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[硕士论文] 徐桑尔
森林保护学 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:多粘类芽孢杆菌CF05菌株是一株从天目山古柳杉分离获得的产芽孢细菌,对根腐病等多种植物病害具有显著生防效果,具有良好研究开发价值。芽孢具有抗逆特性,是微生物农药制备的首选形态。本研究在已有基础上,围绕芽孢形成及调控,研究CF05芽孢形成的形态学和生理学特征,探讨芽孢形成与萌发的调控机制,制备CF05芽孢涂膜剂,应用于山核桃干腐病防治。研究结果如下:
  1、通过扫描电镜、透射电镜等显微观察技术,发现CF05菌株形成芽孢经历了3个形态变化阶段,分别是菌体期、前芽孢期和芽孢期。菌体期,CF05菌株细胞能够以二分裂的方式进行繁殖,菌体大小约2.4×0.5μm,呈杆状,有鞭毛,能游动;前芽孢期,细菌细胞两端尖凸,中部圆起,菌体表面开始不再光滑,大小约1.5×0.8μm;而当营养缺乏后期,形成芽孢,细菌细胞短杆状,两端平齐,无鞭毛无纤毛表面有明显皱褶,大小约1.0×0.9μm。
  2、利用转录组测序技术,比较了CF05菌体期和前芽孢期转录组的差异,发现差异基因2039个,其中上调1069个,下调970个。上调基因中有34个基因只在前芽孢期表达,下调基因中2个基因只在营养菌体表达。这34个基因中,12个基因与产孢相关,10个基因与碳源代谢相关,1个是细胞分裂蛋白,4个膜蛋白,7个基因功能未知。推测这些基因在细菌进入芽孢时,被诱导表达,参与细菌芽孢形态形成、休眠诱导以及感应蛋白积累等过程。
  3、通过单因素试验法,摸索了不同碳源、氮源、钾盐等因素对CF05菌株产芽孢量以及发酵液对供试病原菌(异孢镰刀菌Fusarium letersporum,暗色节菱孢菌Ar thrinium phaeospermum,灰葡萄球菌Botrytis Cinerea)拮抗效果的影响。结果发现GBP培养基(马铃薯浸粉10g/L,葡萄糖20g/L,牛肉膏5g/L(或蛋白胨5g/L),Mg SO4·7H2O1g/L;(NH4)2SO41g/L,CaCl2·2H2O4.41g/L,KH2PO40.6g/L,pH=7.0)效果最佳,芽孢形成时间最短,芽孢形成量达到8.83×108CFU/mL,具有明显拮抗效果。
  4、利用平板菌落计数,发现了CF05菌株能以羟甲基纤维素钠(CMC)和白乳胶(PVAs)作为唯一碳源进行生长。利用CMC和PVAs制备了CF05涂膜剂,发现芽孢浓度可以在半年内维持在107CFU/mL。说明CF05芽孢可以以CMC/PVAs作为载体,制备稳定成膜剂;林间试验发现,CF05涂膜剂对山核桃干腐病具有显著的防治效果。
  综上,本研究围绕多粘类芽孢杆菌芽孢形成及制剂研究,明确了CF05菌株芽孢形成的形态学变化,优化了芽孢形成发酵培养基,发现了芽孢形成的关键调控基因,制备了CF05芽孢涂膜剂,防治山核桃干腐病效果显著。研究结果为CF05菌株微生物农药开发提供了重要参考。
[硕士论文] 朱永明
微生物与生化药学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株Tu-569是从兔肠道中筛选出的对大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)等动物致病菌有较强抑制作用的芽孢杆菌。现将Tu-569菌株作为出发菌株进行紫外-微波诱变选育,以获得抑菌能力更高且遗传稳定的突变菌株。通过观察变异菌株的菌落和菌体形态,以生理生化试验和API50CH细菌鉴定条综合评测高产菌株生理生化特性。除不产接触酶、可耐受10%和15%的NaCl、可利用D-半乳糖和D-塔格糖外,T-70-1菌株的其余生理生化特性与Tu-569菌株均相同。与原菌株Tu-569相比,T-70-1菌株抗菌肽抑菌活性增加了1.74倍;连续传代十次后,T-70-1突变株抑菌效果仅降低了5.6%。最终获得了1株抑菌能力更强、遗传稳定的变异菌株T-70-1。
  对影响T-70-1菌株产抗菌肽的碳源、氮源、无机盐进行单因素试验以选择合适的种类,利用SPSS软件设计正交试验对菌株T-70-1产胞外抗菌肽发酵条件进行优化,以确定最优发酵条件。结果表明,T-70-1菌株产抗菌肽最优发酵条件为:葡萄糖2.5%、蛋白胨2.0%、MgSO4·7H2O0.08%、KC10.1%,初始pH值为6.5,接种量为4.0%,装液量为30mL/250mL,摇床转速180r·min-1,30℃发酵培养32h。最优发酵条件下相应的抑菌圈面积增大至525.5mm2,较优化前增幅达60.7%。获得了最优的发酵条件,显著提高了T-70-1菌株产抗菌肽的能力。
  为了获得T-70-1菌株抗菌肽适宜的提取方法,以抑制大肠埃希氏菌活性为指标,比较了不同提取方法的效果;通过不同截留分子量的透析袋处理菌株发酵液盐析溶解物,推测了该抗菌肽分子量的大致范围;采用不同的蛋白酶、pH、温度、离子种类及浓度、表面活性剂、变性剂处理该抗菌肽,以考察抗菌肽的稳定性和敏感性;以大肠埃希氏菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、福氏志贺菌(S.flexneri)、肠炎沙门氏菌(S.enterica)、芸薹链格孢菌(Alternaria brassicicola)、恶疫霉菌(Phytophthora cactorum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)为病原指示菌,测定了该抗菌肽的抑菌谱。结果表明,当硫酸铵饱和度达到70%时,抑菌圈面积为361.7mm2,抑菌活性最大;采用盐酸沉淀甲醇提取时,抑菌圈面积为178.9mm2;这两种提取方法中硫酸铵盐析的效果更好。透析处理的结果表明该抗菌肽的分子量在3.5~8.0kDa之间。该抗菌肽分别采用高浓度(5000U/mL)的胰蛋白酶、胃蛋白酶处理120min后,仍分别具有62.4%、49.1%的抑菌活性。该抗菌肽在pH7.0时抑菌活性最高,在pH3.0~9.0的范围内,有较高的抑菌活性,说明该抗菌肽对于pH稳定性较好。T-70-1菌株胞外产抗菌肽耐受高温,经100℃加热60min后,抑菌圈面积仅降低了30.1%,说明该抗菌肽耐热性良好。低浓度(25mg/mL)的Zn2+、Mn2+会显著促进抗菌肽的抑菌活性,阴离子种类对抗菌肽活性无显著影响。SDS、CTAB、巯基乙醇可以使该抗菌肽变性失活,EDTA可以增强抗菌肽的抑菌活性。综上,推测该抗菌肽为抗菌蛋白类物质,具有广谱抑菌活性,抑菌活性较为稳定。
  为了获得T-70-1菌株发酵产抗菌肽小试生产的最佳条件,考察了转速、通气量、装液量和罐压对发酵液抑菌活性的影响,设计正交试验优化5L发酵罐的发酵条件;在5L发酵罐最优发酵条件的基础上,以发酵通气率不变为原则,探索发酵时间对30L发酵罐发酵效果的影响。结果表明,5L发酵罐的最优发酵条件为:通气量为2.00L/min,压强为0.05MPa,转速为180r·min-1,装液量为40%;此时发酵液上清对应的抑菌圈面积为394.3mm2。当放大至30L发酵罐时,对应的发酵条件为:装液量20L,通气量为1.2m3/h,压强0.05MPa,转速为180r·min-1,抑菌圈面积可达到465.8mm2。实现了从5L发酵罐到30L发酵罐的放大。
  为了构建T-70-1菌株抗菌肽的分离纯化方法,以抑菌活性为指标,采用硫酸铵盐析法粗提抗菌肽,利用Superdex200(16×150mm)凝胶色谱柱和Capto Q(16×150mm)强阴离子交换色谱柱对粗提物进行分离,并以Tricine-SDS-PAGE检测目的抗菌肽的大小。结果表明,20L发酵液经70%硫酸铵盐析后获得了37.4g粗蛋白;经凝胶色谱分离后,得到2个组分S-1-1和S-1-2;组分S-1-1经检测含有淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶;组分S-1-2有抑菌活性。S-1-2组分经强阴离子交换色谱分离后,得到5个洗脱峰,其中组分Q-3和组分Q-4有抑菌活性。收集有较高抑菌活性的组分Q-4,除盐浓缩,经Tricine-SDS-PAGE检测,目的抗菌肽的分子量约7.6kDa。构建了该抗菌肽的分离纯化方法,为该抗菌肽结构的测定和抑菌机制的研究奠定了基础。
[硕士论文] 宁妍
食品加工与安全 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:作为一种含苯环的稠环芳烃化合物,苯并芘(Benzopyrene)广泛存在于环境中,是一种高活性的致癌物和诱变剂,具有胚胎毒性。苯并芘在人体内降解速度缓慢,仅仅靠机体自身没有办法将苯并芘含量降解到安全水平,极大影响人体健康。国内外有研究表明,乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)具有较强的黏附性,具体表现在其细胞壁具有吸附性,可以吸附多种致突变因子。但当前对于益生菌细胞壁与苯并芘结合过程的研究较为欠缺,因此本研究使用Materials Studio软件构造双歧杆菌肽聚糖结构模型,利用分子对接原理和分子动力学方法模拟并分析双歧杆菌吸附苯并芘的过程,使用高效液相色谱法和红外光谱法对吸附模型进行试验验证。主要结果如下:
  1、使用Materials Studio软件构建肽聚糖结构模型。可以看出肽聚糖的组成结构因菌种不同而有差异。本研究所用双歧杆菌的肽聚糖采用非键作用力吸附苯并芘,结合位点所作用的基团均是与氧原子和氮原子相关的基团。
  2、使用高效液相色谱法对供试菌株肽聚糖的苯并芘吸附率进行测定。结果证实4株供试双歧杆菌菌株(Bb-02,Bl-04,HN019,Bi-26)呈现了一定的的苯并芘吸附能力,且同一种间的不同菌株苯并芘吸附能力相近。其中,乳双歧杆菌菌株HN019和Bl-04的苯并芘吸附率较高,均超过70%,分别为74.37%和76.02%。
  3、使用傅里叶红外光谱法对肽聚糖吸附前后的结构进行分析。结果显示与标准肽聚糖结构对比表明,证明本研究从供试菌株提取的肽聚糖确为双歧杆菌细胞壁肽聚糖;谱图分析表明,其苯并芘吸附位点位于酰胺的C-N和醇类的C-O键附近。
  4、对供试菌株Bl-04的肽聚糖进行酸处理后,再与苯并芘进行吸附结合。结果表明,酸处理可以提高肽聚糖的苯并芘吸附率从75.96%到92.80%,证实酸处理使肽聚糖结构发生了一定变化,暴露了更多的结合位点,同时空间位阻发生变化。
  本次研究表明分子模拟结果与实验结果具有一致性,证明了肽聚糖结构是影响双歧杆菌的苯并芘结合能力和位点的关键。
  本研究旨在对双歧杆菌肽聚糖吸附苯并芘的过程进行阐释,为益生菌脱除致突变因子的应用提供依据。现已有相关益生菌产品在市面流通。
[博士论文] 王冬
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptides synthetases,NRPSs)和环二肽合成酶(cyclodipeptides synthetases,CDPSs)是微生物中的两种非核糖体肽合成酶类。经由NRPS途径合成的杆菌肽和经由CDPS途径合成的普切明酸是地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)中具有代表性的非核糖体肽类抗菌物质。但是,目前对于两种物质合成途径的转录调控还缺乏了解,阻碍了我们对菌株的杆菌肽和普切明酸应用潜力的挖掘。本论文以杆菌肽工业生产菌株B.licheniformis DW2为研究对象,通过基因重组技术、RT-qPCR、凝胶阻滞分析等方法,考察不同转录调控因子在杆菌肽及普切明酸合成过程中的作用,验证了Spo0A-AbrB-SigH调控系统在NRPS成途径中的地位,并首次较完整的揭示了芽胞杆菌中CDPS合成途径的调控网络。本研究得到的主要结论如下:
  1.Spo0A-AbrB-SigH调控系统对杆菌肽合成的调控作用
  bacT为假定的Ⅱ型硫酯酶基因,该基因的缺失不会影响杆菌肽合成酶操纵子bacABC的转录,但是会导致杆菌肽合成效率降低,并使杆菌肽产量下降83.01%,表明该假定的Ⅱ型硫酯酶(BacT)是杆菌肽合成酶系的组成部分。
  地衣芽胞杆菌中杆菌肽合成基因的转录受到Spo0A-AbrB-SigH调控系统的调控。AbrB是bacT和bacABC的直接负调控因子。在abrB基因缺失或者转录受到抑制的菌株(DW2ΔabrB、DW2Δ0AΔabrB、DW2Δ0A/pHY-sad67)中,bacT和bacA基因的转录水平都有不同幅度的提升,单位菌体的杆菌肽产量相比于DW2菌株分别提升19.32%、25.60%和24.15%。在abrB基因表达量较高的菌株(DW2Δ0A、DW2Δabr B/pHY-abrB)中,bacT和bacA基因的转录水都被抑制,杆菌肽合成停止。凝胶阻滞实验证明AbrB蛋白可以与bacT和bacA基因的启动子结合,表明AbrB是该基因的直接负调控因子。在DW2Δ0AΔabrB菌株基础上敲除sigH基因后,bacT、bacA基因的转录水平以及菌株的杆菌肽产量并未出现显著变化,表明SigH没有独立参与杆菌肽的合成调控。
  2.AbrB-YvnA-YvmB调控系统对普切明酸合成的调控作用
  abrB基因的缺失导致普切明酸的合成时间提前4h,产量相对于DW2菌株提升103.16%,yvmC、yvnA和yvmA基因的转录水平不同程度上调,而yvmB基因的转录则被抑制。DW2/pHY-abrB菌株的普切明酸合成停止,yvmC、yvnA和yvmA基因的转录被抑制,而yvmB基因的转录水平上升。凝结阻滞分析证实AbrB是yvmC-cypX基因簇和yvnA基因的直接负调控因子,而对yvmA和yvmB基因为间接调控。DW2ΔyvmB菌株中的普切明酸产量相比于DW2菌株提升60.12%,yvmC和yvmA基因的转录水平相对DW2上调。DW2/pHY-yvmB菌株无法合成普切明酸,yvmC和yvmA基因的转录也受到抑制。凝结阻滞实验证实YvmB是yvmC-cypX基因簇和yvmA基因的直接负调控因子。DW2ΔyvnA和DW2/pHY-yvnA菌株均不合成普切明酸,普切明酸合成基因簇的转录都受到抑制。但是在DW2ΔyvnA中yvmB基因转录水平上升,而在DW2/pHY-yvnA菌株中yvmB基因转录水平下降。在DW2ΔyvnA菌株中敲除yvmB后,菌株的杆菌肽合成能力恢复。凝胶阻滞实验证实,YvnA蛋白通过直接结合的方式抑制yvmC和yvmB的转录,并间接激活yvmA的表达。总体而言,AbrB、YvnA和YvmB皆为普切明酸合成操纵子yvmC-cypX的负调控因子,同时AbrB也是yvnA基因的直接负调控因子,而YvnA则是yvmB基因的直接负调控因子。
  YvmA蛋白则与普切明酸的分泌有关,yvmA基因的缺失会导致菌株细胞内普切明酸的积累增加。
  3.地衣芽胞杆菌的普切明酸免疫机制
  在各个菌株基础上构建其yvmC缺失的对照菌株,并考察各个菌株于对照菌株在不同FeCl3浓度下的细胞生长状况,证明在铁浓度较低(3mg/L-10mg/L的FeCl3)的环境下,过量合成的普切明酸会造成铁饥饿并抑制菌株自身的生长。进一步比较DW2、DW2ΔyvmB和DW2ΔyvnAΔyvmB菌株在0mg/L、5mg/L和20mg/L的FeCl3浓度下各个基因的转录水平变化证明菌株是通过调节YvnA的表达量来控制不同铁离子浓度下的普切明酸合成,并保护自身不受到铁饥饿。
[硕士论文] 林琴
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要包括链霉菌(一种放线菌)SH-62中羊毛硫抗生素生物合成基因簇的异源表达和中断以及雷纳霉素类似物生物合成基因簇中关键基因的敲除这两部分的内容:
  一、链霉菌SH-62中羊毛硫抗生素生物合成基因簇的研究
  羊毛硫抗生素是革兰氏阳性菌产生的,具有良好的抗革兰氏阳性菌的活性。有些羊毛硫抗生素还展现出潜在的抗肿瘤、抗病毒能力,具有较高的研究价值。在链霉菌SH-62的基因组中发现了一个潜在的羊毛硫抗生素生物合成基因簇(命名为lah)。为了研究lah基因簇的功能,本研究将包含有完整lah基因簇的4个BAC质粒15H2、21C4、21D6和21D7通过接合转移转入S.lividans ZX1和S.lividans ZAY3中,获得异源表达菌株。生物活性测定发现以S.lividans ZX1为宿主的异源表达菌株具有抗革兰氏阳性菌的能力,但是在敲除了放线紫红素、十一烷基灵菌红素和钙依赖型抗生素合成基因簇的异源宿主S.lividans ZAY3中lah基因簇没有产生抑菌活性物质。推测是阳性BAC质粒上其它的基因激发了宿主S.lividans ZX1中原本沉默的抗生素合成基因簇的表达。
  为了激活并提高lah基因簇的表达,将lah基因簇中所有关键的合成酶基因克隆到高拷贝的链霉菌自主复制型载体中,并安装了强启动子,构建出超表达质粒。并且将His-tag标签融合到lahA基因的C端,以便后期目标多肽化合物的纯化。
  同时,在原产生菌链霉菌SH-62中,成功构建了脱水酶基因lahB的中断菌株和用于敲除前体肽合成酶基因lahA的质粒,后续基因敲除突变菌株的筛选正在进行中。
  二、链霉菌SH-62中雷纳霉素类似物生物合成基因簇的研究
  雷纳霉素(leinamycin,LNM)是具有抗癌作用的一种大环内酯类抗生素,具有重要的临床价值。生物信息学分析发现链霉菌SH-62的基因组中有一个与LNM生物合成基因簇相似度很高的次级代谢产物合成基因簇(命名为lem),有表达出类似于雷纳霉素的次级代谢产物的可能。本研究对lem基因簇的异源表达菌株进行了生物活性测定和HPLC检测,证实有少量的抑菌活性物质产生,但未检测到异源表达产物的特征吸收峰,推测可能是因为异源表达产物的含量较低。
  同时通过同源重组双交换的方法,成功地在SH-62中敲除了lem基因簇中的关键合成酶基因lemL。目前通过TLC和HPLC分析尚未检测到野生型菌株SH-62和敲除突变菌株SH-62△lemL的代谢产物差异,后期需要进行更加细致的代谢物分析。
[硕士论文] 宋召军
遗传学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:空肠弯曲菌是革兰氏阴性微需氧细菌,是引起人类肠道疾病最常见的病原菌之一。近年来,由于抗生素的滥用,空肠弯曲菌对抗生素的耐药性一直在持续增强。世界卫生组织已将空肠弯曲菌列为重要的抗生素耐药细菌,迫切需求新型抗菌制剂。噬菌体是一种细菌病毒,它可以特异性识别并感染宿主细菌,在其体内大量复制,最终裂解杀死宿主菌。与抗生素相比,噬菌体产品具有使用简便、特异性强、增殖迅速、抗菌能力强等许多优点。
  本研究从鸡粪便和污水样品中分离筛选空肠弯曲菌噬菌体,鉴定噬菌体基础生物学特性和基因组特性。并探索空肠弯曲菌噬菌体最佳应用条件,初步评价噬菌体对空肠弯曲菌的消减效果。
  一、空肠弯曲菌噬菌体的分离和筛选
  以空肠弯曲菌NCTC11168为宿主菌,采用双层平板法,从1480份鸡粪便样品和污水样品中检测出244份阳性样品,其中粪便样品阳性率19.69%(189/960),污水样品阳性率10.58%(55/520)。经过筛选和纯化后,获得45株宽裂解谱空肠弯曲菌噬菌体。不同样品中噬菌体分离率和裂解谱差异明显,粪便样品(19.69%)噬菌体分离率高于污水样品(10.58%),但污水源噬菌体裂解能力强于粪便源噬菌体;活禽市场鸡粪便中的噬菌体分离率最高(43.46%),中小型肉鸡养殖厂鸡粪便中的噬菌体裂解能力最强;平养模式养殖的鸡粪便中的噬菌体分离率(36.74%)和噬菌体裂解能力均高于笼养(2.00%)和散养(7.00%)模式。裂解谱测定显示,45株噬菌体对于90株空肠弯曲菌分离株展现出了较强的裂解能力,其中对鸡源、人源、牛源空肠弯曲菌的裂解率分别为60.71%(34/56)、76.19%(16/21)、75.00%(6/8)。进一步分析裂解谱数据后,筛选出9株裂解谱不同的噬菌体CP7,CP13,CP15、CP23、CP32、CP33、CP35、CP39和CP47,其中CP39裂解率最高(53.33%),CP47裂解率最低(32.22%),CP7裂解谱与其它8株噬菌体差异最大,9株噬菌体组合后裂解率从最低的32.22%提高到70.00%。
  二、空肠弯曲菌噬菌体CP7和CP39生物学特性鉴定
  为深入了解空肠弯曲菌噬菌体基本生物学特性,明确噬菌体遗传背景和基因组特性,选取噬菌体CP7和CP39进行裂解谱测定、形态学鉴定、最佳感染复数测定、一步生长曲线绘制、热稳定性、酸碱耐受性以及基因组酶切分析等生物学特性鉴定。同时对噬菌体CP39进行了全基因组测序和功能注释,比较CP39与其它弯曲菌噬菌体的讲化关系。
  经透射电镜观察,噬菌体CP7和CP39属于肌尾噬菌体,均具有典型的弯曲菌噬菌体终端泡和空头。噬菌体CP7和CP39基因组大小相似,约为140kb,均属Ⅲ组弯曲菌噬菌体,基因组均能被限制性内切酶HindⅢ、HhaⅠ、DraⅠ、EcoRⅤ和TaqⅠ切开,其他限制性内切酶均不能消化。噬菌体CP7和CP39对pH耐受性较强,在pH值为3和12的环境中仍具有较高效价。噬菌体CP7和CP39最适宜温度均在50℃以下,但是CP7对高温的耐受性强于CP39。噬菌体CP7和CP39的潜伏期均为45min,CP7的裂解期120min,裂解量为354/cell,CP39的裂解期约60min,裂解量为177/cell。
  基因组测序显示,噬菌体CP39全基因组大小为130.715kb,G+C含量为26%。CP39全基因组共包含有168个ORF和3个tRNA,其中54个ORF功能已知,114个ORF为假想蛋白表达序列。通过主要衣壳蛋白构建进化树与现有的11株弯曲菌噬菌体比对分析发现,噬菌体CP39与Ⅲ组噬菌体在同一簇中,与噬菌体vB_CjeM_Los1在同一分支中;与Ⅱ组弯曲菌噬菌体亲缘关系较远。噬菌体CP39全基因组分析未发现携带抗生素耐药基因和毒力基因。
  三、空肠弯曲菌噬菌体CP7和CP39初步应用
  鉴定了噬菌体CP7和CP39基本生物学特性后,通过多个单因素实验,探索噬菌体的最佳使用条件,分别摸索出噬菌体最佳作用时间为4h,最佳使用效价为1×1010pfu/ml,最佳作用温度为25℃。在此基础上,测定噬菌体对鸡粪便样品中的空肠弯曲菌消减效果。消减实验结果表明,噬菌体对弯曲菌的消减量在1-5log之间。200份样品中,37.5%(75)的样品消减量在5log左右,弯曲菌平均含量降至0.15lg cfu/g;57.0%(114)的样品消减量在2log左右,弯曲菌平均含量降至3.46lg cfu/g;5.5%(11)的样品消减量在1log左右,弯曲菌平均含量降至4.71lg cfu/g。
[博士论文] 张琰
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated)系统是原核生物所特有的一种后天免疫系统,广泛存在于古菌和细菌中,能够抵御质粒、病毒等外源遗传物质的入侵。每套CRISPR-Cas系统至少包括CRISPR簇和cas基因两个遗传单位。在最新的分类中,CRISPR-Cas系统被分为两大类,六种不同的主要类型。其中,只有Ⅲ型CRISPR-Cas系统既具有RNA切割活性又具有DNA切割活性,是目前已知的唯一具有双核酸干涉活性的CRISPR-Cas系统。之前研究表明,冰岛硫化叶菌REY15A菌株的Ⅲ-B型Cmr-α系统能够规律间隔6nt切割靶标ssRNA,且crRNA一旦与同源的靶标RNA结合,被激活的三元复合体(Cmr-α∷target RNA)显示出很高的非特异性ssDNA切割活性。而Cmr-α系统的这种双核苷酸切割活性是如何被调控的,至今还有许多未知。本论文经研究认为,Cmr1α能够作为一个整合激活模块来增强Cmr-α系统的核酸干涉活性,而Cmr4α在Cmr-α系统免疫过程中复杂激活的时空调控中发挥重要作用。
  为了研究Cmr复合体的非必须亚基Cmr1的功能,本研究在冰岛硫化叶菌(S.islandicus REY15A)中首先构建了一个缺失突变株ΔβΔ1α。体内干涉活性分析表明,ΔβΔ1α缺失突变株仍然能够干涉靶标RNA和入侵质粒,但其活性都大大降低,但仍可以从ΔβΔ1α缺失株中纯化得到不含有Cmr1α的稳定核心核酸蛋白复合体Cmr-αΔ1(Cmr2α-6α)。体外生化分析发现,Cmr-αΔ1复合体中的crRNA发生大量降解,但是仍然具有微弱的切割ssRNA和ssDNA的活性,与体内的干涉活性相一致。经过保守氨基酸和蛋白结构模拟分析显示,Cmr1αN端的第一个α-螺旋上的氨基酸相当保守,并位于Cmr1α蛋白的表面凹槽内。分析部分保守氨基酸的体内体外数据表明,Cmr1α的两个保守疏水氨基酸(W58和F59)对体内的入侵质粒沉默活性和体外切割DNA的影响较大,主要负责Cmr1α与靶标RNA的结合;另外四个高度保守氨基酸(I52,G54,R57和R61)则对靶标RNA的体内干涉活性和体外切割活性影响更大,主要负责Cmr1α与crRNA的结合。Cmr1α虽然不是Cmr-α复合体所必须的,但是一旦与核心复合体结合,能够大大增强Cmr-α复合体依赖于crRNA与目标RNA结合的核酸干涉活性。此外,Cmr1的存在与微生物嗜热生活方式的相关性,也反映了Ⅲ型CRISPR-Cas系统的进化适应性。
  Cas10蛋白家族(Csm1和Cmr2)作为Ⅲ型CRISPR-Cas系统的特征蛋白,其两个保守结构域分别负责非特异性ssDNA切割和激活非特异性ssRNA切割的第二信使cOAs合成。该第二信使能够激活Csx1的CARF结构域而大量非特异性降解ssRNA。本研究数据表明,当靶标RNA表达不活跃时,Cmr2α的Palm2结构域起主要沉默作用;而当靶标RNA表达活跃时,Cmr2α的HD结构域的活性显著增强,也会致死宿主细胞。
  Cmr4作为Ⅲ-B型Cmr复合体的大亚基骨架蛋白,对于复合体的组装和稳定性非常重要。通过选取一些Cmr4同源蛋白进行多序列比对,本研究确定了一系列保守的功能氨基酸残基。通过体内活性分析,结果显示突变这些SisCmr4α保守氨基酸会严重影响Cmr-α系统的体内干涉活性。通过纯化来自突变体的效应复合物时,发现只有从Δβ4α-D83A和Δβ4α-H16A两个突变株中才能纯化得到稳定的Cmr-α复合体。这表明大多数cmr4α的突变可能会影响效应复合物的结构。此外,本研究得到的突变效应复合物中,只含有3个Cmr4α的小复合体的比例较高,而野生型Cmr-α效应复合物中含有4个Cmr4α的大复合体的比例较高,但突变复合体与野生型复合体在体外切割核酸的模式一致。
  为研究由Cmr4α_D27A突变对细胞的致死,我们在Δβ4α-D83A突变株基础上成功突变D27A得到双突变株Δβ4α-D27/83A,却无法从双突变株中纯化得到完整的Cmr-α复合体。这说明D83A点突变很可能影响了Cmr-α复合体的稳定性,或者D27A突变加剧了复合体的不稳定性。Cmr2α的HD结构域和Palm2结构域均突变的菌株,既失活了DNase活性也失活了c-A4的合成活性,从而可以在该双突变株体内成功突变Cmr4α_D27A。结合凝胶迁移阻滞结果分析可知,该突变株呈现出独特的Cmr-α复合体和靶标RNA结合模式。这一结果为进一步研究靶标RNA的结合、切割以及产物释放提供了重要的依据。
  Ⅲ型CRISPR-Cas系统被公认为是一个需要靶标RNA激活的免疫系统。它能够依赖于靶标RNA与crRNA的结合,激活非特异性ssDNA切割,并在切割靶标RNA并释放产物后,失活DNase活性。因此,Ⅲ型系统的核酸蛋白复合物切割非特异ssDNA的速度非常快,并通过切割靶标RNA而失活自身沉默活性来避免“自我免疫”。Cmr4α_D27A突变后,Cmr-α突变复合体不能有效切割靶标ssRNA,复合体始终被激活而不断大量地切割非特异性ssDNA,对自身基因组造成不可逆损伤,从而导致宿主细胞死亡。综合以上结果表明,Cmr4α在Cmr-α免疫过程中对Cmr-α的核酸酶活性和环化酶活性的时空调控起着至关重要的作用。
[博士论文] 许剑
微生物学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:重金属铜是微量营养元素之一,低浓度的铜对生物体生长是必须的,但高浓度的铜却有着毒害作用。微生物中对于铜抗性机制的研究大都集中于细菌和酵母,相关机理已经透彻。丝状真菌具有很高的重金属抗性,与工农业生产和人类健康水平密切相关。铜的抗性机制对该菌的防控和利用具有重大现实意义。目前对丝状真菌的铜抗性机制的尚不清楚,国内外对丝状真菌的铜抗性分子机制相关报道较少,鉴于丝状真菌铜抗性的重要性,有必要对其进行深入研究。
  本研究对高抗多种重金属的微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株GXCR和铜抗性下降的2个突变体EC-6和UC-8进行一系列生理生化实验。结果分析发现,抗铜能力按大小排序依次为WT>UC-8>EC-6。在未添加铜的PDA和TYA培养基上,3个菌株均能正常生长,并且快速产孢;在添加铜离子后,3个菌株的菌落直径急剧变小,产孢量下降。在一定浓度的铜胁迫下,2个突变体已经不形成假根(营养菌丝),而野生型WT在高浓度铜培养基上依旧能够生长,此时只有极少假根形成,说明野生型WT吸收营养物质能力强于突变体。TYA培养基营养物质较少,在添加铜离子的情况下,3个菌株的气生菌丝已经开始出现析铜现象。此外,锰离子添加可以提高菌株铜抗性。外源脯氨酸可以增强菌株抗铜能力,说明脯氨酸在微紫青霉菌的抗铜机制有着关键作用,而对3个时期的3个菌株菌体内脯氨酸含量的测定也验证了这点。添加外源ATP可以增强菌株在铜胁迫的生长能力,而ATP酶抑制剂正钒酸钠则降低菌株铜抗性。铜胁迫下,野生型WT的生物量大于2个突变体。在孢子萌发率实验中,不同重金属对菌株的孢子萌发有着不同的影响,野生型WT的孢子萌发能力强于2个突变体。菌株胞内活性氧在逆境条件下会增加,其含量的变化跟抗氧化酶SOD,POD,CAT的活性高低和胞内MDA含量有着紧密联系,且随着铜浓度的增加呈规律变化。
  对菌株在重金属逆境胁迫的胞内重金属含量的检测发现,铜胁迫下,野生型WT胞内铜离子含量低于2个突变体。在铜锰联合胁迫下,3个菌株的胞内铜离子显著下降,锰离子含量随着浓度的增加而减少,镉胁迫下,3个菌株胞内镉含量随着浓度的增加而升高,0.03mM Mn2+处达到最高随后降低。在此过程中,野生型WT胞内镉含量低于两个突变体。铬胁迫下,3个菌株胞内铬含量随着浓度的增加而升高,野生型WT的胞内铬含量在3、4、5mMCr2+大于2个突变体。与此相反的是铅胁迫下,胞内铅含量随着浓度的增加呈下降趋势。
  在生理生化实验结果的基础上,本研究添加0、0.5和3mM Cu2+的TYB中野生菌株WT和EC-6的6个样本进行转录组测序。获得47407个长度大于100bp的转录本,分析处理后最终得到32585个Unigene。通过数据筛选:1、在非铜胁迫处理下,一共有13802个DETs,其中6853个下调,6949个上调;2、在0.5mM Cu2+处理下,一共有15359个DETs,其中7099个下调,8260个上调;3、3mM Cu2+处理下,一共有23634个DETs,其中8211个下调,15423个上调。为了进一步确保转录组测序数据的可靠性,选取38个铜抗性相关的基因,使用实时荧光定量PCR进行验证,符合预期结果。通过权重基因共表达网络对转录组数据进一步分析,将基因聚类划分成10个表达模式相似的10个模块,结合生理生化实验结果,关联到10个性状,选取相关性最高的四个模块构建网络图,找出116个核心基因。
  最后,通过对微紫青霉菌野生型和突变体铜抗性实验结果,转录组测序数据,权重基因共表达网络分析结果进行拟合和关联分析,确定了丝状真菌高抗铜的主干通路,信号系统和决定因素,并在模型中进行了讨论和概述。
[硕士论文] 舒成城
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着测序技术的高速发展,测序成本不断下降,通过高通量测序技术并结合多种组学,能够更好地研究微生物内的合成调控机制,有助于找到微生物中不同表型差异的原因,也可为一些工业菌株的改造提供数据和理论支持。
  地衣芽孢杆菌是一种常见的工业菌株,能够产生多种氨基酸类和肽类的抗生素,因此被广泛应用在农业生产,生物制药以及工业制造等多个邻域。本研究中的地衣芽孢杆菌DW2菌株在正常条件下可以合成分泌一种次级代谢产物——杆菌肽。杆菌肽是一种非核糖体合成酶合成的多肽类抗生素,能够通过阻止细胞壁的合成而具有抗革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌活性。另外,之前的研究表明,敲除转录因子AbrB能够增加地衣芽孢杆菌杆菌肽的产量,因此,本研究通过结合基因组信息和转录组表达信息,综合分析地衣芽孢杆菌DW2的基因组信息,野生菌株和敲除菌株之间的表达差异以及杆菌肽生物合成调控是非常有意义的。本文研究的主要内容和结果如下:
  1.地衣芽孢杆菌DW2基因组组装和注释
  本研究采用PacBio SMRT测序技术对地衣芽孢杆菌DW2进行全基因组测序,获得原始测序数据约为674Mb,过滤之后测序数据约为500Mb,基因组测序深度约为100×。组装得到基因组大小为4,468,952bp,GC含量约为45.93%。通过基因组注释,获得4,717个蛋白质编码基因,24个rRNA基因和81个tRNA基因。此外,借助PacBio测序数据,还分析了地衣芽孢杆菌DW2的甲基化修饰情况,结果显示在基因组中存在2个6mA的甲基化motif。
  将本研究的地衣芽孢杆菌DW2与地衣芽孢杆菌DSM13,地衣芽孢杆菌WX-02及地衣芽孢杆菌9945A进行比较基因组分析。全基因组共线性比较分析结果表明,地衣芽孢杆菌DW2与地衣芽孢杆菌9945A的基因组共线性最好。同时发现,地衣芽孢杆菌DW2在基因组3.3Mb-3.4Mb存在一个长约80Kb的特异片段,根据功能注释结果推测,这个特异片段可能与地衣芽孢杆菌DW2高产肽类抗生素等生理机制有关。
  2.地衣芽孢杆菌DW2的转录组分析
  本研究采用链特异性RNA-Seq技术测得地衣芽孢杆菌DW2野生菌株与敲除菌株在对数生长期(14h),过渡态时期(22h)以及稳定期(25h)三个时间点的转录表达谱。RNA-Seq测序总共获得42.94Gb原始测序数据。基于转录组数据,通过DEseq软件分析比较了野生菌株和敲除菌株的差异表达基因,发现不论是野生菌株还是敲除菌株,差异表达基因的总数都随着培养时间的增加而增加,这表明有更多的基因在细菌的稳定期被激活或者参与到更多的生物调控。通过COG功能分类和KEGG富集,分析得到多数的差异表达基因主要涉及到氨基酸的代谢和转运,氧化磷酸化,碳代谢,细胞运动等代谢途径。
  通过分析,在地衣芽孢杆菌DW2中得到一个完整的杆菌肽合成基因簇。通过分析基因簇中基因的转录表达变化,发现转运基因bcrABC在敲除菌株中显著上调表达,这既支持了之前研究中地衣芽孢杆菌通过转运基因将合成好的杆菌肽运出细胞以避免自我中毒,也从侧面证实了敲除菌株可以产生更多的杆菌肽。
  本研究通过高通量测序技术,全面分析了地衣芽孢杆菌DW2的基因组和转录组,为地衣芽孢杆菌DW2提供了高质量的参考基因组,并根据转录表达数据展现了两个菌株和三个时间点全局的表达变化,能够为杆菌肽生物合成与转录因子AbrB的调控提供认识。
[硕士论文] 齐蕊名
兽医学;预防兽医学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:乳杆菌作为公认的安全级微生物,具有促消化、抗菌、增强免疫力等多种益生功能,广泛应用于食品工业、医药工程和畜牧业,其中植物乳杆菌、干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌较为常用。在发酵工程中,噬菌体的污染可造成不可忽视的后果,严重影响产品品质,甚至导致发酵失败。
  本研究通过噬菌体富集法从酸菜中分离出两株烈性乳杆菌噬菌体,分别命名为LpeD和Lpa804,并对这两株噬菌体进行了生物学特性的鉴定。通过电镜观察,噬菌体LpeD和Lpa804均具有典型的二十面体头部和非收缩性尾部,均属于尾噬菌体目、长尾噬菌体科。根据宿主范围测定结果,噬菌体Lpa804可感染植物乳杆菌(L.plantarum PA106和L.plantarum SC),而噬菌体LpeD可感染戊糖乳杆菌(L.pentosus KLDS1.0413)和植物乳杆菌(L.plantarum KLDS1.0344)。一步生长曲线的测定结果显示,噬菌体LpeD的潜伏期为15min,裂解期为90min,裂解量为194PFU/cell;噬菌体Lpa804的潜伏期为30min,裂解期为105min,裂解量为221PFU/cell。理化因素对噬菌体的影响结果表明,噬菌体LpeD和Lpa804均对热敏感,LpeD在56℃作用2min全部失活,Lpa804在63℃作用2min全部失活。噬菌体LpeD和Lpa804在pH4-12的环境中较为稳定,显示了较强的酸碱耐受性。紫外线照射并不能使噬菌体LpeD和Lpa804完全灭活,二者在紫外线照射20min后均仍有部分噬菌体颗粒存活。噬菌体LpeD和Lpa804对乙醇和异丙醇较敏感,35%乙醇作用10min可使LpeD全部失活,25%乙醇作用10min可使Lpa804全部失活。35%异丙醇作用10min可使LpeD全部失活,25%异丙醇作用10min可使Lpa804全部失活。
  通过分析不同理化因素对噬菌体吸附作用的影响,结果显示,镁离子对噬菌体LpeD和Lpa804的吸附有促进作用;噬菌体LpeD和Lpa804在pH4-8时吸附率变化不明显,但pH为9-10的环境可使噬菌体LpeD的吸附率下降20%,使Lpa804吸附率下降15%;与活性宿主菌相比,噬菌体LpeD在热灭活的宿主细胞上的吸附率下降50%,Lpa804下降30%;通过改变温度测定噬菌体的吸附效率,结果显示,温度为25℃时,噬菌体LpeD的吸附效率最高,温度为4℃时,噬菌体Lpa804的吸附效率最高。通过酶和化学方法处理细胞壁,噬菌体LpeD在经三氯乙酸处理后的细胞壁上吸附率明显下降,噬菌体Lpa804在经溶菌酶处理后的细胞壁上吸附率明显下降,由此推断,Lpa804的吸附受体是肽聚糖,噬菌体LpeD的吸附受体是与肽聚糖类相连的细胞壁聚合物。
  此外,本研究对噬菌体LpeD和Lpa804进行了全基因组测序及序列分析。噬菌体LpeD是第一个获得全基因组序列的戊糖乳杆菌噬菌体,其基因组全长为145162bp,GC含量为34.11%,包含182个开放阅读框(ORF)。噬菌体Lpa804的基因组全长为142567bp,GC含量为36.62%,包含185个开放阅读框。两个噬菌体基因组均分为四个模块,分别为DNA复制调节模块、裂解模块、溶源模块和结构蛋白模块。通过进化分析发现,噬菌体LpeD和Lpa804与植物乳杆菌噬菌体LP65之间的亲缘关系最近。且经共线性比对分析,LpeD和Lpa804之间相似度为79.68%。
  综上,噬菌体LpeD和Lpa804均为新型乳杆菌噬菌体,且两株噬菌体之间同源性较高。通过分析两株乳杆菌噬菌体的生物学特性,可为防御噬菌体感染以及构建和筛选抗噬菌体菌株提供重要的实验数据和理论依据。噬菌体全基因组的测序分析有助于了解乳杆菌噬菌体的多样性,并为噬菌体进行基因表达等遗传操作奠定理论基础。
[硕士论文] 杨越
应用化学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:链霉菌属于放线菌,其次级代谢能力非常强大,代谢形式更是繁复多样,其可以提供丰富的天然产物,被广泛应用于人类医学,动物健康和植物作物保护。但是对链霉菌的代谢路径、生物合成基因簇功能的了解还是相对有限,通过对微生物代谢组学的分析,可以对链霉菌的细胞功能有更深层次的了解。
  (1)目前,代谢物的识别和鉴定是代谢组学进展最重要的限制因素之一,建立代谢物二级质谱数据库可以有效地促进代谢组学的发展。利用HPLC-Q-TOF高分辨质谱对模式菌株白色链霉菌(Streptomyces albus)的代谢产物进行检测,然后通过二级质谱(Auto ms/ms)对代谢物的结构进行鉴定,从而建立基础的白色链霉菌代谢物质谱数据库。通过实验本文共获得了1188个二级质谱谱图,297种无重复的化合物二级质谱数据,鉴定了其中52种代谢产物。此数据库为后续分析白色链霉菌以及其为宿主的异源表达菌株的代谢差异和研究SF2768生物合成基因簇功能奠定了坚实的基础。
  (2)SF2768为双异腈天然活性物质,具有潜在应用价值。本章研究旨在揭示SF2768的生物合成途径,寻找可能的生物合成前体,解释其生物合成基因簇的功能。首先,本文比较了野生型白色链霉菌与异源表达菌株S.albus∷pZMY13C的代谢差异,以确认只有异源表达菌株可以产生SF2768。随后,利用代谢组学多组比较的方法分析△sfaA、△sfaB、△sfaC、Δs faD这4个基因中断菌株与异源表达菌株S.albus∷pZMY13C代谢差异(前人研究结果表明△sfaA、△sfaB、ΔsfaC、△sfaD和△sfaE这5个基因敲除后会完全阻断抗生素SF2768的生物合成),以寻找SF2768可能的合成前体。通过实验发现谷氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯基甘氨酸、氨基丁酸和烟碱酸为SF2768生物合成途径中的关键代谢物。为了进一步确证我们的结果,在异源表达菌株S.albus∷pZMY13C发酵过程中添加这6种化合物,并检测SF2768的产量变化。同时添加等量的6种可能前体物质后,苯基甘氨酸会极大程度上调SF2768产量,最有可能为SF2768的生物合成的前体物质。
  (3)在前期利用代谢组学的方法探究SF2768生物合成基因簇功能的过程中,本文建立了相对成熟的代谢组学分析方法。由此,利用该方法对系列以白色链霉菌为宿主的异源表达菌株进行代谢组学分析,寻找宿主与异源表达菌株间的代谢差异,以提高抗生素的产量,指导其生物合成或发现新天然产物。这些菌株包括S.albus、S.albus∷pZAY10A3、S.albus∷pZAY23F11,它们分别产肠菌素、全霉素等抗生素。通过LC-MS对上述菌株进行代谢产物扫描,均检测到目标代谢产物,并进行野生菌株与各异源表达菌株代谢差异分析,发现了影响异源表达的重要差异代谢物。
  本文以HPLC-HRMS进行白色链霉菌的代谢组学分析,建立了白色链霉菌代谢物的质谱数据库,开展了以白色链霉菌为宿主的异源表达菌株代谢物差异分析,这对SF2768生物合成基因簇的功能分析和新型抗生素发掘等研究均具有重要意义。
[硕士论文] 易磊
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本实验从污染的黑曲霉平板上分离到一株菌,该菌对黑曲霉有很强抑制效果。通过平板对峙法和牛津杯法检测到了该菌的发酵液对各种植物病原菌如立枯丝核菌和水稻黄单胞菌等有很明显的抑制效果。由此可知该菌在农业植物病防治和水果保藏方面有重要的应用价值。为进一步了解该菌,本论文通过分类学、生物信息学、分离纯化和初步鉴定等技术对该菌进行了阐述,其研究内容如下:
  1.从基因型特征上,确定了所分离获得的菌株YL1为Bacillus velezensis。16S rDNA序列比对结果显示:其与Bacillus velezensis CR-502相似度为99.85%。通过基因组中平均核苷酸一致性(ANI)比对发现:该菌株与Bacillus velezensis CR-502同源性为98.29%,确定该菌株与Bacillus velezensis CR-502为同一个种。由于菌株不同,将此菌株命名为Bacillus velezensis YL1。
  2.获得Bacillus velezensis YL1全基因序列并预测其可能产生的抗生素。通过第二代基因组测序拼接获得该菌株的基因组草图,然后利用antismash网站对基因组进行分析,与已知的抗生素合成基因进行对比,预测其可能产生抗生素的基因和种类,对比发现该菌株基因组中含有完整合成Bacillibactin、Bacilysin以及聚酮类物质Bacillaene和Macrolactin的基因,还有一些基因与脂肽类Fengycin和Surfactin合成基因相似度很高,另外还发现了一些未知产物如萜类和聚酮类的合成基因。
  3.探索了发酵液中对水稻黄单胞菌有抑制作用的物质的性质。发现该发酵液产生的抗水稻黄单胞菌物质在100℃高温下处理2h后活性并无明显降低;当发酵液pH分别调至2-10的范围内并处理4h后,其活性无较大变化:该发酵液内抗水稻黄单胞菌的物质对胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。此外,该成分能溶于多种有机试剂,如甲醇、乙酸乙酯和乙腈,不溶于石油醚。
  4.分离纯化到了该菌产生的多种抗生素。实验先通过浓缩发酵液后用甲醇浸提蒸干后的发酵液,然后利用高效液相色谱(HPLC)确定活性物质的出峰时间:发现该菌并不只产生一种抗生素。进一步用乙腈萃取可将抗细菌的物质提取出来,然后利用HPLC进一步纯化,得到纯度较高的抗水稻黄单胞菌的活性物质;由于抗真菌物质极性较强,采用羟丙基葡聚糖(LH-20)凝胶柱对甲醇浸提物质进行了初步纯化,再利用HPLC进一步纯化,得到纯度较高的活性物质。
  5.确定了抗真菌抗生素为Surfactin。通过LC-MS测得抗真菌物质分子量为1044.56和1058.57,抗细菌物质的分子量为447.24。通过对基因组代谢产物的预测和自然产物词典数据库中比较推测:分子量为1044.56和1058.57分别为脂肽Surfactin的两种衍生物;分子量为447.24的物质并未在基因组预测的物质中并未发现类似的分子量物质,天然产物数据库中也未找到类似性质的物质,还需要进一步实验确定。
  上述研究为Bacillus velezensis在农业微生物病虫害防治的开发应用奠定了基础,为全面认识Bacillus velezensis提供了理论依据。
[硕士论文] 朱思琦
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:聚酮化合物种类繁多,通常具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性,因而引起人们的广泛关注。聚酮化合物的碳链骨架由聚酮合酶催化。不同类型聚酮化合物生物合成途径的揭示,将为未来发现乃至创造新型聚酮化合物的研究指明方向。本研究以两个聚酮合酶基因簇为研究对象,利用遗传学、分子生物学、生物化学的研究方法,对基因簇的功能及调控进行了探索。
  1链霉菌SH-62基因组中聚酮合酶基因簇cluster9的研究
  来自链霉菌SH-62的聚酮合酶基因簇cluster9属于Ⅰ型PKS,与数据库中已知的天然产物合成基因簇同源性较低,可能是一个新的天然产物生物合成基因簇。包含有聚酮合酶基因簇cluster9的BAC质粒在Streptomyces albus中异源表达产生3个疑似的代谢产物。为了检测这3个化合物与cluster9的相关性,采用两种基因组编辑方法,包括λ-Red介导的PCR-targeting系统和CRISPR/Cas9-CodA(sm)系统,对cluster9中的核心pks基因进行了敲除。发现核心基因的敲除没有影响3个化合物的合成,说明它们并不是cluster9的异源表达产物。
  2Aureothin生物合成基因簇中调控因子AurD的研究
  Aureothin是具有良好生物活性的硝基芳香类抗生素,在其生物合成基因簇中只发现了一个潜在的转录调控因子aurD。敲除aurD基因会阻断aureothin的合成过程,而aurD基因的回补实验一直无法成功。考虑到aurD基因的过量表达可能会影响细胞的生长,因此本研究采用了基因原位回补的方法,将安装有组成型强启动子PermE*的aurD基因重新插入到原基因的敲除位点,成功获得了基因回补突变菌株。回补菌株的发酵产物分析证实aurD基因的回补能够恢复aureothin的产生,并且因为组成型强启动子增强了aurD基因的表达使得aureothin产量显著提升,进一步地证实了aurD对aureothin生物合成的正调控效应。
  AurD具有一个OmpR类DNA结合结构域和一个细菌转录激活结构域,属于SARP家族转录调控蛋白。为了研究AurD蛋白的调控机制,分别在大肠杆菌和链霉菌中超量表达AurD蛋白,在链霉菌中,AurD蛋白的表达量很低;在大肠杆菌中,AurD蛋白主要以包涵体形式存在。未来需要在表达系统和条件上进行进一步的优化。
[硕士论文] 熊海涛
微生物学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌,革兰氏阳性菌,是一种重要的工程菌株,广泛用于工业上脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶的生产。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种模式菌株,具有非致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,因此是异源蛋白分泌表达的理想宿主。现有的枯草芽孢杆菌启动子不足以满足工业上利用枯草芽孢杆菌大量表达外源基因的要求,因此寻找新型的可以在枯草杆菌中表达可控的强启动子是非常必要的。
  本课题目的在于探索一种新的筛选芽孢杆菌启动子的方法,通过SDS-PAGE和生物学软件分析芽孢杆菌中筛选启动子,成功获得了具有启动活性的组成型启动子BSP3和诱导型启动子BSP5B,以Saccharomonosra viridis中的麦芽糖α-淀粉酶为报告基因,构建重组质粒pHCMCO4-BSP3-sva和pHCMCO4-BSP5B-sva分别转入B.subtilis1A857中表达。结果显示BSP3和BSP5B均能在枯草芽孢杆菌中表达SVA基因,通过DNS法测的胞外发酵液最高粗酶活分别为16.248U/mL、21.758U/mL。
  本研究以现有的组成型强启动子P43为基础,与克隆得到的组成型启动子BSP3进行核心保守区域的替换杂交。分别得到杂交载体BSP3D2-sva、BSP3D3-sva、XL3-sva、XL4-sva、XL5-sva、XL6-sva,转入B.subtilis1A857中,每隔12h取样测定SVA的酶活及OD600,测得发酵液最高粗酶酶活分别为19.924U/mL、19.063U/mL、14.982U/mL、20.578U/mL、26.142U/mL、17.538U/mL,OD600值分别为4.308、3.592、3.35、3.35、6.418、4.672,单位生物量含有的粗酶酶活单位分别为4.624U/mL、5.307U/mL、4.470U/mL、5.036U/mL、4.073U/mL、3.754U/mL。BSP3D3-sva表达效果较佳是原BSP3启动子表达活性的1.11倍。XL4-sva表达效果是P43启动子表达活性的1.44倍。说明集中不同启动子的优势核心保守区域,可以优化启动子的结构提高启动子的转录效率。
  本课题在成功构建的表达载体pHCMCO4-BSP5B-sva的基础上,对诱导型启动子BSP5B的核心保守区域定点突变,得到突变载体BSP5B-35A-sva、BSP5B-10A-sva、BSP5B-10B-sva、BSP5B-35C-sva、B SP5B-10C-sva,转入B.subtilis1A857表达测得SVA发酵液最高粗酶酶活分别为21.991U/mL、23.595U/mL、31.156U/mL、43.228U/mL、35.981U/mL,OD600值分别为5.115、4.992、5.28、5.318、4.592,单位生物量含有的粗酶酶活单位分别为4.299U/mL、4.793U/mL、5.899U/mL、8.130U/mL、7.836U/mL。突变体BSP5B-35C-sva、BSP5B-10C-sva突变优势明显,表达活性是原BSP5B启动子的1.75倍、1.69倍。该实验结果显示,突变启动子核心保守区域会改变启动子的转录活性,将启动子的核心保守区域定点突变为经典启动核心保守区域会提高启动子的转录活性。
[博士论文] 吕玲玲
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:罗布泊及周边极端高盐碱环境蕴藏着丰富多样的嗜(耐)盐放线菌资源,是挖掘放线菌物种多样性、生物活性多样性、次级代谢产物多样性和嗜(耐)盐机制的宝藏。本论文采用可培养法对罗布泊及其周边23份高盐碱土壤样品进行了放线菌物种的分离、收集、保存和16S rDNA聚类分析,获得了262株嗜(耐)盐放线菌,其中有13株潜在新种;分离并鉴定了6个放线菌新物种;对获得全部菌株进行了耐盐特性、抗菌活性以及PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS和APH等抗生素生物合成基因簇的筛选研究;从6株放线菌发酵液中分离鉴定了13个单体化合物;同时采用转录组比较分析法对一株极端嗜盐放线菌的盐胁迫响应机理进行了初步探索。具体研究结果包括:
  1.罗布泊及其周边盐碱土嗜(耐)盐放线菌多样性研究
  从23份土样中共分离获得了262株嗜(耐)盐放线菌,5株为耐盐放线菌,257株为嗜盐放线菌,发现放线菌潜在新种13个,可能代表新的分类单元。通过16SrDNA聚类分析,将所获放线菌归属于4亚目5科8属,分别为放线多孢菌属(Actinopolyspora)、糖霉菌属(Glycomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、链单孢菌属(Streptomonospora)、链霉菌属(Streptomyces)和拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)。其中,拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)是罗布泊盐湖的主要类群,占该区域分离获得菌株的37.04%,放线多孢菌属(Actinopolyspora)是罗布泊周边盐碱土的主要类群,占该区域分离获得菌株的25.20%。
  2.放线菌新物种的多相分类
  采用多相分类方法鉴定了6株放线菌新物种。其中,放线菌TRM45123为糖多孢菌属新物种,命名为耐盐糖多孢菌(Saccharopolyspora halotolerans);放线菌TRM45387、TRM45198和TRM45127为糖霉菌属新物种,分别命名为塔里木糖霉菌(Glycomyces tarimensis)、新疆糖霉菌(Glycomyces xinjiangensis)和罗布泊糖霉菌(Glycomyces lopnorensis);放线菌TRM45668和TRM45658为嗜盐多孢菌属新物种,分别命名为塔里木嗜盐多孢菌(Halopolyspora tarimensis)和罗布泊嗜盐多孢菌(Halopolyspora lopnorensis)。
  3.抗生素合成基因和抗菌活性筛查
  262株放线菌PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS和APH基因的筛查结果表明,阳性率分别为46.94%、25.57%、22.90%、21.76%。四种功能基因在不同种属之间的分布存在一定差异,PKSⅠ、PKSⅡ基因在各个属都有分布,PKSⅡ基因较PKSⅠ基因分布明显要少,而且绝大多数含有PKSⅠ基因的菌株不含有PKSⅡ基因;NRPS基因主要分布在Actinopolyspora和Streptomyces;APH基因分布于Glycomyces和Nocardiopsis。262株放线菌的生物活性检测得出,有75株放线菌至少对一种病原菌具有拮抗作用,阳性率为28.6%。这些菌株分布于Streptomyces、Nocardiopsis、Actinopolyspora、Saccharopolyspora、Glycomyces、Streptomonospora和Saccharomonospora,阳性率分别为14.5%、8.4%、7.3%、1.1%、1.1%、0.8%和0.4%;活性菌株以Streptomyces最多,而这些活性菌株大部分均含有一种或一种以上的抗生素生物合成基因。
  4.放线菌次级代谢产物的分离纯化与结构鉴定
  采用现代色谱分离技术和核磁共振(NMR)等波谱鉴定技术,从6株放线菌活性菌株发酵液中分离鉴定了13个化合物,分别鉴定为3,4-二氢-6,8-二羟基-3-甲基异香豆素(45037-1)、2-甲基-1,4-苯二醇(45037-2)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)二酯(45037-3)、1,6-二羟基吩嗪(45037-4)、16α-甲基-11β,17α,21-三羟基-9α-氟孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮21-醋酸酯(45306-1)、谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(45306-2/45556-3)、Nb-乙酰色胺(45306-3/45380-1)、N-丙酰色胺(45306-4)、4',7-二羟基异黄酮(45556-1)、4',5,7-三羟基异黄酮(45556-2/45214-1)、大豆皂醇B(45214-2)、1-庚基-2-甲基-3-羟基咔唑(45040-1)和8-庚基-4,5,6-三羟基酞酸(45040-2)。这些化合物均首次从这些菌株的次级代谢产物中分离获得。
  5.一株嗜盐放线菌的盐胁迫响应机理初探
  菌株TRM45611在8%(最低盐浓度生长)、17%(最适生长盐浓度)和25%NaCl(最高盐浓度生长)浓度下转录组比较分析结果表明:以8%NaCl组为对照组,17%NaCl组和25%NaCl组与对照组相比,从生物过程分类中显示菌株在盐胁迫过程中有细胞代谢、生物调节和次级代谢产物等过程参与;在细胞组分分类中显示菌株的盐胁迫与细胞器,还有大分子化合物,如蛋白质、核酸、糖类或脂类的运输代谢等密切相关,同时,这些代谢过程在菌株耐盐中起着重要作用;在分子功能分类中显示菌株的盐胁迫响应机制中,结构分子活性、酶催化活性和分子转运活性也密切相关。不同盐浓度条件下的差异表达基因的比较发现,以8%NaCl组为对照组时,17%NaCl组表达量上调的基因有78个,表达量下调的有155个;25%NaCl组表达量上调的基因有383个,表达量下调的有302个。
  综上所述,本论文在分离并鉴定嗜(耐)盐放线菌的基础上,初步揭示了新疆罗布泊地区嗜(耐)盐放线菌的物种多样性和主要类群;评价了抗生素功能基因多样性、抗菌活性和耐盐特性;在抗生素生物合成基因和生物活性双重评价基础上分离鉴定了部分菌株的次生代产物;同时在转录组水平上探讨了一株极端嗜盐菌的盐胁迫响应机制。以上研究结果对新疆嗜耐盐放线菌资源的保护利用提供了重要参考。
[硕士论文] 赵红晓
生态学;微生物生态学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素是地球上最丰富,潜力巨大的可再生资源,微生物降解纤维素是纤维素有效利用的一种绿色环保的方法。而绿色木霉(Trichoderma viride)可以产生纤维素酶来降解纤维素。
  本研究以绿色木霉(T.viride)AS3.3711菌株为实验材料,根据GenBank数据库上登录号为EU518927的T.viride AS3.3711的egⅦ基因序列来设计引物,通过DNA和RNA为模板进行PCR,得到的序列经过比对得出内切葡聚糖酶Ⅶ基因没有内含子,基因长度782bp,开放阅读框750bp,编码249个氨基酸,理论分子量26.8002KD,理论等电点7.62,信号肽是N端的19个氨基酸,属于糖苷水解酶家族61的一种胞外酶。
  为高效表达内切葡聚糖酶,将克隆到的egⅦ基因连接到表达载体pPIC9K上,获得重组质粒pPIC9K-α1-egⅦ,pPIC9K-α2-egⅦ和pPIC9K-α3-egⅦ。将重组质粒用电转化法转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中,测定内切葡聚糖酶酶活后,发现pPIC9K-05的酶活力最高。甲醇诱导酵母转化子表达,目的蛋白经SDS-PAGE鉴定成功表达,且大小与理论值基本相符。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)的方法检测毕赤酵母(P.pastoris)转化子经甲醇诱导后的表达量,研究表明:转化子的最大表达量出现在第三天。通过正交实验优化重组P.pastoris转化子的发酵条件,得出:甲醇含量为1%,YNB含量为1.34%,pH为6.0,培养温度为29℃时,产酶量最高,为106.91U/g。
  经酶学特性分析,结果显示:温度在40-60℃内酶活较稳定,其中60℃为最佳温度;pH在6.0-8.0范围内有较好的酶活稳定性,其中pH=6.0时最佳;金属阳离子对酶活的影响中,Ag+激活作用较强,Mn2+抑制作用较强;所选五种底物中,MCC效果最好,该内切葡聚糖酶底物饱和时反应速度Vmax=0.5635mg/(mL·min),米氏常数Km=0.2623mg/mL,速度常数Kcat=Vmax/E=0.1702S-1,相对催化效率Kcat/Km=0.6489mL/(S·mg)。
[硕士论文] 田六
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:转录调控网络(transcriptional regulation network,TRN)是由转录因子(transcription factors,TF)和其目标基因的调控关系所构成的有向网络,是原核生物接收、处理、响应内外界环境信息的中枢。目前TRN研究主要集中在网络拓扑结构以及动力学功能两方面。然而,在构建动力学模型时,由于实验数据的缺乏,基因的空间分布以及转录因子搜索目标基因所需的时间往往被忽略。随着转录因子运动机理逐渐明晰,人们发现转录因子综合了扩散、滑动、跳跃以及节间转移等多种运动方式来寻找目标基因。单个转录因子搜索目标基因的时间远远超出之前的预料。同时,现有结果表明转录因子与目标基因的相对位置会影响转录的活性和鲁棒性。因此,细菌TRN的空间结构可能在进化过程中被优化以更好地发挥生物功能。
  近些年来,大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌的三维基因组相继发表,使基因组规模的TRN空间结构特征研究成为可能。本研究以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为研究对象,通过整合TRN和三维基因组数据,在转录调控方式、网络关键节点、网络层级以及网络模体等多个方面探究了TRN的空间组织形式。本研究发现TRN在不同生理条件下存在多种稳定的空间组织特征:1)具有正调控关系的基因间的交互频率显著小于具有负调控关系的基因;2)调控其他基因较多的枢纽节点(Out-Hub nodes)以及瓶颈节点(Bottleneck nodes)都远离与它们有调控关系的节点;3)网络中Middle-Bottom-Target层级间的距离具有特定的空间结构组织模式;4)网络模体内部基因间的空间距离较TRN内部基因间的空间更为接近。这些发现表明细菌TRN的空间结构在多个层面存在优化,这些优化可能与细菌的基本生命活动有着密切的关系。
[硕士论文] 蒙月月
食品科学与工程;食品科学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:免疫(immunity)是机体识别“自我”与“非我(异己)”、产生免疫应答,以清除“异己”抗原或者诱导免疫耐受,从而维持自身内环境稳定。免疫抑制(损伤或缺陷)是指由于免疫系统受到损害,在短时间或者较长一段时间内,机体的免疫系统活动减少,免疫应答降低甚至消失,免疫抑制会导致机体降低对抗原的免疫应答并增加对疾病的敏感性,是一种异常的免疫状态。乳酸菌的表面有很多物质如肽聚糖、胞壁磷壁酸、脂磷壁酸、表层蛋白以及其它细胞壁相关多糖。此外,乳酸菌也可以向细胞外分泌一些具有免疫调节活性的物质成分,如胞外多糖和其它分泌蛋白。这些成分均参与免疫调节或能够直接引起免疫应答,因此构成了乳酸菌发挥其益生功效的物质基础。
  本课题旨在从本实验室保藏的10株乳酸菌中筛选具有较高免疫活性乳酸菌,对筛选出的乳酸菌进行相关生物学特性的研究。并通过建立免疫抑制小鼠模型,观察该乳酸菌是否具有免疫调节能力。
  采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察不同剂量的十株乳酸菌对小鼠脾淋巴细胞增殖能力以及对小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平的影响,采用巨噬细胞吞噬中性红法评估不同剂量的十株乳酸菌的对巨噬细胞吞噬作用的影响。体外试验结果表明,十株乳酸菌对脾淋巴细胞增殖活性作用和对巨噬细胞吞噬作用以及对巨噬细胞能量代谢水平的影响均表现出一定的量效关系,其中植物乳杆菌KLDS1.0318对脾淋巴细胞和巨噬细胞的调节活性最高。
  采用平板计数法和紫外-可见分光光度法测定植物乳杆菌KLDS1.0318生长曲线,pH计测定其产酸能力,平板计数法测定该菌株在酸性及高胆盐环境作用后的活菌数并计算存活率。试验结果显示,植物乳杆菌KLDS1.0318在4h后进入对数期,12h后达到稳定期。其产酸能力较强,pH在12h后降至4.16。菌株在pH为2.5和3.5条件下培养至3h时,其存活率分别为91.20%和97.50%,在胆盐质量浓度分别为0.3、0.5g/100mL的培养基中作用4h后的存活率分别为95.40%和87.76%。
  将90只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级BALB/c小鼠在动物房中适应性饲养1周,待其体重均达(20±2)g后,小鼠被随机分为6组:正常对照组(normal control,NC)、模型对照组(model control,MC)、阳性对照组(positive control,PC)、乳酸菌低剂量组(1×107CFU/只)、乳酸菌中剂量组(1×108CFU/只)、乳酸菌高剂量组(1×109CFU/只)。其中正常对照组小鼠注射等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS),其余小鼠连续3d腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)80mg/kg建立免疫抑制小鼠模型。每组每天灌胃1次,灌胃周期为20d。灌胃结束后,称量各小鼠体重并摘除眼球采血处死小鼠。分别测定各组小鼠胸腺指数和脾脏指数、T淋巴细胞增殖活性、NK细胞活性、巨噬细胞吞噬能力及巨噬细胞能量代谢水平。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)水平。采用苏木素伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色和阿利新蓝-过碘酸-雪夫(Alcian Blue Periodic acid Schiff,AB-PAS)染色观察小肠病理结构。动物试验结果表明植物乳杆菌KLDS1.0318能够作用于小鼠免疫器官,提高了免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数,同时能够增强免疫细胞活性,促进T淋巴细胞增殖,增强NK细胞对YAC-1靶细胞的杀伤活性,提高巨噬细胞吞噬中性红能力及其能量代谢水平;显著上调小鼠的脾细胞IL-2和IFN-γ水平、巨噬细胞TNF-α水平、血清中IL-2、IL-6、IFN-γ及IgG水平;明显提高小肠的绒毛长度、隐窝深度、杯状细胞数量及黏蛋白面积。
  结论:(1)通过体外评估十株乳酸菌对免疫细胞活性的影响,结果表明植物乳杆菌KLDS1.0318具有较高的免疫调节活性。(2)植物乳杆菌KLDS1.0318生长较快,具有较强的产酸能力和耐酸耐胆盐能力。(3)植物乳杆菌KLDS1.0318能够提高免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数,增强其免疫细胞活性,同时显著上调其细胞因子水平,明显改善肠道黏膜的形态结构。综上所述,本课题研究结果表明筛选出的植物乳杆菌KLDS1.0318可以作为具有潜在免疫调节作用的益生乳杆菌。
[硕士论文] 李凯峰
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:地衣芽胞杆菌是一种重要的工业微生物,可以生产出许多各种各样的生物制品。然而,低转化效率和缺乏有效的基因组编辑工具阻碍了它的研究进展。近些年来,由于CRISPR/Cas9系统具有高效、易于操作、操作周期短等优点而受到广泛的关注,并被应用于各种细胞中。但是,Cas9核酸内切酶辅以NHEJ修复途径的基因组编辑策略在应用过程中仍然存在一些问题,如脱靶效应和致死效应等。为了解决这些问题,Cas9的突变体Cas9n单切口酶被人们发现,并且常常辅以同源重组的修复模式运用在基因组编辑技术中。本研究利用一种改进的CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌DW2中构建了系统的基因组编辑策略,希望借此来提高芽胞杆菌的基因组编辑效率,并为其它基因组编辑策略的开发提供思路。
  本研究在穿梭载体pHY300的基础上添加了Cas9n表达元件,并构建了DW2/pCas9n过表达工程菌株。通过SDS-PAGE实验表明,Cas9n蛋白能在地衣芽胞杆菌中表达。为了降低基因组编辑载体的负荷,将P43启动子启动的Cas9n表达元件整合到地衣芽胞杆菌DW2的基因组上,并把Cas9n整合菌株命名为DWC9n。以DWC9n为出发菌株,构建了系统的基因组编辑策略,包括单基因敲除、多基因同时敲除、大片段敲除、单基因整合等,大幅度提高了地衣芽胞杆菌的基因组编辑效率。
  在本研究中,普切明合成酶基因yvmC被选择作为靶基因,并设计特异性的gRNA序列构建了单基因敲除策略。然后,对敲除载体同源臂的大小进行了优化,构建了同源臂大小分别为0.1kb+0.1kb、0.2kb+0.2kb、0.3kb+0.3kb、0.5kb+0.5kb、0.7kb+0.7kb、1.0kb+1.0kb的单基因敲除载体。实验结果表明,即使是在0.1kb大小同源臂的作用下,CRISPR/Cas9n系统也能很好地被应用于单基因敲除,效率达51.4%。随着同源臂大小的增加,敲除效率呈现递增的趋势,但是考虑到载体负荷和策略拓展的问题,0.3kb大小的同源臂是比较合理的选择,敲除效率达80.6%。
  同时,本研究通过将靶向不同基因的两条特异性的gRNA串联在一起实现了epr、wprA双基因的同时敲除,敲除效率达11.6%。以pHY300载体为基础,构建了基于CRISPR/Cas9n的大片段敲除载体,并一次性敲除了42.7kb的大片段DNA序列,敲除效率高达79.0%。为了建立完善的CRISPR/Cas9n基因组编辑技术,将纳豆激酶表达元件整合到地衣芽胞杆菌DWc9n的基因组上,整合效率达76.5%。
  最后,为了测试建立的CRISPP/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌中的适用性,通过敲除地衣芽胞杆菌胞内、胞外蛋白酶基因来增加异源蛋白在宿主细胞内的表达量。利用构建的基因组编辑策略敲除了epr、vpr、mpr、bprA、aprE、clpP、clpE、clpYQ、lonB、bacABC这些基因,获得了工程菌株DWc9n△10。将实验室保存的纳豆激酶表达载体pP43SNT-SsacC电转到DWC9n和DWc9n△10中进行发酵实验,结果表明,DWc9n△10具有良好的异源蛋白表达能力,其生产的纳豆激酶活力比原始菌株提高了30.4%,达到了75.0FU/mL。本研究在地衣芽胞杆菌中构建了一个系统的基因组编辑方法,并且已经被证实可以很好地被应用于地衣芽胞杆菌的菌种改造研究中。
[硕士论文] 曾洁
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:DCE-01是一株“广谱性”、“高效性”脱胶菌,对多种草本纤维原料均能起到很好的脱胶作用,且6.0h能独立完成苎麻脱胶,不需要其他化学方法后处理补充。其脱胶功能的广谱性和高效性在国内外都属于领先地位。本文以DCE-01菌株为研究对象,从DCE-01菌株中克隆出3个关键脱胶酶基因,以2种不同的排列方式将这3个关键脱胶酶基因串联起来,分别在大肠杆菌和DCE-01菌株中表达,获得结果如下:
  1.根据全基因组测序注释结果设计特异引物,从DCE-01菌株克隆出关键脱胶酶基因片段3个:果胶酶基因(pelE)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man)。经测序及生物信息学分析:pelE核酸序列长1185bp,编码395个氨基酸,预测蛋白分子量为43.8kDa;xyn核酸序列长1251bp,编码416个氨基酸,预测蛋白分子量45.74kDa;man核酸序列长1137bp,编码378个氨基酸,预测蛋白分子量41.85kDa。
  2.通过设计特异引物和PCR扩增获得带有特定限制性酶切位点的关键脱胶酶基因(PelE基因、Xyn基因和Man基因)片段,经酶切并与表达载体pET-28a连接,构建成单基因表达重组子,同时,按照PXM、XPM的顺序串联排列在表达载体pET-28a的MCS区段上,构建成多基因共表达重组子,然后,将单基因表达重组子和多基因共表达重组子导入BL21菌株中,成功构建PelE、Man和Xyn的单基因表达重组菌株(pET-28a-P/BL21、pET-28a-M/BL21和pET-28a-X/BL21)和多基因共表达重组菌株(pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21)。
  3.将构建的重组子转入到DCE-01(关键脱胶酶基因来源菌株)中,成功获得单基因同源表达的重组菌株3个,包括pET-28a-P/DCE-01、pET-28a-X/DCE-01、pET-28a-M/DCE-01,多基因同源共表达的重组菌株2个,即pET-28a-PXM/DCE-01(或DCE01PXM)和pET-28a-XPM/DCE-01(或DCE01TM)。
  4.对BL21系列重组菌株的酶活测定结果显示:(1)pelE重组菌株所表达PelE酶活为471.97U/mL,而把pelE排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21时,对应的PelE酶活分别是532.68U/mL和121.43U/mL。(2)xyn重组菌株所表达Xyn酶活为44.32U/mL,而把xyn排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-XPM/BL21和pET-28a-PXM/BL21时,对应的Xyn酶活分别是47.43U/mL和31.42U/mL。(3)man重组菌株所表达Man达16882.86U/mL,而将man排在远离启动子位置形成的pET-28a-PXM/BL21与pET-28a-XPM/BL21时,对应的Man酶活分别为645.21U/mL和230.83U/mL。因此,可以推论:(1)用于构建多基因共表达体系的载体的启动子对pelE的表达效果有显著促进作用;(2)构建多基因共表达体系时,目的基因的表达效果与插入位点离启动子的距离呈负相关,即距离越远效果越差;(3)在多基因共表达体系中,man的表达效果受pelE插入位点的影响突出。
  5.以DCE-01和DSM18020(模式菌株)为对照,对多基因同源共表达重组菌株纯培养液的酶活测定结果显示:(1)重组菌株DCE01PXM、DCE01XPM的PelE酶活性分别是DCE-01菌株的2.77倍、1.01倍和DSM18020菌株的10.91倍、4.11倍;(2)重组菌株DCE-01PXM、DCE-01TM的Xyn酶活性分别是DCE-01菌株的1.28倍、1.82倍和DSM18020菌株的5.61倍、8.08倍;(3)重组菌株DCE-01PⅪM、DCE-01XPM的Man酶活性分别是DCE-01菌株的1.99倍、1.01倍和DSM18020菌株的6.16倍、3.16倍。由此可以得出结论:采用基因串联方法将来自DCE-01菌株的关键脱胶酶基因(pelE、xyn、man)整合到表达载体(pET-28a)中形成重组子,无论是导入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)还是导入DCE-01菌株都获得了成功表达,而且多基因同源共表达重组菌株表达PelE、Xyn、Man的酶活都高于DCE-01菌株。
  6.液相色谱分析DCE-01、DSM18020、DCE-01PXM、DCE-01XPM菌株用于苎麻脱胶发酵液的结果表明:DCE-01PXM菌株的发酵液中检测到的单糖含量要明显高于其他几个菌株,DCE-01PXM菌株发酵液中的单糖含量略高于DCE-01菌株,而DCE-01菌株脱胶发酵液的单糖含量要明显高于DSM18020菌株。这一结果与上述酶活检测结果基本一致,说明将DCE-01关键脱胶酶基因按照PXM的顺序串联排列形成重组子后导入DCE-01中进行多基因同源共表达的方法,能在一定程度上提升DCE-01的脱胶功能。
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