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[硕士论文] 陈丽竹
生物工程 山东师范大学 2017(学位年度)
摘要:聚-β-羟丁酸(PHB)是生物质降解塑料PHA家族中最常见的一种,也是研究最为广泛、最为深入的一类材料。PHB以HB的单体形式构成的α-螺旋二级结构形成,结晶时高度立体专一,结晶度较大,大约为55%~80%。提纯成型的PHB的分子结构和物理性质如熔点、结晶度、抗张强度等类似于聚丙烯,在自然条件下能够被环境中存在的众多微生物彻底降解为C O2和H2 O,具有良好的生物降解性,有助于缓解“白色污染”的问题,是一类环境友好型塑料。PHB具有良好的生物相容性且人体对其无强烈的免疫反应,经常被用作外科手术缝合线、牙齿补填材料、心脏支架、肘钉等固定材料,也可以作为血管、骨板的外科手术替代品,此外PHB材料具有电压性,也可以做成工业电压制品。
  色盐杆菌ST307属于中度嗜盐菌的一种,因其耐盐性相对高,在利用该菌进行工业生产时可从灭菌角度入手减少成本。实验室对其研究相对较多,目前已对其基因全序列进行测序,对其胆碱脱氢酶基因和甜菜碱合成酶基因进行了克隆分析。实验通过苏丹黑染色、紫外全波长鉴定色盐杆菌ST307可以产生并积累P HB,波长235 nm检测得到未经优化ST307的PHB产值为1.48 g/L,PHB占菌体干重的29.48%。
  通过6个单因素实验:盐浓度、碳源种类、氮源种类、碳氮比、碳氮源浓度以及培养时间,确定了色盐杆菌ST307产培养基的最佳培养基方案,每100 mL的PHB培养基含蔗糖5.25 g、胰蛋白胨1.5 g、七水合硫酸镁0.03 g、氯化钙0.01 g、磷酸二氢钾0.003 g、三水合磷酸氢二钾0.01 g、磷酸二氢钠0.004 g、三氯化铁0.002 g、氯化钠6 g。CCD响应曲面实验设置四个因素:温度、转速、pH、装液量。每个因素设置3个水平,其中温度水平为:27、31和35℃;转速水平为:120、160和200 r/min;p H值水平为:6.0、7.0和8.0;装液量水平为:40、80和120 mL。最终得到最佳优化方案:使用量程为250 ml的三角瓶发酵培养时当温度为20.09℃、摇床转速为200 r/min、p H为6.0、装液量为40.02 mL时,PHB产物的OD235可以达到1.59,PHB产量为6.78 g/L,这与第二章色盐杆菌ST307未经优化的PHB产值1.48 g/L相比提高了4.59倍。
  在测序得到的色盐杆菌ST307全基因序列找出ST307产PHB的功能基因phbA(ST307GL000184)、phbB(ST307GL000185)和phbC(ST307GL000186),基因反义链序列及蛋白质序列见附图1-3。色盐杆菌ST307的三个PHB功能基因位置相连,初步推断也位于同一操作子上,研究对这三个基因编码蛋白的跨膜区、二级结构、结构域进行预测,为后续研究其编码蛋白结构打下理论基础。
[硕士论文] 李黎
核技术及应用 新疆大学 2017(学位年度)
摘要:沙漠寡营养细菌能够在极端干旱的沙漠环境中生存,本身能够分泌一种粘性多糖形成生物结皮,这种生物结皮为其它微生物的生长创造了条件。沙漠寡营养细菌对防止沙漠化具有很大的利用价值。本文利用生物信息学方法对低能氮离子注入介导外源基因转化获得的3株重组沙漠寡营养细菌(DOB)进行了比较基因组研究。
  在对DOB全基因组进行De novo测序的基础上,本研究应用生物信息学方法获得了3株重组菌株 DOB073、DOB113和 DOB981的编码基因数量分别为5363、5365和5180个,重组菌株DOB073和DOB113的编码基因数量分别比对照菌株DOB150增加了22个和24个,而重组菌株DOB981的编码基因数量比对照菌株DOB150减少了161个。基因组SNP的研究结果表明,重组菌株DOB073和DOB113的SNP数量分别为25和26个,而重组菌株DOB981的SNP数量高达192306个。基因组共线性和系统发育研究结果显示,重组菌株DOB981的基因组结构与对照菌株 DOB150相差较大,并且其基因组进化速度快于重组菌株DOB073和DOB113。
  同源基因和基因家族的分析结果表明,3株重组DOB菌基因组中绝大部分基因具有相同的功能,能匹配到Orthomcl库中相同的Group中。结果显示重组菌DOB113独有的基因家族有1个,DOB981有100个,对照菌DOB150有2个。应用Islandviewer方法的分析结果显示,DOB细菌基因组39个片段可能为基因岛。重组菌 DOB073有9处基因岛片段;DOB113有10处基因岛片段;DOB981有7处基因岛片段;对照菌DOB150有13处基因岛片段。
  本文通过对重组DOB的比较基因组学研究,探讨了低能 N+注入介导的原核微生物基因组突变与进化的分子机制,为后续相关基因功能与特点研究奠定了基础,对人们深入理解离子注入与生命细胞的相互作用机制具有重要的学术意义,并为DOB的遗传育种提供了理论依据。
[硕士论文] 文华
海洋科学 哈尔滨工业大学 2017(学位年度)
摘要:人类活动对全球环境的影响越来越大,环境中重金属的污染日益严重。在南极地区,生物遭受高盐度、高辐射、低温、重金属等多种胁迫,导致活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的积累。南极生物可以合成冷活性抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase,GR)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)等,以清除活性氧ROS损伤,从而达到对重金属的积累或解毒。本文以南极红酵母AN5(Rhodotorula mucilaginosa AN5)为研究对象,对SOD和GR基因进行克隆、生物信息学分析、重组蛋白的诱导表达、纯化、蛋白特征及重金属适应性分析,初步探讨这2种基因(蛋白)在酵母逆境适应性中的作用。
  (1)将来自南极酵母 R. mucilaginosa AN5的新型超氧化物歧化酶基因克隆,测序,然后在大肠杆菌中表达,分析目的蛋白特征。结果如下:R. mucilaginosa AN5 SOD(命名为RmFeSOD)基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)全长为639 bp,编码212个氨基酸,预测分子量为23.52 kDa,理论等电点(isoelectric point,pI)为7.89。经凝胶过滤层析和SDS-PAGE分析,天然状态的RmFeSOD以同型二聚体形式存在。pH值1.0-9.0条件下,孵育1小时,重组RmFeSOD表现出良好的pH稳定性。50℃下孵育1小时, RmFeSOD仍保持80%以上的活性,具有相对较高的热稳定性。通过1 mmol/L的金属离子处理,Zn2+、Cu2+、Mn2+和 Fe3+能够促进酶活性,Mg2+抑制酶活性。蛋白RmFeSOD对化合物PMSF、SDS、吐温-80、Triton X-100、DMSO、β-ME和尿素的耐受性相对较低,但对还原剂 DTT表现出一定的耐受性。铜胁迫实验中,RmFeSOD重组大肠杆菌比非重组菌表现出更好的生长,这表明RmFeSOD可能在重金属的适应性中起重要作用。
  (2)将来自南极酵母R. mucilaginosa AN5的谷胱甘肽还原酶基因克隆,测序,然后在大肠杆菌中表达,分析目的蛋白特征。结果如下:R. mucilaginosa AN5 GR(命名为RmGR)基因ORF全长为1500 bp,编码499个氨基酸,预测分子量为54.8 kDa,pI为6.07。重组RmGR的最佳酶活pH和温度分别为pH7.5和30℃。在pH值3.0-8.0条件下,孵育1小时,RmGR表现出良好的pH稳定性。在40℃下孵育1小时,RmGR仍保持60%以上的活性,具有相对较高的热稳定性。铜和镉胁迫实验中,RmGR重组大肠杆菌比非重组菌表现出更好的生长,这表明RmGR可能在重金属的适应性中起重要作用。
[硕士论文] 唐亚
核技术及应用 新疆大学 2017(学位年度)
摘要:目前,随着全球土壤侵蚀、土地荒漠化状况日趋加剧,对于研究出高效、方便、快捷的防沙固沙方法则变得至关重要。在我国古尔班通古特沙漠中发现了寡营养细菌,该寡营养细菌可以制成生物菌剂喷洒在流沙表面,形成生物结皮,从而起到固沙的作用。但这种结皮很容易遭到破坏且短时间内难以修复,为了获得更加高效的寡营养固氮菌,本论文对低能 N+注入介导的沙漠寡营养细菌的固氮基因的突变进行了全面研究。
  基于细菌基因组De novo测序的研究,本论文应用6种生物信息学方法分别从5个方面研究了3个低能N+注入介导获得的重组DOB菌的7个固氮基因的突变与进化情况,分析和探讨了nif基因的碱基突变、分子进化树、蛋白质一级结构和二级结构及其结构域变化。
  本研究发现:所有发生突变的nif基因均存在“突变热点”,这说明该区域的碱基对低能氮离子的辐射更敏感,碱基的突变是生物进化的主要动力;重组菌株DOB981的nif基因家族不同于重组菌株DOB113、DOB073和对照菌株DOB150,并且其进化速度快于DOB113和DOB073,为人们研究未来几百万年的DOB菌株提供了有益参考。
  nif蛋白结构分析结果表明,只有nifA和nifM基因编码的蛋白质一级结构发生了变化,主要表现在蛋白质的跨膜区和跨膜方向,为蛋白质的折叠、螺旋、卷曲研究提供了结构基础。在蛋白质二级结构方面,重组菌株 DOB981的 nifH、nifA、nifM、nifS(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和 fixB的蛋白质二级结构发生了的变化,为其固氮酶蛋白的空间结构与其催化功能的关系研究奠定了基础。蛋白质的结构域在蛋白质分子的进化过程中起着核心作用,影响着蛋白质的功能表达,研究发现重组菌株 DOB981的 nifHⅡ的蛋白质结构域发生了变化,为更深入地研究蛋白质进化机制提供依据。
  本论文通过对低能 N+注入介导获得的重组 DOB细菌的生物固氮基因(nif基因)的研究,从分子水平上探讨了离子注入DOB细菌导致其生物固氮基因突变与进化的分子机制,丰富了低能离子与生物体相关作用的理论,为人们更加深入理解生物固氮基因的突变与进化提供了丰富的材料,对DOB的分子育种和应用具有重要的理论意义和实践价值。
[硕士论文] 赵南舍
生物学 哈尔滨工业大学 2017(学位年度)
摘要:黑曲霉(Aspergillus niger)是丝状真菌中最常见菌种,因为其具有优良的产酶产酸功能,被广泛的应用于工业生产中。ras基因属于小G蛋白家族中Ras家族成员,在GTPase蛋白信号途径中发挥重要作用,Ras家族对细胞的增殖、分化、细胞凋亡和基因调控都很重要。目前,真菌中ras基因的报导较少,黑曲霉中ras基因的功能尚不明确。因此,通过分子生物学的手段,对黑曲霉中ras基因进行功能分析,对探讨GTPase蛋白信号途径中关键基因如何调控真菌生长发育及代谢产物具有重要意义。
  本研究通过RAN干扰(RNAi)技术,沉默黑曲霉3.316菌种中的ras基因,对转化子沉默效率进行分析,进一步探究该基因对菌丝生长发育的影响,初步分析ras基因在黑曲霉生长及代谢中的作用。首先,用软件预测ras基因的保守区域,根据保守区域设计引物。以已公布全基因组序列的黑曲霉 CBS513.88为模板设计两对引物,以黑曲霉3.316为模板,克隆出长度分别为629bp和379bp的Lras、Sras基因片段,在片段两段加上合适的酶切位点,与pSilent-1质粒共同经过两步双酶切连接,成功构建S-pS-ras和L-pS-ras两个沉默质粒。利用PEG介导的原生质体转化法和电击转化法,通过潮霉素B抗性平板的筛选得到9株抗性菌株,经过目的基因检测,成功得到4株转化子。
  最后,对转化子特性进行了研究。(1)通过RT-PCR对转化子进行了沉默效率分析,结果显示,两株转化子 ras基因均有所下调,分别下调了67.4%和64.7%。(2)对转化子进行了菌丝生长速度测定、产孢状况观测和生物量测定。野生型菌丝生长速度分别为两株转化子的1.23和1.17倍;同期培养的野生型黑曲霉和沉默转化子,野生型产孢比转化子早,显微观察转化子菌丝相比野生型细,菌丝分支明显减少;野生型黑曲霉生物量分别是两株转化子的1.88和1.82倍。(3)通过液体发酵实验,测定了转化子β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶(Cx)酶活和总酸的产量,结果显示,转化子对比野生型黑曲霉,酶活和总酸产量均有所下降。
  本文研究结果初步说明,ras基因可能通过调控信号通路下游相关基因,进而调控纤维素酶及酸的分泌过程,该基因的沉默对黑曲霉生长以及代谢均有抑制作用。
[硕士论文] 田烨
微生物学 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:非编码RNA(sRNA)是一类通常不编码功能蛋白的RNA,大小多为20-400个核昔酸,近年来研究发现sRNA可以作为转录后调控因子,广泛参与细菌物质代谢、胁迫反应和致病性等多种生理过程的调控。耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)具有极强的逆境胁迫适应性,具有超强的辐射和氧化抗性。目前有关耐辐射微生物sRNA的研究报道甚少,仅通过sRNA深度测序对耐辐射异常球菌潜在的sRNA进行了预测。尽管研究认为耐辐射异常球菌sRNA在辐射、氧化等胁迫抗性反应中发挥了极其重要的作用,但是至今尚无辐射异常球菌sRNA功能、特性相关研究报道。本研究对耐辐射异常球菌中位于编码基因之间的sRNA进行鉴定和特性分析,通过构建sRNA(drrA)缺失突变株,利用荧光实时定量PCR、胁迫表型分析等对该sRNA在耐辐射异常球菌氧化胁迫环境中的功能进行了研究,取得以下研究结果:
  1.drrA基因位于耐辐射异常球菌Ⅰ号染色体dr1016和dr1017的基因间区,全长251bp。Rfam数据库显示drrA可能属于一类新的功能未鉴定的非编码RNA家族。Northern blot证明drrA为非编码RNA,并受氧化胁迫诱导;5'RACE实验证明drrA为反向转录,转录起始于一个腺嘌呤(A)。在通过5'RACE确定的转录起始位点上游的启动子区进行序列分析显示存在σ70因子识别的典型-35/-10区的保守序列(AGGAAA-N17-TAAAAT)。生物信息学分析表明drrA具有异常球菌属特异性,二级结构预测显示sRNA drrA含有多个茎环结构,很可能是直接靶标mRNA的结合位点。
  2.荧光实时定量PCR结果显示,drrA在不同胁迫条件下表达量变化各不相同,在氧化胁迫条件下的表达量变化尤为显著,在80mM H2O2的胁迫条件下,drrA基因在转录水平的相对表达量上调高达51倍,在高温和UV辐射胁迫条件下相对表达量分别上调3倍和下调5倍。不同强度氧化胁迫条件下的drrA表达量分析表明drrA对氧化胁迫极度敏感。
  3.为研究drrA的功能,本研究通过融合PCR技术和同源重组双交换构建drrA缺失突变株(ΔdrrA),在氧化胁迫环境以及高温、UV辐射胁迫环境中进行表型分析,结果表明,突变株ΔdrrA在前两种条件下的存活能力明显低于D.radiodurans R1野生型,相差达到3个数量级;而在UV辐射胁迫条件下突变株ΔdrrA的生存力下降1个数量级。可见,drrA缺失导致耐辐射异常球菌对氧化、高温及UV胁迫敏感。推测sRNA drrA可能参与氧化等胁迫反应的调控。
  4.通过对drrA直接靶基因的在线预测,发现了8个氧化抗性相关的潜在靶标基因(dr1016,dr0435,dr0841,dra0010,dra0233,dra0232,dra0013,drb0092)。为进一步研究drrA基因的氧化胁迫调控机制,通过β-半乳糖苷酶活性测定实验分析氧化相关基因katE、oxyR1、oxyR2以及全局调控因子irrE的启动子活性。结果显示,drrA基因的缺失抑制了katE、oxyR2和irrE的表达,提高了oxyR1的表达,推测drrA可能参与了上述相关基因的表达调控,共同在氧化胁迫环境中发挥作用。
  本研究对耐辐射异常球菌中一个非编码RNA drrA进行了鉴定,该非编码RNA受氧化胁迫诱导,为属特异性非编码RNA,drrA在氧化、高温及UV胁迫反应中发挥重要作用,可能参与了氧化抗性相关基因的调控。有关sRNA drrA在氧化胁迫抗性的调控机制,仍需要进一步研究。
[博士论文] 余江流
生物物理学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是地球上最顽强的生物之一,该菌对电离辐射、氧化压力、干旱、紫外线辐射和丝裂霉素C(MMC)等环境压力表现出强烈的耐受性,并且,该菌具有多层复杂的、兼具革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌特征的细胞外被结构,因而从发现至今一直作为生物体对环境压力抗性和细菌细胞外被研究的模式生物。但目前DR菌细胞外被的组成、稳定性机制及其在菌体抗性中的作用尚不清楚。本研究通过生物信息学、基因重测序、蛋白组学和分子生物学等手段鉴定了DR细胞外被蛋白相关基因,研究了其在细胞外被结构和稳定性中的作用,以及与细胞表面层(Surface layer,S层)蛋白的关系。
  我们通过对DR基因组中含有tamB(translocation and assembly module B)基域的序列进行重测序和开放阅读框(ORF)预测,发现了原数据库中存在部分测序错误,证实了DR_1462、DR_1461和DR_1460的编码序列实际作为一个ORF编码DR_146T,预测为转运与装配组件蛋白亚基TamB的同源物。野生型DR菌的细胞外被蛋白质谱分析表明DR_146T可能是一个完整的细胞外被蛋白。DR_146T含有两个保守TamB结构域和C端DUF490结构域,不同于已报道的只含有一个TamB结构域和C端DUF490结构域的TamB蛋白。继而对DR_146T基因进行完全和分段敲除,研究基因敲除菌的表型变化和各结构域的重要性。该基因的缺失导致细胞外被的S层和糖被层破损脱落、外膜受损,细菌生长速度变慢,表明DR_146T是DR细胞外被的重要组成成分,对细胞外被的完整性和稳定性至关重要。DR_146T突变株(ΔDR_146T)对渗透压和机械外力的耐受力下降,表明DR_146T参与了细胞外被刚性结构和压力抗性。而ΔDR_146T对H2O2等氧化压力的抗性明显增强,通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定胞内金属离子含量发现,ΔDR_146T细胞内Mn离子浓度显著升高,与抗氧化能力相关的Mn/Fe比值升高2倍以上,这可能是导致ΔDR_146T氧化抗性增强的原因之一。表型分析发现,C端DUF490结构域不是DR_146T的关键结构域。
  研究了DR野生型细胞外被蛋白组成和△DR_146T脱落层的蛋白组成特征。构建了细胞表面S层结构蛋白SlpA(DR_2577)的突变株,通过比较野生型、ΔDR_146T、DR_146T部分缺失突变株与SlpA突变株(ΔSlpA)菌体形态和表型,并进一步对细胞外被和脱落层的蛋白组分析发现,在ΔDR_146T外被中SlpA蛋白(123 kDa)缺失,只以其不完整的蛋白片段形式存在,表明DR_146T的缺失可能导致S层蛋白的装配受阻,说明DR_146T参与维护DR菌S层的完整和稳定。此外,DR_146T的DUF490结构域敲除对SlpA蛋白表达没有影响,细胞外被仍可以合成,但不能稳定的附着在菌体表面,进一步证明DUF490不是DR_146T蛋白的主要功能结构域。
  DR基因组没有检测到转运与装配组件中的另一个组分TamA的同源基因,但存在一个进化上与TamA蛋白接近的BamA(β-barrel assembly machineryA)同源蛋白的编码基因DR_0379。通过该基因的突变、表型分析和功能初步研究,结果发现DR_0379缺失导致细胞分裂受阻,菌体聚集成团块状。突变株细胞外被受损脱落,并对渗透压极为敏感,表明DR_0379可能是DR外被合成途径的重要蛋白之一。DR_146T与DR_0379突变株有着不尽相同的表型特征,二者的确切关系有待进一步研究。
  本论文研究了耐辐射奇球菌两个细胞外被蛋白的编码基因,阐述了其参与DR细胞外被结构稳定性及其与细胞表面S层的关系。研究结果不仅加深了对极端微生物-耐辐射奇球菌多层细胞外被特征和抗性的认识,还有助于进一步了解细菌TAM系统多样性和作用机制,为细菌细胞外被蛋白的研究提供基础。
[硕士论文] 孙明慧
微生物 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:本文通过化学诱变的方法即用亚硝基胍(NTG)处理疣孢漆斑菌孢子,使其产生随机突变。通过96孔板高通量筛选的方法,筛选出了两株产耐热性能好的漆酶的菌株,命名为MF-01和MF-02,并对其及其产生的漆酶进行了生理指标检测,结果显示,两株突变株与未突变株比较发酵液中的酶活性,pH以及菌体生长量并没有突出变化,发酵液pH均为下降后上升,菌体生长量为线上升后下降。对两个菌株和未突变株的漆酶进行纯化,得到单一纯蛋白。MF-01的反应最适pH值为3.0,pH稳定性最好的时候在pH3.0-3.5。MF-02的反应最适pH值为4.0,pH稳定性最好时候在3.5-4.0,而未突变株的两值分别在pH4.5和pH4-5之间。说明两个突变株更耐酸性,稳定性更好。在热稳定性和最适温度的实验中,突变株MF-01在30-50℃时有相对较高的酶活,但MF-02与未突变株最适温度的差异不是十分明显。当温度上升至70-90℃,酶活均下降至50%以下,但MF-01的酶活性仍然高于MF-02和未突变菌株。同样在50%的相对酶活条件下,突变株漆酶放置的时间更长。经过分析,两株菌株产生的漆酶均有较好的稳定性,但其中一株MF-01的性能更加突出,并且能够稳定遗传,分析是突变剂使其产漆酶的基因序列发生了变化。
  为了验证这一猜想,实验用RACE的方法对未突变菌株的产漆酶基因进行了克隆,得到了产漆酶基因的编码区全部序列,并以此基因设计引物,对突变菌株的产漆酶基因编码区进行克隆,对两段基因对比发现,在编码区的第1522bp左右的位置,有碱基发生了变,由GCT变成了GAT,致使其编码的氨基酸由丙氨酸变成了天冬氨酸,突变并没有对漆酶的铜中心造成结构变化。铜中心是一个相对保守的区域,活性中心的铜离子位点就位于这个由1个半胱氨酸和10个组氨酸残基构成的配体结构中。丙氨酸为中性氨基酸,而转变为天冬氨酸后,变成了带负电荷的酸性氨基酸,组氨酸属于带正电荷碱性氨基酸;分析这两种氨基酸可能产生了分子间作用力,使漆酶蛋白分子更加稳定,但漆酶不仅由氨基酸组成,还有糖基的参与,分析稳定性的变化还有可能是诱变使糖基化过程发生了某些变化,本文仅在漆酶基因水平上做了基础性研究。
[硕士论文] 申德民
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:灰葡萄孢是一种气传性植物病原真菌,它能够侵染200多种植物,包括番茄、草莓、葡萄以及多种花卉。灰葡萄孢的抗逆性极强,可靠菌核或分生孢子度过恶劣环境。研究灰葡萄孢菌核发育、分生孢子产生或致病机理可为有效防治灰霉病奠定理论基础。本研究以灰葡萄孢菌丝生长时期和菌核发育时期的基因表达谱为基础,挑选出了2个在这两个阶段基因表达量差异较大的基因BC1G_00689和BC1G_03293,并初步研究了它们的功能,取得了以下研究结果:
  1.RNA-seq结果表明基因BC1G_00689在菌核发育时期表达下调,表达量是菌丝生长时期的18%,该基因编码一个包含酸性鞘磷脂酶结构域的蛋白质。基因BC1G_03293在菌核发育时期表达上调,表达量比菌丝生长时期上调了78倍。该基因编码的蛋白质与大肠杆菌中周质空间麦芽糖结合蛋白的结构相似度较高,目前在真菌中还没有相关蛋白质功能的报道。为了研究基因BC1G_00689的功能,我们通过同源重组的方法得到了敲除转化子△BC1G_00689-19和△BC1G_00689-21。也得到了基因BC1G_03293的敲除转化子△BC1G_03293-2和△BC1G_03293-4,并运用基因互补技术得到了互补转化子△BC1G_03293-2-C2和△BC1G_03293-2-C3。
  2.敲除转化子△BC1G_00689-19和△BC1G_00689-21的菌落形态、菌丝尖端形态、菌丝生长速度、对番茄叶片的致病力以及菌核干重与野生菌株B05.10相比无明显差异,但敲除转化子的产孢量明显下降,约为出发菌株B05.10产孢量的70%。结果说明BC1G_00689基因在灰葡萄孢产孢过程中可能发挥重要作用。
  3.BC1G_03293基因敲除后产孢量明显下降,大约为出发菌株B05.10产孢量的45%,并且BC1G_03293基因互补可使敲除转化子的产孢量得到明显恢复。在加麦芽糖和蔗糖的基本培养基上敲除转化子的菌丝生长速度、菌落形态以及菌核干重与B05.10相比无明显区别。结果说明BC1G_03293基因参与调控了灰葡萄孢的分生孢子产生。
[博士论文] 黎尔纳
食品科学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:木糖氧化无色杆菌为革兰阴性杆菌,多分布于水生环境,也见于各种临床标本。随着抗生素大量和长期的使用,木糖氧化无色杆菌对多类抗生素都产生了耐药性,防控变得更加困难,因此开发新的木糖氧化无色杆菌防控方法是刻不容缓的。噬菌体是感染细菌的病毒,能专一高效地裂解宿主菌,具有增殖快、无残留和安全有效等特点,可以作为抗生素的替代品,研发前景广阔,研究思路和方法有可能进一步应用到食品科学领域新技术的研究和开发。本研究以木糖氧化无色杆菌A22732为宿主,分离纯化得到三株烈性噬菌体,命名为phiAxp-1、phiAxp-2和phiAxp-3,对其生物学特性、最佳保存方法和基因组学进行研究,主要研究内容及结论如下:
  1.噬菌体生物学特性
  (1)噬菌体phiAxp-1噬菌斑直径在2-3 mm之间,通过透射电镜观察属于长尾噬菌体科。一步生长曲线显示,phiAxp-1的潜伏期约75 min,裂解期约15 min,爆发量为1742 pfu/cell。phiAxp-1在50℃处理75 min后,效价能保持同一数量级,处理温度越高,噬菌体失活越多;在pH为5-10的条件下,存活率都能有40%以上;当Ca2+、Mg2+浓度分别为10 mmol/L、15 mmol/L时,噬菌体的存活率最高;对低浓度(10%)的乙醇或异丙醇的耐受能力较强,中高浓度的乙醇或异丙醇处理后灭活明显。phiAxp-1的受体是A22732的脂多糖,提取A22732的脂多糖调节其浓度约为12.5μg/mL时, phiAxp-1的吸附效率下降到50%,脂多糖浓度增加到800μg/mL时,89.8%的phiAxp-1不能吸附A22732。
  (2)噬菌体phiAxp-2噬菌斑直径在0.5-1 mm之间,通过透射电镜观察属于长尾噬菌体科。一步生长曲线显示,phiAxp-2的潜伏期约180 min,裂解期约60 min,爆发量为2985 pfu/cell。phiAxp-2在50℃处理75 min后,效价下降了1个数量级,处理温度越高,噬菌体灭活明显;在pH为5-10的条件下,存活率都能有50%以上;当Ca2+、Mg2+浓度分别为10 mmol/L、15 mmol/L时,噬菌体的存活率最高;对低浓度(10%)的乙醇或异丙醇的耐受能力较强,中高浓度的乙醇或异丙醇处理后灭活明显。phiAxp-2的受体是A22732的脂多糖,当提取A22732的脂多糖调节其浓度约为19μg/mL时,phiAxp-2的吸附效率下降到50%,脂多糖浓度增加到800μg/mL时,82.6%的phiAxp-2不能吸附A22732。
  (3)噬菌体phiAxp-3噬菌斑直径在2-3 mm之间,通过透射电镜观察属于短尾噬菌体科。一步生长曲线显示,phiAxp-3的潜伏期约80 min,裂解期约40 min,爆发量约达到9000 pfu/cell。phiAxp-3在50℃处理75 min后,效价下降了1个数量级,处理温度越高,噬菌体灭活明显;在pH为6-9的条件下,存活率都能有50%以上;当Ca2+、Mg2+浓度分别为15 mmol/L、10 mmol/L时,噬菌体的存活率最高;对不同浓度的乙醇耐受能力都很差,对低浓度(10%)的异丙醇的耐受能力较强,中高浓度的异丙醇处理后灭活明显。phiAxp-3的受体是A22732的脂多糖,当提取A22732的脂多糖调节其浓度约为25μg/mL时,phiAxp-3的吸附效率下降到50%,脂多糖浓度增加到800μg/mL时,88.77%的phiAxp-3不能吸附A22732。
  2.噬菌体保存方法
  在-80℃、-20℃和4℃温度保存时,甘油和二甲基亚飒保存16个月后,phiAxp-1和phiAxp-2效价能稳定在初始的1010 pfu/mL,phiAxp-3效价略微从1011 pfu/mL下降到1010 pfu/mL。使用氯仿在4℃保存16个月后,三株噬菌体的效价都略微下降,但优于其他保存温度(-80℃、-20℃、室温和37℃)。三种保存剂在37℃贮存噬菌体时,效果都很差。
  3.噬菌体基因组学分析
  (1)phiAxp-1基因组长度为45,045 bp,GC含量为56.02%,属于环状双链DNA,共编码64个ORF,其中有21个得到功能注释。运用质谱鉴定其蛋白有12个功能得到注释。与已测序的多株噬菌体进行了比较基因组学分析,显示同源性极低,它属于全新的噬菌体。基于末端酶的系统进化分析,发现phiAxp-1属于独立的一个分支。phiAxp-1噬菌体基因组已提交Genbank,序列号为KP313532。
  (2)phiAxp-2基因组长度为62,220 bp,GC含量为60.11%,属于环状双链DNA,共编码86个ORF,其中有28个得到功能注释。与已测序的两株洋葱伯克霍尔德菌噬菌体AH2和BcepNazgul的多基因组共线性比较表明,它属于全新的噬菌体。基于DNA聚合酶和末端酶大亚基的系统进化分析,发现phiAxp-2与AH2属于同一分支。phiAxp-2噬菌体基因组已提交Genbank,序列号为KT321316。
  (3)phiAxp-3基因组长度为72,825 bp,GC含量为55.2%,属于线状双链DNA,含有416bp的末端重复,共编码80个ORF,其中有22个得到功能注释。运用质谱鉴定其蛋白有10个功能得到注释。与已测序的两株木糖氧化无色杆菌噬菌体JWAlpha和JWDelta、埃希氏菌N4噬菌体进行比较基因组学分析,它属于N4类噬菌体。基于RNA聚合酶和末端酶的系统进化分析,发现phiAxp-3与JWAlpha和JWDelta属于同一分支。phiAxp-3噬菌体基因组已提交Genbank,序列号为KT321317。
[硕士论文] 余秋玉
植物病理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:灰葡萄孢(Botrytis cinerea)可危害一些重要经济作物,造成巨大的经济损失。目前细胞自噬在灰葡萄孢中的研究较少,在真核生物中,细胞自噬过程可维持细胞内的生理平衡,有助于细胞度过逆境,并影响一些丝状真菌细胞的分化及致病力。本研究在灰葡萄孢基因组数据库中下载3个自噬相关基因的序列,即BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868,对其进行了基因结构和同源性分析,采用Split-marker技术在野生型菌株B05.10中对其分别进行了敲除,最后对敲除突变体的菌丝生长、菌核产生、营养需求和致病力等方面进行了测定。取得的研究结果如下:
  (1)通过在NCBI上BLAST比对以及构建进化树,证实了BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868分别与多物种的自噬基因ATG26、ATG17和ATG14有同源性,因此命名为BcATG26、BcA TG17和BcA TG14。
  (2)通过Split-marker技术分别敲除基因BcATG26、BcA TG17和BcATG14,经过PCR和Soutnern blot验证,获得了基因缺失突变体△BcATG26、△BcA TG17和△BcATG14。
  (3)明确了自噬基因BcATG26、BcA TG17和BcA TG14在自噬过程中的重要作用。用MDC染色,B05.10的菌丝在激光共聚焦显微镜下出现大量的荧光颗粒,而△BcATG26-13、△BcATG17-6和△BcATG14-107的菌丝细胞中未见或者有极少数的荧光颗粒,自噬基因的敲除阻断了自噬过程,导致不能形成自噬体或者自噬小体。
  (4)细胞自噬影响灰葡萄孢菌丝生长和菌核发育。基因缺失突变体在菌丝生长和菌核形成方面与野生型菌株B05.10有差异。在PDA培养基上,△BcA TG26-13相对于野生型菌株B05.10,菌核黑化延迟,15d仍为黄色;而△BcATG14-107只能形成很小的菌核。在1/8 PDA、DM、DM-C和DM-N培养基上,与野生型菌株B05.10相比,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌丝生长速度减慢,菌落发育畸形。
  (5)细胞自噬影响灰葡萄孢致病力。用菌丝块离体接种烟草叶片、活体接种烟草叶片和离体接种草莓叶片测定致病力,结果表明,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107的致病力与野生型菌株B05.10相比有极显著差异(P<0.01)。
  (6)细胞自噬可能影响灰葡萄孢耐受过氧化氢(H2O2)和植保素(camalexin)的胁迫。在添加有H2O2或者植保素camalexin的PDA上,与野生型菌株B05.10相比,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌丝生长速度减慢,菌落发育畸形,即对H2O2和camalexin更为敏感。
  以上结果表明,细胞自噬在灰葡萄孢菌丝生长、菌核的形成和发育、对寄主植物的致病力以及病原菌耐受活性氧(ROS)和植保素camalexin的胁迫等方面都起着重要作用。解析灰葡萄孢细胞自噬相关基因的功能可为更好的防治灰霉病提供理论基础。
[硕士论文] 包珊珊
核技术及应用 新疆大学 2017(学位年度)
摘要:低能离子注入生物体技术是近些年来发展起来的物理诱变育种技术,该技术一般采用活性氮离子,注入生物样品后掺入靶分子形成新物质,引起生物体的变异,从而引发生物学效应。
  为了进一步理解低能 N+注入介导外源基因转化沙漠寡营养细菌(DOB)引发的rRNA基因的突变情况,本研究在DOB基因组De novo测序的基础上应用生物信息学方法分析了3株离子束重组DOB菌株DOB073、DOB113、DOB981与原始菌株DOB150的rRNA基因序列,并对其rRNA基因的突变进行了研究。通过从DOB基因组De novo测序数据中获取这些DOB菌株的5srRNA、16S rRNA、23srRNA的基因序列,研究其基因突变的基本规律,分析基因突变的具体位点,统计其拷贝数、GC含量、计算进化距离和分子钟,进而构建进化树,并分析基因的进化程度,寻找并分析比对结果中的保守区域。
  rRNA基因拷贝数分析结果表明:重组突变菌 DOB073的5srRNA和16s rRNA基因拷贝数分别比原始菌株 DOB150增加了14和5个;重组突变菌DOB113的16s rRNA基因拷贝数比原始菌株DOB150增加了5个;重组突变菌DOB981的5srRNA基因拷贝数比原始菌株DOB150减少了1个,而其16s rRNA基因拷贝数增加了5个;3株重组突变菌株的23s rRNA基因拷贝数与对照菌株DOB150相同。
  rRNA基因碱基突变位点的研究结果显示,3株重组突变菌的5srRNA基因均在第4、107、112、114处发生了碱基突变,DOB073和DOB113还在第104处发生了碱基突变;3株重组突变菌的16srRNA基因的5-6个碱基突变分别分布于C1区、V1区、V2区、V4区、V6区、V7和V9区;3株重组突变菌的23srRNA基因的保守性较强,只有2-3个碱基位点发生了突变。
  基因进化分析结果显示,重组突变菌株DOB073和DOB113的5srRNA基因和23srRNA基因的进化速度均快于重组突变菌株 DOB981。而 DOB981的16srRNA基因的进化速度快于DOB073和DOB113。
  rRNA基因序列的保守二级结构的研究结果表明:三株重组突变菌株的16srRNA基因和原始菌株的16srRNA基因均具有9个保守二级结构,其碱基位置分别为:80-120,120-240,240-360,360-480,400-520,640-760,760-880,800-920和1420-1540。而三株重组突变菌株的23srRNA基因和原始菌株的23srRNA基因都均具有13个保守二级结构,其处碱基位置分别为:40-160,80-200,120-240,720-840,1200-1320,1480-1600,1520-1640,2120-2240,2200-2320,2240-2360,2280-2400,2360-2480,2520-2640。
  通过对3株重组突变DOB菌株的3种rRNA基因的研究,从分子水平上揭示了离子注入介导DOB菌株rRNA基因突变与进化的分子机制,也为离子注入介导获得的DOB的多样性提供了理论和实践依据,特别是是为低能离子注入介导的原核微生物的进化提供了直接的分子证据。
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:细菌非编码RNA(ncRNA),也称小RNA(sRNA),一般指长度在50-500 bp之间,不翻译咸蛋白质,但是具有特定功能的RNA分子。常规获得ncRNA分子的主要方法包括计算机模拟分析和基于实验室技术的Northern blotting,微阵列,RNA测序等。通过RNA测序方法,大量的非编码RNA在包括大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、苜蓿中华根瘤固氮菌(Sinorhizobium meliloti)、蓝藻细菌(cyanobacteria)、土拉热杆菌(Francisella tularensi),酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、植物病原体白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)等微生物中得到了鉴定。大量的研究表明,在原核生物中,sRNA在菌体的营养代谢、群体感应、细菌毒力和调整细菌生理机能以应对环境胁迫等方面发挥重要作用。非编码RNA发挥功能有多种方式,有些非编码RNA可通过碱基配对的方式与靶标mRNAs结合进而影响靶标基因的表达水平或稳定性进而起调控作用,比如假单胞菌中报道的铁调控RNA prrF;有些非编码RNA具有蛋白结合能力,可通过与靶标蛋白的高亲和结合进而竞争蛋白与其靶标的结合参与蛋白的调控活性,研究较为深入的有碳代谢抑制调控的非编码RNA CrcYZ,次级代谢物调控的rsm YZ等。在固氮微生物中,非编码RNA的研究也有大量报道,但是直接参与固氮基因表达调控的例子不多。2016年本实验室报道了一个可特异结合固氮酶结构基因nifKmRNA并参与固氮酶活性调控的非编码RNA nfiS,但是是否有其他的非编码RNA也参与了固氮系统的表达调控值得进一步的研究。
  施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际,能够定殖在根表或通过伤口入侵到水稻根组织进行联合固氮。该菌具有固氮、促生、耐盐等优良性能,在非豆科作物节肥增产方面具有重要的应用价值。为了获得施氏假单胞菌A1501在固氮条件下表达的非编码RNA信息,我们测定了该菌在固氮条件(0.1mM NH4+,0.5% O2)和铵抑制条件(20mM NH4+,0.5%O2)下的转录组。转录组分析共发现了53个特异表达的非编码RNA,相比铵抑制条件,17个sRNA在固氮条件下表达显著上调,6个sRNA在固氮条件下被抑制。编号为ncRNA31的非编码RNA在固氮条件下表达水平上调了93倍,基因组中位于保守蛋白质PST1955(编码“亚硝酸还原酶(NAD(P)H))亚基,NirD)和PST1956(编码“氰钴胺素生物合成的蛋白质”)之间。通过BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)与GenBank数据库比较,发现该ncRNA在施氏假单胞菌中高度保守,而且其两侧的基因也非常保守。由于该ncRNA在固氮条件下高表达,而且特异响应外界铵离子信号,将其命名为amiR(ammonium induced ncRNA)。
  通过northern blotting证实了总RNA中amiR转录产物的存在。进一步的5'-RACE实验表明AmiR与两测基因反方向转录,同时确认了amiR的转录起始位点。对amiR的启动子进行分析,发现了氮代谢关键调控节点蛋白ntrC和rpoN的保守结合位点;采用qRT-PCR对amiR的表达特性进行了分析,结果表明,与野生型相比,在氮代谢关键调控节点蛋白ΔntrC和ΔrpoN的突变株中amiR的表达显著下调。由此推测,amiR可能是A1501菌氮代谢调控系统的重要组成部分,受ntrC和rpoN的直接调控。
  为了研究amiR的生物学功能,构建了amiR的缺失突变株ΔamiR,过表达菌株以及回补菌株。对野生型、突变株和回补菌株的相关表型进行了测定,主要包括:在LB和基本培养基中生长情况、固氮酶活性、反硝化作用、细菌运动、氧化和渗透胁迫、盐胁迫、生物膜形成等。测定结果发现,相比野生型,ΔamiR菌株的耐氧化、渗透压力和盐耐受性与野生型相比较没有明显改变,但是ΔamiR的固氮酶活性下降了30%,这表明amiR在A1501菌的生物固氮过程中起重要作用。此外,研究也发现,与野生型相比,当硝酸盐作为电子受体进行反硝化生长时,ΔamiR的生长能力减少约30%,当亚硝酸盐作为电子受体时,ΔamiR突变株几乎丧失反硝化作用。采用实时定量测定了固氮酶编码基因nifHDK的表达,结果表明固氮基因不受amiR基因突变的影响。进一步测定了野生型和突变株胞内的能量信号NADPH的水平,发现ΔamiR突变株中NADPH的下降显著。以上数据表明,amiR不仅在固氮过程中发挥作用,在另一种氮同化过程反硝化中也发挥重要作用。amiR突变对固氮系统的影响不是发生在固氮酶基因转录水平,可能是由于能量合成受阻造成的,其作用机制值得进一步深入研究。
  为阐明施氏假单胞菌A1501中amiR参与固氮基因表达调控的具体机制和作用方式,我们对野生型菌株及ΔamiR突变株在固氮条件下的转录组进行了分析。RNA-seq数据显示,与野生型相比,在4278个基因中,突变株中总共有416个基因表达发生显著上升或下调,这些基因大多数参与反硝化过程和能量转移过程,固氮基因的表达没有显著变化,这表明amiR在反硝化和能量转换过程中扮演了重要角色。在ΔamiR缺失突变体中,其侧翼基因亚硝酸盐还原酶基因nirD的表达水平显著下调,该基因是反硝化途径中的重要结构基因。为了确认nirD与amiR缺失造成表型之间的关联,构建了nirD的缺失突变株ΔnirD。进一步测定和比较了ΔamiR和ΔnirD两个突变株的表型,结果表明ΔamiR与ΔnirD在固氮酶活、反硝化过程中有相似的表型,由此推测本研究发现的amiR缺失造成的表型可能与下游基因nirD的表达模式相关。关于amiR的作用机制提出两种假设,一种是amiR是nirD基因的顺式作用元件,也就是nirD可能为amiR的作用靶标,第二种假设为由于amiR编码区与nirD基因的启动区靠近,amiR突变造成了对nirD表达的影响。围绕以上两种假设正在开展进一步的分析和验证。
  RNA分子的二级结构与非编码RNA发挥调控功能高度相关,而且二级结构的特征可进一步用于预测非编码RNA的作用靶标。本研究采用RNAFold软件预测了AmiR的二级结构,用TARGETRNA2软件预测了AmiR的靶标基因。结果表明在AmiR的二级结构中存在多个长度在25-63nt之间的颈环结构。这些预测的颈环结构跟多个mRNA的部分序列互补配对,但是这些颈环结构是否与AmiR缺失引起的表型直接相关以及其具体的作用靶标确定仍需进一步的实验证实。我们尝试在体外对该sRNA进行体外转录和纯化,并通过圆二色谱测定了处在不同的缓冲液中的AmiR的结构,结果表明,在不同的盐浓度下,AmiR能改变其折叠模式。这说明非编码RNA在不同的条件下可形成不同的空间构象,进而具有特定的调控功能或靶标。
  综上所述,AmiR是一个固氮条件下高表达、特异响应铵信号,受氮代谢关键调控节点蛋白ntrC和rpoN调控,在A1501菌的反硝化和生物固氮中具有重要功能的非编码RNA。
[硕士论文] 潘宝平
特种医学 南华大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是目前地球上已知抵抗电离辐射最强的生命形式之一。耐辐射奇球菌中总开关因子PprI通过其金属蛋白酶活性对负调控因子DdrO进行切割作用,从而激活其下游多个参与辐射抗性基因,如 pprA、ddrD、gyrA等基因的表达,而拥有一个高效的DNA损伤响应能力。PprM是一种参与了 PprI依赖的辐射响应的新型调控蛋白,但存在何种依赖关系目前并不清楚。本课题旨在研究PprM蛋白与pprI、recA和pprA之间的关系,进一步了解PprM蛋白参与的PprI依赖的信号途径,从而了解PprM蛋白在耐辐射奇球菌的极端抗性网络中的作用。
  研究方法:①利用课题组前期实施染色质免疫共沉淀(ChIP)结合PCR技术筛选到可能与PprM蛋白发生相互作用的3个关键基因的启动子,即pprI/recA/pprA,诱导pGEX-6p-1-pprM重组载体表达,体外纯化获得GST-PprM融合蛋白;②设计pprI/recA/pprA启动子区域上下游引物,合成生物素标记探针,利用凝胶迁移实验(EMSA)验证pprI/recA/pprA启动子探针与GST-PprM融合蛋白是否有相互作用,进一步预测它们的结合序列;③利用 qRT-PCR检测 pprM缺失突变菌株和DR野生菌株中pprI/recA/pprA的mRNA表达水平,了解PprM在转录水平对这三个基因的影响;④检测 pprM缺失突变菌株与DR野生菌株在低温条件下的生存曲线。
  结果:成功诱导表达并纯化到GST-PprM融合蛋白;PprM蛋白在体外能够与pprI/recA/pprA启动子区域发生结合作用,pprI启动子的结合序列主要位于第三段探针序列,而recA/pprA启动子的结合序列主要位于各自的第二段探针序列,通过分析,结合序列可能为GCCGTGAA或GACCTGAA;pprM缺失突变菌株中的pprI/pprA的mRNA表达水平高于DR野生菌株,但recA的mRNA表达水平差别不大;pprM缺失突变菌株比DR野生菌株其抗寒能力有所增强。
  结论:
  1.EMSA证实PprM蛋白与pprI/recA/pprA三个基因的启动子区域有相互作用,结合序列分别位于 pprI启动子的第三段序列和recA/pprA启动子的第二段序列。
  2.PprM蛋白在转录水平对pprI/pprA基因的表达有一定的抑制作用,但对recA基因没有影响。
  3.pprM基因的缺失突变导致耐辐射奇球菌的抗寒能力增强。
[硕士论文] 韩瑞祥
遗传学 安徽医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过在巴斯德毕赤酵母中异源表达进一步提高嗜热子囊菌木聚糖酶的热稳定性。
  方法:基于巴斯德毕赤酵母的密码子使用偏倚优化原嗜热子囊菌木聚糖酶基因xynA的基因序列。构建重组质粒 pGAPZαA-xynA、pPIC9K-xynA,经线性化处理后电击转化入表达宿主毕赤酵母 GS115中,构建重组菌株。经过含博莱霉素(zeocin)的YPD琼脂板初筛后,抽提基因组筛选阳性转化子。使用博来霉素浓度梯度YPD琼脂平板复筛转化子。采用硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换柱层析、分子筛层析等方法分离、纯化重组木聚糖酶。通过SDS-PAGE凝胶电泳和酶谱实验确定重组木聚糖酶大小,利用高碘酸硝酸银染色和Endo H酶处理检测重组酶是否为糖蛋白及糖蛋白的类型。以失活的重组木聚糖酶 XynA作对照,与重组木聚糖酶XynA同样在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中42°C处理激光打印纸72h,检测其脱墨效果。在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中高温(70~80°C)酶解未处理的玉米芯,温育36h后测定其糖化效果。
  结果:密码子优化后的 xynA基因通过设计、合成,并且在巴斯德毕赤酵母中表达。筛选出在木聚糖琼脂板中形成最大水解透明圈的菌株RX8,用于摇瓶发酵,并产生40U/ml的木聚糖酶活性。S-75型葡聚糖凝胶层析纯化后的重组木聚糖酶比酶活最高,达到1053U/mg的木聚糖活性。通过SDS-PAGE凝胶电泳和酶谱实验确定重组木聚糖酶大小为75kDa。高碘酸-硝酸银染色法显示该重组木聚糖酶为糖蛋白,其表观分子量显著高于其蛋白理论值,表明该重组木聚糖酶在表达的过程中发生了高度糖基化。重组木聚糖酶 XynA的最适反应条件为75°C和pH8.0。该酶在100°C下保温8h仍保持高于80%的酶活性。重组木聚糖酶在Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中42°C处理激光打印纸72h的脱墨效果(247%)高于报道的芽孢杆菌木聚糖酶CKBx1D(200%)。其在高温酶解过程(70~80°C)中对未处理的玉米芯保温36h后的糖化效率7.44%。此外,该重组木聚糖酶在较宽的 pH(4.0~10.0)范围内具有较好的酸碱耐受性和稳定性。
  结论:重组木聚糖酶XynA首次在毕赤酵母中实现了异源表达,其重组木聚糖酶的耐热性较原始木聚糖酶得到较大提高。较高的比酶活力和良好的热稳定性使该重组木聚糖酶具有较大的工业化应用潜力及经济价值,也为其它耐热木聚糖酶的研究奠定了理论基础。
[硕士论文] 周莉
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:链霉菌能够产生多样性的天然产物,并且具有多样的生物活性和功能,是新药发现的宝库。其平衡生长与产素适时适量表达的智能化源泉是精妙的多层次转录调控网络(精确的DNA结合位点,小分子和转录因子相互作用)。充分理解和认识转录调控网络的机制有助于获得高产菌株。为建立快速高通量研究调控网络的方法,利用ALPHA(amplified luminescent proximity homogeneous assays)技术的诸多优势,比如高通量、均相、高灵敏度及灵活性、背景低、方便小型化及自动化,解决了传统方法(EMSA,DNase I足迹法,表面等离子共振技术,染色质免疫沉淀法等)的缺陷。
  阿维链霉菌产生的阿维菌素是微生物药物的杰出代表,是高效低毒生物杀虫剂,对保证我国粮食、农产品安全、畜牧业和医药健康具有重大意义,两亿非洲人也因为中国生产的阿维菌素而幸免河盲症失明。继青霉素和链霉素之后,第三次受到了诺贝尔奖的青睐(也是继DDT之后,又有一个农药品种为其发现者赢得了诺贝尔奖),日本科学家大村智和美国科学家坎贝尔,与发现青蒿素的我国科学家屠呦呦,共同获得了2015年诺贝尔生理学或医学奖。
  1)在链霉菌全基因组转录因子靶点筛选新策略的探索方面,我们利用阿维链霉菌中已经报道证实具有结合作用的AvaR1与sav3705p,建立方法平台来探究转录因子与DNA的相互作用。该方法平台不仅可以快速确定转录因子与DNA有无相互作用,而且可以应用逐步截短策略确定相互作用的精确结合位点,精确定量相互作用的强度,且鉴定目标转录因子的全基因组靶点,表现出快速、高通量的优势。我们利用该平台找到了新的结合位点,很好地确定了精确结合位点而非保护位点,且鉴定了转录因子AvaR1的全基因组靶点。该平台的成功建立,为揭示调控网络和促进阿维菌素产量的大幅度提高提供了有力支持。
  2)在基于别构转录因子(aTFs)的小分子检测新方法的开发方面,原核生物中存在很多能够感应不同小分子的aTFs,我们首次利用aTFs可以感应小分子的特性,结合ALPHA技术,开发高通量的全新小分子体外检测方法。该检测方法利用微孔板,在液态均相体系中实现检测,且无需繁复的清洗步骤,因此可以实现稳定的高通量检测。为筛选土霉素的高产菌株,我们获得了目前最灵敏的土霉素检测生物传感器,其检测限低至0.03 nM。我们还针对重要的临床标志物尿酸,获得了目前最灵敏的尿酸检测生物传感器,其检测限低至1nM。该平台还可用于开发高灵敏度的、全新的化学小分子检测方法,为临床病原标志物检测、以及相关试剂盒的开发提供支持。
[硕士论文] 杨奇
生物学 南华大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景与目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)是已发现物种中电离辐射耐受性最强的生物之一,可耐受超过15kGy的电离辐射,其辐射耐受剂量是大多数脊椎动物的3000多倍。pprI基因是DR中参与DNA损伤修复的一个关键基因,是辐射响应调控的总开关。pprM基因是DR中特有的辐射响应基因,pprM基因缺失突变株对γ辐照抗性明显降低。本实验旨在研究DR辐射响应基因pprI、pprM的表达对293T细胞辐射抗性的影响,为辐射损伤治疗提供新思路。
  研究方法:1、以实验室前期构建的pGEX-6p-1-pprM为模板,PCR扩增pprM基因,构建pEGFP-C1-pprM绿色荧光真核表达载体。
  2、将pEGFP-C1-pprM、pDsRed1-N1-flag-pprI(实验室前期构建)分别单独转入及两质粒共转入293T细胞。倒置荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察红绿色荧光融合蛋白的表达及在细胞内的共定位。Western blot进一步验证pprI、pprM基因融合蛋白的表达。
  3、MTT法检测293T细胞的生存率,荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,WST-1法测总超氧化物歧化酶(SOD)活力, TBA微板法检测丙二醛(MDA)含量及还原型谷胱甘肽(GSH)活力。
  研究结果:1、测序鉴定及Blast比对分析结果显示pEGFP-C1-pprM构建载体序列与模板基因碱基序列一致,载体构建成功。
  2、倒置荧光显微镜下观察到红绿色荧光蛋白的表达量较高,激光共聚焦显微镜下观察到PprI、PprM融合蛋白在293T细胞细胞核与细胞质中存在共定位现象。Western blot结果显示,在约40kD及65kD处有明显条带,分别为pprM、pprI基因所表达的融合蛋白。
  3、与未转染组相比,空质粒转染组细胞无明显差异,pprM、pprI单基因转染组及 pprM+pprI双基因转染组细胞辐照后生存率、总 SOD活力及GSH活力明显增高(P<0.05),细胞内ROS及MDA含量明显降低(P<0.05),且pprM+pprI共转染组比两基因单转染组效果更为明显,差异有统计学意义。
  结论:1、原核DR-pprM、pprI基因能够在真核293T细胞中表达,且PprM、PprI蛋白在细胞内存在共定位,可能存在相互作用。
  2、DR-pprM、pprI及pprM+pprI基因在293T细胞中的表达能够提高辐射损伤后细胞的增殖能力和抗氧化能力。
  3、DR-pprM+pprI双基因转染效果比两基因单转染的细胞增殖能力和抗氧化能力提升效果更为明显,pprM与pprI基因间可能存在协同抗辐射作用。
[硕士论文] 杨晓炜
生物物理学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本实验通过对高压静电场(HVEF)处理后的E.coli K12 W3110细胞膜、胞内酶活性、胞内蛋白质一级结构及二级结构的变化以及细胞可逆修复等方面的研究,揭示了高压静电场对E.coli的损伤机制。结果如下:
  (1)测定静电场处理后的菌体洗脱液核酸和蛋白含量,发现随着处理时间的增加,核酸和蛋白含量呈振荡变化,说明HVEF对E.coli细胞膜有损伤效应。用流式细胞术双染分析,发现同一电场,亚死细胞比例随着处理时间的增加而增加,剂量为5kV*6min和7kV*6min时,亚死细胞比例均达到最大,分别为(65.13±2.62)%和(45.87±0.45)%,之后该比例随着处理时间的增加而减小,即亚死细胞逐渐变为死细胞,表现为电场损伤的累积效应。
  (2)对电场处理后的E.coli胞内蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳和傅立叶变换红外光谱分析,发现不同剂量电场处理的胞内蛋白电泳条带与未处理菌体蛋白的泳带没有差别,即HVEF没有改变E.coli胞内蛋白质一级结构;1kV/cm的HVEF处理后菌体蛋白中β折叠向α螺旋转变,而3、5、7kV/cm的HVEF处理后的菌体蛋白α螺旋和β折叠向β转角和无规卷曲转变,即有序结构向无序结构转变。所以,1kV/cm的HVEF可能对胞内蛋白活性有激活作用,而3、5、7kV/cm的HVEF对E.coli胞内蛋白活性均有损伤效应,且损伤效应最强剂量为5kV/cm。用流式细胞术CFDA单染分析,剂量为5kV/cm*2min和7kV/cm*2min时,CFDA阳性细胞比例均为同一电场强度下最低,说明静电场会损伤E.coli细胞内酶活性。之后,酶活性均有不同程度的增加,可能静电场对E.coli细胞内酶活性有激活作用,最佳激活剂量为5kV/cm*4min和7kV/cm*6min。随着电场处理剂量增加,总的变化趋势为振荡下降型。即静电场对E.coli胞内酶活性的损伤呈振荡增加的趋势,表现为电场损伤的累加效应。
[博士论文] 翟斌元
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:古菌是与细菌和真核生物并列的第三域生命形式,其细胞结构和代谢方式与细菌类似但遗传信息加工传递机制,包括DNA复制、转录、重组、修复和蛋白翻译,更接近于真核生物。硫化叶菌是典型的超嗜热泉古菌,生活于高温及酸性极端环境,但其基因组保持稳定,自发突变率并不高,暗示其细胞内有一套完善的DNA修复系统。根据已有的报道,在硫化叶菌细胞中存在的DNA修复途径包括同源重组修复,核酸切除修复和碱基切除修复。与细菌相比,参与这些修复途径的蛋白也更接近于真核生物。
  DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)是细胞内最严重的DNA损伤形式之一。同源重组修复和非同源末端链接是修复DSBs的两种重要途径。目前,在绝大多数古菌中只发现了同源重组修复途径,对参与该途径的保守蛋白Mre11,Rad50和重组酶RadA(真核生物中为Rad51)都有深入的研究。除此之外,对古菌中参与同源重组修复的其他蛋白也有较多的报道,包括NurA,HerA,Hjc和Hje等。Holliday junction(HJ)是同源重组过程中的标志性中间产物,HJ需要被及时的处理以保证顺利地完成DNA修复和和色体的正常分离。细胞内处理HJ的方式主要有两种,一种是由HJ解离酶介导的“resolution”,典型的HJ解离酶包括RuvC,Hjc,Yen1/GEN1和Slx1-Slx4/SLX1-SLX4;另一种是由解旋酶、拓扑异构酶及其他蛋白组成的复合体介导的“ dissolution”。在细菌中已经报道参与“ resolution”过程的蛋白是RuvAB复合物。到目前为止,在古菌和真核生物中还没有鉴有到经典的类似于RuvAB的蛋白复合物。
  在本研究中,我们在超嗜热古菌冰岛硫化叶菌S.islandicus细胞中表达了羧基端带有组有组酸标签的解离酶Hjc(基因组中其编码基因为SiRe_1431),通过亲和纯化和质谱鉴定发现了与Hjc在基因基上位置相邻并可能与Hjc存在相互作用的一个蛋白,SiRe_1432。对氨基酸序列分析发现, SiRe_1432包含典型的PIN结构域和P-loopATPase结构域,因此将SiRe_1432命名为SisPINA(冰岛硫化叶菌来源的PIN domain-containing P-loop ATPase)。进一步,我们通过Pull-down实验确认了SisPINA与Hjc具有物理相互作用,暗示着SisPINA与Hjc可能在细胞内共同参与HJ的处理。
  为了探索SisPINA在冰岛硫化叶菌S.islandicus中的功能,我们尝试敲除细胞内染色体上SisPINA的编码基因,尝试多次后始终无法获得敲除SisPINA基因的缺失突变体菌株,暗示着SisPINA可能是一个不可敲除的基因。利用遗传回补实验我们确认了SisPINA是S.islandicus细胞正常生长所必须的基因。
  接下来,我们鉴定了SisPINA的基本生化性质。首先,构建了表达野生型和四个不同点突变体的载体;然后,在E.coii中进行异源表达后并对目的蛋白进行了纯化。最后,我们鉴定了SisPINA的ATP水解活性、DNA结合活性和HJ链迁移活性。ATP水解实验表明SisPINA具有明显的ATP水解能力,不同的DNA底物对其ATPase活性无明显的影响。凝胶阻滞实验表明SisPINA能够结合不同类型的DNA底物,包括单链DNA、钝端双链DNA、5’-overhang DNA、 Y形DNA、复制叉DNA和HJ DNA,但是结合复制叉DNA和HJ DNA的能力明显强于其他DNA底物。进一步,我们发现SisPINA能催化HJ DNA发生链迁移,生成Y形的迁移产物,并能够继续解链Y形DNA产生单链DNA。同时,我们确认了SisPINA的链迁移活性依赖其ATPase活性。
  为了进一步研究SisPINA在细胞内的生物学功能,我们鉴定了与SisPINA相互作用的蛋白并分析了蛋白之间的相互作用。实验结果表明, SisPINA与 Hjc具有功能上的相互作用,SisPINA能够明显增强Hjc切割不可动HJDNA的解离酶活性,同时,Njc切割可动HJ DNA的链的偏好性也受到SisPINA的调节,但Hjc对SisPINA的HJ链迁移活性则有明显的抑制作用。除了与Hjc有相互作用,SisPINA和RFCs及Hjm都能分别形成稳定的复合物。Pull-down实验进一步确认了SisPINA的羧基端区域介导了SisPINA与Nc,RFCs和Hjm的相互作用。
  最后,为了从原子水平上揭示SisPINA的作用机理,我们解析了SisPINA两个突变体的晶体结构。SisPINAK261A的晶体结构显示,一个SisPINA的晶胞中包含有6个SisPINA蛋白分子,SisPINA可形成稳定的环形六聚体,该结果与SisPINA在溶液中也形成六聚体的结果一致。进一步分析组成SisPINA六聚体的亚基,我们发现六个亚基处于两种不同的构象,其中亚基A(B,C和E)为未结合AT结的构象,亚基D(F)为结合ATP的构象。通过ATP的结合和水解引起SisPINA构象的变化,从而推动HJ发生链迁移。 SisPINAR147KI199SR206A的晶体结构显示,SisPINA的羧基端可折叠形成一个KH结构域(hnRNPKhomology结构域),在SisPINAK261A的晶体结构中由于电子密度缺失并未观察到该区域的晶体结构。有意思的是在该突变体的晶胞中只包含有一个SisPINAR147KI199SR206A蛋白分子,这种突变导致SisPINA发生解聚的分子机理还需要进一步的研究。根据SisPINA和Hjc的晶体结构,以及SisPINA与Hjc功能上的相互作用,我们构建了SisPINA和Hjc共同处理HJDNA的结构模型,该模型为揭示古菌中Holliday junction的处理机制提供了新的视角。
[硕士论文] 陈欢君
生物工程 广西大学 2016(学位年度)
摘要:芽孢(spore)是一些杆菌和球菌在恶劣环境下在其营养细胞内形成的休眠体。芽孢因其特殊结构,特别是核内高含量的吡啶二羧酸钙(Ca2+-DPA)成分,而对热、辐射、干燥、有毒化学物质具有耐受性和抗性,一旦条件适宜就会萌发成为营养态细胞。研究芽孢萌发特点,分析理化因子对芽孢萌发的影响,在抑制和预防医源、食物源芽孢杆菌等方面有着重要意义。
  苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是全球应用最为广泛的生物农药,与一些病原性细菌具有密切的遗传关系,研究其萌发机制和影响因素,有助于了解试剂对芽孢的杀灭机理,提高生物农药使用效率。
  本文利用微分干涉差(DIC)显微成像与拉曼光谱相结合的方法,动态监测单个Bt芽孢在受到紫外线辐射、NaOH处理、HCl处理后的萌发过程。
  结果表明:
  (1) Bt芽孢对紫外线有较强的抵抗作用。紫外辐射促使Bt芽孢蛋白质的二级结构发生改变,影响最显著的是萌发剂受体,其次是DPA释放通道的相关蛋白,而对皮层水解酶的影响较小。
  (2) NaOH处理并没有破坏Bt芽孢的内膜,蛋白质的二级结构变化不明显,但破坏芽孢萌发的重要相关蛋白质,受损最严重的是皮层水解酶,其次是DPA释放通道及相关蛋白。1.0mol/L NaOH处理30~60min后,75%以上的芽孢无法形成新菌落;而50%以上的芽孢能在丙氨酸的触发下萌发,但不能在外源CaDPA的触发下萌发。
  (3) HCl浓度对芽孢的影响比处理时间长短的影响更大,HCl处理使与萌发相关的蛋白钝化和受损,影响最大的是萌发剂受体蛋白,其次是与释放CaDPA、皮层水解有关联的蛋白。HCl同时影响芽孢的通透性,促进释放部分CaDPA。
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