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[硕士论文] 高震
微生物学 广西大学 2018(学位年度)
摘要:L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,PanD EC4.1.1.11)是微生物泛酸(由泛解酸和β-丙氨酸组成)生物合成途径中的关键酶,由panD基因编码,以丙酮酰基为催化活性中心,具有严格的底物特异性,可以催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸的合成途径只存在于微生物和植物细胞中,因此以L-天冬氨酸α-脱羧酶为靶点设计的抗真菌、抗细菌药物和除草剂对动物或人类无害。
  β-丙氨酸可用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品,用途非常广泛。目前国内β-丙氨酸主要采用化学合成法,存在成本高、生产条件对环境不友好等缺点,开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。但目前筛选到的产酶菌株产酶量较低、酶活性低,难以规模化生产和广泛应用。
  本研究通过传统纯培养技术,从亚热带海洋土壤沉积物样品中初步分离筛选到八十株具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的菌株,经纸层析复筛后选择其中4株酶活力较高的菌株进行菌种鉴定。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16S rRNA序列比对分析和系统发育分析,鉴定出这四株菌中有两株属于不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、一株属于普罗维登斯菌属(Providencia spp.)、一株属于发光细菌属(Photobacterium spp.)。
  以普罗维登斯菌株为研究对象,根据GenBank数据库中已有的普罗维登斯菌属天冬氨酸脱羧酶基因(panD)序列设计引物,PCR扩增获得L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(panDP)。以pET-30a(+)为载体、Escherichia coli DH5α为宿主细胞,构建了重组菌。生物信息学分析结果表明panDP基因包含一个长为381bp的ORF,编码一个由126个氨基酸组成的多肽,分子量预测为13.92kDa。panDP基因在核苷酸水平上与Photorhabdus asymbiotica ATCC43949的aspartate1-decarboxylase precursor基因(GenBank登录号:FM162591.1)的一致性为81%;与Photorhabdus temperata subsp.thracensis strain DSM15199的aspartate decarboxylase基因(GenBank登录号:CP011104.1)的一致性为77%;在氨基酸水平上,PanDP与来自Providencia rettgeri的L-天冬氨酸α-脱羧酶(GenBank登录号:WP036958294.1)具有98%的一致性,但尚未发现其功能特征研究的相关报道。
  将构建好的重组质粒pET-30a-panDP转入表达宿主E.coli(DE3)plysS中,构建重组表达菌株。诱导表达的最佳条件为:以终浓度10g/L的α-乳糖为诱导剂,30℃诱导10h。镍柱纯化蛋白进行酶学性质分析,结果表明:在以L-天冬氨酸为底物时,PanDP的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,在最适反应条件下,金属离子的终浓度为5mM时,Ca2+、Al3+、Fe3+对酶具有促进作用,其中Al3+的促进作用最高,可达到140%。而Na+、Ba2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用,Na+的抑制作用比较微弱,Mn2+、Mg2+、Cu2+的抑制作用比较明显。该酶在低温条件下,比较稳定,超过55℃后,随着时间的延长,稳定性变差,但该酶在80℃下,保存1h,仍具有40%的酶活。当pH值为8.0时,该酶稳定性最好,在pH值为5.0到9.5的范围内,仍保持40%以上的酶活力,在pH值为7.5到8.5的范围内,保持60%左右的酶活力;Km为0.01602mmol/L,Vmax为1.6861μmol/min,kcat值为0.28s-1。
  对panDP基因进行定点突变,获得了四个突变体,分别为K9A,K9D,S25E,S25K;纯化这四个突变体蛋白,进行酶学性质研究,与野生重组酶PanDP相比,这四个突变体酶活性均丧失,由此可知氨基酸残基位点的第9位和第25位均与酶的活性相关。
  本研究完成了Providencia sp.GZ1和Acinetobacter sp.GZ8野生型菌株的鉴定,panDP基因的高效表达和功能分析;PanDP酶的最适反应温度较高,达到60℃,在80℃下仍保留较高的酶活,较高的酶反应温度使其在工业生产中有一定的应用价值和参考价值。
[硕士论文] 赵红晓
生态学;微生物生态学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素是地球上最丰富,潜力巨大的可再生资源,微生物降解纤维素是纤维素有效利用的一种绿色环保的方法。而绿色木霉(Trichoderma viride)可以产生纤维素酶来降解纤维素。
  本研究以绿色木霉(T.viride)AS3.3711菌株为实验材料,根据GenBank数据库上登录号为EU518927的T.viride AS3.3711的egⅦ基因序列来设计引物,通过DNA和RNA为模板进行PCR,得到的序列经过比对得出内切葡聚糖酶Ⅶ基因没有内含子,基因长度782bp,开放阅读框750bp,编码249个氨基酸,理论分子量26.8002KD,理论等电点7.62,信号肽是N端的19个氨基酸,属于糖苷水解酶家族61的一种胞外酶。
  为高效表达内切葡聚糖酶,将克隆到的egⅦ基因连接到表达载体pPIC9K上,获得重组质粒pPIC9K-α1-egⅦ,pPIC9K-α2-egⅦ和pPIC9K-α3-egⅦ。将重组质粒用电转化法转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中,测定内切葡聚糖酶酶活后,发现pPIC9K-05的酶活力最高。甲醇诱导酵母转化子表达,目的蛋白经SDS-PAGE鉴定成功表达,且大小与理论值基本相符。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)的方法检测毕赤酵母(P.pastoris)转化子经甲醇诱导后的表达量,研究表明:转化子的最大表达量出现在第三天。通过正交实验优化重组P.pastoris转化子的发酵条件,得出:甲醇含量为1%,YNB含量为1.34%,pH为6.0,培养温度为29℃时,产酶量最高,为106.91U/g。
  经酶学特性分析,结果显示:温度在40-60℃内酶活较稳定,其中60℃为最佳温度;pH在6.0-8.0范围内有较好的酶活稳定性,其中pH=6.0时最佳;金属阳离子对酶活的影响中,Ag+激活作用较强,Mn2+抑制作用较强;所选五种底物中,MCC效果最好,该内切葡聚糖酶底物饱和时反应速度Vmax=0.5635mg/(mL·min),米氏常数Km=0.2623mg/mL,速度常数Kcat=Vmax/E=0.1702S-1,相对催化效率Kcat/Km=0.6489mL/(S·mg)。
[博士论文] 李程程
生物医学工程 东南大学 2018(学位年度)
摘要:里氏木霉(Trichoderma reesei)因其蛋白分泌量大(100 g/L)、遗传性状稳定、生长繁殖迅速、培养条件简单和生物安全性等特点,已被广泛用于工业生产及各种异源蛋白的表达载体。并且,该菌在特定条件下可以产生大量的具有抗癌、抗病毒、抗菌特性的次级代谢产物黄色色素类物质,具有广泛的商业价值,次级代谢产物黄色色素的产生对纤维素酶的产生有一定的影响,二者受到相关调节因子的调控。同时,里氏木霉多个菌株的全基因组测序已经完成,这为研究里氏木霉纤维素酶、色素类物质的高产机制以及二者之间的相关性奠定了基础,也为基因改造获得具有优良特性的高产菌株提供了辅助手段。
  本论文主要以里氏木霉RUT-C30为出发菌株通过基因工程改造获得了在纤维素诱导条件下高产纤维素酶的基因工程菌TRB1、在纤维素和乳糖诱导下都能高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌SEU-7以及高产色素的基因工程菌ZC121121,并针对以上构建的基因工程菌研究了纤维素酶的高产机制、里氏木霉纤维素酶和色素产生之间的相互转化机制。之后,我们采用荧光标记的办法对里氏木霉三种主要的纤维素酶进行标记以研究纤维素酶的真实分布情况以及分泌机制。最后采用转录组测序及基因干扰等手段对纤维素酶的产生及其和色素产生的转化关系进行了深入研究。具体说来主要包含以下内容:
  1.构建了高产pNPGase/BGL(β-葡萄糖苷酶)的基因工程菌TRB1,并揭示了基因cel3d在纤维素酶高产中的作用及机理
  以里氏木霉RUT-C30为出发菌株,采用农杆菌介导的方法构建了高产β-葡萄糖苷酶的基因工程菌TRB1。qRT-PCR以及基因克隆实验显示TRB1中cel3d基因受到了干扰,是纤维素酶增加的原因之一。
  2.构建了乳糖诱导下高产纤维素酶的基因工程菌SEU-7并研究其高产机制
  首次构建了一株可以在乳糖诱导下高产纤维素酶的基因工程菌SEU-7。与出发菌株RUT-C30相比,SEU-7的纤维素酶和半纤维素酶活性无论在纤维素还是在乳糖诱导条件下都大幅度提高。以乳糖作为诱导物,在分批培养条件下,FPase(滤纸酶活)活性可以达到13 IU/mL;分批补料培养时,活性提高至47 IU/mL,此外,在分批培养过程中,SEU-7在纤维素和乳糖诱导条件下均表现出了极高的pNPGase活性,分别为81和144 IU/mL,是目前已知菌株中最高的。之后采用qRT-PCR、qPCR以及基因组重测序分析研究了其在不同碳源下的高产机理。
  3.敲除基因121121过程中引起的并行突变在里氏木霉纤维素酶和黄色色素产生中的开关作用
  通过构建基因121121干扰的基因工程菌及过表达121121的菌株,揭示了基因121121以及干扰该基因带来的并行突变在纤维素酶产生和黄色色素类物质sorbicillin分泌过程的开关作用,即,干扰121121以及带来的并行突变会降低纤维素酶产量但极大程度增加黄色色素sorbicillin的产量,并对该基因工程菌进行了RNA-seq分析。同时采用液质联用(HPLC-MS)的方法检测了敲除菌株ZC121121和过表达菌株OE121121的代谢产物。
  4.里氏木霉纤维素酶的产生、分布以及分泌机制研究
  采用红色荧光蛋白对三种主要的纤维素酶BGL、CMC/CMCase(内切葡聚糖酶)和CBH/pNPCase(外切葡聚糖酶)进行了标记,研究了三种纤维素酶产生的先后顺序、在细胞内的分布情况以及分泌情况,结果发现BGL在菌丝体内表达量最多,而后是CMC和CBH,然而,BGL的分泌却晚于CMC和CBH。共聚焦观察结果表明BGL和CBH是定位到细胞膜上的,而CMC没有定位到膜上,GC-Cholesterol-PEG-FITC共染、原生质体制备以及超高分辨结果更进一步的证明了BGL定位到了细胞膜上。通过进一步的内质网共染实验证明了三种主要的纤维素酶都会被输送到内质网进行加工修饰,并且三种酶都存在于囊泡中,高尔基体共染实验证明BGL和CMC都要经过高尔基体分泌到胞外,而CBH则可能不通过或少量通过高尔基体分泌。
[硕士论文] 钟越
微生物学 四川师范大学 2017(学位年度)
摘要:为解决聚乙烯塑料在环境中难降解的问题,本研究筛选出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。经筛选纯化,对该菌进行生理生化实验和16SrDNA序列分析;将菌株先后接种于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw>100000)为唯一碳源的基础液体培养基中,28℃,180rpm培养;每24小时,用分光光度法测定菌体生长浓度和胞外蛋白含量;培养60天后,称取残留PE重量,用扫描电子显微镜观察膜片表观,用拉力测试机、水接触角测定仪以及红外光谱仪测定膜片性能。
  为进一步提高原始菌株对高分子量PE的降解能力,本研究对原始菌株进行了诱变处理。采用紫外辐照、微波热效应、LiCl、盐酸羟胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法对菌株进行诱变;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度筛选法,对诱变菌株进行筛选;通过诱变菌株在以聚乙烯为唯一碳源的培养基中的菌体生长情况、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指标,选出降解性能最优的菌株,再将该菌株与原始菌株在相同培养条件下(以PE膜片为唯一碳源)培养60天,测定膜片力学性能。
  为找出降解PE的关键基因和代谢通路,我们将原始菌株在不同碳源培养条件下的(G组:以可溶性淀粉为唯一碳源;W组:以PE为唯一碳源)基因表达情况进行转录组测序分析,经RNA提取纯化、建库、测序、质控等过程,再进行GO、COG、KEGG数据库注释比对、聚类和富集分析;对两个处理组的基因表达量进行差异比较;最后随机选取差异基因进行RT-PCR表达量验证。
  结果表明,筛选出的菌株为放线菌属的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),命名为ZEL-1。该菌在分子量越低的聚乙烯培养液中,菌浓度、胞外蛋白含量、还原糖含量、聚乙烯失重率越高,菌液pH值下降得越快;电镜观察发现膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸强度降低74.15%,断裂伸长率减少84.90%,力学性能显著下降;水接触角从78.58±0.10°变小到41.25±0.16°,亲水性增大;红外光谱研究结果表明,膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。
  诱变育种结果表明,紫外辐照50s,微波诱变800Hz、120s,0.02%吖啶橙,0.7%LiCl,0.6%盐酸羟胺,为各方法的最优的诱变剂量。复合诱变采用紫外50s的突变菌株为出发菌株,再用0.02%吖啶橙诱变。PE培养基中菌体生长趋势,除盐酸羟胺组外,其他组均优于原始菌株组;紫外组胞外蛋白含量较原始组平均提高2.06倍,微波组平均提高1.24倍,吖啶组平均提高2.70倍,盐酸羟胺组平均提高1.60倍,复合诱变组平均提高3.30倍;盐酸羟胺组膜片失重率低于原始菌株组,其他组均高于原始菌株组,复合诱变组膜片失重率最大,高于原始组2.28倍;选择复合诱变组菌株UV-AO-1为优势菌株,PE降解60天后,UV-AO-1组水接触角比原始菌株组减小2.5°;拉伸强度减小3.37Mpa,断裂伸长率减少39.62%。
  转录组测序结果表明,此次共得到12372(63.24%)个非冗余Unigene,其中2095条Unigene富集于代谢过程组中;与COG数据库比对,有3328条Unigene与COG数据库中的基因具有同源性;涉及到代谢活动相关的Unigene占50.57%;发现差异表达基因423个,与G组相比,W组有293个基因表达上调,130个基因下调;AlkB基因差异表达最为显著。与KEGG Pathway数据库比对,有5776条转录本比对到KEGG数据库中,有92个代谢通路出现差异;碳代谢、氨基酸合成、丙酮酸代谢途径的差异基因表达上调数量较多,乙酰-CoA合成、脂肪酸代谢的相关基因表达差异上调显著,柠檬酸循环的差异基因下调明显。
  实时荧光定量PCR验证结果表明,荧光定量PCR得出的表达量与转录组测序结果的差异基因表达量上下调模式基本一致,证明此次转录组数据结果可信。
  综上所述,本研究菌株ZEL-1能够直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;诱变菌株UV-AO-1的降解性能优于原始菌株,具有更大的应用潜力。原始菌株在PE碳源的培养条件下,菌株代谢倾向于碳架构建,减少了糖类物质的合成和代谢;推测菌株ZEL-1对聚乙烯的降解始于Alk B基因编码的烷烃单加氧酶对聚乙烯的末端氧化断链作用,经由脂肪酸β氧化,完成PE的无机矿化。ZEL-1降解聚乙烯的基因表达差异,基本反映了不同碳源引起的代谢通路差异,为后期深入研究聚乙烯降解机理提供了理论依据。
[硕士论文] 雅男
食品科学 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是自然界中最丰富、来源最广泛的有机物质,它是地球上重要的可再生资源。黑龙江省有着丰富的纤维素资源,但大部分纤维素被焚烧、废弃、对环境造成严重污染。要使纤维素被分解转化成小分子化合物或其它营养物质,筛选分离出能够降解纤维素的优良菌是关键。本文对纤维素降解菌的筛选、产酶条件的优化、酶学性质并对纤维素酶降解菌基因组进行了初步研究,主要研究内容和结果如下:
  1.纤维素降解菌的筛选
  利用羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基、结合碘液染色法、滤纸分解实验和纤维素酶活力测定,从熊猫粪便中筛选出一株纤维素降解菌。结合形态学观察、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析,初步鉴定为Paenibacillus cookii LZ033,它是一种产芽孢且好氧的革兰氏阳性细菌。
  对小鼠灌胃Paenibacillus cookii LZ033菌液,采用一次性灌胃,灌胃菌液浓度为3×108CFU/mL、3×107CFU/mL、3×106CFU/mL,并设置阳性对照组,灌胃剂量均为0.2mL/10g体重。观察14天,未出现中毒症状,无死亡现象,肝脏、脾脏及胸腺无异常改变。
  2.纤维素降解菌发酵产酶条件的优化
  Paenibacillus cookii LZ033菌株的液体发酵产酶培养基:葡萄糖添加量0.99%、蛋白胨添加量0.97%、硫酸镁添加量0.076%、磷酸二氢钾添加量0.31%,在此条件下纤维素酶活力为92.2U/mL。
  Paenibacillus cookii LZ033菌株的液体发酵产酶条件:培养基初始pH6.6、培养温度36℃、摇床转速121r/min,装液量120mL/250mL三角瓶,在此条件下纤维素酶活力为97.8U/mL。
  3.酶学性质的研究
  纤维素酶活力在60℃~70℃之间比较稳定;纤维素酶活力在pH3~4.6之间比较稳定;酶促反应最适温度为70℃;酶促反应最适pH为3。
  金属离子浓度为1mmol/L的条件下,Fe2+、Mn2+对纤维素酶具有明显的激活作用。Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+对纤维素酶具有明显的抑制作用。添加少量的 Fe2+、Mn2+有利于提高菌株的产酶能力。
  4.基因组初步分析
  采用 Illumina公司开发的Miseq测序平台进行测序,根据基因组序列对Paenibacillus cookii LZ033的基本遗传信息进行了初步分析。
  Paenibacillus cookii LZ033基因序列全长为3978050bp,GC含量为46.46%。通过使用Cenemark软件对基因组进行预测,使用COG、GO及 KEGG等数据库进行了注释。共预测到4049个基因,编码基因的序列占整个染色体序列的88.7%,平均长度为878bp。对COG、GO及KEGG注释结果进行检索,Paenibacillus cookii LZ033一共含有10个编码纤维素酶的基因,这些基因编码的酶包括β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶。
  Paenibacillus cookii LZ033含糖酵解途径、柠檬酸途径、磷酸戊糖途径及淀粉和蔗糖代谢途径,可以为自身提供能量,维持正常的生理活动。Paenibacillus cookii LZ033基因组测序为它的应用和研究提供了良好的理论基础。
[硕士论文] 颜凯
生物学;微生物学 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:抗肿瘤抗生素在临床中广泛使用,但存在药物毒副作用及肿瘤细胞多耐药性等问题,为了解决这一难题,寻找结构新颖的抗肿瘤化合物,本研究采用活性追踪的方法开展了抗肿瘤土壤放线菌筛选及对两株活性放线菌次级代谢产物的研究工作。
  以人肺癌细胞A549和人结肠癌细胞HCT-116为筛选模型,采用CCK-8方法从土壤放线菌中筛选出两株活性菌,经16S rRNA初步鉴定均为链霉菌,分别命名为Streptomyces sp.HS-NF-1006和Streptomyces sp.HS-NF-853。
  结合抗肿瘤模型筛选结果和菌株在不同培养基中的生长状况,最终选定葡萄糖1%,可溶性淀粉4%,酵母抽提物0.4%,麦芽提取物0.1%,CaCO30.2%,FeSO4·7H2O0.1%,MnCl2·4H2O0.1%为Streptomyces sp.HS-NF-1006的最适发酵培养基;选定葡萄糖1%,可溶性淀粉4%,酵母抽提物0.4%,麦芽糊精1%,0.1 ml/L(Fe SO4·7H2O0.1%,MnCl2·4H2O0.1%,ZnSO4·7H2O0.1%)为Streptomyces sp.HS-NF-853的最适发酵培养基。利用50 L发酵罐分别对两株活性菌进行放大发酵。
  所得发酵液经前处理后,利用硅胶、凝胶、HPLC等分离方法对两株活性菌的发酵产物进行分离,最终得到9个化合物,利用核磁共振和质谱等分析方法进行结构鉴定,从菌株HS-NF-1006提取到3个化合物1-3,均为蒽环类化合物,其中化合物1为新结构化合物,命名为13-oxy-13-decarbony-6"-cyano-6"-deoxy-TAN-1120;从菌株HS-NF-853提取到6个化合物4-9,其中化合物4是一个结构新颖度较高的四氢苯并呋喃酮化合物,命名为StrefuranoneA。
  对所得到化合物进行抗肿瘤活性评价,化合物1对结肠癌细胞HCT-116的IC50为0.0978μM,对人肺癌细胞A549的IC50为0.08μM,化合物2-9未表现抗肿瘤活性。
[硕士论文] 石斌超
遗传学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:L-丝氨酸是一种在医药、食品、化妆品等领域具有广泛应用的非必需氨基酸。而微生物发酵法作为一种新兴的L-丝氨酸生产方法,具有生产成本低,生产效率高,环境污染小等优点,使其在未来具有十分广阔的应用前景。目前,L-丝氨酸生产菌株的构建手段及技术已经较为成熟,菌株构建主要通过两种方法实现:增强L-丝氨酸合成途径和弱化L-丝氨酸降解途径。随着合成途径及降解途径的改造日趋完善,人们的思路开始转向L-丝氨酸转运途径的改造上来。本文的研究方向则以转运途径中的吸收途径为主。基因 sstT、cycA、sdaC和tdcC是文献报道过的四个大肠杆菌 L-丝氨吸收基因,其中,sstT编码一种Na+耦合的丝氨酸-苏氨酸协同转运蛋白,cycA的转录产物是主要丙氨酸转运子,但是在大肠杆菌中,该转运子也参与丝氨酸和甘氨酸的吸收,sdcC和tdcC都能够编码H+耦合的协同转运蛋白,两者在整个编码区域具有很高的同源性,仅在3’端存在显著差异。其中sdaC编码一个高特异性的丝氨酸吸收蛋白,而tdcC则编码另一种丝氨酸-苏氨酸系统转运蛋白。
  实验室前期在出发菌株SWCH-05(sdaA缺失、glyA突变)的基础上构建得到4株单基因缺陷菌和6株双基因缺陷菌,并对单基因缺陷菌的L-丝氨酸生产情况进行了研究。发酵结果表明L-丝氨酸吸收基因sdaC的敲除对菌株产L-丝氨酸能力的提升最大。
  本研究则利用Red重组系统进一步构建了4株三基因缺陷菌及1株四基因缺陷菌,并综合之前的10株L-丝氨酸吸收基因缺陷菌通过测定菌株L-丝氨酸吸收活性对吸收基因不同敲除组合的影响进行了研究;针对该实验结果又进行了吸收基因过表达实验进一步证明吸收基因的功能;最后通过摇瓶发酵实验对菌株产L-丝氨酸能力进行了初步测定,主要研究及结果如下:
  1)以双基因缺陷菌SWCH-61、SWCH-62和SWCH-64为基础,利用Red重组系统敲除L-丝氨酸吸收基因sdaC和tdcC进一步构建了4株三基因缺陷菌SWCH-71(△sstT,△cycA,△sdaC)、SWCH-72(△sstT,△cycA,△tdcC)、SWCH-73(△sstT,△sdaC,△tdcC)和SWCH-74(△cycA,△sdaC,△tdcC)以及1株四基因缺陷菌SWCH-08(△sstT,△cycA,△sdaC,△tdcC)。
  2)为了解吸收基因敲除对菌株L-丝氨酸吸收能力的影响,我们对所有15株L-丝氨酸吸收基因缺陷菌的吸收活性进行了检测。结果表明,在单基因缺陷菌中,sdaC单基因缺陷菌SWCH-51的L-丝氨酸最终吸收活性是0.798 nmol(mg dry weight)?1,与出发菌SWCH-05相比下降23.34%。但是, sstT单基因缺陷菌SWCH-53、cycA单基因缺陷菌SWCH-52和tdcC单基因缺陷菌SWCH-54的最终吸收活性则分别提高了34.29%、78.29%和48.03%。而在双基因和三基因缺陷菌中,只有敲除了基因 sdaC的菌株其 L-丝氨酸吸收活性降低。但是当所有四个 L-丝氨酸吸收基因被敲除后, sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因缺陷菌SWCH-08的吸收活性接近于零。
  3)针对吸收活性实验中部分菌株出现吸收活性上升的情况,我们利用双酶切系统构建了4个L-丝氨酸吸收基因重组质粒 pSC-sstT、pSC-cycA、pSC-sdaC和 pSC-tdcC,并将其分别导入出发菌SWCH-05中构建得到 L-丝氨酸吸收基因过表达菌株 SWCH-05/pSC-sstT、SWCH-05/pSC-cycA、SWCH-05/pSC-sdaC和SWCH-05/pSC-tdcC。通过测定它们的L-丝氨酸吸收活性发现基因sstT、cycA、sdaC和tdcC确实参与菌株的L-丝氨酸吸收,它们确实是L-丝氨酸吸收基因。其中,过表达基因cycA的菌株 SWCH-05/pSC-cycA L-丝氨酸吸收活性最强,达到2.983 nmol·(mg dry weight)-1, SWCH-05/pSC-sdaC次之。
  4)11株多基因缺陷菌的摇瓶发酵结果表明, sstT·sdaC双基因敲除菌 SWCH-62/pSC-05, sstT·sdaC·tdcC、sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌SWCH-73/pSC-05和SWCH-71/pSC-05的L-丝氨酸产量与对照菌 SWCH-05/pSC-05相比有明显提升,分别达到271.11、312.58和322.57 mg/L;而sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌SWCH-08/pSC-05的L-丝氨酸产量最高,达到了450.58 mg/L,是对照菌的6倍。在菌株生长方面,双基因敲除菌和三基因敲除菌的生长量优于对照菌或者与对照菌相近,而四基因敲除菌的生长量与对照菌相比则下降了28%。
[硕士论文] 崔登雪
生物工程 东北农业大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是地球上最原始、储存量最大的天然化合物,是最珍贵且廉价的可再生资源。我国每年有超过一半以上的秸秆都被人为的就地点燃焚烧或直接丢弃在田间地头,造成极大的资源浪费,同时污染环境,危害人类健康。因而将废弃的农业资源变成有价值的物质,一直深受关注。根据大量的研究表明,采用酶法降解纤维素优势明显,如今纤维素酶在许多行业的应用研究已经产生了诸多成效,比如在食品、发酵工业及环境保护等的应用都取得了巨大效益。多年研究发现,生物界有许多生物都能产生纤维素酶,同时若要大量制备纤维素酶,最有效的方法是采用微生物发酵。其中芽胞杆菌属是可以形成孢子(内生孢子)的球状或杆状细菌,芽胞杆菌对外部有害因素有抗性,分布广泛,存在于土壤,水,空气和动物肠道等,具有较高的耐热性,更适合生产发酵的应用。在中国对于产纤维素酶微生物的研究,已经成为了一个重要的研究方向,并且方法技术都已相对成熟。本论文的研究目的是富集、筛选出能够产生纤维素酶、高效降解纤维素的芽胞杆菌,并对其分离、鉴定,对筛选到的高活性菌株的降解特性及发酵培养条件进行较为系统的研究。
  通过高温处理富集后,在只有CMC-Na做碳源的培养基中培养,30℃、48 h后,筛选得到20株产纤维素酶的芽胞杆菌。经形态学、生理生化、分子生物学鉴定,菌株JD2为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens、菌株JK1为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis、菌株JK5为杀线虫芽胞杆菌Bacillus nematocida、菌株JK7为枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、菌株JK9为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus。经初步比较酶活力,其中菌株JK7的酶活力最高,进一步对菌株JK7酶学性质进行研究,表明菌株JK7所产纤维素酶的最适温度为50℃,最适pH5.0,最适碳源为玉米秸秆(30 g/L),最适氮源为豆粕(10 g/L),且具有一定的热稳定性。
  在此基础上,为优化发酵产酶条件,得到更高的酶活性,初步研究影响发酵产酶的因素,确定其中影响较大的因素作为优化条件,分析各因素试验范围,采用Box-BehnkenDesign(BBD)方法设计响应面优化试验,找出菌株JK7优化培养条件组合。运用Design-Expert.8.0.5软件,将实验结果拟合绘制成响应面优化三维图,得到优化最佳发酵产酶条件:起始pH值6.91、转速237rpm、温度35.3℃。在最佳产酶发酵条件下培养,测得纤维素酶活最高可达12.16 U/mL,比最初酶活提高了6.85倍。
[硕士论文] 梅森
生物工程 北京化工大学 2017(学位年度)
摘要:糖是细胞的碳和能量的最主要来源。活细胞能通过特异性的不同糖的运输系统,使糖穿过细胞膜进入细胞质,对细胞而言,这是细胞生命周期内,尤为重要生理功能。这些特异性的糖的运输系统的运行机制不尽相同,有系统机制是主动运输,而有些系统则是促进扩散机制。与糖运输类似,蛋白质运输也通过特定的通道,这是一个protein-conducting系统,多肽跨膜转移或者集成到细胞膜。在细菌和古生菌中,这个通道位于细胞膜上,由SecY复合体形成。有证据表明,SecY通道在其静息状态下,通过一个塞子域和一个氨基酸的孔隙环密封,起到防止细胞质内的小分子外泄作用。
  本项目以大肠杆菌非特异性跨内膜转运糖分子为目的,研究内容包括:利用栓塞结构域和氨基酸孔环的理性突变,解除SecY蛋白转位通道对水溶性物质的严格密封,削弱细胞内膜对糖分子的屏障作用;结合突变型SecY通道、SARS病毒外壳蛋白SCVE和糖类激酶,构建简单扩散跨膜系统及磷酸化辅助系统;以简单扩散跨膜系统替代木糖、阿拉伯糖、乳糖和纤维二糖转运系统;结合简单扩散跨膜系统和磷酸化辅助系统替代葡萄糖、果糖和甘露糖转运系统。此外,拟探讨简单扩散跨膜系统的设计、构建原理以及简单扩散跨膜系统和磷酸化辅助系统的适配机制,阐明简单扩散跨膜系统克服底物狭窄、“饱和现象”、抑制物敏感和“诱导物排斥”的实现机理和调控策略。本项目有望为大肠杆菌提供新的糖转运策略,研究成果有助于进一步拓展大肠杆菌在代谢工程和合成生物学中的应用前景。
[硕士论文] 周佳
生物化学与分子生物学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:消去化修饰是近年来发现的一种新的罕见的蛋白质翻译后修饰,是指通过巯基进攻不饱和氨基酸从而发生米歇尔共价加成反应。目前发现的消去化修饰蛋白只有三种,晶状体蛋白、MAPKs和Glutathione peroxidase,而多肽有200多种。对于消去化修饰的鉴定,目前科学界并没有较好的研究方法,为填补这一空白,发现更多的具有消去化修饰的蛋白质及多肽,我们在本实验室已经成熟的标记探针基础上对大肠杆菌 BL21(DE3)裂解液进行标记,并鉴定到了221个可能具有消去化修饰的蛋白。选取其中两个大肠杆菌中鉴定到的可能具有消去化修饰的蛋白,苹果酸脱氢酶和丝氨酸乙酰转移酶,进行后期条件更加严格的鉴定。
  首先通过构建重组菌在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行诱导表达,选用 Ni-TED进行亲和层析纯化得到纯度较高的苹果酸脱氢酶以及丝氨酸乙酰转移酶,利用成熟探针bio-SH试剂对目的蛋白进行初步标记,发现二者具有较好的Michael加成效果。同时为验证所使用的化学探针bio-SH试剂的特异性,排除反应中可能存在非特异性,选择在加成反应过程中加入已验证的具有加成效果的DTT试剂进行竞争,发现苹果酸脱氢酶和丝氨酸乙酰转移酶Michael加成反应有一定程度的减弱,近而说明了化学探针bio-SH试剂具有特异性。
  其次,将bio-SH试剂进行过化学标记的蛋白与Streptavidin-NHS beads进行室温孵育,对两个目的蛋白进行特异性富集纯化,为后边进行质谱检测奠定了基础。
  最后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大肠杆菌中苹果酸脱氢酶进行敲除,随后通过对其基因缺陷株进行回补以及表达纯化。对目的蛋白进行特异性化学标记后,比较过表达蛋白与正常表达蛋白之间加成效率的差异。其中在缺陷株中蛋白过表达后其加成效率要高于大肠杆菌BL21(DE3)中正常表达的蛋白。
  本课题建立在本实验室成熟的探针标记基础上,对大肠杆菌中苹果酸脱氢酶和丝氨酸乙酰转移酶进行化学标记,在排除非特异性反应的条件下对二者进行挂柱效率的检测,并通过MDH基因敲除系统的建立,比较蛋白过表达后的加成效率为后边质谱检测以及研究蛋白之间相互作用奠定了基础。同时,该鉴定方法也为后边近一步研究消去化修饰蛋白与多肽的鉴定提供了理论基础。
[硕士论文] 房晓冉
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:生物表面活性剂是一种由微生物发酵生产的两亲性化合物,其分子内同时含有头部亲水基团与尾部疏水集团,具有润湿、乳化、起泡等物理化学特性,与化学合成的表面活性剂相比,具有低毒性、环境友好性以及生物可降解性等诸多优点,因而有希望在食品、化妆品、药品等行业中得到广泛应用。
  槐糖脂是目前产量最高的生物表面活性剂,应用前景最为广阔。天然槐糖脂是由一些非致病性酵母发酵产生的混合物,槐糖脂根据分子结构不同可分为酸型和内酯型两种,酸型槐糖脂的水溶性和发泡能力较好,内酯型槐糖脂则具有更好的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。槐糖脂的表面活性和生物活性会受到脂肪酸侧链的不同和槐糖部分乙酰化程度的影响。内酯型槐糖脂各组分中,又以C18∶1双乙酰化内酯型槐糖脂组分对食管癌细胞等肿瘤细胞的抑制效果最好。
  球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)是一类槐糖脂高产的酵母菌,由本实验室从污水中筛选分离得到。目前,在槐糖脂代谢和合成调控方面的研究尚处于起步阶段。研究槐糖脂合成相关的基因,有助于我们在基因水平上对球拟假丝酵母进行遗传改造,得到期望的特定槐糖脂组分,从而扩展槐糖脂的应用领域,并能开发在特定的工农业领域中的应用。
  本论文主要研究内容及结果如下:
  1.槐糖脂合成相关的胞外酸性蛋白酶基因的功能研究
  将球拟假丝酵母基因组信息与不同氮源条件下发酵的转录组数据分析结果相结合,我们发现,以硫酸铵为氮源进行发酵时,酸型胞外蛋白酶基因axp的转录量显著上调;敲除axp和其他三个同源蛋白基因后,将敲除株以硫酸铵为氮源进行发酵时,产物中酸型槐糖脂的产量明显提高。
  基于以上研究结果,对不同氮源条件下发酵液的蛋白质组进行分析,我们发现,在以硫酸铵为氮源的发酵液中,Axp蛋白的丰度呈现较高的水平;而在以酵母粉为氮源的发酵液中,检测不到Axp蛋白。我们构建了axp过表达菌株,在以酵母粉为氮源的发酵条件下,槐糖脂产量降低了15%。将axp在毕赤酵母GS115中进行异源表达,得到纯化的Axp蛋白液。将纯化的Axp蛋白用于外源添加实验,外源添加Axp蛋白液的球拟假丝酵母野生型菌株总槐糖脂产量降低了33%,内酯型槐糖脂的产量下降了41%,酸型槐糖脂的产量下降了23%。
  2.槐糖脂合成相关的长链脂肪酸去饱和酶基因的功能研究
  球拟假丝酵母发酵产生的槐糖脂,根据结构主要分为内酯型和酸型两种,其中又包括脂肪酸侧链长度、乙酰化程度和不饱和程度等差异。结构不同的槐糖脂组分间生理生化活性不同,其中C18∶1的双乙酰化内酯型槐糖脂(C18∶1 DLSL)是现有报道中抗肿瘤活性最好的组分。目前对槐糖脂合成方面的研究仅局限于合成通路中催化几步关键反应的酶,对合成通路中的去饱和酶未见报道。
  基于以上背景,我们研究了槐糖脂合成通路中的去饱和酶基因。我们在球拟假丝酵母基因组中,通过基因注释和比对分析,找到两个长链脂肪酸去饱和酶基因,并将其分别命名为desA1和desA2,通过氨基酸序列比对,确定基因组中无其他同源蛋白。对这两个基因分别进行了敲除和过表达。desA1无法被敲除,过表达菌株中desA1基因的表达水平上调程度也不显著,推测其为球拟假丝酵母生长必需基因。desA2的敲除株和过表达菌株均构建成功,C18∶2 DLSL与C18∶1DLSL的峰面积之比为1.22,而ΔdesA2菌株中C18∶2 DLSL与C18∶1 DLSL的峰面积之比为1.08,表明敲除株中的C18∶1 DLSL组分占总槐糖脂的比例增加。
[博士论文] 彭圣娟
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素生物质的生物降解研究具有重要的生物学和工业应用意义。对木质纤维素降解酶系进行组成优化和酶学性质改造,对促进木质纤维素生物转化生产生物燃料和大宗化产品具有重要价值。草酸青霉(Penicillium oxalicum)作为一种重要的产纤维素酶工业微生物,和里氏木霉相比具有酶系组成和比例更加合理、半纤维素酶活力更高的优点。目前已有的草酸青霉木质纤维素降解酶系在大规模工业化生产生物乙醇中仍然存在用量大、成本高的问题。找到能够促进纤维素降解的关键酶组分、降低生产成本是提高木质纤维素生物转化经济性的关键途径之一。
  本论文的主要研究结果如下:
  1.革酸青霉木质纤维素降解酶库的构建及其成员的酶学性质研究
  通过同源、异源方式表达了12种木质纤维素降解相关酶,构建成一个小型的草酸青霉木质纤维素降解酶库。其中纤维素酶有2种,半纤维素酶有8种,此外还有2个辅助酶。测定了部分酶库成员的比酶活、最适温度、最适pH、温度稳定性以及pH耐受性。外源添加β-葡萄糖苷酶能够显著提高草酸青霉高产菌株JU-A10-T酶系对工业废渣木糖渣的糖化能力,从而减少了达到同等水解效率时酶的用量。
  2.添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D等半纤维素酶对预处理木质纤维素底物降解的促进作用
  添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D和内切-β-1,4-甘露聚糖酶Man5A可以明显促进草酸青霉酶系降解水热法预处理的玉米芯和木糖渣时的葡萄糖产量。进一步探究Abf43D促进纤维素降解的机理发现,用Abf43D预处理能够提高底物的转化率,推测其能够通过除去底物中木聚糖侧链上的阿拉伯呋喃糖基,从而打破糖化中的抗降解屏障,与内切-β-1,4-木聚糖酶Xyn10A等协同促进半纤维素的降解,并有利于纤维素酶对纤维素的水解,最终提高了葡萄糖产量。此外Abf43D的添加能够缓解木聚糖水解液对纤维二糖水解酶活力的抑制作用。
  3.添加醛糖酸内酯酶AltA对木质纤维素糖化中β-葡萄糖苷酶活力和葡萄糖产量的影响
  D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力有强烈的抑制作用。添加AltA能缓解D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力的抑制。向糖化体系中添加AltA,不仅能提高草酸青霉和里氏木霉酶系的β-葡萄糖苷酶活力,还能促进纤维素的降解。通过HPLC-ESI-Q-TOF MS分析,证实了当AltA存在时糖化体系内的D-葡萄糖酸-1,5-内酯水平显著降低。当添加叠氮化钠和金属离子螯合剂EDTA抑制氧化还原酶类活性后,AltA的增效作用明显减小。
  4.裂解性多糖单加氧酶-醛糖酸内酯酶-β-葡萄糖苷酶(LPMO1-AltA-BGL1)协同体系降解木质纤维素研究及其组分配比的优化
  证实了LPMO1-AltA-BGL1体系能够协同降解磷酸膨胀纤维素,并可促进商业纤维素酶降解微晶纤维素和多种预处理的木质纤维素类底物。糖化体系中存在AltA时,内酯含量下降、β-葡萄糖苷酶活力上升,说明AltA缓解了可能由LPMO1产生的内酯对BGL1的抑制,从而使协同体系进一步发挥效果。利用DesignExpert软件设计了混料实验并预测了优化方案,得到LPMO1、AltA和BGL1的最优配比约是3∶8∶14。
[博士论文] 王文爽
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)又称为粘多糖,是由重复单位组成的直链多糖。根据其二糖单位的不同,糖胺聚糖又被分为透明质酸(Hyaluronic Acid,HA),肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate,Hep/HS),硫酸软骨素/硫酸皮肤素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate,CS/DS),硫酸角质素(Keratan Sulfate,KS)。糖胺聚糖常常由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂,主要表现为D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸,糖链中不同部位羟基(-OH)和氨基(-NH2)的硫酸化,以及己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖结构的复杂性赋予其功能的多样性,不同的结构具有不同的功能。
  糖胺聚糖广泛存在于动物细胞表面和细胞基质中,常常通过与各种蛋白的相互作用参与了细胞的增殖分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程。糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子,在医药及功能食品中得到广泛应用,如肝素、硫酸软骨素、透明质酸等。但由于糖胺聚糖结构的不均一性,特别是硫酸化糖胺聚糖结构的高度复杂性,使不同来源和不同批次的同一种糖胺聚糖在活性上存在很大差异。近年来的大量研究表明,糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的,同一多糖链中存在不同结构的功能区,与不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能。因此通过运用底物特异性的糖胺聚糖内切酶选择性的部分降解糖胺聚糖多糖链,制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖;通过运用底物特异性糖胺聚糖硫酸酯酶可以对特性功能区寡糖进行改造和修饰;通过综合运用底物特异性糖胺聚糖内切酶和外切酶可以对特性功能区寡糖进行测序。这些具有特异性的糖胺聚糖工具酶不仅在糖胺聚糖构效关系研究和寡糖制备中具有重要作用,并且在神经系统损伤治疗中也有重要作用。但是目前可以利用的糖胺聚糖工具酶屈指可数,因此寻找新型糖胺聚糖工具酶对于糖胺聚糖构效关系研究具有重要作用。
  海洋作为生命的起源,存在大量的生命形式。海洋中存在大量的结构多样的糖胺聚糖,但是之前并没有相关糖胺聚糖降解酶的研究和报道。本论文以硫酸软骨素为唯一碳源,在海泥中筛选出一株高效降解糖胺聚糖的菌株并进行了基因测序。通过生物信息学分析发现了一系列新型糖胺聚糖工具酶基因,并对这些基因进行了深入研究。主要研究成果包括以下几个方面:
  (a)糖胺聚糖降解菌的筛选:以鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素CS-C为唯一碳源,从海泥中筛选得到15株多糖降解菌,其中编号为FC509的菌株表现为对褐藻胶、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、肝素等多种多糖的降解和利用活性。因此本论文重点对FC509菌株进行研究,通过对其进行全基因组测序和生物信息学分析,发现了一系列与糖胺聚糖降解利用相关的酶基因,并着重对其中的多个降解酶基因进行了深入研究。
  (b)内切型糖胺聚糖裂解酶HCLase的相关研究:将HCLase基因构建到大肠杆菌表达载体中异源表达,并利用镍柱进行纯化。底物降解实验表明:该酶具有高效降解HA和CS的活性,因此被命名为HCLase。基本酶学性质研究表明:HCLase与已报道的糖胺聚糖降解酶不同,其具有嗜盐特性,这与它来源于海洋细菌有关,切表现出良好的温度和pH稳定性。底物降解模式分析表明:HCLase是一个内切型糖胺聚糖裂解酶,最小底物是4糖,最小产物是2糖。同时我们对HCLase不能降解的四糖进行了序列测定,其结构为A4,5HexUAα1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S),这个结果揭示CS糖链中葡萄糖醛酸二位羟基的硫酸化会抑制HCLase对糖苷键的有效切割。HCLase的最大的优点是具有超高的酶活和良好的稳定性,这些特性使其成为具有巨大应用潜力的新型糖胺聚糖工具酶。
  (c)外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的相关研究:将HCDLase基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中异源表达,并运用亲和层析柱对异源表达的酶进行了纯化。酶学性质研究和底物降解模式分析表明:该酶具有典型的外切型酶活性,可以从糖链的还原端有效降解HA、CS和DS,但不能降解Hep和HS,因此被命名为HCDLase。进一步的研究表明:HCDLase可以降解还原端荧光标记的硫酸化CS寡糖并产生二糖,但是不能降解荧光标记的DS和HA寡糖,这说明糖苷键类型和硫酸化程度影响HCDLase的降解活性。最后我们运用这种酶成功的对系列硫酸软骨素六糖和八糖进行了测序。上述一系列研究结果表明:HCDLase作为一个新型的外切型糖胺聚糖裂解酶,在糖胺聚糖的构效关系研究,特别是复杂CS功能寡糖测序中具有重要的应用价值。
  (d)新型内切型糖胺聚糖硫酸酯酶4-O-Endosulfatase的相关研究:将该硫酸酯酶基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中,并进行诱导表达和分离纯化。基本酶学性质研究表明:该酶在最适反应条件(30℃,pH8.0)下具表现出强的CS和DS硫酸酯酶活性;底物降解模式分析表明:该酶与已报道的CS/DS硫酸酯酶不同,不仅可以高效去除糖链端基的GalNAc上4位硫酸基团,而且还可以有效去除多糖链内部的4位硫酸根。多底物降解分析显示:该酶可有效去除多种CS和DS多糖链中的4位硫酸根,去除率在17-65%之间,硫酸基团的去除率与糖链的硫酸化模式密切相关。作为第一个被深入研究的CS/DS内切型硫酸酯酶,4-O-Endosulfatase在CS/DS构效关系研究和糖链硫酸化修饰调节中具有重要应用价值。
[硕士论文] 李剑南
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:为了提高来自里氏木霉的纤维素酶降解木质纤维素的效率,我们在里氏木霉和毕赤酵母中使用异源表达技术表达并构建了复合型酶系。来自Clostridiumstercorarium的耐热纤维素内切酶Cel9a和经过热稳定性改造的里氏木霉胞内β-葡萄糖苷酶Cel1b-S在里氏木霉中分别使用XYNⅡ和CBHⅠ的启动子和信号肽序列进行了表达分泌。Cel1b-S同样在毕赤酵母GS115中得到了异源表达,经镍柱纯化后与里氏木霉纤维素酶混合,并以微晶纤维素和脱木素玉米芯等木质纤维素作为底物进行了糖化水解测试,对其纤维素降解能力进行了高效液相色谱(HPLC)测定。
  为了更深层次的理解丝状真菌降解木质纤维素的机理,我们尝试对里氏木霉的胞外纤维素酶多聚体进行了纯化。我们使用凝胶过滤色谱(GFC)、疏水作用色谱(HIC)及离子交换色谱(IEC)对分离浓缩后的里氏木霉T1胞外蛋白进行纯化,并对经过纯化后的蛋白样品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN PAGE)进行检测。我们将在接下来的工作中尝试使用冷冻电镜(Cryo-EM)对多聚体结构进行解析。
[硕士论文] 胡亚炜
微生物 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:微生物生态系统是基因多样性的宝库,但是99%的微生物是无法在实验环境下培养的。宏基因组学通过直接提取和克隆环境中微生物DNA,对DNA进行基因分析,分析内容包括测序分析以及生物功能基因筛选等方面。
  测序分析以大规模测序环境DNA序列为基础,从已有的序列信息中获得微生物生态系统的基因组成和基因的多样性。但是依据序列信息推断的功能基因常常与实验结果不符,因此功能基因筛选成为挖掘微生物生物活性基因的重要方法。如今,微流控技术的广泛应用促进了功能基因筛选的自动化,微型化和高通量。由此启发,本文旨在探索宏基因组文库高通量筛选的新方法,即构建土壤宏基因组文库,利用液滴技术包裹单克隆,在微流控筛选系统上进行功能基因筛选。
  本文构建了土壤宏基因组文库,库容为1200Mbp。在探索筛选方法上,我们利用微流控芯片制作包裹荧光大肠杆菌的稳定双乳化液滴,在流式细胞仪上根据荧光信号分选液滴,证明液滴技术在分选实验中的可能性。为将来筛选宏基因组文库奠定了基础。
  在筛选系统上,我们搭建了微流控筛选系统,系统以负压为流体动力,根据荧光检测改变电磁阀的通电状态,选择性的将荧光细胞注入特定通道内。该系统的构建成功将有利于流式技术的自动化和微型化。
[硕士论文] 郑福存
化学 东华理工大学 2017(学位年度)
摘要:目前,国内外对壳聚糖酶的研究主要集中在产壳聚糖酶菌株的筛选、酶的分离纯化及产酶条件优化等方面。由于大多微生物产生的壳聚糖酶活性较低,产量高,很难实现工业化的生产。随着分子生物学技术的不断发展,壳聚糖酶基因的克隆表达、重组、突变等技术在酶工程领域得到了广泛的应用。主要包括酶基因的定点突变,化学修饰改进酶的特性,提高酶活力和表达量等方面。运用基因工程技术克隆壳聚糖酶基因,分析酶的结构,构建产壳聚糖酶的重组微生物,是获得比自然酶活力更高、更稳定的工业酶的有效途径之一。
  本实验以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,成功克隆出一条壳聚糖酶基因。该基因序列大小831bp,编码277个氨基酸,理论分子量为31.3kDa,理论等电点为9.51。将该壳聚糖酶基因的DNA片段构建到热激表达载体pHsh中,得到含有壳聚糖酶基因的重组表达载体。将该表达载体转入大肠杆菌细胞中,通过菌落PCR和测序鉴定,证实了转化的成功,得到了表达壳聚糖酶的重组大肠杆菌。
  对重组壳聚糖酶的酶学性质进行了研究,得出结论:壳聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0。对壳聚糖酶的热稳定性研究结果表明,当温度为35℃时,相对酶活性为100%,当温度升高到50℃时,其相对酶活性下降了50%,表明该酶具有一定的热稳定性。对诱导后的宿主菌细胞进行有效破碎,使用镍柱对重组壳聚糖酶蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳检测结果表明,得到了分子量大小约为28kDa的蛋白质。根据米氏方程计算出Km值为2.952mg/mL,Vmax值为0.111mg/mL。
  运用PYMO对壳聚糖酶进行了同源建模分析,总体分子结构显示:该酶含有14个α螺旋和5个β链,组成了两个球状上部和下部结构域,产生用于底物结合的活性位点裂缝。该酶的分子折叠方式类似于来自链霉菌属的脱乙酰壳多糖酶。运用Biolog自动鉴定系统,对重组大肠杆菌对碳源、氮源的利用研究。结果表明;以四唑紫为还原染色剂,能够利用D-果糖等26种碳源,同时能够利用4种氮源,对8种抗生素有敏感作用。
[硕士论文] 尹畅
环境科学与工程 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是一种极为重要的n-3多不饱和脂肪酸,具有抗癌、抗炎、预防心血管疾病的作用,并能促进婴幼儿神经系统和视觉系统的发育和成熟。而裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)是属于破囊壶菌科的一类海洋真菌,体内积累了大量的DHA,是目前已知的DHA含量最高的海洋真菌,因其具有的重要经济价值而备受人们关注。因此通过对裂殖壶菌DHA合成途径的研究,利用生物工程方法来最大限度提高裂殖壶菌DHA产量,具有极为重要的生物学意义和经济价值。
  CRISPR/Cas9是一种高效准确的新兴基因编辑技术,目前已应用该技术成功在多个物种实现基因编辑。本文旨在以裂殖壶菌为研究对象,通过构建相应的CRISPR/Cas9基因编辑系统,对裂殖壶菌中与脂肪酸合成相关的基因进行敲除,并替换为Zeocin抗性基因片段,初步探索CRISPR/Cas9基因编辑系统在海洋真菌裂殖壶菌中的应用,以及相关基因敲除后对脂肪酸产量的影响。据此,本实验的主要内容及研究结果如下:
  (1)为了确定本实验的选择标记基因,从而能够成功筛选出转化菌株,本实验选取了基因工程中常用的抗生素Zeocin、氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan),分别研究其对裂殖壶菌生长的影响,结果表明,浓度为50μg/mL和100μg/mL的氨苄青霉素和卡那霉素对裂殖壶菌的生长基本没有影响,而Zeocin抗生素浓度为50μg/mL时,裂殖壶菌的生长受到一定的抑制作用,当Zeocin浓度为100μg/mL时,裂殖壶菌的生长被完全抑制,且到第十天仍没有菌落出现,所以本研究选择Zeocin作为裂殖壶菌的抗性筛选试剂,筛选浓度浓度为100μg/mL。
  (2)根据专门的设计网站https://www.dna20.com/products/crispr设计出用于敲除裂殖壶菌PKS亚基PksD基因的gRNA序列,并将该序列构建进能够高效表达CRISPR/Cas9系统的pCRISPR-Schi载体中。利用重叠延伸PCR克隆出带有PksD基因上下游区域同源序列的Zeocin抗性基因片段,通过电转化方法将该片段与CRISPR载体转入裂殖壶菌中,成功得到PksD基因敲除的裂殖壶菌菌株,且转化效率达到80%。而通过对转化菌株和野生型菌株生物量的测定可知,细胞干重并没有太大差异,说明CRISPR载体和抗性基因片段的插入对菌株的正常生长没有太大影响,也进一步说明CRISPR/Cas9基因编辑系统适用于海洋真菌裂殖壶菌,并且能够快速、高效地对裂殖壶菌进行相关基因的敲除与加入。
  (3)对敲除PksD基因的裂殖壶菌阳性菌株,采用气相色谱-质谱(GC-MS)对其脂肪酸含量进行测定,结果发现,转化菌株与野生型菌株相比,各转化菌株总脂含量均有一定程度的提高,而脂肪酸的组成没有发生变化,但与野生型菌株相比,转化菌株的DHA含量降低约20%,说明PksD基因的破坏对总脂和DHA的合成产生了影响,进一步说明PksD基因在裂殖壶菌脂肪酸合成的PKS途径中起着比较重要的作用。该体系的构建为后续运用CRISPR/Cas9系统研究裂殖壶菌的基因功能奠定了基础。
[硕士论文] 陈逸文
生物工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:纤维素是地球上存量最为巨大的生物可再生资源,使用其生产能源物质对人类未来发展的可持续性具有重要意义。纤维素酶能够将纤维素催化水解转化成葡萄糖,可为后续生产生物燃料提供原料。产纤维素酶的生物具有广泛性和多样性,微生物、动物甚至植物都有能产生纤维素酶的种属。纤维素酶的应用十分广泛,在食品、畜牧、纺织、造纸等行业都有很好的应用。海洋环境的特殊性使得海洋微生物能够产生具有新特性的酶。对海洋微生物资源的开发与利用可以极大的丰富微生物酶资源库。
  本研究从舟山市桃花岛附近海域采集的样本中筛选出一株能够产纤维素酶的放线菌。根据菌落形态、生理生化特征和16S基因序列的比对确定该菌是密旋链霉菌Streptomyces pactum。
  对该菌的液体发酵产酶进行了优化研究。发现该菌发酵的最适碳源和氮源分别为麸皮和NH4NO3,然后对培养基组分进行显著性分析,发现麸皮、K2HPO4、吐温-80是影响产酶的显著因素。对这三个显著因素进行了响应面分析,根据分析结果确定了最佳的培养基成分。同时又结合遗传算法通过BP人工神经网络方法优化了培养基组分。最后基于最佳配比培养基研究确定的发酵条件为:发酵温度30℃,接种量5%,摇瓶装液量70 mL/150 mL,转速200 r/min,起始pH7,在168小时酶活达到最高值为0.455 U/mL,酶活提高了97.82%。
  对该菌液体发酵所得的酶液进行了浓缩、硫酸铵分级沉淀、脱盐处理后得到初步纯化的纤维素酶液。对该酶液的CMC酶活性质的研究表明显示,该酶最适反应温度为60℃,在pH6-7有最高的酶活性,一定浓度(≤0.6%)的NaCl对酶活有提高作用,在NaCl浓度为2%的情况下酶活比不含NaCl的情况下提高了1.19倍;50℃以下酶的稳定性良好;低浓度(5 mmol/L)的K+、Mg2+、Zn2+对酶活有促进作用,Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+有较强的抑制酶活作用,高浓度(10mmol/L)时K+、Mg2+对酶活有促进作用,Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+对酶有抑制作用,该酶具有良好的耐碱性、耐热性和耐盐性,在工业应用领域有一定的应用前景。
[硕士论文] 李清云
海洋化学 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:海洋水体的富营养化导致赤潮频繁暴发,有害赤潮藻所产毒素在贝类体内富集形成贝类毒素,严重危害消费者的身体健康,阻碍水产品对外贸易的发展,成为影响贝类产业可持续发展的瓶颈之一。本文以新型贝类毒素氮杂螺环酸毒素为研究对象,建立多种AZAs毒素的Q-Exactive高分辨质谱检测方法,同时在实验室内对产自我国沿海的一株氮杂螺环酸产毒藻AZDY06进行单种培养并对其产毒能力进行了评估。随后,应用该产毒藻对栉孔扇贝进行暴露实验来研究氮杂螺环酸毒素在栉孔扇贝体内的代谢轮廓,及其对栉孔扇贝组织结构和生理的胁迫作用等方面进行了实验研究。论文的主要内容如下:
  (1)采用Q-Exactive高分辨质谱,在液相色谱-串联质谱法基础上进一步创建了AZA毒素高分辨非定向定性筛查和低分辨目标物定量筛查检测方法,对蓄积代谢试验样品进行综合分析,根据化学分子式计算各AZAs的精确质量数,精确筛查到了AZA2在贝类蓄积代谢过程产生的四种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19和AZA23),并使用液相色谱-串联质谱对实际阳性样品进行了定量检测,达到了同时精准定性和精确定量的要求,适用于氮杂螺环酸毒素代谢物质的的筛查分析工作,为进一步完善我国水产品中贝类毒素的监控体系提供可靠的工作基础和技术支撑。
  (2)将栉孔扇贝(Chlamys farreri)暴露于三种产毒藻不同生物量模式下模拟赤潮爆发时初期、中期和后期海洋环境过程,通过比较毒素组分、各组织器官中毒素的蓄积及代谢转化特异性,研究氮杂螺环酸毒素(Azaspiracid,AZAs)在栉孔扇贝体内危害形成的过程。结果显示,分布于我国南海海域的氮杂螺环酸产毒藻(A.poporum,AZDY06株),其生长及产毒性状稳定,产毒能力较强,主要产生AZA2毒素,单细胞产度能力一般为7.05±0.52fg/cell;投喂低生物量产毒藻组扇贝体内有共有三种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19)产生,中生物量和高生物量实验组有四种代谢产物(AZA6、AZA12、AZA19和AZA23)产生,说明贝类摄食产毒藻生物量的大小影响代谢产物组分的转化过程;中生物量和低生物量组在暴露阶段的变化趋势相似,都是在蓄积阶段呈现迅速上升的趋势,达到最高点随后呈现总体下降趋势,而高生物量组在蓄积阶段呈现迅速上升的趋势,在蓄积前期既已达到峰值后呈急剧下降趋势,随后缓慢增加直至暴露结束后,比较而言,各实验组对AZAs毒素蓄积能力由大到小顺序为:中生物量组>高生物量组>低生物量组,其中以中生物量组蓄积能力最强。实验数据初步探究了AZA2在栉孔扇贝体内的代谢转化机制,为后续实验奠定基础。
  (3)前期实验表明,高生物量产毒藻暴露实验会增加栉孔扇贝体内代谢产物的组分种类和各组分的含量,但是随之也会加重对扇贝的毒害作用,会降低扇贝对氮杂螺环酸毒素的蓄积能力,暴露时间越长,扇贝对毒素的蓄积代谢能力越弱。所以将栉孔扇贝(Chlamys farreri)直接暴露于更高生物量产毒藻,同时缩短暴露时间。结果表明,栉孔扇贝对该产毒藻具有较强摄食能力及AZAs蓄积能力,扇贝在12h内摄食5×107cells产毒藻细胞后,体内AZAs毒素含量已超欧盟安全限量,达165.3μg AZA1 eq/kg,蓄积效率为78.2%;AZAs毒素在扇贝各组织间分布存在显著差异:内脏团>鳃>外套膜>闭壳肌,内脏团中毒素组份最多且AZAs毒素含量最高,为该毒素在栉孔扇贝体内蓄积代谢的靶器官;AZA2在扇贝中潜在转化方式不同,包括碳键位的羟基化、去羧基化和氧化等作用方式;暴露期间共生成4种代谢产物:AZA6、AZA12、AZA19和AZA23,其中AZA19为最主要代谢产物,约占总毒素40%左右,其他代谢产物含量较低,因此像AZA19这种持久性代谢产物,应成为我国AZA限量标准制定的潜在考虑对象。本研究证明我国近海分布氮杂螺环酸产毒藻毒性危害较强,建议加快制定AZAs限量标准。
  (4)暴露于三种不同生物量模式下的栉孔扇贝在暴露实验初期,内脏团和鳃组织内的抗氧化防御系统中的氧化还原酶被激活,MDA含量增多,脂质发生过氧化,相应的GSH-PX和POD酶活力均增强,粒细胞分泌的ACP、POX活力增强。综合AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织的超微结构的损害以及引起的组织中氧化还原酶的激活作用,可共同为AZAs胁迫下贝类的组织毒理学指标的确立提供理论依据。实验结果显示:暴露实验过程中,在AZAs的作用下栉孔扇贝内脏团和鳃组织的超微结构均出现了病理变化,内脏团的肠上皮细胞空泡化,细胞核萎缩变形,严重时细胞坏死裂解,且损伤程度随暴露毒素生物量的增加而加重;暴露前期,鳃的柱状上皮细胞中线粒体和溶酶体增多且聚集,后期上皮细胞肿胀破裂,粘液细胞大量释放粘液颗粒。通过暴露实验检测内脏团和鳃组织中抗氧化防御系统中氧化还原酶的变化,同时观察了AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织超微结构的毒理学作用进一步研究AZAs对栉孔扇贝内脏团和鳃组织的毒理学胁迫作用。
[硕士论文] 徐茜茜
水产品加工及储藏工程 河南科技学院 2017(学位年度)
摘要:酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的双重生理生化特征,其芽孢具有更强的耐高温高酸特性,当外部条件适宜时迅速萌发并生长繁殖,引起果汁腐败变质,对低pH食品工业的巴氏灭菌工艺提出严峻的挑战,该菌的危害控制已成为食品研究领域普遍关注的问题。芽孢萌发是细菌开启生长繁殖的关键环节,同时失去极端抗性,是其危害控制的重要阶段。本文研究了不同营养因子对酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢形成及pH值对其芽孢萌发的影响,通过芽孢萌发过程中的蛋白组学研究,揭示其芽孢在低pH条件下萌发生长的调控机制,为控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染及如何修订低pH食品的巴氏杀菌工艺提供理论依据。
  本研究主要内容包括:⑴葡萄糖、酵母浸粉、Mn2+、Mg2+对酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体密度和芽孢形成率影响显著,而Ca2+、NH4+和K+的影响不显著,其中过量的Mn2+和Mg2+会抑制酸土脂环酸芽孢杆菌的生长,Ca2+与K+或者与NH4+协同作用时可以促进酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢的形成。⑵通过芽孢菌悬液光密度检测和环境扫描电镜检测,发现酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢萌发的最佳pH值为4.0;在pH3.0和5.0条件下,芽孢萌发过程延长,pH为2.0时芽孢外壁受到破坏。⑶酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢在pH3.0条件下萌发2 h,有98种蛋白差异表达,分子功能主要集中在磷酸三酯活性、乳酰谷胱甘肽裂解酶活性、核糖体的结构组成、分子结构活性、转移酶活性、肽酶活性和外肽酶活性等;生物学过程主要集中在有机氮化合物生物合成和代谢、蛋白代谢、谷氨酰胺代谢、细胞蛋白代谢和有机物合成等中;涉及的通路有 beta-内酰胺抗性、核糖体、次级代谢产物合成、丙酮酸代谢、卟啉和叶绿素代谢、萜类化合物骨架合成、双组分系统和细菌分泌系统等。
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