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[硕士论文] 李悦
环境科学与工程 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:巴丹吉林沙漠是我国第三大沙漠,湖泊众多,微生物资源丰富。本研究利用Illumina Miseq高通量测序平台,结合Mothur、Canoco和R软件对巴丹吉林沙漠盐碱湖沉积物中细菌及古菌群落结构及多样性进行了研究。采用荧光定量PCR测定了沉积物硫酸盐还原菌基因丰度。初步了解了盐碱湖沉积物中的微生物特性,并且有利于进一步开发盐碱沉积物环境中微生物资源。主要研究结果如下:
  (1)通过测定巴丹吉林沙漠盐碱湖沉积物理化性质,参照土壤分类标准,巴丹湖-东和宝日陶勒盖沉积物为低盐度沉积物;双海子-西和双海子-东为高盐度沉积物;巴丹湖-西、音德尔图、青海子、南海子、庙海子、诺尔图为超高盐度沉积物。通过测定巴丹吉林沙漠盐碱湖水样理化性质,参照水化学分类标准,巴丹湖-东和宝日陶勒盖为氯化钠型微咸水湖;双海子-西和双海子-东为氯化钠型盐湖;巴丹湖-西、音德尔图、青海子、南海子、庙海子、诺尔图为碳酸钠型盐湖。
  (2)盐碱湖沉积物中细菌共有58个门类,主要门类为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。高、超高盐度沉积物的最优势门类为厚壁菌门,所占比例为37.1%-61.6%。低盐度沉积物最优势门类为变形菌门,所占比例在50%左右。古菌有15个门类,主要门类为广古菌门(Euryarchaeota),占比为32%-99%。
  (3)低盐度沉积物细菌优势菌属为硫杆菌属(Thiobacillus),古菌优势菌属为甲烷杆菌属(Methanobacterium)。高、超高盐度沉积物细菌优势菌属为未分类菌属norank_Syntrophomonadaceae,古菌优势菌属为盐长命菌属(Halovivax)。
  (4)低盐度沉积物细菌多样性与NH4+正相关,与pH、Sal、SO42-、Cl-负相关。高、超高盐度沉积物细菌多样性与pH、Sal、SO42-、Cl-正相关,与NH4+负相关。古菌多样性与盐度无明显关联性,受到多种因素综合影响。
  (5)荧光定量PCR结果显示,盐碱湖沉积物中硫酸盐还原菌基因丰度为1.24×105copies/g-6.26×106copies/g。相关性分析表明,硫酸盐还原菌基因丰度与NO3-含量极显著正相关,与含水率与总磷显著负相关。
[硕士论文] 梁其云
微生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:自70多年前第一株可捕食的粘细菌被报道以来,越来越多的捕食性细菌类群、捕食策略、生态位的重要性以及潜在应用纷纷被报道。捕食性细菌类群分布在多种环境类型中,捕食者类群与非捕食者类群之间的相互作用在某些特定的生态环境中可能对其它细菌类群的存亡起重要作用;细菌的捕食行为也逐渐被认为是一种环境驱动力量,捕食性细菌类群的菌群结构和物种多样性逐渐被视为可控制或者调节环境样品中微生物的群落结构。慢生单胞菌类群是本实验室于2015年建立的高级分类单元——慢生单胞菌目,在研究中发现其进化分支中的两个物种具有捕食细菌的功能;因此,本文以慢生单胞菌类群为研究对象,对现有的捕食性细菌类群进行了兼性捕食与专性捕食的比较基因组学差异性分析、系统性地分析了慢生单胞菌类群和对照菌株黄色粘球菌的猎物谱,并对慢生单胞菌类群的生物地理学分布进行了解析。取得如下
  成果:
  1.整合了直系同源蛋白组差异性分析的流程,首次提出了“兼性捕食者指数”。通过对8个专性捕食性细菌和16个兼性捕食性细菌基因组的蛋白序列与OrthoMCL数据库比对进行直系同源蛋白组(Orthologous proteins)注释,并对上述数据进行多响应置换分析(Multiresponse permutation test,MRPP),借助指示者参量(Indicator values,IVs)获得56个兼性捕食性细菌类群的直系同源蛋白组与9个专性捕食性细菌类群的直系同源蛋白组。基于兼性捕食性细菌类群特有的直系同源蛋白组提出了“兼性捕食者指数”。
  2.在较大分类学范围内确定了捕食性慢生单胞菌的猎物谱。本项研究依托山东省海洋微生物菌种资源库平台,选择了不同分类地位的345株细菌作为候选猎物细菌,探讨了捕食性慢生单胞菌的猎物谱,研究发现捕食性慢生单胞菌类群Bradymonas sediminis FA350T和Bradymonadaceae sp.B210可分别对205株和147株候选猎物细菌进行捕食,对照菌株黄色粘球菌Myxococcusxanthus DK1622T可对215株候选猎物细菌进行捕食。通过对三种捕食性细菌猎物谱的聚类分析,两株捕食性慢生单胞菌类群具有相似的猎物种类。依据慢生单胞菌类群广泛的猎物范围,为通过添加猎物细菌来分离培养慢生单胞菌类群中的新物种群体奠定了研究基础。
  3.首次提出“猎物指数”,并根据该指数对弧菌科类群进行了预测。通过对5株猎物型弧菌类群细菌和5株非猎物型弧菌类群细菌的直系同源蛋白进行差异分析,提出了弧菌科类群中的“猎物指数”;通过对117株弧菌科细菌类群进行“猎物指数”预测,发现捕食性慢生单胞菌类群可以掠食多种水产养殖中的病原微生物(副溶血性弧菌与溶藻弧菌等),为深度挖掘捕食性慢生单胞菌类群的经济价值奠定了研究基础。
  4.基于7,025份高通量16S rDNA环境样本数据首次构建的MetaTaxDB数据库,对慢生单胞菌类群的生物地理学分布进行首次分析,研究发现慢生单胞菌类群具有广泛的全球分布性。基于MetaTaxDB数据库,发现慢生单胞菌类群倾向分布于有盐环境与偏碱性环境中,慢生单胞菌类群对特定生境的偏好为进一步分离获得更多该类群中的新物种提供了样品类型的选择依据。本文基于慢生单胞菌类群相对丰度较高的样本环境类型与注释序列的来源类别分析,首次推演了慢生单胞菌类群的演化模型。
[硕士论文] 桑进
微生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:许多嗜盐细菌具有独特的生理特性和代谢机制,并且能产生特殊的活性物质。因此,嗜盐细菌的分离、嗜盐机理及活性物质的研究有着特殊的意义。
  本文从山西运城盐湖不同湖区对盐湖沉积物样品进行采集,通过直接涂布的方法和富集培养并涂布的方法分别在正常培养基和寡营养培养基上对样品中可培养微生物进行了分离。挑取200株细菌菌株,主要分布在变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门四个门,包含29个属58个物种。比较正常培养基与寡营养培养基,直接涂布与寡营养涂布对可培养微生物分离的影响。发现在直接涂布中,寡营养培养基与正常培养基相比,微生物多样性更高,主要种类相似。与寡营养富集涂布相比,直接涂布法具有更高的微生物多样性,两者的种类分布有较大差异。在分离过程中共发现3个潜在新属及13个潜在新物种。
  同时,对原始样品和富集样品进行16S rDNA高通量测序,对样品中细菌的种类和分布及富集过程中微生物多样性的演替进行分析。对三个样品泥样、15天富集、30天富集以及三组相应水样共12组进行16S rDNA高通量测序。结果表明在所有样品中,变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门及放线菌门在门水平都占主要成分。样品1经过富集微生物多样性减少,而样品2、3经过富集微生物多样性增多。经过寡营养富集,厚壁菌门与放线菌门丰度显著增多,而拟杆菌门丰度略有减少,变形菌门变化不大。寡营养富集之后与之前微生物区系有所不同。经过富集之后一些稀有门类丰度有大幅增加。
  对原始样品及富集样品共九个样品进行聚类,原始样品聚类较近,富集样品聚类位置较近。表明寡营养富集对样品多样性的影响较为显著,富集因素是影响多样性聚类的重要因素,且富集过程对Y1和Y3样品影响较大,对Y2样品影响较小。富集过程中独有OTU数目随着富集天数增加先有明显的下降,表明了富集过程对稀有、难培养OTU可培养过程可能起到的作用。
  本文对四株嗜盐细菌进行了多相分类鉴定。
  菌株WDS4A13T分离自山东省威海市文登盐场。好氧,革兰氏阴性杆菌,不产芽孢。WDS4A13T细胞不具有运动性,无鞭毛,橘黄色菌落。最适生长温度为33℃(生长范围20-40℃),最适盐度6%(w/v)NaCl(盐度生长范围4-14%,w/v),最适pH7(pH生长范围6.5-8.5)。唯一呼吸醌型为MK-6,主要脂肪酸(>10%)为iso-C15∶1、iso-C15∶0和C15∶0。极性脂成分为磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、心磷脂和其他一些未知的脂质(磷脂、脂和磷氨基脂)。基因组的G+C含量为35.2mol%。根据16SrDNA序列分析WDS4A13T最相近的是冷弯曲菌属的菌株(92.0-97.3%)。系统发生学分析以及生理生化特征表明,WDS4A13T代表冷弯曲菌属的一个新的菌种,建议命名为喜盐冷弯曲菌,模式菌株为WDS4A13T(=MCCC1H00134T=KCTC52043T)。
  菌株WDS2C27T分离自山东省威海市文登盐场。好氧,革兰氏阴性杆菌,不产芽孢。WDS2C27T细胞不具有运动性,无鞭毛,橘红色菌落。最适生长温度为33℃(生长范围20-50℃),最适盐度6%(w/v)NaCl(盐度生长范围4-14%,w/v),最适pH7(pH生长范围6.5-8.5)。唯一呼吸醌醌型为MK-6,主要脂肪酸(>10%)为iso-C15∶0和anteiso-C15∶0。极性脂主要成分为两种磷脂(PL1、PL2)、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺。基因组的G+C含量为35.6mol%。根据16SrDNA序列分析WDS2C27T最相近的是冷弯曲菌属的菌株(91.1-92.0%)。系统发生学分析以及生理生化特征表明,WDS2C27T代表冷弯曲菌属的一个新的菌种,建议命名为耐盐冷弯曲菌,模式菌株为WDS2C27T(=MCCC1H00133T=KCTC52044T)。
  菌株Y17T分离自山西省运城盐湖。好氧,革兰氏阴性杆菌,不产芽孢。Y17T细胞不具有运动性,无鞭毛,菌落无色半透明。最适生长温度为30℃(生长范围20-40℃),最适盐度8%(w/v)(盐度生长范围4-20%,w/v),最适pH7(pH生长范围6.5-8.5)。根据16SrDNA序列分析Y17T最相近的是冷弯曲菌属的菌株(91.1-92.0%)。系统发生学分析以及生理生化特征表明,Y17T代表嗜纤维菌目的一个新属,建议命名为盐螺旋菌属,模式种为运城盐螺旋菌,模式菌株为Y17T。
  菌株Y22T分离自山西省运城盐湖。好氧,革兰氏阴性杆菌,产芽孢。Y22T细胞不具有运动性,无鞭毛,橘红色菌落。最适生长温度为30℃(生长范围20-40℃),最适盐度10%(w/v)(盐度生长范围4-20%,w/v),最适pH7(pH生长范围6.5-8.5)。根据16SrDNA序列分析Y22T最相近的是支芽孢杆菌属的菌株(91.1-92.0%)。系统发生学分析以及生理生化特征表明,Y22T代表冷弯曲菌属的一个新的菌种,建议命名为喜盐支芽孢杆菌,模式菌株为Y22T。
[硕士论文] 于雯楠
微生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:慢生单胞菌对其他细菌有捕食作用,对于海洋中慢生单胞菌的分布进行分析对微生物群落演替的研究、新药开发、以及渔业发展具有重要意义。本研究通过设计了可与沉积物慢生单胞菌FA350T(Bradymonas sediminis FA350T)特异性结合的探针,通过对其进行特异性验证,结果表明所设计的探针可以与沉积物慢生单胞菌FA350T特异性结合;以文登高岛盐场样品为研究对象,以高通量测序技术与荧光原位杂交技术相结合,探究了不同生活环境中沉积物慢生单胞菌的分布情况。
  研究发现:在九个样品中,同一盐度的样品,OTU数目,多样性丰富度均为下层泥最高,表层泥次之,水样中最低。盐度为60‰、110‰、150‰的样品中OTU数目依次减少,多样性依次降低。
  同一盐度样品群落丰富度由低到高的顺序为:水样、表层泥、下层泥;水样的微生物多样性低,泥样的微生物多样性较高。在九个样品中,表层泥与下层泥群落的丰度由高到低分别是盐度为60‰、110‰、150‰的样品。
  水样中未检测到慢生单胞菌。在表层泥样品中,慢生单胞菌的丰度从高到低依次是盐度为110‰、150‰、60‰的样品;在下层泥样品中,慢生单胞菌的丰度从高到低依次是盐度为150‰、110‰、60‰的样品。从垂直分布来看,盐度为60‰和盐度为150‰的样品中均为下层泥中慢生单胞菌群落丰度最高,而盐度为110‰的样品中,表层泥样品中的慢生单胞菌群落丰度最高。盐度为110‰表层泥样品在所有样品中慢生单胞菌群落丰度最高。可能由于在该环境中的盐度条件、慢生单胞菌生长所需的营养物质物质相对较多、该环境条件下的其他微生物群落组成结构等其他环境因素对慢生单胞菌生长有利,该结果为从盐场样品中分离得到慢生单胞菌提供了依据。
  同时,本论文完成了三株海洋新菌的多相分类:菌株2p52T分离自中国海南陵水县采集的红藻样品。菌株为革兰氏阴性,无运动性。呼吸醌的类型为Q-8。菌株菌株2p52T的主要脂肪酸为C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH、C16∶0、C18∶1ω7c。主要极性脂成分为磷脂乙酰醇胺、磷脂酰甘油。DNA G+C含量为43.2mol%。与其16S rRNA基因序列亲缘关系最接近的菌株是Agaribacter marinus NBRC110023T,相似性为96.5%。根据表型特征与系统发育分类结果,证明菌株2p52T为Agaribacter属的一个新物种,并将它命名为浅黄色嗜琼脂杆菌,拉丁名为Agaribacter flava。
  菌株QM202T分离自中国海南陵水县采集的红藻样品,菌株为革兰氏阴性,绝对好氧菌。主要极性脂为双磷脂酰甘油,磷脂酰甘油。主要脂肪酸为C16∶1ω7cand/or iso-C15∶02-OH,C16∶0,C18∶1ω7c。主要呼吸醌为Q-8。DNA G+C含量为41.31mol%。其16S rRNA基因序列与Marinomonas pontica DSM17793T相似度最高,为96.0%。根据表型特征与系统发育分类结果,证明菌株QM202T为海单胞菌属的一个新物种,并将它命名为噬琼脂海单胞菌,拉丁名为Marinomonas agarovorans。
  菌株XAY1247T分离自威海近海沉积物。菌株为短棒状。菌株XAY1247T主要脂肪酸为C18∶1ω7c、C12∶13-OH;主要呼吸醌为Q-10;主要极性脂为1种未知磷脂、1种未知脂质、双磷脂酰甘油。DNA G+C含量为62.9mol%。根据表型特征与系统发育分类结果,证明菌株XAY1247T为Roseovarius属的一个新物种,并将它命名为短杆状玫瑰变色菌,拉丁名为Roseovarius brevitalea。菌株XAY1247T16SrRNA基因序列相似性值为99.7%。菌株XAY1247T与Roseovarius属中亲缘关系最相近的菌株的16S rRNA基因序列的相似性为96.7%。根据表型特征与系统发育分类结果,证明菌株XAY1247T属于Roseovarius属,并将XAY1247T命名为短杆状玫瑰变色菌,拉丁名为Roseovarius brevitalea。
[硕士论文] 姜金融
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:空气微生物是城市生态系统的重要组分,更是评估环境质量的重要指标之一,它既可以造福人类,亦会危害人类的生活和健康。近年来,随着城市空气环境恶化以及雾霾事件的不断发生,对城市空气微生物的研究越来越受到重视。研究兰州市空气微生物浓度分布特征及多样性以期为准确了解兰州市空气微生物群落与生态功能奠定基础,为空气微生物对居民健康、空气环境质量影响评价提供科学依据。
  本研究以兰州市不同功能区,即风景区(Scenic Area, SA)、交通干线(Main TrafficLine,MTL)、公共服务区(Public Service Area,PSA)、文教区(Culture and Education Area,CEA)空气微生物样品为研究材料,采用恢复培养手段和Biolog方法研究空气中微生物浓度、粒径时空分布特征和空气微生物群落碳代谢功能多样性,阐明空气微生物浓度及群落功能多样性与环境因子的相关性,利用分子生物学技术对兰州市春季可吸入肺空气细菌粒子进行群落组成和致病性分析,得到以下主要结果:
  (1)兰州市空气中微生物总浓度、细菌、真菌浓度具有明显的空间、季节和日变化规律,空气微生物浓度变化与环境因子之间具有较好的相关性。兰州市空气微生物总浓度范围为196~3752 CFU/m3,空气细菌浓度范围为83~3344 CFU/m3,空气真菌浓度范围为102~1315 CFU/m3,从均值看,兰州市空气细菌浓度为916 CFU/m3,空气真菌浓度为322 CFU/m3,空气中细菌所占比例较大,为66.5%;四个功能区空气微生物总浓度和细菌浓度大小排列一致:MTL>PSA> CEA> SA,空气真菌浓度大小排列依次为:SA>PSA>CEA>MTL。对兰州市各功能区空气微生物污染状况进行评估,结果显示,MTL、PSA空气细菌为较清洁等级,其他功能区空气微生物总浓度及空气真菌均为清洁等级;空气微生物浓度在春、夏季较高,秋、冬季较低,其中,空气细菌浓度均在秋季达到最低值。由于雾霾天气原因,进入冬季后细菌浓度有所升高,不同功能区空气真菌浓度季节变化差异不大;SA空气微生物浓度均表现为13:00时较高,9:00和17:00较低,MTL、PSA空气总微生物浓度和细菌浓度变化特征为:9:00>17:00>13:00,而真菌浓度变化特征为:13:00>9:00>17:00,CEA空气微生物浓度变化特征为:9:00>17:00>13:00;兰州市空气微生物总浓度、细菌浓度与温度呈显著正相关,与风速、湿度呈负相关,空气真菌浓度与温度、湿度、风速相关性较弱。
  (2)兰州市空气微生物粒径呈现明显的时空分布特征。细菌粒子主要分布在一到三级(>3.3μm),呈偏态分布,而空气真菌粒径呈正态分布,粒径范围在2.1μm~7.0μm的粒子居多;在四个功能区空气中,可吸入肺细菌粒子占23.1%~28.9%,可吸入肺真菌粒子占33.7%~40.7%;一年四季中,可吸入肺细菌粒子浓度在秋冬季较高,可吸入肺真菌粒子浓度在春秋季较高;在一天不同时段,可吸入肺细菌粒子浓度在9:00和13:00时较高,而真菌粒子浓度在9:00和17:00时较高;兰州市空气细菌中值直径约为3.68μm,空气真菌中值直径约为3.15μm,空气细菌中值直径大于空气真菌的中值直径;空气细菌在不同季节中值直径变化范围为3.06μm~4.11μm,在春夏两季中值直径较大,空气真菌中值直径季节变化范围为2.74μm~3.59μm,在夏季中值直径较大;空气细菌中值直径在9:00时段较大,而空气真菌中值直径在17:00时段较大。
  (3)各季节四个功能区空气微生物的碳源利用强度存在显著差异,在春季和秋季,SA和PSA空气微生物碳源代谢强度高于其他两个功能区,夏季SA空气微生物碳代谢强度最高,冬季CEA、PSA、SA空气微生物碳代谢强度较高;各季节不同功能区空气微生物Shannon指数和Simpson指数差异性不大,表明四个功能区空气中微生物群落丰富度和优势度相似,而McIntosh指数差异较大,表明不同功能区空气微生物群落均一度受不同环境地域、气象条件的影响较大;各季节空气微生物群落碳代谢功能呈现区域性差异,且导致这种差异的主要碳源分异类型不同,氨基酸类是导致春秋两季兰州市空气微生物群落碳代谢功能区域性差异的主要分异类型,导致夏季不同功能区空气微生物碳代谢功能差异的主要分异类型是糖类,冬季主要分异类型是醇类。四个功能区不同季节空气微生物碳代谢强度亦存在差异,SA空气微生物碳代谢能力在春、夏季较高,MTL和PSA空气微生物群落碳代谢能力在秋冬季较高,CEA空气微生物碳代谢能力在冬季较高,夏季与秋季差异不大;各功能区不同季节空气微生物Shannon指数和Simpson指数差异性不大,说明同一功能区空气中微生物群落丰富度和优势度随着季节变化不会发生太大的改变,而McIntosh指数季节差异较大,说明同一功能区空气微生物群落均一度受季节环境变化的胁迫以及气象因子的影响较大;四个功能区空气微生物群落碳代谢功能呈现季节性差异,糖类是导致SA和PSA空气微生物群落碳代谢功能季节性差异的主要分异类型,导致MTL和PSA空气微生物碳代谢功能季节差异的主要分异类型是氨基酸类。
  (4)兰州市不同功能区可吸入肺空气细菌群落组成存在差异,共检测出48属,分布在六大门类,分别为Actinobacteria、Cyanobacteria、Deinococcus Thermus、Firmicutes、Proteobacteria、Saccharibacteria;CEA和SA细菌群落相似性较高,MTL、PSA进化过程较独立,具有较大的差异性;可吸入肺带菌粒子粒径小于3.3μm,在空气中停留时间越长,传播距离更远,其导致疾病传播以及人体感染的风险也就越大,兰州市可吸入肺空气细菌中检测到9种致病菌或条件致病菌,致病菌的分布也存在空间差异,且人群密集的功能区检出率更高。
[硕士论文] 李旦旦
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本论文以分离自南海和北极海域表层海水样品的四株细菌作为研究对象,利用多相分类方法,详细研究了这四株细菌的表型,细胞化学组成及分子遗传学等方面的分类特征,最终基于分类特征分析分别确定了它们的分类地位。
  1.菌株SM1501T的多相分类研究
  菌株SM1501T分离自南海表层海水样品。菌株SM1501T的革兰氏染色反应为阴性,其细胞为短杆状,无鞭毛,好氧。该菌株生长的温度范围为7-42℃,生长的NaC1浓度范围是0-11%(w/v)。菌株SM1501T的主要脂肪酸是C17∶1ω6c,C15∶02-OH,C17∶1ω8c和C18∶1ω7c。该菌的极性脂包括磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),鞘糖脂(sphingoglycolipid,SGL),双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG)及磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)。该菌的主要细胞呼吸醌是泛醌10(ubiquinone-10,Q-10)。菌株SM1501T的细胞基因组DNA G+C含量为66.8mol%。
  菌株SM1501T与Erythrobacter属成员的16S rRNA基因序列相似性最高(94.2-97.4%),基于16S rRNA基因序列的系统进化树显示菌株SM1501T与Erythrobacter luteus,Erythrobacter atlanticus,Erythrobacter gangjinensis及Erythrobacter marinus成簇,但形成一个独立的进化分支。
  基于以上多相分类学数据,菌株SM1501T代表Erythrobacter属的一个新种,命名为Erythrobacter nanhaiensis sp.nov.,菌株SM1501T(=KCTC42669T=CCTCC AB2015396T)为该新种的模式菌株。
  2.菌株SM1502T的多相分类研究
  菌株SM1502T来源于北极海域表层海水样品。菌株SM1502T革兰氏阴性菌,细胞为杆状,无鞭毛。菌株SM1502T生长的温度范围为10-40℃C,生长的NaCl浓度范围为0-8.0%(w/v)。
  菌株SM1502T的主要脂肪酸为iso-C15∶0,iso-C17∶1ω9c,iso-C17∶03-OH,iso-C15∶1G,C15∶0及unknown ECL13.565;其主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE),一种未鉴定结构的氨基磷脂及一种未鉴定结构的极性脂类。菌株SM1502T的主要呼吸醌类为甲基萘醌6(menaquinone6,MK-6)。菌株SM1502T基因组DNA的G+C含量为37.0 mol%。
  菌株SM1502T与Flavobacterium suzhouense的16S rRNA基因序列相似性最高(96.0%);在基于16S rRNA基因序列的系统进化树中,菌株SM1502T和Flavobacterium属内包括Flavobacterium suzhouense在内的六个已知种成簇,同时形成单独的簇内分支。
  以上多相分类数据表明,菌株SM1502T代表Flavobacterium属内的一个新种,命名为Flavobacterium arcticum sp.nov.,菌株SM1502T(=KCTC42668T=CCTCC AB2015346T)为该种的模式菌株。
  3.菌株SM1503T的多相分类研究
  菌株SM1503T分离自南海表层海水样品,为革兰氏阴性菌,其触酶及氧化酶为阳性。菌株SM1503T生长温度范围在8-45℃之间,生长的NaCl浓度范围是0-7.5%(w/v)。菌株SM1503T可以还原硝酸盐为亚硝酸盐,可水解Tween20、40及60。
  菌株SM1503T的主要脂肪酸包含C17:1ω6c,C17∶0,C15∶0,C18∶1ω7c,C17∶1ω8c以及C16∶0;主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG),鞘糖脂(sphingoglycolipid, SGL)和磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)。该菌主要呼吸醌为泛醌10(ubiquinone-10,Q-10),其基因组DNA的G+C含量为61.6 mol%。
  16S rRNA基因序列比对分析表明菌株SM1503T与Sphingomonadaceae科内Blastomonas及Parablastomonas属已知种有最高的序列相似性(95.2-95.8%),根据16S rRNA基因序列构建的系统进化树显示菌株SM1503T在Blastomona及Parablastomonas进化分支的根部形成一个独立的进化分枝。
  上述多相分类数据表明,菌株SM1503T应属于Sphingomonadaceae科内的一个新属,命名为Pseudoblastomonas gen.nov.,而菌株SM1503T代表该属内的一个新种,命名为Pseudoblastomonas maris gen.nov.,sp.nov.,菌株SM1503T(=KCTC42715T=CCTCC AB2015347T)是该新种的模式菌株。
  4.菌株SM1504T的多相分类研究
  菌株SM1504T来源于北极海域表层海水样品。菌株SM1504T革兰氏阴性菌,严格好氧,无运动性。菌株SM1504T生长的温度范围为4-30℃,生长的NaCl浓度范围为0-4.0%(w/v)。菌株SM1504T可水解七叶苷和明胶,但不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
  菌株SM1504T的主要脂肪酸为summed feature3(包含C16∶1ω7c和/或iso-C15∶02-OH)和iso-C15∶0;菌株SM1504T的极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)和一种未鉴定的极性脂类。菌株SM1504T的主要呼吸醌类为甲基萘醌7(menaquinone7,MK-7)。菌株SM1504T基因组DNA G+C含量为40.8 mol%。
  基于16S rRNA基因序列的系统进化树显示菌株SM1504T在Cytophagaceae科内与Lacihabitans,Emticicia,Fluviimonas及Leadbetterella属成员紧密成簇,但形成独立的簇内分枝,而该菌株与这些属成员的16S rRNA基因序列相似性非常低(88.9-91.6%)。
  基于上述多相分类数据分析,菌株SM1504T应隶属于Cytophagaceae科内的一个新属,命名为Arcticibacterium gen.nov.,而菌株SM1504T代表该新属内的一个新种,命名为Arcticibacterium luteifluviistationis gen.nov.,sp.nov.,菌株SM1504T(=KCTC42716T=CCTCC AB2015348T)为该种的模式菌株。
[硕士论文] 任豫霜
微生物学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:自2003年三峡水库正式蓄水以来,由于库区内水位抬升引起水体流速减缓,支流回水区由于水体滞留时间的延长和营养因子的蓄积,水华爆发情况尤其严重。水华爆发的主要原因是水体中营养过剩,而水体营养主要有2个来源:包括河岸陆地等外源和水体内源。有关三峡库区陆地面源和点源污染与库区支流水华关系的研究已有不少,但有关支流底泥等内源沉积物对水华贡献的研究较为少见。沉积物作为水体内源营养物质的来源,对水体富营养化现象的维持起着至关重要的作用,而微生物作为物质循环和能量流动的重要组成部分,在水-沉积物间物质循环的过程中发挥着重要作用,影响着藻类植物的生长和水华的形成。本研究以三峡水库北岸最大一级支流澎溪河的回水区—高阳平湖为对象,于2016年1月至2017年1月进行了野外长期定点监测,分析了回水区藻类植物群落结构的季节变化特征,水华不同时期上覆水-沉积物间理化性质、沉积物中微生物群落结构及生物酶活性变化,探讨沉积物中微生物种群与内源营养物质循环及水华爆发的关系,为三峡库区支流回水区水华的防控、治理提供一定理论依据。研究具体结果如下:
  (1)于2016年3月~2017年1月对澎溪河回水区水体浮游植物群落组成及演替规律进行研究。结果显示,四季水体样品中共检出藻类植物7门117种(包括变种),藻类群落组成季节差异明显。春季水华爆发时期仅藻类检出5门32种,主要优势藻为蓝藻门小型色球藻(Chroococcus minor)、尖细颤藻(Oscillatoria acuminata)、湖泊鞘丝藻(Lyngbya limnelica)、绿藻门小球藻(Chlorella vulgaris),此时藻类群落结构单一。随季节交替,秋季藻类增加至7门82种,优势藻逐渐演替为硅藻门针杆藻(Synedra sp.)、隐藻门尖尾蓝隐藻(Chroomonas acuta)。
  (2)监测期间,澎溪河回水区4个采样断面藻类生物量与叶绿素a(Chla)含量的季节变化同步,与藻类细胞密度季节变化趋势稍有差异。蓝藻、隐藻和硅藻是该回水区的主要藻类,其中硅藻主要出现在秋、冬季,绿藻在各个断面均有检出,但细胞密度占比不大,蓝藻、隐藻种类数少于绿藻但细胞密度水平较高,峰值分别为48.89×106 cell/L、1.61×106 cell/L,属于澎溪河回水区的优势藻种。研究期间藻类集群演替情况大致为:蓝藻、甲藻→绿藻→隐藻、硅藻。
  (3)2016年1月~2016年7月,对澎溪河回水区水华不同时期上覆水(水面下0.5 m)、沉积物环境因子的变化进行跟踪监测。结果显示:上覆水pH随水华发生显著升高(P<0.05),溶解氧含量在水华前及水华初期显著上升,总氮(TN)、总磷(TP)、溶解性总氮(DTN)、溶解性总磷(DTP)、硝态氮(NO3--N)、正磷酸盐(PO43--P)含量在水华前期显著上升,并随水华持续发生明显下降,溶解性磷是上覆水中磷元素主要存在形式,约占51.9%~74.4%;硝化作用是上覆水硝态氮的来源之一。沉积物中总氮、总磷和硝态氮含量在3月水华形成期明显下降,但随水华持续发生显著升高;其含量分别是上覆水对应营养因子的401.9~515.8、5062.5~5675.7和58.5~89.2倍,体现出沉积物作为水体内源磷库的重要作用,沉积物中内源营养在水华发生前释放进入水体,是上覆水氮、磷营养的主要来源。
  (4)在水华发生不同时期,水体富营养化限制因子仍为磷元素。沉积物磷主要以无机磷形式存在,其含量为0.40~0.54 g/kg,占沉积物总磷的66.7%~95.2%。各形态磷含量变化:铁铝结合态磷(NaOH-P)>钙结合态磷(HCl-P)>氧化还原形磷(BD-P)>松散结合态磷(NH4Cl-P),无机磷组成以铁铝结合态磷(NaOH-P)为主。水华发生前沉积物HCl-P、NaOH-P含量明显下降(分别降低28.5%、5.6%),随水华的持续发生,其含量稳定上升,BD-P含量在3~5月持续下降。沉积物TP、NaOH-P、NH4Cl-P与上覆水营养因子呈极显著正相关关系(P<0.01),对水-沉积物界面间物质循环及水体富营养化的维持起到重要作用。
  (5)与1月样品相比,沉积物中微生物磷脂脂肪酸(PLFAs)含量在水华形成期及水华发生初期明显升高(分别为76.0%、151.8%),随水华现象的持续明显降低至6月水华消逝期缓慢回升,较5月上升了14.1%。此外,随水华发生,沉积物中个别种类细菌丰度明显上升占据优势,导致沉积物细菌类群组成与相对比例发生明显改变,细菌群落多样性和均匀度明显下降,相比1月,5月水华持续期多样性及均匀度指数分别下降49.6%、24.0%。沉积物中碱性磷酸酶(APA)活性在水华发生前显著提高(P<0.05),随水华持续爆发其活性受到抑制。
  (6)冗余分析(RDA)的结果表明,水华爆发前期,澎溪河回水区主要为蓝-绿藻型水体,此后水体有向绿-硅藻转化的趋势;沉积物中微生物PLFAs与TP相关性较大,沉积物中APA、PLFAs和TP的含量是澎溪河回水区水华发生的主导因子。此外,NH4Cl-P、BD-P分别在水华形成初期和水华消逝后对藻类生长有较大影响。
[硕士论文] 冯帅
生物学 西南科技大学 2017(学位年度)
摘要:氮循环与农业生产和生态环境息息相关。人类通过施加氮肥来增加作物产量,但与此同时,氮肥流失破坏了氮原有的平衡,进而导致全球性的环境问题。植物根际是土壤介质、植物和微生物交互作用的微界面,也是物质和能量交换的区域。大量研究表明接种联合固氮菌能促进玉米的产量,但是接种效率和稳定性容易受到环境因素的影响;同时接种对土壤及根际微生物群落影响的研究报道甚少,其中的微生物机理和生态效应也存在疑问。本研究将固氮施氏假单胞菌A1501和玉米作为模式对象,考察该菌在根部的定殖效率,利用15N同位素稀释法定量生物固氮对玉米氮素的贡献。同时考察不同水分条件下接种固氮施氏假单胞菌 A1501对玉米的促生效应及根际氮循环功能微生物群落及活性的影响,为深入了解联合固氮菌和宿主植物间的相互作用,提高微生物的固氮效率及减少农业生产的氮肥用量提供理论依据。主要研究结果如下:
  一、分别在营养液和土壤培养条件下,通过平板计数和扫描电镜方法观察固氮施氏假单胞菌A1501在玉米根系的定殖情况。结果表明,固氮施氏假单胞菌A1501能够在玉米根系定殖。
  二、盆栽试验结果表明,无菌土壤介质中种植的玉米生长量受到水分条件和固氮菌接种的显著影响。接种固氮施氏假单胞菌A1501后第60天的玉米植株生长量在干旱条件和水分充足时分别提高22.7%和32.5%。未灭菌的自然土壤介质种植的玉米生长量也受到水分条件的显著影响;固氮菌接种提高了玉米生长量,但是结果不显著。15N同位素稀释法测定结果表明水分条件显著影响了固氮施氏假单胞菌A1501的固氮贡献量,水分充足条件下固氮贡献率为31.6%,而干旱条件下为20.1%。因此本实验条件下接种固氮施氏假单胞菌A1501可以为玉米提供生长所需的部分氮素。
  三、采用绝对定量qPCR和高通量测序技术,分析不同水分条件和固氮施氏假单胞菌A1501接种对玉米不同土壤区域(根际土和表层土)氮循环功能微生物种群数量、转录活性及群落结构的影响。结果表明水分条件措施显著影响了根际土固氮菌nifH基因、氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因数量和转录活性,但对表层土和根际土的微生物群落结构没有显著影响。固氮施氏假单胞菌A1501接种显著影响了玉米根际固氮菌nifH基因、氨氧化细菌和古菌amoA基因拷贝数和转录数,同时对根际土中细菌和固氮菌群落结构产生显著影响。不同土壤区域的细菌和固氮菌群落多样性也表现出差异,固氮菌更多地存在于根际土中,而氨氧化细菌和氨氧化古菌在表层土中数量更高,表明不同土壤区域(生态位)是影响土壤微生物及氮循环关键功能微生物最主要的因素,这很可能是土壤特性如有机碳和氮含量差异造成的。
  本论文阐释了固氮施氏假单胞菌A1501和玉米的联合固氮作用,表明固氮施氏假单胞菌A1501能够在玉米根际定殖并通过固氮作用对植株贡献氮;同时接种固氮菌对微生物群落的影响显著小于土壤生态位的影响。
[硕士论文] 谢月
微生物学 哈尔滨工业大学 2017(学位年度)
摘要:氨氧化过程作为硝化过程的首要步骤也是关键性的限速步骤,由氨氧化古菌(Ammonia-Oxidizing Archaea,AOA)和氨氧化细菌(Ammonia-Oxidizing Bacteria, AOB)所共同参与完成。AOA的发现完善了过去人们认为氨氧化过程仅由AOB所独立完成的认识。东北黑土区作为世界上仅有的三大黑土区,湿地类型丰富,湿地作为水生生态系统和陆地生态系统之间的重要过渡区域,具有很强的边缘效应特征,有着重要的研究价值,探究两种同功微生物在不同生境中的种群分布特征具有重要的生态学意义。本文以典型的东北寒温带沼泽湿地—酸性土壤的三江湿地和弱碱性土壤的扎龙湿地为研究对象,利用理化分析与分子生物学手段相结合的方法,探究了在两种典型湿地中AOA和AOB的活性、丰度、种群的结构以及环境因子对其的影响,旨在为揭示复杂湿地环境中氨氧化微生物种群的分布特点及其所发挥的生态学功能的研究提供一定的理论基础。
  在本研究中,表层植被的差异并不会影响到土壤中氨氧化微生物的潜在氨氧化活性以及氨氧化微生物的丰度,但AOB在苔草植被覆盖的土壤中发挥着重要作用。土壤的 pH值能显著的影响 AOA的潜在氨氧化活性(Potential Ammonia Oxidation rate,PAO)(p<0.01);在两湿地中AOA的丰度与PAO(AOA+AOB)呈现显著正相关(p<0.05),而与PAO(AOA)不存在相关性,表明功能基因的丰度高低并不能代表功能的强弱。
  在本研究中,不同性质的湿地土壤中AOA和AOB的种群差异明显,弱碱性湿地的AOA种群的丰富度和多样性要显著高于酸性湿地,而AOB在两湿地中未见显著差异。
  在调查样地中,两湿地中 AOA以 Nitrososphaera cluster为主,AOB为Nitrosomonadales(亚硝化单胞菌目)为优势菌群。
  Nitrososphaera subcluster1在三江湿地生长季(2016.07.25)与非生长季(2016.10.24)两个取样时间中大量存在,占比分别为99.78%和90.11%,表明其偏好酸性环境,而 Nitrososphaera subcluster1.2在两取样时间中均只出现在扎龙湿地的AOA中表明其偏好弱碱性环境。在由生长季变为非生长季时,两湿地中氨氧化微生物种群的丰富度和多样性均降低。扎龙湿地AOA中偏好贫营养环境的Nitrosospumilus cluster在非生长季由于样地NH4+浓度上升导致其占比从14.27%下降至4.12%,三江湿地中嗜酸性的Nitrosotalea cluster因非生长季土壤pH上升适宜生长占比从0.002%提升至9.44%。对AOB而言,扎龙湿地中Proteobacteria(变形菌门)在非生长季占比由31.36%上升93.16%占据了优势地位,而三江湿地在门水平上生长季与非生长季种群组成变化很小。在属水平上,由生长季到非生长季,Nitrosospira(亚硝化螺菌属)在扎龙湿地的占比由29.51%上涨至89.36%,而在三江湿地Nitrosospira占比由34.71%下降至16.77%。 Nitrosovibrio为三江湿地生长季所特有的属。
  以上结果为揭示不同湿地生态系统中氨氧化微生物种群的分布特征及其所行使的生态学功能提供一定的理论基础。
[硕士论文] 郭秋平
自然地理学 江西师范大学 2017(学位年度)
摘要:鄱阳湖是我国的第一大淡水湖,对调节长江中下游水位,维持生态平衡起着重要的作用。近年来,随着江西省经济建设的加快和城市化水平的不断发展,鄱阳湖的污染状况也日渐加剧。微生物作为水环境中的重要组成部分,既受到水质因子的影响,同时也对湖泊水质有着反作用。本研究通过研究2016年鄱阳湖河湖交错带丰水期表层水体的水质理化指标、微生物多样性指数和细菌群落组成结构,得出主要研究结论如下:
  (1)鄱阳湖河湖交错带丰水期表层水体水质污染情况严重,其中总氮含量和总磷含量均超标严重。从氮磷比数据来看,影响鄱阳湖河湖交错带丰水期表层水体富营养化的主要限制性因素是磷限制。同时鄱阳湖河湖交错带丰水期表层水体各项污染物指标在空间上存在着显著的空间分布差异:其中,饶河、赣江和瑶湖的电导率水平明显高于其他区域;而在赣江、饶河和南矶山等区域总氮含量要高于其他区域;总磷含量较高的区域为瑶湖、湖口过江水道和南矶大桥段。
  (2)人类活动对鄱阳湖河湖交错带表丰水期表层水体水质的影响非常明显,总氮含量和总磷含量较高的区域都是人类农业生产和航运较为频繁的区域。然而,就人类活动对污染物的贡献率来看,人类活动对总磷的贡献率要大于对总氮的贡献率。饶河和赣江上游都是我国较为重要的有色金属开采基地,导致饶河和赣江水质中电导率指数较高;而修水上游由于工业基础较为薄弱,生态系统较为完整,使得修水成为了鄱阳湖水质较好的区域。
  (3)通过对本研究所采集的11个样本中微生物多样性和丰富度指数进行分析,发现所有样本中,湖口过江水道、吴城赣江入湖口和大湖池等区域的ACE
  指数相对较高,而南矶大桥段和赣江与修水交汇口的ACE指数相对较低。就微生物多样性指数而言,湖口过江水道的微生物多样性指数最高,达到5.44,而南矶山碟形湖的微生物多样性指数最低,仅有3.9。
  (4)对本研究所采集的11个样本进行高通量测序得到333794条有效碱基序列,对所获得的有效碱基序列进行OUT分类共得到1193个OUT。通过对细菌群落结构分析,发现所采样本中所有细菌分属于34个门、414个属和678个种。其中在门水平上的主要优势细菌群落为(Proteobacteria)拟杆菌门
  (Baceroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、和蓝藻门(Cyanobacteria);在属水平上的优势细菌群落为hgcI_clade、CL500-29_marine_group、
  Rheinheimera、Sporichthyaceae_unclassified和Flavobacterium;在种水平上的优势细菌群落为hgcI_clade_unclassified(12.3%)、hgcI_clade_uncultured_bacterium(8.6%)、
  CL500-29_marine_group_unclassified(6.1%)、Sporichthyaceae_unclassified(4%)和Rheinheimera_uncultured_gamma_proteobacterium(3.6%)。
  (5)对所测得出的细菌群落结构进行单因素分析和相似性聚落分析发现,
  不同采样点之间的细菌群落在门水平、属水平和种水平上都存在着显著的差异性。说明不同的污染物因子和不同的污染程度对微生物群落结构有着重要的影响。
[硕士论文] 刘文君
化学工程 山东科技大学 2017(学位年度)
摘要:为了筛选高效固氮菌并探讨菌-藻共处条件下的固氮机理,本实验从生长在黄河三角洲盐碱地的野生大豆根瘤菌内分离、筛选出一株高效自生固氮菌,命名为SKDGD-10。首先,通过在无氮固体培养基中生长计数,初步确定其具有固氮能力。进一步测定菌株SKDGD-10的固氮能力,结果发现在无氮液体培养基中的氨氮、亚硝态氮和硝态氮的量分别为0.5404ug/mL、0.00568ug/mL和0.703ug/mL,总固氮量达到1.25 ug/mL。通过土壤固氮实验,发现菌株SKDGD-10能将土壤的全氮量由0.05%提高到0.12%(总氮/土壤:m/m)。以34F和491R作为引物,对菌株SKDGD-10的nifH基因进行PCR扩增,扩增出460bp左右的特异性目标条带,从分子水平上证明了菌株SKDGD-10具有固氮基因。通过菌落性状、生理生化性状、扫描电子显微镜、16S rDNA和系统分类学位置等分析,初步确定筛选出的菌株SKDGD-10属于肠杆菌属。
  菌-藻共处固氮机理的研究通过设计三种处理方式完成:处理1,菌株SKDGD-10单独培养;处理2,菌株SKDGD-10和蛋白核小球藻A共培养;处理3,蛋白核小球藻A单独培养。通过测定三种处理方式初始和结束时总氮的含量,结果表明:处理2中菌株的固氮量是处理1的1.52倍,证明了菌-藻共培养提高了菌株SKDGD-10的固氮能力。为了进一步分析菌-藻共处对固氮影响的机理,本研究从菌-藻数量、叶绿素含量、溶解氧、反应体系中pH、以及代谢产物五个方面进行了分析:通过相差显微镜观察三种处理方式中菌株SKDGD-10和蛋白核小球藻A的数量,发现处理2中菌株SKDGD-10的数量多于处理1,处理2中蛋白核小球藻A的数量多于处理3,证明了菌-藻共培养促进了菌株SKDGD-10和蛋白核小球藻A的生长;通过测定处理2和处理3中叶绿素的含量,发现培养84h时处理2中叶绿素的含量达到12.9mg/L,处理3中叶绿素含量只有3.3mg/L,证明了菌-藻共培养促进了蛋白核小球藻 A的生长;通过便携式溶氧仪测定溶解氧,处理1中的溶解氧持续下降至0.2mg/L,达到厌氧状态,处理3内的溶解氧持续上升至20mg/L,体系2内溶解氧持续维持在0.5mg/L左右的低氧状态,证明了菌-藻共培养为菌株 SKDGD-10提供了固氮最适的低氧环境;通过测定反应体系中 pH值,处理1中的pH持续下降至7.2,处理3中的pH持续上升至10.85,处理2中的pH上升并维持在9.2左右,证明了菌-藻共培养满足了菌株最适生长pH为9.0左右的条件;通过高效液相色谱仪(HPLC)测定三种处理方式中的甲酸、乙酸含量,三种处理方式中均没有检测到甲酸,处理1中检测到乙酸,处理2和处理3中均没有检测到乙酸,证明了乙酸作为一种碳源物质被菌株SKDGD-10利用。综上,本研究证明了菌-藻共处提高了菌对氮气的固定能力。
[硕士论文] 伍朝亚
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:黄渤海域是中国的陆源浅海,其海底沉积物中蕴藏着丰富的微生物资源,在海洋生态系统氮循环中扮演着重要的角色。本研究采用传统平板培养法和现代分子生物学方法分别对渤海和北黄海海底沉积物中产胞外蛋白酶、脂肪酶细菌多样性进行分析,揭示渤海和北黄海沉积物中可培养产胞外蛋白酶、脂肪酶细菌的多样性,增加人们对黄渤海域生态系统中产胞外酶细菌多样性的认识,为挖掘海洋产蛋白酶、脂肪酶微生物提供菌群资源。
  采用酪蛋白明胶培养基,从北黄海5个海底沉积物样品中分离到66株蛋白酶的细菌菌株,通过16S rRNA基因系统进化分析表明,这66株菌隶属于4个不同门的7个属,包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)四个门的7个属,其中Pseudoalteromonas(69.9%)、Sulfitobacter(12.1%)和Salegentibacter(10.6%)是优势属。沉积物样品中的可培养的产蛋白酶细菌达到104 CFU/g的丰度。分别测定胞外蛋白酶活性并对选定菌株进行基于苯甲基磺酰氟(PMSF,丝氨酸蛋白酶抑制剂)、邻菲罗啉(o-phenanthroline,O-P,金属蛋白酶抑制剂)、E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)和pepstatinA(天冬氨酸蛋白酶抑制剂)四种抑制剂的酶活抑制实验以及所有菌株对三种底物(酪蛋白、明胶、弹性蛋白)的水解能力分析这些细菌所产胞外蛋白酶的特性及多样性,实验结果显示有39株菌能够产生足够量的酶用于蛋白酶抑制剂实验。抑制剂实验表明39株测定菌株产生的胞外蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶,仅有少数菌株所产蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶活性。对所有菌株进行三种底物的水解实验表明,所有菌株能降解酪蛋白和/或明胶,Pseudoalteromonas和Salegentibacter菌株具有水解弹性蛋白的能力,Salegentibacter菌株对三种底物具有更强的蛋白水解能力。
  用同样的方法,从渤海菜州湾7个沉积物样品中筛选到121株产蛋白酶细菌,它们隶属于Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria和Bacteroidetes四个门的17个属,Bacillus、Pseudoalteromonas和Photobacterium是优势属。蛋白酶抑制剂实验表明,有62株菌能够产生足够量的酶用于蛋白酶抑制剂实验且均被PMSF抑制,抑制率为19.36%~100%,27株菌的蛋白酶酶活被OP抑制,抑制率为21.12%~66.37%,E-64对7株菌的蛋白酶酶活有抑制作用,抑制率为12.14%~65.11%, Pepstatin A对7株菌的蛋白酶酶活有抑制作用,抑制率为12.91%~34.5%,测定菌株所产胞外蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶。通过对所有菌株进行三种底物的水解实验表明,Bacillus属的菌株对酪蛋白、明胶和弹性蛋白表现出较高的水解能力。
  采用吐温80培养基和三丁酸甘油酯筛选平板,从8个渤海沉积物样品中分离获得51株产脂肪酶细菌,通过对这51株菌的16S rRNA基因系统进化分析表明,这些菌株隶属于Bacteroidetes、Proteobacteria和Firmicutes三个门的8个属,其中Pseudoalteromonas(35.2%)、Marinobacter(23.5%)和Sulfitobacter(17.6%)是优势菌群。以对硝基苯酚棕榈酸酯(PNPP)为底物,利用对硝基苯酚法测定所有菌株胞外脂肪酶活性,结果显示所有测定菌株都能够分泌脂肪酶,菌株70623分泌的脂肪酶酶活最高,为42.4 U/mL。
  综上所述,渤海和北黄海海域沉积物中可培养产蛋白酶、脂肪酶细菌类群较为丰富,菌株所产的蛋白酶种类主要是是丝氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶,获得了一株高效产脂肪酶菌株Marinobacter sp.70623,具有有良好的开发应用价值。
[硕士论文] 闵西田
微生物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:群体感应(Quorum sensing,QS)是微生物中广泛保守存在的一种细胞与细胞间的通信机制,协调细菌各种群体活动,参与调控细菌的致病性。研究群体感应机制对控制和预防细菌感染至关重要。绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),属假单胞菌属(Pseudomonas),采用由las、pqs及rhl调控系统组成的群体感应网络协调其毒力基因表达。其中las系统位于级联反应的顶端。不少临床分离株均发现中央las系统功能突变受损,张炼辉带领的团队于2013年首次发现绿脓杆菌中一种取代las的机制,并分离鉴定到一种新群体感应信号IQS,上连中央las系统和磷酸胁迫应激反应机制,下接pqs及rhl系统。阻断IQS合成导致pqs及rhl系统的群体感应并显著降低菌株毒力。IQS产生受las严格控制但同时也被磷酸贫乏状况激活,磷酸贫乏是细菌感染过程中的常见胁迫信号。低磷酸盐离子浓度条件下的绿脓杆菌,利用IQS系统,在低磷响应的转录激活因子PhoB的调控下,越过las系统,激活rhl以及pqs系统,表现生物毒性。
  本课题使用分子微生物学、基因组学、生物化学和分析化学的研究手段作为主要研究方法来研究IQS的生物合成途径。根据文献报道,四个在同一操纵子的基因(ambB、ambC、ambD和ambE)参与了IQS的生物合成。我们通过高效液相色谱HPLC和液质联用LC-MS的方法分析检测△amb突变体菌株,导入amb合成基因簇的大肠杆菌ambBCDE-DH5a的菌株和野生型PAO1菌株的中IQS相关信号的变化情况,发现amb基因突变不会导致IQS产量变化,且异源表达菌株未检测到IQS的峰(m/z205),而是检测到抗代谢物AMB(m/z131.06)的峰。结合生物信息学提供的NRPS合成基因预测,发现一组pch功能基因簇。早期的研究发现,pch基因簇参与了铁载体Pyochelin的生物合成。通过构建pchA、B、C、D、E、F和G的突变体,分别检测了突变体中IQS的产生情况。发现pch的突变体中,均检测不到IQS的产生;而在pchE(△pchE)互补体能恢复IQS产生。初步证明amb不是直接参与IQS的生物合成,而pch基因则参与合成IQS。IQS分子的的合成底物为1分子水杨酸(Sal)和1分子半胱氨酸(Cys),我们进行底物添加实验。向△pchA,△pchD,△pchE培养液中添加底物水杨酸,结合高效液相色谱分析明确相关重要基因的功能,初步阐明了IQS生物合成途径,证实IQS的前体为铁载体Pyochelin生物合成途径的中间产物。
  为阐明绿脓杆菌群体感应机理和致病调控机制奠定了基础。
[博士论文] 王鹏
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:二甲基巯基丙酸内盐(Dimethylsul foniopropionate,DMSP)是全球硫循环和碳循环的重要载体物质。海洋浮游植物、大型藻类和临海被子植物是DMSP的主要生产者。每年DMSP的产量可以达到109吨。在大洋表面的某些区域,DMSP的产量可以达到碳固定总量的10%。微生物介导的DMSP的分解代谢是全球硫循环和碳循环的重要步骤。海洋玫瑰杆菌类群细菌(Marine Roseobacter Clade,MRC)是分解代谢DMSP的主要微生物类群之一。微生物利用胞内DMSP裂解酶裂解DMSP产生二甲基硫(Dimethyl sulfide,DMS)和丙烯酸(Acrylate)。DMS具有挥发性,是连接海洋硫库和大气硫库的重要媒介。同时,它也是重要的影响气候的小分子物质,可以通过影响地球对太阳辐射的反射率影响全球气候环境。而丙烯酸则是重要的海洋碳源,很多微生物可以利用其作为唯一碳源生长。研究海洋细菌对DMSP的分解代谢对于更好认识全球硫循环和碳循环以及微生物代谢过程对环境的影响具有重要意义。在本论文中,我们以海洋玫瑰杆菌类群细菌为研究对象,主要从DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制、DMSP裂解酶的进化机制、DMSP裂解产物丙烯酸胞内代谢的分子机制以及DMSP分解代谢的动力学调控机制等几个方面进行了研究。
  1.海洋玫瑰杆菌类群细菌裂解DMSP产生DMS的分子机制
  每年通过微生物的DMSP裂解酶裂解DMSP产生的DMS可以达到约3亿吨。DMSP裂解酶种类丰富,到目前为止一共发现了8种不同的DMSP裂解酶。但DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制研究较少。DddP是海洋中最丰富的DMSP裂解酶之一,主要来自于海洋玫瑰杆菌类群细菌。在本论文中,我们以来自Ruegeria lacuscaerulensis ITI_1157的DMSP裂解酶RlDddP为研究对象,研究了DddP催化DMSP裂解的分子机制。我们首先利用RT-qPCR技术和酶活检测实验手段验证了RlDddP的功能。实验结果表明RldddP基因能够被DMSP诱导上调表达,重组表达纯化的RlDddP具有显著的DMSP裂解酶活性。然后我们检测了RlDddP的酶学性质。RlDddP的最适pH为6.0,最适温度为60℃,Km值为17.1±0.98 mM。邻菲罗啉(o-phenanthroline,o-P)和2,2-联吡啶(2,2-bipyridine)能够显著抑制RlDddP的活性,而典型的金属螯合剂EDTA和EGTA则对RlDddP的活性无显著影响。然后,我们分别解析了RlDddP结合底物类似物吗啉乙磺酸(MES),RlDddP结合产物类似物磷酸根,RlDddP突变体Y366A结合产物丙烯酸,RlDddP突变体D377A结合产物丙烯酸的晶体结构。RlDddP在溶液中以二体形式存在。RlDddP单体有两个结构域,两个结构域之间的夹角约90°,是典型的“pitta-bread”结构。每个RlDddP二体含有两个催化中心,每个催化中心螯合两个Fe3+作为金属离子辅基,并有10个保守的氨基酸。其中377位的天冬氨酸位于DMSP的β-C附近,很可能是催化过程中的亲核攻击碱。突变验证结果表明突变377位的天冬氨酸会导致RlDddP酶活的丧失,验证了该氨基酸为攻击碱的推断。接着,我们对已解析的四个结构进行了叠合分析,发现RlDddP的二铁离子辅基中的一个Fe3+在催化过程中存在“ion-shift”现象。Fe3+的移动有助于DMSP的结合并且增加了DMSP的α-H的酸性,是RlDddP实现催化功能的关键一步。最后,在综合实验结果的基础上,我们提出了RlDddP裂解DMSP的分子机制。本研究对更好的认识微生物裂解DMSP产生丙烯酸释放DMS的过程具有重要意义。
  2.M24金属蛋白酶来源的DMSP裂解酶DddP的进化机制
  序列和基因组分析认为DMSP代谢是在其它已存在的代谢途径的基础上进化产生的。DMSP裂解酶种类丰富,已发现的DMSP裂解酶分属于不同的家族。DMSP裂解酶的多样性暗示着DMSP裂解酶可能具有不同的进化来源。在本论文中,我们以来源于R.lacuscaerulensis ITI1157的RlDddP为例,研究了DddP从金属蛋白酶进化为DMSP裂解酶的机制。因为序列分析显示DddP属于M24金属蛋白酶家族,所以我们首先利用RT-qPCR技术和酶活检测实验手段检测了RlDddP的蛋白酶功能。研究发现RldddP基因不能被短肽和酪蛋白诱导,重组表达纯化的RlDddP也检测不到蛋白酶活性,说明RlDddP从金属蛋白酶进化为DMSP裂解酶后完全丧失了蛋白酶功能。然后,我们分别对DddP的蛋白全长及N端结构域进行了系统发生分析。研究发现,DddP在M24金属蛋白酶家族中形成了一个独立的分支,而且拥有一个不同于其他M24金属蛋白酶的全新的N端结构域。结构分析结果显示全新的N端结构域使得RlDddP形成了一个紧密的二体结构,从而使得RlDddP的底物入口仅能允许DMSP进入而不允许短肽进入。接着,我们对RlDddP与M24金属蛋白酶极为相似的C端结构域进行了结构叠合分析。结果显示在金属蛋白酶中起稳定反应中间态作用的氨基酸突变成了DMSP裂解酶中的关键的催化碱。催化中心关键氨基酸的突变导致了RlDddP蛋白酶催化能力的丧失和DMSP裂解酶催化能力的形成。最后,在综合N端结构域和C端结构域研究结果的基础上,我们提出了DddP从金属蛋白酶进化为DMSP裂解酶的机制。这一研究有助于更好地认识DMSP裂解酶的进化机制。
  3.海洋玫瑰杆菌类群细菌胞内代谢丙烯酸的分子机制
  丙烯酸是重要的海洋微生物碳源,同时丙烯酸及其代谢产物丙烯酰辅酶A具有很高的细胞毒性,丙烯酸需要在胞内实现快速代谢从而避免对微生物的生存造成影响。但是到目前为止,丙烯酸代谢的分子机制尚不清楚。在本论文中,我们以代谢DMSP的主要类群海洋玫瑰杆菌类群细菌为研究对象,研究了DMSP代谢菌株胞内代谢丙烯酸的分子机制。首先,我们验证了该类群胞内代谢丙烯酸的代谢途径。研究发现,该类群主要通过以丙酸辅酶A连接酶(PrpE)和烯酰辅酶A还原酶(AcuI)为关键酶的PrpE-AcuI途径实现丙烯酸的代谢。然后,我们分别解析了Dinoroseobacter shibae DFL12的PrpE和R.pomeroyi DSS-3的AcuI的结构。PrpE在溶液中以单体形式存在。它的拓扑结构与同家族的其它酰基辅酶A连接酶相似,拥有两个结构域,一个N端结构域和一个C端结构域。AcuI则在溶液中以二体形式存在。它的拓扑结构与来自大肠杆菌的YhdH相似,拥有一个典型的rossmann折叠结构用以结合辅酶NADPH。接着,我们分别研究了PrpE和AcuI催化中心保守的氨基酸的功能。PrpE具有两个构象,即腺苷酸形成构象和硫酯形成构象。PrpE高度保守的588位的赖氨酸和502位的甘氨酸分别位于两个构象的活性中心,且突变会导致PrpE的酶活丧失。因此,PrpE588位的赖氨酸很可能是PrpE催化腺苷酸形成半反应的关键氨基酸,而502位的甘氨酸则很可能是硫酯形成半反应中的关键氨基酸。AcuI的催化中心结合一个NADPH辅基。NADPH烟酰胺基团附近的亲水氨基酸中仅有323位的精氨酸突变会显著影响AcuI的酶活。因此,323位的精氨酸很可能是AcuI催化过程中接受电子的广义酸,而NADPH则很可能在AcuI的催化过程中提供反应的还原力。最后,综合实验结果,我们提出了PrpE和AcuI共同参与胞内代谢丙烯酸的分子机制。本研究对更好的认识微生物的胞内丙烯酸代谢具有重要意义。
  4.海洋玫瑰杆菌类群细菌分解DMSP的动力学调控机制
  DMSP在细菌胞内的分解代谢是一个复杂的过程,涉及到多步反应,需要多种酶分工合作,相互协调。DMSP除了作为重要的硫循环和碳循环的载体物质之外,还具有重要的生理功能。DMSP代谢菌株往往会在胞内积累DMSP作为渗透压保护剂、抗氧化剂或防冻剂。DMSP在胞内的浓度可以达到毫摩尔量级,而DMSP裂解过程的产物丙烯酸,尤其是丙烯酰辅酶A,具有很强的胞内毒性,需要快速代谢。因此,DMSP分解代谢需要一个调控机制来维持胞内的DMSP浓度并保证丙烯酸,尤其是丙烯酰辅酶A,的快速代谢。而到目前为止,尚没有文献涉及DMSP分解代谢的调控。在本论文中,我们以代谢DMSP的主要类群海洋玫瑰杆菌类群细菌为研究对象,研究了DMSP裂解过程的动力学调控机制。首先,我们研究了已报道的多种DMSP裂解酶、丙烯酸代谢相关酶PrpE和AcuI的Km值。研究发现绝大多数的胞内DMSP裂解酶的Km值>PrpE的Km值>>AcuI的Km值。而后,我们比较了多种DMSP裂解酶,丙烯酸代谢相关酶PrpE和AcuI的kcat/Km值。结果表明,绝大多数的DMSP裂解酶的kcat/Km值>PrpE的kcat/Km值>>AcuI的kcat/Km值。在此基础上,我们提出了DMSP裂解过程的动力学调控机制,即DMSP裂解酶、PrpE和AcuI底物结合能力和催化效率的不同保证了DMSP的胞内积累和其代谢产物丙烯酸,尤其是丙烯酰辅酶A的快速代谢。接着,我们通过研究PrpE和AcuI在自然界的丰度发现PrpE和AcuI不仅在海洋玫瑰杆菌类群细菌中存在,在不同生境不同生物域的生物中均有分布。而且,除DMSP分解代谢外,多种代谢——如DMSP去甲基化代谢、乳酸代谢、丙酸代谢、β-丙氨酸和葡萄糖代谢——都可以产生丙烯酸和丙烯酰辅酶A。因此,DMSP裂解过程的动力学调控机制不仅对来自海洋的玫瑰杆菌类群细菌的DMSP分解代谢具有意义,同时具有扩展到其它生境的其它生物的其它代谢过程中的潜力,具有较为广泛的意义。
  本论文对海洋玫瑰杆菌类群DMSP裂解酶裂解DMSP的分子机制、DMSP裂解酶的进化机制、DMSP裂解产物丙烯酸胞内代谢的分子机制及DMS分解代谢的动力学调控机制进行了较为深入的研究,研究结果有助于我们更好的认识DMSP的分解代谢过程,更好的认识地球硫循环和碳循环。
[硕士论文] 王丹丹
微生物学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:胶州湾地处中国暖温带,其丰富的自然资源和生物资源都与人类生产及生活密切相关。海鞘体内共附生了丰富的微生物,在其体内发现了大量结构新颖且活性显著天然产物,从海鞘中分离共附生微生物将是利用海洋微生物资源的途径之一。本论文利用经典培养技术对胶州湾来源的萨氏海鞘(Ciona savignyi)共附生微生物进行了分离培养及后对分离菌株进行系统发育多样性分析,为海洋微生物的开发利用提供了基础。同时,还利用多相分类法确定2株海洋新菌系统分类地位,丰富了对海洋细菌种质资源的研究,为新基因、新化合物的探索奠定了基础。
  利用传统平板培养法对胶州湾来源的萨氏海鞘中的可培养细菌共附生细菌进行了分离纯化并根据其16S rRNA基因序列构建neighbor-joining系统进化树进行系统发育多样性分析。研究分离得到17种不同的细菌,它们分别具有不同的菌落特征,主要属于变形菌门、拟杆菌门和放线菌门3个细菌发育类群,α-变形菌纲、γ-变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌_c纲4个纲。其中分离得到的菌株中有12株菌属于变形菌门,占所分离菌株的70.6%,为优势类群,且主要属于变形菌门的α-变形菌纲和γ-变形菌纲。
  对萨氏海鞘中分离得到的细菌利用2216E等4种不同的培养基进行发酵,以大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等5株多重耐药菌为指示菌株,采用琼脂扩散法对发酵产物进行抑菌活性研究。研究发现,能产生抑制屎肠球菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的活性物质的菌株数量多于抑制大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的菌株;最有利于产生抑菌(供试菌株)物质的培养基是ISP2海洋培养基;菌株H-7、H-8和H-9为易产生活性物质的菌株。
  利用传统平板培养法,以2216E为分离培养基,从中国胶州湾的萨氏海鞘中分离得到一株海洋细菌H-12T,并对其进行分类鉴定。结果显示,菌株H-12T属于红杆菌科、红杆菌属的一个新种,命名为Amylibacter cionae,其典型菌株为H-12T(=KCTC52581T=CGMCC1.15880T)。其16S rRNA基因序列比对结果显示与Amylibacter属的唯一种Amylibacter marinus2-3T相似性最高为95.3%。其为革兰氏阴性、无鞭毛、杆菌,细胞大小约为0.6-1.1μm×1.5-2.2μm;在2216E平板上培养4天后,形成光滑、不透明、边缘整齐、浅黄色的圆形突起菌落。最适生长条件为25-30°C,3.0-4.0%NaCl,pH7.0-8.0;严格好养菌。过氧化氢酶、氧化酶、明胶酶、水解吐温20,60实验结果为阳性;DNA G+C含量为53.7 mol%;主要的细胞醌为Q-10;主要的脂肪酸为C18:1ω7c和C18:1ω7c 11-CH3;主要的极性脂为磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE),一个未鉴定的氨基脂(AL)、两个未鉴定的磷脂(PL1-2)和一个未鉴定的脂质(L)。
  用传统平板培养法,以2216E为分离培养基,从中国胶州湾的海水沉积物中分离得到一株海洋细菌T17T,并对其进行分类鉴定。结果显示,菌株T17T属于Marinobacte属的一个新种,命名为Marinobacter bohaiensis,其典型菌株为T17T(=KCTC52710T=MCCC1K03282T)。其16S rRNA基因序列比对结果显示与Marinobacter属的唯一种Marinobacter lacisalsi LMG24237T相似性最高为96.0%。其为革兰氏阴性、由一个端生鞭毛运动的杆菌,细胞大小约为0.6-1.2μm×1.3-2.2μm。菌株T17T在2216E平板培养3天后,形成光滑、不透明、边缘整齐、乳白色的圆形突起菌落;在MH平板上培养3天后,形成光滑、不透明、边缘整齐、浅黄色的圆形突起菌落;最适生长条件为35°C,6.0-10.0%NaCl,pH7.0-8.0;严格好养菌。氧化酶、过氧化氢酶、淀粉酶、水解吐温20,60,80、脲酶、H2S产生实验结果为阳性;DNA G+C含量为63.0 mol%;主要的细胞醌为Q-9;主要的脂肪酸为C12:0、C16:0、C16:010-CH3和Sum feature2。
[硕士论文] 郭令云
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:近海沉积物中微生物多样性丰富,蕴藏大量的潜在新菌资源。本研究通过细菌富集分离手段,对不同富集时期的近海沉积物样品进行新菌资源挖掘,并通过454FLX+平台宏基因组测序探究了不同富集时期富集培养液中细菌区系演替规律。本研究发现了大量潜在新茵,并对7株海洋新茵进行了多相分类。本研究发现慢生单胞菌新菌B210具有捕食现象,并对其进行了初步探究。
  通过富集分离,获得326株细菌,包括49株潜在新菌。通过宏基因组测序分析得出:不同富集时期,富集培养液中有其独特的细菌区系,为以后有目的性地挖掘海洋新菌提供指导;物种丰富度会随着富集时间的增加而降低,而至第30天时,呈上升趋势;某些丰富度极低的细菌门类通过富集,数量得到了剧增,如酸杆菌门细菌。
  菌株Z1T和JL1分别分离自石花菜和真江蓠,可降解琼胶。呼吸醌为Q-8。菌株Z1T的主要脂肪酸是C18∶1ω7c、C16∶0和summed feature3(C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH)。主要极性脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和1种未知的氨基脂。DNAG+C含量是45.1 mol%。与最相近物种的16S rDNA序列相似性低于92.3%。根据多相分类,菌株Zlr和JL1代表Gammaproteobacteria的一个新属新种,命名为Marinagarivorans algicola gen.nov.,sp.nov。模式菌株为Z1T(=ATCC BAA-2617T=CICC10859T)。
  菌株NC2-42T分离自威海近海沉积物,革兰氏染色可变。呼吸醌是MK-7。细胞壁含二氨基庚二酸。极性脂组分包括磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、2种未知的糖脂、1种未知的磷脂、1种未知的氨基磷脂、1种未知的脂质。主要脂肪酸是anteiso-C15∶0、iso-C16∶0和C16∶0。基因组DNA G+C含量58.1 mol%。菌株NC2-42T与Paenibacillus profundus有最高16S rDNA序列相似性(92.32%)。通过多相分类,NC2-42T为Paenibacillaceae的一个新属新种,命名为Marinicrinis sediminisgen.nov.,sp.nov。模式菌株为NC2-42T(=KCTC33676T=MCCC1K01238T)。
  菌株XDB06T分离于威海近海沉积物,革兰氏染色阴性。呼吸醌是Q-8。主要脂肪酸是iso-C15∶0和C16∶0。极性脂成分为双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、2种糖脂和4种磷腊。基因组DNA G+C含量65.0 mol%。与Wenzhouxiangella marina的16S rDNA相似性最高,为96.5%。通过多相分类,菌株XDB06T是Wenzhouxiangella的一个新物种,命名为Wenzhouxiangella sediminis sp.nov。模式菌株为XDB06T(=KCTC52041T=MCCC1K02285T)。
  菌株0W14T分离于文登海洋盐田,革兰氏染色阳性。MK-7是唯一呼吸醌。肽聚糖类型是A4βL-Om-D-GIu。主要脂肪酸组分是anteiso-C15∶0。极性脂组分是双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、2种未知的糖脂和4种未知的磷脂。基因组DNAG+C含量44.6 mol%。菌株0W14T与Virgibacillus litoralis具有最高16S rDNA相似性(96.0%)。根据多相分类,菌株0W14T代表Bacillaceae的一个新属新种,命名为Marinisalinus sediminis gen.nov.,sp.nov。模式菌株为0W14T(=KCTC33835T=MCCC1H00171T)。
  菌株NC2-31T分离于威海近海沉积物,革兰氏染色阳性。呼吸醌为MK-7,肽聚糖中含二氨基庚二酸。主要极性脂是双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺。基因组DNA G+C含量46.3 mol%。主要脂肪酸为iso-C15∶0、anteiso-C15∶0、iso-C16∶0和Summed Feature3(C16∶1ω7c and/or iso-C15∶02-OH)。基于16S rDNA序列的系统发育分析表明菌株NC2-31T在Bacillus内形成独立分支。根据多相分类,菌株NC2-31T代表Bacillus的一个新物种,命名为Bacillus marinisedimentorumsp.nov。模式菌株为NC2-31T(=KCTC33721T=MCCC1K01239T)。
  菌株WDN1C137T分离于文登海洋盐田,革兰氏染色阴性。Q-10是唯一醌型。主要脂肪酸成分为C18∶1ω7c、cyclo C19∶0ω8c、C16∶0。主要极性脂为磷脂酰甘油、磷酸糖脂、1种未知的糖酯、1种未知的脂质、2种未知的氨基脂和3种未知的磷脂。基因组DNA G+C含量71.4 mol%。菌株WDN1C137T与Roseivivaxjejudonensis有最高16S rDNA相似性(94.5%)。根据多相分类,菌株WDN1C137T代表Rhodobacteraceae的一个新属新种,Rhodosalinus sediminis gen.nov.,sp.nov。模式菌株为WDN1C137T(=KCTC52478T=MCCC1H00170T)。
  菌株B210T分离于威海小石岛近海沉积物,革兰氏染色阴性。呼吸醌是MK-7。极性脂组分是双磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、1种未知的磷脂、1种未知的脂质。主要脂肪酸是iso-C15∶0。基因组DNA G+C含量是64.7 mol%。系菌株B210T与Bradymonas sediminis FA350T有最高16S rDNA序列相似性(89.2%)。通过多相分类,B210T为Bradymonadales的一个新属新种。模式菌株为B210T(=KCTC42951T)。
  对鉴定的慢生单胞菌新菌B210捕食现象进行了初步探究。其捕食谱广泛,能捕食革兰氏染色阳性和阴性细菌,这同黄色黏球菌的捕食谱相似,而不同于只能捕食革兰氏阴性菌的蛭弧菌;通过扫描电子显微镜观察、捕食接触性试验推断其捕食需要细胞间接触。通过对菌株B210发酵液不同组分的抑菌作用的探究,发现其发酵上清液和胞内产物都不具有抑菌作用,这进一步佐证了其捕食行为需借助与猎物的细胞接触。
[硕士论文] 许振兴
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:能源、资源、环境问题是21世纪制约社会经济可持续发展的主要瓶颈。为进一步解决能源紧缺问题,从海洋中寻找新的生物能源途径越来越引起科研人员的重视。海洋面积占地球总面积的70%以上,其中蕴藏丰富自然生物资源,并且含有大量可进行生物质转化的藻类。琼胶作为一种海洋功能多糖,是海洋红藻细胞壁的主要成分,总量巨大,是生物质能转化的重要来源之一。另外,琼胶经水解后的寡糖也由于水溶性好,易被机体吸收的特点,在食品,医药,化妆品等领域有着巨大应用前景。微生物作为降解琼胶的初级消费者,是研究琼胶生物质转化以及制备琼胶寡糖的主要物种来源。因此,本文以细菌的琼胶降解为研究主线,开展了一系列研究工作。
  首先,本文完成了包括两株琼胶降解菌在内的四株海洋新菌的分类鉴定工作。分离自青岛养殖池海水并且具有琼胶降解能力的菌株QM50T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白、DNA以及吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,基因组分析以及16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为科尔韦尔氏菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶科尔韦尔氏菌(Colwellia agarivorans sp.nov.)。分离自条斑紫菜表面并且具有琼胶降解能力的菌株HZ1T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白以及吐温80,呼吸醌类型为MK-6,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和三个未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征以及16S rRNA序列的系统发育分析,菌株HZ1T为黏着杆菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶黏着杆菌(Tenacibaculum agarivorans sp.nov.)。分离自鲨鱼腮的中度嗜盐菌SS9T,革兰氏阴性菌,最适生长盐度为6%,能够积累PHA,呼吸醌类型为Q-9,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,16S rRNA序列的系统发育分析以及MLSA分析,该菌为是盐单胞菌科的一个新属新种,建议将其命名为橙色鲨鱼球菌(Pistricoccus aurantiacusgen.nov,sp.nov.)。分离自威海近海沉积物的菌株N211T,革兰氏阴性菌,可以水解明胶和吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺,磷脂酰甘油和一种未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征和16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为深海杆菌属的一个新物种,建议将其命名为沉积物深海杆菌(Thalassotalea sediminis sp.nov.)。另外,还对鉴定的两株琼胶降解菌进行了基因组测序,结果显示菌株QM50T的基因组大小为4.7 Mb,GC含量为35.8%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌株存在5条β-琼胶酶基因,4条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。菌株HZ1T的基因组大小为5.6 Mb,GC含量为30.9%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌存在11条β-琼胶酶基因,1条α-琼胶酶基因,2条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。并且这两株菌还注释出不完全相同的半乳糖代谢通路。
  然后,本文对来源于本实验室之前鉴定的两株琼胶降解菌HQM9T和QIT的11条琼胶酶基因和6条新琼二糖水解酶基因进行了外源表达分析。利用生物信息学分析,除琼胶酶AgaAJ属于GH86家族,琼胶酶Q1B2属于GH118家族外,其余9条琼胶酶基因都属于GH16家族,6条新琼二糖水解酶基因属于GH117家族。并且经过对琼胶降解酶基因的外源表达过程,我们成功构建了11条琼胶酶的基因工程菌,经表达检测及酶活分析,9条琼胶酶进行了重组蛋白表达并显示出一定活性。而6条新琼二糖水解酶基因中只有四条基因被成功表达,除了NABH1表达可见的可溶性重组蛋白外,其余3条基因均表达包涵体,经底物水解检测,这四条重组的新琼二糖水解酶没有显示出降解底物的能力。对多个重组酶进行纯化,最后利用亲和层析结合包涵体复性的方式成功纯化出重组琼胶酶Q1B1,对其进行生理生化特征鉴定,重组酶Q1B1在底物为1%时的比酶活为222.84U/mg,并且具有琼胶底物专一性,它的最适反应温度为40℃,最适底物浓度为1.6%,最适反应的pH值为8,DTT对酶活的促进有很大影响。纯化后的重组酶以琼脂糖为底物时的最终降解产物为新琼四糖和新琼六糖,它的最小降解底物为纯的新琼六糖。
  最后,本文还从基因转录水平分析了菌株Q1T在琼脂糖诱导条件下,在不同时间琼胶降解相关基因的表达差异。结果显示琼胶降解酶基因的表达集中于菌株诱导生长的前期,并随着菌株生长持续减弱,至菌株生长至稳定期后期时,琼胶降解基因基本停止表达。另外,根据琼胶降解基因在基因组上的分布,菌株Q1T中的琼胶降解酶基因大部分可能属于单独调控型,虽集中表达,但表达量只与诱导条件有关,而与基因所处位置无关。
[硕士论文] 朱晓文
微生物学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:高盐、高压、低温、低氧和寡营养等极端环境造就了海洋链霉菌独特的代谢方式,使其次级代谢产物丰富多样进而成为新型活性物质的重要来源。分离自青岛胶州湾的海洋链霉菌(Streptomyces griseoaurantiacus)菌株M045能够产生手霉素A、中尼霉素A和B等多种抗生素。其中,中尼霉素A是由前体物质手霉素A经辅酶依赖型氧化还原酶CHIE4催化合成。研究表明中尼霉素可抑制黑色素瘤与乳腺癌的发生,并对农作物病原真菌具有抑制活性,因而具有较高的研究与应用价值。
  本课题采用多种蛋白表达系统对来自海洋链霉菌菌株M045的CHIE4进行了体外重组表达研究。结果表明,由原核表达载体pET28表达的CHIE4会形成包涵体,通过透析和复性等处理能够获得可溶性的CHIE4,但是活性检测发现该CHIE4的催化活性基本丧失。利用原核表达载体pMAL-p5x和pMAL-c5x可获得与麦芽糖结合蛋白标签融合表达的可溶性CHIE4。该融合蛋白经MBP亲和层析、TEV蛋白酶酶切和Ni柱串联亲和层析可得到纯化的单一CHIE4,活性检测实验证实该CHIE4具备催化活性。实验同时证实利用真核表达载体pPIC9K和毕赤酵母表达系统无法获得CHIE4的表达。
  辅酶依赖型氧化还原酶CHIE4的编码基因GC含量高达65%,原核表达易形成包涵体,变性复性后蛋白又极易失去催化活性,为CHIE4的生产应用带来挑战。本研究利用麦芽糖结合蛋白标签融合表达系统,经蛋白酶切和串联亲和层析获得了具有催化活性的CHIE4,为实现CHIE4的大规模应用和中尼霉素的工业化生产奠定基础。
[硕士论文] 郭文捷
微生物学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:深海是海洋生态系统的重要组成部分,它具有复杂多样的环境如冷泉、热液、海山等,还具有高盐、高压、低温、寡营养和永久黑暗的理化特征。这些特殊的环境以及理化特征孕育了独特的微生物群落结构。深海极端环境微生物群落结构的研究可以拓展人们对深海极端环境的认知,挖掘深海极端环境资源,探究微生物与环境之间的关系,进一步解析微生物在地球化学循环中的作用,因此研究深海极端环境的微生物群落结构十分必要。本研究围绕冷泉和海山两种极端环境,系统地分析冷泉区贻贝附生菌的多样性状况以及海山区海水微生物多样性的状况。
  冷泉区甲烷和硫化氢富集,形成典型的冷泉生态系统。本研究以采集后适应培养0-24 h以及添加甲烷和硫化钠培养24-240 h的南海冷泉区深海贻贝为材料,取其鳃部,分析附生菌的多样性与适应性变化状况。共分离鉴定出贻贝附生菌270株,主要分布在4个门,其中变形菌的数量最多且多样性高。分析发现原位新采集的贻贝鳃部附生菌的多样性较高,6h后附生菌的多样性明显降低。分别添加甲烷和硫化钠对深海贻贝进行培养,甲烷组与碳代谢有关的假单胞菌的数量逐渐增多;硫化钠组的芽孢杆菌属所占比例升高。此外还发现4株潜在的新种。本研究实现了深海冷泉区贻贝的实验室培养,丰富了海洋极端环境微生物资源库,并为深入解析贻贝与其附生菌之间的相互作用关系奠定了基础。
  另外,本研究在吕宋海峡-雅浦海山断面上选取9个站位表层到底层六个深度共34个海水样本,利用高通量测序分析其微生物多样性情况。通过门水平各站位微生物的组成可以得出:门水平上主要包括变形菌、蓝细菌、放线菌、绿弯菌及拟杆菌,其中变形菌占主要优势。通过聚类分析发现9个站位的表层样品聚集在一起,相似性较高。结合非度量多维尺度分析得出:除了Y3-15站位和DY11站位,其余站位的样品均是按深度进行排布,深度是影响微生物多样性的主要因素。Y3-15和DY11站位的同一深度和其余站位低一深度的样品聚集在一起;推测Y3-15由于地震活动使得雅浦海沟处的水层出现骤然上升,而 DY11站位由于帛硫海沟的俯冲使得水层整体呈上升的趋势。大范围的探究该海域表层到底层海水微生物多样性对于掌握该海域微生物分布情况及进一步微生物与环境之间的研究奠定了基础。
[硕士论文] 宁传德
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:南极地区极端的气候条件使其成为地球上最严酷的陆地生境之一,其特殊生境条件孕育了独特的微生物类群。南极区域少有人类活动,其深海沉积物不仅地质学特征复杂,所含矿物成分种类众多,是复杂的微生物栖息地,也是一种特殊的生态环境。罗斯海(Ross Sea)是南太平洋深入南极洲的大海湾,位于罗斯陆缘冰(Ross ice shelf)之北,维多利亚地阿代尔角西(Cape Adare)与爱德华七世半岛的科尔贝克角东(Cape Colbeck)之间(158°W-170°E)。本论文对南极罗斯海沉积物中可培养微生物的多样性和低温酶活性进行了研究,并采用遗传学、表型特征、生理生化指标和化学分类指标等多项分类法鉴定出1株南极细菌新种。
  利用传统平板培养法,对采集自罗斯海的6份沉积物样品进行了细菌和真菌的分离培养,选择形态差异较大的细菌和真菌进行了16SrDNA和ITS鉴定。16SrDNA序列分析结果显示需盐杆菌属7株,芽孢杆菌属7株,海洋杆菌属4株,动球菌属6株,嗜冷杆菌属12株。ITS鉴定结果表明筛选得到的真菌属于6个属:枝孢属、链格孢属、弯孢属,蜡蚧菌属、定殖真菌属、青霉菌属,其优势真菌为枝孢属菌株。以上菌株中,88.89%的细菌可产生α-葡萄糖苷酶,72.22%的细菌可以产生蛋白酶,83.33%的细菌可产生脲酶,69.44%的细菌可产生β-半乳糖苷酶,69.44%的细菌能将硝酸盐还原成亚硝酸盐和氮气;产淀粉酶、纤维素酶和酪蛋白酶的真菌分别占真菌菌株总数的37.93%、34.48%、61.54%;8株菌株对至少一种受试菌株有拮抗作用,且其拮抗活性主要针对真菌(辣椒疫霉)和革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、鳗弧菌),未发现对革兰氏阳性细菌(枯草杆菌)有明显抑制作用的菌株。由以上结果可以看出,罗斯海沉积物中的微生物具有丰富的多样性,这为筛选具有特殊功能的菌株和发现新菌种提供了基础。
  利用传统平板培养法,以海水R2A培养基,对一株南极细菌2PM7进行分类鉴定。结果显示,该细菌是革兰氏阴性菌,严格需氧,呈杆状,无鞭毛,无运动性;在0-20℃条件下生长状况良好,该菌株适合生长的pH值为4.0-8.0,适合在低于0.9%(w/v)NaCl的培养基中生长;具有氧化酶、过氧化氢酶活性。该菌DNA的G+C含量为44.4mol%,细胞呼吸醌为甲基萘醌7(MK-7),主要脂肪酸为iso-C15∶0(18.1%)、C16∶1ω5c(14.2%)和Summed feature3(40.5%)。2PM7与粘液杆菌属(Mucilaginibacter)的一株细菌标准菌株Mucilaginibacterrugui sp.nov.的相似度为96.8%,另外与该科其他细菌的同源相似性均低于96.8%。构建的系统进化树显示,2PM7形成了一个独立的分支。因此,根据该菌在遗传学特征和表型特征上所表现出来的特殊性,认定该菌属于黏液杆菌属的一个新种,命名为Mucilaginibacter ning sp.nov.。
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