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[硕士论文] 申德民
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:灰葡萄孢是一种气传性植物病原真菌,它能够侵染200多种植物,包括番茄、草莓、葡萄以及多种花卉。灰葡萄孢的抗逆性极强,可靠菌核或分生孢子度过恶劣环境。研究灰葡萄孢菌核发育、分生孢子产生或致病机理可为有效防治灰霉病奠定理论基础。本研究以灰葡萄孢菌丝生长时期和菌核发育时期的基因表达谱为基础,挑选出了2个在这两个阶段基因表达量差异较大的基因BC1G_00689和BC1G_03293,并初步研究了它们的功能,取得了以下研究结果:
  1.RNA-seq结果表明基因BC1G_00689在菌核发育时期表达下调,表达量是菌丝生长时期的18%,该基因编码一个包含酸性鞘磷脂酶结构域的蛋白质。基因BC1G_03293在菌核发育时期表达上调,表达量比菌丝生长时期上调了78倍。该基因编码的蛋白质与大肠杆菌中周质空间麦芽糖结合蛋白的结构相似度较高,目前在真菌中还没有相关蛋白质功能的报道。为了研究基因BC1G_00689的功能,我们通过同源重组的方法得到了敲除转化子△BC1G_00689-19和△BC1G_00689-21。也得到了基因BC1G_03293的敲除转化子△BC1G_03293-2和△BC1G_03293-4,并运用基因互补技术得到了互补转化子△BC1G_03293-2-C2和△BC1G_03293-2-C3。
  2.敲除转化子△BC1G_00689-19和△BC1G_00689-21的菌落形态、菌丝尖端形态、菌丝生长速度、对番茄叶片的致病力以及菌核干重与野生菌株B05.10相比无明显差异,但敲除转化子的产孢量明显下降,约为出发菌株B05.10产孢量的70%。结果说明BC1G_00689基因在灰葡萄孢产孢过程中可能发挥重要作用。
  3.BC1G_03293基因敲除后产孢量明显下降,大约为出发菌株B05.10产孢量的45%,并且BC1G_03293基因互补可使敲除转化子的产孢量得到明显恢复。在加麦芽糖和蔗糖的基本培养基上敲除转化子的菌丝生长速度、菌落形态以及菌核干重与B05.10相比无明显区别。结果说明BC1G_03293基因参与调控了灰葡萄孢的分生孢子产生。
[硕士论文] 田烨
微生物学 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:非编码RNA(sRNA)是一类通常不编码功能蛋白的RNA,大小多为20-400个核昔酸,近年来研究发现sRNA可以作为转录后调控因子,广泛参与细菌物质代谢、胁迫反应和致病性等多种生理过程的调控。耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)具有极强的逆境胁迫适应性,具有超强的辐射和氧化抗性。目前有关耐辐射微生物sRNA的研究报道甚少,仅通过sRNA深度测序对耐辐射异常球菌潜在的sRNA进行了预测。尽管研究认为耐辐射异常球菌sRNA在辐射、氧化等胁迫抗性反应中发挥了极其重要的作用,但是至今尚无辐射异常球菌sRNA功能、特性相关研究报道。本研究对耐辐射异常球菌中位于编码基因之间的sRNA进行鉴定和特性分析,通过构建sRNA(drrA)缺失突变株,利用荧光实时定量PCR、胁迫表型分析等对该sRNA在耐辐射异常球菌氧化胁迫环境中的功能进行了研究,取得以下研究结果:
  1.drrA基因位于耐辐射异常球菌Ⅰ号染色体dr1016和dr1017的基因间区,全长251bp。Rfam数据库显示drrA可能属于一类新的功能未鉴定的非编码RNA家族。Northern blot证明drrA为非编码RNA,并受氧化胁迫诱导;5'RACE实验证明drrA为反向转录,转录起始于一个腺嘌呤(A)。在通过5'RACE确定的转录起始位点上游的启动子区进行序列分析显示存在σ70因子识别的典型-35/-10区的保守序列(AGGAAA-N17-TAAAAT)。生物信息学分析表明drrA具有异常球菌属特异性,二级结构预测显示sRNA drrA含有多个茎环结构,很可能是直接靶标mRNA的结合位点。
  2.荧光实时定量PCR结果显示,drrA在不同胁迫条件下表达量变化各不相同,在氧化胁迫条件下的表达量变化尤为显著,在80mM H2O2的胁迫条件下,drrA基因在转录水平的相对表达量上调高达51倍,在高温和UV辐射胁迫条件下相对表达量分别上调3倍和下调5倍。不同强度氧化胁迫条件下的drrA表达量分析表明drrA对氧化胁迫极度敏感。
  3.为研究drrA的功能,本研究通过融合PCR技术和同源重组双交换构建drrA缺失突变株(ΔdrrA),在氧化胁迫环境以及高温、UV辐射胁迫环境中进行表型分析,结果表明,突变株ΔdrrA在前两种条件下的存活能力明显低于D.radiodurans R1野生型,相差达到3个数量级;而在UV辐射胁迫条件下突变株ΔdrrA的生存力下降1个数量级。可见,drrA缺失导致耐辐射异常球菌对氧化、高温及UV胁迫敏感。推测sRNA drrA可能参与氧化等胁迫反应的调控。
  4.通过对drrA直接靶基因的在线预测,发现了8个氧化抗性相关的潜在靶标基因(dr1016,dr0435,dr0841,dra0010,dra0233,dra0232,dra0013,drb0092)。为进一步研究drrA基因的氧化胁迫调控机制,通过β-半乳糖苷酶活性测定实验分析氧化相关基因katE、oxyR1、oxyR2以及全局调控因子irrE的启动子活性。结果显示,drrA基因的缺失抑制了katE、oxyR2和irrE的表达,提高了oxyR1的表达,推测drrA可能参与了上述相关基因的表达调控,共同在氧化胁迫环境中发挥作用。
  本研究对耐辐射异常球菌中一个非编码RNA drrA进行了鉴定,该非编码RNA受氧化胁迫诱导,为属特异性非编码RNA,drrA在氧化、高温及UV胁迫反应中发挥重要作用,可能参与了氧化抗性相关基因的调控。有关sRNA drrA在氧化胁迫抗性的调控机制,仍需要进一步研究。
[硕士论文] 余秋玉
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:灰葡萄孢(Botrytis cinerea)可危害一些重要经济作物,造成巨大的经济损失。目前细胞自噬在灰葡萄孢中的研究较少,在真核生物中,细胞自噬过程可维持细胞内的生理平衡,有助于细胞度过逆境,并影响一些丝状真菌细胞的分化及致病力。本研究在灰葡萄孢基因组数据库中下载3个自噬相关基因的序列,即BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868,对其进行了基因结构和同源性分析,采用Split-marker技术在野生型菌株B05.10中对其分别进行了敲除,最后对敲除突变体的菌丝生长、菌核产生、营养需求和致病力等方面进行了测定。取得的研究结果如下:
  (1)通过在NCBI上BLAST比对以及构建进化树,证实了BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868分别与多物种的自噬基因ATG26、ATG17和ATG14有同源性,因此命名为BcATG26、BcA TG17和BcA TG14。
  (2)通过Split-marker技术分别敲除基因BcATG26、BcA TG17和BcATG14,经过PCR和Soutnern blot验证,获得了基因缺失突变体△BcATG26、△BcA TG17和△BcATG14。
  (3)明确了自噬基因BcATG26、BcA TG17和BcA TG14在自噬过程中的重要作用。用MDC染色,B05.10的菌丝在激光共聚焦显微镜下出现大量的荧光颗粒,而△BcATG26-13、△BcATG17-6和△BcATG14-107的菌丝细胞中未见或者有极少数的荧光颗粒,自噬基因的敲除阻断了自噬过程,导致不能形成自噬体或者自噬小体。
  (4)细胞自噬影响灰葡萄孢菌丝生长和菌核发育。基因缺失突变体在菌丝生长和菌核形成方面与野生型菌株B05.10有差异。在PDA培养基上,△BcA TG26-13相对于野生型菌株B05.10,菌核黑化延迟,15d仍为黄色;而△BcATG14-107只能形成很小的菌核。在1/8 PDA、DM、DM-C和DM-N培养基上,与野生型菌株B05.10相比,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌丝生长速度减慢,菌落发育畸形。
  (5)细胞自噬影响灰葡萄孢致病力。用菌丝块离体接种烟草叶片、活体接种烟草叶片和离体接种草莓叶片测定致病力,结果表明,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107的致病力与野生型菌株B05.10相比有极显著差异(P<0.01)。
  (6)细胞自噬可能影响灰葡萄孢耐受过氧化氢(H2O2)和植保素(camalexin)的胁迫。在添加有H2O2或者植保素camalexin的PDA上,与野生型菌株B05.10相比,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌丝生长速度减慢,菌落发育畸形,即对H2O2和camalexin更为敏感。
  以上结果表明,细胞自噬在灰葡萄孢菌丝生长、菌核的形成和发育、对寄主植物的致病力以及病原菌耐受活性氧(ROS)和植保素camalexin的胁迫等方面都起着重要作用。解析灰葡萄孢细胞自噬相关基因的功能可为更好的防治灰霉病提供理论基础。
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:细菌非编码RNA(ncRNA),也称小RNA(sRNA),一般指长度在50-500 bp之间,不翻译咸蛋白质,但是具有特定功能的RNA分子。常规获得ncRNA分子的主要方法包括计算机模拟分析和基于实验室技术的Northern blotting,微阵列,RNA测序等。通过RNA测序方法,大量的非编码RNA在包括大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、苜蓿中华根瘤固氮菌(Sinorhizobium meliloti)、蓝藻细菌(cyanobacteria)、土拉热杆菌(Francisella tularensi),酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、植物病原体白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)等微生物中得到了鉴定。大量的研究表明,在原核生物中,sRNA在菌体的营养代谢、群体感应、细菌毒力和调整细菌生理机能以应对环境胁迫等方面发挥重要作用。非编码RNA发挥功能有多种方式,有些非编码RNA可通过碱基配对的方式与靶标mRNAs结合进而影响靶标基因的表达水平或稳定性进而起调控作用,比如假单胞菌中报道的铁调控RNA prrF;有些非编码RNA具有蛋白结合能力,可通过与靶标蛋白的高亲和结合进而竞争蛋白与其靶标的结合参与蛋白的调控活性,研究较为深入的有碳代谢抑制调控的非编码RNA CrcYZ,次级代谢物调控的rsm YZ等。在固氮微生物中,非编码RNA的研究也有大量报道,但是直接参与固氮基因表达调控的例子不多。2016年本实验室报道了一个可特异结合固氮酶结构基因nifKmRNA并参与固氮酶活性调控的非编码RNA nfiS,但是是否有其他的非编码RNA也参与了固氮系统的表达调控值得进一步的研究。
  施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际,能够定殖在根表或通过伤口入侵到水稻根组织进行联合固氮。该菌具有固氮、促生、耐盐等优良性能,在非豆科作物节肥增产方面具有重要的应用价值。为了获得施氏假单胞菌A1501在固氮条件下表达的非编码RNA信息,我们测定了该菌在固氮条件(0.1mM NH4+,0.5% O2)和铵抑制条件(20mM NH4+,0.5%O2)下的转录组。转录组分析共发现了53个特异表达的非编码RNA,相比铵抑制条件,17个sRNA在固氮条件下表达显著上调,6个sRNA在固氮条件下被抑制。编号为ncRNA31的非编码RNA在固氮条件下表达水平上调了93倍,基因组中位于保守蛋白质PST1955(编码“亚硝酸还原酶(NAD(P)H))亚基,NirD)和PST1956(编码“氰钴胺素生物合成的蛋白质”)之间。通过BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)与GenBank数据库比较,发现该ncRNA在施氏假单胞菌中高度保守,而且其两侧的基因也非常保守。由于该ncRNA在固氮条件下高表达,而且特异响应外界铵离子信号,将其命名为amiR(ammonium induced ncRNA)。
  通过northern blotting证实了总RNA中amiR转录产物的存在。进一步的5'-RACE实验表明AmiR与两测基因反方向转录,同时确认了amiR的转录起始位点。对amiR的启动子进行分析,发现了氮代谢关键调控节点蛋白ntrC和rpoN的保守结合位点;采用qRT-PCR对amiR的表达特性进行了分析,结果表明,与野生型相比,在氮代谢关键调控节点蛋白ΔntrC和ΔrpoN的突变株中amiR的表达显著下调。由此推测,amiR可能是A1501菌氮代谢调控系统的重要组成部分,受ntrC和rpoN的直接调控。
  为了研究amiR的生物学功能,构建了amiR的缺失突变株ΔamiR,过表达菌株以及回补菌株。对野生型、突变株和回补菌株的相关表型进行了测定,主要包括:在LB和基本培养基中生长情况、固氮酶活性、反硝化作用、细菌运动、氧化和渗透胁迫、盐胁迫、生物膜形成等。测定结果发现,相比野生型,ΔamiR菌株的耐氧化、渗透压力和盐耐受性与野生型相比较没有明显改变,但是ΔamiR的固氮酶活性下降了30%,这表明amiR在A1501菌的生物固氮过程中起重要作用。此外,研究也发现,与野生型相比,当硝酸盐作为电子受体进行反硝化生长时,ΔamiR的生长能力减少约30%,当亚硝酸盐作为电子受体时,ΔamiR突变株几乎丧失反硝化作用。采用实时定量测定了固氮酶编码基因nifHDK的表达,结果表明固氮基因不受amiR基因突变的影响。进一步测定了野生型和突变株胞内的能量信号NADPH的水平,发现ΔamiR突变株中NADPH的下降显著。以上数据表明,amiR不仅在固氮过程中发挥作用,在另一种氮同化过程反硝化中也发挥重要作用。amiR突变对固氮系统的影响不是发生在固氮酶基因转录水平,可能是由于能量合成受阻造成的,其作用机制值得进一步深入研究。
  为阐明施氏假单胞菌A1501中amiR参与固氮基因表达调控的具体机制和作用方式,我们对野生型菌株及ΔamiR突变株在固氮条件下的转录组进行了分析。RNA-seq数据显示,与野生型相比,在4278个基因中,突变株中总共有416个基因表达发生显著上升或下调,这些基因大多数参与反硝化过程和能量转移过程,固氮基因的表达没有显著变化,这表明amiR在反硝化和能量转换过程中扮演了重要角色。在ΔamiR缺失突变体中,其侧翼基因亚硝酸盐还原酶基因nirD的表达水平显著下调,该基因是反硝化途径中的重要结构基因。为了确认nirD与amiR缺失造成表型之间的关联,构建了nirD的缺失突变株ΔnirD。进一步测定和比较了ΔamiR和ΔnirD两个突变株的表型,结果表明ΔamiR与ΔnirD在固氮酶活、反硝化过程中有相似的表型,由此推测本研究发现的amiR缺失造成的表型可能与下游基因nirD的表达模式相关。关于amiR的作用机制提出两种假设,一种是amiR是nirD基因的顺式作用元件,也就是nirD可能为amiR的作用靶标,第二种假设为由于amiR编码区与nirD基因的启动区靠近,amiR突变造成了对nirD表达的影响。围绕以上两种假设正在开展进一步的分析和验证。
  RNA分子的二级结构与非编码RNA发挥调控功能高度相关,而且二级结构的特征可进一步用于预测非编码RNA的作用靶标。本研究采用RNAFold软件预测了AmiR的二级结构,用TARGETRNA2软件预测了AmiR的靶标基因。结果表明在AmiR的二级结构中存在多个长度在25-63nt之间的颈环结构。这些预测的颈环结构跟多个mRNA的部分序列互补配对,但是这些颈环结构是否与AmiR缺失引起的表型直接相关以及其具体的作用靶标确定仍需进一步的实验证实。我们尝试在体外对该sRNA进行体外转录和纯化,并通过圆二色谱测定了处在不同的缓冲液中的AmiR的结构,结果表明,在不同的盐浓度下,AmiR能改变其折叠模式。这说明非编码RNA在不同的条件下可形成不同的空间构象,进而具有特定的调控功能或靶标。
  综上所述,AmiR是一个固氮条件下高表达、特异响应铵信号,受氮代谢关键调控节点蛋白ntrC和rpoN调控,在A1501菌的反硝化和生物固氮中具有重要功能的非编码RNA。
[硕士论文] 潘宝平
特种医学 南华大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是目前地球上已知抵抗电离辐射最强的生命形式之一。耐辐射奇球菌中总开关因子PprI通过其金属蛋白酶活性对负调控因子DdrO进行切割作用,从而激活其下游多个参与辐射抗性基因,如 pprA、ddrD、gyrA等基因的表达,而拥有一个高效的DNA损伤响应能力。PprM是一种参与了 PprI依赖的辐射响应的新型调控蛋白,但存在何种依赖关系目前并不清楚。本课题旨在研究PprM蛋白与pprI、recA和pprA之间的关系,进一步了解PprM蛋白参与的PprI依赖的信号途径,从而了解PprM蛋白在耐辐射奇球菌的极端抗性网络中的作用。
  研究方法:①利用课题组前期实施染色质免疫共沉淀(ChIP)结合PCR技术筛选到可能与PprM蛋白发生相互作用的3个关键基因的启动子,即pprI/recA/pprA,诱导pGEX-6p-1-pprM重组载体表达,体外纯化获得GST-PprM融合蛋白;②设计pprI/recA/pprA启动子区域上下游引物,合成生物素标记探针,利用凝胶迁移实验(EMSA)验证pprI/recA/pprA启动子探针与GST-PprM融合蛋白是否有相互作用,进一步预测它们的结合序列;③利用 qRT-PCR检测 pprM缺失突变菌株和DR野生菌株中pprI/recA/pprA的mRNA表达水平,了解PprM在转录水平对这三个基因的影响;④检测 pprM缺失突变菌株与DR野生菌株在低温条件下的生存曲线。
  结果:成功诱导表达并纯化到GST-PprM融合蛋白;PprM蛋白在体外能够与pprI/recA/pprA启动子区域发生结合作用,pprI启动子的结合序列主要位于第三段探针序列,而recA/pprA启动子的结合序列主要位于各自的第二段探针序列,通过分析,结合序列可能为GCCGTGAA或GACCTGAA;pprM缺失突变菌株中的pprI/pprA的mRNA表达水平高于DR野生菌株,但recA的mRNA表达水平差别不大;pprM缺失突变菌株比DR野生菌株其抗寒能力有所增强。
  结论:
  1.EMSA证实PprM蛋白与pprI/recA/pprA三个基因的启动子区域有相互作用,结合序列分别位于 pprI启动子的第三段序列和recA/pprA启动子的第二段序列。
  2.PprM蛋白在转录水平对pprI/pprA基因的表达有一定的抑制作用,但对recA基因没有影响。
  3.pprM基因的缺失突变导致耐辐射奇球菌的抗寒能力增强。
[硕士论文] 杨奇
生物学 南华大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景与目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)是已发现物种中电离辐射耐受性最强的生物之一,可耐受超过15kGy的电离辐射,其辐射耐受剂量是大多数脊椎动物的3000多倍。pprI基因是DR中参与DNA损伤修复的一个关键基因,是辐射响应调控的总开关。pprM基因是DR中特有的辐射响应基因,pprM基因缺失突变株对γ辐照抗性明显降低。本实验旨在研究DR辐射响应基因pprI、pprM的表达对293T细胞辐射抗性的影响,为辐射损伤治疗提供新思路。
  研究方法:1、以实验室前期构建的pGEX-6p-1-pprM为模板,PCR扩增pprM基因,构建pEGFP-C1-pprM绿色荧光真核表达载体。
  2、将pEGFP-C1-pprM、pDsRed1-N1-flag-pprI(实验室前期构建)分别单独转入及两质粒共转入293T细胞。倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察红绿色荧光融合蛋白的表达及在细胞内的共定位。Western blot进一步验证pprI、pprM基因融合蛋白的表达。
  3、MTT法检测293T细胞的生存率,荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,WST-1法测总超氧化物歧化酶(SOD)活力, TBA微板法检测丙二醛(MDA)含量及还原型谷胱甘肽(GSH)活力。
  研究结果:1、测序鉴定及Blast比对分析结果显示pEGFP-C1-pprM构建载体序列与模板基因碱基序列一致,载体构建成功。
  2、倒置荧光显微镜下观察到红绿色荧光蛋白的表达量较高,激光共聚焦显微镜下观察到PprI、PprM融合蛋白在293T细胞细胞核与细胞质中存在共定位现象。Western blot结果显示,在约40kD及65kD处有明显条带,分别为pprM、pprI基因所表达的融合蛋白。
  3、与未转染组相比,空质粒转染组细胞无明显差异,pprM、pprI单基因转染组及 pprM+pprI双基因转染组细胞辐照后生存率、总 SOD活力及GSH活力明显增高(P<0.05),细胞内ROS及MDA含量明显降低(P<0.05),且pprM+pprI共转染组比两基因单转染组效果更为明显,差异有统计学意义。
  结论:1、原核DR-pprM、pprI基因能够在真核293T细胞中表达,且PprM、PprI蛋白在细胞内存在共定位,可能存在相互作用。
  2、DR-pprM、pprI及pprM+pprI基因在293T细胞中的表达能够提高辐射损伤后细胞的增殖能力和抗氧化能力。
  3、DR-pprM+pprI双基因转染效果比两基因单转染的细胞增殖能力和抗氧化能力提升效果更为明显,pprM与pprI基因间可能存在协同抗辐射作用。
[硕士论文] 周莉
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:链霉菌能够产生多样性的天然产物,并且具有多样的生物活性和功能,是新药发现的宝库。其平衡生长与产素适时适量表达的智能化源泉是精妙的多层次转录调控网络(精确的DNA结合位点,小分子和转录因子相互作用)。充分理解和认识转录调控网络的机制有助于获得高产菌株。为建立快速高通量研究调控网络的方法,利用ALPHA(amplified luminescent proximity homogeneous assays)技术的诸多优势,比如高通量、均相、高灵敏度及灵活性、背景低、方便小型化及自动化,解决了传统方法(EMSA,DNase I足迹法,表面等离子共振技术,染色质免疫沉淀法等)的缺陷。
  阿维链霉菌产生的阿维菌素是微生物药物的杰出代表,是高效低毒生物杀虫剂,对保证我国粮食、农产品安全、畜牧业和医药健康具有重大意义,两亿非洲人也因为中国生产的阿维菌素而幸免河盲症失明。继青霉素和链霉素之后,第三次受到了诺贝尔奖的青睐(也是继DDT之后,又有一个农药品种为其发现者赢得了诺贝尔奖),日本科学家大村智和美国科学家坎贝尔,与发现青蒿素的我国科学家屠呦呦,共同获得了2015年诺贝尔生理学或医学奖。
  1)在链霉菌全基因组转录因子靶点筛选新策略的探索方面,我们利用阿维链霉菌中已经报道证实具有结合作用的AvaR1与sav3705p,建立方法平台来探究转录因子与DNA的相互作用。该方法平台不仅可以快速确定转录因子与DNA有无相互作用,而且可以应用逐步截短策略确定相互作用的精确结合位点,精确定量相互作用的强度,且鉴定目标转录因子的全基因组靶点,表现出快速、高通量的优势。我们利用该平台找到了新的结合位点,很好地确定了精确结合位点而非保护位点,且鉴定了转录因子AvaR1的全基因组靶点。该平台的成功建立,为揭示调控网络和促进阿维菌素产量的大幅度提高提供了有力支持。
  2)在基于别构转录因子(aTFs)的小分子检测新方法的开发方面,原核生物中存在很多能够感应不同小分子的aTFs,我们首次利用aTFs可以感应小分子的特性,结合ALPHA技术,开发高通量的全新小分子体外检测方法。该检测方法利用微孔板,在液态均相体系中实现检测,且无需繁复的清洗步骤,因此可以实现稳定的高通量检测。为筛选土霉素的高产菌株,我们获得了目前最灵敏的土霉素检测生物传感器,其检测限低至0.03 nM。我们还针对重要的临床标志物尿酸,获得了目前最灵敏的尿酸检测生物传感器,其检测限低至1nM。该平台还可用于开发高灵敏度的、全新的化学小分子检测方法,为临床病原标志物检测、以及相关试剂盒的开发提供支持。
[硕士论文] 杨晓炜
生物物理学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本实验通过对高压静电场(HVEF)处理后的E.coli K12 W3110细胞膜、胞内酶活性、胞内蛋白质一级结构及二级结构的变化以及细胞可逆修复等方面的研究,揭示了高压静电场对E.coli的损伤机制。结果如下:
  (1)测定静电场处理后的菌体洗脱液核酸和蛋白含量,发现随着处理时间的增加,核酸和蛋白含量呈振荡变化,说明HVEF对E.coli细胞膜有损伤效应。用流式细胞术双染分析,发现同一电场,亚死细胞比例随着处理时间的增加而增加,剂量为5kV*6min和7kV*6min时,亚死细胞比例均达到最大,分别为(65.13±2.62)%和(45.87±0.45)%,之后该比例随着处理时间的增加而减小,即亚死细胞逐渐变为死细胞,表现为电场损伤的累积效应。
  (2)对电场处理后的E.coli胞内蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳和傅立叶变换红外光谱分析,发现不同剂量电场处理的胞内蛋白电泳条带与未处理菌体蛋白的泳带没有差别,即HVEF没有改变E.coli胞内蛋白质一级结构;1kV/cm的HVEF处理后菌体蛋白中β折叠向α螺旋转变,而3、5、7kV/cm的HVEF处理后的菌体蛋白α螺旋和β折叠向β转角和无规卷曲转变,即有序结构向无序结构转变。所以,1kV/cm的HVEF可能对胞内蛋白活性有激活作用,而3、5、7kV/cm的HVEF对E.coli胞内蛋白活性均有损伤效应,且损伤效应最强剂量为5kV/cm。用流式细胞术CFDA单染分析,剂量为5kV/cm*2min和7kV/cm*2min时,CFDA阳性细胞比例均为同一电场强度下最低,说明静电场会损伤E.coli细胞内酶活性。之后,酶活性均有不同程度的增加,可能静电场对E.coli细胞内酶活性有激活作用,最佳激活剂量为5kV/cm*4min和7kV/cm*6min。随着电场处理剂量增加,总的变化趋势为振荡下降型。即静电场对E.coli胞内酶活性的损伤呈振荡增加的趋势,表现为电场损伤的累加效应。
[博士论文] 翟斌元
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:古菌是与细菌和真核生物并列的第三域生命形式,其细胞结构和代谢方式与细菌类似但遗传信息加工传递机制,包括DNA复制、转录、重组、修复和蛋白翻译,更接近于真核生物。硫化叶菌是典型的超嗜热泉古菌,生活于高温及酸性极端环境,但其基因组保持稳定,自发突变率并不高,暗示其细胞内有一套完善的DNA修复系统。根据已有的报道,在硫化叶菌细胞中存在的DNA修复途径包括同源重组修复,核酸切除修复和碱基切除修复。与细菌相比,参与这些修复途径的蛋白也更接近于真核生物。
  DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)是细胞内最严重的DNA损伤形式之一。同源重组修复和非同源末端链接是修复DSBs的两种重要途径。目前,在绝大多数古菌中只发现了同源重组修复途径,对参与该途径的保守蛋白Mre11,Rad50和重组酶RadA(真核生物中为Rad51)都有深入的研究。除此之外,对古菌中参与同源重组修复的其他蛋白也有较多的报道,包括NurA,HerA,Hjc和Hje等。Holliday junction(HJ)是同源重组过程中的标志性中间产物,HJ需要被及时的处理以保证顺利地完成DNA修复和和色体的正常分离。细胞内处理HJ的方式主要有两种,一种是由HJ解离酶介导的“resolution”,典型的HJ解离酶包括RuvC,Hjc,Yen1/GEN1和Slx1-Slx4/SLX1-SLX4;另一种是由解旋酶、拓扑异构酶及其他蛋白组成的复合体介导的“ dissolution”。在细菌中已经报道参与“ resolution”过程的蛋白是RuvAB复合物。到目前为止,在古菌和真核生物中还没有鉴有到经典的类似于RuvAB的蛋白复合物。
  在本研究中,我们在超嗜热古菌冰岛硫化叶菌S.islandicus细胞中表达了羧基端带有组有组酸标签的解离酶Hjc(基因组中其编码基因为SiRe_1431),通过亲和纯化和质谱鉴定发现了与Hjc在基因基上位置相邻并可能与Hjc存在相互作用的一个蛋白,SiRe_1432。对氨基酸序列分析发现, SiRe_1432包含典型的PIN结构域和P-loopATPase结构域,因此将SiRe_1432命名为SisPINA(冰岛硫化叶菌来源的PIN domain-containing P-loop ATPase)。进一步,我们通过Pull-down实验确认了SisPINA与Hjc具有物理相互作用,暗示着SisPINA与Hjc可能在细胞内共同参与HJ的处理。
  为了探索SisPINA在冰岛硫化叶菌S.islandicus中的功能,我们尝试敲除细胞内染色体上SisPINA的编码基因,尝试多次后始终无法获得敲除SisPINA基因的缺失突变体菌株,暗示着SisPINA可能是一个不可敲除的基因。利用遗传回补实验我们确认了SisPINA是S.islandicus细胞正常生长所必须的基因。
  接下来,我们鉴定了SisPINA的基本生化性质。首先,构建了表达野生型和四个不同点突变体的载体;然后,在E.coii中进行异源表达后并对目的蛋白进行了纯化。最后,我们鉴定了SisPINA的ATP水解活性、DNA结合活性和HJ链迁移活性。ATP水解实验表明SisPINA具有明显的ATP水解能力,不同的DNA底物对其ATPase活性无明显的影响。凝胶阻滞实验表明SisPINA能够结合不同类型的DNA底物,包括单链DNA、钝端双链DNA、5’-overhang DNA、 Y形DNA、复制叉DNA和HJ DNA,但是结合复制叉DNA和HJ DNA的能力明显强于其他DNA底物。进一步,我们发现SisPINA能催化HJ DNA发生链迁移,生成Y形的迁移产物,并能够继续解链Y形DNA产生单链DNA。同时,我们确认了SisPINA的链迁移活性依赖其ATPase活性。
  为了进一步研究SisPINA在细胞内的生物学功能,我们鉴定了与SisPINA相互作用的蛋白并分析了蛋白之间的相互作用。实验结果表明, SisPINA与 Hjc具有功能上的相互作用,SisPINA能够明显增强Hjc切割不可动HJDNA的解离酶活性,同时,Njc切割可动HJ DNA的链的偏好性也受到SisPINA的调节,但Hjc对SisPINA的HJ链迁移活性则有明显的抑制作用。除了与Hjc有相互作用,SisPINA和RFCs及Hjm都能分别形成稳定的复合物。Pull-down实验进一步确认了SisPINA的羧基端区域介导了SisPINA与Nc,RFCs和Hjm的相互作用。
  最后,为了从原子水平上揭示SisPINA的作用机理,我们解析了SisPINA两个突变体的晶体结构。SisPINAK261A的晶体结构显示,一个SisPINA的晶胞中包含有6个SisPINA蛋白分子,SisPINA可形成稳定的环形六聚体,该结果与SisPINA在溶液中也形成六聚体的结果一致。进一步分析组成SisPINA六聚体的亚基,我们发现六个亚基处于两种不同的构象,其中亚基A(B,C和E)为未结合AT结的构象,亚基D(F)为结合ATP的构象。通过ATP的结合和水解引起SisPINA构象的变化,从而推动HJ发生链迁移。 SisPINAR147KI199SR206A的晶体结构显示,SisPINA的羧基端可折叠形成一个KH结构域(hnRNPKhomology结构域),在SisPINAK261A的晶体结构中由于电子密度缺失并未观察到该区域的晶体结构。有意思的是在该突变体的晶胞中只包含有一个SisPINAR147KI199SR206A蛋白分子,这种突变导致SisPINA发生解聚的分子机理还需要进一步的研究。根据SisPINA和Hjc的晶体结构,以及SisPINA与Hjc功能上的相互作用,我们构建了SisPINA和Hjc共同处理HJDNA的结构模型,该模型为揭示古菌中Holliday junction的处理机制提供了新的视角。
[硕士论文] 陈欢君
生物工程 广西大学 2016(学位年度)
摘要:芽孢(spore)是一些杆菌和球菌在恶劣环境下在其营养细胞内形成的休眠体。芽孢因其特殊结构,特别是核内高含量的吡啶二羧酸钙(Ca2+-DPA)成分,而对热、辐射、干燥、有毒化学物质具有耐受性和抗性,一旦条件适宜就会萌发成为营养态细胞。研究芽孢萌发特点,分析理化因子对芽孢萌发的影响,在抑制和预防医源、食物源芽孢杆菌等方面有着重要意义。
  苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是全球应用最为广泛的生物农药,与一些病原性细菌具有密切的遗传关系,研究其萌发机制和影响因素,有助于了解试剂对芽孢的杀灭机理,提高生物农药使用效率。
  本文利用微分干涉差(DIC)显微成像与拉曼光谱相结合的方法,动态监测单个Bt芽孢在受到紫外线辐射、NaOH处理、HCl处理后的萌发过程。
  结果表明:
  (1) Bt芽孢对紫外线有较强的抵抗作用。紫外辐射促使Bt芽孢蛋白质的二级结构发生改变,影响最显著的是萌发剂受体,其次是DPA释放通道的相关蛋白,而对皮层水解酶的影响较小。
  (2) NaOH处理并没有破坏Bt芽孢的内膜,蛋白质的二级结构变化不明显,但破坏芽孢萌发的重要相关蛋白质,受损最严重的是皮层水解酶,其次是DPA释放通道及相关蛋白。1.0mol/L NaOH处理30~60min后,75%以上的芽孢无法形成新菌落;而50%以上的芽孢能在丙氨酸的触发下萌发,但不能在外源CaDPA的触发下萌发。
  (3) HCl浓度对芽孢的影响比处理时间长短的影响更大,HCl处理使与萌发相关的蛋白钝化和受损,影响最大的是萌发剂受体蛋白,其次是与释放CaDPA、皮层水解有关联的蛋白。HCl同时影响芽孢的通透性,促进释放部分CaDPA。
[硕士论文] 赵传强
植物病理学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile CT2)是一种最适生长温度较高的极端微生物,其产生的纤维素酶在高温下可以保持优良的催化活性,此特性利于纤维素酶的工业应用。本研究以嗜热毛壳菌为研究对象,通过RT-PCR扩增出编码嗜热毛壳菌外切纤维二糖水解酶CBH3及内切葡聚糖酶 EG2成熟肽的基因,利用毕赤酵母诱导表达体系分别对这两个蛋白进行了高效表达、纯化及性质研究;对外切纤维二糖水解酶CBH3进行同源建模,选定了5个氨基酸位点并且分别进行了定点突变,利用毕赤酵母表达体系同样对5个突变酶分别进行了高效表达、纯化及性质研究。
  酵母工程菌WTCBH3表达的CBH3酶,其蛋白分子量大小约为47kDa,最适反应温度为60℃,最适反应pH为5。该酶在70℃条件下保温1h后,剩余酶活力仍有最高酶活的80%,具有良好的热稳定性。CBH3在50℃~60℃时,酶活力保持在最高酶活的90%以上,但当反应温度高于65℃后,CBH3酶活力会随着温度的升高而迅速降低,当温度达到70℃时,剩余酶活力不足20%;酵母工程菌WTEG2表达的EG2酶,其蛋白分子量大小约为45kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH为5,该酶在70℃条件下保温1h后,剩余酶活力有70%。
  外切纤维二糖水解酶Cel7B与CBH3的氨基酸序列相似度达到80.65%,且Cel7B的空间三维结构已通过X射线衍射技术了解清楚,Cel7B各项参数符合同源建模的模板标准。将CBH3与Cel7B进行同源建模后,选定了CBH3上5个与底物结合相关的氨基酸位点为突变位点。通过定点突变的方法,将5个选定的氨基酸分别突变为丙氨酸后,进行酵母诱导表达、纯化、收集蛋白,测定纯化蛋白的酶学性质,期待筛选出CBH3结构域中底物结合区的关键氨基酸。
  对纯化的5个突变酶 CBH3-246Y、CBH3-250R、CBH3-261D、CBH3-337D、CBH3-391R进行活性测定,5个突变酶的最适温度均为60℃,最适pH均为5。5个突变酶的酶活力与原酶CBH3相比都产生了不同程度的降低,其中突变体CBH3-391R的酶活力降低了约60%;突变体CBH3-246Y、CBH3-261D、CBH3-337D的酶活力均降低了25%以上。在反应温度为40℃时,除CBH3-250R外,其它四个突变酶活力均降低到最高酶活的30%以下。
  根据实验结果可以推断出,CBH3氨基酸序列中第246位的酪氨酸、第261位的天冬氨酸、第337位的天冬氨酸、第391位的精氨酸都是CBH3催化反应过程中与底物结合相关的重要氨基酸,其中第391位的精氨酸的突变对酶分子的活性影响最大。
[硕士论文] 王飞
食品工程 齐鲁工业大学 2016(学位年度)
摘要:无性产孢是丝状真菌主要的繁殖方式,也是病原真菌传播的基础,真菌无性孢子的产生也受内在分子机制的调控。真菌无性产孢分子机制的阐明,对有益真菌的利用及有害真菌的防控都具有重要的意义。粗糙脉孢菌容易培养,生长速度快,不易被污染,基因注释信息非常详细,70%的基因都具有敲除突变体,具有丝状真菌覆盖率最大的突变体库,是用作研究丝状真菌无性产孢非常好的模式材料。
  为了全面解析ADA-6所调控的基因,我们首先采用RNA-seq技术,比较了野生菌株在产孢诱导前后全基因组范围的差异表达谱(诱导前0h,诱导12h,诱导24h),对诱导前后差异表达基因的聚类分析发现,无性产孢诱导主要影响氧化还原过程与代谢过程,与ROS(reactive oxygen species)相关的基因差异表达明显,无性产孢诱导阶段伴随ROS的升高。同时,与产孢相关的基因(包括调控基因和结构基因)出现特异性表达。为揭示其它诱导表达基因在无性产孢中的功能,我们对这些基因的突变体的无性产孢表型进行了分析,新发现6个正向影响无性产孢的基因(NCU09792、NCU05159、NCU06112、NCU05079、NCU00461、NCU07521(fwd-2))。这6个基因在无性产孢过程中增量表达,相应的基因突变体无性产孢量与野生菌株相比有明显降低,说明它们对无性产孢具有正调控作用。
  其次,我们比较了野生型菌株和ada-6突变株在无性产孢诱导前后转录表达谱,差异表达基因的聚类分析发现差异表达基因主要涉及氧化还原过程,有机酸、羧酸、氨基酸跨膜运输过程,细胞壁组织和膜改性,分子功能上主要是氧化还原酶活性和水解酶活性。与产孢相关的fl和eas基因,在突变株中的表达量明显低于野生型菌株的水平,转录因子ADA-6正调控fl基因和eas基因。poi-2和nop-1是之前报道过与产孢相关的基因,RNA-seq和qrt-pcr结果显示ada-6正向调控调控poi-2和nop-1。参与氧化还原过程的酶编码基因NCU04865、NCU09209、NCU08755、NCU08856,突变株表型与野生型菌株相似,但在突变株中的表达量明显低于野生型菌株的水平,说明ada-6可能和其它转录因子共同调控这些基因。我们的结果进一步加深了我们对粗糙脉孢菌无性产孢发育及其调控网络的认识,对丝状真菌无性产孢及其调控的认识有一定借鉴意义。
[硕士论文] 黄红英
微生物 山西大学 2016(学位年度)
摘要:当三个终止密码子UAA、UAG和UGA中的任何一个进入核糖体的A位点时,蛋白质翻译终止发生。在使用标准遗传密码子的生物中,真核生物第一类肽链释放因子(eRF1)可以完全识别三个终止密码子,但是密码子变异的物种或细胞器中终止密码子发生了重新分配。纤毛虫eRF1只能识别UAA、UAG和UGA中的一个或两个。在高等真核细胞中,eRF1的N端结构域(domain1)已被证明在蛋白质合成的终止过程中负责识别 mRNA上的终止密码子,其中3个高度保守的模体结构域GT区,TASNIKS区和YCF区,对eRF1识别终止密码子的活性有较大影响。但具体哪些氨基酸或者模体负责三个终止密码子的识别仍然没有一致的结论。关于第一类肽链释放因子的识别机制目前尽管建立了几种模型,但几种模型之间仍然有诸多矛盾,各种模型也不够完善,还需要更为确定的数据来证实哪些序列参与终止密码子的识别以及识别的方式。
  为了鉴定第一类肽链释放因子中识别终止密码子的关键的氨基酸位点,选用通用密码子物种(standard code species)的eRF1,如酵母(Saccharomyces cerevisae)和肠肾虫(Nycototherus ovalis)的eRF1,以及变异密码子物种(variant code species)的eRF1,如八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)和四膜虫(Tetrahymena thermophilia)作为研究材料。其中八肋游仆虫将UGA编码为半胱氨酸,而四膜虫只将UGA作为终止密码子。设计了两种实验方案。第一是将纤毛虫八肋游仆虫 eRF1的 N端结构域中的关键的氨基酸位点逐一突变为肠肾虫、四膜虫和酵母eRF1的对应位点的氨基酸。第二个方案是将酵母的 eRF1的 N端结构域的关键的氨基酸位点分别突变为肠肾虫、四膜虫和游仆虫eRF1对应位点的氨基酸。分析这些氨基酸位点的改变对eRF1性质和功能的影响。研究的氨基酸位点有第57位、60位、61位、70位和126位(以人氨基酸序列计数)。
  研究方法主要是5氟乳清酸平板法和双荧光素酶(萤火虫和海肾荧光素酶基因)报告系统。前者用以分析突变体 eRF1支持细胞生存的活性,后者分析突变体 eRF1对于三个终止密码子的通读效率。使用酵母菌株YDB447(eRF1基因敲除型)为工具菌。研究结果显示,这些突变体eRF1的识别活性发生了显著变化。当游仆虫eRF1(Eo/Sc eRF1)中引入A70S时,不能支持酵母细胞的生长,对UGA的通读效率达到了23.4%,是野生型的两倍左右,当继续引入I126L、E60S与S61N之后,得到的组合突变体Eo/Sc eRF1(E60S/S61N/A70S/I126L)(对应于酵母氨基酸位点)可以支持酵母的生长,和野生型的生长情况相当,并且Eo/ Sc eRF1可以识别三个终止密码子UAA、UAG和UGA,通读效率分别为0.16%、0.16%、0.05%。结果表明,就细胞的生长而言,eRF1上两个模体TASNIKS(第55-61氨基酸)与Y×C××F(第122-128位氨基酸)对终止密码子的识别是起协同作用的。向Eo/ Sc eRF1中引入A70S和I126F(类似于四膜虫eRF1氨基酸)后,突变体识别UGA的活性明显降低,通读效率达到35.8%。当酵母eRF1(Sc eRF1)中引入G57S和L126F(类似于四膜虫氨基酸位点)后,得到的eRF1突变体对UAA,UAG和 UGA的通读效率都有所提高,分别达到0.99%,0.83%和3.22%,是野生型Sc eRF1的4-8倍;当引入S70A与 L126I后(类似于游仆虫氨基酸位点),Sc eRF1突变体对UGA表现出了15.96%的通读效率,是野生型的35倍,对UAA和 UAG的通读却没有表现出明显的变化,产生了类似于游仆虫的密码子识别模式,进一步说明S70A/L126I在决定肽链释放因子识别活性中的关键作用。
  由此可见,eRF1的N端结构域中的关键的氨基酸位点对于eRF1的性质和功能具有决定性的作用,尤其是第70位和第126位的氨基酸。在NIKS模体中的氨基酸位点对eRF1的功能也具有一定的影响。该结果支持了cavity模型,为进一步研究肽链释放因子识别终止密码子的机制提供大量数据。
  其次,本研究进一步分析了蛋白质的翻译后修饰对第一类肽链释放因子功能的影响。利用赭纤虫(Blepharisma japonicum)eRF1(Bj-eRF1)为材料,预测发现,赭纤虫eRF1和酵母eRF1的N端的一些与密码子识别有关的氨基酸被磷酸化修饰的几率很高,且二者磷酸化修饰的氨基酸位点有所差异。用基因突变方法向 Bj-eRF1中引入磷酸化激酶识别位点,或者删除其自身可能的磷酸化激酶识别位点,分析了磷酸化修饰对BJ-eRF1识别密码子特异性的影响。当向赭纤虫eRF1的N端引入与酵母eRF1一致的磷酸化位点时(N23S/D25E/A70S/Q115E),其识别终止密码子的特异性发生了显著的改变,对UGA识别的通读效率显著降低,对UGA、UAG、UAA通读效率分别为5.71%、1.59%和0.20%,由 UAA/UAG识别特异性转变为UAA/UAG/UGA三个密码子全识别。说明这些位点磷酸化可能参与调节 eRF1识别终止密码子的过程。
[硕士论文] 崔金玉
微生物学 青岛农业大学 2016(学位年度)
摘要:甲基营养菌(Methylotrophs)能利用一碳(C1)化合物如甲烷、甲醇和甲胺等为唯一碳源和能源的革兰氏阴性菌。在我国甲醇产能严重过剩,同时沼气甲烷资源综合利用率低,因而改造甲基营养菌生物催化一碳化合物合成高附加产品越来越受关注。Methylobacterium extorquens AM1是甲基营养菌的模式菌株,其在以甲醇为碳源时,利用Ethylmalonyl-CoA代谢途径(EMC途径)生成乙醛酸回补丝氨酸同化途径,更重要的是 EMC途径为合成高附加产品提供重要的前体物。前期研究发现当碳源由 C4琥珀酸转变为C2乙胺过程中,Ethylmalonyl-CoA变位酶是一个重要的调控节点。因而本研究探究了Methylobacterium extorquens AM1以甲醇为碳源时,Ethylmalonyl-CoA变位酶是否也是重要核心调控节点,并基于此探究利用EMC途径中的中间代谢物巴豆酰辅酶A合成1,3-丁二烯重要前体物巴豆醇关键脱氢酶的基础研究,为胞内催化转化巴豆酰辅酶A生成1,3丁二烯提供基础。
  首先将EMC途径中ecm、phaA、mcmA和mcmB基因利用强启动子mxaF分别过表达,发现在以甲醇为碳源生长时,与对照菌株(含有空质粒)相比,ecm基因过表达菌株的比生长速率降低27%;利用液相色谱三重四级杆质谱联用(LC-QQQ-MS)和气相色谱质谱联用(GC-MS)进行胞内外代谢物组检测,靶向代谢物组分析显示其内大部分胞内中心代谢物浓度没有显著变化,而聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)降低了4.5±0.22倍,3-羟基丁酰辅酶A(3-hydroxybutyryl-CoA)增加了1.6±0.21倍,具有一定毒性的关键调控代谢物乙醛酸增加了2.6±0.19倍,且胞外也显著积累增加1.8±0.33倍,这些结果表明过表达ecm基因导致乙醛酸积累和聚羟基丁酸酯降解;同时利用液相色谱飞行时间质谱(LC-QTOF)进行非靶向代谢组数据采集,运用 MZmine2、Metaboanalyst3.0和MetFusion等生物学多元统计方法寻找生物标记物及定性,分析发现两个化合物 alanine(Ala)–meso-diaminopimelic acid(mDAP)和Ala-mDAP-Ala,在ecm基因过表达菌株中显著积累,比对照菌株分别增加了53.3±4.6倍和47.6±8.4倍;此外,在胞外加入不同浓度乙醛酸发现,随着乙醛酸浓度的增加,这两个短肽含量随之同步增加,而 PHB未发生显著变化。基于此研究,通过表达异源蛋白、蛋白纯化和酶活测定等方法初步筛选催化EMC途径中间代谢物巴豆酰辅酶A合成巴豆醇的脱氢酶,发现来源于E. coli BL21(DE3)的双功能酶乙醛/乙醇脱氢酶能以巴豆酰辅酶A、巴豆醛、丁酰辅酶 A和丁醛为底物进行催化反应,结果分别为0.020±0.01μmol/min/mg,0.500±0.05μmol/min/mg,0.245±0.01μmol/min/mg和2.587±0.40μmol/min/mg。乙醛/乙醇脱氢酶催化丁醛的酶活是催化丁酰辅酶A的10倍,表明第一步脱去辅酶A的催化反应可能是限制性步骤。这为胞内生物催化转化巴豆酰辅酶 A,进而合成1,3-丁二烯提供基础。
  本研究首次揭示了Methylobacterium extorquens AM1在以甲醇为碳源生长时,ecm基因过表达导致比生长速率降低,与胞内外关键代谢物变化存在紧密关系,为以后EMC途径的代谢调控提供借鉴,乙醛/乙醇脱氢酶酶活的测定为改造甲基营养菌胞内生物催化转化巴豆酰辅酶A生成巴豆醇提供基础。
[硕士论文] 刘亢
微生物学 青岛农业大学 2016(学位年度)
摘要:木聚糖是半纤维素的一种最主要的成分,是除了纤维素以外含量最高的可再生资源,以木聚糖为底物的木聚糖酶是一种非常重要的酶,在快速工业化的过程中有很大的发展应用潜力,因此得到了越来越广泛的研究。生活在极端环境中的极端环境微生物所产生的木聚糖酶具有很多普通微生物酶所不具有的优良特性,比如耐盐、耐高温及耐酸碱等特性。目前,人们对于高盐环境下产木聚糖酶的极端环境微生物研究较少。本实验室前期分离到了一株耐盐的菌株海微菌 LS-A18,具有产木聚糖酶的特性,本文以该株菌为研究对象进行了进一步的研究。
  本研究从海微菌LS-A18菌株中克隆得到了分别来自GH11家族和GH10家族的两种木聚糖酶基因xyl353及xyl1294,并构建了原核表达体系。通过诱导原核表达体系表达的方法分离得到了这两种木聚糖酶蛋白,并测定了其酶学性质。
  1、本研究将得到的两种木聚糖酶基因连接到表达质粒pET-28a(+)上,转入受体细胞大肠杆菌E.coli BL21(DE3)内,并诱导其在E.coli BL21(DE3)内成功表达。
  2、本研究通过DNS测定还原糖的方法来检测诱导获得的木聚糖酶是否具有木聚糖酶活性。并且最终确定所获得的木聚糖酶具有木聚糖酶活性。
  3、本研究测定了两种木聚糖酶的最佳反应温度、最佳反应pH、最适盐浓度,得出最佳反应温度为50℃,最佳反应pH为pH7.0,最适盐浓度为0%NaCl。
  4、本研究测定了两种木聚糖酶的酶学性质。分别测定了温度稳定性、pH稳定性、盐浓度稳定性、金属离子、表面活性剂和有机溶剂对其影响。两种酶均在温和条件下酶稳定性最佳,当环境恶化之后,酶的稳定性随之降低;Hg2+对两种酶的活性均有较大的抑制作用,Co2+在一定的浓度条件下对两种酶的活性有一定的促进作用;添加剂 SDS、TritonX-100、β-巯基乙醇、高浓度(10 mM)EDTA以及常见的有机溶剂对Xyl353及Xyl1294的酶活力有较大的抑制作用。
[硕士论文] 石美琳
微生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:细菌RNA聚合酶(RNAP)的σ因子对特定启动子序列的识别和结合决定了特定阶段和条件下细胞内基因表达的差异,是原核生物基因表达中最为保守的初级调控方式。除了决定细胞生存必须的主要σ因子外,多数细菌都编码有可替代σ因子,它们在诸如膜胁迫、营养获得、发育分化等广泛的细胞生理生化过程中发挥重要作用。胞质外功能σ因子(Extracytoplasmic Function sigma factor,ECFσ)是可替代σ因子中数量最多、序列最为多变的一类小的调控蛋白,一般受到跨膜的anti-σ因子调控,是原核生物感知和应答环境变化的重要的信号传导与调节机制之一。典型的粘细菌是一类以土壤为主要生境且分布广泛的环境微生物,拥有包括多细胞营养扩展、子实体形成和孢子分化在内的复杂生活周期。该类群拥有目前已知最大的细菌基因组,编码大量的ECFσ因子,推测它们在粘细菌适应多变自然生境、完成生活史中发挥重要作用,但尚缺乏系统的研究。通过对模式菌株基因组序列的生物信息学分析,我们从其编码的ECFσ/antiσ基因中选择了尚未有报道的31个ECFσ因子和14个ECF anti-σ因子进行研究。
  我们首先利用同源重组敲除法,在模式菌株Myxococcus xanthus DZ2中成功构建了45个ECFσ/anti-σ单因子缺失突变株。鉴于ECFσ因子主要是对胞外信号进行应答,而粘细菌的生态分布又较为广泛,我们首先选择了温度、pH、氧化水平、盐和渗透压力等非生物环境信号进行研究。对于每个信号分别设置5-10不同的梯度,测定背景株的生长情况并选择亚适生长条件作为后续分析的信号参数,分别是:温度26℃和35.5℃,酸碱度pH6.4和pH8.8,3%甘露醇,100 mMNaCl和5 mM H2O2。
  在确定了上述具体信号和参数之后,我们深入比较了所有突变株与野生株在这些条件下的营养生长情况。在正常培养条件下,所有突变株的生长与野生菌株DZ2没有明显变化,符合ECFσ因子为可替代σ因子的作用特点。而在设定的压力条件下,许多突变株的生长减慢,提示相应的ECFσ因子在该种环境信号应答中发挥作用。经过复筛验证,我们获得了与野生株生长曲线显著不同的11株突变株,其中有5株仅在某一种研究条件下生长减弱,分别为MXAN_2395、 MXAN_3686、MXAN_3959、MXAN_4315和MXAN_6174基因敲除突变株,提示它们可能是特异性应答相应刺激。另外6株即MXAN_4147、MXAN_4148、MXAN_4987、MXAN_6460、MXAN_6461和MXAN_7214基因敲除突变株则在两种及以上设定条件下均出现了生长变化,提示它们可能应答多种环境变化。
  营养匮乏引发的多细胞子实体发育及抗逆性粘孢子分化是粘细菌最为显著的特征,这一过程受到严格的时间和空间调控,涉及到包括诸多调控途径如双组份系统等在内的复杂调控网络。但除了营养匮乏外,这一过程是否也会受到其他外界不利环境的影响?ECFσ因子是否也参与了该过程的信号传导与调控?为了解答这些问题,我们比较了所有突变株与野生株在添加和不添加10mMH2O2条件下的运动、子实体形成和孢子萌发率。结果显示,氧化压力条件下,与野生株相比,有25突变株与DZ2的运动不同,其中既有单独影响个体或者群体运动能力的,亦有同时影响两种运动能力的。而ECFσ因子对于发育和生孢的影响则更为多样,例如,有7株突变株与正常饥饿信号刺激下的发育相关,进一步的功能鉴定将可以补充现有的粘细菌子实体发育信号途径。另有5株突变株与DZ2在正常条件下的发育和生孢率无明显差别或相对氧化压力下的差异较小,而在氧化压力条件下,其中3株MXAN_4316、MXAN_5410和MXAN_7288基因缺失突变株现为发育延迟,生孢率明显降低,而MXAN_2394则表现为发育提前,生孢率明显升高,另1株和MXAN_4986基因缺失突变株的生孢率也明显升高。初步证实多种不利环境变化均可诱发粘细菌的发育分化过程。以上结果提示,ECFσ因子对黄色粘球菌的运动、子实体形成和生孢等均发挥着广泛而复杂的调控作用。
  综合所有突变体表型,我们发现MXAN_6461基因缺失的性状最为显著,在高温、酸、碱、盐和氧化压力信号下它的生长都比野生株慢,且在营养匮乏条件下不能正常发育,也无法形成抗逆性的粘孢子。本论文最后部分对其进行了深入研究。我们首先通过基因回补实验确证了突变株的所有缺陷性状均由该基因缺失导致。qRT-PCR分析显示,野生株中的MXAN_6461基因在35.5℃、pH6.4、/pH8.8,3%甘露醇,100mMNaCl和5 mM H2O2条件下的表达量都有不同程度的提高,这与其条件下的生长表型相一致,说明该因子确实作为广谱性ECFσ因子参与粘细菌对高温、酸、碱、盐和氧化胁迫等环境信号的应答。转录分析同时显示,MXAN_6461与其上下游基因MXAN_6457-MXAN_6462共转录。将MXAN_6461异源表达纯化后进行了bandshift试验,结果显示其所在operon的启动子序列位于MXAN_6462基因上游500bp内。该基因簇中的MXAN_6460预测编码MXAN_6461的anti-σ因子。我们利用细菌双杂交试验证实MXAN6460和MXAN_6461的编码产物确实存在相互作用。这些结果初步揭示了ECFσ因子MXAN_6461的信号传导机制。
  综上所述,本论文系统研究了M.xanthus中ECFσ因子在不同环境压力下的生长、运动、发育和孢子萌发等表型,对其中表型显著的ECFσ因子进行了调控机制分析,为进一步研究鉴定不同ECFσ因子的信号传导及应答机制奠定了扎实的基础。
[硕士论文] 赵文昭
微生物学 厦门大学 2016(学位年度)
摘要:DNA是至今发现的绝大多数生物遗传信息的携带者。DNA复制机制保证了细胞分裂期间遗传信息的复制和传递,是维持生物遗传稳定性的前提。DNA复制过程涉及几十种蛋白和酶的参与以确保遗传信息被准确而及时的复制。
  研究DNA复制对人类疾病,特别是肿瘤及传染病的机理探索有至关重要的意义。然而参与真核生物(包括人类)DNA复制的酶系非常复杂,对真核生物DNA复制机制的研究面临着诸多挑战。细菌的DNA复制系统相对简单,但其复制酶系与真核生物差别较大。古菌的复制酶系与真核生物的复制酶系相似,而且相对简单。因此古菌可以作为研究真核生物DNA复制的一个简易模型。本文参照本课题组总结的T.kodakarensis菌中DNA复制蛋白的互作网络,关联分析了这些蛋白在P.pacificus菌中的同源基因,并建立了这些同源基因的重组表达载体库和蛋白库,为今后开展蛋白组学研究奠定了基础。
  本文还研究了PCNA与其互作蛋白的关系,并探索了可能的调控机制。一些古菌可编码一个小蛋白Tip,它能够抑制复制蛋白PCNA三聚环结构的形成,进而抑制DNA复制。由于结构性的原因,野生型Tip蛋白不适宜用来解析PCNA-Tip复合物的晶体结构。本研究对来自P.pacificus菌的Tip蛋白进行了一系列改造,找到了一个依然能够与PCNA互作的突变型Tip多肽,它对于研究PCNA-Tip复合物的晶体结构和互作表位非常有利。本文还利用荧光标记核酸结合PAGE方法,对GAN蛋白在不同二价离子环境下的生化性质进行了研究。此外本文还尝试利用一代测序结合统计学方法,对DNA聚合酶的保真性进行研究并初步将该方法用于商业化聚合酶的品质分析。
[博士论文] 戚振华
生物化工 天津大学 2016(学位年度)
摘要:硫酸盐还原菌(SRB)是最常见且对全球碳硫循环极其重要的一种厌氧微生物。已知SRB有两种生命形式:硫酸盐代谢和共生代谢。为了全面研究SRB两种生长条件下代谢调控机制,我们发展并优化了一套共生培养技术和单细胞RT-qPCR分析技术,并利用此技术以硫酸盐还原菌的模式菌株普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)为研究基础,对其进行三部分对比分析:①对比分析D.vulgaris与巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)共生代谢和纯培养硫酸盐代谢的基因表达差异;②硫酸盐代谢下,对比分析D.vulgaris生物膜与浮游细胞基因表达差异;③共生代谢条件下,对比分析了从原始纯培养到共生建立及维持的进化过程中基因表达差异。
  结果发现:①通过单细胞水平下对比分析研究,我们证实了在细胞中存在专一负责维持共生代谢关系的一些基因(如:基因簇(DVU0148-DVU0150)等),并发现D. vulgaris共生代谢与纯培养代谢单细胞间均存在明显的异质性,这将有助于以后对微生物共生相互关系的分子机制及其调控的理论研究;②通过单细胞水平下对比分析研究,我们发现在D. vulgaris生物膜和浮游培养中单细胞间都存在明显的基因表达异质性,生物膜单细胞中基因表达异质性相对于浮游细胞明显的增加,生物膜高度异质性很可能造成了不同部位的细菌对金属腐蚀的不同作用,进一步加深了对普通脱硫弧菌生物膜形成以及造成金属腐蚀的分子机制的理解,而且研究发现了三个铁离子浓度调控相关基因(DVU1340、DVU1397和DVU2571)与高浓度铁离子环境下的D. vulgaris生物膜正常代谢的关系,发现高浓度铁离子很可能对D. vulgaris生物膜形成具有毒害作用;③利用单细胞基因表达分析技术,对比分析了在共生进化50次传代D vulgaris菌株中发现的8个重要突变基因在不同共生传代阶段的基因表达水平和基因表达异质性水平,发现了这8个突变基因在从原始纯培养到共生建立与维持过程中表达水平和表达异质性水平的变化规律,首次在单细胞水平上发现了这些基因与共生进化代谢关系。
  总之,通过单细胞技术和高通量测序等技术,我们首次对D. vulgaris两类生活形式(硫酸盐代谢和共生代谢)的转录水平和细胞间转录异质性水平做了比较全面的对比分析,发现了与共生进化调控与代谢相关的一些基因,并鉴定出了一些基因与共生代谢及生物膜的关系,对D. vulgaris遗传、生理和进化及该物种所处环境、同一环境下其他物种对其代谢的影响有了进一步认识,有助于加深对厌氧微生物SRB代谢与生物腐蚀、生物修复及全球碳硫循环关系分子机制的理解。
[博士论文] 丁啸
生物医学工程 东南大学 2016(学位年度)
摘要:宏基因组也称环境基因组,代表了环境微生物群落中所有物种基因组的总和。由于自然界中仅有不足1%的微生物可以单纯培养,而宏基因组学的研究方法使得微生物的免培养研究成为可能,所以宏基因组学逐渐成为研究微生物的主流方法。宏基因组学的首要任务就是分析环境群落的物种多样性,然后在此基础上研究物种的功能。此外,宏基因组学的另一个重要任务就是研究不同环境类型的宏基因组之间的差异,从而解决实际的生物医学问题。DNA序列是生命信息的主要载体,解读序列信息是研究生命活动的关键。而序列特征作为序列信息的表现形式,可以有效地对物种或者功能基因进行辨识。随着高通量测序技术的日益成熟和测序费用的降低,很多大型宏基因组计划都测序完成。面对海量的宏基因组数据,开发高效准确的数据分析方法迫在眉睫。
  宏基因组数据分析方法通常分为两类:基于比对和基于序列特征的分析方法。基于比对的方法是以数据库作为参考,利用比对软件分析数据,方法的正确性依赖于数据库信息的完整程度。面序列特征直接提取于序列,是对基因组序列内部的组成和关联信息的深入挖掘,可以特异地区别物种以及基因组中的功能原件。所以基于序列特征的宏基因组分析方法不依赖于数据库,不仅能够准确分析宏基因组测序数据,还可以从中探索未知的信息,为研究人员提供新的研究思路。本课题围绕基因组序列特征,建立具有物种分辨能力的序列特征模型,发展基于序列特征的宏基因组分析方法。论文主要包含以下内容:
  1.提出了一种序列关联性特征。序列统计特征分为组成性特征和关联性特征。组成性特征统计的是基因组序列中不同组分的含量如GC含量,寡核苷酸频率等。而序列关联性特征则是对基因组中不同组分之间的相互关联性进行量化。本文基于统计学中的比率比和信息理论中的互信息的概念提出了一种序列关联性特征ICO(Intrinsic Correlation of Oligonucleotides),寡核苷酸内关联度特征,并将其应用在宏基因组测序数据的分类方法中。ICO特征反映了一个寡核苷酸中两个连续组分之间的关联信息,可以作为基因组标识,用以辨别不同物种的基因组及其片段。序列特征图谱的实验结果表明ICO特征不仅可以区分不同的微生物基因组,还可以准确辨识基因组片段的归属。种内和种间距离的差异统计分析表明ICO的两个单独部分对于辨别不同分类级别的物种有着各自的优势,而ICO特征作为整体性能要优于每一个单独部分,同样要优于四联核苷酸频率特征。最后,我们基于皮尔逊相关系数定义了种内和种间关联度去评估序列特征辨别基因组片段归属的能力。实验结果证明相比于四联核苷酸频率特征,ICO可以更准确地辨别DNA片段的归属。综上所述,我们提出的这种序列关联性特征通过对基因组信息的深入挖掘,有着良好的辨别微生物物种基因组及其片段归属的能力。
  2.发展了一种基于序列特征的宏基因组无监督分装算法。宏基因组分装算法的目的是将宏基因组测序数据中杂乱无章的片段根据其所属的物种来源进行归类。我们将四联核苷酸的ICO特征和频率特征进行组合,结合谱聚类算法,发展了一种基于序列组合特征的无监督分装算法,HSS-bin。我们通过对模拟和真实宏基因组数据集的分装实验评估了HSS-bin算法的性能。实验结果表明,基于组合特征的分装算法弥补了基于单独特征的分装算法的不足,对包含短片段和物种丰度不均匀模拟数据集的分装正确率都超过基于两种单独特征的分装算法。此外,结合谱聚类算法的机器学习策略可以显著提高分装算法的正确率。对比广泛应用的无监督分装算法,HSS-bin算法分装人类肠道宏基因组数据集的正确率分别高出MetaCluster算法和LikelyBin算法38.1%和31.18%。因此,序列组成性特征和关联性特征的组合以及谱聚类算法的应用在宏基因组数据的分装工作中都具有很好的应用价值。
  3.建立了一种基于序列特征的宏基因组有监督样本分类算法。不同微生物群落的宏基因组样本差异分析是宏基因组学的主要任务之一。我们利用KPLS(Kernel Partial Least Squares)算法对基于长寡核苷酸的ICO特征集合进行动态地筛选,最后结合SVM的机器学习策略提出了一种基于序列特征的宏基因组有监督样本分类算法,DectICO。通过对三组不同测序深度的真实宏基因组测序数据进行分类,我们评估了DectICO算法的分类性能。实验结果表明我们发展的分类算法在基于长寡核苷酸时性能比基于寡核苷酸的频率特征的分类算法要好,并且优势随核苷酸长度变长而增大。另一方面,利用动态的KPLS算法对ICO特征进行筛选可以显著地提高DectICO算法的分类正确率。此外,我们还通过实验比较了DectICO算法和基于RSVM(Recursive Support Vector Machine)的分类算法的性能。结果表明我们发展的分类算法正确率更高,算法的稳定性和通用性也更好,其稳定性受宏基因组数据集测序深度的影响更小。综上所述,该工作可以为后续的微生物群落差异分析提供了基础,进一步为检测临床样本的疾病表型、法医学鉴定以及环境污染等研究提供帮助。
[硕士论文] 原月梦
生物化学与分子生物学 东华大学 2016(学位年度)
摘要:近二十年来,来源于极端环境微生物及其产生的极端环境酶,已经成为很多领域的研究热点。糖苷酶是工业生产中不可缺少的重要酶类,而内切1,4-β-甘露糖苷酶在食品、制药、饲料、纤维制造等领域更是有着重要的工业应用价值。因此,开发耐热内切1,4-β-甘露糖苷酶对工业生产具有重大的研究意义。海栖热袍菌(Thermotoga maritime)是极端嗜热微生物的一种,生长条件十分苛刻,大规模的发酵培养用于工业化生产十分困难。利用基因工程技术对海栖热袍菌的耐热酶基因进行克隆并高效表达,得到需要的耐热酶是人们利用海栖热袍菌的主要方法。
  本课题主要研究了海栖热袍菌中的内切1,4-β-甘露糖苷酶。采用分子生物学手段构建得到表达内切1,4-β-甘露糖苷酶的基因工程菌,通过热处理的方式去除大量杂蛋白,便于纯化,操作简单。同时,对酶产量的发酵条件进行优化,有利于后续的工业生产研究,本文的主要研究内容及结果如下:
  1.选用海栖热袍菌(Thermotoga maritima)内切1,4-β-甘露糖苷酶(MSB8-898257)基因的克隆片段、以pET-28a(+)质粒为表达载体,大肠杆菌BL21为表达系,得到表达海栖热袍菌内切1,4-β-甘露糖苷酶的工程菌。
  2.采用IPTG作为诱导剂,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色、蛋白免疫印迹等方法进行检测,在77 kDa左右处出现目的条带,验证目的蛋白成功表达。
  3.利用生物信息学软件,进行目的蛋白理化性质分析;DNS法检测酶活性;Ni-NTA树脂进行目的蛋白纯化,得到较纯的目的蛋白,并对目的蛋白的诱导条件进行了优化。
  4.通过摇瓶培养试验考察BL21-898257基因工程菌的发酵条件并进行优化。主要考察温度、pH、诱导剂浓度、诱导培养时间、诱导起始OD600值。结果发现,培养温度、时间、起始OD600值对目的蛋白的表达量影响较为明显。并根据试验结果,设计正交实验方案,进行1L发酵液的发酵条件优化。得到最佳发酵条件为:培养温度32℃,在OD600达到1时加入0.2 mM诱导剂,诱导培养时间为7 h,收获菌体。每升发酵液可获得5 mg左右的酶蛋白表达量。
  5.通过初步的脱胶效果分析,进行重组酶的应用探究。结果表明:重组酶脱胶效果显著,在纺织纤维制造工业里有很好的应用价值。
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