绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 14007 条结果
[博士论文] 杨静思
化学(无机化学) 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:生物大分子结构的解析有助于对它们功能的理解,进而可针对性地进行药物设计、基因改造、疫苗研制开发,甚至人工构建蛋白质等工作,从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用,因此具有重要意义。X射线晶体学是研究生物大分子结构和功能的主要方法。本论文研究内容主要包括两个方面:采用X射线晶体学方法研究酵母5'-核苷酸酶的结构和功能,探索5'-核苷酸酶反应机制;研究大肠杆菌毒素-抗毒素复合物的结构和功能,探讨抑制毒性机制及自身转录调控机制。
  5'-核苷酸酶(5'-nucleotidase,简称5'-NT)可水解多种核苷酸,是维持体内核苷酸水平以保证生物体内多种生理过程和代谢过程的正常运行的重要的一类酶。5'-核苷酸酶在个体的生长、繁殖、遗传、变异等生理生化功能方面起着重要作用。HD-domain超家族蛋白可作为5'-核苷酸酶,在核苷酸代谢和信号传导方面发挥重要作用。目前还没有关于真核生物中HD-domain5'-核苷酸酶结构与功能的报道。本论文对模式生物酵母中含HD-domain的5'-核苷酸酶YGK1(YGL101W)和YB92(YBR242W)进行结构和功能研究,得到以下结果:
  表达、纯化了YGK1和YB92的重组蛋白,证实了两个蛋白均属于5'-核苷酸酶。通过晶体学方法,解析了YGK1的晶体结构。YGK1蛋白活性中心位于中间loop区域形成的凹槽中,活性中心螯合一个金属离子,金属离子周围的残基构成保守的HXnHDXnD基序(motif)。实验结果表明,YGK1蛋白在溶液中以二聚体形式存在。通过突变体活性实验,证实除了位于活性中心保守氨基酸(His89、Asp90和Glu93)以外,还存在其他的保守氨基酸(Glu114和Glu145)对YGK1的催化活性起到了至关重要的作用。这些研究找到了核苷酸酶活性的关键结构域和催化残基,解释了5'-核苷酸酶的催化活性机制,为探索其在核苷酸代谢和信号传导方面的机制打下了基础。
  抗菌药物的不合理使用,使细菌耐药性急速加剧。尤其是耐药性在致病菌中的快速播散,更是成为全球面临的最严重公共卫生问题之一。毒素-抗毒素(Toxin-antitoxin,简称TA)是细菌和古细菌中一类重要的生物大分子复合物,目前TA的研究集中在肠道细菌和致病菌当中。TA能够促进多重耐药菌群的形成,是影响耐药性扩散的重要因素。同时TA参与细菌的程序性死亡、调控生物被膜形成、介导细菌环境适应过程等多个重要的生命过程。为了全面了解TA毒素与抗毒素的作用模型和特异性识别DNA的分子机制和模型,本论文对模式生物大肠杆菌TA系统HigBA和HicAB的结构及功能进行了相关研究,得到以下结果:
  通过分析hicAB基因序列,发现抗毒素蛋白HicB开放阅读框5'端的两个ATG均可作为翻译起始密码子,进而产生两种长度的蛋白(HicBs和HicBL)。通过体外重组表达纯化得到了相应的这两种形式的HicAB复合物:HicABs和HicABL。通过两种复合物蛋白的结晶实验,发现HicABs复合物相对更容易结晶,从而获得了HicABs复合物的晶体并收集了该复合物的X射线单晶衍射数据。
  通过晶体学方法,解析了HigBA复合物的晶体结构。HigBA复合物呈现异源四聚体形式(HigB-(HigA)2-HigB)。其中抗毒素蛋白HigA全部由α螺旋组成,围绕着球形的毒素蛋白HigB。两个抗毒素蛋白HigA的N端通过疏水相互作用形成同源二聚体,进而组成四聚体复合物。在复合物中,虽然毒素蛋白HigB的活性位点并没有完全被抗毒素蛋白HigA遮挡,但它却不释放毒性。原因在于只有当毒素蛋白HigB在细胞体内并结合在核糖体上时才能发挥对RNA的降解作用。因此,抗毒素蛋白HigA抑制毒性的机制为:在空间上阻断毒素蛋白HigB与核糖体结合,进而抑制其活性。通过蛋白与DNA体外结合试验发现,抗毒素蛋白HigA和复合物HigBA均可结合位于higBA操纵子区的-7到-68区域的两段回文序列。DNA在蛋白上的结合部位位于抗毒素蛋白HigA的C端结构域(HTH motif)。这些研究提出了TA新型的抑制毒素机制和结合DNA方式,对TA系统抑制毒素机制和自身调控系统的研究具有重要意义。
[硕士论文] 徐慧
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:RNA甲基化作为一种表观遗传标记,在基因调控中发挥着重要作用。至今为止,已发现RNA存在着100多种修饰,其中甲基化是主要的修饰形式,6-甲基腺嘌呤(m6A)和5-甲基胞嘧啶(m5C)是最具有代表性的两种甲基化修饰。有研究表明RNAm5C修饰在生物体的发育以及癌症的发生中起重要作用。最初被认为是DNA甲基转移酶的TRDMT1(tRNA aspartic acid methyltransferase1)近十年来被证实是RNA m5C甲基转移酶,催化tRNA产生5-甲基胞嘧啶修饰。最近有研究发现TRDMT1基因对器官形成、生物体的发育以及疾病的发生有影响。然而,对TRDMT1调控这些过程的分子机制尚不清楚。
  本研究利用CRISPR/Cas9诱导的同源重组技术在RNA甲基化酶TRDMT1基因的转录起始位点上敲入转录终止序列BGH ploy(A),终止TRDMT1的表达从而达到敲除的目的。通过构建TRDMT1敲除的HEK293细胞系,研究TRDMT1去表达对细胞表型以及其他基因表达的影响,从而了解TRDMT1基因的功能,为研究RNAm5C甲基化的功能提供新思路。主要的研究方法与结果如下:
  1、建立RNA甲基化酶TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系
  首先,针对TRDMT1第一个外显子设计并筛选出具有高基因编辑效率的sgRNA表达载体,并构建含有抗性筛选基因(PuroR和NeoR)和转录终止序列BGH ploy(A)的同源重组Donor载体。其次利用CRISPR/Cas9系统介导的同源重组将Donor序列敲入TRDMT1基因的第一个外显子前,利用嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)对转染的HEK293细胞进行筛选。最后通过RT-qPCR鉴定TRDMT1的表达情况。结果表明TRDMT1基因发生了转录终止,且细胞株TRDMT1转录终止效率达到了99%,最终确认成功获得了TRDMT1敲除的HEK293细胞系(命名为:HEK293-TRDMT1-Knowdown,HEK293-TKO)。
  2、TRDMT1敲除与恢复对细胞表型的影响
  研究敲除TRDMT1基因对HEK293细胞表型的影响,对HEK293-TKO细胞进行了4个表型观测:细胞周期、细胞生长曲线、细胞划痕以及细胞克隆形成。细胞周期实验结果表明,TRDMT1基因敲除能影响HEK293细胞周期,导致G1期细胞显著减少,G2期细胞显著增加。细胞生长曲线实验结果显示:TRDMT1基因敲除能显著抑制HEK293细胞的增殖,细胞数量在第2-3天达到显著差异(P<0.05),在第4-7天达到了极显著差异(P<0.01)。然而细胞单克隆实验结果说明TRDMT1的敲除对细胞群体依赖性没有影响。细胞划痕实验结果表明,TRDMT1基因敲除抑制了HEK293细胞的迁移能力,12h和24h的迁移距离差异达到极显著水平(P<0.01)。
  为研究TRDMT1基因敲除的作用是否可以通过TRDMT1的重新表达来恢复。首先构建并鉴定TRDMT1过表达载体pcDNA3.1-TRDMT1,利用ExFect(R)转染试剂将pcDNA3.1-TRDMT1质粒瞬时转染至HEK293-TKO细胞中;然后对瞬转的HEK293-TKO细胞进行细胞生长曲线实验和细胞划痕实验。结果显示:在HEK293-TKO细胞中重新表达TRDMT1后,恢复了细胞增殖能力以及活性,并同时增强了其迁移能力,进一步证实TRDMT1基因确实对细胞增殖和迁移能力有影响。
  3、转录组测序及分析
  为研究TRDMT1基因敲除对HEK293细胞基因表达的影响,对HEK293和HEK293-TKO细胞进行了转录组测序。结果发现HEK293-TKO细胞和HEK293细胞之间存在2352个差异基因,其中有1585个基因上调,767个基因下调。通过GO分析发现差异基因主要富集在有丝分裂细胞周期G2/M期转变、细胞迁移、细胞黏附以及Rho蛋白信号转导等生物过程。差异基因KEGG分析说明差异基因主要富集在RNA剪接、神经配体-受体互作、cAMP信号传导途径、TGF-β信号、NOTCH信号、细胞周期、癌症等相关通路。从这些通路中选取了11个差异基因进行RT-qPCR验证,结果显示与转录组测序一致。TRDMT1敲除后导致NOTCH1、DLL4、CREBBP、FN1基因下调,CIR1、CCNE2、CDK1、TGFB2、UPF3B、ROCK1、ROCK2和APC基因上调,进一步说明TRDMT1与细胞周期、细胞增殖以及迁移密切相关。在TRDMT1敲除型斑马鱼中检测到CREBBPa、NOTCH1和DLL4具有相同的表达趋势,这暗示了TRDMT1介导的RNAm5C甲基化可能通过NOTCH信号通路、cAMP信号传导途径以及癌症相关通路在生物体个体发育过程中起到重要的调控作用。
[博士论文] 吴成超
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:人类基因组计划发现,人类基因组中超过98%的区域是非编码区域。ENCODE、Roadmap epigenomics等后续计划进一步发现,非编码DNA中包含如DNA甲基化位点、启动子、增强子等众多DNA调控元件。DNA调控元件通过激活或抑制转录事件,精准地调控目标基因的表达量。一方面,这些DNA调控元件正是由于其环境序列的特异性才能够参与转录调控;另一方面,DNA序列在数学上可被视为有限字母表上的有限词,研究其复杂度特征可以挖掘DNA的序列特异性。这激发我们通过序列复杂度数学工具来量化识别DNA调控元件。本研究分为以下三部分:
  第一部分,我们详细描述两种序列复杂度的数学定义,重点研究其计算算法,并通过特征选择筛选出有效特征。首先根据不同序列长度确定因子复杂度的算法获取原始特征,随后根据二阶差分工具筛选拓扑熵特征,并最终确定因子复杂度的有效特征。同时,我们研究了abelian复杂度的数学定义和计算算法,并通过对abelian复杂度特征进行特征筛选确定出其有效特征。
  第二部分,我们应用因子复杂度有效特征构建CpG甲基化水平预测模型。我们首先获取人类胚胎细胞的甲基化实验数据,并筛选其中的CpG甲基化位点。在将位点扩增至合适长度之后,我们提取序列因子复杂度特征和序列的基本组成特征,并构建了基于支持向量机算法的CpG甲基化水平预测模型,该模型在不同染色体上的平均分类准确率为94.7%。与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后我们利用已构建的预测模型预测全基因组水平不同功能元件中的CpG甲基化平均水平,通过与实验数据的对比,进一步验证了该模型的预测能力。
  第三部分,我们应用abelian复杂度特征构建增强子预测模型。我们从FANTOM5计划的数据库中获取人类基因组的增强子数据,通过提取序列abelian复杂度特征和序列基本组成特征,构建了基于随机森林算法的增强子预测模型,其中正负样本1∶1模型的分类准确率为93.1%,正负样本1∶10模型的分类准确率为96.0%。在与已发表工具的比较中,我们的模型获取了更高的预测准确率。最后利用该模型在人类基因组22号染色体进行步长为100bp的扫描预测,成功预测到5,123条增强子区域。以不同细胞系和组织的组蛋白修饰信号为佐证,扫描预测准确率最高可达42.8%。
  综上所述,我们通过研究序列的因子复杂度特征和abelian复杂度特征,结合基本序列组成特征,成功构建了DNA甲基化、增强子等DNA调控元件的精准预测模型。基于预测模型的全基因组扫描预测结果可以缩小和降低相关生物学实验的目标范围和难度,为相关研究工作提供了有力的参考和指导,有助于解析人类复杂疾病的转录调控机制和完善人类基因组功能元件的注释。
[硕士论文] 张宝
发育生物学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:CRISPIR/CAS9系统是重要的基因编辑技术。研究证实,Rosa26基因编码一种非必需的RNA,可作为外源基因插入位点。为使成肌细胞特异性表达Cas9蛋白的序列插入到C2C12细胞中,本研究利用CRISPIR/Cas9系统在小鼠Rosa26位点将连有MCK启动子的Cas9蛋白与荧光报告基因通过同源重组的方法定点插入,并通过嘌呤霉素筛选获取阳性细胞。通过本研究获得以下结果。
  1.Rosa26-sgRNA载体的构建
  根据小鼠Rosa26一段含有XbaⅠ的序列设计Oligo引物(gRNA),经退火后获得的双链DNA序列与经BbsⅠ单酶切过的PX459载体进行连接,获得载体Rosa26-PX459;利用Lipo2000将Rosa26-PX459载体转染小鼠成纤维细胞后第48h,提取基因组DNA;Rosa26位点上下设计引物并进行PCR。经XbaⅠ酶切鉴定结果,与野生型出现2个条带相比,转染Rosa26-PX459载体的PCR产物出现3个条带(未完全切开)。上述结果表明gRNA可以引导Cas9蛋白对Rosa26位点实现基因编辑。
  2.MCK-Cas9载体的构建
  采用PCR法扩增获得含有SP1和RBS等调控原件的小鼠肌肉型肌酸激酶(MCK)启动子1358bp片段;将其与切除CMV启动子的Rosa26-PX459连接,成功构建小鼠肌肉特异性CRISPR/Cas9载体Rosa26-PX459-MCK。将该重组质粒使用Lipo2000转染C2C12细胞后第48h提取DNA与RNA。使用XbaⅠ酶切PCR产物出现3个条带(未能完全切开)。再使用T7E1酶切验证,结果PCR产物可以被切割成2条小片段,对琼脂糖凝胶电泳结果进行灰度分析,发现突变率为15%,低于CMV启动子的24%。qPCR结果表明转染Rosa26-PX459-MCK载体的C2C12细胞的Cas9表达量是转染Rosa26-PX459载体的C2C12细胞的20%。
  3.小鼠Rosa26位点同源臂打靶载体的构建
  为了便于后续实验的观察与检测,在DsRed序列前加上T2A序列,将其连接到Rosa26-PX459-MCK载体Cas9序列下游。从重组质粒上PCR扩增MCK-Cas9-T2A-DsRed序列,将其连接到连有小鼠Rosa26位点左右同源臂的Donor载体上,获得Donor-MCK-Cas9-T2A-DsRed载体。使用同样的方法将原始CMV启动子的片段CMV-Cas9-T2A-DsRed连接到Donor载体上,获得Donor-CMV-Cas9-T2A-DsRed载体。
  4.嘌呤霉素抗性细胞的筛选和基因插入的验证。
  将同源打靶载体转染C2C12细胞和293T,结果发现转染Donor-CMV-Cas9-T2A-DsRed载体的293T细胞何和C2C12细胞既能观察到红色荧光也能观察到绿色荧光,表明载体进入细胞中且Cas9也能表达;而转染Donor-MCKCas9-T2A-DsRed载体的293T细胞只能观察到绿色荧光,而C2C12细胞既能观察到红色荧光也能观察到绿色荧光,MCK启动子能在C2C12中启动基因表达而不能在293T细胞中发挥作用,表明MCK启动子有肌肉特异性表达活性。Rosa26-PX459载体分别与同源打靶载体共转染C2C12细胞48h后,都能够观察到绿色荧光与红色荧光。加入1ug/mL的嘌呤霉素筛选7天后提取基因组,在插入位点附近,针对基因组与插入片段分别设计上下游引物,PCR结果表明,两个同源打靶载体均可整合到小鼠基因组的Rosa26位点。
  上述结果表明,本研究通过CRISPIR/CAS9系统打靶小鼠Rosa26基因位点,并成功在该位点分别插入MCK-Cas9-T2A-DsRed与CMV-Cas9-T2A-DsRed序列,成功建立小鼠C2C12细胞外源基因敲入方法,为转基因小鼠的制备奠定了基础。
[硕士论文] 胡玉笑
生物工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着第二代和第三代高通量测序技术的发展,功能基因组学和合成生物学的迅速发展迫切需要一种快速、无痕、高效的基因编辑工具,实现对基因组的定向编辑改造。
  传统的基因敲除系统主要是利用双向筛选系统,需要两次转化的过程。首先将带有目的基因和标记基因的核酸片段转入细胞,通过同源重组替换靶基因组。然后将含有插入位点上下游同源序列的核酸片段转化进入细胞,通过同源重组删除抗性标记基因。
  标记基因在遗传转化中起筛选和鉴定转化重组子作用,例如:抗生素类和除草剂类。标记基因的使用在不仅对邻近基因及其目的基因表达产生影响,同时还将造成潜在的生态环境安全性问题和食用安全性问题。根据标记基因的安全性及无痕编辑等要求,通常需要在完成所需的基因编辑后删除标记基因。生物安全性标记基因的优点主要在于标记基因无毒副作用,且有利于标记基因的回收和重复使用,提高转化效率。因此,对生物安全性标记基因的研究显得非常重要。本课题利用GAL启动子高表达酵母细胞壁CWP1基因致死的特性,以GAL-CWP1作为生物安全性标记基因,实现标记基因的安全性。
  本研究利用分子内基因同源重组原理,通过在目的基因上下游串联同源臂序列的方法,实现了一步转化两步重组完成基因敲除的过程。相对于传统的基因敲除方法需要两次转化完成,本试验提供的方法只需要一次转化就可以实现预期的基因敲除和标记基因的删除,因此极简化了基因敲除的过程。主要步骤如下:
  a.构建带有GAL-CWP1序列的筛选模板质粒,设计GAL-CWP1序列在其两端含有与待修饰位点的上游和下游同源的序列,所述片段转化到细胞之后能够与待修饰位点发生同源重组,所述核酸片段整合到靶位点上,将待修饰位点的基因或碱基替换删除。
  b.在发生上述第一步的同源重组之后,通过筛选富集重组子。
  c.利用上下游串联的同源序列的分子内同源重组删除标记基因。经YPGal合成培养基反向筛选,使含有同源臂片段的GAL-CWP1基因序列再次发生同源重组,丢失GAL-CWP1片段,最终获得基因无痕敲除的酵母突变株。
[硕士论文] 韩曼俐
药学 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:利用粘性末端介导的DNA链置换反应(Toehold-mediated DNA strand displacement reaction,TSDR)可以合理地构建一系列动态的DNA模型,而小分子物质三聚氰酸可以通过与poly(adenine)(poly(A))之间形成非经典氢键使其组装成稳定的纤维结构。本研究以三聚氰酸与poly(A)之间的非经典氢键所驱动的DNA动态自组装为基础构建出一种新的DNA模型,并探究内部因素与外部因素对其速率的影响,同时利用此模型实现对micro RNA较好的分型效果和在DNA四面体组装中的应用。
  通过对反应条件、反应物浓度及寡核苷酸链的长度进行优化,使得构建的DNA模型成立的同时,其发生动态自组装的产率和速率最大。在对反应条件进行优化时,发现当反应体系中的缓冲溶液的pH值为4.5、缓冲溶液的镁离子浓度为10mmol·L-1时,并在室温下(25℃)动态自组装的产率和速率最大,即体系的荧光值上升量最大;在对反应物浓度进行优化时,若寡核苷酸链的初始浓度为1μmol·L-1,发现当三聚氰酸的浓度为500μmol·L-1时反应产率和速率最大;在对寡核苷酸链的长度进行优化时,分别对该DNA模型的头部,中间及尾部进行优化,发现在此模型的头部增加两个碱基,即侵入链的长度为31bp时反应产率最大。除了通过反应体系荧光强度的变化来对反应结果进行表征,还可以通过原子力显微镜、聚丙烯酰胺凝胶电泳、反应产物的发射光谱、圆二色谱以及熔解曲线的测量等方法对其进行表征。研究结果表明,较之经典氢键驱动的链置换反应,该模型的反应速率较高,且能被内部和外部因素影响。若利用此最佳模型对micro RNA let-7a和let-7c进行检测,分别将let-7a和let-7c替换掉模型的保护链,并使其在最佳条件下进行反应,发现当目标链不同时,体系的荧光值下降的速率和程度不同,说明该模型可以较好的应用于micro RNA的分型。实验结果表明该模型也可以应用到DNA四面体组装中,在构建纳米结构方面有一定的应用性。
[硕士论文] 黄毅
食品科学与工程 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本实验起始菌株为实验室已经构建的菌株13#菌株,该菌株中的GOD基因是使用了DNA shuffling技术改造后的,其中有三个氨基酸序列发生了突变(D195G,T357A,L368P)。实验过程中为提高菌株产酶的能力,分步进行了几个阶段的探索研究:
  第一阶段:在破胞后对胞内蛋白进行蛋白电泳发现胞内仍存在一部分目的蛋白未分泌出来,在蛋白表达分泌的角度对目的菌株进行了改造,分别在转运,折叠,以及转录调控对菌株进行了改造。在pGAPZB载体上插入了转运因子SEC56,发酵结果显示在表达了转运因子后目的蛋白的表达量未得到提高;在pGAPZB分别插入了CNE1,BIP和PDI三个折叠修饰因子,其中BIP基因的表达使得目的蛋白的表达量得到了提高;在pGAPZB载体上插入了转录调控因子HAC1和THR,发酵结果在表达了HAC1转录调控因子的菌株目的蛋白表达有提高。
  第二阶段:对上罐发酵的盐离子培养基的浓度进行了简单的优化,在BSM培养基离子浓度为0.5时显示其菌体生长最好,酶活由364U/ml提升到了446U/ml。在表达了BIP基因后的菌株的3L盐离子培养基培养发酵最终测定粗发酵液的酶蛋白活性为530U/ml,从粗发酵液的酶的活力来看酶的产量提高了18%;同样进行盐离子培养基发酵的结果显示表达了转录调控因子HAC1的菌株最终发酵液酶活达到了600U/ml,酶的产量提升了30%多;在之后的工作中对酶活最高的菌株HAC1进行了进一步的探究,在HAC1菌株中表达了来源于透明颤菌的血红蛋白基因vgb,测定粗发酵液的活性结果酶蛋白的活性达到了630U/ml,该阶段vgb蛋白的表达小弧度的提高了目的蛋白的表达,而该阶段菌体的生长后期低于对照菌株。
  第三阶段:对不同来源的基因的表达进行了对比,将突变后的黑曲霉来源的GOD和尼奇青霉来源的GOX进行密码子优化后进行了表达。发酵数据显示同一基因来源的基因GOD,密码子偏好性优化之后进行的表达的菌株酶蛋白活性为540U/ml,未进行密码子偏好性优化过进行的表达的菌株的酶蛋白活性为446U/ml;不同来源的基因优化过在同一表达体系中的表达量也纯在差异,GOX的在菌株中最后的表达酶蛋白活性为640U/ml,而GOD的酶蛋白活性为540U/ml。经镍柱纯化后经过超微量分光光度计和蛋白电泳的验证,结果显示GOX来源的基因在最终蛋白表达量为1.32g/L,GOD的量有1.17g/L低于GOX的表达量。
[硕士论文] 李陈孟
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:转录系统是表达蛋白的重要组件,其转录强弱直接影响到启动子下游基因的表达强弱。衡量转录系统强弱的基本方法是通过在启动子下游引入报告基因,测定报告基因的表达强弱进而判断转录系统的强弱。但是影响外源蛋白表达强弱的因素较多,此外,像T7转录系统由于其转录能力超强,转录过程有时候会明显影响宿主正常的生长和代谢,因此会发生突变,降低或者丧失其转录能力。基于以上问题,通过终止子的转录通读现象构建了转录强度筛选器,在基因终止子下游插入一段筛选压力基因(“RBS—抗性基因”的结构),与终止子上游的基因构成一种多顺反子结构。转录能力强,通读概率大,抗性基因转录量就大,抗性能力就强,转录能力与抗性基因的表达量呈正相关。通过抗性强弱的检测,判断和筛选出不同转录能力的转录系统。采用改变抗生素浓度的方法,检测、筛选到转录强度不同的T7转录系统,并通过工艺控制获得自适应、稳定的T7转录系统。因此,本论文的结果包括以下四点:
  (1)T7转录筛选器的构建。本实验需要快速筛选出稳定的、不同强度的T7转录系统。通过改造单质粒T7表达系统,将诱导型系统改造为组成型系统,增加宿主的负担从而造成转录系统不稳定。之后,将筛选器结构引入表达载体中,替换启动子、报告基因等构建出一系列T7转录筛选器;
  (2)探究影响转录通读的因素。通过菌体生长曲线的测量来探究启动子、目的基因长度、目的基因结构、终止子结构等方面对转录筛选器的影响,目的基因长度越长、结构越复杂、通读率越低其生长抑制情况越明显;
  (3)利用筛选器来检测、筛选稳定的转录系统。通过传代实验,平均荧光强度和流式细胞仪的结果证明本论文构建得到的菌株BL21(No lacI-1×GFP-RD17)和BL21(No lacI-1×GFP-RD7)应用壮观霉素筛选获得稳定且不同强度的转录系统;
  (4)采用传代实验,从报告基因的长度、基因的结构方面对筛选器的适用性进行研究,表明可通过改变抗性浓度解决稳定性问题。此外,流式细胞仪检测证明构建的转录筛选器KT2440-RD1能够消除P.putida KT2440中的非荧光细胞峰。
[硕士论文] 孙尖
生物学;生物技术 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:重组工程即为重组介导的基因工程,是指采用九噬菌体来源的重组酶催化DNA之间的同源重组,因此,也称之为λRed重组工程。该技术由于操作简单,快速高效而成为实行DNA克隆和DNA修饰的一种常用基因工程手段。单链寡核苷酸重组工程可以在细菌基因组实行多个位点的同步编辑,相比传统的重组工程具有更加高的基因编辑效率。
  CRISPR-Cas系统,其中CRISPR是成簇规律间隔的短回文重复序列,而Cas是CRISPR相关蛋白,该系统正迅速成为从细菌到人类细胞系的基本编辑策略。CRISPR-Cas系统的特征在于具有几乎相同序列的定向重复,这些重复序列之间的间隔序列,被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA的部分序列相同,约50%的细菌和80%的古细菌通过CRISPR-Cas这一获得性免疫系统来防御病毒和其他入侵的核酸。CRISPR系统中来自Streotococcus pyogenes SF370的TypeⅡCas9蛋白研究最为透彻,应用最为广泛,该系统由于能够切割DNA,并且切割序列的特异性可由crRNA的序列所决定,因此成为了理想的基因编辑工具。
  本文的第一个研究内容是将寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9系统联合应用于大肠杆菌引发酶DnaG基因组编辑。2013年,重组工程和CRISPR-Cas9相结合首次应用于大肠杆菌及至微生物的基因组编辑,大肠杆菌引发酶DnaG参与了DNA复制,其报道的Q576A和K580A单突变体提高了DNA重组效率,但没有报道Q576A K580A双突变体,也没有报道寡核苷酸重组效率的比较,我们希望寡核苷酸和CRISPR/Cas9技术相结合简便、快捷地实现单个突变和双突变。首先,本研究构建了cas9表达质粒和sgRNA表达载体,包括基于高拷贝pMB1复制子的cas9表达质粒,基于低拷贝p15A复制子的cas9表达质粒,基于高拷贝pUC复制子的sgRNA表达载体和基于低拷贝pBBR1复制子的sgRNA表达载体。在进行转化效率测定后,选择基于p15A复制子的cas9表达质粒和基于pUC复制子的sgRNA表达载体组成的系统用于进一步研究,基于pUC复制子的sgRNA表达质粒设计为含有I-SceI归巢核酸内切酶及其切割位点,使其成为自剪切载体。此后,将寡核苷酸和sgRNA表达载体共同转化到含有重组工程和CRISPR-Cas9系统的大肠杆菌感受态细胞中,通过对转化子特定区域的PCR和DNA测序比对,成功地获得了Q576A和K580A单突变体,命名为E.coli LS3513和E.coli LS3516,单突变效率分别达到40%和100%,菌株E.coli LS3513和E.coli LS3516中sgRNA表达质粒的消除效率是100%和44%。然而经过各种尝试没有获得Q576A和K580A双突变体,仅仅得到了和丙氨酸(Ala)在结构上相似的疏水性氨基酸缬氨酸(Val),命名为E.coli LS3519V,突变效率达到5%,sgRNA表达质粒的消除效率是70%。此外,苏氨酸(Thr)也是在突变过程中被高频率获得的氨基酸,命名为LS3519T,突变效率达到73%,sgRNA表达质粒的消除效率是46%。
  本研究的第二个部分是涉及N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)酶催化相关前体生物合成相关的酶的基因工程改造。Neu5Ac在生物大分子的末端发现并参与生物体内的许多生理反应,是抗流感药物扎那米韦中使用最多的中间体。ppsA和csrB是参与Neu5Ac前体磷酸烯醇式丙酮酸生物合成的两个基因,通过偶联寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9系统将ppsA和csrB基因的启动子置换为T7启动子,我们获得了ppsA基因区域单一插入T7启动子菌株E.coli LS3561,突变效率达到5%,csrB基因区域单一插入T7启动子菌株E.coli LS3571,突变效率达到100%,ppsA和csrB基因区域同时插入T7启动子菌株E.coli LS3581,突变效率达到10%,并且E.coli LS3561,E.coli LS3571,E.coli LS3581中sgRNA中的消除效率分别是100%,2%和84%。此外,我们构建了p15A质粒骨架的自剪切载体pLS3550并运用于cas9表达质粒pLS3535的消除,成功消除了cas9表达质粒消除,效率分别达到21%,24%和41%。此工程菌株有望提高Neu5Ac酶促催化的产量。
[硕士论文] 李一峰
数学;运筹学与控制论 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:布尔网络是一类由布尔逻辑变量和布尔逻辑函数刻画的动态系统.受扰布尔控制网络是在布尔网络中增加了布尔逻辑控制变量和布尔逻辑干扰变量后的一类离散动态控制系统.布尔网络模型在遗传生物学中有很好的应用背景,它能有效的分析基因间的相互作用.随着近年来系统生物学的迅猛发展,布尔网络的研究很快成为了系统生物学家们关心的热点问题.布尔控制网络模型对基因调控网络的模拟与控制起到了重要作用.鉴于布尔控制网络对某些基因疾病的理解与治疗有潜在的应用价值,布尔网络的控制理论引起了系统生物学和控制科学领域的广泛关注.受扰布尔控制网络由于引入了逻辑干扰变量,能够描述实际基因调控网络中的某类不确定性因素,更加符合实际.布尔控制网络关于干扰输入的系统分解问题是通过逻辑坐标变换把系统分解为两个子系统,使得其中一个子系统不受干扰的影响.通过该系统分解问题的解决,可以更好的理解干扰对控制系统的影响能力.
  本论文在矩阵半张量积理论框架下,运用代数和图论方法研究了受扰布尔控制网络,提出了系统关于干扰输入的分解问题.首先,根据布尔控制网络基于矩阵半张量积的代数表示形式,得到系统可实现上述分解的等价代数条件.然后,基于布尔控制网络的状态转移图,提出了系统可分解的等价图条件.最后,给出了具体的受扰布尔控制网络系统分解算法.
[硕士论文] 王吉平
生物工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:半纤维素资源是自然界中最丰富的可再生资源之一,将其通过微生物转化方法生产木糖醇是高值化利用的有效途径。本论文在实验室已有工作的基础上,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,对E.coli W3110进行代谢工程改造,强化其辅酶NADPH的再生,构建一株多拷贝整合木糖还原酶高产木糖醇的菌株。
  本工作采用双质粒CRISPR系统,通过构建不同pTargetF质粒和修复模板,使用木糖还原酶基因表达模块替换ptsG、ptsF和xylAB基因,获得一株整合了3个木糖还原酶基因拷贝数的出发菌株WZ04。并在此基础上,分析大肠杆菌的葡萄糖代谢通路,通过实验分别敲除EMP途径中编码磷酸果糖激酶的pfkA、pfkB基因及磷酸葡萄糖异构酶的pgi基因和转氢酶sthA基因,获得相应的工程菌并检测胞内NADPH/NADP+的比值和发酵液中的木糖醇含量,获得了最优改造后的菌株WZ41。该菌株胞内辅酶NADPH/NADP+比值为出发菌株的1.68倍,有效地提高了木糖醇对葡萄糖的得率;通过RT-qPCR、菌株的生长性能及摇瓶发酵生产木糖醇的能力综合分析得出木糖还原酶表达模块的整合拷贝数最佳为5,使用该菌株进行摇瓶发酵,补加混糖后30h,发酵液中木糖醇浓度为16.76 g/L,葡萄糖和木糖残余量分别为0.44 g/L和10.50 g/L。
  最后,我们将辅酶改造的策略应用在原有构建的高产菌株IS5-d中,得到最优改造菌株IS5-d△pfkA,该菌株在摇瓶发酵中,与未改造的IS5-d菌株具有相同的生长速率,且发酵结束后木糖全部转化为木糖醇,无葡萄糖和木糖残留。使用该菌株进行发酵罐放大,以工业级玉米浆干粉为氮源,葡萄糖母液为碳源,半纤维素水解液为补料液进行分批补料发酵,木糖醇的终浓度达126.62 g/L,木糖和葡萄糖等糖类全部消耗,生产效率达2.01g/L/h。
[硕士论文] 张小敏
凝聚态物理 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:细胞重编程技术对药物发现及筛选、移植治疗、基因治疗和疾病研究带来了深远影响,同时也打开了再生医学的大门。然而,大量实验研究表明,细胞重编程过程会面临效率低、不完整等问题。因此,如何提高重编程的效率及加速重编程过程的生物技术成为前沿课题之一。
  本文以体细胞重编程过程实验为基础,根据细胞重编程过程中基因表达的时间线(Timeline),构建起重编程过程中标记基因之间前反馈调控网络模型,利用随机动力学理论和数值模拟方法对该模型进行动力学研究,得到了以下研究成果:
  (1)根据重编程过程中标记基因之间前反馈调控网络模型,建立起了重编程过程中标记基因之间前反馈调控网络的动力学方程,数值模拟结果表明:在外源性转录因子OSKM(输入信号)连续表达条件下,细胞内标记基因Y(如SSEA1)在2天左右开始表达,标记基因Z(如Nanog,Oct4,Sox2)在7天左右表达,这些结果与生物学实验结果相吻合,能够解释重编程不同阶段的相关机制。
  (2)本文选取了6个测试参数探究其对加速重编程的影响,结果表明:随着上游标记基因对下游标记基因的最大激活率的增大,标记基因Z的表达时间将会明显缩短,即快速的基因表达可以导致更快的重编程过程。同时还发现,外源性转录因子OSKM对开启重编程起重要作用。
  (3)运用劳斯-霍尔维茨稳定性判据分析了微分方程组解的稳定性。考虑到细胞重编程过程具有随机性,引入高斯白噪声得到了近似Fokker-Planck方程,运用Langevin理论推导出在稳态附近基因表达水平的Fano因子、协方差以及敏感性等物理量解析式,最后运用Gillespie算法进行数值模拟并验证理论结果的正确性。
[硕士论文] 李婷
教育学;教育技术学 天津师范大学 2018(学位年度)
摘要:由于生物信息学中对基因进行测序的成本大幅下降,尤其是ChIP-chip和ChIP-seq这两种测序技术的广泛使用,使得能够在很短地时间内识别出大量的转录因子的DNA序列,产生了庞大的ChIP基因数据集,这既为研究的进一步发展提供了实验依据同时也带来了很大的挑战。虽然在近几年,第三代测序技术的出现实现了每秒检测出10个碱基,读长可以达到10Kb-15Kb,但是其发展不够成熟,目前已有的数据库中的数据还是少量的,因此,本论文采用的是ChIP数据集作为研究内容。模式生物果蝇在2003年就已经完成基因组的测序,并且随着研究的进行,目前对果蝇基因的认识越来越深入,其具有繁殖速度快、基因易产生变异,产生变异的表征比较明显等特点。所以本论文使用果蝇的数据作为研究对象。
  基因的异常表达可能导致很多疾病的产生,而顺式调控模块产生异常是导致基因异常表达的主要原因,通过整合很多ChIP数据集来识别出基因组中的顺式调控模块,对于构建基因的调控网络、理解基因转录调控的分子机制、乃至理解疾病机理都有重要的意义,但是到目前为止,我们对真核生物的顺式调控模块知之甚少,那么在生物信息学学科领域中在全基因组范围内,利用从头预测的方式对真核生物预测顺式调控模块就更是少之又少。现在,生物信息学者和专家已经设计出了很多种识别顺式调控模块的工具,最常用的方法就是计算机统计的方式,目前最新的从头预测顺式调控模块的方式是DePCRM,但是该算法过于复杂,而且所预测出的顺式调控模块有很多都是假定的,不具有准确性,因此,本论文提出了一种新的研究思路,通过整合来自不同组织、细胞类型和生理阶段以及不同实验条件下的果蝇模式生物ChIP数据集研究其模体共生模式,可以实现生物物种在全基因组范围内对顺式调控模块的从头预测,运用模体发现算法FisherMP、模体相似度量法SPIC以及模体聚类算法CLIMP,通过整合顺式调控模块的各种特定信息,从头预测出果蝇的顺式调控模块。本算法在从头预测果蝇顺式调控模块上与现有的DePCRM算法进行比较,本算法在速度上和准确度上都要优于DePCRM。
[硕士论文] 田然
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:在生物体内,维持基因组的稳定性是细胞正常生存的必要条件。然而,有许多外源因素和内源因素会造成DNA的断裂,如细胞代谢产物、UV和电离辐射等。为维持基因组的稳定性,机体进化出了高度保守的应答体系,称之为DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)。DNA损伤应答过程包括DNA损伤位点的识别、招募DNA修复复合物到DNA损伤位点、修复受损的DNA、激活细胞周期检验点以及诱发凋亡[1],DNA损伤应答对多个细胞进程都有广泛的影响。为确保足够的时间完成精确有效的DNA损伤修复,细胞周期检验点激活并使细胞周期阻滞。同时,细胞也将激活一些基因的转录,这些基因包括DNA损伤修复和调控细胞周期相关基因。最近研究表明,不仅蛋白编码基因,非编码的基因也在维护基因组稳定性过程中起到重要作用[1-3]。其中长链非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)是一类由RNA聚合酶Ⅱ产生,长度大于200bp的RNA,它们的表达量低,保守性低,且具有组织特异性。当DNA损伤后,DDR相关lncRNA会在转录水平、转录后水平以及RNA降解水平被调控。同样的,lncRNA也可以靶向DDR相关的基因调控其表达。lncRNA可以作为信号、诱饵、导引、支架调控基因表达。近几年来,虽然已经在lncRNA维护基因组稳定性方面做过很多研究,识别了许多参与DNA损伤应答的lncRNA,但lncRNA如何参与DNA损伤应答以及它们的应答机制仍然是未知的。
  在来自清华大学高冠军教授实验室的大力支持下,获得了43株lncRNA敲除的果蝇株。为研究参与DNA损伤应答的lncRNA,采用在辐照后统计生存率和染色体断裂数目的方法,对43株lncRNA敲除果蝇株进行了DNA损伤敏感性的检测,获得了12株具有DNA损伤敏感性的IncRNA敲除果蝇株,初步认为这12个lncRNA可能参与DNA损伤应答。为系统性的筛选出更多参与DNA损伤应答的lncRNA,采用了高通量测序技术,使用野生型w1118果蝇、p53突变果蝇、e2f1突变果蝇的三期幼虫,在生理条件和辐照条件下,获得了242个差异表达的lncRNA。此外,在43株IncRNA敲除果蝇株里面,CR43356在RNA测序结果中出现了差异表达。DNA损伤敏感性检测实验表明,CR43356敲除果蝇株对DNA损伤高度敏感。通过查找FlyBase网站信息,发现CR43356主要在果蝇三期幼虫的翅膀胚芽组织中表达。为进一步探究CR43356参与DNA损伤应答的机制,对CR43356果蝇进行了G2/M检验点检测和凋亡检测,结果发现CR43356参与DNA损伤应答通路中凋亡调控过程。
[硕士论文] 汤玲
生物化学与分子生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)是一种从囊胚时期内细胞团(Inner cell mass,ICM)中经分离培养的具有多潜能性的细胞。自我更新(Self-renewal)和多向分化(Differentiation)是其重要的两大生物学性质。因此,它已成为筛选药物和制造疾病动物模型的有力工具之一。小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,mESCs)自1981年成功建系以来,就已经成为研究者应用最多的理想实验模型之一,近些年的不断探索发现,胚胎干细胞的广泛应用为我们研究哺乳动物胚胎发育机制、细胞组织的定向分化提供了广泛的思路,也为医学和生物学的研究发展做出了巨大贡献。
  目前,mESCs自我更新性质的维持可通过两种方法培养,其中比较经典的是LIF/Serum的培养条件。我们将LIF(Leukemia inhibitor factor)这种白血病抑制因子添加到培养液中后,会激活LIF介导的信号通路,从而活化这条信号转导系统中的一系列基因,它们共同发挥作用将mESCs维持在自我更新的状态,并具有保持其多向分化的能力。有文献报道,Sp5是LW/STAT3信号通路中STAT3下游的直接靶基因,在无LIF的培养条件下,上调Sp5的表达可以将mESCs维持在不分化的状态,但Sp5是怎样发挥这项功能的,到目前为止,还不清楚。所以,为了进一步探究Sp5维持mESCs未分化的具体分子机制,完善这条信号转导通路,使人们更好的理解mESCs自我更新与分化的关系,我们研究方向就明确了。本实验主要分两大部分进行:其一,筛选Sp5下游的直接靶基因;其二,对筛选的靶基因和Sp5自身的结构展开一系列的功能性验证实验。
  首先,为了筛选出这些基因,我们利用PiggyBac(PB)载体成功构建了带有HA标签的过表达Sp5(PB-Sp5)的46C细胞系。因为之前有文献报道,过表达Klf2/4/5,Nanog,Gbx2,c-Myc,Tfcp2l1,Tbx3基因[9-20],可以在无LIF的培养条件下维持mESCs自我更新,为了探究Sp5是否通过这些基因将mESCs维持在不分化的状态,在过表达Sp5的实验组及其对照组的mESCs中,我们用qRT-PCR在转录水平上分别检测以上基因的相对表达量,结果显示Nanog和Klf2的表达量明显升高。为了进一步确定Sp5的候选基因,我们又构建了Sp5敲低和敲除细胞系,同样用qRT-PCR在转录水平上检测Nanog和Klf2的表达量,最终确定Nanog是Sp5的靶基因。除此之外,结合染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告系统实验显示,Sp5直接调控Nanog的启动子。
  紧接着我们做了一系列的功能性验证实验。看看Sp5到底是不是通过Nanog发挥其维持mESCs自我更新作用的。首先,我们检测Nanog的下调是否对Sp5维持mESCs自我更新的能力产生影响。我们在上调Sp5的细胞系中下调Nanog,将其置于没有LIF的培养基下培养8天,结果发现:(1)没有下调Nanog的对照组细胞能维持较好的干细胞形态,有较高的碱性磷酸酶活性,且高表达胚胎干细胞标志性因子OCT4和SSEA1,而下调Nanog的实验组细胞则分化了。(2)实验组相比较对照组,高表达和分化相关基因,低表达和自我更新相关基因。这些结果都表明:Sp5是通过调控Nanog的表达来维持mESCs不分化形态,换句话说,下调Nanog会损害Sp5维持mESCs自我更新的能力。
  Sp5除了通过调控Nanog的表达发挥功能外,其自身的Zn指结构可能对其发挥作用也产生影响。因为Sp5C端含有3个保守的类似于KLF家族的Zn指结构[21,22]。研究表明,KLF家族(Klf2/4/5)的3个Zn指结构对其维持mESCs自我更新的功能至关重要[23,24],缺失其中任何一个Zn指结构都会影响其发挥功能。于是我们就猜想Sp5的3个Zn指结构是否也具有和KLF家族中(Klf2/4/5)相类似的功能呢?为了验证这个猜想,我们用Over-lap PCR分别构建了缺失不同Zn指结构过表达Sp5的缺失突变体细胞系,在无LIF的培养条件下培养时显示:和过表达野生型的Sp5的细胞比较,(1)缺失突变组产生较少的典型胚胎干细胞及AP阳性克隆数。(2)Nanog表达量相对减少。这些结果均说明:3个Zn指结构对于维持完整的Sp5活性至关重要,缺失其中任何一个Zn指结构都会削弱Sp5发挥其维持mESCs自我更新的能力。
  我们的研究结果表明,Nanog是Sp5下游的直接靶基因,Sp5通过Nanog和自身的Zn指结构发挥其维持mESCs自我更新的功能。实验结果扩大了人们对维持mESCs多能性调控网络的认识,有利于后面的科研工作者对其进一步展开研究。
[硕士论文] 周文
概率论与数理统计 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:在基因与疾病的关联分析中,一个较普遍的做法是讨论单个疾病与基因的关系,实际上由于代表疾病的各种性状之间具有一些相关性以及基因本身的基因多效性,使得同时检验一些性状的基因关联性变得有意义,并且与考察单个性状相比具有更好的检验功效.在这个领域的研究中,不少学者研究的都是具有相关关系的定量性状或者定量性状与定性性状与基因的同时关联分析.本文单单讨论二元的二分表现型的基因关联分析,在三种模型下研究多个疾病与基因的关系.第一种模型是传统的logistic回归模型,在考虑单个定性性状和基因的关系基础上,通过联立得分函数构造检验统计量完成多个性状与单个基因的关联检测;第二种模型假定存在与定性性状相关的潜在的连续型变量,使得定性变量的取值由连续型变量决定,通过讨论该连续型变量与基因的关系来研究定性变量与基因的关系,由于这些连续型变量的相关性使得同时关联检测比单个关联检测有意义的多.第三种模型基于条件分布的概念,假设多个定性性状的某一个性状与其余性状和基因一起具有logistic线性关系,这样多个性状的概率分布可以方便给出,从而大大简化模型,提高检验功效.
  文章的第一部分介绍基因关联检测的研究背景和研究意义,并给出已有的参考文献中关于基因关联检测的检验方法,分别从基因位点和性状两个方面出发介绍;文章的第二部分考察两个二分变量和单个基因的同时关联分析,提出了三种模型,并在每种模型下都给出检验方法,理论上证明了这些方法的合理性并给出检验统计量;文章的第三部分通过计算机模拟分别验证三种检验方法是否能控制第一类错误,并比较在不同的数值模拟参数下三种检验方法的检验功效,给出三种检验方法的优劣;文章的第四部分对模拟结果进行分析,给出结论:三种检验模型中潜在正态模型的检验功效最高但可操作性不大,条件线性模型功效次之,但当人群中只患某种疾病的概率远小于同时患两种疾病的概率时条件线性模型是最佳的选择.在解决一般的二维二分表现型变量是否与特定基因相关时我们可以用logistic回归模型,当两种疾病有较明显的相关性时可以用条件logistic回归模型进行假设检验.
[硕士论文] 吴霜
分析化学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:DNA是生物体内最主要的遗传物质。由于DNA在信息储存、生物相容性、结构转换多样性和设计灵活性等方面的天然优势,DNA被广泛应用于生物传感器、分子逻辑门、分子成像以及分子马达等方面。DNA生物传感器有响应范围广、结构变化多样等优点,可实现对多种金属离子以及ATP、蛋白质、miRNA、DNA等生物分子的灵敏检测。DNA还可被用作生物学研究和医学诊断的重要生物标志物,人体内的多种病症如胰腺癌、肺癌、21三体综合征等的发生发展都与遗传物质突变异常相关。核酸序列分析检测是实现个体化医疗、有效诊断管理癌症和传染病的重要途径。近年来,DNA生物传感器在基因检测领域有着广泛的研究应用。
  论文主要分为以下三部分:
  第一章主要介绍了支点介导链置换反应和目标物诱导链置换反应的基本原理以及在DNA分子器件中的应用,多种功能性核酸分子及其应用以及2-氨基嘌呤探针的荧光特征及其应用。
  第二章以NMM为探针构建免标记的熵增链置环循环,并将其应用于目标DNA的检测中。D1链与HP结合发生链置换反应,释放原本与HP结合的D2链,裸露出可与fuel结合的toehold区域,触发链置换反应。Fuel链与HP结合生成稳定双链释放出D1链和被束缚的PW17序列,D1链可重新参与下一次循环,PW17形成G-四链体结构与NMM结合,体系荧光强度明显增加。对目标基因的检测限可达1 nM。
  第三章以2-氨基嘌呤为探针实现对两种胰腺癌相关基因的灵敏检测。由ATP和钾离子触发的目标物诱导的链置换反应,使得原本被覆盖的toehold区域裸露出来,加入P53基因和K-ras基因分别与toehold区域结合触发链置换反应,释放出颈部有2-氨基嘌呤凸环的发夹环。而形成凸环的2-氨基嘌呤荧光强增强作为输出信号,可实现对P53基因和K-ras基因的灵敏检测,检测限可达2 nM。
[硕士论文] 何鹏
凝聚态物理 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:生物分子间的相互作用及其规律的研究是现代分子生物学研究的一个重要领域。从分子生物实验出发,研究分子间相互作用机理的系统生物学,有助于人们认识许多复杂疾病、动植物的寿命、生命周期节律等重要生命现象的本质。系统生物学中关于基因调控网络重构和功能预测是具有挑战性的课题之一。
  MicroRNA(miRNA)作为真核生物中普遍存在的一类重要的非编码RNA,大量的生物学实验研究表明:miRNA转录后抑制靶基因表达功能,在生物发育、细胞衰老与凋亡、癌症发生及转移等方面都起到了重要的作用。因此,对具有miRNA调控的基因网络动力学进行研究,在实验和理论上都有重要意义。
  基于已有的关于细胞周期、肿瘤细胞EMT/MET过程中基因调控网络的研究,本文主要考虑miRNA的作用、生化噪声、相互作用时间延迟分别对这两个生物过程的影响,建立起了相应的非线性动力学。本文的主要研究结果如下:
  (1)考虑MiR-17-92对细胞周期中Rb-E2F基因调控网络的作用,改进了此网络构建起了由Rb-E2F-CycE基因回路、E2F基因自激活回路两个正反馈环、E2F-miR-17-92负反馈环、转录因子Myc直接上调miR-17-92的非一致前馈环,这四个功能环组成的Rb-E2F-miRNA调控网络,并建立起该网络基因相互作用非线性动力学。研究表明:miR-17-92的调控会很大程度的延缓细胞G1至S期进程,使得细胞处于静止期的时间更长。而且调节miR-17-92对E2F的抑制率导致的延时效果比调节Myc对miR-17-92的产生率更加明显。噪声情况下,发现miR-17-92的加入可以使细胞有更大的概率处在静止期,从而维持网络的鲁棒性。通过对不同调控途径的动力学分析,发现miRNA的加入不会改变系统的双稳性质。但调节miR-17-92对E2F的抑制率、Myc对miR-17-92的产生率会出现实验中的miRNA“靶标回避”现象,此现象与miRNA和E2F表达的关联性有关,这可能为miR-17-92抑癌和致癌的双重角色提供了新的理论解释。
  (2)针对细胞EMT过程的[miR-34/SNAIL]:[miR-200/ZEB]调控网络,提出了一个简化模型。研究表明:该简化模型可以很好地重现实验中发现的肿瘤细胞EMT和MET过程,并从动力学机制上解释了肿瘤细胞的E/M混合表型在转换中的不对称性,即E/M混合态只出现于EMT过程。噪声存在时的数值模拟结果表明:在三稳表型态下,噪声会导致肿瘤细胞从E表型转换到M表型,从而增加了肿瘤细胞的转移性和侵袭性,并且发现混合表型有一定的噪声抵抗能力。此外,通过噪声和时滞同时存在时的研究发现,噪声会导致ZEB的高表达,而时滞则会削弱这种影响,将ZEB维持在低表达水平,表明二者之间存在一种竞争效应。这些结论可能为肿瘤的临床治疗提供新的思路。
[博士论文] 蒲莲容
计算机应用技术 山东大学 2018(学位年度)
摘要:基因组重组排序问题,即计算不同基因组之间的重组距离和重组操作序列问题,是计算生物学中的经典问题之一。两个基因组之间的重组距离可用于近似估计它们的进化距离。基因组重组是非常复杂的过程,基本的重组操作包括翻转、移位和转位。翻转和转位操作是作用在单条染色体上的重组操作,而移位操作是作用在两条不同染色体上的重组操作。因此,相比翻转和转位重组操作,移位重组操作在基因组进化过程中扮演着更加重要的角色。最近研究发现,在高温环境的影响下,小麦基因组中确实发生了移位重组操作。这项研究结果再次验证了研究基因组移位排序问题对探索生物进化过程具有重要的意义。
  目前,通过借助断点图结构,有向基因组的移位排序问题已经可以在多项式时间内被求解。而无向基因组的移位排序问题却被证明是NP-难的。近年来,很多计算生物学研究者们致力于设计多项式时间的近似算法来求解它。在为无向基因组的移位排序问题设计近似算法时,一个通用的思路是将无向基因组对应的断点图进行圈分解。因此,求解断点图的圈分解问题对进一步推进无向基因组移位排序问题的近似算法设计有着重要的意义。
  虽然断点图已经成了基因组重组研究的一个重要通用工具,但如将断点图进一步应用于分析重复片段的进化史上仍是未知的。基因组中的重复片段是发生基因组重组和突变的热点区域。这些重复片段中频繁发生的基因组重组和突变,既可能增加物种的环境适应能力,也可能导致一些基因疾病的产生。最近研究发现,血友病甲、史密斯-马吉利综合症和安格曼综合症等许多基因疾病都与基因组重复片段中的基因变异息息相关。随着测序技术的发展,人类基因组的拼接序列已经日渐完善,随之而来的问题是如何在这些拼接出来的大型基因组数据中检测到重复片段的信息。准确检测出人类基因组中的重复片段并对其进行详细分析,将有助于人们深入了解人类基因组的进化史和探索基因疾病的临床治疗方案。
  本文主要研究基因组结构中的重组操作和重复片段检测等问题。本文的主要研究工作和创新点:
  1.断点图的2-圈分解问题的线性时间算法设计。
  断点图的圈分解问题要求在一个给定断点图中分解出尽可能多的圈,该问题被证明是NP-难的。目前,该问题的最好的近似度是1.4193+ε。在设计断点图的圈分解问题的近似算法时,一个基本的思路是在断点图中分解出尽可能多的2-圈。本文首次明确定义了断点图的2-圈分解问题并为该问题设计了一个确定性的算法,该算法可以在线性时间内判定给定断点图是否存在一个圈分解,且该圈分解中仅包含2-圈。如果存在,则在线性时间内输出这样一个仅包含2-圈的圈分解。
  2.无向基因组移位排序问题的近似算法设计。
  无向基因组的移位排序问题是NP-难的。目前该问题最好的近似度是1.408+ε。本文为无向基因组移位排序问题设计了一个近似算法,将其近似度从1.408+ε改善到了1.375。该近似算法采用分而治之的思想,先将整个基因组的断点图按特定规则分解成若干个小的连通分支。然后,对每个连通分支单独进行圈分解,在每个连通分支中分解出尽可能多的圈,确保其达到1.375近似。本文的主要技巧在于将整个断点图分解成若干个独立的连通分支时,对仅含有一个2-圈或者3-圈的最小候选子排列要进行特殊处理,避免它被分解成一个独立的连通分支。
  3.大型基因组中重复片段的检测问题。
  本文设计的SDquest算法可以快速有效地检测出大型基因组中的重复片段信息。SDquest算法检测了人类、猿类和老鼠基因组中的重复片段。和已知重复片段数据相比,SDquest算法检测到了许多之前未知的、新的重复片段。本文首次将断点图的概念引入到重复片段的分析中,并对SDquest算法检测到的重复片段构造断点图进行分析。SDquest算法已经用Java语言实现,其可执行脚本被公布在GitHub平台上。SDquest软件是现在唯一一款简单易用的、可用于检测大型基因组中重复片段的软件。
[硕士论文] 翟姗姗
软件工程 山东大学 2018(学位年度)
摘要:基因组重组,是基因组更改变换基因排列次序的行为,可形式化为翻转、移位、转位等基本操作。基因组重组,也是导致生命特征演化的典型结构变异行为。基因组重组排序,目的是找到最短的重组操作序列,将一个给定的基因组转化为另外一个基因组。这是推断生命演化过程,比较生命亲缘关系的组合优化问题模型。
  每个基因在基因组中仅限重复一次的基因组重组排序,已有广泛而深入的算法研究进展。Berman等给出的近似性能比为1.375的无向基因组的翻转排序算法,是当前最好的。Hannenhalli等对有向基因组序列构造断点图,并根据图中的特殊结构及其数量给出了翻转排序的多项式算法,Bader等人设计出计算翻转距离的时间复杂度为O(n)的算法,以及获取翻转之后新序列的时间复杂度为O(n2)的算法。对于有向基因组移位排序问题,Li等人给出了一个时间复杂度为O(n)的计算移位距离的算法;对于无向基因组移位排序,Cui等设计了时间复杂度为O(n2)、近似度为1.75的近似算法,目前Pu等给出的1.375近似算法,是解答该问题最好的算法。
  基因在基因组中通常会重复多次。然而目前针对允许基因重复多次的全基因组结构差异比较,还缺少有效的组合优化问题模型和算法。
  本文建立了一个组合优化问题模型,用于刻画两个基因重复基因组之间的重组距离。两个基因重复的基因组的翻转排序可描述为如下组合优化问题:给定一个源基因序列π和一个目标基因序列σ,两个基因序列的元素构成相同,目标是通过对基因序列进行一定次数的翻转操作,输出一个新的基因序列π',消除基因序列π和σ之间的全部断点且满足操作的翻转次数最少。我们总将基因序列表示为一个字符序列,其中一个字符表示一个基因。本文给出两个解答基因重复基因组翻转排序问题的算法。
  (1)设计给出一个近似比为4、时间复杂度为O(n3)的翻转排序的近似算法。我们利用断点、邻接概念定义了基因序列中的块、同位置匹配块、和异位置匹配块。分类讨论执行不同的翻转操作对同位置匹配块和异位置匹配块的影响,对消除同位置匹配块和异位置匹配块以外的断点设计了特定的翻转操作。给出消除基因序列中所有断点的近似算法,并证明每两次翻转操作至少可以消除一个断点,从而证明算法近似性能比不超过4。
  (2)定义了表达两个基因重复基因组翻转距离的断点图。给出一个当断点图为无交叉图时,基因重复基因组翻转排序的精确算法。分析了无交叉图的三种简单结构,对无交叉图三种简单结构进行任意翻转操作并根据翻转子串的不同位置分类讨论,给出由无交叉图参数表达的翻转距离的上界。证明任意无交叉图可约减为简单结构的无交叉断点图。从而证明前面的翻转距离上界适用于任意无交叉断点图。我们设计的算法所得到的翻转距离恰好等于前面给出的上界,因此算法能够求到最优的基因重复基因组的翻转距离。
  本文的主要创新点:
  1.建立了含重复基因的基因组重组排序的问题模型,在此之前人们只对不含重复基因的基因组进行重组排序问题的相关研究。
  2.发现并定义了基因序列中的‘块’,由此设计出一个近似性能比为4的翻转排序的近似算法。
  3.建立了表达两个含重复基因的基因组重组距离的断点图模型,给出无交叉断点图表达的基因组翻转排序的多项式精确算法,并证明其最优性。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

万方选题

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部