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[硕士论文] 李玉凤
生态学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:Ca2+是真核细胞重要的细胞内信使。细胞内Ca2+浓度的变化是许多生理进程所必需的。钙库操纵的钙通道(SOCs)是钙离子流入细胞内的主要的方式,其中最著名最具特色的是钙离子释放激活钙离子(CRAC)通道。CRAC通道调节许多基本的细胞功能,包括基因表达、细胞增殖、细胞分泌等。在近十几年里,作为CRAC通道的Orai蛋白和作为内质网钙离子感受器的STIM蛋白的发现是理解CRAC通道的机制和功能取得极大进步的基础。当内质网钙库释放后,STIM蛋白发生一系列的构象变化与Orai蛋白相互作用,从而开放CRAC通道,允许细胞外的钙离子流入细胞内。但CRAC通道门控的分子机制仍然知之甚少。
  为了进一步揭示CRAC通道门控的分子机制,我们表达并分离纯化了果蝇源的Orai蛋白和STIM蛋白不同片段。在过程中对STIM蛋白不同片段的分离纯化条件进行了优化,对STIM蛋白不同片段进行了功能测试,并最终获得了较稳定并具有功能的STIM蛋白片段,同时对纯化的Orai蛋白和STIM蛋白片段进行了等温滴定测定其相互作用。我们发现Orai蛋白与STIM蛋白片段亲和力较强,这为后续通过单分子荧光能量转移技术和蛋白技术共结晶进一步的研究两蛋白的相互作用的构象变化奠定了基础。
[硕士论文] 刘建
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:对豹猫6种组织进行原代培养建系,最后选择3种组织来源细胞即剑状软骨源细胞、心脏源细胞和肺源细胞。以该3种细胞为实验材料研究豹猫细胞的生物学特性。
  在本研究中,主要进行了如下实验:细胞的原代建系及传代培养的形态观察、细胞贴壁率计算、冻存复苏率对比、3种细胞生长曲线的对比、支原体污染检测、核型分析等。
  在形态学观察方面,3种来源细胞各有显著特征但均属于成纤维样细胞。贴壁率能力分析显示,心脏源细胞最弱;肺源细胞代次P9之前易贴壁,P9之后细胞贴壁增殖及传代比较困难;剑状软骨源细胞最易贴壁。将三种细胞冻存前后存活率进行实验对比发现:解冻后相比于冻存前均有所下降,随着细胞代次的增高,细胞的存活率也有所下降。生长曲线对比发现,曲线均呈“S”型曲线,曲线显示剑状软骨源细胞增殖的最快,肺源细胞次之,心脏源细胞最慢。支原体污染检测细胞污染情况为阴性。在豹猫细胞核型分析研究中发现,染色体数目为2n=38,18对为常染色体,形态类型为7M+11SM;1对为性染色体,其形态类型X为ST。本研究为日后利用豹猫细胞、保存遗传信息及深入研究其生物学特性提供了一个好的依据和实验材料。
[硕士论文] 臧欢
农业电气化与自动化 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:畜牧养殖业迅猛发展,禽流感、口蹄疫等动物传染病随之暴发流行,兽用疫苗的市场需求量大幅度增加,采用传统转瓶培养方式生产疫苗已远远不能满足现代畜牧养殖业的发展。动物细胞悬浮培养技术逐步代替传统转瓶培养方式,并成为当前工业生产生物疫苗的主流技术,所以,如何应用动物细胞悬浮培养技术实现疫苗的快速高效生产成为当前以及未来生物制药领域的焦点和竞争核心。
  动物细胞悬浮培养过程具有高度的非线性、时变性等特性,过程中由于受到传统物理仪表测量方法的限制(易染菌、成本高等),一些关键状态变量(如葡萄糖浓度、乳酸浓度、细胞密度等)的实时监测严重制约了产物合成从而影响了生物制品的产量和质量。而离线测量又具有一定的滞后性,严重影响了整个过程的优化控制。软测量技术的出现为解决上述问题提供了一种有效途径。
  本文针对BHK-21(乳仓鼠肾细胞)悬浮培养过程关键状态变量难以实时测量的问题,提出一种基于直角三角形角度值动态加权的软测量建模方法。首先结合培养过程工艺机理,确定模型的主导变量,然后基于现场采集数据,应用相关系数法确定模型的辅助变量,最后建立软测量模型。在深入了解支持向量机、最小二乘支持向量机和关联向量机的基础上,将其与基于直角三角形角度值动态加权的关联向量机建模方法进行对比。结果表明,相比支持向量机与最小二乘支持向量机,关联向量机的解具有较好的稀疏性和更高的鲁棒性,且模型预测精度较高;动态关联向量机不仅具有关联向量机的优点,而且能将工业过程的动态特性引进模型中,使得预测效果更加精确、更能体现工业过程的本质。
  为了实现BHK-21细胞悬浮培养过程实时监测及优化控制,充分利用MATLAB强大的计算能力和WinCC强大的脚本编程能力,建立基于MATLAB和WinCC混合编程平台的BHK-21悬浮培养过程关键状态变量的在线预测及实时监控系统,为培养过程的优化控制奠定了基础。实验结果表明,所建监控系统能够实时准确的进行关键状态变量的显示,为进一步的优化控制提供了充分的工况信息,降低了系统故障概率,从而实现经济高效的工业生产。
[硕士论文] 杜盼
药学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:自2006年 Yamanaka首次利用“四因子”组合(pSOX2、pOCT4、pC-MYC、pKLF4)成功诱导生成iPSCs后,细胞重编程技术始终是研究热点之一。由于iPSCs来源于患者自身体细胞,并具有自我更新和多向分化能力,因此,将 iPSCs作为一种替代胚胎干细胞(ESCs)的细胞应用于临床中,能够有效避免很多伦理及法律问题,且 iPSCs源于患者,能够实现个体化治疗。
  原位肝移植是目前唯一能有效治疗肝癌的方法。然而,由于器官短缺,近年来因为肝癌死亡的人数不断增加;此外,世界范围内的肝癌发病率也在不断上升。肝细胞移植的临床试验带来振奋人心的成果。但作为替代肝脏移植的肝细胞移植仍然需要解决肝细胞来源的问题。目前,很多研究都致力于寻找一种能够产生稳定的功能性肝细胞的可行性方法。其中,可能会成为肝细胞不竭来源的细胞就是人源诱导多能干细胞(hiPSCs)。hiPSCs具有自我更新和多向分化能力,与人源胚胎干细胞(hESCs)相比,hiPSCs涉及到的伦理问题较少,且完全不受来源限制。因此,hiPSCs来源肝细胞(hiPSC-HEPs)在药物筛选、细胞治疗以及体外疾病模型等方面具有重要的意义。本研究课题是以磷酸钙纳米粒作为基因载体,通过携带两种不同因子组合将人脐带间充质干细胞(hUMSCs)重编程为hiPSCs,继而进行肝细胞定向诱导分化,并筛选优化出最佳诱导分化培养基,采用最佳诱导方案对其进行培养,使其分化为肝细胞,为肝细胞移植提供理论基础,从而更好地解决肝细胞短缺问题。
  第一章重编程法制备人源肝脏细胞及其应用研究进展
  通过查阅大量资料,对人源肝细胞重编程方法进行了综述,总结并分析人源肝细胞重编程的影响因素;阐述了人源肝细胞重编程技术的研究现状及其在再生医学、药物筛选及体外疾病模型等方面的应用,并指出人源肝细胞应用于临床实践的局限性。为本论文实验工作的顺利开展和进行提供了理论依据。
  第二章非病毒纳米基因传递系统的 hiPSCs重编程研究
  采用磷酸钙纳米粒作为基因载体,对比两种不同的因子组合,即 pSOCK(pSOX2、pOCT4、pC-MYC、pKLF4)与 pOS+miR(pOCT4、pSOX2、miR302b-367),制备得到磷酸钙纳米粒 C-pSOCK与 C-pOS+miR,通过琼脂糖凝胶电泳、透射电镜观察、毒性评价、粒径以及 Zeta电位测定等一系列检测进行表征;以人脐带间充质干细胞(hUMSCs)为源细胞,进行重编程研究。结果显示:两种因子组合所制备得到的纳米粒均呈现形态规整、分散均匀、表面带正电荷的球形或者椭球型;细胞毒性实验表明两种不同因子组合制备得到的磷酸钙纳米粒无毒或低毒;通过碱性磷酸酶染色,统计阳性克隆数,从而考察两种纳米粒的重编程效率;免疫荧光、Western blot均说明纳米粒 C-pOS+miR诱导生成的 hiPSCs能够表达多能性标记蛋白,且能进行体内分化(内、中、外)。
  第三章 hiPSCs的肝细胞定向诱导分化研究
  设置4种不同肝细胞诱导分化培养基(MediumⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),对重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化,采用酶联免疫检测法(ELISA)分别在诱导分化第0,3,7,11,15,19,23,27,32天检测 AFP和 ALB表达情况,从而筛选出最佳诱导方案;光学显微镜下观察细胞形态变化;用免疫荧光法、Western blot检测肝脏特征性蛋白(AFP、ALB、CK8、CK18、SOX17)的表达。结果显示:诱导培养基 MediumⅡ、诱导方案“三步法”的肝细胞诱导效果较好;显微镜下观察细胞形态发生明显变化,从“克隆团”形态逐渐变化为“铺路石”样形态,诱导分化结束后,细胞形态基本一致,为多角多边形或者类圆形,且细胞核较明显,部分细胞表现出典型肝细胞形态:出现双核甚至多核现象,且诱导分化的肝细胞能够表达肝脏肝脏特征性蛋白(AFP、ALB、CK8、CK18、SOX17)。
  第四章二维培养体系中肝细胞药物代谢酶表达及细胞活性研究
  在二维培养体系下,选择Ⅰ相代谢酶细胞色素 P450(CYP450)、Ⅱ相代谢酶葡萄糖醛酸转移酶(UGT)与谷胱甘肽硫转移酶(GST),用 Western blot测定诱导后细胞蛋白表达,以人胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)为阳性对照;考察在诱导分化不同时间药物代谢酶的动态变化,同时比较 hiPSCs诱导形成的肝细胞与胚胎干细胞来源肝细胞(hESCs-HEPs)药物代谢酶的表达差异;不同时间取样,检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)的质量浓度;检测白蛋白分泌、尿素合成及葡萄糖消耗含量,分别采用溴甲酚绿法、二乙酰-肟法及葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法。结果显示:hiPSCs诱导形成的肝细胞(hiPSCs-HEPs)能够较好表达 CYP450、UGT与 GST,且与hESCs-HEPs表达无明显差异;而诱导前 hiPSCs很少表达甚至不表达CYP450、UGT与 GST;hiPSCs的肝细胞诱导分化过程中ALT、AST、LDH变化趋势与 hESCs基本一致;hiPSCs-HEPs与 hESCs-HEPs测定的白蛋白分泌水平、尿素合成浓度以及葡萄糖消耗量基本一致。
  第五章三维培养体系中hiPSCs定向肝细胞诱导分化
  在三维培养体系下,对重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化。以Ⅰ型胶原和壳聚糖作为支架材料,采用冷冻干燥-热固化法制备胶原/壳聚糖三维支架,考察不同质量比与不同固化时间对支架性能的影响,优化三维支架制备工艺,通过形态观察、吸水率与保水率测定等对制备得到的支架进行表征;将纳米粒 C-pOS+miR与空白胶原/壳聚糖支架相结合,得到三维载基因纳米粒-胶原/壳聚糖支架;人脐带间充质干细胞(hUMSCs)在三维载基因纳米粒-胶原/壳聚糖支架中进行重编程后,形成边界清晰、形态规整的克隆团;对三维支架上重编程生成的 hiPSCs进行肝细胞定向诱导分化,用 ELISA法对比二维与三维培养体系中肝细胞功能;分别用溴甲酚绿法、二乙酰-肟显色法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法比较二维与三维培养体系中肝细胞代谢活性。结果显示:在三维培养体系诱导21天后,细胞形态呈现明显的肝细胞样细胞形态;在三维培养体系下,诱导形成的肝细胞功能没有“损伤”,仍处于正常肝功能状态。
[硕士论文] 李猛
内科学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:引言:研究表明自怀孕第6周至妊娠结束,胎盘中均含有HSC(HSC),且具有细胞数量大,获取便捷,使用过程中不存在伦理问题等优点。目前针对脐血(UCB)来源造血干/祖细胞(HSPC)的体外扩增临床研究已经取得成功,采用扩增后UCB来源HSPC进行移植可以有效解决HSC数量不足造成的造血恢复延迟等问题,数据表明移植后干细胞较未扩增UCB来源HSPC具有相同植入率。胎盘来源HSC与UCB来源HSC同属于围产期干细胞,研究表明其较UCB来源HSC更为原始,目前国内外尚无针对胎盘来源HSC体外扩增的文献报道。
  目的:本研究旨在通过比较机械处理联合化学酶消化法及AMD3100循环灌注法提取人胎盘来源HSC的效果,构建适用于未来临床应用的胎盘来源HSC分离提取方法,得到来源清楚组份确定的HSC;基于模拟造血微环境的体外扩增理论,探讨UCB中CD34+细胞在间充质干细胞(MSC)共培养体系、UM171联合细胞因子扩增体系以及 UM171联合细胞因子与MSC共培养体系三种不同扩增体系下体外扩增效果;依据优化的胎盘来源HSC提取方法,对胎盘来源 HSC进行分离提取,并基于模拟造血微环境理论构建的扩增体系对提取得到的CD34+细胞行体外扩增,评价扩增效果及扩增后HSPC功能,为拓展临床HSC来源做出尝试。
  方法:
  1、健康足月顺产胎盘依照处理方法不同分为两组进行胎盘来源 HSPC体外提取:A组(机械处理联合化学酶消化组)、B组(AMD3100循环灌注组),每组处理胎盘5个。A组将胎盘经预处理后解剖成小组织块,采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后收集清洗液(命名为A1),采用胶原酶、透明质酸酶、DNA酶对清洗后的胎盘组织块进行消化,并置于100目及200目滤网研磨,收集消化液(命名为A2)。B组采用智能蠕动泵连接脐动静脉,采用生理盐水(NS)NS及含AMD3100的NS分步对胎盘脉管系统行循环灌注,分别收集两次灌洗液(命名为B1及B2)。比较两种方法收集得到各类细胞总数,并分别测定两种方法不同阶段收集得到细胞数量及其流式表型情况。
  2、采集到的UCB进行磁珠分选后得到纯净的CD34+细胞,脐带剪至小块后采用含有0.2%Ⅱ型胶原酶的 DMEM/F12培养基进行消化后,进行贴壁传代培养。UCB来源 CD34+细胞及脐带来源 MSC分为以下四组进行体外扩增培养10天:A组(对照组)、B组(UM171培养组)、C组(MSC共培养组)、D组(UM171联合MSC共培养组)。四组细胞均采用 StemSpan培养基,并添加100 ng/ml干细胞因子(SCF),100 ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3),50 ng/ml促血小板生成素(TPO),CD34+按照1×105/孔密度接种于六孔板中,其中 B组在培养基中额外添加100 ng/ml UM171,C组采用分离得到的第三代脐血同源脐带MSC作为基质细胞,待贴壁90%融合采用60Co照射,剂量为10Gy,D组在C组实验条件基础上同时添加100 ng/ml UM171,细胞培养10天后比较不同组别间细胞扩增倍数及流式表型和集落培养情况。
  3、分别将AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液经免疫磁珠纯化,采用UM171联合MSC共培养方法分别对纯化后的胎盘来源CD34+细胞进行体外扩增培养,验证其扩增效果及流式表型和集落培养情况。
  结果:
  1、A组与 B组收集得到的 TNC分别为(45.19±9.41)×107和(42.69±11.19)×107,二者无统计学差异;收集得到的 CD34+细胞数(12.98±3.62)×107和(1.87±0.87)×107,二者比较,p=0.00,具有显著统计学差异;收集得到的CD133+细胞数分别为(1.16±0.61)×107和(1.15±0.63)×107,二者无统计学差异;A组收获的细胞液 A1中含有 TNC为(6.76±2.13)×107,其中CD34+CD38-比例为(1.14±0.56)%。收获的细胞液 A2中含有 TNC为(38.44±7.33)×107,其中 CD34+CD38-比例为(30.31±10.75)%;B组收获的细胞液 B1中含有 TNC为(15.11±6.03)×107,其中 CD34+CD38-比例为(0.72±0.34)%。收获的细胞液 B2中含有 TNC为(27.58±11.14)×107,其中CD34+CD38-比例为(5.56±1.78)%。
  2、分离得到的脐带MSC传代培养后细胞状态良好,流式检测发现其高表达 CD105, CD73, CD90,不表达 CD14, CD34,CD19,CD45, HLA-DR,SSEA-4含量约在1%,经过诱导培养后可以分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。CD34+细胞在不同条件下体外培养10天后发现,对照组细胞总数扩增3.7倍,CD34+细胞扩增3.5倍,组别间无明显差异。UM171培养组总有核细胞数扩增14倍,CD34+细胞扩增13.5倍;MSCs共培养组总有核细胞数扩增11倍,CD34+细胞扩增10倍;联合培养组总有核细胞数扩增达22倍,CD34+细胞扩增21倍。UM171联合 MSCs组得到CD34+CD38-细胞比例为91.49±2.67%,较MSCs及UM171组(分别为(78.11±2.34)%,(87.66±1.48)%)均在显著差异,含UM171培养体系CD133细胞比例较单独MSCs培养组存在差异,扩增后细胞集落培养14天后,各系集落形成良好, UM171扩增组细胞较MSCs扩增组在红系及粒系形成能力方面存在优势。
  3、胎盘NS灌洗液中CD34+细胞经10d培养后细胞总数扩增17倍, CD34+细胞扩增14倍;胎盘AMD3100灌洗液中CD34+细胞经10天培养后几乎全部死亡。脐血对照组与胎盘NS灌洗组扩增后细胞在TNC、CD34+细胞总数、CD133+细胞总数均存在统计学差异,其中胎盘 NS灌洗组CD34+CD38-比例为(82.70±6.89)%;扩增后脐血来源及胎盘 NS灌洗液中CD34+各谱系集落形成能力良好,胎盘NS灌洗液中CD34+细胞在粒系形成能力方面较未扩增脐血CD34+细胞存在差异。
  结论:
  1、机械处理联合化学酶消化法以及AMD3100循环灌注法均可以对胎盘来源CD34+细胞进行有效收集,其中AMD3100循环灌注法在保证细胞收集数量的同时可以有效降低细菌污染风险,并可降低母体组织对胎盘来源HSC的影响,收集得到的CD34+细胞经免疫磁珠分选后纯度较高,较机械处理联合化学酶消化法在收集胎盘来源HSC上具有更大的优势。
  2、脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可提高CD34+细胞体外扩增效果,UM171在扩增过程中可较好的保持细胞干性,二者联合应用扩增效果最佳,建立的脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34+细胞的扩增方法可用于CD34+细胞体外扩增培养。
  3、经AMD3100循环灌注法收集的NS灌洗液及AMD3100灌洗液中CD34+细胞在脐带MSC联合细胞因子及UM171培养体系中扩增效果存在明显差异,其中NS灌洗液中CD34+细胞扩增效果可达17倍,其中较为原始的CD34+CD38—细胞比例达82%,扩增后细胞集落培养实验表明其具有与脐血来源扩增后 CD34+细胞同样的谱系重建能力。AMD3100灌洗液中CD34+细胞在该体系中不能进行有效扩增,其细胞来源及功能尚需进一步研究。
[硕士论文] 蔚梦怡
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:随着小鼠胚胎干细胞诱导的研究越来越受到关注,各实验室利用不同培养基建立了不同多能性状态的干细胞系,包括由本实验室利用四种细胞因子ABCL(ActivinA、BMP4、CHIR99021和mLif)诱导类胚层干细胞系(AFSCs)获得的新型胚胎干细胞系ASCs(Advanced Stem Cells)。在本文中,我们利用分别缺少ABCL中单个细胞因子的培养基[A(-)组、B(-)组、C(-)组及L(-)组]培养GOF-GFP标记的AFSCs,同时以添加ABCL培养基为对照组,研究ABCL四种细胞因子在诱导和维持ASCs多能性中的作用。
  本研究主要内容包括:⑴ABCL组的GOF-GFP阳性克隆出现的最早,数量也最多,并能稳定传代,即新型胚胎干细胞系ASCs。⑵除A(-)组没有出现GOF-GFP阳性克隆以外,其余三组均有GOF-GFP阳性克隆出现:B(-)组在培养后第5天、L(-)组在第6天、C(-)组在第10天依次出现GOF-GFP阳性克隆。但是否可获得稳定的干细胞系还有待进一步研究。⑶实时荧光定量PCR(RT-qPCR)结果表明,ABCL组细胞的多能性基因表达水平随着培养天数的增加明显高于其它四个单个细胞因子缺少组,如Nanog的表达。结果还显示,ActivinA的主要作用为促进多能性基因的表达,并抑制AFSCs向表皮方向的分化;BMP4的作用为抑制神经相关基因,同时促进部分多能性基因表达;mLif的作用主要为抑制原始内胚层(PrE)相关基因的表达,并促进多能性基因表达;而CHIR的作用并不明显,可能与表观遗传调控和生殖特化等基因的表达相关。⑷核型分析结果显示,ASCs在不同培养液ABCL、AF和FH的培养和诱导过程中,均未见明显异常。
[硕士论文] 史文姝
动物遗传育种与繁殖 延边大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精过程中,多精入卵被视为最普遍的异常受精,而近年来的许多研究表明,透明带(ZP)的泛素化异常是造成多精入卵的主要原因之一。泛素羧基末端水解酶-1(UCHL1)是一种主要的去泛素化酶,研究显示UCHL1与透明带蛋白的泛素化水平相关。本试验的丰要目的是探究抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟、透明带泛素化及多精入卵的影响。试验主要分三部分进行:(1)UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用DAPI染色观察极体排放情况,从而验证抑制UCHL1对猪卵母细胞体外成熟率的影响;(2) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用SDS-PAGE和Western blot等方法检测猪卵母细胞透明带泛素化水平的影响;(3) UCHL1抑制剂处理GV期卵母细胞后,用Hoechst染色观察精卵粘附及多精入卵情况。试验得到以下结果:
  1.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,对照组成熟率为66.22%,而30μM组的成熟率为5.30%,且各处理组成熟率差异性显著(P<0.05),结果表明抑制UCHL1对猪卵母细胞的体外成熟有影响。
  2.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,经Western blot检测结果显示各处理组的ZP在约65kDa,85kDa,120kDa处均发生不同程度的泛素标记,通过灰度值分析差异显著(P<0.05),结果表明随UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。
  3.在成熟培养液中添加不同浓度UCHL1抑制剂(10μM,20μM,25μM,30μM,DMSO及对照组)体外培养猪卵母细胞46 h后,进行体外受精,经Hoechst染色显示对照组ZP精子粘附数最多,精子入卵数最少;随着UCHL1抑制剂浓度逐渐增大,ZP精子粘附数逐渐减少,精子入卵数逐渐增多;添加30μM UCHL1抑制剂组的ZP精子粘附数少,没有精子入卵。结果表明UCHL1调节ZP精子粘附及多精入卵。
  结果显示,UCHL1抑制剂对猪卵母细胞的体外成熟有影响。随着UCHL1抑制剂浓度的增加,ZP发生泛素化的程度逐渐降低。UCHL1调节ZP精子粘附以及多精入卵。
[硕士论文] 游兴
整形外科 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  通过对SD大鼠默克尔细胞(merkel cell,MCs)的提取、分离、培养及鉴定,观察局部注射MCs联合美宝湿润烧伤膏(MEBO)外用对大鼠足底创面神经再生的影响。
  方法:
  1)取新生SD大鼠(1~3d)足垫、须垫及背部皮肤,采用酶消化法分离提取MCs,接种于多聚赖氨酸(PLL)包被的培养瓶内,通过细胞免疫组织化学法测定细胞角蛋白CK20的表达,qPCR检测MCs中Piezo2 mRNA的表达,ELISA法检测培养第2d、4d、6d、8d、10d细胞分泌CGRP情况。
  2)建立SD大鼠足底创面模型,按照干预方式的不同分为如下五组:A组(MCs注射+MEBO组);B组(MCs局部注射组);C组(MEBO外用组);D组(阴性对照组);E组(鼠神经生长因子注射阳性对照组)。细胞组用MCs1×106个/mL分别注射于创面基底中央及创缘3、6、9、12点标记处,24小时后追加1次,每次每个部位25μL;MEBO组按相应分组给予MEBO外用,每日换药一次,直至创面愈合。阳性及空白对照组分别予等体积鼠神经生长因子及PBS注射。观察创面愈合时间,计算各组创面各时间点愈合率,棉拭子检测足底感觉恢复情况,分别于干预后7d、14d、21d三个时相各组分别随机抽取6只大鼠,切取组织,制作石蜡切片,免疫荧光染色观察新生皮肤神经纤维生长情况。
  3)每组大鼠均于造模后第7d、14d、21d时用棉拭子检测大鼠足底缩足反射,记录、统计缩足次数并计算百分比。
  结果:
  1)采用中性蛋白酶和胰酶依次消化SD大鼠足底及须垫部位所取皮肤组织可得到较多MCs,以CK20做细胞免疫化学染色可见MCs呈阳性反应。
  2)实验中应用中性蛋白酶及胰酶双酶消化法可得到MCs,以Ham,s F-12培养基为基础培养基,加入20ng/ml bFGF可使MCs稳定增殖;qPCR结果示MCs中Piezo2 mRNA的表达量为:0.0270±0.0042;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测检测MCs上清液中降钙素基因相关肽(CGRP)在培养第2、4、6、8、10天浓度随培养时间的延长逐渐增加,培养第6d到8d时增加速率更快,间接提示默克尔细胞增殖情况。
  3)创面愈合方面,大体观察肿胀程度及炎性反应程度无明显区别,总愈合时间上应用MEBO的两组创面较其他实验组提前,A组~E组愈合时间分别为14.33±0.69天、16.44±0.86天、14.83±0.71天、17.44±0.98天、16.27±0.67天。在同时间点创面愈合率上,A组和C组优于其他对照组(P<0.05),到21d时各组创面均全部愈合。在缩足反射比较上,除E组外,A组较其他三组反射阈值更低、对刺激更敏感(P<0.05),提示默克尔细胞联合MEBO应用有促进大鼠足底创面神经再生的作用。
  4)创面新生皮肤免疫荧光染色显示示A组在神经纤维数量较多、排列有序,优于阴性对照或单一实验处理组,与阳性对照组(E组)相近。
  结论:
  1)中性蛋白酶及胰酶双酶消化法是获取大鼠MCs的有效方法,在加入bFGF的Ham,s F-12培养基的体系中培养的MCs大量增殖。
  2)MCs局部注射联合MEBO外用可缩短创面愈合时间、促进创面皮肤神经的再生。
[硕士论文] 赵一桐
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:透明带(zona pellucida,zP)是包裹在卵母细胞外的一层由糖蛋白组成的外被结构,在初级卵泡早期阶段由卵母细胞和颗粒细胞共同分泌形成。在受精过程和早期胚胎发育中起着重要作用。然而,透明带的厚化和硬化不利于胚胎的孵化。因此,我们尝试利用辅助孵化(assisted hatching,AH)技术提高囊胚的孵化率,从而提高胚胎的着床率以及子代的出生率。辅助孵化是通过人为的方法对透明带进行处理,使胚胎从透明带释放出的技术。目前,辅助孵化技术有许多种,我们组早期的实验发现,不同的辅助孵化技术对不同时期的胚胎进行操作会有不同的效果。Piezo介导的各种辅助孵化技术中,在桑椹胚期进行透明带打小孔处理后(打孔尺寸约为10μm),可获得最高的囊胚孵化率。而该种方法是否能够提高胚胎的着床率以及子代的出生率仍有待考究。本实验利用该种辅助孵化方法处理胚胎,再进行胚胎移植(embryo transfer,ET),统计其胚胎着床率、母鼠妊娠率、子代出生率以及子代生长曲线等数据,以探明piezo介导的辅助孵化对小鼠胚胎着床和发育的影响。
  本研究对以下三种不同来源的胚胎进行分析,包括:(1)自然交配组(mating组),用作非辅助孵化、非胚胎移植操作的对照组;(2)体内受精获得的胚胎,仅进行胚胎移植,而不进行辅助孵化处理,用于观察胚胎移植对妊娠效率及后代发育的影响(embryo transfer,ET组);(3)体内受精获得的胚胎,进行辅助孵化处理后,再进行胚胎移植,用于观察辅助孵化和胚胎移植对妊娠效率及后代发育的影响(small hole,SH组)。
  我们的研究结果表明,与Mating组相比,ET组中的胚胎移植操作会降低胚胎着床数,着床后的胚胎发育迟缓,孕天延迟,子代出生数降低,并影响子代生长曲线;但对胚移后妊娠率、活胎率、性别都没有影响。胚移后得到的子代小鼠再进行自然交配,其孕天以及生育能力没有受到影响。
  与ET组相比,SH组虽然能够提高胚胎的体外孵化效率,但着床后胚胎发育迟缓,并影响子代生长曲线。打孔之后的胚胎在胚移之后,母鼠存活率、着床数、着床率、妊娠率、孕天、子代小鼠出生数、出生率、活胎率、性别、孕天以及子代小鼠生育能力等都没有影响。
  SH组与Mating组相比较,会降低胚胎着床数,着床后的胚胎发育更加迟缓,孕天延迟,子代出生数降低,并影响子代生长曲线;但对胚移后妊娠率、活胎率、性别都没有影响。胚移后得到的子代小鼠再进行自然交配,其孕天以及生育能力没有受到影响。
  综上所述,piezo介导的透明带打小孔的辅助孵化方式并不能够提高胚胎的着床率、母鼠的妊娠率和子代的出生率。相反,经过辅助孵化和胚胎移植操作后,会导致胚胎发育紊乱,对着床后胚胎的发育和子代生长曲线都有影响,但并不影响子代小鼠的性别和生殖能力。因此,我们认为,依赖于打孔方式的辅助孵化技术,在临床上应该被谨慎使用。
[硕士论文] 刘大军
电路与系统 宁波大学 2017(学位年度)
摘要:温度控制作为是影响细胞培养的一个关键因素,直接关系着细胞培养能不能达到最佳的培养效果。因此,一个温度控制精度高并且温度均匀性好的细胞培养箱将具有广泛的商业应用价值。当前,在细胞培养箱温度控制中,传统PID控制器仍然应用最广泛,其参数整定比较复杂,需要大量的在线参数调试,若被控对象的数学模型不能精确建立,根据传统PID的理论基础和控制特性去设计控制系统,所得控制参数无法保证温度控制系统的控制精度、温度均匀性以及鲁棒性等。
  针对细胞培养箱温度控制具有一阶惯性、非线性、纯滞后性、易受外部因素影响且其数学模型难以精确建立等特性,本文设计一种基于模糊PID参数自整定的细胞培养箱温度控制系统,实现了对PID参数的实时在线调整,并针对温控系统的软硬件开发和模糊PID控制算法设计进行了详细的分析。硬件方面,基于F28M35处理芯片为核心设计了完整的温度控制系统,包括温度测控、系统电源、通信电路以及人机交互等。软件系统采用了面向对象模块化设计,因此具有良好的通用性,共享性以及抗干扰性强等优点。该模糊PID参数自整定控制算法不用建立被控对象的数学模型,具有良好的动态响应以及适应性强,温度稳态精度高。
  实验表明,该模糊PID参数自整定温度控制算法,温度从26℃上升到目标温度37℃,建立稳态的时间为2890s,温度超调控制范围限制在0.05℃以内,系统温度控制精度为±0.1℃,温度均匀性在±0.3℃以内,并在相同型号的细胞培养箱上同样得到验证。在控制稳定性方面获得了比传统PID控制更好的控温效果,稳定快,极小超调,温度控制精度高,能满足细胞培养箱温度控制的要求。
[博士论文] 高笠雄
临床医学(眼科学) 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:背景:视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一类以感光细胞凋亡为特征的遗传性致盲性眼病,目前尚无治愈方法,通过移植干细胞来源的感光细胞或视网膜色素上皮细胞成为RP治疗最有希望的新方法之一。视网膜是免疫豁免器官,加之玻璃体视网膜手术进行细胞移植是成熟技术,细胞移植后的视网膜功能和植入细胞的情况可以通过无创方法进行检测,使得眼睛成为细胞移植研究的理想器官。受制于伦理等因素,目前涉及从直接从人体组织获得干细胞进行临床研究的进展较缓慢。
  人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有向内中外三胚层分化的潜能,是一类理想的种子细胞。体外三维诱导hESCs形成类器官的方法较好地解决了种子细胞来源问题,同时,由于三维诱导hESCs形成类器官的过程很好地重演了胚胎发育发育过程中器官发生的过程,已经使其成为发育学研究的良好模型。目前,利用三维培养离体诱导hESCs已经可以形成包括视杯在内的多种器官组织,但三维培养形成神经视网膜(neural retina,NR)仍存在有以下几点问题亟待解决:1、hESCs三维诱导形成的NR与在体发育过程中形成的NR仍存在结构和功能的差异;2、影响三维培养hESCs所形成的NR的因素不明,诱导效率偏低。此外,由于诱导形成的NR尚处发育阶段,其内细胞组分混杂,缺乏特异膜标记物直接定位和分选视网膜前体细胞(retinal progenitor cells,RPCs)。基于此,选择合适的手段改善三维培养方法并选择恰当的膜标记物分离细胞是当下研究的关键点。
  氧对生命的维系至关重要,一方面,生命体通过氧化磷酸化的有氧呼吸方式大量产生ATP保障了生命活动的高效运转;另一方面,机体发育伴随了外环境氧浓度的变化,而干细胞的命运与氧浓度的高低密切相关。通常认为:低氧是决定干细胞调节自我更新以及维持干性的重要因素;高氧则会促进干细胞的分化。三维诱导hESCs形成NR的过程通常都在常氧条件下进行,但胚胎发育过程中,中枢神经系统发育先于心血管系统,因此在血液循环建立前后,视网膜的发育会经历一个氧浓度由低升高的过程。目前,大多数三维培养没有涉及氧浓度的转变过程。
  此外,理想的可移植细胞应具备以下条件:1、处于前体细胞阶段,便于移植前离体扩增以及移植后分化为目的细胞;2、无胚胎源性,不会在移植入器官后无限增殖形成畸胎瘤。研究发现,器官来源的络氨酸蛋白激酶受体(tyrosine-protein kinaseKit,C-Kit)阳性细胞是一类具有自我更新和分化潜能的干细胞,将其移植入对应的器官可发挥组织修复功能。而阶段特异的胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen4,SSEA4)为人器官组织在胚胎阶段表达的表面标记物,SSEA4将有利于鉴别胚胎源性的细胞。
  目的:hESCs三维培养以探究其形成的NR的细胞和组织构筑特点;研究氧浓度升高对三维诱导hESCs形成NR效率的影响,从而通过调控氧浓度改良三维诱导方法;研究从三维诱导hESCs形成NR中分离的C-Kit+/SSEA4-细胞的生物学特点以及低氧对其干性维持的影响,进而获取状态良好和足够数量的RPCs;利用全基因谱扫描分析从三维诱导hESCs形成NR分离的C-Kit+/SSEA4-细胞的基因表达谱,全面深入了解该细胞的特点。
  方法与结果:
  本研究分为三个部分:
  第一部分、hESCs的三维培养及神经视网膜的自发形成
  1、利用细胞免疫荧光、流式细胞分析研究hESCs细胞系H1的细胞特性。发现H1-hESCs成克隆聚集样生长,核分裂相明显。高达95%以上的细胞表达胚胎干细胞标志物OCT4,SOX2和SSEA4。
  2、通过免疫荧光染色鉴定三维诱导hESCs形成的视泡、视杯样结构。可见拟胚体(embryonic bodies,EBs)在8天左右即可形成视泡样结构,继续培养24天后,视泡的形态更加清晰,并可观察到双层凹陷的视杯样结构,三维诱导38D的hESCs来源NR可表达增殖标记物Ki67; RPCs标记物:RAX、PAX6、CHX10;神经前体细胞标记物:SOX2、NESTIN;神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)标记物Tuj1及感光前体细胞标记物Crx,其中RAX在全神经视网膜均有表达。
  第二部分、氧浓度对三维诱导hESCs形成神经视网膜发育的影响
  1、利用免疫荧光染色分析高氧对三维诱导hESCs自发形成NR的影响,发现40%O2的高氧可以明显促进神经视网膜内细胞的增殖,且40%O2组中NR内增殖细胞在尖-底(apical-basal)端两侧间迁移增加,高氧可促进细胞核动态迁移(Interkinetic nuclear migration)的发生。
  2、利用免疫荧光染色研究高氧对三维诱导hESCs自发形成NR中神经玫瑰花节(neural rossetes)尖-底端极性的影响,发现在20%O2组中,神经玫瑰花结内侧尖端面会翻转至外侧,而40%O2组中神经玫瑰花节可按照正常生理的尖-底端极性发育。
  3、利用免疫荧光染色研究高氧对三维诱导hESCs自发形成NR中RPCs的影响,发现氧浓度变化并不会改变神经视网膜标记物的表达模式,但40%O2下PAX6阳性视网膜祖细胞数量较20%O2显著增加,RPCs向神经内层迁移更为明显,且40%O2显著促进RGCs的形成。相比20%O2的常氧处理,高氧下三维诱导hESCs形成的RGCs的突起更长,向基底侧迁移增加。
  第三部分、氧浓度对hESCs三维诱导NR来源C-Kit+/SSEA4-(hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-)细胞的增殖的影响及其生物学特性分析
  1、利用改进的三维诱导方法诱导hESCs形成NR,研究氧浓度的影响对NR标记物表达的影响,发现改进的三维诱导方法所得EBs形成相对较慢,其形成的NR细胞与组织构筑特点没有显著变化,高氧对EBs生长仍有促进作用。
  2、利用免疫荧光染色研究改进的三维诱导hESCs形成NR中C-Kit的表达的时空分布特点,发现C-Kit阳性细胞主要分布于神经视网膜的内层,C-Kit阳性细胞同时表达干细胞标记Nestin、PAX6、RAX,但不表达CHX10。随着诱导时间的进展,NR内C-Kit的表达水平不断下降。
  3、利用细胞生存实验分析hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞增殖特性,发现hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞在3%O2的低氧下细胞增殖明显增加,在诱导30D、45D及60D分选细胞,以30D分选的细胞增殖活性最好。
  4、利用细胞免疫荧光染色,研究hESC-NR-C-Kit+/SSEA4的-细胞的特性,发现hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞可以表达包括Nestin、PAX6、RAX等多种RPCs的标记物和增殖标记物Ki67,且可以诱导分化形成RGCs、双极细胞、感光细胞及Müller细胞。
  5、利用全基因组转录谱表达分析,研究hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞的基因表达谱特点,发现30D、45D及60D分选的hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-视网膜前体细胞与人胚眼分离的RPCs之间的Pearson相关系数均在0.88以上,且以30D最高(0.908),hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞较RPCs增殖和迁移相关基因表达增加,p53信号通路激活增加,但细胞粘附分子通路激活降低。
  结论:
  1、三维诱导hESCs形成的NR可以表达各类视网膜干细胞标记物,其发育类似在体视网膜发育过程。选用改进的(BMP4介导)三维诱导方法,其诱导过程操作简单,NR形成更稳定,表明改进的三维诱导方法更利于后期临床运用。
  2、氧浓度升高对于三维诱导hESCs形成NR的主要影响有包括促进NR的增殖、促进神经玫瑰花结按照正常生理的尖-底端极性发育、促进PAX6阳性RPCs的形成和迁移以及促进RGCs的形成、成熟和迁移。表明高氧处理有利于获得更多、更接近在体发育的NR。
  3、低氧培养下,诱导30D分选的hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞的状态和增殖活性较常氧培养有明显改善,表明低氧培养有利于细胞的稳定扩增。
  4、三维诱导hESCs形成的NR中C-Kit阳性细胞可以同时表达Nestin、 PAX6、RAX等视网膜干细胞标记,但不表达胚胎抗原,可分化为感光细胞,双极细胞,Müller细胞及RGCs,表明hESC-NR-C-Kit+/S SEA4-细胞为一类RPCs。
  5、基因组表达谱扫描结果显示hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞与从人胚眼中分离的RPCs非常类似(>90%),但其增殖和迁移相关基因表达高于RPCs,提示hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞是接近于在体发育的一类RPCs。为干细胞移植治疗视网膜变性疾病提供了成瘤风险低、分化潜能好、有标准化产业化条件新的种子细胞。
[硕士论文] 牛艳
细胞生物学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)是目前应用最广泛的荧光素,因其特殊的分子结构及理化性质,FITC常用作荧光标记物对蛋白质、核酸、多糖等生物大分子进行标记。尤其是基于FITC建立的FITC-抗FITC检测系统,能够有效地扩大抗原抗体反应的敏感性。本实验采用直接标记法制备出异硫氰酸荧光素人工完全抗原,并通过杂交瘤技术研制出高亲和力、高特异性的杂交瘤细胞株,利用体内诱生腹水技术制备出抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行了鉴定。抗 FITC单克隆抗体的研制为高效、快速地对FITC标记的蛋白质、核酸、多糖等生物大分子进行检测奠定了基础。
  1.异硫氰酸荧光素人工完全抗原的合成及鉴定
  采用直接标记的方法将 FITC分别与大分子偶联载体牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)进行偶联,合成人工完全抗原 FITC-BSA和 FITC-OVA。通过紫外吸收光谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和动物免疫法对人工完全抗原的偶联效果进行鉴定。依照紫外吸收光谱结果计算出 FITC-BSA和 FITC-OVA的偶联比分别为14:1和13:1;SDS-PAGE鉴定结果显示:FITC-BSA和 FITC-OVA的条带相对于载体蛋白 BSA和 OVA的条带出现了明显的拖尾现象,初步证明偶联成功。动物免疫实验结果显示:制备的 FITC-BSA能够诱导小鼠产生有效免疫应答,多抗血清效价均可达到1:12800,其中3号小鼠的半数抑制浓度 IC50可以达到4.25 ng/mL,表明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。
  2.异硫氰酸荧光素单克隆抗体的制备及鉴定
  选取免疫效果最好的3号小鼠进行细胞融合,通过间接ELISA法和间接竞争 ELISA法筛选出两株强阳性杂交瘤细胞株,分别将其命名为1F11和2A7,采用有限稀释法分别对其进行亚克隆,三轮亚克隆后筛选出细胞培养上清效价较高(1:3200)的2A7杂交瘤细胞株,通过小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗 FITC单克隆抗体,通过正辛酸-硫酸铵法对收集到的单抗腹水进行纯化, SDS-PAGE电泳结果显示其仅在53 KD和25 KD处存在两条明显的特异性条带,表明纯度较高。经鉴定,纯化后的2A7单抗效价可以达到1:2.048×106,亲和力常数为1.72×109 L/mol,对FITC的IC50为1.37μg/mL;根据鼠单抗亚型鉴定试剂盒测定其亚型为 IgG1、κ轻链型;特异性鉴定结果显示其仅与 FITC特异性结合;经过连续三个月的传代培养以及反复冻存、复苏后,2A7杂交瘤细胞株依然能够稳定地分泌抗 FITC的单克隆抗体。本研究研制出了高效价、高亲和力的特异性抗FITC单克隆抗体,从而为高效、快速地对各种FITC标记物进行检测打下了基础。
[硕士论文] 孙琦
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:我们采取初情期的内蒙古白猪卵巢,用胶原酶对皮质组织消化处理,制备卵巢皮质组织单细胞悬液,再通过差速贴壁和抗体-磁珠分选法结合的方法富集卵原干细胞。在本实验中,我们采用的分选靶蛋白为Fragilis,最后将富含卵原干细胞的细胞悬液置于含有血清、EGF、BFGF、LIF的培养液中,在38.5℃、5%CO2的环境下培养,并对获得的卵原干细胞进行生物学特性验证。
  在培养5-7天后,出现卵原干细胞克隆,以后每隔2-3天传代一次,现在该细胞系在体外已经传代56代,猪卵原干细胞的克隆细胞与小鼠卵原干细胞的形态相似,细胞界限清晰,核质比大,体外传代次数超过6代后,小部分的卵原干细胞开始自发分化,细胞的体积增大,其直径可达60μm,形成卵母细胞样细胞,并且在卵母细胞样细胞外周形成透明带样结构,免疫荧光分析显示该结构与ZP3蛋白的抗体特异结合,免疫荧光染色显示这类细胞表达Scp3蛋白,表明这些卵母细胞样细胞处于减数分裂期。经免疫荧光检测、RT-PCR基因表达分析结果显示猪卵原干细胞表达Oct4、DDX4、C-kit、Nanog、Stella、Ifitm3、Blimp1等干细胞标记基因。核型分析显示我们建立的猪卵原干细胞系含有38条染色体,其中2条为XX性染色体。以上结果表明该细胞系具有卵原干细胞的全部特性,证明我们在体外成功构建了猪卵原干细胞系。
[硕士论文] 李治颖
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:人胚胎干细胞(hESCs)是一种多潜能干细胞,具有在体外无限增殖、自我更新和向机体各种类型细胞分化的能力。hESCs在特定条件下可分化为胰岛素分泌细胞(IPCs),可以用于移植治疗Ⅰ型糖尿病,以解决临床治疗器官来源不足的问题。MiR-375是胰腺发育和成熟过程中必不可少的转录调控因子,在胰岛β细胞和非β细胞中均有表达,能够提高胰岛素转录水平,促进胰岛β细胞增殖。因此,研究miR-375在hESCs向IPCs分化过程中的作用,对于提高hESCs向IPCs分化的效率,获得单一表达Insulin的成熟胰岛β细胞具有重要意义。本研究在特定条件下使hESCs向IPCs分化,分化过程包括终末内胚层(StageⅠ)、原肠(StageⅡ)、内分泌前体(StageⅢ)和胰腺内分泌细胞(StageⅣ)四个阶段。先以分化体系中的维甲酸(RA)为变量优化分化条件,再分别采用慢病毒介导的稳定过表达和脂质体介导的瞬时过表达提高细胞miR-375的表达水平,通过实时定量PCR检测miR-375和分化各阶段标志性基因Foxa2、Cxcr4、Ngn3、Pdx1、Insulin、Glucagon、Somatostatin的相对表达量,并通过免疫荧光染色和Elisa检测胰岛素合成和分泌情况,从而研究过表达miR-375对hESCs分化为IPCs的影响。
  1、为了优化hESCs分化为IPCs的培养条件,在终末内胚层向内分泌前体细胞分化的不同时间段添加2μM RA对细胞进行诱导,分别为不添加RA、在StageⅡ添加RA、在StageⅢ添加RA、在StageⅡ和StageⅢ都添加RA。研究发现在没有RA诱导的条件下,hESCs未能成功分化为IPCs;在StageⅡ添加RA的条件下,胰向分化相关基因Foxa2、Cxcr4、Ngn3、Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin的相对表达量最高,并且在此条件下细胞一直保持良好的生长状态。因此在细胞分化StageⅡ添加2μMRA可作为分化培养的最佳条件。
  2、通过对hESCs进行慢病毒介导的miR-375稳定过表达,发现慢病毒感染会对hESCs的生长状态造成极大影响,降低细胞增殖分化能力并增加细胞凋亡,使细胞在分化早期大量死亡,进而导致hESCs无法分化产生IPCs。
  3、对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 mimic转染,发现在分化早期过表达miR-375会提高Foxa2和Cxcr4的相对表达量,在分化中期过表达miR-375会提高Ngn3和Pdx1的相对表达量,在分化末期过表达miR-375会提高Insulin的相对表达量同时降低Glucagon和Somatostatin的相对表达量。并且瞬时过表达miR-375可促进胰岛素的合成和分泌。因此,在hESCs向IPCs分化过程中过表达miR-375可提高胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平,降低分化末期细胞多激素共表达程度,促进β细胞成熟和胰岛素分泌。
[硕士论文] 刘凤姣
生物工程 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:神经肌肉接头(NMJ)是一种外周胆碱能化学突触,主要由三种细胞组成:运动神经元,肌纤维和雪旺氏胶质细胞。NMJ发育和损伤后修复的过程是一个复杂且精细的多分子参与调控过程。
  为研究NMJ发育、成熟和再生过程中基因的表达变化,本课题建立了三种研究模型:(1)C2C12肌细胞分化成肌管细胞和AGRIN蛋白刺激肌管细胞模拟突触后膜形成ACHR聚集簇的模型;(2)生理状态下,新生和成年小鼠膈肌表面NMJ突触区和非突触区发育的模型;(3)小鼠臂丛神经去支配损伤后的肌肉组织的NMJ损伤修复再生模型。
  基于这三种模型,利用Illumina深度测序法,对三种模型的基因表达水平进行差异统计和比对分析。对统计结果进行质量评估,发现样品的Clean reads、测序饱和度和mRNA打断的随机程度都符合要求。对符合要求的统计结果进行比对,并且对差异基因进行Gene Ontology和KEGG pathway分析。根据上述分析,对差异基因的细胞组成、参与的生物过程、发挥的分子功能和主要参与的信号通路进行了统计。统计发现各个样品中差异基因主要细胞组成是细胞膜、细胞器和胞外基质等;主要参与的生物过程是细胞基础代谢、细胞黏附和生物调控等;主要发挥的分子功能是蛋白结合作用和催化作用等。而差异基因富集的信号通路较为广泛,其中主要有:细胞黏附作用、细胞代谢、WNT信号和细胞外基质信号等。
  基于以上统计分析,发掘出若干在NMJ发育、成熟和修复再生中可能发挥重要作用的信号分子。这些分子中有些分子的功能已经被前期的研究证明,如ACHR各个亚基;而有些信号分子的潜在生物学功能还需要进一步的实验研究加以证明,如miRNA、Smad家族、Ccnd1&Ccnd3、Laminin家族和Sfrp家族等。
  综上所述,本课题通过对NMJ发育、成熟和再生三种模型表达差异基因的统计分析,搜寻到若干在NMJ发育、成熟与再生过程中可能发挥重要调控作用的关键信号分子。例如,LAMININα2蛋白及其结合糖蛋白DYSTROGLYCAN或整合素INTEGRINα7β1发生缺陷时可产生显著先天性肌无力症状,而测序结果发现在肌细胞分化之前和新生小鼠的膈肌突触区中Lamininα2基因高表达,猜测LAMININα2蛋白只在NMJ的早期发育阶段在突触后膜的肌肉组织中发挥关键作用。研究还发现Laminin家族的多种不同亚基在NMJ发育不同阶段表达水平具有显著的差异,这对进一步研究LAMININ蛋白在NMJ中的作用,以及研究先天性肌无力症状的具体发病机制和潜在治疗方案提供了方向。本课题对参与调控NMJ发育、成熟和再生的关键基因的挖掘工作不仅为理解NMJ发育的神经生物学基础提供了重要线索,也为神经再生和神经肌肉系统相关疾病的治疗提供了潜在的靶点。
[硕士论文] 李媛
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:实验目的:
  1.确定成体干细胞标记物Lgr5对细胞重编程的作用。
  2. LGR5作为G蛋白偶联受体,是否存在合适配体参与影响细胞重编程。
  3.探究LGR5影响细胞重编程的机制。
  4.利用LGR5对细胞重编程的影响解决生物医学难题。
  实验方法:
  首先采用qPCR的技术手段,检测Lgr5在小鼠各个组织细胞中的表达情况,根据表达情况构建过表达载体或者敲低表达载体,过表达载体我们选择构建在可以被强力霉素(Doxycycline,Dox)控制表达的pFUW-tet-on载体上,利用293T细胞以及psPAX2和pmd2.G的病毒包装质粒实现病毒的包装和获得,利用病毒感染的方式,直接感染小鼠胚胎多能性干细胞或者建立Lgr5过表达的稳转小鼠胚胎多功能干细胞细胞株,在此基础上探测Lgr5过表达对小鼠胚胎多能干细胞的影响,同样Lgr5的敲低表达载体按照同样的方法。对于小鼠胚胎多能干细胞的影响,我们主要通过观察细胞物理形态和检测多能干细胞的多能标记基因(marker)Nanog、Oct4、Rex1、Fgf5等。针对Lgr5对细胞重编程的影响,我们利用小鼠的胚胎成纤维细胞作为体细胞重编程的起始细胞,利用已经成功建立的诱导体系,获得能够直接添加强力霉素启动内源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc表达来诱导细胞发生重编程的小鼠胚胎成纤维细胞,利用病毒感染的方法完成对此细胞Lgr5的过表达或者敲低,进而进行细胞重编程,对重编程得到的克隆的形成的速率和效率进行统计比较,密切观察记录细胞出现克隆的日期。为了探究Lgr5影响细胞重编程的机制,我们筛选了跟Lgr5相关的一些蛋白。LGR5作为G蛋白耦联受体,参与Wnt信号通路,而Wnt信号通路对于细胞干性维持有重要作用,RSPO3作为LGR5的同源配体,与其共同作用参与Wnt信号通路,同样方法检测Rspo3过表达对于重编程效率和小鼠胚胎多能干细胞的影响。利用荧光定量PCR和Western Blot在RNA水平和蛋白水平检测Wnt通路中核心因子β-catenin的相关变化。利用ChIP-seq深度解析不同类型细胞中关键转录因子结合的DNA序列,分析LGR5和RSPO3参与Wnt通路调控的下游靶基因,揭示Lgr5在细胞重编程中的作用机制。
  实验结果:
  1. Rspo3过表达能够促进小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率。
  2. Lgr5和 Rspo3在小鼠胚胎干细胞中过表达后能够上调胚胎干细胞多能性标记基因的表达。
  3.在小鼠胚胎干细胞中过表达Lgr5基因,Wnt通路的核心蛋白β-catenin表达水平上升。
  实验结论:
  Lgr5与Rspo3过表达协同促进小鼠胚胎成纤维细胞重编程,维持小鼠胚胎干细胞多能性。
[硕士论文] 钱怡
内科学 西南医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究微血管内皮细胞(MEC)对造血干细胞(HSC)增殖的影响,寻找促进HSC增殖的方法。
  方法:
  1. MEC分离、培养及鉴定:将肺组织经I型胶原酶消化获得的细胞,在20%FBS、2ng/mlVEGF、肝素100u/ml、DMEM-F12中培养,24h全换液,此后每2-3天全量换液,镜下观察细胞形态变化及生长情况,取第8天细胞进行FITC-CD31免疫荧光鉴定,“铺路石”细胞用于流式鉴定、传代培养和共培养。连续8天观察P1代MEC生长情况、形态变化,并逐日细胞计数,绘制P1代MEC生长曲线。
  2.GFP小鼠HSC的分离、鉴定:密度梯度离心法获得小鼠骨髓单个核细胞(MNC),MACS-CD117+磁珠分选HSC。应用流式细胞计数仪(FACS)检测阳性细胞的纯度及HSC CD117CD34共表达率。
  3.微血管内皮细胞对造血干细胞增殖的研究:设立对照组(HSC)、共培养组(MEC+HSC),体外培养7天,观察HSC生长情况、细胞计数、绘制生长曲线、计算HSC扩增倍数。收集共培养组HSC,FACS检测共培养组HSC CD117CD34共表达率,与共培养前对比。
  结果:
  1.MEC分离、培养及鉴定:原代细胞:6h贴壁,24h少数细胞形态不规则,多数细胞呈圆形。48h见多角形、短梭形细胞。第3d细胞聚集生长,形成形态大小较一致的细胞团。第6d相邻细胞伪足彼此相连,第10d细胞继续增多,第14d细胞生长达80%融合,呈“铺路石”外观。?传代细胞:4h贴壁,P1代MEC第3d见多角形、短梭形细胞。第4d细胞聚集生长,形成形态大小较一致的细胞团,第7d细胞密集生长,多数呈梭形、不规则形。第8d细胞生长近80%融合。P1代MEC生长曲线:第4到7天为对数生长期,随后进入平台期。CD31抗体免疫荧光检测阳性率为54.5%。MEC FACS鉴定vWF、CD31、CD34、CD45表达率分别为:81.39%、45.8%、57.48%、0.17%。
  2.GFP小鼠HSC的分离、鉴定:本实验中平均每只GFP小鼠骨髓经密度梯度离心后可以获得约1.1×108个MNC,活细胞率为98%。MNC经MACS CD117磁珠分选后可以获得约4.7×105个 CD117+细胞,活率为97%。骨髓MNC中CD117+细胞含量约0.43%。磁珠分选后的CD117+HSC纯度为99.51%,HSC CD117CD34共表达率为75.28%。荧光显微镜下:HSC呈绿色,圆形,大小均一。
  3.微血管内皮细胞对造血干细胞增殖的研究:培养时间增加,两组HSC数均增加,共培养组较对照组更明显。共培养组与对照组细胞数的比值:第1d,共培养组细胞数约为对照组的1.21倍(P<0.01),第2d,共培养组约为对照组的1.35倍(P<0.05),第3d,共培养组约为对照组的1.50倍(P<0.01),第4d,共培养组约为对照组的1.72倍(P<0.01),第5d,共培养组约为对照组的1.71倍(P<0.01),第6d,共培养组约为对照组的1.75倍(P<0.01),第7d,共培养组约为对照组的1.78倍(P<0.01)。共培养组与对照组细胞数比值变化曲线示:比值逐渐增加,第4d变化最明显。D1-D7较D0的HSC数比较:第7d与第0d相比,共培养组扩增约12.31倍(P<0.01),对照组扩增约6.92倍(P<0.01);第6d与第0d相比,共培养组扩增约11.28倍(P<0.01),对照组扩增约6.45倍(P<0.01);第5d与第0d相比,共培养组扩增约9.72倍(P<0.01),对照组扩增约5.66倍(P<0.01);第4d与第0d相比,共培养组扩增约7.31倍(P<0.01),对照组扩增约4.25倍(P<0.01);第3d与第0d相比,共培养组扩增约3.45倍(P<0.01),对照组扩增约2.30倍(P<0.01);第2d与第0d相比,共培养组扩增约1.92倍(P<0.01),对照组扩增约1.42倍(P<0.01);第1d与第0d相比,共培养组扩增约1.20倍(P<0.01),对照组扩增约0.99倍(P>0.05)。共培养7天后,共培养组HSC CD117CD34共表达率为92.06%。
  结论:
  1.微血管内皮细胞对造血干细胞增殖有促进作用,共培养第4天促进作用最明显。
  2.微血管内皮细胞可以促进造血干细胞CD34的表达。
[硕士论文] 孙元元
细胞生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:干细胞是一类具有自我更新能力的细胞,在体外培养条件下可无限增殖,同时保持着分化为不同类型细胞和组织的潜能,现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一,具有巨大的应用前景。小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)是第一株在体外成功建立的干细胞系。此后,人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)系也得以成功构建。2007年,科学家们又从小鼠着床后的囊胚上胚层中分离得到一种新型的干细胞——小鼠上胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)。值得关注的是,mEpiSCs与mESCs虽然具有相同的物种属性,但二者在生物学特性上存在较大差异,而mEpiSCs与hESCs之间却表现出许多更为相似的特性。由于人源性,hESCs无法进行嵌合体实验或其它涉及伦理问题的研究,在此种情况下,mEpiSCs则可以充当相应空白领域的补充材料,而对于mEpiSCs的深入研究,也是对整个干细胞研究领域的拓展,有利于扩大人们对于干细胞内部信号调控网络的认识。
  早期分离得到的mEpiSCs被培养在人工合成培养基(chemically definedmedium,CDM)中,并加入细胞因子激活素A(Activin A)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast grow factors-2,FGF2)来维持细胞的自我更新状态。但此种条件下培养的细胞易出现生长缓慢、不耐受单细胞消化、易凋亡等问题。经改进后的培养条件,以10%胎牛血清(FBS)含量的DMEM培养基为基础,加入ActivinA、bFGF、IWR1(Axin蛋白的稳定剂)以及Y27632(ROCK激酶的抑制剂)这四种细胞因子和小分子化合物,可以显著提高mEpiSCs的存活能力。然而,Activin A+bFGF+IWR1+Y27632培养条件由于涉及因子种类过多,不利于后续对细胞内信号通路与调控机制的深入探究,且培养成本较高。我们在前期工作中尝试对mEpiSCs的培养条件作进一步改进与优化,最终得到仅添加IWR1和Y27632即可使mEpiSCs维持在自我更新状态的最佳培养条件。为探究IWR1和Y27632维持mEpiSCs自我更新的作用机制,设计对照实验,检测IWR1条件下和Y27632条件下,mEpiSCs中各基因的差异化表达程度,并以此为基础,筛选出每种小分子可能作用的靶基因。考虑到课题周期的限制,我们首先选取IWR1作为研究对象,筛选出其在细胞中可能作用的下游靶基因为Foxd3,并利用另一种小分子CHIR99021与IWR1对于Wnt/β-catenin信号通路所具有的拮抗作用来设计反向实验,证明了Foxd3的表达与IWR1之间确实具有相关性。
  下一步,围绕Foxd3来设计实验,探究IWR1调控mEpiSCs自我更新状态的中间媒介。相关实验分两个方向展开:其一,构建包含目的基因的过表达载体,转染并借此在细胞内上调Foxd3的表达量,观察其能否替代IWR1来维持细胞的自我更新状态;其二,利用shRNA干扰的方法,在mEpiSCs内下调Foxd3的表达水平,观察细胞是否出现分化现象。在mEpiSCs中分别上调与下调Foxd3后,通过形态观察、细胞计数、qRT-PCR、免疫荧光等实验手段来检测mEpiSCs的自我更新水平与生长情况。结果显示,在缺乏IWR1的培养条件下,与对照组细胞相比,过表达Foxd3后的mEpiSCs能够维持正常的形态特征,且生长速率明显提高,qRT-PCR实验可检测到细胞内自我更新标志基因Esrrb、Nanog和Oct4的正常表达,且代表不同胚层的分化基因,如Gata6、Mixl1和Nestin的表达量未出现变化,而在免疫荧光实验中也可检测到自我更新标志基因Oct4和Nanog的蛋白表达产物,说明上调Foxd3的表达量,能够替代IWR1的作用来维持mEpiSCs处于自我更新状态;另一方面,在IWR1存在的条件下,下调Foxd3后的mEpiSCs与对照组相比,细胞形态出现异常,自我更新标志基因Oct4和Nanog在转录与蛋白水平上的表达量均出现下调,且内胚层、中内胚层与中胚层的标志基因表达水平出现显著上升,说明下调Foxd3的表达量,能够使IWR1维持mEpiSCs自我更新的作用失效。由此可以推断Foxd3作为小分子IWR1的下游靶基因,在其调控mEpiSCs生长与内部信号通路的过程中发挥着重要作用,是维持细胞自我更新状态的关键环节。该研究结果扩大了目前人们对于维持mEpiSCs自我更新分子机制的理解,有利于后续对其展开进一步的基础研究与应用,同时可以为探究人胚胎干细胞以及其他种类多能性干细胞的自我更新机制提供线索。
[硕士论文] 眭伟浩
干细胞与再生医学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:背景:再生医学界领袖之一Richard.GOSS将再生、生命、死亡三者之间的关系解释为:“如果没有再生,就没有生命,如果处处再生,就没有死亡”,可见再生是个体存活维持组织功能的重要机制。基于人干细胞尤其是人多能干细胞(humanpluripotent stem cells,hPSCs)含人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)和人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的再生医学为发展个体化医疗带来了前所未有机遇和前景。hPSCs具有在体外无限复制和向各种谱系细胞分化的潜能,为治疗多个系统的退行性病变提供可能的种子细胞用于移植。但是hPSCs应用于临床还存在很多瓶颈,例如研究表明体细胞重编程过程中过表达重编程因子后引起的DNA复制压力和氧化自由基应激导致的DNA损伤可以破坏iPSCs的基因组产生基因突变,另一方面hPSCs在快速增殖过程中伴随着由细胞代谢和DNA复制活跃产生的活性氧自由基(ROS)也可以导致DNA损伤从而产生基因突变,移植携带基因突变的细胞到体内后可能产生肿瘤。因此研究hPSCs如何维持基因组的稳定性对于获得更安全的hPSCs用于细胞治疗十分重要。相比于体细胞DNA损伤修复的研究,关于hESCs和iPSCs如何维持基因组稳定性的报道却不多,目前的研究发现hPSCs维持基因组稳定性的主要机制为:一.ESCs内线粒体数量较低,同时ESCs主要通过不依赖于线粒体氧化磷酸化的糖酵解代谢方式获得能量,因此产生的ROS水平很低,另外ESCs高表达抗氧化相关基因,因此具备更强的抗ROS导致的DNA损伤能力;二.ESCs在DNA损伤时会发生分化和凋亡清除无法完成损伤DNA修复的细胞群体。本课题研究了多梳家族蛋白PHC1在hESCs基因组稳定性维持中的作用。我们的研究结果显示利用shRNA沉默PHC1的表达后可以降低NANOG的表达水平,提示PHC1可能参与hESCs的干性维持;进一步通过紫外辐射和阿霉素处理诱导DNA损伤后,敲降PHC1后的hESCs对DNA损伤更敏感。另外,以前的研究表明过表达重编程因子引起的DNA损伤反应是体细胞重编程的一个重要障碍。我们的结果显示在人体细胞重编程过程中敲降PHC1的表达后引起细胞凋亡增加、周期阻滞,从而降低重编程的效率,提示PHC1参与了多能性形成过程中细胞的DNA损伤反应。
  第一部分、PHC1在hESCs干性维持中的作用
  目的:研究PHC1对于多能性维持的作用。
  方法:利用qPCR和western blot检测PHC1在hPSCs与分化细胞中的表达差异,构建PHC1 shRNA在hESCs中沉默PHC1基因表达后检测多能性基因的表达变化。
  结果:PHC1在hPSCs中的表达高度富集。成功构建了在HFF和hESCs中有良好敲降效果的PHC1 shRNA。hESCs中沉默PHC1基因表达后多能性基因OCT4和NANOG在转录水平没有明显差异,但NANOG蛋白水平表达有一定降低。
  结论:PHC1对于hESCs多能性维持具有一定的作用。
  第二部分、PHC1对于维持hESCs基因组稳定性的作用
  目的:建立诱导hESCs DNA损伤的模型,探索敲降PHC1后hESCs对DNA损伤修复的反应。
  方法:沉默PHC1基因表达后,分别采用紫外(UV)辐射,阿霉素(Dox)处理诱导hESCs DNA损伤模型,检测细胞凋亡水平变化细胞增殖情况。
  结果:对比载体对照组,敲降PHC1可以造成hESCs基因组稳定性下降,对DNA损伤敏感度增加。
  结论:PHC1对hESCs基因组稳定性维持具有一定作用。
  第三部分、PHC1在人体细胞重编程中的作用
  目的:探讨PHC1在过表达转录因子介导的体细胞重编程中的作用。
  方法:建立利用慢病毒载体过表达OCT4,SOX2,KLF4,c-MYC重编程人成纤维细胞为iPSCs的体系,检测沉默PHC1表达后对重编程效率的影响。
  结果:重编程过程中沉默PHC1后引起细胞周期阻滞、细胞凋亡增加以及重编程效率降低。
  结论:PHC1参与人体细胞重编程过程中发生的DNA损伤反应,从而影响重编程效率。
[硕士论文] 宁明明
生物学(植物学) 佳木斯大学 2016(学位年度)
摘要:本实验研究鸡羊水干细胞(CAFSCs)体外分离、培养方法及优化CAFSCs的培养体系,同时进行生物学特性鉴定,其次探究人参皂苷对CAFSCs增殖的影响。
  实验选取受精7-9天的鸡蛋,采用高速离心法与温差法分离CAFSCs;体外模拟禽类体内的生长环境,用含一定比例鸡血清及生长因子的全培养基对CAFSCs进行培养;用免疫荧光组织化学和RT-PCR对CAFSCs表面分子标志进行鉴定;分别用不同浓度的人参皂苷对CAFSCs进行处理,用CCK-8法、EdU-EU法、RT-PCR检测CAFSCs增殖情况。
  实验结果表明,通过高速离心法与温差法以较低的成本获得较多的CAFSCs;体外培养的CAFSCs呈条形,贴壁生长,生命力较强,目前能够传到34代;免疫荧光组织化学检测CAFSCs表面标志物Oct-4、CD105、nanog、CD73、SSEA-4呈阳性;RT-PCR检测CAFSCs表面标志物CD44、CD29、CD73、SH2呈阳性。说明本实验分离培养的细胞是我们需要的CAFSCs,且在体外培养中能够维持干细胞基本特性。在倒置显微镜下观察人参皂苷处理下的CAFSCs形态向四周伸展;CCK-8法检测第五代CAFSCs增殖情况,绘制表型曲线,并进行SPSS统计分析后发现,人参皂苷在一定浓度内,随着浓度不断增加,OD值越高(P<0.01);EdU-EU法检测第五代CAFSCs增殖情况,通过对图像的分析,发现人参皂苷在一定浓度内,随着浓度不断增加,增殖的细胞数量越多;RT-PCR检测第二十五代CAFSCs增殖情况,进行灰度分析并做条形图,发现人参皂苷在一定浓度内,随着浓度不断增加,NIFK、EGFR、C-myc三个增殖基因的表达越强。
  该实验是目前已见报道的首个成功分离、培养禽类羊水干细胞的案例。实验证明, CAFSCs获取方便,成本低廉,具有较强的体外增殖能力,适合在体外大规模分离培养,为干细胞治疗提供了一种更好的选择。人参皂苷能够促进高、低不同代次CAFSCs增殖,拓宽了其在医学药用领域的应用。
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