硒含量最高,为396.54μg/g;紫外扫描在200 nm左右有强的吸收峰,红外扫描分别在590 cm-1和659 cm-1处有Se=O和Se-O-C的不对称伸缩振动,表明硒化修饰成功;硒化前后总抗氧化性的测定说明肽聚糖经硒化后抗氧化性显著增强。⑶研究了硒化前后的抗氧化性及抗肿瘤特性。CCK-8试剂盒检测硒化修饰后对正常细胞以及结肠癌细胞 HT-29的抑制作用;以 H2O2诱导 IEC-6细胞氧化损伤为模型,以MDA、CAT、GSH-Px含量的变化为指标检测抗氧化性的变化;以HT-29为细胞模型,通过荧光倒置显微镜及流式细胞仪研究肽聚糖修饰前后的抗肿瘤作用。结果显示肽聚糖修饰后对正常细胞没有毒性,而对结肠癌细胞有强烈的抑制作用,抑制率约为肽聚糖的3倍;抗氧化实验和抗肿瘤实验得出硒化肽聚糖有显著的抗氧化性和抗肿瘤作用。⑷制备了硒化肽聚糖-壳聚糖微胶囊。以包封率以及载药量为指标,筛选了硒化肽聚糖和壳聚糖质量的配比,结果得出当质量比为1:1时,包封率最好,载药量最高。
[硕士论文] 关翔宇
轻工技术与工程 天津科技大学 2016(学位年度)
摘要:2,3-丁二醇是一种重要的化工原料,广泛用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域。木糖是木质纤维原料水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖,因此,充分利用纤维素原料中的木糖、提高木糖2,3-丁二醇的转化率是高效利用纤维素原料生产2,3-丁二醇的关键问题之一。本实验通过对全局转录调控因子sigma的编码基因rpoD定向进化和压力诱导突变的定向筛选,旨在获得能够高效利用木糖生产2,3-丁二醇的菌株,并对表型变化产生的机理在分子水平上进行阐述,为2,3-丁二醇的生物转化提供参考。
  1)通过对比不同木糖浓度培养基中KPG菌株(Klebsiella pneuoniae CICC-10781)生长状况,确认菌株KPG对木糖耐受性的阈值为75 g/L。
  2)利用pUC18k和pDK7质粒构建rpoD基因过表达菌株。通过发酵验证证明,rpoD基因表达量的变化对菌株木糖耐受性有一定影响。提高rpoD基因的表达量,能够促进菌株对木糖的消耗,提高木糖消耗速率。KP-18-rpoD和KP-7-rpoD菌株的木糖消耗量相对出发菌株分别提高了167.2%和127.3%;2,3-丁二醇及其他副产物的产量也有一定程度的提高。
  3)通过对recA、rpoB和ldh进行表达量分析,确定了使用recA作为RT-PCR内参基因。在此基础上,对KPG、KP-18-rpoD和KP-7-rpoD菌株中的rpoD基因进行表达量测定,发现KP-18-rpoD和KP-7-rpoD菌株中rpoD基因表达分别上调了7.43倍和7.67倍,没有明显差异。
  4)通过对全局转录调控因子sigma的编码基因rpoD定向进化,筛选获得了突变株KPC;通过压力诱导突变的定向筛选选获得了突变株KP2。在高木糖浓度下利用菌株KP2和KPC发酵,与KPG对比发现,KP2和KPG两株菌在125 g/L木糖初始浓度培养基中,对木糖的耐受性有一定提高,发酵时间延长一倍的情况下,木糖消耗量分别提高了117%和168%,2,3-丁二醇产量分别达到35.78 g/L和33.23 g/L,相对原始菌株分别提高了132.4%和115.8%。
  5)对KPG、KP2和KPC菌株进行RNA-seq测序和转录组de novo分析,获得三菌株高木糖浓度培养48 h时转录本信息,共计Unigene4539个,总长5693375nt。以KPG为对照,分别比较KP2和KPC菌株基因表达情况,KP2和KPC菌株差异表达基因总数分别为505和674个,其中分别有242个和500个基因上调,263个和174个基因下调。差异表达基因Pathway分析表明,KP2和KPC菌株相对出发菌株KPG,转录水平的变化主要表现在信号转导、跨膜运输、碳水化合物代谢、能量代谢和其它物质代谢,如:核苷酸代谢和氨基酸代谢等方面。
[硕士论文] 王晨红
生物化工 燕山大学 2016(学位年度)
摘要:克雷伯肺炎杆菌作为一种重要的工业生产应用微生物,存在于该菌周质空间的葡萄糖氧化途径已有文献报道。一般认为,葡萄糖进入克雷伯肺炎杆菌胞内至少存在四条不同的代谢通路,其中两条通路葡萄糖分子先在周质空间中被分别氧化2-酮基葡萄糖酸分子、葡萄糖酸分子之后,再通过转运系统进入胞内;另外两条通路则是葡萄糖分子直接进入胞内,这就要依赖于ABC转运系统和PTS转运系统。本论文在课题组以前研究的基础之上,对克雷伯肺炎杆菌葡萄糖氧化途径做了进一步的探究工作,利用基因敲除的方法,成功构建十多株存在于葡萄糖氧化途径尤其是位于细胞内膜上功能基因缺失的单突变、双突变以及多突变菌株,并以此为出发点,在M9单一碳源培养基中培养,测定不同基因突变株在有氧和无氧条件下,菌体的生长情况,并解析出葡萄糖进入胞内的代谢途径,推断除了所提到的葡萄糖进入胞内的四条途径外,还有其他途径的存在。
  课题组通过设计实验发现,生物群体效应基因LuxS对克雷伯肺炎杆菌发酵生产2,3-丁二醇和乙偶姻影响显著,通过构建不同的LuxS基因缺失菌株,在批次发酵实验结果中证明,突变菌株的2,3-丁二醇发酵产量明显高于对照组,而在乙偶姻发酵实验中发酵时间也缩短了3h,对于1,3-丙二醇的发酵过程,影响并不明显。
  课题组前期已经成功构建基因缺失菌株kpΔgad,即基因gad控制合成的葡萄糖酸脱氢酶缺失的菌株,阻断了葡萄糖在周质空间转化为2-酮基葡萄糖酸转运到胞内的代谢通路。在发酵过程中,严格控制发酵液的pH,从而达到葡萄糖酸大量积累的目的。
  在本论文中,通过批次发酵数据可以看出,自然菌株克雷伯肺炎杆菌和突变株kpΔgad不仅可以利用木糖进行正常的生长代谢,而且积累的主要代谢产物经鉴定为木糖酸。流加木糖至发酵第79h,突变株kpΔgad共积累木糖酸104.32g/L,质量转化率约为1:1,表明在木糖酸的工业生产中,克雷伯肺炎杆菌基因突变株拥有具有巨大的研究价值和发展潜力。
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