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[硕士论文] 曾洁
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:DCE-01是一株“广谱性”、“高效性”脱胶菌,对多种草本纤维原料均能起到很好的脱胶作用,且6.0h能独立完成苎麻脱胶,不需要其他化学方法后处理补充。其脱胶功能的广谱性和高效性在国内外都属于领先地位。本文以DCE-01菌株为研究对象,从DCE-01菌株中克隆出3个关键脱胶酶基因,以2种不同的排列方式将这3个关键脱胶酶基因串联起来,分别在大肠杆菌和DCE-01菌株中表达,获得结果如下:
  1.根据全基因组测序注释结果设计特异引物,从DCE-01菌株克隆出关键脱胶酶基因片段3个:果胶酶基因(pelE)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man)。经测序及生物信息学分析:pelE核酸序列长1185bp,编码395个氨基酸,预测蛋白分子量为43.8kDa;xyn核酸序列长1251bp,编码416个氨基酸,预测蛋白分子量45.74kDa;man核酸序列长1137bp,编码378个氨基酸,预测蛋白分子量41.85kDa。
  2.通过设计特异引物和PCR扩增获得带有特定限制性酶切位点的关键脱胶酶基因(PelE基因、Xyn基因和Man基因)片段,经酶切并与表达载体pET-28a连接,构建成单基因表达重组子,同时,按照PXM、XPM的顺序串联排列在表达载体pET-28a的MCS区段上,构建成多基因共表达重组子,然后,将单基因表达重组子和多基因共表达重组子导入BL21菌株中,成功构建PelE、Man和Xyn的单基因表达重组菌株(pET-28a-P/BL21、pET-28a-M/BL21和pET-28a-X/BL21)和多基因共表达重组菌株(pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21)。
  3.将构建的重组子转入到DCE-01(关键脱胶酶基因来源菌株)中,成功获得单基因同源表达的重组菌株3个,包括pET-28a-P/DCE-01、pET-28a-X/DCE-01、pET-28a-M/DCE-01,多基因同源共表达的重组菌株2个,即pET-28a-PXM/DCE-01(或DCE01PXM)和pET-28a-XPM/DCE-01(或DCE01TM)。
  4.对BL21系列重组菌株的酶活测定结果显示:(1)pelE重组菌株所表达PelE酶活为471.97U/mL,而把pelE排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21时,对应的PelE酶活分别是532.68U/mL和121.43U/mL。(2)xyn重组菌株所表达Xyn酶活为44.32U/mL,而把xyn排列在启动子后面第一位和第二位所形成pET-28a-XPM/BL21和pET-28a-PXM/BL21时,对应的Xyn酶活分别是47.43U/mL和31.42U/mL。(3)man重组菌株所表达Man达16882.86U/mL,而将man排在远离启动子位置形成的pET-28a-PXM/BL21与pET-28a-XPM/BL21时,对应的Man酶活分别为645.21U/mL和230.83U/mL。因此,可以推论:(1)用于构建多基因共表达体系的载体的启动子对pelE的表达效果有显著促进作用;(2)构建多基因共表达体系时,目的基因的表达效果与插入位点离启动子的距离呈负相关,即距离越远效果越差;(3)在多基因共表达体系中,man的表达效果受pelE插入位点的影响突出。
  5.以DCE-01和DSM18020(模式菌株)为对照,对多基因同源共表达重组菌株纯培养液的酶活测定结果显示:(1)重组菌株DCE01PXM、DCE01XPM的PelE酶活性分别是DCE-01菌株的2.77倍、1.01倍和DSM18020菌株的10.91倍、4.11倍;(2)重组菌株DCE-01PXM、DCE-01TM的Xyn酶活性分别是DCE-01菌株的1.28倍、1.82倍和DSM18020菌株的5.61倍、8.08倍;(3)重组菌株DCE-01PⅪM、DCE-01XPM的Man酶活性分别是DCE-01菌株的1.99倍、1.01倍和DSM18020菌株的6.16倍、3.16倍。由此可以得出结论:采用基因串联方法将来自DCE-01菌株的关键脱胶酶基因(pelE、xyn、man)整合到表达载体(pET-28a)中形成重组子,无论是导入原核表达菌株E.coli BL21(DE3)还是导入DCE-01菌株都获得了成功表达,而且多基因同源共表达重组菌株表达PelE、Xyn、Man的酶活都高于DCE-01菌株。
  6.液相色谱分析DCE-01、DSM18020、DCE-01PXM、DCE-01XPM菌株用于苎麻脱胶发酵液的结果表明:DCE-01PXM菌株的发酵液中检测到的单糖含量要明显高于其他几个菌株,DCE-01PXM菌株发酵液中的单糖含量略高于DCE-01菌株,而DCE-01菌株脱胶发酵液的单糖含量要明显高于DSM18020菌株。这一结果与上述酶活检测结果基本一致,说明将DCE-01关键脱胶酶基因按照PXM的顺序串联排列形成重组子后导入DCE-01中进行多基因同源共表达的方法,能在一定程度上提升DCE-01的脱胶功能。
[硕士论文] 李凯峰
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:地衣芽胞杆菌是一种重要的工业微生物,可以生产出许多各种各样的生物制品。然而,低转化效率和缺乏有效的基因组编辑工具阻碍了它的研究进展。近些年来,由于CRISPR/Cas9系统具有高效、易于操作、操作周期短等优点而受到广泛的关注,并被应用于各种细胞中。但是,Cas9核酸内切酶辅以NHEJ修复途径的基因组编辑策略在应用过程中仍然存在一些问题,如脱靶效应和致死效应等。为了解决这些问题,Cas9的突变体Cas9n单切口酶被人们发现,并且常常辅以同源重组的修复模式运用在基因组编辑技术中。本研究利用一种改进的CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌DW2中构建了系统的基因组编辑策略,希望借此来提高芽胞杆菌的基因组编辑效率,并为其它基因组编辑策略的开发提供思路。
  本研究在穿梭载体pHY300的基础上添加了Cas9n表达元件,并构建了DW2/pCas9n过表达工程菌株。通过SDS-PAGE实验表明,Cas9n蛋白能在地衣芽胞杆菌中表达。为了降低基因组编辑载体的负荷,将P43启动子启动的Cas9n表达元件整合到地衣芽胞杆菌DW2的基因组上,并把Cas9n整合菌株命名为DWC9n。以DWC9n为出发菌株,构建了系统的基因组编辑策略,包括单基因敲除、多基因同时敲除、大片段敲除、单基因整合等,大幅度提高了地衣芽胞杆菌的基因组编辑效率。
  在本研究中,普切明合成酶基因yvmC被选择作为靶基因,并设计特异性的gRNA序列构建了单基因敲除策略。然后,对敲除载体同源臂的大小进行了优化,构建了同源臂大小分别为0.1kb+0.1kb、0.2kb+0.2kb、0.3kb+0.3kb、0.5kb+0.5kb、0.7kb+0.7kb、1.0kb+1.0kb的单基因敲除载体。实验结果表明,即使是在0.1kb大小同源臂的作用下,CRISPR/Cas9n系统也能很好地被应用于单基因敲除,效率达51.4%。随着同源臂大小的增加,敲除效率呈现递增的趋势,但是考虑到载体负荷和策略拓展的问题,0.3kb大小的同源臂是比较合理的选择,敲除效率达80.6%。
  同时,本研究通过将靶向不同基因的两条特异性的gRNA串联在一起实现了epr、wprA双基因的同时敲除,敲除效率达11.6%。以pHY300载体为基础,构建了基于CRISPR/Cas9n的大片段敲除载体,并一次性敲除了42.7kb的大片段DNA序列,敲除效率高达79.0%。为了建立完善的CRISPR/Cas9n基因组编辑技术,将纳豆激酶表达元件整合到地衣芽胞杆菌DWc9n的基因组上,整合效率达76.5%。
  最后,为了测试建立的CRISPP/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌中的适用性,通过敲除地衣芽胞杆菌胞内、胞外蛋白酶基因来增加异源蛋白在宿主细胞内的表达量。利用构建的基因组编辑策略敲除了epr、vpr、mpr、bprA、aprE、clpP、clpE、clpYQ、lonB、bacABC这些基因,获得了工程菌株DWc9n△10。将实验室保存的纳豆激酶表达载体pP43SNT-SsacC电转到DWC9n和DWc9n△10中进行发酵实验,结果表明,DWc9n△10具有良好的异源蛋白表达能力,其生产的纳豆激酶活力比原始菌株提高了30.4%,达到了75.0FU/mL。本研究在地衣芽胞杆菌中构建了一个系统的基因组编辑方法,并且已经被证实可以很好地被应用于地衣芽胞杆菌的菌种改造研究中。
[博士论文] 吕玲玲
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:罗布泊及周边极端高盐碱环境蕴藏着丰富多样的嗜(耐)盐放线菌资源,是挖掘放线菌物种多样性、生物活性多样性、次级代谢产物多样性和嗜(耐)盐机制的宝藏。本论文采用可培养法对罗布泊及其周边23份高盐碱土壤样品进行了放线菌物种的分离、收集、保存和16S rDNA聚类分析,获得了262株嗜(耐)盐放线菌,其中有13株潜在新种;分离并鉴定了6个放线菌新物种;对获得全部菌株进行了耐盐特性、抗菌活性以及PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS和APH等抗生素生物合成基因簇的筛选研究;从6株放线菌发酵液中分离鉴定了13个单体化合物;同时采用转录组比较分析法对一株极端嗜盐放线菌的盐胁迫响应机理进行了初步探索。具体研究结果包括:
  1.罗布泊及其周边盐碱土嗜(耐)盐放线菌多样性研究
  从23份土样中共分离获得了262株嗜(耐)盐放线菌,5株为耐盐放线菌,257株为嗜盐放线菌,发现放线菌潜在新种13个,可能代表新的分类单元。通过16SrDNA聚类分析,将所获放线菌归属于4亚目5科8属,分别为放线多孢菌属(Actinopolyspora)、糖霉菌属(Glycomyces)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、链单孢菌属(Streptomonospora)、链霉菌属(Streptomyces)和拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)。其中,拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)是罗布泊盐湖的主要类群,占该区域分离获得菌株的37.04%,放线多孢菌属(Actinopolyspora)是罗布泊周边盐碱土的主要类群,占该区域分离获得菌株的25.20%。
  2.放线菌新物种的多相分类
  采用多相分类方法鉴定了6株放线菌新物种。其中,放线菌TRM45123为糖多孢菌属新物种,命名为耐盐糖多孢菌(Saccharopolyspora halotolerans);放线菌TRM45387、TRM45198和TRM45127为糖霉菌属新物种,分别命名为塔里木糖霉菌(Glycomyces tarimensis)、新疆糖霉菌(Glycomyces xinjiangensis)和罗布泊糖霉菌(Glycomyces lopnorensis);放线菌TRM45668和TRM45658为嗜盐多孢菌属新物种,分别命名为塔里木嗜盐多孢菌(Halopolyspora tarimensis)和罗布泊嗜盐多孢菌(Halopolyspora lopnorensis)。
  3.抗生素合成基因和抗菌活性筛查
  262株放线菌PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS和APH基因的筛查结果表明,阳性率分别为46.94%、25.57%、22.90%、21.76%。四种功能基因在不同种属之间的分布存在一定差异,PKSⅠ、PKSⅡ基因在各个属都有分布,PKSⅡ基因较PKSⅠ基因分布明显要少,而且绝大多数含有PKSⅠ基因的菌株不含有PKSⅡ基因;NRPS基因主要分布在Actinopolyspora和Streptomyces;APH基因分布于Glycomyces和Nocardiopsis。262株放线菌的生物活性检测得出,有75株放线菌至少对一种病原菌具有拮抗作用,阳性率为28.6%。这些菌株分布于Streptomyces、Nocardiopsis、Actinopolyspora、Saccharopolyspora、Glycomyces、Streptomonospora和Saccharomonospora,阳性率分别为14.5%、8.4%、7.3%、1.1%、1.1%、0.8%和0.4%;活性菌株以Streptomyces最多,而这些活性菌株大部分均含有一种或一种以上的抗生素生物合成基因。
  4.放线菌次级代谢产物的分离纯化与结构鉴定
  采用现代色谱分离技术和核磁共振(NMR)等波谱鉴定技术,从6株放线菌活性菌株发酵液中分离鉴定了13个化合物,分别鉴定为3,4-二氢-6,8-二羟基-3-甲基异香豆素(45037-1)、2-甲基-1,4-苯二醇(45037-2)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)二酯(45037-3)、1,6-二羟基吩嗪(45037-4)、16α-甲基-11β,17α,21-三羟基-9α-氟孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮21-醋酸酯(45306-1)、谷甾醇-3-O-葡萄糖苷(45306-2/45556-3)、Nb-乙酰色胺(45306-3/45380-1)、N-丙酰色胺(45306-4)、4',7-二羟基异黄酮(45556-1)、4',5,7-三羟基异黄酮(45556-2/45214-1)、大豆皂醇B(45214-2)、1-庚基-2-甲基-3-羟基咔唑(45040-1)和8-庚基-4,5,6-三羟基酞酸(45040-2)。这些化合物均首次从这些菌株的次级代谢产物中分离获得。
  5.一株嗜盐放线菌的盐胁迫响应机理初探
  菌株TRM45611在8%(最低盐浓度生长)、17%(最适生长盐浓度)和25%NaCl(最高盐浓度生长)浓度下转录组比较分析结果表明:以8%NaCl组为对照组,17%NaCl组和25%NaCl组与对照组相比,从生物过程分类中显示菌株在盐胁迫过程中有细胞代谢、生物调节和次级代谢产物等过程参与;在细胞组分分类中显示菌株的盐胁迫与细胞器,还有大分子化合物,如蛋白质、核酸、糖类或脂类的运输代谢等密切相关,同时,这些代谢过程在菌株耐盐中起着重要作用;在分子功能分类中显示菌株的盐胁迫响应机制中,结构分子活性、酶催化活性和分子转运活性也密切相关。不同盐浓度条件下的差异表达基因的比较发现,以8%NaCl组为对照组时,17%NaCl组表达量上调的基因有78个,表达量下调的有155个;25%NaCl组表达量上调的基因有383个,表达量下调的有302个。
  综上所述,本论文在分离并鉴定嗜(耐)盐放线菌的基础上,初步揭示了新疆罗布泊地区嗜(耐)盐放线菌的物种多样性和主要类群;评价了抗生素功能基因多样性、抗菌活性和耐盐特性;在抗生素生物合成基因和生物活性双重评价基础上分离鉴定了部分菌株的次生代产物;同时在转录组水平上探讨了一株极端嗜盐菌的盐胁迫响应机制。以上研究结果对新疆嗜耐盐放线菌资源的保护利用提供了重要参考。
[硕士论文] 杨学
细胞生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:细菌人工染色体文库是生物基因组研究的重要资源,它们被成功地应用于图位克隆,构建物理图谱以及全基因组测序。本研究工作由两部分组成:1.放线菌BAC载体改造及放线菌0026BAC文库构建;2.矮牵牛BAC文库构建及相关基因筛选。
  放线菌(Actinomycetes)产生的次级代谢产物在医药和学术研究上有着重要意义。常用于构建放线菌BAC(Bacterial artificial chromosome)文库的载体为pMSBBACs,用其构建的放线菌BAC文库在进行质量检测时存在一定的缺陷。本研究通过在放线菌复合载体pMSBBACs中引入归位内切酶Ⅰ-SceI位点,改造出适用于放线菌属大片段基因组DNA克隆和异源表达的pHZAUBACFXJ复合载体。pHZAUBACFXJ1载体不仅在构建放线菌文库方面简单实用,在验证文库质量时用Ⅰ-SceI代替NotI进行酶切,也方便放线菌BAC文库外源插入片段大小的计算,评估放线菌BAC文库质量。本研究使用pHZAUBACFXJ1复合载体成功构建了一个放线菌0026的BAC文库。该文库总计3,456个克隆,保存在9块384板中,随机挑拣40个放线菌BAC克隆用Ⅰ-SceI酶切检测,平均插入片段约130kb,空载率约10%。以放线菌0026基因组8Mbp计算,约覆盖放线菌0026基因组40倍。构建了该BAC文库行列混合池,并提取行列混合池DNA。合作者已成功利用该文库筛选到克隆。
  矮牵牛(Petunia hybrida)因其花期长、花开繁盛等优点,广泛应用于街边花坛布置和园林景观摆设,在研究植物花发育中具有重要意义。为了研究矮牵牛开重瓣花的基因调控序列,本研究利用pHZAUB AC1复合载体构建了一个含有78,336个重组克隆的矮牵牛重瓣花BAC文库,保存在204块384板中。随机挑选440个矮牵牛BAC克隆检测外源DNA插入片段大小,平均外源插入片段约为120kb,空载率小于2%。以矮牵牛基因组900Mbp计算,约覆盖整个矮牵牛基因组10倍。通过构建高效二维混合池PCR筛选方法,利用6对引物(SCF1-9FR、SCF2-2FR、SCF43FR、SCF4-1FR、SCF1-12FR、SCF101FR)对矮牵牛BAC文库进行筛选,共筛选出9个阳性BAC克隆,对矮牵牛开重瓣花调控机理的研究具有重要意义。
[博士论文] 王冬
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptides synthetases,NRPSs)和环二肽合成酶(cyclodipeptides synthetases,CDPSs)是微生物中的两种非核糖体肽合成酶类。经由NRPS途径合成的杆菌肽和经由CDPS途径合成的普切明酸是地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)中具有代表性的非核糖体肽类抗菌物质。但是,目前对于两种物质合成途径的转录调控还缺乏了解,阻碍了我们对菌株的杆菌肽和普切明酸应用潜力的挖掘。本论文以杆菌肽工业生产菌株B.licheniformis DW2为研究对象,通过基因重组技术、RT-qPCR、凝胶阻滞分析等方法,考察不同转录调控因子在杆菌肽及普切明酸合成过程中的作用,验证了Spo0A-AbrB-SigH调控系统在NRPS成途径中的地位,并首次较完整的揭示了芽胞杆菌中CDPS合成途径的调控网络。本研究得到的主要结论如下:
  1.Spo0A-AbrB-SigH调控系统对杆菌肽合成的调控作用
  bacT为假定的Ⅱ型硫酯酶基因,该基因的缺失不会影响杆菌肽合成酶操纵子bacABC的转录,但是会导致杆菌肽合成效率降低,并使杆菌肽产量下降83.01%,表明该假定的Ⅱ型硫酯酶(BacT)是杆菌肽合成酶系的组成部分。
  地衣芽胞杆菌中杆菌肽合成基因的转录受到Spo0A-AbrB-SigH调控系统的调控。AbrB是bacT和bacABC的直接负调控因子。在abrB基因缺失或者转录受到抑制的菌株(DW2ΔabrB、DW2Δ0AΔabrB、DW2Δ0A/pHY-sad67)中,bacT和bacA基因的转录水平都有不同幅度的提升,单位菌体的杆菌肽产量相比于DW2菌株分别提升19.32%、25.60%和24.15%。在abrB基因表达量较高的菌株(DW2Δ0A、DW2Δabr B/pHY-abrB)中,bacT和bacA基因的转录水都被抑制,杆菌肽合成停止。凝胶阻滞实验证明AbrB蛋白可以与bacT和bacA基因的启动子结合,表明AbrB是该基因的直接负调控因子。在DW2Δ0AΔabrB菌株基础上敲除sigH基因后,bacT、bacA基因的转录水平以及菌株的杆菌肽产量并未出现显著变化,表明SigH没有独立参与杆菌肽的合成调控。
  2.AbrB-YvnA-YvmB调控系统对普切明酸合成的调控作用
  abrB基因的缺失导致普切明酸的合成时间提前4h,产量相对于DW2菌株提升103.16%,yvmC、yvnA和yvmA基因的转录水平不同程度上调,而yvmB基因的转录则被抑制。DW2/pHY-abrB菌株的普切明酸合成停止,yvmC、yvnA和yvmA基因的转录被抑制,而yvmB基因的转录水平上升。凝结阻滞分析证实AbrB是yvmC-cypX基因簇和yvnA基因的直接负调控因子,而对yvmA和yvmB基因为间接调控。DW2ΔyvmB菌株中的普切明酸产量相比于DW2菌株提升60.12%,yvmC和yvmA基因的转录水平相对DW2上调。DW2/pHY-yvmB菌株无法合成普切明酸,yvmC和yvmA基因的转录也受到抑制。凝结阻滞实验证实YvmB是yvmC-cypX基因簇和yvmA基因的直接负调控因子。DW2ΔyvnA和DW2/pHY-yvnA菌株均不合成普切明酸,普切明酸合成基因簇的转录都受到抑制。但是在DW2ΔyvnA中yvmB基因转录水平上升,而在DW2/pHY-yvnA菌株中yvmB基因转录水平下降。在DW2ΔyvnA菌株中敲除yvmB后,菌株的杆菌肽合成能力恢复。凝胶阻滞实验证实,YvnA蛋白通过直接结合的方式抑制yvmC和yvmB的转录,并间接激活yvmA的表达。总体而言,AbrB、YvnA和YvmB皆为普切明酸合成操纵子yvmC-cypX的负调控因子,同时AbrB也是yvnA基因的直接负调控因子,而YvnA则是yvmB基因的直接负调控因子。
  YvmA蛋白则与普切明酸的分泌有关,yvmA基因的缺失会导致菌株细胞内普切明酸的积累增加。
  3.地衣芽胞杆菌的普切明酸免疫机制
  在各个菌株基础上构建其yvmC缺失的对照菌株,并考察各个菌株于对照菌株在不同FeCl3浓度下的细胞生长状况,证明在铁浓度较低(3mg/L-10mg/L的FeCl3)的环境下,过量合成的普切明酸会造成铁饥饿并抑制菌株自身的生长。进一步比较DW2、DW2ΔyvmB和DW2ΔyvnAΔyvmB菌株在0mg/L、5mg/L和20mg/L的FeCl3浓度下各个基因的转录水平变化证明菌株是通过调节YvnA的表达量来控制不同铁离子浓度下的普切明酸合成,并保护自身不受到铁饥饿。
[硕士论文] 黄义
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:碳代谢物抑制((C)arbon(C)atabolite(R)epression,CCR)是指在多种碳源存在条件下,细菌优先利用优势碳源,同时抑制非优势碳源的利用达到最佳生长的现象。研究表明,RNA结合蛋白(如Crc和Hfq)在转录后水平负调控非优势碳源代谢基因的表达,而其与靶标的结合活性受非编码RNA(ncRNA)的竞争抑制。ncRNA与抑制蛋白之间的数量关系影响了菌体对碳源的选择。优势碳源存在时,RNA结合蛋白与靶标基因mRNA结合,抑制相关蛋白表达,菌体不能利用非优势碳源。当优势碳源消耗殆尽时,ncRNA高水平表达,与抑制蛋白结合,靶标mRNA得以释放,细胞开始利用非优势碳源。参与CCR调控的ncRNA广泛存在于假单胞菌中,但不同种中所含的ncRNA种类不同,固氮施氏假单胞菌A1501含有两个ncRNA CrcZ和CrcY,但其表达规律及功能分化尚不清楚。本论文以施氏假单胞菌A1501为试验材料,探究crcZ和crcy基因在不同营养环境中的表达特性及其转录产物的稳定性,取得的主要结果如下:
  1.分别构建了ncRNA crcZ和crcy的启动子-lacZ融合表达载体PcrcZ-lacZ和PcrcY-lacZ,用于研究不同营养环境下crcZ和crcy的启动子活性。β-半乳糖苷酶酶活测定结果表明,crcZ在LB培养条件下启动子活性最低,为85U,以优势碳源乳酸钠和非优势碳源葡萄糖为唯一碳源培养条件下的启动子活性相当,均为LB丰富培养条件下的4.9倍;crcY在以上三种培养条件下启动子活性存在显著差异,LB培养条件下最低,为209U,乳酸钠和葡萄糖分别为唯一碳源条件下启动子活性依次升高,分别是LB培养条件下的2.03倍和3.56倍;相比氮限制条件,固氮条件下crcZ和crcY的启动子活性均变化不大。碳源匮乏相比碳源丰富条件crcZ和crcY启动子活性均升高;在以上测定的培养条件下,crcZ的启动子活性均低于crcY,数字PCR结果显示,CrcZ的胞内拷贝数为crcY的36.8倍,推测这两个ncRNA的稳定性受不同机制调控。
  2.荧光定量分析和转录活性测定结果表明:苯甲酸为唯一碳源培养条件下,crc(碳代谢抑制控制蛋白编码基因)突变株中,CrcZ的胞内水平和转录活性分别为野生型的0.016倍和0.3倍,CrcY的胞内水平和转录活性分别为野生型的0.21倍和0.18倍,暗示Crc不仅影响了crcZ和crcy基因转录,而且可能影响CrcZ的稳定性。苯甲酸唯一碳源培养条件下,△crc中cbrB和rpoN的表达量相比于野生型下降1倍,推测Crc蛋白通过影响cbrB和rpoN的表达进而正调控crcZ和crcy的转录。RNA稳定性试验结果表明,野生型中CrcZ和CrcY在利福平处理第50min仍分别保留90%和60%(与处理0min相比),△crc中CrcZ和CrcY在第17min即下降50%,表明Crc蛋白正调控CrcZ和CrcY的稳定性。此外,RNA分子伴侣蛋白编码基因hfq的突变株中CrcZ和CrcY水平逐渐降低,在第50min分别下降21%和36%,而野生型中CrcZ和CrcY在第5min即下降约40%。上述结果表明,CrcZ和CrcY的稳定性受到Crc和Hfq蛋白的影响。生物信息学分析结果表明,预测的施氏假单胞菌A1501CrcZ和CrcY的茎环结构的环上富含发挥调控功能的“CA motif’,其附近存在着RNase E的剪切位点(单链AU-rich RNA序列),RNase E可能是CrcZ和CrcY功能调控网络中的一个特异性降解酶。
  本研究初步探讨了不同生长条件、不同调控节点突变体中非编码基因crcZ和crcY,的转录特性及转录产物稳定性,为深入研究碳代谢物抑制与固氮作用的网络调控机制奠定了理论基础。
[硕士论文] 张宏扬
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:假单胞菌基因组通常含有四个主要的过氧化氢酶编码基因(katA,B,E和G),其表达受氧化胁迫诱导和氧化胁迫应答蛋白OxyR调控。此外,非编码RNA在细菌的氧化胁迫抗性应答中也发挥重要的调控作用。固氮施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际,其固氮活性受根际非生物胁迫因子、特别是氧化胁迫因子的影响较大。我们前期研究发现,A1501拥有一个参与最佳固氮活性和氧化胁迫抗性调控的新型非编码RNA NfiS。该非编码RNA通过与固氮酶基因nifK mRNA互作来调控固氮酶活性,但其参与氧化胁迫抗性调控的靶标基因和分子机制尚不清楚。本研究开展突变株构建、基因截短和MST测定等研究工作,证明NfiS在转录后水平上参与氧化胁迫抗性调控,其靶标基因为katB。主要研究进展如下:
  1.在H2O2冲击条件下,A1501菌中氧化胁迫相关基因如oxyR、katA、katB和katE均表达上调,其中katB上调最强,为正常条件表达值的9倍。进一步构建了katB插入突变株和回补株,发现在H2O2冲击条件下katB突变降低了菌株的氧化胁迫抗性和过氧化氢酶酶活,而回补株能够回补相关突变表型,表明KatB在A1501的氧化胁迫反应中具有重要功能。
  2.生物信息学分析发现,NfiS的茎环结构上存在两个可能与katB mRNA互作的位点,分别位于6-23bp处和141-153bp处。两个位点的单突变能够部分回补nfiS突变株的氧化胁迫抗性,但双突变丧失了回补功能。互补结果表明,上述两个位点与NfiS的氧化胁迫抗性调节功能相关。
  3.人工合成了含有上述结合位点序列及其突变序列的寡核苷酸片段,采用MST实验证明,katB mRNA与NfiS茎环结构上的两个位点序列均存在直接的结合作用。进一步分析了nfiS突变对katB mRNA的半衰期影响,发现在H2O2冲击条件下其半衰期在野生型中为6min,而在nfiS突变株中为3min。上述结果表明,NfiS通过与katB mRNA的直接结合增强其稳定性。
  4.测定了不同氧浓度下野生型、katB突变株和回补株、nfiS突变株和回补株的固氮酶活,发现处于最佳浓度1.0%时,katB突变株的固氮酶活相当于野生型的67%;随着氧浓度升高,各菌株酶活均显著下降,其中katB突变株的酶活下降最明显:当氧浓度升至2.0%时,其酶活仅为野生型的13%,而katB回补株在不同氧浓度下均能回补突变株酶活,说明katB的突变提高了菌株固氮酶的氧敏感性。但是,在不同氧浓度下nfiS突变株的酶活均相当于该浓度下野生型酶活的50%左右,说明nfiS的突变不影响菌株固氮酶的氧敏感性,推测当nfiS突变后可能仍有其他调节因子通过与katB mRNA的互作参与A1501固氮酶活的调控过程。
  综上所述,NfiS通过与katB mRNA的相互作用增强其转录后稳定性,提高过氧化氢酶的表达量,进而参与了A1501氧化胁迫抗性和固氮酶活的调控过程。
[博士论文] 尚立国
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:自然界中,生物膜形成对细菌的环境适应至关重要,但其调控网络非常复杂,通常分为转录调控和转录后调控两种方式。大量研究发现,胞外多糖是影响生物膜形成的最重要的组分,环二鸟苷酸(c-di-GMP)则是调控胞外多糖重要的第二信号分子。在假单胞菌中,RNA结合蛋白RsmA结合到胞外多糖及c-di-GMP合成相关基因的mRNA上抑制其表达,非编码RNA RsmX、RsmY和RsmZ则通过与RsmA结合解除其抑制作用。此外,sigma因子RpoN和RpoS也被证明参与调控生物膜形成,但其调控方式缺乏深入研究。本论文以水稻根际联合固氮施氏假单胞菌A1501为研究对象,系统开展固氮生物膜形成的网络调控机制研究,取得如下研究结果:
  1.研究了碳源和氮源对固氮生物膜形成的影响。在碳源丰富而无氮源条件下,A1501生物膜形成和固氮能力最强。当NH4+浓度提高到0.5mM时,非生物膜细胞固氮酶活性被完全抑制,但生物膜的固氮酶活性还保留69%,同时生物膜条件下固氮基因高表达,表明生物膜形成能增强固氮酶表达对NH4+的耐受性。
  2.RsmA在转录后水平上抑制胞外多糖合成调控因子algU和c-di-GMP合成酶基因sadC的表达,负调控生物膜的形成。rsmA基因的突变提高了algU和sadC基因表达的蛋白水平,导致胞内c-di-GMP的水平以及胞外多糖的含量显著增加,进而增强生物膜形成能力。凝胶阻滞实验进一步表明,RsmA蛋白与algU和sadC的mRNA的特异性结合,这种结合在转录后水平上抑制了基因表达。
  3.凝胶阻滞实验证明非编码RNARsmX、RsmY和RsmZ特异性结合RsmA蛋白,表明这些非编码RNA通过特异性结合RsmA蛋白,解除其对生物膜形成的抑制作用。RsmY和RsmZ的缺失突变导致生物膜形成能力下降,而RsmY和RsmZ的过量表达则增强生物膜的形成。转录调控因子GacA突变株中RsmX、RsmY和RsmZ的表达下降10倍以上,表明其表达为GacA依赖型。RpoS的突变导致生物膜形成能力显著的增强。RsmZ的表达在RpoS突变株中表达量增加,表明RpoS可能通过未知方式负调控生物膜形成。
  4.RpoN突变导致固氮能力和生物膜形成能力完全丧失,表明其在生物膜形成过程中起至关重要的调节作用。糖基转移酶PslA突变株的胞外多糖含量为野生型的34%,生物膜形成能力完全丧失,表明胞外多糖是生物膜形成的关键因子。RpoN突变株中固氮调节基因nifA表达下调50多倍,胞外多糖合成基因pslA表达下调10多倍。nifA和pslA启动子区包含RpoN保守识别位点(GGN10GC),凝胶阻滞实验证实RpoN蛋白与nifA和pslA启动区DNA直接结合,表明RpoN主要通过直接激活pslA和nifA的表达,在转录水平上正调控固氮生物膜形成。
  5.提出了固氮生物膜形成的网络调控模型。在转录水平上,RpoN感应无氮信号,通过调控pslA等基因的表达,增加胞外多糖合成,同时调控nifA的表达激活固氮作用,进而正调控固氮生物膜的形成。在转录后水平上,GacA激活非编码RNA RsmX、RsmY和RsmZ的转录表达,后者通过与RsmA结合,解除其对AlgU和SadC的表达的转录后抑制作用,正调控固氮生物膜形成。
[硕士论文] 秦伟彤
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:镉是一种非生物必需有毒的重金属元素,长期暴露于镉污染环境会威胁生物的健康。重金属镉污染已经成为近年来最受关注的环境问题之一。然而即使生态条件变得恶劣,有些微生物会因境而变,可根据外界环境的变化而提高自身对镉离子的抗性。因此深入理解及挖掘与镉抗性及吸附相关的基因,模拟微生物在镉离子条件下的分子进化,可在理论上帮助揭示微生物的抗镉机制,同时也为利用微生物在重金属修复相关应用技术的研发提供理论依据。
  本研究首先测定了镉离子对不同大肠杆菌亚种(BL21(DE3),JM109,DH5α,Top10和Mach)的最小抑制浓度(Minimum inhibition concentration,MIC值)。研究结果表明大肠杆菌不同亚种对镉离子的抗性明显不同,其中以大肠杆菌BL21(DE3)对镉离子的抗性最强。因此本研究选定BL21(DE3)为研究对象。通过构建菌株BL21(DE3)基因组的Fosmid文库,并对文库在镉压力条件下进行筛选,得到了四株对镉抗性显著提高的重组菌株。通过对这些菌株的重组质粒进行测序分析,发现每个质粒中的插入片段都包含一段位于九噬菌体DE3区的区段。我们通过对这一段区域的部分基因进行过表达并研究了其与镉抗性及镉吸附的相关性,最终发现了一个等电点较低的蛋白(CapB)。该蛋白在细胞体内可高效螯合镉离子,进而提高大肠杆菌的镉抗性。
  然而capB基因属于大肠杆菌的外源基因,我们更期望能够筛选到大肠杆菌自身与镉相关的基因,因此在实验室条件下利用基因组突变与筛选相结合连续进化的方法(Genome replication engineering assisted continuous evolution,GREACE),通过加速BL21(DE3)基因组的进化速度来驯化出高抗镉的大肠杆菌突变菌株。最终得到一株高抗镉的大肠杆菌突变菌株8mM-CRAA,其对镉的MIC值为8mM比野生型高8倍。随后利用Illumina测序平台将得到的高抗镉菌株分别进行了基因组重测序,发现与野生型菌株相比突变菌株8mM-CRAA的基因组上存在329个Singlenucleotide polymorphisms(SNPs)。通过将突变体8mM-CRAA基因组上的SNPs以及受镉离子胁迫的RNAseq数据进行综合分析,筛选出一些新的可能与镉抗性相关的基因。并对不同基因分别进行过表达初步发现基因htpX(编码热激蛋白)和gor(编码谷胱甘肽还原酶)与大肠杆菌的镉抗性相关。然后再分别将基因htpX和gor进行基因敲除进一步确定了其与镉离子的抗性密切相关。分别对基因htpX和gor中V16和G249位点进行定点突变,发现这些位点的突变可以影响重组菌株对镉离子的抗性。
  本研究在实验室条件下成功驯化出了高抗镉的大肠杆菌突变菌株,并发现了新的与大肠杆菌镉抗性相关的基因capB,htpX和gor,其完全不同于已报道的基因zntA(编码Zn2+/Cd2+/pd2+外排泵)的镉抗性机制。该研究加深了我们对于细菌抗镉机制的理解,同时也为抗镉微生物的应用研究提供了新的思路。
[硕士论文] 张雪
微生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:原油是我国主要的能源和化工原料,但超过2/3的原油残留在地下无法被有效开采。利用厌氧微生物,将残余原油转变为甲烷进行“生物气”开采,是近年国内外研究的前沿课题。石油烃作为原油的主要组分,其产甲烷降解过程是个多重互营代谢反应(包括石油烃的起始降解、中间代谢产物脂肪酸的氧化等),需要不同功能类型的细菌和产甲烷古菌的参与才能完成。互营代谢是石油烃降解产甲烷过程的限速步骤,由于互营微生物分离培养的难度极大,目前多采用未培养的微生物分子生态学手段,研究石油烃降解产甲烷过程中的功能微生物和产甲烷途径,但是互营烃降解菌等纯培养物的缺失,已经成为限制我们深入了解厌氧烃降解分子机理的“绊脚石”。
  传统互营菌分离技术的分离通量低,而且采用先富集培养,后分离的策略,难以定向分离。本文提出了先分开后培养的新思路,并据此开发出一种多孔板高通量分离技术。利用课题组多年富集的石油烃降解产甲烷菌系为接种物,分离石油烃降解产甲烷过程中的互营微生物等功能菌。取得的结果如下:
  (1)证实了不同温度条件下(25-55℃)的石油烃降解产甲烷菌系都具有互营短链脂肪酸(VFAs:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸)的降解代谢能力;不同温度和VFA富集获得的优势互营菌群不同,高温条件下获得的优势互营菌群主要有Tepidanaerobacter、Thermosyntropha、Thermotoga和Pelotomaculum,中温条件下获得的已知互营菌群为Tepidanaerobacter,低温条件下获得的优势互营菌群主要为Syntrophomonas。此外,通过VFAs富集培养,还发现了大量未培养微生物。
  (2)分离获得厌氧菌265株,其中分类地位明确的菌株共142株,分布于12个科13个属,包含具有互营乳酸代谢功能的Thermodesulfovibrio yellowstonii11株。剩余123株代表潜在新物种18个(16S rRNA基因相似度<97%)。
  (3)鉴定了一株来源于高温互营烃降解产甲烷菌系SK的厌氧发酵细菌SK-Y3T,革兰氏阳性,产芽孢的弯杆状细菌。最适生长条件为0%NaC1、50℃和pH7.0。利用木聚糖时产生木糖。主要的细胞脂肪酸为C150iso,C150anteiso和C170iso;基因组DNA G+C mol%为37.2%。根据生理生化和分子遗传学特征,提出新属新种Petroclostridium xylanilyticum gen.nov.sp.nov。依据SK-Y3T全基因组测序和分析,将clostrdial clusterⅢI划分为4个新属(Thermoclostridium gen.nov.、Hungateiclostridium gen.nov.、Ruminiclostridium gen.nov.、Pseudoclostridium gen.nov.和Petroclostridiun gen.nov.),并与Petroclostridium xylanilyticum gen.nov.一起,被归到一个新科Hungateclostridiaceae fam.nov.。
  (4)鉴定了一株来源于高温互营烃降解产甲烷菌系SK的产乙酸菌SK-G1T,革兰氏阴性,单端生鞭毛,呈不规则的短杆状,大小约0.3-0.5μm×1.5-3.0μm;最适生长条件为55℃,pH7.0-7.5;利用碳水化合物生长的主要发酵产物为乙酸;基因组DNA G+C mol%为43.9%;全基因组测序发现其具有完整的互营丁酸代谢途径。根据生理生化和分子遗传学特征,,将SK-G1T鉴定为新属新种,并命名为Biomaibacter acetigenes gen.nov.sp.nov.。进一步根据全基因组序列特征,提出了一个新科Biomabacteraceae fam.nov.。
[博士论文] 何青
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:细菌能准确感知周围环境条件如营养、压力、温度、渗透压、PH等的变化并能充分进行回应,这种能力对细菌的生存至关重要。而在这个过程中起重要的信号转导作用的是细菌的第二信使分子。近年来,环二核苷酸作为一类重要的第二信使分子被人们越来越广泛认知。研究发现细菌体内的环二核苷酸(c-di-GMP以及c-di-AMP)能调控包括细菌的移动性、毒性、细菌大小、细胞壁稳态以及生物被膜的形成等在内的许多细菌的生理活动,同时在感染宿主过程中能作为激活剂结合STING后诱导宿主Ⅰ型干扰素(IFNs)的应答。
  本论文第一部分主要对结核分枝杆菌中降解c-di-AMP的酶Rv2837c进行结构生物学以及生理生化酶活分析。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)属于革兰氏阳性菌,是引起结核病的胞内病原菌,结核病至今仍为世界上重要的传染病之一。到目前为止对于结核分枝杆菌的了解仍很有限,因此关于它的研究在结核病的预防以及治疗性疫苗的研发中非常重要。和一些革兰氏阳性病原菌相似,结核分枝杆菌胞内也存在c-di-AMP信号分子调控系统。CnpB(即Rv2837c)具有降解c-di-AMP的磷酸二酯酶活性,对结核分枝杆菌胞内c-di-AMP水平的稳定是必不可少的,同时cnpB的敲除菌株进行感染巨噬细胞及活体小鼠实验时,敲除菌株诱导巨噬细胞Ⅰ型干扰素的产生比野生型增强了十倍,且感染小鼠的毒性减弱。同时Rv2837c作为单DHH-DHHA1结构域蛋白,早在2012年就被报道作为NrnA家族蛋白可以发挥多种功能:既可以作为Orn同源类蛋白降解nanoRNA(RNA oligos<5nucleotides),又可以发挥CysQ功能将pAp去磷酸化生成AMP。Rv2837c对多种类型的底物都具有降解活性,且不同底物的降解速率不同。目前,Rv2837c对不同底物的具体降解机制并不清楚。论文本部分主要通过结构生物学、分子生物学及微生物学等多种实验方法结合来解释Rv2837c的降解机制。主要研究内容和结论如下:
  (一)解析得到2.0(A)的Rv2837c晶体结构,通过对结构进行分析比较以及突变体酶活测定确定了酶活反应需要两个锰离子参与。和其同源蛋白的多序列比对也表明两个锰参与降解反应的机制是普遍存在的。
  (二)解析得到2.3(A)的Rv2837c降解c-di-AMP反应中间态的Rv2837c/pApA复合物的晶体结构。pApA作为c-di-AMP降解的中间产物,同时也属于一类nanoRNA,这一复合物晶体结构的取得为Rv2837c降解nanoRNA类核苷酸小分子提供了准确、真实的降解模型。根据复合物结构以及生化数据提出了简单的Rv2837c水解磷酸二酯键的酶活反应机制。
  (三)测定了Rv2837c降解不同环二核苷酸(c-di-AMP、c-di-GMP、3,-5,cGAMP)以及线性二核昔酸(pGpG、pApA)的降解速率,明确了Rv2837c能特异识别并降解3'-5'磷酸二酯键。首次测定到Rv2837c能降解2'-5'cGAMP生成线性二核苷酸2'-5'-pGpA。
  (四)通过对c-di-AMP降解过程中底物及产物含量变化的实时检测,以及c-di-AMP与pApA的酶活米氏曲线的测定,并结合动力学公式计算,推导得出了Rv2837c降解c-di-AMP时需要第一步反应的中间产物pApA在蛋白内部进行翻转,接着在酶活中心进行第二步水解反应产生2个AMP。
  (五)在敲除MSMEG-2630的耻垢分枝杆菌中以及MG1655中分别过表达Rv2837c蛋白,诱导表达后测定胞内c-di-AMP或c-di-GMP浓度以及MG1655移动性,实验结果表明Rv2837c在体内能降解c-di-AMP和c-di-GMP,且能通过c-di-GMP水平调控细菌的移动性。通过细菌体内实验以及对结核分枝杆菌基因组分析,推测Rv2837c在M.tuberculosis中可能参与调控c-di-AMP、c-di-GMP两条信号通路。
  本论文第二部分主要对铜绿假单胞菌c-di-GMP调控的转录因子BrlR的晶体结构以及生理功能进行了研究。铜绿假单胞菌为革兰氏阴性菌,是医院内感染常见的条件致病菌,在烧伤菌血症感染、泌尿道感染、肺部感染及术后伤口感染中都是重要的感染来源,且这些感染是无法根除的。铜绿假单胞菌能引起诸多类型的感染主要依赖于它强大的毒力因子系统。而在临床抗感染治疗困难的主要原因在于铜绿假单胞菌能对多种抗生素产生耐药性。铜绿假单胞菌基因PA4878编码的蛋白BrlR,同源性分析表明属于MerR家族蛋白,仅在细菌生物被膜时表达且与生物被膜的耐药性相关基因的表达调控有关。随后的研究表明BrlR蛋白能结合并调控自身启动子以及mexA,mexE启动子激活外排泵的表达来增强细菌的耐药性,但是作为MerR家族蛋白却不受外排药物分子激活,而是受到c-di-GMP的结合调控,且与c-di-GMP结合比例为2∶1。最初想通过结构解析来了解c-di-GMP与BrlR的结合机制,但随着研究的深入,发现BrlR是一个复杂的转录调控因子,受多种信号通路的调控。主要研究内容和结论如下:
  (一)解析得到3.1(A)的BrlR晶体结构,通过结构比较发现BrlR蛋白三个独立的结构域在拓扑结构上与同源蛋白相比非常保守,但N端与C端的相对位置发生了改变。且同源蛋白一般为二聚体形式并以二聚体发挥功能,而BrlR相比同源蛋白形成了不同的自我封闭式的四聚体构型。
  (二)BrlR独特的四聚体构型导致其N端HTH结构域大部分被四聚体中另一亚基的C端结构域堵塞,这预示着BrlR蛋白结合DNA的能力应该很弱。随后通过FP实验以及EMSA实验验证了体外时BrlR对DNA的弱结合。
  (三)解析得到2.5(A)的BrlR/c-di-GMP复合物晶体结构,发现BrlR的DNA结合结构域有两个c-di-GMP结合位点。通过相关突变体生化实验,确定BrlR蛋白确实存在两个c-di-GMP结合位点,且两个结合位点都有助于c-di-GMP促进BrlR-DNA的结合。
  (四)对结构进行分析比较发现BrlR的C端存在保守的药物结合口袋,尤其与同源蛋白SAV2435的拓扑结构非常相似,且BrlR蛋白以及BrlR的C端结构域(BrlR-C)都能结合EB分子,经过与SAV2435/RH6G复合物晶体结构比对以及相关突变体EB染色分析,确定了BrlR-C具有结合多种药物分子的能力。利用SPR筛选结合的药物分子,最终确定BrlR能特异性结合妥布霉素和庆大霉素等氨基糖苷类抗生素。
  (五)由BrlR结合的药物分子构型,以及它可以结合EB等颜色小分子,推测其可能结合铜绿自身分泌的染料分子绿脓菌素(PYO)。通过SPR实验进行验证发现BrlR结合PYO的能力比结合妥布霉素及庆大霉素都高。经过多种晶体条件筛选,最终解析了1.4(A)的BrlR-C与PYO类似物的复合物结构。通过结构解析发现吩嗪环分子并不在经典的结合口袋而是位于紧邻其上方新的结合位置。这一新的结合位置更有利于PYO促进BrlR与DNA的结合,最终通过EMSA以及RT-PCR实验确定了BrlR蛋白也是受绿脓菌素调控的转录调节因子。首次表明铜绿假单胞菌的抗药性与自身毒力因子之间有联系。
[博士论文] 刘军峰
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:细胞分裂是所有细胞生命体的重要生命过程。在细菌中,细胞分裂过程主要由FtsZ和FtsA(MreB)介导,其中FtsZ和FtsA分别是真核生物微管蛋白和肌动蛋白的同源蛋白;FtsA可以帮助FtsZ在即将发生分裂的细胞中间位置形成收缩环,随后有超过20种蛋白在收缩环处组装形成分裂体,同时收缩环提供收缩力,最终将两个姊妹细胞分离开来。
  在真核生物中,细胞分裂的起始是由肌动蛋白和肌球蛋白在即将发生分裂的细胞分裂沟处形成收缩环,收缩环的收缩将细胞分成了两大部分,此时的姊妹细胞仍由细胞间桥和中间体连接;最后ESCRT-Ⅲ蛋白复合物被招募到中间体处,并对中间体一端的细胞膜进行切割,最终两个姊妹细胞完成分离。
  在古菌中,截至目前的研究证明至少存在三种细胞分裂方式:在广古菌(Euryarchaeota)和纳古菌(Nanoarchaeota)中,利用基于FtsZ的类似细菌的细胞分裂方式;在包含绝大多数泉古菌在内的TACK[奇古菌(Thaumarchaeota)、曙古菌(Aigarchaeota)、泉古菌(Crenarchaeota)和古古菌(Korarchaeota)]和Asgard[洛基古菌(Lokiarchaeota)、托尔古菌(Thorarchaeota)、奥丁古菌(Odinarchaeota)和海姆达尔古菌(Heimdallarchaeota)]中,利用类似真核生物的ESCRT-Ⅲ分裂机器的细胞分裂方式;在泉古菌的热变形菌目(Thermoproteales)中,利用基于古菌肌动蛋白(Crenactin)的细胞分裂方式。
  硫化叶菌细胞利用类似真核生物的ESCRT-Ⅲ分裂机器进行细胞分裂,它包含三个蛋白CdvA、ESCRT-Ⅲ(CdvB)和Vps4(CdvC);其中CdvA是古菌特有的一个蛋白,ESCRT-Ⅲ和Vps4分别是真核生物ESCRT-Ⅲ和Vps4的同源蛋白。与真核生物类似,硫化叶菌细胞中也含有多个ESCRT-Ⅲ蛋白。除了ESCRT-Ⅲ,硫化叶菌细胞同时编码另外三个ESCRT-Ⅲ的同源蛋白,分别命名为ESCRT-Ⅲ-1(CdvB1)、ESCRT-Ⅲ-2(CdvB2)和ESCRT-Ⅲ-3(CdvB3)。这三个ESCRT-Ⅲ同源蛋白是否参与到细胞分裂过程,以及包括CdvA、ESCRT-Ⅲ在内的参与细胞分裂的蛋白它们具体在细胞分裂过程的哪一阶段发挥作用都还不清楚。本文在冰岛硫化叶菌(Sulfolobusislandicus)细胞中,利用遗传学和细胞学等方法,分析鉴定了这些ESCRT-Ⅲ同源蛋白的功能,并对这些参细胞分裂过程的蛋白进行了功能定位。
  发现ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2能够定位在即将发生分裂的细胞中间形成带状(环状)结构,并且随着细胞分裂过程的进行,这些带状结构会逐渐发生收缩,说明ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2直接参与到细胞分裂过程,而ESCRT-Ⅲ-3在细胞中呈相对均一、弥散的分布,说明ESCRT-Ⅲ-3在细胞分裂过程不发挥作用;与它们发挥的功能相对应,escrt-Ⅲ-1和escrt-Ⅲ-2对冰岛硫化叶菌细胞是必需的,而escrt-Ⅲ-3是非必需的,敲除escrt-Ⅲ-3对细胞的生长和形态没有显著影响。
  分析了冰岛硫化叶菌细胞中这些参与细胞分裂过程蛋白的相互作用网络,基于这个蛋白相互作用网络和对这些蛋白二级结构的分析,构建了它们的C-端缺失突变体,以阻断这些蛋白间的相互作用。通过在冰岛硫化叶菌细胞中过表达这些突变体,证明这些蛋白分别在细胞分裂过程的不同阶段发挥重要的作用,这些结果对于阐明硫化叶菌细胞分裂的具体过程具有重要的意义。另外引人关注的是,在过表达ESCRT-Ⅲ-2蛋白C-端缺失突变体的细胞中观察到了类似真核生物细胞分裂后期的细胞间桥和中间体的结构,这是迄今为止在古菌细胞中第一次观察到这样的结构,这些结果进一步说明了硫化叶菌细胞可能采用了类似真核生物的细胞分裂机制,同时也增加了古菌和真核生物细胞所具有的新的共同特点。
  在真核生物中,ESCRT-Ⅲ蛋白除了在细胞分裂过程发挥重要作用,它们还在其它很多过程发挥功能,例如膜包被病毒的出芽过程。Sulfolobus tengchongensis spindle virus2(STSV2)是从中国云南腾冲热泉中分离的一种膜包被的单尾梭状病毒,它可以在硫化叶菌细胞中长时间的培养,并且在不同的压力条件下尚未发现STSV2能够裂解宿主细胞,因此它是古菌中研究病毒与宿主关系的一个理想的模式病毒。在本文的研究工作中,在感染STSV2的冰岛硫化叶菌野生型菌株REY15A中观察到了出芽的现象,同时发现ESCRT-Ⅲ-3能够定位在出芽位置;而在感染STSV2的△escrt-Ⅲ-3菌株中则观察不到出芽现象,这说明ESCRT-Ⅲ-3在由感染STSV2引起的出芽过程中发挥重要功能。另外,发现ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2也能够定位在出芽位置,说明ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2也可能参与到出芽过程。真核生物HIV-1、流感病毒以及埃博拉病毒等膜包被病毒一般也都采用出芽的方式从宿主细胞表面释放,ESCRT-Ⅲ蛋白在这些病毒的出芽释放过程中起到了重要的作用。我们的研究结果说明STSV2采用了类似真核生物膜包被病毒的出芽过程从宿主细胞表面释放的机制,在这个过程中ESCRT-Ⅲ蛋白发挥了重要的作用。
  现在越来越多的比较基因组学及系统进化分析数据支持真核生物的古菌起源学说,但其中最大的不足是它们缺少实验证据的支持。我们的研究结果从实验层面上支持了真核生物古菌起源的进化学说,在进化上具有重要的意义;同时也可为研究真核生物细胞分裂和膜包被病毒的出芽过程提供一定的参考,也有可能为将来在辅助治疗人类HIV-1、流感病毒以及埃博拉病毒方面提供一定的帮助。
[硕士论文] 魏清伟
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)是生物浸矿应用中最为重要的微生物之一,A.ferrooxidans对多种重金属都具有很高的耐受能力。通过研究其重金属抗性机制,对深入了解微生物细胞维持体内重金属平衡的机理非常重要。
  目前,A.ferrooxidans铜、镉代谢机理的遗传学研究报道还比较少。A.ferrooxidans中许多与金属抗性相关基因的研究大多集中于生物信息学预测,缺乏相应的实验数据支持,因而我们在A.ferrooxidans全基因组注释信息中挑选了三个与金属抗性相关的基因,分析了其氨基酸序列信息,同时分别构建了这些基因的过表达菌株,为探究这些基因的具体生物学功能提供实验数据支持。研究工作主要有以下几个方面:
  1、本实验室从甘肃省兰州市七里河区阿干镇煤矿收集酸性矿坑废水分离纯化得到一株A.ferrooxidans L1,革兰氏阴性菌,短杆状;该菌株以Fe2+为能源物质,且具有较高的硫氧化活性,其生长曲线特征显示延滞期较长,约43h,稳定期约14h;生长70h后进入衰亡期;通过驯化试验,该菌株对不同重金属离子显示出不同的耐受能力:在相同培养条件下,Cu2+、Cd2+对A.ferrooxidans L1生长的抑制作用大小为Cu2+>Cd2+,最高耐受浓度分别是0.04mol/L和0.08mol/L。
  2、运用生物信息学在线分析软件对基因编码的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能结构域、系统发育以及可能参与的代谢通路等进行了预测。推测AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495这三种蛋白均分布在胞外或细胞膜上,参与金属离子的吸附转运等机制。
  3、为探究A.ferrooxidans中AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495的功能特性,以本实验室分离鉴定的A.ferrooxidans L1为材料,采用PCR扩增技术克隆了afe-1948、afe-1862、afe-RS11495基因。将其转化E.coli BL21(DE3),通过SDS-PAGE分析,确定其在大肠杆菌中的最佳表达条件。
  4、为了进一步地了解这三个基因的功能,采用过表达分析的方法考察了其转入受体菌之后的抗性的变化。结果表明:在不同浓度Cu2+、Cd2+胁迫下,E.coli BL21导入目的基因后,相对于对照组,菌体的生物量明显下降,说明其抗性下降,但是其胞内目的蛋白的含量却有所增加,推测是由于导入目的基因后胞内重金属的含量明显上升导致的。
[硕士论文] 景艳军
生物化学与分子生物学 兰州理工大学 2017(学位年度)
摘要:嗜酸氧化亚铁硫杆菌是一种应用性很强的工业微生物菌种,鉴于其较好的重金属抗性,可用于贵金属的浸提、环境污染的治理等领域。铁氧还蛋白作为一种广泛存在并参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌新陈代谢过程诸如铁硫簇组装等重要环节的蛋白质,研究其结构和功能对了解嗜酸氧化亚铁硫杆菌的代谢过程、电子传递及重金属抗性具有重要意义。本研究的内容和结果如下:
  (1)从甘肃省兰州市、白银市和陇南市3个典型矿区采集的样品中分离出四株嗜酸氧化亚铁硫杆菌,一株氧化亚铁钩端螺旋菌。选取生长周期短、菌体富集量大的菌株BYSW1进行后续的研究。首先选取温度、pH值、接种量、能源种类利用单因素实验对其生长条件进行优化。在pH为2,于30℃下接种10%的菌液,BYSW1生长最好,葡萄糖和蛋白胨会明显抑制其生长。
  (2)在NCBI数据库中找出铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ),在BYSW1中扩增出目的片段,连接到pET-32(a),转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)DH5α。自BYSW1扩增出的铁氧还蛋白基因序列(fdⅠ、fdⅡ)与数据库汇总的序列一致性分别为83.92%和85.59%,编码的蛋白与数据库中的序列一致性分别为89.47%和85.59%。
  (3)重组的质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。选取温度、时间、IPTG浓度进行单因素实验,优化重组蛋白的表达条件,并用蛋白质印记法进行验证。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。FdⅠ和FdⅡ分别在25℃下加入0.5mM IPTG诱导6h、25℃下加入0.3mM IPTG诱导6 h表达效果最佳。FdⅠ和FdⅡ分别可用100mM咪唑和50mM咪唑自亲和柱中洗脱下来。
  (4)挑取五种重金属(Cd2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+),对其重金属抗性进行研究;对重金属(Cu2+和Cd2+)驯化前后的嗜酸氧化亚铁硫杆菌的菌体形态和基因组变化、重组蛋白表达差异、宿主菌体的生长情况进行了研究。结果表明:BYSW1具有较强的重金属抗性,分别在0.04mol/L Cd2+、0.04mol/L Cu2+、0.15mol/L Mn2+、0.08mol/L Ni2+和0.08mol/L Zn2+存在时生长良好,但是高浓度(大于0.04mol/L)的Cu2+和Cd2+会明显抑制BYSW1的生长。Cu2+和Cd2+胁迫后,BYSW1的菌体细胞明显变小,且表面粗糙,但基因组仍然能保持完整。不同浓度、不同种类的重金属胁迫前后,铁氧还蛋白的表达存在显著差异,且Cd2+对嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长的影响比Cu2+显著;不同浓度、不同种类的重金属对于重组蛋白的表达宿主菌体生长影响不同,0.25mM的Cu2+和Cd2+能明显抑制宿主菌体的生长。
[硕士论文] 张永利
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌因其多种优越的性能而被研究者关注。本研究首先从奶制品中分离乳酸菌,并根据乳酸菌的菌落形态特征、过氧化氢酶接触试验以及革兰氏染色试验对乳酸菌进行初步鉴定。再利用16S rDNA序列分析、生理生化特性以及碳水化合物发酵试验进行进一步鉴定。然后通过人工胃液耐受力、胆盐耐受力以及粘附能力试验进行益生性乳酸菌的初步筛选。最后用筛选的6株乳酸杆菌灌胃小鼠,LPS/D-GalN诱导小鼠急性肝损伤,通过观察小鼠的体重、肝脏的病理变化及重量,检测小鼠外周血以及肝脏中AST与ALT的分泌量,肝脏与小肠中TNF-α与IL-6的表达量,研究这6株乳酸杆菌对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的保护效果。
  本研究主要内容包括:⑴从奶制品中共分离出107株乳酸菌,属于17个种。其中乳酸杆菌71株属于9个种,乳酸球菌36株属于8个种:Lactobacillus brevis、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillu helveticus、Lactobacillusplantarum subsp.argentoratensis、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillusdiolivorans、Pediococcus pentosaceus、 Enterococcus faecalis、Leuconostocmesenteroides、Pediococcus acidilactici、Pediococcus.sp、Enterococcus.sp、Lactococcus.sp、Leuconostoc.sp。这17种乳酸菌中有88.3%为同型发酵乳酸菌,11.7%为异型发酵乳酸菌,部分菌株可以在低pH、高盐、低温、高温的条件下生长。⑵对139株乳酸菌进行耐人工胃液(pH=3.0)、耐胆盐以及粘附Caco-2细胞的试验,共筛选出6株具有较强耐受和粘附能力的的乳酸杆菌,它们分别是: L.paracasei subsp.paracasei WXD5、L.casei SXJ30、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD55、 L.plantarum subsp.argentoratenis WXD100、 L.subsp.argentoratenis WXD106、L.plantarum subsp.argentoratenis WXD101。⑶研究WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30这6株乳酸菌对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤保护作用。⑷结果显示,与模型组相比,灌胃乳酸菌WXD5、WXD55、WXD100、WXD101、WXD106、SXJ30的小鼠肝脏病变程度得到不同程度的缓解,AST、ALT、IL-6以及TNF-α因子的表达量也显著下降,且以灌胃乳酸菌WXD5保护效果最为明显,可以为急性肝损伤的研究提供技术支持与理论依据。
[硕士论文] 修磊
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸菌胞外多糖(Lactic acid bacteria exopolysaccharide,LAB EPS)具有多种生物活性,对其研究与开发具有重要的实际意义与良好的应用前景。本研究以实验室保存鉴定的乳酸菌为出发菌株,筛选能够增强细胞免疫活性的乳酸菌EPS,随后将其进行分离纯化及结构初步鉴定,在此基础上探讨其对免疫细胞活性及机体特异性免疫应答的影响。
  本研究主要内容包括:⑴对实验室保存鉴定的110株乳酸杆菌所产EPS进行测定,筛选10株高产EPS乳酸杆菌,其中Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS可以增强巨噬细胞增殖、吞噬以及NO释放能力。⑵将上述Lactobacillus harbinensis TCP086、Lactobacillus kefiri SXJ29和Lactobacillus casei SXJ30所产EPS经过DEAE-Sepharose Fast Flow和SepharoseCL-6B色谱柱进行分离纯化后获得主要均一组分:TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS。紫外光谱和红外光谱扫描发现三种EPS均不含核酸和蛋白质,且均具有多糖的特征吸收峰,存在α型吡喃糖环构型;多角度激光光散射仪检测其分子量分别为4.908×104 Da、3.423×104 Da和3.737×104 Da;离子色谱检测单糖组成发现,三种EPS均由氨基葡萄糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖以及葡萄糖醛酸等7种单糖组成,其中TCP086 EPS各主要组分摩尔比氨基葡萄糖∶氨基半乳糖∶甘露糖∶葡萄糖醛酸约为2.6∶1.6∶1.2∶1; SXJ29 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基半乳糖∶氨基葡萄糖约为3.1∶1∶1;SXJ30 EPS各主要组分摩尔比葡萄糖∶氨基葡萄糖∶甘露糖约为1.4∶1.1∶1。⑶以纯化的TCP086 EPS、SXJ29 EPS和SXJ30 EPS刺激巨噬细胞,对其增殖能力、吞噬中性红能力、NO释放能力、细胞因子分泌以及表面分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达进行检测后发现,巨噬细胞的免疫增强活性与EPS的浓度呈正相关,且SXJ30 EPS对巨噬细胞的免疫增强活性最强。⑷在体外成功利用IL-4和GM-CSF诱导获得小鼠骨髓来源树突状细胞,显微镜下观察SXJ30 EPS刺激小鼠BMDCs后,细胞突起增多,体积增大;流式细胞术和ELISA法检测后发现,SXJ30 EPS能显著增强小鼠BMDCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达以及细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12)的分泌。⑸将SXJ30 EPS与OVA抗原免疫小鼠,发现SXJ30 EPS可以显著提高小鼠脾脏DCs表面CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达量;与铝盐(Alum)佐剂相比,SXJ30 EPS可以显著提高小鼠血清中OVA特异性IgG抗体以及IgG抗体亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的滴度;此外,SXJ30 EPS还能显著促进脾脏T淋巴细胞增殖以及INF-γ和IL-4的分泌;显著提高脾脏IL-4+ CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞以及IFN-γ+ CD8+T细胞的比例,与Alum佐剂相比差异显著。
[硕士论文] 马力群
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是能够高效发酵合成聚-γ-谷氨酸的生产菌,不同Mn2+浓度可以影响地衣芽孢杆菌产聚-γ-谷氨酸的构型。目前关于该菌产不同构型的γ-聚-D-PGA(γ-D-PGA)机理方面的研究还不是很透彻。围绕三个L-谷氨酸和D-谷氨酸代谢关键酶,分别为谷氨酸消旋酶(GR)、D-丙氨酸转氨酶(D-DDT)和谷氨酰胺合成酶(GS),以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH-2为对照菌株,通过体内体外酶学性质研究、结合基因转录水平术等功能基因组学分析手段,初步阐明了不同Mn2+浓度对地衣芽孢杆菌产不同聚-γ-谷氨酸的机理。
  本文分析比较了不同Mn2+浓度对B.licheniformis和S. subtilis产聚-γ-谷氨酸的构型变化。其中对比菌株B.subtilis KH-2,在含有不同的Mn2+浓度(0,0.6,1.2,1.8和2.4 mmol/L)的发酵液中,γ-D-PGA所占的比例稳定(84%-86%),而不同Mn2+浓度下,B.licheniforms WBL-3产γ-L-PGA和γ-D-PGA的比例明显不同。Mn2+浓度为0时,γ-D-PGA仅占22%,当Mn2+浓度为0.6 mmol/L时,γ-D-PGA构型所占的比例最高,达到67%,继续提高Mn2+浓度,发酵液中γ-D-PGA所在的比例出现降低的趋势。
  比较两菌三个L-谷氨酸和D-谷氨酸代谢关键酶在Mn2+浓度为0与0.6 mmol/L的体外酶学性质。B. subtilis KH-2中Mn2+并未对三种代谢关键酶起到激活作用,而对于B.licheniformis WBL-3 Mn2+对GR起到一定的促进作用,催化效率Kcat/Km值(18.12±2.90)高于(14.61±2.60)。只有在Mn2+存在时才检测到GS的活性,由于GS催化L-谷氨酸生成L-谷氨酰胺,而GR催化L-谷氨酸转化生成D-谷氨酸,因此,在Mn2+存在下,体系中L-谷氨酸积累减少,而D-谷氨酸积累增加,导致发酵液中γ-D-PGA所占的比例增加。
  检测谷氨酰胺合成酶体内酶活。通过HPLC对B.licheniformis WBL-3菌体破碎粗酶液中的GS进行检测。在未添加Mn2+的反应液中未检测到谷氨酰胺的生成,而Mn2+存在的反应液中,则检测到0.71 mmol/L的谷氨酰胺生成。以上结果与体内酶活实验吻合,近一步说明了B.licheniformis WBL-3菌体内积累的L-谷氨酸浓度降低,使得γ-D-PGA比例增加。
  实时荧光定量PCR分别检测了B.licheniformis中合成γ-D-PGA相关基因(谷氨酸消旋酶编码基因racE、D-丙氨酸转氨酶编码基因dat和谷氨酰胺合成酶编码基因gltA)体内转录水平,结果显示,在Mn2+作用下racE转录水平是无Mn2+的2.16倍,dat的转录水平是无Mn2+的4.44倍,gltA的转录水平是无Mn2+的1.84倍。由此可见,B.licheniformis WBL-3中L-谷氨酸代谢基因和D-谷氨酸合成基因的转录水平在Mn2+存在条件下均高于无Mn2+,进一步证实了Mn2+的存在,使得体系中D-谷氨酸积累增加,导致发酵液中γ-D-PGA所占的比例增加。
[硕士论文] 陈璐
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种对植物生长及人体健康有着重大危害作用的真菌。误食被黄曲霉污染的食物会出现发热、倦怠和厌食症、腹痛、呕吐、肝炎等慢性肝中毒的症状,长期便会引发肝癌。中国作为粮食生产的大国,所以研究在种植、贮存及运输中,预防黄曲霉污染带来的经济损失与食品安全等问题,具有重要的意义。实验室从南海海绵中筛选出多株黄曲霉拮抗菌株,本论文对其中拮抗活性最强的菌株CL展开研究,取得以下结果:
  从CL的培养特征、形态特征、生理生化和16S rDNA序列分析等方面对该细菌进行鉴定,确定其为芽孢杆菌属,与Bacillus velezensis strain YK50亲缘关系最近,达到99%,命名为Bacillus velezensis strain CL。
  用响应面分析法优化了Bacillus velezensis strain CL产抑菌活性物质的发酵条件,以单因素实验结果为依据进行P-B设计,确定了接种量、初始pH和培养温度为影响抑菌活性物质产量的主要因素;设计最陡爬坡实验确定最佳实验中心点;通过B-B实验,最终确定最适培养条件为:初始pH5.5、接种量3%、培养温度24℃、80mL/250mL装液量,培养时间为96 h。优化的培养基为50 g/L葡萄糖、25 g/L酵母浸粉。在最优条件下,抑菌圈直径的预计值为3.23 cm,实际值达到3.2±0.13 cm,与推理值相符性达到96.23%,Bacillus velezensis strain CL产抑菌活性物质抑菌活性较原发酵培养基提高了52.38%。
  抑菌活性物质特性试验:
  温度稳定性:Bacillus velezensis strain CL所产抑菌活性物质在4℃与37℃处理时,其抑菌活性保持率可以达到90%以上,经-20℃处理其抑菌活性保持率明显降低,只有56%的抑菌活性,而经55℃处理后抑菌活性保持率降至38%,一旦超过80℃将完全丧失抑菌活性。
  pH稳定性:Bacillus velezensis strain CL的抑菌活性物质分别经pH2-8条件下都能保持稳定,其抑菌活性保持率都能达到85%以上,而在pH10的条件下处理10 h,其抑菌活性有所降低,降至56%。
  光辐射:Bacillus velezensis strain CL所产的抑菌活性物质在紫外稳定性并不强,当紫外照射剂量达到54 K,Bacillus velezensis strain CL抑菌活性保持率降低到32%;Bacillus velezensis strain CL的抑菌活性物质具有稳定的光照稳定性,在光照条件下照射10 d Bacillus velezensis strain CL的抑菌活性保持率始终保持在98%以上。
  遗传性能:Bacillus velezensis strain CL的遗传性能相当稳定,连续传8代其所产的抑黄曲霉菌的能力没有下降,其抑菌活性保持率始终在99%以上。
  Bacillus velezensis strain CL抑菌活性物质的组分分析,CL产的的抑菌活性物质为小分子蛋白类。通过透析法发现Bacillus velezensis strain CL产的的抑菌活性物质分子量大于2 KDa小于3.5 KDa,对滤膜及超滤膜有很强的吸附性。Bacillus velezensis strain CL所产的抑菌活性物质可以抑制黄曲霉孢子的萌发。而且Bacillus velezensis strain CL基因组中含有的抑菌活性物质编码基因,扩增出3个基因序列分别为bamD、bacD与bacAB。其中bacD与 bacAB基因编码的抑菌活性物质为 bacilysin, bamD基因编码的抑菌活性物质是bacillomycin。
[硕士论文] 李娟
微生物学 兰州交通大学 2017(学位年度)
摘要:抗生素的过量使用和滥用导致大量耐药菌的出现,特别是超级耐药菌的出现,对人类健康造成严重的威胁。寻找新的更为安全高效的抗生素,以及不易产生细菌耐药性的抗生素替代物,对于保障人类健康,以及健康食品生产和动物养殖具有重要意义和迫切需求。抗菌肽类物质是天然抗菌物质,具有稳定性好、无毒副作用、不会出现细菌耐药性等突出优点,也具有替代某些抗生素的潜力。因此,本项研究的目的是利用基因工程的方法,构建人工合成抗菌肽和抗菌酶基因的重组表达质粒,将重组质粒导入毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中进行异源表达,获得了酵母表达的抗菌肽和抗菌酶,旨在为抗菌肽类物质的实际应用提供技术资料。本论文报道了几种抗菌肽类物质和具有抗菌作用的葡萄氧化酶的酵母异源表达的主要研究结果。
  1、构建了对革兰氏阴性菌有很好抗性的抗菌肽AP基因重组表达载体pPICAP,将其导入毕赤酵母SMD1168中,获得了抗E.coli的毕赤酵母菌株AP26,该菌株在培养的72 h时抑菌活性最高,之后抑菌活性降低,表明72 h时抗菌肽AP的表达量最高。进一步研究表明,在培养的72h后,重组菌抑菌活性降低是因为发生了质粒的丢失。LC-MS结果表明重组菌株正确表达了抗菌肽AP。对菌株AP26进行了亚硝基胍(NTG)诱变,筛选到了抗菌肽AP表达量最高的诱变菌株APmu4,其抗菌肽AP最高生物效价达到1.7×109 U/L。对影响抗菌肽AP表达量的因素进行了研究,发现pH为7.5、接种量为50g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AP的表达量。
  2、构建了具有广谱抗菌活性的抗菌肽AB基因的重组载体pPICAB,将其导入到毕赤酵母SMD1168菌株中,获得分泌表达抗菌肽AB的毕赤酵母菌株,该重组菌株对E.coti有抗性,LC-MS结果表明该菌株正确表达了抗菌肽AB。对重组菌株进行了NTG诱变,筛选到超量表达抗菌肽AB的诱变菌株ABN97。为了进一步提高诱变菌株抗菌肽AB表达量,构建了颤藻血红蛋白基因vgb的重组载体,将其导入到菌株ABN97中,筛选出了抑菌效果最好的菌株ABN97vgb,抗菌肽AB生物效价达到4.53×108 U/L。对影响抗菌肽AB表达量的因素进行了研究,发现pH为6.0、接种量为50 g/L、盐浓度较高的YDFMY培养基、酵母提取物能够提高抗菌肽AB的表达量,最高表达量提高了14倍。
  3、构建了对革兰氏阳性菌有良好抑菌活性的抗菌肽菌丝霉素Plectasin基因重组质粒pPICPle,将其导入毕赤酵母并成功异源表达抗菌肽Plectasin。对重组菌株进行NTG诱变并筛选得到高效表达Plectasin的诱变菌株Ple100,其Plectasin的表达量提高了1.93倍。对影响菌株Ple100 Plectasin表达量的因素进行研究,结果表明盐浓度较高的YDFMY培养基和酵母提取物能提高菌株Plectasin表达量。
  4、构建了抗菌肽PSI基因的整合型载体pLACPSI和游离型载体pKDUPSI,将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,筛选到分泌表达抗菌肽PSI的重组菌株。对重组菌株发酵液中抗菌肽PSI进行硫酸铵沉淀法和阳离子交换柱纯化,SDS-PAGE检测验证了抗菌肽PSI。对重组菌株产抗菌肽PSI的发酵条件进行优化,结果表明中性或偏碱性、酵母提取物和盐度较高的YDFMY培养基更有利于抗菌肽PSI的表达。纯化的抗菌肽PSI对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、三线镰刀菌(Fusarfum tricinctum)、链格孢菌(Alternaria alternata)、灰霉菌(Botrytis cinerea)、平头炭疽(Colletotrichumtruncatum)有抗性。水果保鲜实验表明纯化后的抗菌肽PSI也具有开发为新型果蔬保鲜剂的潜力。
  5、构建了葡萄糖氧化酶(GOX)基因的整合型载体pLACGOX和游离型载体pKDUGOX,成功将其导入到乳酸克鲁维酵母K1SEL1基因突变型菌株中,获得了一株能超量分泌表达GOX的乳酸克鲁维酵母菌株,其GOX最大表达量为70±7 kU/L,SDS-PAGE检测验证了GOX正确表达。研究了影响GOX酶活的因素,结果表明pH4件下GOX酶活最高,温度为37℃时GOX稳定,YPGal培养基中的高盐浓度对GOX有抑制作用。
[硕士论文] 付宇婷
微生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起哺乳动物感染的关键病原菌之一,易侵入乳腺组织诱发乳腺炎。乳腺炎对人畜造成的负面影响极大,影响乳品的质与量。乳蛋白是乳品重要的组成成分,乳腺上皮细胞中氨基酸的种类、含量直接影响其合成,氨基酸代谢是影响乳蛋白合成的重要因素。细菌侵袭乳腺上皮细胞会影响乳蛋白的合成与分泌,但对于氨基酸代谢的影响与机制目前还不清楚。
  本研究以人乳腺上皮细胞MCF-10A为模型,利用金黄色葡萄球菌(ATCC27543)侵袭细胞,检测宿主细胞六种氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白的表达情况。六种酶包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和谷氨酸脱羧酶(GAD),分别涉及转氨、脱氨、联合脱氨和脱羧等过程。首先,利用金黄色葡萄球菌侵袭细胞,qPCR检测细胞中氨基酸代谢关键酶基因及β-酪蛋白基因的表达,ELISA检测细胞内外相关基因产物的合成与分泌,westernblot检测mTORC1信号通路活性;其次,用肽聚糖刺激人乳腺上皮细胞,同样用qPCR和ELISA方法检测氨基酸代谢关键酶基因及其产物的表达与分泌,western blot检测mTORC1通路及几种转录因子活性;最后,在前两部分实验的基础上探究mTORC1信号通路对相关转录因子活性和氨基酸代谢关键酶表达的调控作用。通过特异性抑制剂Rapamycin及RNA干扰技术降低mTORC1活性,检测金黄色葡萄球菌侵袭与非侵袭条件下氨基酸代谢关键酶及β-酪蛋白基因及其产物的表达变化,并检测几种可能同氨基酸代谢相关的转录因子的活性变化。结果表明:⑴金黄色葡萄球菌能侵入体外培养的人乳腺上皮细胞内,随着侵袭过程的进行,细胞内氨基酸代谢关键酶含量呈先上升而后下降的趋势,细菌侵袭8h后,β-酪蛋白的合成量与分泌量显著下降(p<0.001)。同时,细菌侵袭过程中mTOR信号通路的活性也呈现先上升而后下降的趋势;⑵肽聚糖刺激MCF-10A细胞,诱导细胞内氨基酸代谢关键酶表达,含量显著上升(p<0.001),而对β-酪蛋白的合成与分泌没有显著影响(p>0.05)。同时mTOR信号通路和几种转录因子的活性增强;⑶Rapamycin能够显著抑制上述细菌侵袭和肽聚糖刺激对氨基酸代谢关键酶基因的诱导表达(p<0.01),导致氨基酸代谢关键酶在细胞内的含量显著下降(p<0.01),β-酪蛋白的合成与分泌也受到抑制(p<0.01),mTORC1信号通路和相关转录因子的活性均有不同程度的下降;⑷通过靶向siRNA沉默mTORC1关键组分Raptor编码基因,进而抑制mTORC1信号通路,所得结果与上述Rapamycin处理结果一致,印证了mTORC1信号通路对氨基酸代谢关键酶和β-酪蛋白的合成与分泌具有调控作用。
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