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[硕士论文] 李新新
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:糖基化修饰是生物体内最常见的一种蛋白质翻译后修饰,可以影响蛋白分泌、稳定性,以及免疫原性等生物学功能。自然界中真核微生物分泌大量糖苷水解酶用于降解植物多糖。这些糖苷水解酶经常发生N/O-糖基化修饰,从而影响酶的活性和稳定性。本论文中以来源于嗜热真菌篮状菌(Talaromyce leycettanus JCM12802)的β-葡萄糖苷酶bgl3A为研究材料,比较了该基因在三种真核表达系统(篮状菌,毕赤酵母和腐质霉)和一种原核表达系统(大肠杆菌)中不同程度糖基化修饰对酶学性质的影响。通过N/O-糖基化单点突变和毕赤酵母表达,初步分析了不同位点,不同类型糖基化修饰对酶的影响。主要研究结果如下:
  (1)四种重组Bgl3A的酶学性质比较
  β-葡萄糖苷酶Bg13A分别在四种系统中成功表达并纯化成单一蛋白。SDS-PAGE分析表明不同真核系统表达的重组Bgl3A存在不同程度的N-糖基化修饰和O-糖基化修饰,其中腐质霉表达系统中的糖基化修饰程度低于其他两种真核表达系统。酶学性质比较发现不同表达系统来源的重组Bgl3A性质差异较大,如pH稳定性(篮状菌>大肠杆菌>腐质霉>毕赤酵母)、纤维二糖催化效率(腐质霉,91s-1mM-1>毕赤酵母,89s-1mM-1>篮状菌,27s-1mM-1>大肠杆菌,12s-1mM-1)。结果表明不同系统表达酶蛋白存在不同程度的糖基化后修饰,这些糖基化后修饰对酶蛋白的性质有一定影响。
  (2)N-糖基化对β-葡萄糖苷酶Bgl3A酶学性质的影响
  通过定点突变构建N-糖基化突变体并进行酶学性质分析。突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到酶活力;突变体T44A和S299A的最适pH和温度没有改变,但二者的Tm值和70℃下的热稳定性都明显优于野生型。以纤维二糖为底物时,突变体T44A和S299A的催化效率基本不变。由此可知,N-糖基化主要影响Bgl3A的分泌和热稳定性,其中N226位点的N-糖基化在酶的折叠和分泌中起重要作用,且不同位点的N-糖基化修饰因其结构上的差异而导致了酶学性质的丰富性。
  (3)O-糖基化对β-葡萄糖苷酶Bgl3A酶学性质的影响
  同时构建O-糖基化突变体。与野生型相比,突变体的最适温度和pH均没有发生明显变化,但不同程度地拓宽了Bgl3A的pH稳定性,即T443A>T436A>T437A>WT。酶促反应动力学分析表明T443A对两种底物的催化能力明显降低,而突变体T436A和T437A对纤维二糖的催化效率具有一定的提高。结果表明T443位点的O-糖基化对维持Bgl3A的活性起到关键作用,而T436和T437位点的O-糖基化有可能影响到Bgl3A的三维结构,进而对催化效率起到一定作用。由于糖链与缓冲液相互作用,O-糖基化对Bgl3A的pH稳定性起到重要作用。
  本论文通过比较四种系统表达β-葡萄糖苷酶Bgl3A的酶学性质,初步得出不同糖基化对Bgl3A的性质影响不一。在毕赤酵母表达系统中,构建不同类型糖基化突变体并比较酶学性质,结果可知N-糖基化主要影响Bgl3A的催化效率,O-糖基化主要影响Bgl3A的pH稳定性。这一结论可为糖基化对β-葡萄糖苷酶Bgl3A影响机理的研究提供一定理论基础。
[博士论文] 曹艳丽
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上含量最为丰富的碳水化合物之一,丝状真菌是自然界中降解木质纤维素的主要微生物类别,而里氏木霉(Trichoderma reesei)是其中的典型代表。在纤维素等底物存在的条件下,里氏木霉能表达分泌大量的纤维素酶以实现对纤维素的高效降解,因此成为纤维素酶工业的主要生产菌株。
  目前对里氏木霉纤维素酶表达合成的研究主要集中在两个方面:一方面集中在纤维素酶基因的表达调控方面,以期从理论上阐释产酶调控机制,从而为通过菌株的遗传改造提升纤维素酶的表达水平提供理论支持;另一方面,通过对里氏木霉现有酶系组分的性能改善或合理复配以提高其酶解效率。在纤维素酶基因表达调控方面,目前已经鉴定到了多个直接参与酶基因表达的转录因子包括正调控因子及负调控因子。研究发现,不同的转录因子在启动子上具有各自特定的结合位点及生物学功能,这意味着纤维素酶基因的诱导转录是一个多转录因子参与,从而响应不同环境信号的复杂过程。为了更为深入地了解这一复杂过程,有必要筛选鉴定纤维素酶基因表达过程中涉及的其他未知转录因子及辅功能因子,从而解析里氏木霉纤维素酶基因的转录调控网络。
  此外,作为真菌的里氏木霉,其染色质结构的变化包括重构和核小体共价修饰可能也是纤维素酶基因诱导表达过程中的重要影响因素,系统阐述此种变化在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用对全面理解相关调控机制也极为重要。因此,论文工作主要从上述几个方面展开,取得相应结果如下:
  一、鉴定了一个新的纤维素酶基因转录抑制因子Rce1,其通过与Xyr1在纤维素酶基因启动子上竞争性结合参与纤维素酶基因的表达调控
  以里氏木霉主要的纤维素酶基因启动子(Pcbh1)为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中筛选获得了真菌典型转录因子Ga14类型的转录因子Rce1。细胞定位分析发现Rce1主要位于细胞核。对rce1的缺失及过表达分析表明,Rce1在纤维素酶表达过程中发挥抑制作用。通过体外的凝胶泳动迁移(EMSA)及DNA足迹保护(DNAse Ifootprinting)实验鉴定了Rce1在cbh1启动子上的结合位点,发现其与纤维素酶基因的关键转录激活因子Xyr1具有相似的结合位点。进一步通过体外竞争及染色质免疫共沉淀(ChIP)实验分析发现,Rce1在纤维素诱导表达过程中与Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子,进而实现对纤维素酶表达的抑制作用,而xyr1过表达可以解除rce1对纤维素酶的表达抑制。综上所述,我们通过酵母单杂交筛选到一个转录抑制因子Rce1,通过与转录激活因子Xyr1竞争性结合纤维素酶基因启动子来调控纤维素酶的表达。
  二、发现泛素结合酶TrUbc4在里氏木霉纤维素酶表达过程中发挥重要作用
  以纤维素酶基因启动子cbh1为“诱饵”,从里氏木霉cDNA文库中还筛选获得了一个属于UBC超家族的泛素结合酶TrUbc4。细胞定位分析发现TrUbc4定位于细胞核。TrUbc4编码基因的敲除显著降低了里氏木霉纤维素酶基因的诱导转录和表达。突变体回补实验发现,TrUbc4的活性位点C85在纤维素酶表达过程中发挥着重要作用。在Xyr1过表达菌株中缺失Trubc4并分析表型发现,Xyr1的过表达并不能恢复Trubc4缺失对纤维素酶表达造成的的下调。进一步的ChIP分析发现,Trubc4缺失导致Xyr1在纤维素酶基因启动子区的占据水平显著降低,这种降低即使在Xyr1过表达的情况下仍然存在。以TrUbc4为“诱饵”进行酵母双杂交文库筛选,获得了具有SWIB/MDM结构域的蛋白TrSnf12。该基因的缺失表型及蛋白细胞定位与TrUbc4类似,但是我们并没有检测到TrSnf12的泛素连接酶活性。综合上述结果,我们发现Trubc4在纤维素酶基因诱导表达过程中发挥着重要作用,此种作用是特异性的,并且依赖于其泛素结合酶活性。
  三、泛素修饰组学初步分析TrUbc4可能参与里氏木霉多种生理调控过程
  对TU6以及Trubc4缺失菌进行了泛素化蛋白质组学定量研究,鉴定到位于1385个蛋白上的2563个泛素化位点,其中941个蛋白的1623个位点包含定量信息。以1.5倍为变化阈值,在具有定量信息的泛素化位点中,△Trubc4/TU6比较组中有396个位点的修饰水平发生上调,298个位点的修饰水平发生下调,△Trubc4缺失导致里氏木霉整体的泛素化水平升高。进一步分析发现与TU6相比,有295个位点,258个蛋白在△Trubc4缺失菌中未检测到,这些蛋白涉及了转录因子、泛素结合酶、蛋白激酶、转运蛋白以及SAGA复合物,这说明Trubc4可能参与里氏木霉多种调控过程。
  四、Xyr1招募SWI/SNF复合物参与纤维素酶基因的表达调控
  酵母双杂交及体外GST-pull down实验发现,所鉴定的里氏木霉潜在的SWI/SNF复合物同源亚基TrSnf12与Xyr1的转录激活结构域(activation domain,AD)区存在相互作用,并且TrSnf12与同源核心亚基TrSwi1也存在相互作用。Trswi1及另一个同源核心亚基编码基因Trsnf5的缺失对里氏木霉的生长及生孢均具有严重的影响,并且使得纤维素酶的表达性能丧失。ChIP实验结果表明,在纤维素诱导条件下,TrSwi1及TrSnf5均能被招募至纤维素酶基因启动子区。进一步分析发现,在Xyr1过表达背景下,即使在非诱导条件下,TrSwi1也能被招募至纤维素酶基因启动子区,这说明Xyr1可能通过与TrSnf12之间的相互作用,通过靶向募集TrSwi1来介导纤维素酶基因启动子区的染色质结构变化,进而调控纤维素酶基因的表达。然而,对OExyr1Δswi1/snf5的表型分析发现,在xyr1过表达的条件下,无论是诱导条件还是非诱导条件,Trswi1及Trsnf5的缺失对纤维素酶表达的影响程度都很小,这说明在xyr1过表达的条件下,纤维素酶基因的表达可能摆脱了对Trswi1及Trsnf5的绝对依赖。综上,在里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达过程中,染色质重塑复合物SWI/SNF发挥着重要的调控的作用。Xyr1可通过与TrSnf12亚基的相互作用招募TrSwi1/TrSnf5亚基到纤维素酶基因启动子区,从而调控纤维素酶的表达。
[硕士论文] 张建波
生物化学与分子生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:在蛋白质工程中,通过在蛋白质的特定位点进行拆分或插入新的结构域可构造出不同的调控元件,但如何发现蛋白质中特定的改造位点限制着这些调控元件的构建。因此,找到一种合适的方法来筛选目的蛋白中的改造位点就显得尤为重要。
  在我们的研究中,我们构建了基于转座子的体外转座反应体系,经优化后能够快速、高效地构建转座子随机插入文库,且构建的随机插入文库满足多样性和均一性的要求。在目的蛋白的选择上,我们将激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)蛋白作为研究对象,AID蛋白的脱氨作用能够实现碱基C→T的特异性突变,利用AID蛋白及其同家族成员的脱氨特性构建的单碱基基因编辑工具能够实现单碱基的精确编辑,由此了解AID蛋白中的插入突变耐受位点对其后续利用有着重要的意义。
  为此,我们构建了转座子随机插入到AID蛋白中的文库,通过后续的酶切连接分别将(GGGGS)2片段和(EAAAK)2片段插入到AID蛋白中,最终通过基于利福平抗性的鉴定方法筛选出AID蛋白中的两个耐受插入区域:loop7和C端,并在此基础上结合易错PCR和循环富集筛选的策略筛选出了一系列活性较野生型AID蛋白不同程度提高的、带有插入突变的易错PCR突变体,这为后续改造和利用AID蛋白提供了实验基础。
[硕士论文] 祝倩倩
生物工程 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和南极磷虾(Euphausia superba)是具有重要经济价值的甲壳动物。甲壳动物体液内无免疫球蛋白,也缺乏抗体介导的免疫反应,但是甲壳类动物具有先天性免疫防御系统,可预防病原微生物的侵袭。
  组织蛋白酶是一类溶酶体蛋白酶,主要分为丝氨酸类组织蛋白酶(如组织蛋白酶A,CatA)、半胱氨酸类组织蛋白酶(如组织蛋白酶B,CatB;组织蛋白酶H CatH;组织蛋白酶L,CatL)、天冬氨酸类组织蛋白酶(组织蛋白酶D,CatD),参与蛋白质水解、先天免疫防御反应、抗原递呈、细胞凋亡等生理活动。
  本研究通过设置了一系列的影响中华绒螯蟹组织蛋白酶进行酶促反应的因素(浸提时间、pH、温度、金属离子以及激活剂与抑制剂),来探究各组织蛋白酶的酶学性质。
  (1)中华绒螯蟹肝胰腺组织浸提时间达到120 min时,CatA和CatD的酶活达到最高,CatB、CatH、CatL各自的最佳浸提时间分别为30 min、60 min、90 min。
  (2)CatA、CatB、CatL、CatD反应的最适pH都为5,CatH的最适反应pH为7,说明组织蛋白酶主要为酸性蛋白酶。
  (3)CatA和CatB最适反应温度为45℃,CatH和CatD的最适反应温度55℃, CatL最适反应温度为65℃,说明CatL耐高温。
  (4)Mg2+对CatA无明显作用,对CatB激活作用,对CatH、CatL和CatD有抑制。而Ca2+、Mn2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+对CatA、CatB、CatH、CatL和CatD均有不同程度的抑制作用。
  (5)DTT对CatA和CatD的活性具有一定的抑制作用,对CatB、CatH和CatL有一定的激活作用。EDTA、E-64和亮抑蛋白酶肽则抑制CatA、CatB、CatH、CatL和CatD活性,其中E-64和亮抑蛋白酶肽对半胱氨酸蛋白酶(CatB、CatH、CatL)的抑制作用较显著。
  (6)中华绒螯蟹在注射Escherichia coli、Staphylococcus aureus和Saccharomyces cerevisiae12 h后,CatB、CatH、CatL和CatD的活性都显著提高,CatA的活性显著减低,说明CatA、CatB、CatH、CatL和CatD参与自身免疫防御反应。
  南极磷虾(E.superba)自身内源性组织蛋白酶可以高效降解蛋白质,严重影响南极磷虾(E.superba)的贮藏、运输与保鲜。研究南极磷虾组织蛋白酶的一些基本性质,旨在为南极磷虾的贮藏、运输与保鲜以及组织蛋白酶的应用提供理论指导。因此通过研究南极磷虾不同自溶条件(自溶时间、自溶pH、自溶温度、金属离子以及激活剂与抑制剂)的变化来探究CatB、CatH、CatL、CatD的酶活变化,从而达到控制自身蛋白降解的目的。
  (1)南极磷虾在自溶30 min时,CatB和CatD的剩余酶活较高;自溶60 min时, CatH和CatL的剩余酶活较高。
  (2)南极磷虾自溶缓冲液pH为5时,CatB剩余酶活最高;自溶缓冲液pH为6时,CatH剩余酶活最高;自溶缓冲液pH为4时,CatL剩余酶活最高;自溶缓冲液pH为8时,CatD剩余酶活最高。CatB、CatH、CatL、CatD在各自最适自溶缓冲液pH时,均具有较高显著性。
  (3)南极磷虾在不同温度(-20℃,0℃,20℃,40℃,60℃)下自溶,自溶温度为0℃时,CatB和CatL的剩余酶活最高;自溶温度为20℃时,CatD的剩余酶活最高;自溶温度为40℃时,CatL的剩余酶活最高。
  (4)在南极磷虾自溶缓冲液中加入浓度为5 mmol/L的Mg2+,CatB、CatH和CatL被激活,Ca2+、Mn2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+(浓度均为5 mmol/L)对其有抑制作用,且Mg2+相较于其他金属离子显著性差异较大。Mg2+和Zn2+对CatD无显著性作用, Ca2+、Mn2+、Pb2+和Cu2+对CatD具有抑制作用,Cu2+的抑制作用较为显著。
  (5)在南极磷虾自溶缓冲液中加入2 mmol/L的DTT和L-Cys可激活CatB、CatH、CatL和CatD的活性,EDTA(2 mmol/L)、E-64(0.1 mmol/L)和亮抑蛋白酶肽(0.1 mmol/L)则使CatB、CatH、CatL和CatD的活性受到抑制,E-64和亮抑蛋白酶肽对半胱氨酸蛋白酶(CatB、CatH和CatL)的抑制较为显著。
[硕士论文] 陈铭
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,目前,我国每年产生约有6亿废弃木材和农作物秸秆,但是人们通常用焚烧的方式处理秸秆,不能被有效利用起来,这种方式不仅浪费了资源,加重了环境污染,增加大气中二氧化碳的含量使温室效应加剧。木质纤维素生物质可以被用热化学处理法来除去木质素,使半纤维素和纤维素组分松散,木质纤维素可以被各种纤维素水解酶分解,产生单体糖,然后将其发酵成乙醇。在植物细胞壁中,半纤维素与木质素以共价键连接,纤维素内包含着微纤丝核心,外部包围着半纤维素形成的基质层,这种结构进一步阻碍了纤维素分解酶和半纤维素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木质纤维素是我们目前面临的重大难题。
  嗜热子囊菌( Thermoascus aurantiacus)是一类可在高温环境中生存的真菌,在40~50℃的条件下生长繁殖,从嗜热真菌中分离的热稳定酶,在未来的工业生产中具有广泛的应用前景。多糖单加氧酶(Polysaccharide monooxygenases, PMOs)是一类含铜氧化酶,在还原型辅因子(如维生素C)存在下可使纤维素分子氧化降解。
  本研究以嗜热子囊菌为材料,提取真菌菌丝的DNA,已知两个PMO蛋白序列, PMO4983和PMO8913,我们对两条序列进行分析后,发现两个PMO蛋白序列均含有信号肽,因此两个蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的两条序列分别编码228和333个氨基酸(不含信号肽),蛋白分子量预测分别为24.33KDa和34.67KDa。设计特异引物以DNA为模板扩增得到PMO基因序列,利用基因重组的方法构建pPICZαA-PMO表达载体,利用电击转化法将重组质粒pPICZαA-PMO转入毕赤酵母GS115并进行博来霉素抗性筛选,筛选出具有高拷贝数的阳性转化子后进行工程菌发酵以及甲醇诱导分泌蛋白,获得异源表达重组蛋白。发酵进行到第七天时收集发酵液,用硫酸铵沉淀法分离蛋白,然后用PBSA缓冲液透析两天后离心,去除杂质得到粗酶。将粗酶用HisTrapTM FF镍柱层析的方法进行洗脱,在起峰时收集蛋白,将目的蛋白分离纯化出来。然后用SDS-PAGE的方法检测蛋白纯度以及分子量大小,结果显示均为单一组分,PMO4983和PMO8913实际分子量大小分别为40.0KDa和60.1KDa。
  将重组蛋白分离纯化并鉴定后,进行进一步酶学性质检测以及氧化性检测。实验发现,以磷酸膨胀纤维素为反应底物,这两种多糖单加氧酶都没有水解纤维素的能力,但是在维生素C为还原剂的条件下,PMO4983能够将纤维素氧化裂解为纤维寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明显,因而PMO8913的性质还有待进一步鉴定。而在下一步实验中,我们不但证明了PMO4983具有氧化裂解的性质,初步确定了其氧化裂解方式,同时,我们还证明了PMO4983具有提高纤维素水解酶水解活性的能力。在二价铜离子以及维生素C的环境中,用PMO4983将底物处理48h后,与传统纤维素酶混合均匀,能够发现PMO4983可以不同程度地提高纤维素酶的水解活性。
[硕士论文] 刘玉姣
植物病理学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素在自然界中广泛存在,而且含量丰富,是一种可再生资源,对解决能源短缺和资源枯竭具有重要意义。但是,我国的纤维素利用率很低,造成大量的浪费。在纤维素的分解过程中,纤维素酶发挥非常大的作用,将纤维素最终分解为葡萄糖,使得纤维素能够得到充分的利用。嗜热革节孢是一种嗜热真菌,能够产生热稳定性酶,是纤维素的分解者之一。
  本研究对来自嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因cbhk和β-葡萄糖苷酶基因bgk进行克隆,并在毕赤酵母中进行表达,得到CBHK和BGK重组酶。对重组酶进行分离纯化, SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量,外切葡聚糖酶CBHK的表观分子量为72kDa,大于理论分子量50kDa,可能是糖基化造成的;β-葡萄糖苷酶BGK的分子量大小为55kDa与理论的分子量大小基本一致。
  改善酶活性对提高纤维素的降解具有十分重要的作用。基于嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶HiBG的结构,本研究对嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶活性位点进口端的12个氨基酸残基进行定点突变。通过同源建模,对来源于嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因进行四个位点的定点突变。并将它们在毕赤酵母中进行了突变基因的高效表达。与野生型外切葡聚糖酶相比,突变体的酶活性都有所降低,其中W163H酶活性降低最多,降低了50%;E429D和Q459T分别降低了40%和35%;突变后W397H活性完全丧失。与野生型β-葡萄糖苷酶相比,所有突变体的酶活力都降低了,其中A260N、F348G、Y179F和F180H酶活性降低较少,分别降低了20%、20%、30%和30%;D237S、L173Q酶活性分别降低了55%和60%;而突变W168H、N335F和W349G的酶活性完全丧失。
  在纤维素的分解过程中,β-葡萄糖苷酶起着关键作用,酶的催化存在产物抑制现象,大多数酶都存在产物抑制现象,但是一些酶对葡萄糖具有耐受性。嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶对葡萄糖具有耐受性,但是具体的作用机制尚不清楚。本研究,通过对嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的12个进口端位点进行定点突变,研究这些位点对于嗜热革节孢第一家族β-葡萄糖苷酶酶活性及葡萄糖耐受性的影响。突变L173Q丧失葡萄糖耐受性,突变Y179F在高浓度葡萄糖时丧失葡萄糖耐受性。初步证明进口端位点对于酶活性及葡萄糖耐受性都具有一定的影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。
[硕士论文] Jawad Ullah
生物学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:工业酶是使用生物催化方法生产食品、医药、化工等产品的主要酶源。它们具有手性、立体异构和结构域特异性,并且具有在简单介质(如水)中而不是特定介质(如有机溶剂和其他溶液)中识别底物的能力。脂肪酶是α或β折叠水解酶,也是众所周知的蛋白拆分器。来自嗜热生物的脂肪酶能耐受高温,可用于工业生物过程。而且,这些酶的稳定性和表达可以通过将其展示在芽孢表面上来改善。芽孢展示技术效果显著,低成本,耗时少,因此是很有潜力的技术,可应用于环境、医疗和工业等行业中。芽孢能耐受恶劣的工业环境,包括耐热、耐碱、耐化学溶剂,易于回收和可再利用,因此芽孢展示技术工业中应用前景广泛。酵母菌和细菌(包括革兰氏阳性和阴性菌),是最常被用于展示各种蛋白质的载体,但与孢子不同,由于营养细胞对热、pH和化学物质敏感,易破裂。因此,芽孢是避免这些问题的最佳选择,并且相对于营养细胞展示技术,芽孢展示技术则具有多种应用领域。梭菌和芽孢杆菌的各种菌株都能形成芽孢,但是枯草芽孢杆菌最合适做展示载体,因为根据世卫组织认定它对人类是安全的,被认为是“GRAS”(通常被认为是安全的)。芽孢表面展示技术在工业、疫苗开发、环境等方面有着各种应用,细胞表面展示增强了蛋白质表达稳定性和活性,合适的连接肽会使展示的融合蛋白活性和稳定性增强。在本研究中,以海栖热袍菌和枯草芽孢杆菌染色体基因组作为模板进行PCR扩增脂肪酶Tm1350和CotB基因,在Tm1350和CotB之间融合了一系列具有不同长度、刚柔性和残基位置的连接肽基因,将所需基因插入大肠杆菌B.subtilis穿梭载体PHS,构建了重组质粒。将重组质粒PHS-CotB-Lx-Tm1350转化到枯草芽孢杆菌中并诱导芽孢形成。纯化芽孢,通过western印迹分析证实了CotB-Lx-Tm1350的表达。检测了各种温度(40-80℃),不同pH(范围4.0-10)和不同有机溶剂对含各种连接肽的芽孢表面展示酶生物活性的影响。结果表明所有芽孢展示的融合蛋白的最适温度为75℃,L8和L10的最适pH为8.5,对于L0,L5,L6和L9,最适pH为9.0,而对于L1,L2,L3,L4和L7最适pH为9.5。在最佳温度和pH下,具有较长柔性连接肽L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)和L7(GGGGS-GGGGS-EAAAK-EAAAK-GGGGS-GGGGS)的融合蛋白具有比原始活性高1.29和1.16倍的活性。此外,在80℃下,孵育5小时后,具有连接肽L3(EAAAK-GGGGS)和L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)的展示酶热稳定性最好,分别比原来的活性高1.40和1.35倍。测定了不同氨基酸残基位置取向和长度的连接肽的展示酶生物活性,其中L5,L6和L7含有30个不同氨基酸残基取向的连接肽的测定结果表明L7展示酶的活性分别是L6和L5的1.05和1.27倍。研究了0.1%蛋白酶K和菠萝蛋白酶,20%乙醇和30%甲醇对含连接肽的重组芽孢活性的影响。具有适当甘氨酸残基(柔性)的连接肽展示比丙氨酸残基(刚性)具有更高的活性。综上所述,为了提高工业过程中展示酶的活性和稳定性,通过在一定程度上优化连接肽的氨基酸残基位置取向和刚柔性,能达到改善效果。
[硕士论文] 陈炜
生物学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:为了保证染色体结构的完整性和遗传的稳定性,细胞内除了有各种分工明确的损伤修复途径外,它还进化出一种跨损伤修复的损伤耐受机制,涉及一种被广为深入研究的有错跨损伤合成途径,即:通过低保真跨损伤合成聚合酶临时取代复制性DNA聚合酶δ(DNA polymeraseδ,Polδ),旁路通过受损碱基,使得由于DNA损伤而导致S-期暂停的复制叉进程得以恢复,这种复制聚合酶与跨损伤合成聚合酶之间的转换构成了有错跨损伤修复途径的核心,但目前对该途径所涉及的聚合酶转换机制仍存在争议。有观点认为,Polδ和Polζ的催化亚基通过共享辅助亚基在损伤点(域)进行了转换,但这种模型无法解释其它跨损伤合成(translesion synthesis,TLS)聚合酶在损伤点(域)与Polδ是如何进行交换的。还有一种观点认为,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的泛素化-去泛素化修饰介导了跨损伤合成途径中的聚合酶转换。但相反的研究表明,被单泛素化修饰了的PCNA-Ub1并不影响复制聚合酶Polδ的活性,也未破坏Polδ-PCNA的捆绑结构,且对TLS聚合酶Polη的活性无增强作用;类似的研究也表明,无论是未经修饰的PCNA还是被单泛素化了的PCNA-Ub1,它们对TLS聚合酶Polζ和REV1的活性均并无任何刺激作用,因此,PCNA的单泛素化修饰并不是聚合酶转换的核心。
  本实验室前期研究表明,泛素E3连接酶RNF8能够介导Polδ的p50亚基单泛素化修饰反应,可能在激活聚合酶转换过程中起关键作用,但对p50单泛素化修饰的详细机制未知,如:涉及细胞内的p50泛素化修饰途径、p50亚基的单泛素化修饰位点、修饰后的p50与TLS聚合酶的互作反应以及如何介导跨损伤合成途径中的聚合酶转换,等。
  作为国家自然科学基金项目研究内容的一部分,本硕士论文研究主要针对DNA聚合酶Polδ小亚基p50的泛素化修饰位点进行筛查确认。通过已发表的多种泛素化修饰位点预测软件,首先对p50亚基可能被泛素分子特异性结合的赖氨酸残基K位点进行预测;再根据预测的K的分布情况,分别构建、表达并纯化出截短了的4个p50多肽片段,每个片段分别含4-5个分值较高的K;通过以各p50片段蛋白为基质的体外泛素化反应分析,初步确定出p50最有可能发生单泛素化修饰反应的位点(之一)为第145位的赖氨酸残基(K145)。另外,通过对被单泛素化修饰了的p50-Ub1蛋白直接进行质谱分析,又鉴定出p50被单泛素化修饰的另外一个位点K267。针对以上的实验结果,我们又对这两个位点进行了(分别和全部的)诱变,通过以诱变体蛋白为基质的体外泛素化反应实验,最终确认K145和K267同为p50被泛素化修饰的位点。
  本论文的研究为揭示跨损伤修复途径中聚合酶Polδ与TLS聚合酶交换的新机制提供了研究基础,为今后以Polδ作为一种小分子抑制剂的潜在新靶标、设计新的肿瘤诊断方法和治疗手段来抗击癌症疾病提供理论参考。
[硕士论文] 李杰
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)又被称为肝蛋白,简称为SOD。SOD是超氧阴离子自由基(?2O)的专一性清除剂,能够预防和治疗超氧阴离子引起的多种疾病如风湿性关节炎、肺气肿、老年性白内障等。目前,SOD除了药用外已被添加至多种食品和化妆品中来作为保健品及延缓衰老。因此,SOD是很有前途的一种蛋白酶,有着非常广泛的应用前景。但是由于天然SOD在体内具有许多缺点如:停滞期短、不稳定、免疫原性、易于被蛋白酶水解等,从而影响到大规模生产及广泛的应用。因此,为了克服上述缺陷,设计开发出活性高、稳定性强的新型SOD就非常必要。
  本课题主要是通过PDB(Protein Data Bank)数据库得到小鼠的Cu,Zn-SOD三维晶体构象,使用DiscoveryStudio4.0蛋白设计软件对Cu,Zn-SOD蛋白质的非保守区序列进行基于热稳定性的虚拟氨基酸突变和分子动力学模拟,根据折叠自由能的差值ΔΔGmut变化确突变氨基酸位点组合,并通过分子动力学模拟得到最后的突变氨基酸位点。然后通过实验的方法构建野生型和突变型的重组表达质粒并转入大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)中进行克隆和表达,对表达得到的Cu,Zn-SOD(Wild Type)及MCu,Zn-SOD(Mutant)的热稳定性进行验证。本课题的主要过程及结果如下:
  1.自NCBI获得来自猩猩、牛、羊、人等的Cu,Zn-SOD的氨基酸序列,将以上氨基酸序列与Mus Musculus的序列通过软件ClustalX2进行氨基酸序列的比对,并由DNAman分析得到小鼠Cu,Zn-SOD的保守序列,将相对应的27个非保守氨基酸序列作为待突变的位点;
  2.通过PDB数据库获得Mus Musculus的Cu,Zn-SOD三维空间结构(登录号:3GTT)并载入软件Discovery Studio4.0中,采用虚拟氨基酸定点突变技术,将Cu,Zn-SOD中待突变的非保守氨基酸分别突变为其他的19种氨基酸,根据能量变化最终得到单点突变(S-MSOD)、双点突变(D-MSOD)和三点突变(T-MSOD)的突变能变化最优的TOP5突变体;
  3.通过对WT-SOD、S-MSOD、D-MSOD和T-MSOD的突变能变化最优的TOP5突变体进行10 ns分子动力学模拟,由Analysis Trajectory模块进行分析得到RMSD、RMSF、Potential Energy、Bond Energy等数据,从中确定最优的单点突变为:Q49W;双点突变为:Q49W/G90I;三点突变为:V30W/Q49W/G90I;
  4.从小鼠血液中提取RNA,并通过PCR、Overlap PCR、酶切、连接、转化等步骤构建重组质粒pGEX6p-1-SOD、pGEX6p-1-S-MSOD、pGEX6p-1-D-MSOD、pGEX6p-1-T-MSOD;
  5.将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,反复冻融法破菌后对全菌液、上清及沉淀进行SDS-PAGE电泳,确定Cu,Zn-SOD上清中在16 kD左右处产生特异性蛋白条带,说明Cu,Zn-SOD有适量可溶性表达。以GST琼脂糖为介质利用亲和层析法纯化得到野生型融合蛋白GST-SOD及突变型融合蛋白GST-MSOD。Thrombin凝血酶对融合蛋白切割得到SOD和MSOD纯品;
  6.25℃,邻苯三酚自氧化法测定野生型SOD及突变型SOD比活。比活测定结果为:WT-SOD比活为714 U/mg;S-MSOD比活为839 U/mg;D-MSOD比活为632 U/mg;T-MSOD比活868 U/mg;S-MSOD比WT-SOD酶活提高17.5%;T-MSOD比WT-SOD酶活提高21.6%;D-MSOD较WT-SOD酶活降低13%;
  7. WT-SOD和MSOD稳定性测定:当在85℃温度条件下处理1 h,WT-SOD的相对酶活剩余为10%左右;T-MSOD蛋白的稳定性较WT-SOD有明显提高,其相对酶活剩余为35%左右;而D-MSOD则较WT-SOD稳定性有一定的降低,其相对酶活剩余为7%左右;S-MSOD较WT-SOD稳定性也有明显的提高,其相对酶活剩余为20%左右。
[硕士论文] 开思琪
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:本实验通过构建模型生物膜体系,并利用和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)等多种表征手段,在形态学、反应动力学和分子结构等方面全面探究磷脂酶A2与生物膜的作用,从现象到分子层面对磷脂酶A2的水解作用提供一个深入、一致的系统性解释,为磷脂酶的生物学研究提供一个较为完整的模型。
  本文通过三种光学技术——和频振动光谱(SFG)、共聚焦荧光显微镜(LSCM)和衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR),研究了平面磷脂双分子层在钙离子依赖性蜂毒磷脂酶A2(bvPLA2)作用下的水解过程。研究采用荧光共定位的方法,通过LSCM观测,追踪水解的动态过程和形态学变化,半定量以及定性地阐释了水解产物的空间分布情况。结果表明,水解产物之一的脂肪酸大部分从界面上脱离并游离到溶液介质当中,而另一个水解产物溶血磷脂则在界面上形成了稳定的自组装微管结构。ATR-FTIR实验的观测结果同样佐证了这一动态过程。SFG实验明确地揭示了钙离子在水解过程中发挥的作用,即通过连接磷脂膜和吸附在其表面的磷脂酶,诱导磷脂酶分子取向发生变化,从而有效激发界面上磷脂的水解反应。本研究以界面磷脂水解反应为例,建立了一个基于现代光学技术、能够在分子和微观层面上表征界面信息的实验体系,对于探究和理解磷脂水解的这一重要的生物物理化学过程有很大的帮助。
  此外,为了优化和扩展实验体系,本文在其他荧光标记手段上和多种模型双层膜制备上有所尝试,制备出可用于荧光标记且不易淬灭的新型硅量子点,并制备了软基底的磷脂分子双分子层和二氧化硅微球支撑双分子层,使本文研究方法在将来能够继续拓展,以在基础研究方面开发出更大的价值。
[硕士论文] 李彩霞
生物物理学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:目前微波杀菌技术由于其安全环保高效的优点而在食品工业中得到了广泛的应用,其杀菌所需要的时间和温度都低于其他常规方法,并且对食物的营养成份影响较小甚至无影响。近年来,有研究表明紫外协同微波作用的杀菌优势比单独的微波杀菌更强,但是关于紫外协同微波作用在大米灭菌及呼吸作用方面的研究却鲜有报道。对大米进行灭菌的目的是延长其保质时间,而延长大米保质时间的另一个方法便是抑制大米的呼吸作用,目前有很多这方面的研究和应用,但是尚未见到通过降低辅酶Q含量来抑制大米呼吸作用的报道。所以本课题以未处理的样品为空白对照,以水浴处理和单独的微波处理为对比,研究紫外协同微波处理对大米灭菌及辅酶Q的影响,欲通过此研究为延长大米的储存期提供一个新的理论方法。主要研究内容和结果如下:
  1.通过研究水浴加热、单独的微波加热和紫外协同微波加热的升温曲线,我们发现无论是否有紫外辐射的存在,微波使用功率300 W时的升温曲线都与水浴升温曲线最接近。
  2.用以上三种不同的处理方式分别处理大米1 min,3 min,5 min和7 min之后,提取大米蛋白质,进行SDS-PAGE电泳,发现所有条带的分布和颜色都基本一致,说明紫外协同300 W微波功率处理不会影响大米中蛋白谷的分子量和含量。
  3.用以上同样的方式处理大米表面的霉菌,随着处理时间的延长,三种处理方式处理之后细菌的残余菌数都逐渐减少;当处理时间为3 min的时候,紫外协同300 W微波功率处理后的杀菌效率是单独的微波功率处理之后的2.1倍,这说明紫外协同300 W微波功率处理能够在相对短的时间内具有更高的杀菌效率。
  4.用以上同样的方式处理大米,测定大米中辅酶Q的含量,结果显示紫外协同300 W微波功率处理之后,大米中辅酶Q含量降低的幅度最大,说明紫外协同300 W微波功率处理能更有效地降低大米中辅酶Q的含量。因辅酶Q在电子传递链中作用重大,所以通过降低辅酶Q的含量,可以抑制大米细胞的呼吸作用,从而延长大米的保质时间。同时用傅立叶变换红外光谱分析仪和紫外分光光度计分别测定用以上处理方式以及不同处理时间之后的辅酶Q10的结构,结果显示紫外协同微波作用能够改变辅酶Q10的化学结构。
[硕士论文] 周文娟
生物医学工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:蛋白酶体在细胞内代谢调控扮演着重要作用,诸多报道显示蛋白酶体功能异常和人类衰老等相关疾病的发生有关。虽然蛋白酶体结构与功能已被深入研究,但是由于人们对蛋白酶体的代谢调控的了解很少,对于蛋白酶体在疾病代谢调控的通路中的具体作用机制并不是很完整清晰的了解。糖原合成激酶是糖原代谢过程中的限速酶,在调控血糖方面起着重要作用,大量研究表明,在老年痴呆症发病初期,糖原合成激酶表达显著提高。而蛋白酶体活性和糖代谢有着密切关系,因此我们将研究糖原合成激酶在蛋白酶体代谢调控中扮演的作用。
  本文从细胞内和体外的实验验证糖原合成激酶对蛋白酶体活性起抑制作用,并寻找可以在体外逆转糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性的磷酸化蛋白。发掘更多蛋白酶体活性调控代谢因子,为蛋白酶体活性调控在老年痴呆、糖尿病及其他血管病的发生机理代谢机制提供新的视角和见解。从细胞内和体外的实验证明糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性,但是糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性并不直接作用于26S蛋白酶体。PP1A在体外可以提高核提取物和26S蛋白酶体的肽酶活性,并且可以逆转糖原合成激酶抑制核提取物蛋白酶体活性,证明PP1A是可以逆转糖原合成激酶抑制蛋白酶体活性的磷酸化蛋白。因此得出结论糖原合成激酶抑制蛋白酶体的活性。
[硕士论文] 谢买胜
海洋生物学 国家海洋局第一海洋研究所 2017(学位年度)
摘要:地球在形成后的初期是一个高温缺氧的极端环境,与现在发现的一些热泉环境极为相似。由于地球形成后,出现最原始、最丰富的生命体是微生物,因此很多科学家认为对热泉环境中的微生物的研究有助于揭示地球上生命的起源,同时还能开发出更适应用于工业生产和科学研究的热稳定酶。其中,最为成功的例子就是广泛应用于PCR的DNA聚合酶。本研究以产κ-卡拉胶酶的热泉微生物为研究对象,对其分泌的κ-卡拉胶酶进行了一系列研究,从而为生物酶法制各卡拉胶寡糖及卡拉胶寡糖的应用提供科学依据。
  本文以κ-卡拉胶作为唯一碳源,从印尼热泉样品中分离出16株具有κ-卡拉胶酶活性的菌株,经16S rRNA基因鉴定表明,其中11株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),2株属于芽孢杆菌属(Bacillus),其余3株分别属于科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、希瓦氏菌属(Shewanella)和海单胞菌属(Marinomonas)。以其中1株酶活性最高的Bacillus sp.Carl9为研究对象,对其发酵条件进行了优化。发酵条件优化结果显示,9个因子影响Bacillus sp.Car19的产酶量;其中,3个主要影响因素分别为培养温度、培养基中Cu2+、NaCl浓度。综合次要因素对Bacillus sp.Car19产酶影响,Bacillus sp.Car19最佳产酶发酵条件为:培养温度52℃、Cu2+浓度6.93 mmol/L、NaCl浓度37.03 g/L,培养基pH为6,接种量1%,培养时间36 h,半乳糖浓度0.3 g/L,硝酸铵浓度7g/L,卡拉胶浓度0.5 g/L;优化后发酵上清液酶活力达到15.21 U/mL,与优化前相比提高了1.5倍。
  以优化的培养基培养Bacillus sp.Car19,对其分泌的卡拉胶酶进行分离纯化结果表明,该卡拉胶酶相对分子质量在40~50 KDa之间;酶最适反应温度为60℃,具有良好的热稳定性,最适反应pH约为7;金属离子Sr2+、Fe2+、Cd2+、Fe3+对该酶活性有抑制作用,其中Sr2+的抑制作用最为明显,酶活下降约50%;Cu2+、Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用,其中Cu2+作用最显著,能使酶活提高80%左右,而Ni2+、Mn2+等金属离子对酶活性无显著影响;底物特异性表明,该酶仅对κ-卡拉胶具有显著的降解活性,而对ι-卡拉胶、λ卡拉胶以及琼胶和褐藻酸钠等底物无降解活性。酶解产物经薄层层析(TLC)分析表明,该卡拉胶酶降解卡拉胶的最终产物为卡拉二糖。
  利用卡拉胶酶与卡拉胶反应得到的卡拉胶二糖进行植物促生抗病实验结果表明,1%和1‰卡拉寡糖水溶液处理的小麦种子,其根系较空白对照组增长效果分别达到29.48%和27.17%,且根较空白对照的粗壮;在防治黄瓜病毒病方面,2%卡拉寡糖稀释100倍和200倍的水剂对黄瓜白粉病的防治效率分别达到55.27%和45.36%,防治效果比市面上常用的氨基寡糖稍低;同时,在防治黄瓜白粉病实验表明,1%和2%卡拉寡糖水溶液防治效果分别为48.99%和37.82%。有关卡拉寡糖的活性作用机理以及该酶编码基因的克隆和异源表达等工作还需进一步研究。
[硕士论文] 楚茨
生物学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:作为鳞翅目类昆虫的代表,家蚕是研究农业及林业类害虫防治优先考虑的生物模型,也是研究动物细胞分化、生长、遗传和变异的重要模式生物之一。利用家蚕幼体作为一种生物反应器,可以低成本和大规模地获取外源蛋白。真核生物DNA聚合酶δ一般是多亚基蛋白复合物,例如高等哺乳动物DNA聚合酶δ多由四亚基组成,昆虫DNA聚合酶δ多由三亚基组成。真核生物DNA聚合酶δ是非常重要的复制型DNA聚合酶,具有持续合成DNA的能力,其3’-5’核酸外切酶活性保证复制的高保真度,并且在调节细胞正常代谢以及保证基因组完整性和稳定性等方面发挥重要的作用。
  本研究基于MultiBac系统表达家蚕DNA聚合酶δ复合物。通过与人(Homo sapiens)DNA聚合酶δ基因的生物信息学比对分析,从家蚕数据库(GenBank)中获取家蚕DNA聚合酶δ复合物三个亚基的基因序列。从家蚕五龄幼虫的血淋巴中提取总RNA,经RT-PCR反应得到cDNA。根据生物信息学比对分析结果设计引物并以cDNA为模板分别PCR得到三个亚基的基因,分别为Bmpol-1、Bmpol-2及Bmpol-3。然后分别制备pFastBacHTb-Bmpol-1和pUCDM-Bmpol-2/3两个重组质粒。辅助质粒pMon7124表达的转座酶介导pFastBacHTb-Bmpol-1和Bacmid在E.coli细胞内发生Tn7转座反应,通过蓝白斑筛选及抗性筛选得到Bcmid Bmpol-1重组受体。pBADZHis6Cre质粒表达的 Cre重组酶介导pUCDM-Bmpol-2/3与Bacmid Bmpol-1在Cre-loxP位点发生特异性重组,得到Bacmid Bmpol-1/2/3重组质粒。将重组Bacmid质粒转染Sf-9细胞制备重组病毒。从感染的细胞中提取RNA,经RT-PCR反应检测到Bmpol-1、Bmpol-2及Bmpol-3基因在细胞内均发生转录。Western blot杂交实验表明,家蚕DNA聚合酶δ复合物BmPOL-1及BmPOL-3蛋白亚基均在Sf-9细胞中表达(目前还没有BmPOL-2蛋白亚基抗体,因此并未做BmPOL-2亚基Western blot杂交实验)。poly(dA)/oligo(dT)酶活性检测实验表明,单独的Bmpol-1大亚基不能催化合成DNA,而三亚基复合物能催化DNA合成,显示出酶学活性。使用Strep-Tactin和Ni2+-NTA亲和层析柱大量纯化得到家蚕DNA聚合酶δ复合物,质谱鉴定各亚基分子量分别为123.5 KDa(BmPOL-1)、49.1 KDa(BmPOL-2)和52.6 KDa(BmPOL-3)。至此,本研究通过使用MultiBac系统成功制备了具有酶学活性的家蚕DNA聚合酶δ复合物,使大量且快速获取家蚕DNA聚合酶δ复合物用于深入研究家蚕DNA复制以及DNA损伤修复成为可能。
[博士论文] 郭丽敏
分析化学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:核酸适配体是一种能和靶分子特异性结合的人工体外合成的单链寡核苷酸,其靶分子可以是离子、小分子、蛋白质甚至整个细胞。近年来,适配体作为分子识别探针已经在医疗诊断、化学分析、环境检测、食品安全等方面发挥了重要作用。在基于适配体的分析研究中,凝血酶的两种适配体是短链,合成成本低,而且它们可与凝血酶的不同位点结合,形成三明治结构,同时不影响凝血酶的催化活性,因此凝血酶与其适配体是最常见的研究对象。但是这些研究大多数都集中在对凝血酶的检测上。
  利用适配体对凝血酶的亲和力以及凝血酶的催化活性等特点,本文发展了新型的凝血酶联适配体法(TLAA)检测其他蛋白质,拓展了凝血酶及其适配体的分析应用。构建了一条由蛋白质目标分子适配体序列和凝血酶的适配序列体组成的DNA探针,DNA探针既可与蛋白质目标分子结合,也可与凝血酶结合,通过凝血酶和适配体的直接结合将凝血酶分子标记在蛋白质上,从而将蛋白质的检测转化为凝血酶的检测。凝血酶催化底物产生光学信号,实现对蛋白质的定量测定。以血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)的检测为例,分别建立了几种不同模式的TLAA检测方法,包括三明治夹心模式的TLAA,滚环扩增偶联的TLAA和竞争模式的TLAA。整个论文包括如下6个章节:
  第一章:简要介绍了适配体的筛选和特点,综述了基于适配体的蛋白质检测方法,阐述了论文的立题背景、主要研究内容和创新点。
  第二章:发展了一种以磁球为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。DNA探针(由PDGF-BB的适配体、凝血酶的适配体和连接臂三部分组成)和包被在磁球上的抗体分别与PDGF-BB的两个位点结合,形成三明治结构,凝血酶与DNA探针中凝血酶适配体部分结合从而标记在三明治复合物上,凝血酶催化荧光底物或生色底物,产生可检测信号的产物,实现定量测定PDGF-BB。磁球的预富集作用和凝血酶的催化放大使该方法有较高的灵敏度,使用荧光底物时,检出限为16pM。使用生色底物可以进行简单常见的吸光度分析,同时由于产物有颜色,可以利用反应前后溶液颜色的变化进行目测,实现对PDGF-BB的半定量检测。
  第三章:发展了一种以微孔板为基底的三明治模式TLAA检测蛋白质。在上一章工作的基础上,本论文以微孔板为固体基质,利用其快速高通量检测的优点,将抗体修饰在微孔板上,随后依次在微孔板中加入PDGF-BB和DNA探针,形成三明治结构。然后凝血酶被DNA探针捕获,标记在复合物上。凝血酶催化荧光多肽底物产生荧光信号,信号的强度与PDGF-BB的浓度在一定范围内呈线性相关。该方法也可用于复杂样品中PDGF-BB的检测。
  第四章:发展了滚环扩增偶联的凝血酶联适配体检测方法(RCA-coupled TLAA)。方法利用RCA反应产生具有重复凝血酶适配体序列的寡核苷酸,从而实现多重的凝血酶标记,而凝血酶的催化功能则将检测信号放大,实现了RCA和凝血酶催化的双重放大效应,进一步提高了检测灵敏度。修饰在微孔板上的抗体、PDGF-BB和连有引物的适配体形成三明治结构,引物与编码有凝血酶适配体互补序列的模板杂交,RCA反应将引物序列延伸,产生一条含有多重凝血酶适配体的长DNA链,RCA产物可以捕获许多凝血酶分子,在三明治复合物中实现多重的凝血酶标记。凝血酶催化其生色底物或荧光底物产生可检测的产物,实现对目标蛋白质的定量测定。由于RCA和凝血酶催化的双重放大效应,检测的灵敏度得到提高,在使用荧光底物的情况下,方法的检出限可低至3.1pM,与单个凝血酶分子标记相比,检出限降低了62倍。
  第五章:构建了竞争模式的TLAA检测体系。首先PDGF-BB吸附在微孔板表面,然后溶液中的PDGF-BB和固定在微孔板上的PDGF-BB竞争性地与一条包含PDGF-BB适配体和凝血酶适配体的DNA探针结合,与固定的PDGF-BB结合的DNA探针捕获凝血酶分子,最后捕获的凝血酶催化底物产生荧光信号,进而完成对溶液中PDGF-BB的定量检测。溶液中的PDGF-BB越多,与固定的PDGF-BB结合的凝血酶就越少,从而引起荧光信号的下降。方法可以检测0.125nM的PDGF-BB,同时实现在1%人血清的检测。与三明治检测模式相比,竞争模式的TLAA只需要一个亲和探针,缩短了实验时间。通过简单改变DNA探针中适配体序列,该方法可以凝血酶为标记用于其它物质的检测,扩大了检测物范围。
  第六章:总结了本文的主要工作和创新点,提出了下一步的工作计划。
[硕士论文] 马振桥
食品科学 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:维生素B6(Vitamin B6,VB6)是一类可以相互转换的吡啶类化合物的总称,包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamin,PM)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)以及它们所对应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5'-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5'-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoal-5'-phos phate,PLP)。其中PLP是细胞内140多种酶的辅酶。动物自身不能合成VB6,其需要从食物中获取各种形式的VB6通过代谢转换途径完成PLP的合成。在自然界中存在两条从头合成途径,一条是DXP依赖途径,另一条是DXP非依赖途径。植物通过DXP非依赖途径合成PLP,PLP在植物体内经过一系列酶的催化作用代谢转换成不同形式的VB6。在这个过程中VB6磷酸酶、PL还原酶、PM-丙酮酸转氨酶、吡哆醛激酶(PLK,Pyridoxal kinase)和磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO,Pyridoxine5'-phosphate oxidase)起着至关重要的作用。PLK可以将PN、PM和PL磷酸化生成PNP、PMP和PLP,PNPO可以将PNP和PMP氧化生成PLP。
  植物作为动物的主要食物来源,也是VB6的主要来源。植物体内VB6的代谢转换途径的研究对人体营养素VB6的供给问题具有重要的意义,PLK和PNPO两个关键代谢转换作用酶的研究也尤为必要。在植物拟南芥中已经克隆鉴定出PLK和PNPO并通过T-DNA插入突变在基因表达水平上研究对其他VB6合成代谢转换酶基因表达的影响,但其还缺乏在不同物种和不同方法上的验证。本实验采用模式植物烟草为材料进行PLK和PNPO相关研究,对植物体内营养素VB6的合成和代谢转换具有参考作用。
  本研究,利用拟南芥PLK和PNPO cDNA序列在烟草EST库中检索,寻找到预测编码烟草NtPLK和NtPNPO的eDNA序列,在Genbank上的登录号分别为XM_009804516.1和XM_009801441.1。以提取的烟草叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板,设计引物对NtPLK和NtPNPO的编码框进行克隆得到预期大小的DNA片段,产物测序结果显示NtPLK的编码框长为1020bp,编码的蛋白含有339个氨基酸,分子量大小为37.4kDa,等电点为6.96。氨基酸序列比对发现相对哺乳动物、昆虫和细菌存在N端延长,酶活性位点处的氨基酸残基和其他物种一样保守。该基因在染色体上跨度1.2kb DNA,含有13个外显子和12个内含子。NtPNPO的编码框长为1620bp,编码的蛋白质含有539个氨基酸,分子量大小为60kDa,等电点为8.03。氨基酸序列比对发现与哺乳动物、昆虫和细菌相比在N端大幅度延长约280个氨基酸残基,该区域主要是YJeF_N功能域,该功能域功能目前尚不清楚。该基因在染色体上跨度0.7kb DNA,含有14个外显子和13个内含子。NtPLK在烟草的叶片中转录表达水平最高,根和茎中转录表达水平较低且比较接近。NtPNPO在烟草的叶片中转录表达水平最高,茎中次之,根中最低。
  将克隆得到的NtPLK和NtPNPO的编码框序列导入到pET32a(+)表达载体中在Rosetta大肠杆菌中表达出预期蛋白。NtPLK的粗酶液相对于底物PL,显示的吡哆醛激酶的活性为29.7nmolPLP/mg/min。NtPNPO的粗酶液相对于底物PMP,显示的磷酸吡哆醛氧化酶的活性为21.4nmolPLP/mg/min。酶活证实了克隆的序列所编码的蛋白为烟草PLK和PNPO。
  选取NtPLK的编码框内490bp的特异性的序列和NtPNPO的编码框内497bp的特异性的序列,将其各自的正反向序列分别插入pHANNIBAL中内含子的两端,构建发卡结构的RNAi载体。利用农杆菌EHA105介导侵染烟草叶片,通过qRT-PCR检测显示NtPLK RNAi在烟草叶片中下调NtPLK转录水平表达效果的最佳时间是72h,NtPNPO RNAi在烟草叶片中下调NtPNPO转录水平表达效果的最佳时间是48h。NtPLK RNAi处理后72h,烟草叶片中NtPLK、NtPNPO和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了50.9%、51.1%和26.3%,而NtPLR上升了27.7%;NtPNPO RNAi处理后48h,烟草叶片中NtPNPO、NtPLK、NtPLR和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了68%、22.1%、29.5%和33.9%。证实了构建的RNAi载体成功的下调了目的基因的表达。
[硕士论文] 王晶
应用化学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:在本论文中,运用酶活力的分析方法、DLS法及界面性质研究的张力及扩张流变法等研究了碱性蛋白酶溶液随放置时间的增加其界面性质的变化情况;并用多个界面吸附模型将碱性蛋白酶的平衡界面张力(空气/水、正己烷/水界面)进行了拟合,比较了碱性蛋白酶在两个不同界面上的吸附。
  本论文首先研究了不同质量分数的碱性蛋白酶溶液随放置时间的增加,其酶活力、粒径和Zeta电位、界面张力和界面扩张流变的变化。
  本实验测定了不同质量分数的碱性蛋白酶酶活力、粒径和Zeta电位、界面张力和界面扩张流变随放置时间的变化。随碱性蛋白酶溶液放置时间的增加和质量分数的增大,溶液中蛋白酶分子的粒径增大、Zeta电位下降,碱性蛋白酶溶液体系不稳定,溶液内蛋白酶分子趋向于发生聚集。在体相溶液中,碱性蛋白酶分子发生聚集首先导致了碱性蛋白酶的活力下降甚至失活,其次还改变了蛋白酶分子从体相扩散到界面的动力学。碱性蛋白酶溶液在水气界面的平衡张力值增大且随着时间的增加,界面吸附趋于平衡,由此引起了界面膜的弹性和机械强度全部下降的改变。
  本论文其次主要研究了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的吸附情况。
  本实验主要运用界面张力、界面扩张流变及用不同吸附模型对空气/水界面和正己烷/水界面的平衡界面张力拟合,研究了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的吸附情况进行了比较研究。首先,分别测定了不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的动态界面张力随时间的变化关系;其次,用不同的吸附模型对不同浓度碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的平衡界面张力进行了拟合;此外,在一定的频率范围内,对不同浓度的碱性蛋白酶溶液在空气/水界面和正己烷/水界面的总模量随碱性蛋白酶浓度的变化情况进行测定,进一步研究碱性蛋白酶在空气/水界面和正己烷/水界面的的界面性能并进行比较。
[硕士论文] 邓文凤
生物化学与分子生物学 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:1,2,3-三氯丙烷(TCP)作为表氯醇工业生产中的主要副产物,已经成为一种持久性的地下水污染物,对人体具有潜在致癌性,急需建立一种廉价高效的技术将TCP从污染源中清除。相比传统的手段,生物降解环境污染物的方法更加环保高效,同时也能节约成本带来更多的效益。卤醇脱卤酶(HHDHs)是一种能够催化卤代醇的碳-卤键断裂的裂解酶,因此可以降解环境中的TCP。同时,它们也可以在亲核试剂存在的情况下催化逆向的环氧化物开环反应,可以用来制备多种具有重要应用价值的手性卤代醇、环氧化物和β-取代醇。改造卤醇脱卤酶的脱卤活性和立体选择性是本论文研究的两个重要方面。
  最新研究显示,在生物降解1,2,3-三氯丙烷(TCP)的多酶体系中,HheC酶催化中间产物2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)发生脱卤反应的活性极低,严重制约了TCP的生物转化。为此,本论文借助组合式改造策略来提高HheC酶对2,3-DCP的催化活性。首先运用分子动力学模拟获得HheC在对2,3-DCP进行脱卤时相关的氨基酸残基信息,预测筛选出得到可能发挥作用的10个关键位点;然后借助半理性设计的策略,将这10个位点进行合理组合构建了6个饱和突变文库;筛选约8200个克隆子后,最终获得了30个针对底物2,3-DCP脱卤活性提高的突变体,其中突变体P84A活性提高了21.8倍,F86I提高16.7倍,F12Q/F186L和W249P分别提高17.4倍和16.9倍。筛选得到对映体选择性提高的突变体F86S/L142Y(由ER=7.6提高到ER=200),W139A(由野生态的ER=7.6提高到ER=184),P84A也从ER=7.6提高到ER=72。
  通过分子对接和MD分析进一步探究上述突变体催化特性大幅改进的结构基础。结果表明:P84、F86、F12、F186和W249这些位点对提高HheC降解2,3-DCP的活性至关重要,且这些位点突变为小侧链氨基酸时活性更高;氨基酸P84,F86, L142,T134,N176和W139在调控HheC酶对底物的立体选择性方面也起着关键作用,P84,F86和W139突变成小侧链氨基酸时,卤醇脱卤酶HheC对(R)-2,3-DCP有很强的偏好性,而当T134和N176发生突变时,HheC酶对(R)-2,3-DCP的偏好性全部丧失,有逆转HheC偏好性的趋势。综上所述,卤醇脱卤酶HheC的脱卤活性和立体选择性的调控是由多个氨基酸共同完成的。因此,组合式改造策略对HheC相关催化特性的改造具有很大的优势。
[硕士论文] 周洁
营养与食品卫生学 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:维生素B6(VitaminB6,VB6)是六种可以相互转化的吡啶衍生物的总称。维生素B6是多种酶的辅酶,在多种物质代谢反应中起重要的作用。磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)是维生素B6的主要辅酶活性形式。PLP以辅酶形式参与多种氨基酸代谢转化。PLP的化学结构中存在活泼醛基,在活泼醛基的作用下生物体内的游离PLP会与含有胺基的化合物相结合生成醛亚胺等物质,且这种结合反应极易发生,这就可能影响生物体内含有胺基的化合物或其他物质的正常生理水平。PLP的动态平衡对哺乳动物的正常生理功能的维持有着重要的意义。
  PLP代谢在哺乳动物体内研究较多,但是对其如何保持动态平衡机制尚不明确。生物体内的PLP水平受到PLP磷酸酶、PL激酶和PNP氧化酶等因素的调控。生物体内游离PLP的浓度需要一定机制进行调控,而PLP的水解是其重要的调控机制。对PLP水解相关酶的基因克隆和分析等方面的研究是明确PLP的水解机制的基础。本研究将大豆作为实验材料,由于大豆种子中含有丰富的植物蛋白,在相应生理过程中氨基酸代谢非常活跃,因此维持体内PLP浓度的动态平衡对大豆有非常重要的意义。
  本实验以大豆为实验材料,根据在NCBI中查找得到已被命名但未被验证的大豆磷酸吡哆醛磷酸酶(GmPLPP)(Gene ID:100806718)基因,设计引物并克隆,在表达菌株中进行原核表达获得目的蛋白,对目的蛋白进行纯化并研究相关的酶学性质,同时构建GmPLPP的RNAi载体。
  本研究克隆的大豆GmPLPP基因cDNA长948bp,编码315个氨基酸,对应的分子量约为36.91kDa。核苷酸序列分析结果显示,GmPLPP与人和小鼠特异性PLP磷酸酶的一致性都达到36%。氨基酸序列分析结果显示,GmPLPP的氨基酸序列与人和小鼠特异性PLP磷酸酶的氨基酸序列在与活性位点有关的氨基酸相对保守,同时它们之间含有多个同源的蛋白质翻译后修饰位点(包括1个N-糖基化位点、3个磷酸化位点和3个N-豆蔻酰化位点)。将大豆预测的PLPP基因与已验证的人和小鼠的PLPP基因以及多个物种预测的PLPP基因对比。氨基酸序列的一致性结果显示,多个物种的PLPP基因存在一个与活性位点有关的保守的氨基酸——-天冬氨酸;并且发现动物体内PLPP的氨基酸序列之间的一致性较高,植物体内的PLPP氨基酸序列之间的一致性也较高,但是动物之间的PLPP氨基酸序列一致性不高,这可能与植物和动物之间的物种差异性有关。
  酶学性质分析结果显示,该酶的最适pH约为7.5,最适温度45℃;通过不同二价金属阳离子对酶活性影响研究发现,Mg2+对该酶的酶促反应有促进作用,并且能够解除低浓度EDTA对酶促反应的抑制作用;Ca2+、Zn2+对酶促反应有弱抑制作用;Mn2+和Cu2+对酶促反应有强抑制作用,这种作用会随其浓度增加而增强。
  在最适酶促反应条件下,以4-硝基苯磷酸二钠(pNPP)、磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)为底物的Km值分别为0.608mmol/L、0.452mmol/L和0.637mmol/L,Vmax分别为0.703umol/min/μg protein、0.814umol/mir/μg protein和0.967umol/min/μgprotein。由于PLP的Km值比pNPP和PMP小,说明该酶对PLP的亲和力相对较高。以多种磷酸酯型化合物为底物进行酶活性测定发现,该酶对其他底物也有一定活性,但是对PLP活性是最大的。根据不同化合物对以PLP为底物的酶促反应的影响结果可知,发现咪唑对酶促反应存在竞争抑制作用。并且,pNPP、PMP、Na3PO4、Na2MoO4、Na4P2O7和KF对酶促反应有抑制作用,并且随浓度升高抑制性增强。本研究已成功构建出GmPLPP的RNAi载体,以便后续研究的进行。
[硕士论文] 刘凡
病原生物学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:将 N-端含有 His-tag标签的具底物杂泛性的芒果 C-糖基转移酶 MiCGTb通过 Ni-柱进行初步纯化,然后再通过多级 HPLC分离得到高纯度蛋白。通过对不同序列长度的蛋白的结晶条件(包括温度、缓冲液、pH、蛋白浓度、沉淀剂等)的筛选,最终确定适合进行结构研究的蛋白序列长度,得到没有底物(受体或供体)结合的糖基转移酶的晶体结构,并初步确定其催化活性中心。
  方法:1、将来源为芒果的已知序列的 C-糖基转移酶 MiCGTb基因通过设计引物克隆扩增连接到pET28载体上,其C-糖基转移酶MiCGTb的N-端含有His-tag标签和TEV酶切位点,构建的pET28-MiCGTb载体在RIPL宿主中表达,IPTG的终浓度为0.2mM,30℃诱导表达,经 Ni-柱进行初步纯化,通过阴离子交换柱再次纯化,最终分离得到高纯度的目的蛋白。
  2、将来源为芒果的已知序列的 C-糖基转移酶MiCGTb基因通过蛋白混乱度系统分析,分别将其N-端和C-端的7个和5个氨基酸截去,之后通过设计引物克隆扩增连接到 pET28载体上,截短后的 C-糖基转移酶 MiCGTb(JMiCGTb)的 N-端含有 His-tag标签和 TEV酶切位点,构建的pET28-JMiCGTb载体在RIPL宿主中表达,IPTG的终浓度为0.2mM,30℃诱导表达,经 Ni-柱进行初步纯化,通过阴离子交换柱再次纯化,最终分离得到高纯度的目的蛋白。
  3、构建的 pET28-JMiCGTb载体在 B834表达宿主中表达,获得含有稀有元素硒的蛋白,用于异常散射实验获得实验数据4使用初筛结晶试剂盒筛选蛋白结晶的条件,初筛试剂盒为 HamptonⅠ、HamptonⅡ、CRYO1和 CRYO2两个产品的试剂盒,互相弥补彼此之间缺失的结晶条件。初筛和复筛均是采用的16孔悬滴法,经过大量的初筛、复筛以及条件优化最终得到了相对较好的JMiCGTb晶体。
  结果:1、优化MiCGTb C-糖基转移酶的表达菌株,采用不同的表达宿主,得到高表达 MiCGTb的菌株。
  2、通过采用不同的纯化手段,最终获得高纯度的 C-糖基转移酶MiCGTb可溶性蛋白。
  3、获得C-糖基转移酶MiCGTb的单晶以及X-Ray衍射数据。
  结论:1、获得高表达的截短的 C-糖基转移酶 MiCGTb表达菌株。
  2、获得高纯度的截短的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白。
  3、获得截短的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白质单晶。
  4、获得一组6埃的C-糖基转移酶MiCGTb蛋白质单晶X-Ray衍射扫描数据。
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