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[硕士论文] 宁晓彦
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:凝乳酶(chymosin,EC34234)是一种天冬氨酸蛋白酶,是干酪加工过程的关键性酶。凝乳酶传统上是从未断奶的小牛皱胃中提取,随着干酪产量增加,这种方法已不能满足当前市场的需求。基因工程菌株作为一种新的高效蛋白生产途径,有望解决牛凝乳酶来源短缺的难题。
  本研究将牛来源凝乳酶原基因在巴斯德赤酵母系统中异源表达。通过密码子优化、融合标签蛋白表达、启动子选择和发酵条件优化的策略提高重组牛凝乳酶原在毕赤酵母中的表达量。
  依据毕赤酵母的密码子偏好性,按照OptimumGeneTM算法对牛凝乳酶原基因pcw进行密码子优化得到pcm14基因。在pcm14基因前端融合标签蛋白基因cherrym得到clpcm14基因。pcm14和clpcm14基因在毕赤酵母中表达,分别筛选到产酶活力最高的菌株2-70和clp2-91。在摇瓶水平这两株菌中目的基因转录水平相近,基因拷贝数相同,凝乳酶活力分别为2188SU/mL和3705SU/mL。
  在clpcm14基因表达盒的基础上,用组成型启动子PGAP替换甲醇诱导启动子PAox1,筛选得到高表达菌株GH-1。对GH-1菌株的发酵过程进行工艺优化,包括pH值、补料方式和碳源的优化。发酵最优条件是pH40,以葡萄糖为碳源,采取分批补料方式发酵。GH-1菌株生产凝乳酶活力最高可达到12000SU/mL,培养基中蛋白含量为028mg/mL。在3L发酵罐水平,组成型菌株GH-1的生产强度是诱导型菌株clp2-91的3倍。
  本研究将多种可提高毕赤酵母菌株外源蛋白表达量的优化策略进行组合,筛选到的高产菌株GH-1能够高效生产牛凝乳酶原,其生产强度满足酶制剂生产企业需求,有很高的工业化大规模生产潜力。
[博士论文] 刘炜
计算机应用技术 湖南大学 2017(学位年度)
摘要:人类基因组计划的完成标志着现代生命科学研究进入了系统生物学时代。系统生物学不仅仅是一个新兴的领域,更重要的是它代表一种对生物学研究的新方法。人们逐渐认识到在研究过程中不能仅局限于研究单个基因,而应该全面地从系统的角度去探寻这些基因之间的表达调控规律,研究整个生命系统的运行机制,最终破译生命遗传的秘密。
  随着高通量技术的飞速发展,大量的研究结果产生了海量的基因表达数据。如何从这些数据中发掘出具有生物意义的调控关系以及调控规律是后基因组时代人类所面临的最具挑战性的生物学问题之一。基因调控网络结构推测的目的正是从基因表达数据中构建基因与基因间相互调控关系所组成的网络结构。因此基因调控网络结构推测的研究具有重大意义。本文以基因表达数据为研究对象,以信息论为背景,针对当前基因调控网络推测方法中存在的一些问题开展基因调控网络结构推测算法的相关研究。本文主要工作概括如下:
  (1)针对当前大多数基于信息论的基因调控网络模型中主要采用单一网络特性推测网络结构的现状,本文将拓扑理论中的节点中心性与信息论中的互信息相结合提出了一种基于网络拓扑中心性的基因调控网络结构推测算法LDCNET。该算法首先采用互信息对基因间调控关系进行初始化和预处理。其次分别计算每一个基因的节点中心性并基于中心性对所有基因降序排列。当排序过程中出现不同基因具有相同节点中心性的情况时,依据一种基于目标基因的相邻基因节点中心性的策略对序列进行再次排序。最后依次为序列中的每一基因挑选出调控基因,并最终将所有基因的调控关系整合成完整的调控网络结构。算法在四个数据集上对其有效性进行验证,实验结果表明该算法具有良好的网络结构推测性能。
  (2)针对基因表达数据的“高维度、小样本”的数据特点,本文提出了一种基于最大相关最大显著的调控网络结构推测算法 MRMSn。该算法将基因调控网络结构推测问题转化为为每个目标基因挑选调控基因的二分类问题。为了有效挑选目标基因的调控基因,算法给出了一种基于互信息和熵减少的特征基因挑选模型,模型提供的一阶增量搜索的算法保证了所挑选的调控基因能近似地获得模型的极优值。模型中涉及不同特征的权重问题,因此本文给出了一种基于局部密度的权重自动设定方法。最后所有基因的调控关系基于一种给定约束被调整,并整合成完整的调控网络结构。算法在五个数据集上进行有效性验证,实验结果表明该算法具有良好的推测性能。
  (3)基因表达数据具有高噪声及非线性相关的特性,这使得基因调控网络结构的推测具有较高的假阳性率,有必要通过冗余控制技术分别除去这些冗余的调控关系。为此本文提出了一种基于冗余控制策略的调控网络结构推测算法RRMRNET,该算法是 MRNET算法的一种扩展。该算法首先利用一种新的基于信息论和聚类技术的冗余控制策略以减少非线性相关所引起的冗余调控关系;然后基于互信息及条件互信息为每一个目标基因分配有效的“best-first”调控基因以减少因数据噪声所引起的冗余关系。最后将所获得的每一个基因的候选基因集及“best-first”调控基因作为 MRNET算法的输入并获取最终的网络结构。RRMRNET算法在六种数据集上进行有效性验证,实验结果表明冗余控制策略能有效提升网络结构准确性。
[硕士论文] 李玉凤
生态学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:Ca2+是真核细胞重要的细胞内信使。细胞内Ca2+浓度的变化是许多生理进程所必需的。钙库操纵的钙通道(SOCs)是钙离子流入细胞内的主要的方式,其中最著名最具特色的是钙离子释放激活钙离子(CRAC)通道。CRAC通道调节许多基本的细胞功能,包括基因表达、细胞增殖、细胞分泌等。在近十几年里,作为CRAC通道的Orai蛋白和作为内质网钙离子感受器的STIM蛋白的发现是理解CRAC通道的机制和功能取得极大进步的基础。当内质网钙库释放后,STIM蛋白发生一系列的构象变化与Orai蛋白相互作用,从而开放CRAC通道,允许细胞外的钙离子流入细胞内。但CRAC通道门控的分子机制仍然知之甚少。
  为了进一步揭示CRAC通道门控的分子机制,我们表达并分离纯化了果蝇源的Orai蛋白和STIM蛋白不同片段。在过程中对STIM蛋白不同片段的分离纯化条件进行了优化,对STIM蛋白不同片段进行了功能测试,并最终获得了较稳定并具有功能的STIM蛋白片段,同时对纯化的Orai蛋白和STIM蛋白片段进行了等温滴定测定其相互作用。我们发现Orai蛋白与STIM蛋白片段亲和力较强,这为后续通过单分子荧光能量转移技术和蛋白技术共结晶进一步的研究两蛋白的相互作用的构象变化奠定了基础。
[硕士论文] 郭宵
发酵工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:小麦芽富含阿拉伯木聚糖(AX),AX及酶解产物分子大小及结构会对麦汁及啤酒的粘度、浊度、过滤速度等产生重要影响,还具有抗肿瘤、提高免疫力等保健作用。β-1,4-木聚糖内切酶是降解AX主链改变AX溶解度、粘度、浊度等特性的关键酶。本文对小麦芽中β-1,4-木聚糖内切酶进行了分离纯化,并研究了β-1,4-木聚糖内切酶对植物源阿拉伯木聚糖的降解作用。主要研究结果如下:
  (1)经硫酸铵沉淀(ASI)、阴离子交换层析、疏水交换层析(HICIII)、凝胶过滤层析,获得了分子量为27.8 kDa,SDS-PAGE电泳条带单一的β-1,4-木聚糖内切酶(E-WMA)。纯化倍数为12.08倍,比活力为4.47 u/mg,回收率为1.45%。
  (2)液相串联质谱分析发现分子量为14.0 kDa的 SDS-PAGE电泳条带也存在与β-1,4-木聚糖内切酶相匹配的肽段,小麦芽中可能存在分子量为14.0 kDa的β-1,4-木聚糖内切酶。
  (3)在40 ℃将硫酸铵沉淀后的β-1,4-木聚糖内切酶(简称ASI)作用于纯小麦芽麦醪,与对照相比,麦汁浊度明显降低,在30 min、90 min、120 min分别降低了7.16%、38.01%和22.22%;水溶性阿拉伯木聚糖(WEAX)含量增高;重均分子量为1.85×103 Da的组分含量变化最显著,作用时间低于30 min时将水不溶的阿拉伯木聚糖(WUAX)转化为重均分子量为1.85×103 Da的WEAX的速率占主导,高于30 min降解1.85×103 Da的WEAX的速率占主导作用。
  (4)在纯小麦芽协定糖化初始阶段加入 ASI,降低了终麦汁过滤时间;但麦汁粘度没有明显变化;ASI使浊度降低30.36%~50.00%。ASI添加量低于0.9 mg/mL时,将WUAX转化为重均分子量1.92×103 Da的WEAX的速率占主导;添加量高于0.9 mg/mL时,降解1.92×103 Da的WEAX的速率占主导。
  (5)疏水层析后得到的β-1,4-木聚糖内切酶(简称HICIII)可将玉米芯中WUAX转化成WEAX,主要产物分子量为1.54×106 Da。HICIII对甘蔗渣中AX有显著降解作用,可将甘蔗渣中WUAX转化为WEAX,还可将WEAX中组分1.20×106 Da降解为组分2.81×104 Da和组分2.18×103 Da。
  (6)E-WMA对低中高粘度的小麦源WEAX都有降解作用,对高粘度的WEAX降解效果最为显著。三种WEAX溶液的浓度为2 mg/mL,高粘度WEAX粘度为2.42 mPa·s,酶解后粘度下降9.92%,Mw由2.07×106 Da的组分降解为3.37×105 Da的组分;低粘度和高粘度WEAX粘度分别为1.77 mPa·s和2.09 mPa·s,酶解后粘度分别下降了5.65%和8.13%。此外,E-WMA可将小麦源的WUAX转化成WEAX,体系粘度增高了1.89%;E-WMA还可以将转化成的WEAX进一步降解,其Mw下降20.77%。
[硕士论文] 刘建
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:对豹猫6种组织进行原代培养建系,最后选择3种组织来源细胞即剑状软骨源细胞、心脏源细胞和肺源细胞。以该3种细胞为实验材料研究豹猫细胞的生物学特性。
  在本研究中,主要进行了如下实验:细胞的原代建系及传代培养的形态观察、细胞贴壁率计算、冻存复苏率对比、3种细胞生长曲线的对比、支原体污染检测、核型分析等。
  在形态学观察方面,3种来源细胞各有显著特征但均属于成纤维样细胞。贴壁率能力分析显示,心脏源细胞最弱;肺源细胞代次P9之前易贴壁,P9之后细胞贴壁增殖及传代比较困难;剑状软骨源细胞最易贴壁。将三种细胞冻存前后存活率进行实验对比发现:解冻后相比于冻存前均有所下降,随着细胞代次的增高,细胞的存活率也有所下降。生长曲线对比发现,曲线均呈“S”型曲线,曲线显示剑状软骨源细胞增殖的最快,肺源细胞次之,心脏源细胞最慢。支原体污染检测细胞污染情况为阴性。在豹猫细胞核型分析研究中发现,染色体数目为2n=38,18对为常染色体,形态类型为7M+11SM;1对为性染色体,其形态类型X为ST。本研究为日后利用豹猫细胞、保存遗传信息及深入研究其生物学特性提供了一个好的依据和实验材料。
[硕士论文] 冯清
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  以NCBI创建的开放式基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibu,GEO)为例,开发爬虫程序可以有效的解决日益增长的高通量基因表达的实验数据带来的问题。对信息进行挖掘和处理,而不被海量信息所淹没,提高数据库的利用率;减少生物医学信息资源的浪费,为医学工作者供给全面的基因表达数据信息,推动临床生物信息学的发展。
  方法:
  1.文献分析法:
  查阅网络爬虫系统、网页抓取技术、GEO数据库方面的相关文献等,深入学习了解网络爬虫系统发展现状,网页抓取技术的策略和GEO数据库发展现状。为开发设计专门适用于GEO数据库中RNA相关数据抓取的网络爬虫系统提供理论参考和实践经验。
  2.编程语言:
  利用Python语言编写爬虫程序。
  3.数据库技术;
  使用MySQL数据库技术储存爬虫程序爬取到的基因表达数据。
  结果:
  1.本研究成功开发一款爬虫程序,爬虫程序投入运行;
  2.爬虫程序抓取GEO数据库中全部基因表达数据共71032个,并保存在Mysql数据库中。
  结论:
  爬虫程序实现GEO数据库中基因表达信息相关数据的自动抓取,免去人工下载的繁琐,有效的实现数据的大规模下载。高效地从数据库的海量信息中挖掘出有效的信息或者生物知识,帮助临床研究者浏览生物医学文献,允许数据资源的批量下载,很大程度上方便生物研究与信息的查询与借鉴。其抓取到的成果不仅对基础医学研究有极大推动作用,而且对人类疾病防治,基因定位等都具有重要意义。
[博士论文] 张欣
化学工程与技术 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:油脂资源绿色可再生,天然产量丰富,是生物质资源的重要组成部分。生物催化在区域选择性、副反应控制等方面具有传统的油脂加工工艺不可比拟的优势,因而成为近年来的研究热点。然而,生物催化剂高昂的市场售价,限制了该类技术的应用与发展。本课题组开发的Candida sp.99-125脂肪酶系列产品具有成本低,比酶活高,稳定性良好等优点,性价比优于同类国外产品。目前,以Candida sp.99-125脂肪酶为核心的绿色催化平台技术日渐成熟,并已成功应用于多类脂肪酸酯类化合物的合成与生产。但Candida sp.99-125脂肪酶针对于结构型酯类化合物(糖醇酯,甘油结构酯等)的催化特性及催化区域选择性尚有深入挖掘潜力,相关工艺尚未系统性开发并进一步优化。另外,近年来脂肪酶催化的不饱和双键环氧化反应也逐渐成为油脂改造的研究热点之一,Candida sp.99-125脂肪酶在该方面的应用尚需发展。
  为进一步完善以Candida sp.99-125脂肪酶为基础的绿色平台催化技术,本论文针对结构型类化合物产品及环氧油脂类产品,分别选取具有产品代表性的木糖醇脂肪酸酯、人乳脂肪替代结构酯(HumanMilk Fat Substitutes,HMFS)、环氧脂肪酸为目标产物,进行了合成过程分析及工艺开发的研究。论文通过探讨Candida sp.99-125脂肪酶的催化区域选择性;优化反应水含量及底物摩尔比等参数,构建合理的反应微环境;结合过程反应机理及副反应进程,调控反应温度、过程传质等参数;最终设计开发了Candida sp.99-125脂肪酶针对于相应产品的高效催化工艺。具体研究内容如下:
  1.Candida sp.99-125脂肪酶催化木糖醇脂肪酸酯合成中,首先建立了叔丁醇溶剂催化反应体系。通过预加热处理制备木糖醇-叔丁醇过饱和溶液,有效地提高反应体系中木糖醇浓度,从而提高木糖醇脂肪酸酯的转化率。在该体系中反应6h后,木糖醇转化率约为70%,产品中1(5)-O-木糖醇单脂肪酸酯含量约95%.在此基础上,本研究建立了更为绿色的木糖醇酯无溶剂反应体系。通过木糖醇等摩尔分批5次加入,解决反应底物溶解问题。反应120 h后,糖醇酯的转化率为70%。其中1(5)-O-木糖醇癸酸单酯相对含量为16%,1,5-O-木糖醇癸酸二酯相对含量为60%,木糖醇1,2,5-O-癸酸三酯与1,3,5-O-木糖醇癸酸三酯相对含量为24%.同时发现,体系最终产品构型同脂肪酶的催化选择性无关,反应能量壁垒和体系热力学特性决定了最终产品的构型和组成。
  2.母乳脂肪中甘油三酯具有特定结构,其从头合成对催化选择性及反应过程控制要求较高,极具挑战性。本研究结合酶催化过程中酰基转移副反应的机理实现了对反应过程进行调控,并有效控制了催化过程的位置选择性,得到了针对Candida sp.99-125脂肪酶催化合成HMFS的最佳工艺条件。催化得到的产品经分离纯化后,产品的酸价为2 mgKOH/g,甘油三酯中sn-2位棕榈酸占总棕榈酸比例的含量为52%-55%,棕榈酸甘油三酯在总甘油三酯中的含量为8.4%-9.6%,目标产品型甘油三酯含量为55-59%,产品过氧化值1.41-1.89meq/g,产品的各项指标均可满足并超过国家标准要求。
  3.不饱和脂肪酸的环氧化过程中,由于游离羧基的作用,使得该反应过程相对于脂肪酸酯的环氧化更加复杂,副反应更难于控制。本研究首先针对化学催化脂肪酸环氧化过程中,环氧基团开环副反应严重的问题,通过过程分析与优化,建立了过程动力学模型,通过分析各反应的速率及能量问题,得到了化学催化过程各类开环反应难以避免的结论。在化学催化研究的基础上,设计并优化了Candida sp.99-125脂肪酶催化的不饱和脂肪酸环氧化反应体系。以油酸为底物,在30℃条件下,反应10h后,产物环氧值可达4.12%,环氧转化率76.58%,环氧化选择性0.98。以无患子油混合脂肪酸为原料,验证了该催化工艺的稳定性和可靠性。最终,从反应条件、反应机理、反应动力学方面,对比了化学催化甲酸原位环氧化和Candida sp.99-125脂肪酶催化环氧化过程的区别,讨论了两种方法的优缺点。
  综上所述,论文通过研究Candida sp.99-125脂肪酶在结构型酯类化合物产品催化转化过程中,酰基转移副反应的机理、历程、相关调控措施、策略;以及不饱和脂肪酸环氧化过程中开环副反应的影响及控制技术,过氧化物对脂肪酶的毒性问题及其解决方案;进一步完善了以Candida sp.99-125脂肪酶为基础的绿色生物催化平台技术,有利于提高生物催化技术在工业生产应用中的竞争力。
[硕士论文] 臧欢
农业电气化与自动化 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:畜牧养殖业迅猛发展,禽流感、口蹄疫等动物传染病随之暴发流行,兽用疫苗的市场需求量大幅度增加,采用传统转瓶培养方式生产疫苗已远远不能满足现代畜牧养殖业的发展。动物细胞悬浮培养技术逐步代替传统转瓶培养方式,并成为当前工业生产生物疫苗的主流技术,所以,如何应用动物细胞悬浮培养技术实现疫苗的快速高效生产成为当前以及未来生物制药领域的焦点和竞争核心。
  动物细胞悬浮培养过程具有高度的非线性、时变性等特性,过程中由于受到传统物理仪表测量方法的限制(易染菌、成本高等),一些关键状态变量(如葡萄糖浓度、乳酸浓度、细胞密度等)的实时监测严重制约了产物合成从而影响了生物制品的产量和质量。而离线测量又具有一定的滞后性,严重影响了整个过程的优化控制。软测量技术的出现为解决上述问题提供了一种有效途径。
  本文针对BHK-21(乳仓鼠肾细胞)悬浮培养过程关键状态变量难以实时测量的问题,提出一种基于直角三角形角度值动态加权的软测量建模方法。首先结合培养过程工艺机理,确定模型的主导变量,然后基于现场采集数据,应用相关系数法确定模型的辅助变量,最后建立软测量模型。在深入了解支持向量机、最小二乘支持向量机和关联向量机的基础上,将其与基于直角三角形角度值动态加权的关联向量机建模方法进行对比。结果表明,相比支持向量机与最小二乘支持向量机,关联向量机的解具有较好的稀疏性和更高的鲁棒性,且模型预测精度较高;动态关联向量机不仅具有关联向量机的优点,而且能将工业过程的动态特性引进模型中,使得预测效果更加精确、更能体现工业过程的本质。
  为了实现BHK-21细胞悬浮培养过程实时监测及优化控制,充分利用MATLAB强大的计算能力和WinCC强大的脚本编程能力,建立基于MATLAB和WinCC混合编程平台的BHK-21悬浮培养过程关键状态变量的在线预测及实时监控系统,为培养过程的优化控制奠定了基础。实验结果表明,所建监控系统能够实时准确的进行关键状态变量的显示,为进一步的优化控制提供了充分的工况信息,降低了系统故障概率,从而实现经济高效的工业生产。
[硕士论文] 杜盼
药学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:自2006年 Yamanaka首次利用“四因子”组合(pSOX2、pOCT4、pC-MYC、pKLF4)成功诱导生成iPSCs后,细胞重编程技术始终是研究热点之一。由于iPSCs来源于患者自身体细胞,并具有自我更新和多向分化能力,因此,将 iPSCs作为一种替代胚胎干细胞(ESCs)的细胞应用于临床中,能够有效避免很多伦理及法律问题,且 iPSCs源于患者,能够实现个体化治疗。
  原位肝移植是目前唯一能有效治疗肝癌的方法。然而,由于器官短缺,近年来因为肝癌死亡的人数不断增加;此外,世界范围内的肝癌发病率也在不断上升。肝细胞移植的临床试验带来振奋人心的成果。但作为替代肝脏移植的肝细胞移植仍然需要解决肝细胞来源的问题。目前,很多研究都致力于寻找一种能够产生稳定的功能性肝细胞的可行性方法。其中,可能会成为肝细胞不竭来源的细胞就是人源诱导多能干细胞(hiPSCs)。hiPSCs具有自我更新和多向分化能力,与人源胚胎干细胞(hESCs)相比,hiPSCs涉及到的伦理问题较少,且完全不受来源限制。因此,hiPSCs来源肝细胞(hiPSC-HEPs)在药物筛选、细胞治疗以及体外疾病模型等方面具有重要的意义。本研究课题是以磷酸钙纳米粒作为基因载体,通过携带两种不同因子组合将人脐带间充质干细胞(hUMSCs)重编程为hiPSCs,继而进行肝细胞定向诱导分化,并筛选优化出最佳诱导分化培养基,采用最佳诱导方案对其进行培养,使其分化为肝细胞,为肝细胞移植提供理论基础,从而更好地解决肝细胞短缺问题。
  第一章重编程法制备人源肝脏细胞及其应用研究进展
  通过查阅大量资料,对人源肝细胞重编程方法进行了综述,总结并分析人源肝细胞重编程的影响因素;阐述了人源肝细胞重编程技术的研究现状及其在再生医学、药物筛选及体外疾病模型等方面的应用,并指出人源肝细胞应用于临床实践的局限性。为本论文实验工作的顺利开展和进行提供了理论依据。
  第二章非病毒纳米基因传递系统的 hiPSCs重编程研究
  采用磷酸钙纳米粒作为基因载体,对比两种不同的因子组合,即 pSOCK(pSOX2、pOCT4、pC-MYC、pKLF4)与 pOS+miR(pOCT4、pSOX2、miR302b-367),制备得到磷酸钙纳米粒 C-pSOCK与 C-pOS+miR,通过琼脂糖凝胶电泳、透射电镜观察、毒性评价、粒径以及 Zeta电位测定等一系列检测进行表征;以人脐带间充质干细胞(hUMSCs)为源细胞,进行重编程研究。结果显示:两种因子组合所制备得到的纳米粒均呈现形态规整、分散均匀、表面带正电荷的球形或者椭球型;细胞毒性实验表明两种不同因子组合制备得到的磷酸钙纳米粒无毒或低毒;通过碱性磷酸酶染色,统计阳性克隆数,从而考察两种纳米粒的重编程效率;免疫荧光、Western blot均说明纳米粒 C-pOS+miR诱导生成的 hiPSCs能够表达多能性标记蛋白,且能进行体内分化(内、中、外)。
  第三章 hiPSCs的肝细胞定向诱导分化研究
  设置4种不同肝细胞诱导分化培养基(MediumⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),对重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化,采用酶联免疫检测法(ELISA)分别在诱导分化第0,3,7,11,15,19,23,27,32天检测 AFP和 ALB表达情况,从而筛选出最佳诱导方案;光学显微镜下观察细胞形态变化;用免疫荧光法、Western blot检测肝脏特征性蛋白(AFP、ALB、CK8、CK18、SOX17)的表达。结果显示:诱导培养基 MediumⅡ、诱导方案“三步法”的肝细胞诱导效果较好;显微镜下观察细胞形态发生明显变化,从“克隆团”形态逐渐变化为“铺路石”样形态,诱导分化结束后,细胞形态基本一致,为多角多边形或者类圆形,且细胞核较明显,部分细胞表现出典型肝细胞形态:出现双核甚至多核现象,且诱导分化的肝细胞能够表达肝脏肝脏特征性蛋白(AFP、ALB、CK8、CK18、SOX17)。
  第四章二维培养体系中肝细胞药物代谢酶表达及细胞活性研究
  在二维培养体系下,选择Ⅰ相代谢酶细胞色素 P450(CYP450)、Ⅱ相代谢酶葡萄糖醛酸转移酶(UGT)与谷胱甘肽硫转移酶(GST),用 Western blot测定诱导后细胞蛋白表达,以人胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)为阳性对照;考察在诱导分化不同时间药物代谢酶的动态变化,同时比较 hiPSCs诱导形成的肝细胞与胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)药物代谢酶的表达差异;不同时间取样,检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)的质量浓度;检测白蛋白分泌、尿素合成及葡萄糖消耗含量,分别采用溴甲酚绿法、二乙酰-肟法及葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法。结果显示:hiPSCs诱导形成的肝细胞(hiPSCs-HEPs)能够较好表达 CYP450、UGT与 GST,且与hESCs-HEPs表达无明显差异;而诱导前 hiPSCs很少表达甚至不表达CYP450、UGT与 GST;hiPSCs的肝细胞诱导分化过程中ALT、AST、LDH变化趋势与 hESCs基本一致;hiPSCs-HEPs与 hESCs-HEPs测定的白蛋白分泌水平、尿素合成浓度以及葡萄糖消耗量基本一致。
  第五章三维培养体系中hiPSCs定向肝细胞诱导分化
  在三维培养体系下,对重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化。以Ⅰ型胶原和壳聚糖作为支架材料,采用冷冻干燥-热固化法制备胶原/壳聚糖三维支架,考察不同质量比与不同固化时间对支架性能的影响,优化三维支架制备工艺,通过形态观察、吸水率与保水率测定等对制备得到的支架进行表征;将纳米粒 C-pOS+miR与空白胶原/壳聚糖支架相结合,得到三维载基因纳米粒-胶原/壳聚糖支架;人脐带间充质干细胞(hUMSCs)在三维载基因纳米粒-胶原/壳聚糖支架中进行重编程后,形成边界清晰、形态规整的克隆团;对三维支架上重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化,用 ELISA法对比二维与三维培养体系中肝细胞功能;分别用溴甲酚绿法、二乙酰-肟显色法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法比较二维与三维培养体系中肝细胞代谢活性。结果显示:在三维培养体系诱导21天后,细胞形态呈现明显的肝细胞样细胞形态;在三维培养体系下,诱导形成的肝细胞功能没有“损伤”,仍处于正常肝功能状态。
[硕士论文] 董剑
化学工程与技术 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是最丰富的可再生和可生物降解的聚合物。自然界里的纤维素年产量预计为1011–1012吨,虽然有如此多的纤维素来源,但是人们对于这种生物质资源的利用不是很高。纤维素酶是生物来源的催化剂,在温和条件下具有较高的选择性、特异性。但是由于纤维素酶的工作条件比较苛刻,在催化水解的过程中容易失去活性。因此纤维素酶的催化水解效率不高。由于固定化酶在较温和的pH值、温度、压力条件下进行催化,有着高活性和无与伦比的选择性,酶的固定化变的越来越重要。
  本文讨论了两种复合材料固定化纤维素酶,一种是四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在四氧化三铁磁性纳米粒子的上面。第二种是接枝两种不同臂长的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面。本文选定了以蛋白载量,固定化酶的活力,比活力为衡量标准,讨论了加酶量、时间、温度三个条件对固定化纤维素酶的影响。又比较了游离酶与固定化纤维素酶的酶学性质,另外还比较两种不同臂长的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面固定化纤维素酶的酶学性质。主要是从最适最适pH、温度、米氏常数、热稳定性、重复使用稳定性以及贮藏稳定性这几个方面研究其酶学性质。研究结果表明:游离酶的催化反应最适温度为45℃,而固定化酶的为50℃,游离酶的pH为5,固定化酶催化最适pH为4。四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在四氧化三铁磁性纳米粒子固定化纤维素酶、接枝分子接枝分子量5K的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面固定化纤维素酶、接枝分子量10 K的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面固定化纤维素酶的米氏常数分别是11.9471 g/L,3.0411 g/L,1.6220 g/L。固定化酶在热稳定性、重复使用稳定性、其贮藏稳定性都比游离纤维素酶的好。最后做了三种酶的催化水解应用实验,发现接枝分子量10 K的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面固定化纤维素酶的催化效果比接枝分子接枝分子量5K的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面固定化纤维素酶好,接枝分子接枝分子量5K的四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在磁性氧化石墨烯表面固定化纤维素酶的催化效果比四臂型聚乙二醇树枝状聚合物修饰在四氧化三铁磁性纳米粒子固定化纤维素酶效果好。
[硕士论文] 安扬东方
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:海藻糖普遍存在于自然界,是一种非还原性二糖。海藻糖酶可以将海藻糖特异性地水解为葡萄糖,海藻糖酶作为食品添加剂可以治疗二糖缺乏症,人体内某些肾脏疾病的诊断可以通过检测尿海藻糖酶的活性来实现,故而海藻糖酶在食品、医疗等领域具有很高的应用价值,此外,也可以通过研究海藻糖酶的结构与功能开发新型酶抑制剂应用于昆虫防治中。
  本研究从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae strain AR_0002)中克隆到了一个海藻糖酶基因,将其命名为treE。treE基因全长1650bp,GC含量58%,编码549个氨基酸,分子量为63.5kDa,预测的pI为4.93。与NCBI数据库中的海藻糖酶基因序列对比后发现,treE与来自于Enterobacter Cloacae ATCC13047的海藻糖酶基因序列具有88%的一致性。
  酶学性质分析表明,treE的最适反应温度和pH分别为50℃和6.0。在pH5.5-9.0的范围内,酶在4℃条件下处理了48h,保持了80%以上的活性,说明在偏中性的条件下,该酶的稳定性良好。Mn2+,Fe3+(1mM,5mM),Co2+(1mM)可以提高treE的活性, Cu2+,Fe3+(10mM),Mg2+(10mM),Co2+(10mM)抑制了treE的活性。最适条件下,treE的Km是3.318 mmol/L,Vmax是0.445 mmol/L·min, kcat是1265.164s-1,催化效率(kcat/Km)为381.303 L·mmol-1·s-1。
  为了提高treE的催化活性,对treE进行了体外诱变,构建了随机突变文库,利用实验室建立的高通量筛选方法,我们从16000个随机突变体中筛选获得了一个酶活提高突变子1-D8。序列分析表明,1-D8含有两个突变位点:Tyr22Cys和Trp491Arg。酶学性质分析表明,1-D8的最适反应温度为45℃,比野生型降低了5℃;最适反应pH为6.5,用pH5.5-9.0的缓冲液在4℃下处理48h后,仍保留80%以上的活性。动力学分析表明,1-D8的Km是3.082 mmol/L,kcat值为1819.651 s-1,kcat/Km值为590.412 L·mmol-1·s-1,比野生型提高了54.8%。
  为了探究1-D8中两个突变位点对酶活的影响,本研究依次对它们进行了单点回复突变。酶动力学分析表明, Y22C的Km是3.355mmol/L, kcat为1331.910 s-1,催化效率(kcat/Km)为396.993 L·mmol-1·s-1,比野生型提高了4.0%。突变体W491R的Km值为3.060mmol/L,kcat值为1734.137s-1,催化效率(kcat/Km)为566.711 L·mmol-1·s-1,比野生型高了48.6%。这表明1-D8活性的提高主要来自突变位点W491R的贡献。
  此外,本研究通过结构模拟与分子对接,初步确定R168可能与treE的催化效率有关。为了验证这一推测,我们构建了单点突变R168G,其Km为2.380mmol/L,kcat为530.777 s-1,催化效率(kcat/Km)为223.016L·mmol-1·s-1,与野生型相比下降了41.5%。
  本研究在获得海藻糖酶的基础上,对其进行定向改良,获得了酶活提高的突变体,为进一步改造提高酶活提供了材料和线索。同时,鉴定了与催化效率相关的氨基酸残基,为深入探索海藻糖酶结构与功能关系提供了参考。
[硕士论文] 李猛
内科学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:引言:研究表明自怀孕第6周至妊娠结束,胎盘中均含有HSC(HSC),且具有细胞数量大,获取便捷,使用过程中不存在伦理问题等优点。目前针对脐血(UCB)来源造血干/祖细胞(HSPC)的体外扩增临床研究已经取得成功,采用扩增后UCB来源HSPC进行移植可以有效解决HSC数量不足造成的造血恢复延迟等问题,数据表明移植后干细胞较未扩增UCB来源HSPC具有相同植入率。胎盘来源HSC与UCB来源HSC同属于围产期干细胞,研究表明其较UCB来源HSC更为原始,目前国内外尚无针对胎盘来源HSC体外扩增的文献报道。
  目的:本研究旨在通过比较机械处理联合化学酶消化法及AMD3100循环灌注法提取人胎盘来源HSC的效果,构建适用于未来临床应用的胎盘来源HSC分离提取方法,得到来源清楚组份确定的HSC;基于模拟造血微环境的体外扩增理论,探讨UCB中CD34+细胞在间充质干细胞(MSC)共培养体系、UM171联合细胞因子扩增体系以及 UM171联合细胞因子与MSC共培养体系三种不同扩增体系下体外扩增效果;依据优化的胎盘来源HSC提取方法,对胎盘来源 HSC进行分离提取,并基于模拟造血微环境理论构建的扩增体系对提取得到的CD34+细胞行体外扩增,评价扩增效果及扩增后HSPC功能,为拓展临床HSC来源做出尝试。
  方法:
  1、健康足月顺产胎盘依照处理方法不同分为两组进行胎盘来源 HSPC体外提取:A组(机械处理联合化学酶消化组)、B组(AMD3100循环灌注组),每组处理胎盘5个。A组将胎盘经预处理后解剖成小组织块,采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后收集清洗液(命名为A1),采用胶原酶、透明质酸酶、DNA酶对清洗后的胎盘组织块进行消化,并置于100目及200目滤网研磨,收集消化液(命名为A2)。B组采用智能蠕动泵连接脐动静脉,采用生理盐水(NS)NS及含AMD3100的NS分步对胎盘脉管系统行循环灌注,分别收集两次灌洗液(命名为B1及B2)。比较两种方法收集得到各类细胞总数,并分别测定两种方法不同阶段收集得到细胞数量及其流式表型情况。
  2、采集到的UCB进行磁珠分选后得到纯净的CD34+细胞,脐带剪至小块后采用含有0.2%Ⅱ型胶原酶的 DMEM/F12培养基进行消化后,进行贴壁传代培养。UCB来源 CD34+细胞及脐带来源 MSC分为以下四组进行体外扩增培养10天:A组(对照组)、B组(UM171培养组)、C组(MSC共培养组)、D组(UM171联合MSC共培养组)。四组细胞均采用 StemSpan培养基,并添加100 ng/ml干细胞因子(SCF),100 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3),50 ng/ml促血小板生成素(TPO),CD34+按照1×105/孔密度接种于六孔板中,其中 B组在培养基中额外添加100 ng/ml UM171,C组采用分离得到的第三代脐血同源脐带MSC作为基质细胞,待贴壁90%融合采用60Co照射,剂量为10Gy,D组在C组实验条件基础上同时添加100 ng/ml UM171,细胞培养10天后比较不同组别间细胞扩增倍数及流式表型和集落培养情况。
  3、分别将AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液经免疫磁珠纯化,采用UM171联合MSC共培养方法分别对纯化后的胎盘来源CD34+细胞进行体外扩增培养,验证其扩增效果及流式表型和集落培养情况。
  结果:
  1、A组与 B组收集得到的 TNC分别为(45.19±9.41)×107和(42.69±11.19)×107,二者无统计学差异;收集得到的 CD34+细胞数(12.98±3.62)×107和(1.87±0.87)×107,二者比较,p=0.00,具有显著统计学差异;收集得到的CD133+细胞数分别为(1.16±0.61)×107和(1.15±0.63)×107,二者无统计学差异;A组收获的细胞液 A1中含有 TNC为(6.76±2.13)×107,其中CD34+CD38-比例为(1.14±0.56)%。收获的细胞液 A2中含有 TNC为(38.44±7.33)×107,其中 CD34+CD38-比例为(30.31±10.75)%;B组收获的细胞液 B1中含有 TNC为(15.11±6.03)×107,其中 CD34+CD38-比例为(0.72±0.34)%。收获的细胞液 B2中含有 TNC为(27.58±11.14)×107,其中CD34+CD38-比例为(5.56±1.78)%。
  2、分离得到的脐带MSC传代培养后细胞状态良好,流式检测发现其高表达 CD105, CD73, CD90,不表达 CD14, CD34,CD19,CD45, HLA-DR,SSEA-4含量约在1%,经过诱导培养后可以分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。CD34+细胞在不同条件下体外培养10天后发现,对照组细胞总数扩增3.7倍,CD34+细胞扩增3.5倍,组别间无明显差异。UM171培养组总有核细胞数扩增14倍,CD34+细胞扩增13.5倍;MSCs共培养组总有核细胞数扩增11倍,CD34+细胞扩增10倍;联合培养组总有核细胞数扩增达22倍,CD34+细胞扩增21倍。UM171联合 MSCs组得到CD34+CD38-细胞比例为91.49±2.67%,较MSCs及UM171组(分别为(78.11±2.34)%,(87.66±1.48)%)均在显著差异,含UM171培养体系CD133细胞比例较单独MSCs培养组存在差异,扩增后细胞集落培养14天后,各系集落形成良好, UM171扩增组细胞较MSCs扩增组在红系及粒系形成能力方面存在优势。
  3、胎盘NS灌洗液中CD34+细胞经10d培养后细胞总数扩增17倍, CD34+细胞扩增14倍;胎盘AMD3100灌洗液中CD34+细胞经10天培养后几乎全部死亡。脐血对照组与胎盘NS灌洗组扩增后细胞在TNC、CD34+细胞总数、CD133+细胞总数均存在统计学差异,其中胎盘 NS灌洗组CD34+CD38-比例为(82.70±6.89)%;扩增后脐血来源及胎盘 NS灌洗液中CD34+各谱系集落形成能力良好,胎盘NS灌洗液中CD34+细胞在粒系形成能力方面较未扩增脐血CD34+细胞存在差异。
  结论:
  1、机械处理联合化学酶消化法以及AMD3100循环灌注法均可以对胎盘来源CD34+细胞进行有效收集,其中AMD3100循环灌注法在保证细胞收集数量的同时可以有效降低细菌污染风险,并可降低母体组织对胎盘来源HSC的影响,收集得到的CD34+细胞经免疫磁珠分选后纯度较高,较机械处理联合化学酶消化法在收集胎盘来源HSC上具有更大的优势。
  2、脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可提高CD34+细胞体外扩增效果,UM171在扩增过程中可较好的保持细胞干性,二者联合应用扩增效果最佳,建立的脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34+细胞的扩增方法可用于CD34+细胞体外扩增培养。
  3、经AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液中CD34+细胞在脐带MSC联合细胞因子及UM171培养体系中扩增效果存在明显差异,其中NS灌洗液中CD34+细胞扩增效果可达17倍,其中较为原始的CD34+CD38—细胞比例达82%,扩增后细胞集落培养实验表明其具有与脐血来源扩增后 CD34+细胞同样的谱系重建能力。AMD3100灌洗液中CD34+细胞在该体系中不能进行有效扩增,其细胞来源及功能尚需进一步研究。
[硕士论文] 刘倩
化学工程 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:作为一种天然催化剂,酶在催化过程中具有的催化效率高,反应条件温和,高度专一的特点,同时也有易失活和难回收等阻碍酶工业应用的特点。为了利用酶优良催化性能的同时克服上述弱点,固定化酶成为专家学者们的研究重点。而固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的载体材料。
  本论文中,我们将制备三种不同的复合材料作为载体,以共价结合的方式,分别固定化纤维素酶或辣根过氧化物酶,具体内容如下:
  (1)设计合成了磁性复合微球Fe3O4@SiO2@P(GMA-co-NIPAM),并对其性能和形貌进行表征。该微球呈现直径约为350nm的核-壳-壳结构,同时具有超顺磁性。将其应用到纤维素酶的固定化过程中,最佳固定化条件下得到纤维素酶固载量约为233.00mg g-1.对固定化酶的酶学性能进行了测定,相对于游离酶,固定化酶的催化温度域拓宽;催化 PH值没有太大影响;温度稳定性,贮藏稳定性均有提升。利用固定化酶反复水解催化羧甲基纤维素6次后,相对酶活为65.6%,具有较高的重复操作性。此外,固定化纤维素酶具有一定的热变性复性能力。
  0设计合成磁性多臂复合微球Fe3O4@PAA-6-arm-PEG-NH2,并对性能和形貌进行表征。利用戊二醛连接辣根过氧化物酶和材料表面的氨基,得到共价固定化辣根过氧化物酶。其次,探讨了固定化过程〔戊二醛浓度,材料量,时间,温度)对固定化结果的影响,得到酶固载量约为139.82mg g-1,远远高于其他学者的研究。固定化辣根过氧化物酶的酶学性能都有了一定程度的提升。其中,在贮存60天后,固定化辣根过氧化物酶的相对酶活高达71.05%;催化反应8次后,相对酶活为61.06%。最后,探讨了该固定化辣根过氧化物酶降解水溶液中苯酚的能力,优化降解过程,如苯酚浓度、过氧化氢量、固定化酶用量、反应时间。在此基础上,对含有苯酚的水溶液进行降解,对比载体材料和游离辣根过氧化物酶,固定化酶的降解速率明显高于游离酶和载体材料。
  (3)设计合成了磁性氧化石墨稀复合材料 GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2,并对其形貌结构进行表征。该材料呈现近乎透明的薄膜状,具有超顺磁性,饱和磁化强度为30.80 emu g-1。利用 GO-Fe3O4-6-arm-PEG-NH2固定化辣根过氧化物酶,最佳酶固载量约为186.34 mg g-1.相比游离酶,固定化辣根过氧化物酶对催化环境的条件耐受性略有增强。温度稳定性,贮存稳定性和操作稳定性有所提升。利用固定化辣根过氧化物酶进行苯酚降解实验,由于氧化石墨烯材料具有一定类酶催化性能,固定化辣根过氧化物酶对苯酚的降解效果远远高于游离酶和载体材料。
[硕士论文] 李发家
微生物学 广西大学 2017(学位年度)
摘要:壳聚糖为目前发现的唯一一种天然阳离子多糖,它在自然界中分布广泛,储量丰富。壳寡糖为壳聚糖的水解产物,具有壳聚糖抗菌、抗肿瘤和抗氧化等独特生理活性;同时,又因为壳寡糖低分子量、高水溶性和易被生物体吸收等特点,更利于工业生产和利用。红树林生态系统结构复杂,其中蕴含着丰富的微生物资源,存在数量繁多的甲壳类生物,是天然壳聚糖的重要产地。
  本研究通过纯培养技术,从广西亚热带海洋土壤沉积物样品中分离筛选得到四株能够在壳聚糖筛选平板上产生水解圈的菌株,经过复筛后选择其中壳聚糖酶活力最高的菌株GZ1进行菌种鉴定。鉴定结果表明,菌株在显微镜下观察为杆状,革兰氏染色呈阳性,有芽孢和荚膜,在培养基上菌落生长较大,颜色呈黄色,表面粗糙不透明,边缘呈不规则波浪状。同时,经过16S rDNA测序后发现GZ1与Bacillussubtilis strain CS10有99%一致性,进化树构建结果显示亲缘性最近菌株为Bacillus subtilis strain CS10,结合菌株GZ1的常规生理生化性质鉴定,菌株GZ1可鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为Bacillus subtilis GZ1。
  采用DNS法测定发酵液的壳聚糖酶活力,同时对粗酶液的最适反应温度与pH进行了测定,测定结果显示粗酶液的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.5。
  进行氮源、碳源、pH值、装液量、转速、温度和壳聚糖量的单因素实验,并根据单因素实验结果进行了氮源浓度、pH值、装液量和温度的四因素三水平正交实验,最终所得到的最适氮源为1%蛋白胨、最适碳源为1%可溶性淀粉、最适发酵温度为20℃、最适发酵pH为7.5、最适装液量为80mL/250mL、最适培养转速为180rpm、最适壳聚糖量为0.75%、培养时间为2d。在最优发酵条件下进行发酵产酶,测定所得发酵液最高酶活力为1.886U/mL,为优化前的2.6倍。在本研究中,经过正交实验优化后,除了温度没有改变外,其他几个因素相对于单因素实验都有一定的变化,因此,在Bacillus subtilisGZ1的发酵条件优化中,各因素间的相互作用可能影响较大,以响应面法来进行条件优化应该能取得更好的效果。
  当前报道的重组表达壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌发酵产酶能力大都较高,与之相比,Bacillus subtilis GZ1为野生型菌株,未经过改造,发酵产酶能力较低。因此,通过对Bacillus subtilis GZ1壳聚糖酶基因的启动子与拷贝数进行改造的方式,应能使Bacillus subtilis GZ1的发酵产壳聚糖酶能力有一个较大的提升。此外,枯草芽孢杆菌为动物饲料的常用添加剂,而Bacillus subtilis GZ1所产壳聚糖酶最适反应温度较高,达到55℃,较高的酶反应温度使其在饲料工业的生产中有一定的应用价值和参考价值。
[硕士论文] 杜博雅
计算机科学与技术;计算机应用技术 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:在生物信息学领域,生物基因的序列比对一直是科学研究的热门问题之一。随着生物学的发展与对物种研究的深入,基因数据日益增多。同时新一代测序技术的出现,测序时间和成本下降、测序通量高使序列数据显著增加,呈指数形式增长趋势,并且每天仍有新的生物基因序列数据被发现和记录,而数据产生的速度远大于数据处理的速度,因此对大规模DNA测序数据的处理亟待更高效的方法。对海量数据进行及时有效的处理、分析,对于揭示其内涵、阐明和理解其所蕴含的生物学意义、得到对人类有用的信息具有重要意义。序列比对作为基因数据研究的基础问题,能够为后续基因组计划等研究提供重要信息,因此提高测序数据的序列比对速度至关重要。
  本文通过对已有序列比对算法的研究,针对目前基于BWT(Burrows-Wheeler Transform)索引技术的比对软件比对准确率高且内存消耗小,较其他基于哈希表的方法性能优越,但存在访存次数多,时间消耗较大的问题,就如何提高BWT索引技术的序列比对速度进行研究,提出一种应用基于Intel微架构的AVX(Advanced vector Extensions)指令技术,从改进原有算法内部函数运算方式的角度进行单线程并行优化的方法,对BWT算法中计算量大、多次递归调用的函数进行改写,减少函数运算次数及CPU访存次数,提高算法执行效率,实现提高BWT算法序列比对速度、降低算法时间消耗的目的。
  本文设计并实现了基于AVX指令集优化的BWT序列比对算法,在对BWT算法的代码及实现过程进行深入研究之后,找到适于AVX指令对代码改写的部分。将occ函数结果全部计算出来并存在内存中,在计算时使用AVX指令集的计算方式进行计算,使计算机能够一条指令并行执行多次计算,极大缩短算法运行时间。为验证比对结果的准确性和速度比,本文采用大豆测序数据对算法进行实验。实验结果表明,本文提出的指令改进有效提高了算法的查找效率,加快了序列比对速度。在接近源码比对准确率的同时提高比对速度近50%,使算法时间性能得到显著提升,实现序列比对在算法改写方向的并行优化。
  本文提出的基于AVX指令集的BWT序列比对算法相比于传统的算法计算过程,能够进行并行计算查找,有效减少函数计算时的循环遍历,减少计算次数与CPU访存次数,降低算法时间复杂度,提高序列比对速度,使得算法的时间性能有所提高。并且算法性能十分稳定,在低误配率下表现良好,对更精确的序列比对算法改进具有实际意义,为基因数据分析提供更高效快速的序列比对方法,为进一步加快对全基因组序列的处理打下基础。
[硕士论文] 徐志龙
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:角蛋白是一种结构致密的蛋白质,在自然界中的资源分布非常广泛。然而,因其分子间存在大量的二硫键,使角蛋白很难被普通蛋白酶降解。角蛋白酶是一类能够特异性降解角蛋白的生物酶,若能合理地利用角蛋白酶的这个特性,不仅可以将每年数百万吨的禽类羽毛变废为宝,还保护了环境。
  本研究从土壤中分离到一株产角蛋白酶菌株——枯草芽孢杆菌KS12,液态发酵角蛋白酶酶活可达46.89 U/mL。在对其粗酶的酶学性质进行探究后发现:枯草芽孢杆菌KS12生产的角蛋白酶的最适反应pH为7.5,在碱性环境(pH7.5-9.0)中的稳定性较高,酸性条件下的酶活受到明显抑制;该酶的最适反应温度为37℃;不耐高温,60℃条件下孵育1h后,相对酶活仅为50%。Ca2+和Mg2+(5 mmol/L)对酶活有较大的促进作用;重金属离子普遍对角蛋白酶活性表现出抑制作用,Cu2+的存在会强烈抑制角蛋白酶的活性。浓度为5%的吐温80会在一定程度上提高角蛋白酶的活性,SDS和H2O2对酶活的抑制作用明显;有机溶剂的加入可能会对角蛋白酶产生毒害作用,致使酶活受到强烈抑制。
  为了进一步了解枯草芽孢杆菌KS12在发酵中产酶的能力,研究通过单因素试验确定了羽毛粉麸皮混合固态发酵的工艺条件:羽毛粉70%,麸皮30%,培养基初始含水量55%,氢氧化钙浓度0.2%,葡萄糖3%,接种量为10%,适宜的发酵温度为37℃,发酵3d,间隔12h翻料一次。当发酵进行到72h时,角蛋白酶酶活最高可达356.34±7.21 U/g,可溶性蛋白含量为60.46±1.69mg/g。浅盘放大发酵结果表明,36h角蛋白酶酶活达到542.46±15.47U/g,可溶性蛋白含量为45.41±2.27mg/g。体外模拟消化试验测得罐头瓶发酵产物的体外消化率较未发酵前提高了28.1%。
[硕士论文] 张富豪
发酵工程 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:1,3-甘油二酯(1,3-DAG)是一种健康的油脂,它能在体内以能量的形式释放而不会在体内积累,从而可以减少肥胖发生的机率。酶法制备1,3-甘油二酯是最为有效的方法,而脂肪酶是该法常用的一种酶。1,3-甘油二酯的脂肪酶法制备包括酯合成、甘油解、转酯化法、甘油三酯水解四种,其中最为简便的应为甘油三酯直接水解法,但这需要能专一性水解 Sn-2位酯键的脂肪酶参与,而该类型的脂肪酶在国内外报道极少。本课题组在富含油脂的土壤中筛选得到一株产高Sn-2位选择性且酶活较高的胞外脂肪酶菌株黑曲霉GZUF36。然而,该菌株产胞外 Sn-2脂肪酶性状出现了衰退。因此,本文从该菌株出发,对黑曲霉 GZUF36产胞外Sn-2脂肪酶性能的复壮、胞外Sn-2脂肪酶分离纯化、酶学性质、酶固定化进行研究,从而为进一步研究该酶酯键选择性机理做铺垫。
  首先对黑曲霉GZUF36稳定生产胞外Sn-2脂肪酶培养基的探索,发现培养基配方(牛肉膏0.5%,蛋白胨0.5%,橄榄油1.0%,硫酸铵0.2%,磷酸氢二钾0.5%,硫酸镁0.02%,氯化钙0.01%,氯化钠0.5%)能恢复其产酶性能。对该菌株产的胞外 Sn-2脂肪酶进行水解酶活力和油酸甘油三酯水解反应产物进行测定,发现水解酶活力为7.92±2.23 U/mL,1,3-DAG得率为16.34±1.27%,1,3-DAG选择性为82.67±3.01%。相较于衰退前的胞外Sn-2脂肪酶催化性能,该培养基下产的胞外Sn-2脂肪酶的水解酶活力和1,3-DAG得率偏低,但选择性已经恢复到先前水平,说明衰退的黑曲霉GZUF36重新复壮后仍能生产高Sn-2选择性的脂肪酶。而水解酶活力和1,3-DAG得率偏低可以通过培养基和培养条件优化来改善。
  其次对发酵液中胞外 Sn-2脂肪酶进行分离纯化,采用丙酮沉淀和反胶束萃取法相结合来实现。研究发现丙酮沉淀的最佳条件为:发酵液和丙酮的体积比为1:2.5,混合物在-18℃下沉淀1 h,在该条件下脂肪酶酶活力回收率为73.2±1.36%,纯化倍数为2.13±0.072。反胶束前萃取的最佳条件为:CTAB浓度为125 mM,有机溶剂体系75%异辛烷/15%正丁醇/10%正己醇(体积比);水相 NaCl的浓度为0.075 M,pH为9.0;有机相和水相以体积比1:1混合,在30℃条件下萃取30 min,在该条件下前萃取效率达到了90.3±3.2%。反萃取的最佳条件:水相KCl的浓度为1.5 M,添加10%无水乙醇,pH为6.5;前萃取中含脂肪酶的有机相和上述水相以体积比1:1混合,在30℃条件下萃取1.5 h,该条件下反萃取效率为85.05±2.9%,纯化倍数为4.76±0.092。整个反胶束萃取过程的萃取效率(脂肪酶酶活力回收率)为76.8%,纯化倍数为4.76±0.092。经过丙酮沉淀和反胶束萃取两步提纯,整个过程的纯化倍数达到10.14。该纯化后的酶经过SDS-PAGE表征发现可以提纯至电泳纯,用 LC-MS/MS分析测定了该酶的氨基酸序列,在NCBI检索得出该酶属于脂肪酶家族。
  接着对纯化后的胞外Sn-2脂肪酶进行酶学性质研究。研究发现胞外Sn-2脂肪酶的最适温度为35℃,在低于25℃以下具有较好的稳定性,但对高温敏感;最适pH为6.5,在pH6.5-7的条件下该脂肪酶具有极强的稳定性,处理12小时后酶活力损失率仅为13.1%和14.7%,但在pH<5或pH>8的条件下保存12小时,酶活力损失率极高。Mg2+、Ca2+对脂肪酶活性具有较强的促进作用,而Zn2+、Mn2+、Al3+具有一定的抑制作用,Fe2+、Cu2+、Ni2+有极强的抑制作用。底物特异性研究发现:玉米油、芝麻油、大豆油对脂肪酶酶活力具有极大的促进作用,菜籽油和橄榄油效果相差不大,花生油略好于橄榄油,这可能是因为玉米油、芝麻油、大豆油含有的亚油酸量较多。酶动力学研究发现:该脂肪酶的Vmax和Km,分别为37.17 mM/min和9.28 mM。
  最后对海藻酸钠固定胞外 Sn-2脂肪酶的最佳条件进行研究。通过单因素分析及正交试验设计,固定化的最佳条件为:海藻酸钠浓度为3%、海藻酸钠与酶液的体积比为2:1、固定化时间为60 min,该条件下固定化效率为63.67±1.71%。对固定化酶进行重复6次橄榄油水解反应,发现固定化脂肪酶重复4次稳定性较好,仍能保持89.17±0.61%的酶活性,但是重复6次仅能保留73.91±1.58%的酶活性,这可能是由于固定化材料不太适合以及重复实验操作导致的酶损失等原因造成的。
[硕士论文] 柯蒙蒙
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:酯酶(Esterase,EC3.1.1.X)是水解酶的一种,能够催化酯键断裂生成醇类和酸类产物,也可以催化酯键的形成。酯酶由于能够催化酯水解反应和转酯反应,广泛应用于工业、农业、洗涤业以及制药业等领域。冷活性酶具有在低温下催化效率高,可以节约能源和特殊化合物的合成。因此,本研究针对酯酶EstA进行了研究,主要结果如下:
  从肠肝菌Enterobacter sp.中克隆到一个新的酯酶基因estA,大小为717bp,编码238个氨基酸,分子量为25 kDa。序列比对结果发现EstA没有被报道过。另外,序列分析表明EstA序列具有水解酶典型的结构催化三联体Ser-Asp-His及包含Ser的保守结构Gly-Ala-Ser-Met-Gly。
  酯酶EstA在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达和纯化后,对酶学性质进行了分析,结果表明:在不同侧链长度的对硝基苯酯类底物中,酯酶EstA对对-硝基基苯乙酸酯活性最高,活性随着底物侧链长度增加而降低,对对硝基苯基棕榈酸酯(p-Nitrophenyl palmitate)的活性最低。最适反应温度是40℃,最适反应pH值为9.0。以对硝基苯乙酸酯为底物,测得EstA的动力学常数Km为393.75μmol/L,Kcat为905.6 min-1,Kcat/Km为2.30×103 min-1·μM-1。在0℃到20℃范围之间,EstA仍保持70%以上的活性,说明酯酶EstA具有较好的冷活性。在3M NaCl存在下,EstA保留60%左右的活性,而且经过4M NaCl溶液4℃处理24 h,EstA仍保留100%活性,说明酯酶具有一定程度的耐盐性。乙二醇、30%的异丙醇和30%的丙酮对EstA有明显的抑制作用,10%、20%的异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇和二甲基亚砜对EstA活性影响较小,说明EstA具有有机溶剂耐受性。EstA在0.5%和1% Triton-100、tween-20、tween-80 CTAB及10%的Triton-100、tween-20去污剂中保留60%以上的活性。
  EstA热稳定性差,45℃处理120 min或50℃处理30 min,酶活几乎丧失。为了提高EstA的热稳定性,通过随机突变得到一个热稳定性提高的突变体A92P,45℃处理120 min,仍保留95%的活性,是野生型的19倍;A92P在50℃处理30 min,保留55%的活性,是野生型EstA的2倍;为了进一步探讨92位氨基酸对热稳定性的影响,对92位位点进行饱和突变,结果表明:突变体A92D热稳定性显著提高,45℃处理120 min对其活性几乎没有影响,50℃处理30 min,仍保留85%左右的活性,是野生型的3.4倍。为了探究92位突变位点对酶热稳定的影响机理,对EstA及突变体进行同源模拟及92位点附近空间结构进行了分析,结果显示:突变体A92D的92位疏水性氨基酸(Ala)被亲水性氨基酸(Asp)取代后,其与溶液之间及周围亲疏水结构之间形成了更有利于蛋白稳定的结构;而突变体A92P热稳定提高可能是由于脯氨酸Pro具有限制蛋白二级结构的旋转,增加蛋白的刚性,从而推测可能是提高热稳定性的主要原因。这些结果为进一步研究冷活性酶结构和功能关系及热稳定性研究提供了重要信息。
[硕士论文] 韩英坤
微生物学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:谷氨酰胺合成酶(GS)广泛存在于动物、植物和微生物体内,能够利用ATP提供的能量催化合成谷氨酰胺,与生物的氮代谢密切相关。此外,研究中发现部分GS也能催化乙胺和谷氨酸生成茶氨酸。谷氨酰胺有很好的营养价值和药用价值,茶氨酸是很好的保健品,这两种化合物均有巨大的市场,所以GS有很好的工业应用潜力。因此,研究针对本室筛选的拥有GS活性的巨大芽孢杆菌N6展开了工作,取得了以下结果:
  根据巨大芽孢杆菌相关基因组信息设计引物,经PCR扩增得到目的基因BGS。测序得知BGS有1335bp,共有氨基酸444个,分子量约为50.4kDa。经比对与枯草芽孢杆菌的GS的相似性最高(88%)。纯化产物酶学性质检测表明,最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.0。该酶在55℃的条件下保温2.5h后,BGS仍有高达90%的活性,在65℃条件下保温1h后,仍有50%的活性。通过薄层层析和HPLC验证该酶具有合成茶氨酸的活性。
  为了改良BGS的酶学性质,利用随机突变和定点突变技术对该基因进行体外定向进化。通过易错PCR构建了随机突变文库,从8000个转化子中筛选获得了2个突变株:F1-D10(D198G)、F1-F10(I28T、L159I)。经测定,F1-D10对ADP的催化效率提高了33%,对谷氨酰胺的催化效率下降了20%,对盐酸羟胺的催化效率提高了79%;F1-F10对ADP的催化效率提高了65.7倍,对谷氨酰胺的催化效率提高了56%,对盐酸羟胺的催化效率提高了67%。对F1-F10进行回复突变,构建了I28T和L159I,其中L159I对ADP、谷氨酰胺、盐酸羟胺的催化效率分别提高了93.7倍,2.5倍和3.2倍。通过多序列比对和同源建模方法选取了7个距离活性中心比较近的位点进行了定点突变。结果表明,E65A与野生型相比对ADP、谷氨酰胺、盐酸羟胺的催化效率分别提高了154.7倍、1.4倍和2倍。为了探讨不同突变位点是否存在叠合效果,构建了E65A/D198G,结果并未产生叠加效应。对E65A,L159I酶学性质研究表明,与野生型相比E65A的最适温度由30℃变为50℃,L159I的最适温度变为55℃。同时,L159I的热稳定性得到了显著提升,在65℃水浴2.5h后还有90%的活性,而野生型在相同的条件下仅剩15%。在合成茶氨酸方面,L159I较野生型产量提高了35%。结构模拟的结果显示,L159I的159位的Leu变为Ile,使得两个单体之间的空间位阻变小,附近氢键结合更紧密。65位的Glu变为Ala不仅使催化位点更容易暴露而且使活性空腔开口变大,反应底物更易进入。总之,本研究为BGS的结构与功能研究及进一步研发奠定了基础。
[硕士论文] 王文宸
生物工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:超氧化物歧化酶(SOD)可以交替催化超氧化物自由基(O2-),使其发生歧化反应变为普通分子氧(O2)和过氧化氢(H2O2),这使得超氧化物歧化酶具有关键的抗氧化作用,在人类的生产生活中是不可或缺的;过氧化氢酶(CAT)可以催化过氧化氢(H2O2),使其变为水(H2O)和氧(O2),从而使超氧化物歧化酶催化反应所产生的过氧化氢变为完全无害的物质,且可以促进超氧化物歧化酶的催化反应。固定化酶使得酶的稳定性提高,且便于回收、再利用,对于环境也有保护作用,具有很强的现实意义。
  本论文首先对SOD-ELP和CAT-ELP在适宜的条件下进行表达纯化,之后,通过酸催化热缩聚、水浴、碱性条件下水解的方法制得可溶性的聚合物载体接枝十六烷基链的聚天冬氨酸(PASP-C16)。然后,使用NHS-EDC化学交联法将SOD-ELP和CAT-ELP固定到PASP-C16上。得出:交联单酶和交联双酶都具有活性,且与游离酶相比,活性损失不大;另外,通过比较交联单酶和交联双酶的活性,得出了CAT可以促进SOD的催化反应,两种酶具有协同作用。证明了交联双酶可以更有效地提升反应速率,具有更广阔的市场前景。
  此外,本论文运用了扫描电子显微镜、红外光谱、荧光光谱、激光扫描共聚焦显微镜、圆二色光谱等一些仪器对载体、游离酶及固定酶进行了表征分析。扫描电子显微镜、红外光谱和激光扫描共聚焦显微镜的实验结果证明了单酶SOD和双酶SOD-CAT确实通过交联的方法固定在了载体PASP-C16上。荧光光谱通过使用荧光猝灭剂丙烯酰胺对固定前和固定后的酶进行猝灭反应,得出的结论为固定化使酶的稳定性得到了提高,使酶不易因环境的改变而改变蛋白结构。圆二色光谱(CD)通过对固定前和固定后的酶的二级结构进行分析,得出的结论为固定化并没有使酶的二级结构发生太大的改变,α-螺旋的含量略微有些下降,无规则卷曲变多,可初步的确保酶活性没有丧失。
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