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[硕士论文] 张宇
遗传学 天津大学 2015(学位年度)
摘要:CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region-related)多肽激素是近十年来研究最热的植物多肽激素,也是迄今为止最大的植物多肽分子家族,主要通过编码一小段分泌蛋白来参与细胞间的信号转导,进而在植物生长发育过程中维持干细胞增殖与分化间的平衡,特别是在茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM)、根尖分生组织(root apical meristem,RAM)以及原形成层(procambium)等组织的发育调控中起着关键的作用。尽管CLE基因家族在拟南芥和水稻等模式植物中已有一定的研究,但在木本模式植物杨树与肉果类模式植物番茄中,有关CLE多肽基因家族的研究尚属空白。
  本文以模式植物杨树和番茄作为研究对象,利用拟南芥全部32个CLE基因的序列在Phytozome等数据库中进行基因的检索与挖掘,共获得50个杨树CLE候选基因(PtCLE)和15个番茄CLE候选基因(SlCLE)。随后利用生物信息学手段,分别对杨树和番茄的CLE基因进行了基因理化性质分析、信号肽预测、基因结构分析、染色体定位、多序列比对、蛋白全长和CLE12肽进化树的构建、上游调控区顺式作用元件的查找以及表达热图谱的绘制等。在杨树中,本文还挑选出了3个与AtCLV3同源,6个与AtCLE41/44同源的杨树CLE基因,对这9个PtCLE基因进行了克隆与表达载体的构建等,并通过实时定量PCR技术对其组织特异性的表达进行了验证。在番茄中,本文对全部15个番茄CLE基因进行了实时定量组织特异性表达验证,并挑选出了3个特异性表达的基因SlCLE10、12和13。对上述3个SlCLE基因的CLE12肽进行人工合成后,通过体外添加多肽的方法来处理番茄,发现这3种12肽均能抑制番茄主根的伸长,其中SlCLE12对根的抑制作用最为明显,而且在下胚轴伴有花青素的大量积累。
  本文利用生物信息学、比较基因组学等方法,首次对杨树和番茄这两种模式植物的CLE基因家族进行了鉴定与分析,是对植物信号转导过程研究的重要补充。同时,本文也为对木本模式植物维管组织形成与发育的研究,以及对肉果类模式植物果实发育与成熟的研究等提供了重要的理论依据。
[硕士论文] 雷天宇
数学 河北联合大学 2015(学位年度)
摘要:植物基因组进化的重要特征之一就是发生了广泛的基因组多倍化事件。在已经测序的植物基因组中研究发现其在进化过程中均受到多倍化的影响。理清植物基因组的结构和进化过程对于深入认识植物基因组的功能和相关生物学过程都具有十分重要的科学意义和潜在的经济价值。
  准确判别基因组染色体同源片段是基因组研究工作的基础,也是整个研究工作中极为重要的一步。然而,由于基因组的复杂性,对基因组染色体同源片段的判别需要一定的时间和精力投入,尤其是现有的方法和软件不能快速、准确地判别基因组染色体同源片段,所以论文旨在结合已有的生物知识,总结归纳了现有对禾本科植物和棉花的基因组倍增事件的研究理论,将具体的生物实际问题转化为数学问题,建立数学模型,改进 Smith-Waterman动态规划算法,设计合理的算法,为判别多基因组染色体同源片段提供了理论基础;采用 C#语言编写程序,开发了一个灵活、通用性强、有与用户交互的界面的软件,以设计好的算法来量化每一个可能为同源片段的基因;在水稻(Oryza sativa)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、二穗短柄草(Brachypodium)四种禾本科植物的基因组序列上,实际应用设计的算法和编写的程序,准确、有效地判断出2092-14227个基因组内(间)共线基因(表1),60-468个基因组内(间)同源基因区域(表2),并进一步以高粱基因组序列为参照进行了多重序列比对分析(图15);对棉花(Gossypium)的基因组序列进行了同源片段判别分析,依据结果建立了三种数学模型假设,并用计算机模拟验证,得出了棉花与可可基因组分化后,最为可能发生了五倍化事件的结论。
  论文研究成果将有力支持今后的基因组研究工作,并为基因组染色体同源片段的判别提供方法和工具。
[硕士论文] 徐惠娟
植物学 安徽师范大学 2014(学位年度)
摘要:转录因子T-bet(T-box expressed in T cells)是T-box基因家族的新型转录因子,含530个氨基酸,其中有一个189个氨基酸组成的能与T盒DNA结合的结构域。人与小鼠的TBX21基因(编码T-bet)具有88%的同源性。T-bet在原初 T细胞向Th1方向分化时具有重要的作用。T-bet作为Th1细胞的谱系限定转录因子,对于Th1细胞的分化及稳定起了非常重要的作用。同时T-bet又能通过抑制其他细胞亚型的细胞因子的表达从而抑制其分化。Th1细胞也称为炎症性 T细胞,介导并参与细胞内病毒和局部炎症有关的免疫应答,参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的形成,目前报道与多种自身免疫疾病相关,尤其与人类的自身免疫病多发性硬化症有关。本文主要通过小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建和对 T-bet转录因子的筛选,为了解 T-bet在其引起Th1等辅助T细胞介导的自身免疫疾病中的信号转导及转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路提供了方向。研究结果如下:
  1.本研究构建了小鼠 T-bet基因启动子区和非编码保守序列(No-coding conserved sequence, CNS)萤火虫荧光素酶报告基因载体,与转染空质粒pGL4.10组相比,293T细胞(P=0.0122)和Jurkat细胞(P=0.0022)中转染 pGL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中pGL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性。
  2.用人的848个转录因子表达质粒pLenti6.2/V5-DEST-TFs与T-bet启动子荧光素酶重组质粒共转染293T细胞,筛选到可能调控 T-bet转录的转录因子有16个。其中EBF、PJA1、CEBPE、SSX2特异与CNS作用影响T-bet的转录。
  有报道EBF敲除的淋巴细胞中GATA3的表达上调,然而EBF是通过何种方式下调GATA3的表达并不清楚。此外,有报道称而GATA3与T-bet相互抑制表达。而我们的实验结果表明 EBF上调了 T-bet的表达。因此,我们猜想EBF可能通过抑制了GATA3的表达从而促进了T-bet的表达。这为进一步研究T-bet在其引起Th1等辅助T细胞介导的自身免疫疾病中的信号转导及转录调控机制提供了方向。
[硕士论文] 王元丽
水生生物学 暨南大学 2014(学位年度)
摘要:类波氏真眼点藻(Eustigmatos cf.polyphem)属于异鞭藻门(Heterokontophyta)真眼点藻纲(Eustigmatophyceae),是一种土壤黄绿色单细胞微藻。前期研究证实,该藻能合成多不饱和脂肪酸、β-胡萝卜素和金藻昆布糖等高附加值生物活性物质,特别是在氮限制培养后期能大量积累储藏性油脂,是一株具有生物产品和生物燃料开发潜能的微藻。本文以类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)为研究材料,克隆藻细胞TAG合成途径中二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT)基因的cDNA全长序列,通过外源表达确定基因的具体功能,探讨类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)在氮限制培养时TAG积累过程中DGAT的转录水平表达情况,了解类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)中TAG合成代谢的分子机理与调控机制,为微藻生物能源的开发提供一定的理论依据。研究结果如下:
  (1)利用RACE技术扩增得到类波氏真眼点藻(E.cf.polyphem)二酰甘油酰基转移酶基因EcfpDGATb的cDNA全长序列2347 bp,同时分别得到EcfpDGATa和EcfpDGATc的3’ cDNA序列309 bp和480 bp。
  (2)DNA序列分析发现EcfpDGATb全长cDNA含有23 bp5’和338 bp3’非翻译区(Untranslated Regions,UTR)序列,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)1986 bp,编码661个氨基酸;该蛋白质N端具有43个氨基酸长度的预测信号肽和9个预测跨膜区,结构域中包含6个II型DGAT的保守基序,说明EcfpDGATb可能属于编码II型DGAT的基因家族成员。
  (3)EcfpDGATb的异源表达证实其能使TAG合成缺陷酵母菌株恢复部分的油滴积累能力,并偏好于利用16C不饱和与18C脂肪酸合成TAG,说明EcfpDGATb参与TAG的生物合成过程。
  (4)EcfpDGATb的mRNA相对表达量在两种硝酸钠浓度培养条件下都呈现先上升后下降的趋势,在高氮组(18 mmol/L NaNO3)中培养36 h时达到最高相对表达量,低氮组(6 mmol/L NaNO3)在96 h达到最高,表明EcfpDGATb mRNA水平的表达对氮限制有一定的响应。
[硕士论文] 杨仕鑫
生物化学与分子生物学 电子科技大学 2015(学位年度)
摘要:随着一系列序列特异性核酸酶例如 ZFN、TALEN以及 CRISPR/Cas9等的出现,基因组定向修饰技术发展的越来越快。它们可以通过目标基因组特定位点的高效特异性剪切,诱导实现DNA双链断裂,引发错配修复的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复或者精确的同源重组修复(homologous recombination,HR),从而实现针对特定位点的基因修饰。目前,已经有多种检测基因组定向修饰的方法被开发出来。最常用的方法包括基于异源双链的分析法(SURVEYOR、CEL-I或T7E1分析法等)、聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析法和高分辨率融解曲线分析法等。
  然而,目前检测基因组定向修饰的方法在使用中有很多局限性。它们或者需要在定向修饰位点处存在合适的酶切位点,或者无法产生可用于测序的突变DNA片段,或者无法区分异源多倍体动植物中天然存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点。因此寻找更适用的定向修饰位点检测方法具有十分重要的意义。本研究将传统的单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分型法应用于定向修饰检测当中,旨在得到一种更佳的基因组定向修饰检测手段。
  SSCP分析是一种简单、灵敏的点突变检测方法。它的基本原理是利用单链DNA序列中碱基的变化来改变单链 DNA特定的构象,引发其在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率发生变化。因此我们可以通过电泳产生的不同带型来区分野生型和突变型的DNA单链。
  本研究中,我们通过对SSCP分型法的胶浓度、胶配比、电泳电压、电泳时间等主要实验条件进行摸索和优化,建立了一套基于SSCP分型法检测植物基因组定向修饰位点的检测体系,并对该体系的重复性、灵敏度和检出效率等影响因素进行了分析。实验结果表明利用该体系进行目标位点系列突变模型检测时具有很好的可重复性和较高的分辨率,对于仅有一个碱基突变的序列也可以很好地进行分辨。影响检出效率的因素主要是扩增检测片段的长度以及突变位点在扩增片段中的位置等。本研究还针对水稻内源基因定向修饰位点进行了SSCP分型法分析。研究选取了OsDEP1、OsYSA2和OsROC5三个水稻内源基因修饰位点进行分析,分别对其原生质体样品和稳定转化突变体单株样品进行了SSCP分型。实验结果表明在原生质体样品中,SSCP分型法仅对转化效率较高的OsDEP1实现了基因分型;对OsDEP1、OsYSA2和OsROC5三个位点稳定转化产生的T0代突变体单株均实现了高效的基因分型,而且还可以很好的区分不同基因定向突变类型。
[硕士论文] 霍智慧
遗传学 哈尔滨师范大学 2015(学位年度)
摘要:CAMTA1是一类钙调素结合蛋白,对植物抵抗非生物胁迫及自身的生长发育具有重要作用。本研究从紫花苜蓿中克隆得到MsCAMTA1基因,将其连至过表达载体pCBM和敲除载体pYLCRISPR/Cas9-DH,并对紫花苜蓿进行遗传转化,为研究MsCAMTA1基因的功能奠定基础。主要研究结果如下:
  1.MsCAMTA1基因的克隆与序列分析
  利用RT-PCR法克隆获得MsCAMTA1基因。序列分析结果显示,MsCAMTA1基因共有3123个核苷酸,编码1040个氨基酸,包含有CG-1结构域、TIG结构域、ANK重复和IQ基序。同蒺藜苜蓿MtCAMTA1蛋白的氨基酸序列比对发现,MsCAMTA1的氨基酸序列含有32处突变,包括插入、缺失和替换。
  2.pCBM-MsCMATA1和pYLCRISPR/Cas9-MsCMATA1植物表达载体的构建
  构建了pCBM-MsCMATA1植物基因过表达载体,带有CaMV35S启动子调控的MsCAMTA1基因,以Bar基因为筛选标记基因;
  构建了pYLCRISPR/Cas9-MsCMATA1植物基因敲除表达载体,带有三个可以碱基互补配对结合MsCAMTA1基因的靶点,以潮霉素抗性基因为筛选标记基因。
  3.MsCAMTA1基因对苜蓿的遗传转化
  (1)确定了苜蓿子叶节与下胚轴对草铵膦和潮霉素的筛选压力
  将子叶节与下胚轴分别放置于添加不同浓度草铵膦或潮霉素的诱导培养基上。子叶节草铵膦的筛选浓度为0.5 mg/L,下胚轴草铵膦筛选浓度为4 mg/L;子叶节潮霉素筛选浓度为20 mg/L,下胚轴潮霉素筛选浓度为5 mg/L。
  (2)对苜蓿子叶节和下胚轴外植体进行转化
  以紫花苜蓿子叶节为外植体,以1 mg/L6-BA的MS培养基为诱导培养基,添加100μmol/L乙酰丁香酮(AS),预培养3 d,OD600为0.4~0.6农杆菌侵染20 min,共培养3-5 d,液体培养基洗涤除菌,进行筛选培养,同时向培养基中添加500 mg/L头孢抑制农杆菌;诱导的抗性不定芽移至0.5 mg/L6-BA的MS培养基进行伸长,伸长的不定芽切下插入1/2 MS中生根。通过该法累计侵染约600个苜蓿子叶节,共获得转化过表达MsCAMTA1的草铵膦抗性植株13株;转化敲除MsCAMTA1基因的潮霉素抗性植株8株。
  以紫花苜蓿下胚轴为外植体,5倍稀释OD600为0.6~0.8的农杆菌菌液侵染10 min,置于含2,4-D2 mg/L、KT0.25 mg/L、酸水解酪蛋白2 g/L的MS培养基共培养2 d,液体培养基除菌后,在原培养基成分基础上添加500 mg/L头孢和相应的筛选剂,筛选诱导愈伤组织;抗性愈伤移至6-BA0.5 mg/L、NAA0.05 mg/L的愈伤分化培养基中继续筛选,胚状芽形成后进入无筛选压力的1/2MS中生根。通过该方法累计侵染约300个下胚轴外植体,获得MsCAMTA1过表达草铵膦抗性植株7株;MsCAMTA1基因敲除的潮霉素抗性植株6株。
[硕士论文] 孟红恩
生物学 新疆大学 2016(学位年度)
摘要:在植物界广泛存在的金属硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是一类可与金属离子结合的、富含半胱氨酸残基(10-30%)的小分子蛋白,可以被众多非生物因素诱导产生,其所具有的强烈的清除自由基和结合重金属离子的能力使其成为植物研究的热点。盐穗木(Halostachys caspica)金属硫蛋白HcMT含有78个氨基酸,其中半胱氨酸数量为14个,理论分子量为7.70 kD,理论等电点为5.05。生物信息学分析结果显示,HcMT符合典型的植物Type2型MT序列特征,通过MEGA4.0系统进化树分析与其它一些Type2型MT进化起源表明,其和海蓬子(Salicornia brachiata)的亲缘关系较近,氨基酸相似性达93%。
  为研究HcMT的功能活性,将HcMT基因亚克隆至pGEX-6p-2原核表达载体上,在大肠杆菌BL21中表达,分离纯化融白蛋白GST-HcMT,通过原子吸收分光光度法测定GST-HcMT结合金属离子的量以判断其与金属离子的结合能力。结果显示,诱导表达的GST-HcMT分子量在34 kD左右,与预期一致,且通过Western blot进一步得到验证;诱导的同时添加金属离子,分离纯化GST-HcMT与金属离子复合物后,原子吸收结果表明其具有结合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的能力,结合量分别是对照的25倍、10倍、4倍和2倍,结合能力大小依次是:Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。同时发现,工程菌pGEX-6p-2-HcMT/BL21具有耐受H2O2、NaHCO3、Na2CO3的能力。将其亚克隆至pET32a原核表达载体,E.coli BL21表达后分离纯化融合蛋白TrxA-HcMT,Western blot鉴定其活性。采取与GST-HcMT相同的研究策略,发现TrxA-HcMT与GST-HcMT相比可以特异性的结合更多的金属离子,如Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+、Pb2+、Zn2+、Hg2+。在Cd2+、Cu2+、Zn2+胁迫下,含pET32a-HcMT/BL21的工程菌繁殖速度明显优于含pET32a/BL21的工程菌。GST-HcMT与TrxA-HcMT的这种差异,可能与标签蛋白中半胱氨酸残基含量相关。
  为初步探索HcMT工业化生产的可行性,通过单因素实验及20 L发酵罐放大培养优化了影响转盐穗木金属硫蛋白大肠杆菌发酵培养基的成分及其它因素。优化培养基为:每900 mL培养基含蔗糖4 g,酵母浸粉24 g,蛋白胨8 g;每100 mL磷酸缓冲液含KH2PO42.31g、K2HPO4?3H2O12.54 g,两部分分别灭菌后混合。蛋白表达条件为:乳糖6 mmol/L,诱导4 h。通过20 L发酵罐发酵培养,可使菌体量达到2.68 g/L,比摇瓶培养提高了31%,每克干重菌体结合的铜离子达到315.3 mg,比摇瓶培养提高了69%,适宜放大培养。
  为进一步研究HcMT基因的功能活性及其应用于植物修复的可行性,将HcMT构建至pCAMBIA1301植物表达载体,通过EHA105农杆菌介导浸染烟草。基因组PCR鉴定筛选到转pCAMBIA1301-HcMT烟草阳性植株,转HcMT基因烟草的各种非生物胁迫耐受性以及对不同金属离子的富集情况有待于进一步的研究。
[硕士论文] 李宁
生物化学与分子生物学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)作为植物体内最重要的植物激素之一,参与调控了植物多种生长和发育过程,如种子成熟、种子萌发、幼苗生长、气孔运动以及开花等。此外,ABA在植物响应外界各种环境胁迫的过程中也扮演着非常重要的角色,被称为逆境激素。
  目前最为认可的ABA信号转导通路含有三种核心组分:ABA受体PYR/PYL/RCAR蛋白、负调控因子2C类蛋白磷酸酶(PP2C)和正调控因子 SNF1相关蛋白激酶2(SnRK2),它们组成一个双重负调控系统来控制ABA信号的转导。本实验以拟南芥为研究材料,通过用NaCl、甘露醇、ABA等处理超表达株系、突变体和野生型幼苗来研究AtPSL4的功能。研究结果和主要结论如下:
  (1)通过对GENEVESTIGATOR和Arabidopsis eFP Browser数据库的检索,结合本实验室之前iTRAQ数据的结果,鉴定出潜在的响应盐胁迫的候选基因,并最终选择了AtPSL4作为研究对象开展下一步实验。AtPSL4基因编码一个类葡萄糖苷酶IIβ亚基,其CDS全长包括1944个碱基,编码一条647个氨基酸的多肽链。通过与拟南芥及其他物种比对分析,发现AtPSL4进化非常保守,且无旁系同源基因,其N端存在信号肽和PRKCSH-like结构域,C端存在内质网滞留信号和PRKCSH_1结构域。
  (2)通过萌发时野生型和AtPSL4超表达对盐、甘露醇的响应分析,发现AtPSL4超表达株系的萌发速率明显高于野生型;萌发后,AtPSL4超表达株系的幼苗子叶变绿的速度也快于野生型。说明AtPSL4正调控萌发和萌发后幼苗的生长。
  (3)通过高通量数据和qRT-PCR的方法对AtPSL4的表达模式进行分析,发现AtPSL4存在一定的组织表达特异性,其中在根中的表达量最多,在花中几乎不表达;另外, AtPSL4受ABA诱导明显上调,而受盐、甘露醇等的影响较小。
  (4)通过构建PSL4与GFP的融合蛋白载体,进行烟草瞬时侵染,发现PSL4定位于内质网。片段缺失实验表明N端信号信号肽在其定位中发挥重要功能。
  (5)利用多效唑作为赤霉素合成的抑制剂,发现AtPSL4超表达株系萌发速度依旧高于野生型。同时,用qRT-PCR检测了赤霉素合成代谢及响应的marker基因的表达量,发现AtPSL4超表达株系和野生型没有明显差别,表明AtPSL4未参与到赤霉素信号通路中,暗示它可能参与了ABA信号转导过程。
  (6)当存在ABA时,AtPSL4超表达株系的萌发速度高于野生型,且随着ABA浓度的升高,差异越来越明显。利用qRT-PCR检测了ABA信号通路marker基因的表达量,发现ABI3、ABI4、ABI5、RD29A等在AtPSL4超表达中表达量明显下降,而PYL/PYRs、PP2Cs、SnRKs的表达量未表现差异,说明AtPSL4参与了ABA信号转导过程,且可能在SnRKs下游、ABI5上游发挥功能。
  (7)利用酵母双杂实验检测了 PSL4与CaM2.1、CaM4.1、CaM6、CaM7的互作情况,发现它们并不互作;利用qRT-PCR检测了ABA处理条件下CaMs的表达量,发现没有明显差异,说明AtPSL4未参与到钙调蛋白介导的ABA通路中。
  (8)通过酵母双杂和BiFC实验发现PSL4和SnRK2.2、SnRK2.3、SnRK2.6互作,与ABA受体不互作,表明其可能在SnRKs下游发挥功能。
[硕士论文] 刘世宏
遗传学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:多倍化对促进植物进化和植物基因组重组做出了突出贡献。多倍化现象普遍存在,约35%的维管植物,即15%的开花植物以及30%的蕨类植物,是在新物种产生时就已经具备了多倍性,这也表明多倍性与物种形成有重要联系。有些学者认为同源多倍体是进化的“死胡同”,因为同源多倍体的基因被大量的重复序列所遮蔽而导致基因的有效选择性降低。但也有学者认为植物的同源多倍化过程会影响减数分裂时期同源染色体的正常配对和分离,提高了基因重组频率,促进了遗传多样性。与异源多倍体相比,关于同源多倍体基因组结构变异的研究仍然较少。
  在目前有限的研究资料中,关于同源多倍体与其祖先二倍体之间具有怎样的进化联系、由于多倍化的发生导致植物基因组结构变异的程度如何,以及对多倍体本身造成的影响我们仍不是十分清楚。
  因此,本研究中,利用两代不同生态型(Col、Ler、Ws)拟南芥二倍体、同源四倍体,以及以Col型拟南芥同源四倍体为母本、二倍体为父本杂交形成的三倍体为材料,通过AFLP分子标记技术横向和纵向比较不同生态型、不同倍性、不同世代拟南芥的基因组结构变异,然后对产生的特异条带进行克隆、测序、生物信息学分析,并对测序得到的相关基因的表达量进行半定量分析。结果如下:
  1、以Col型同源四倍体拟南芥作为母本,二倍体作为父本,杂交获得三倍体植株。
  2、通过AFLP技术分析不同倍性拟南芥,即Col型二倍体、同源三倍体以及同源四倍体基因组结构,结果表明,与二倍体亲本相比,同源多倍化导致了同源多倍体基因组结构的变异,且三倍体的基因组结构变异程度大于同源四倍体。
  3、通过AFLP技术分析三种不同生态型的不同倍性拟南芥,即Col型、Ler型和Ws型二倍体及其同源四倍体基因组结构,结果表明,在不同生态型条件下,同源多倍化均导致了基因组结构的变异;且在产生的差异性条带中,同源四倍体相较二倍体丢失的条带数多于新增的条带数。
  4、通过AFLP技术分析不同世代的Ws型拟南芥二倍体及其同源四倍体发现,相邻世代的多倍体基因组结构没有发生明显的变异,这暗示着基因组结构变异可能主要发生在第一代加倍后产生的同源四倍体拟南芥中;而后来随着世代遗传,虽然基因组结构并不是一成不变的,但是发生的基因组结构变异速度却很可能大大减慢了。
  5、通过对三种突变体( Spoll-1、 Dmc1、Prd1)在不同倍性(2x、4x)条件下与野生型拟南芥相比的研究中,证明了在四倍体倍性条件下产生的差异率(差异条带/总条带)略大于二倍体,但差异率的变化幅度不大且并没有成倍数增长,暗示了同源多倍体化后的多倍体基因组可能会对基因突变造成的的基因组结构变异产生一定的缓冲作用。
  6、通过对产生的特异性条带进行回收、克隆、测序和生物信息学分析发现,多倍化导致基因组结构变异的位点在基因间和基因内都存在。
  7、通过半定量分析与多倍化导致基因组结构变异相关的15个不同基因表达量发现,基因的表达量发生了改变,且改变的方向不同,表达量上调、下调和不变的现象均存在。
  实验结果表明,同源多倍化引起了基因组结构变异和基因表达量的变化。本实验为进一步研究同源多倍体基因组结构进化提供了理论基础。
[硕士论文] 张春青
细胞生物学 山东农业大学 2016(学位年度)
摘要:拟南芥CDE基因家族包含5个基因(CDE1,At1g10410;CDE2,At1g13970;CDE3, At1g59650;CDE4,At3g29180;CDE5,At5g39430),都包含DUF1336结构域,属于DUF1336基因家族。DUF1336基因家族共包含15个基因。目前对拟南芥DUF1336家族基因的研究较少,仅有关于EDR2的报导,该基因与拟南芥对白粉病的抗性有关。
  课题对拟南芥CDE家族基因进行了相关研究,主要结果如下:
  课题对DUF1336基因家族的生物信息学信息进行了分析。对DUF1336基因家族所表达蛋白质的序列进行比对分析,发现该家族基因产生的蛋白质依据其结构可以分为三类,一类包含PH结构域、START结构域和DUF1336结构域,一类基本只包含DUF1336结构域,最后一类包含DUF1336结构域和N端的一段肽链,CDE基因家族属于最后一类。通过基因序列的比对分析发现 DUF1336家族基因为植物特异。多物种 DNA序列比对分析发现进化中较早产生的植物中不含DUF1336家族基因,而在被子植物中,许多物种也没有DUF1336家族基因。除此之外,还对CDE基因家族的蛋白质结构使用相关软件进行了预测。蛋白质跨膜性预测分析显示CDE基因家族表达的蛋白质为非跨膜蛋白。
  对CDE家族基因的相关突变体进行研究,转录组学数据(AtGenExpress Visualization Tool, http://www.arabidopsis.org/)显示胁迫处理会使CDE家族基因的表达水平发生明显变化,但对CDE1、CDE4的缺失突变体和野生型对照进行氯化钠处理和甘露醇处理,结果没有发现突变体有明显的表型。
  在拟南芥生长的幼苗时期(7d),有莲座叶但抽薹前和植株成熟时(产生成熟果荚)这三个时期对拟南芥各个部位进行半定量RT-PCR和GUS染色,用来分析拟南芥CDE家族基因的表达模式。半定量RT-PCR的结果显示:CDE1,CDE2,CDE3,CDE4在拟南芥幼苗时期根中的表达量高于地上部,在成熟植株中根、茎、花器官中表达量较高, CDE2,CDE4在花粉中的表达明显高于其它部位;CDE5全程未检测到基因表达。GUS染色分析显示:CDE基因家族5个基因的表达有差异,但很多地方相似,CDE1,CDE2, CDE3,CDE4在拟南芥营养生长时期集中在根尖,地上部气孔、叶脉中表达,生殖生长时期地上部集中在花器官中表达;CDE5表达量较少,且该基因与气孔关系密切;同时实验中发现CDE4的GUS材料在受到机械损伤时会在附近产生较多的GUS信号,表明CDE家族基因可能与机械损伤和胁迫相关。
  课题通过对DUF1336基因家族生物信息学信息的分析,CDE家族基因相关突变体的研究,半定量 RT-PCR及 GUS染色分析 CDE基因家族表达模式这些实验,获得了CDE基因家族的一些基础性信息,为以后对CDE基因家族功能的研究提供了基础。
[硕士论文] 王欢
植物学 河南大学 2016(学位年度)
摘要:盐胁迫严重影响植物生长发育和粮食产量,盐胁迫下细胞内活性氧(ROS)大量生成,超氧阴离子(O2.-)是ROS的最初生成形式,在植物生命活动中有独特的作用,但是目前 O2.-研究的一个重要瓶颈缺乏体内精确检测 O2.-的方法。因此,在植物体内检测O2.-的方法的建立和应用,对深入研究植物响应盐胁迫的生长和发育具有重要意义。Ca2+也参与了植物的盐胁迫应答过程,细胞内 Ca2+信号如何与 O2.-共同调节盐胁迫下植物的生长仍需深入研究。
  利用动物细胞中的O2.-特异指示剂cpYFP,通过改造使其定位于不同的亚细胞器,转基因筛选获得稳定遗传转基因植株。本课题组前期工作对胞质、叶绿体和线粒体等不同亚细胞定位的转基因材料进行分析检测,结果发现:在正常生理状态下,仅线粒体定位cpYFP(MCP)转基因植株细胞内有较强的荧光信号。本研究利用MCP研究了盐胁迫下,根细胞和叶肉细胞线粒体中O2.-的动态变化和产生机制,并对其在盐胁迫应答中的功能做了初步的分析。另外,利用定位于线粒体的Ca2+指示剂Yc3.6(m),研究Ca2+参与在 NaCl诱导线粒体中 O2.-产生过程中的作用。结果显示,盐处理可快速诱导拟南芥根尖和叶肉细胞原生质体线粒体O2.-的产生、累积,并在一定的NaCl浓度范围内,MCP荧光强度的变化是和NaCl的浓度正相关。使用Antimycin A(电子传递链复合体Ⅲ抑制剂)处理叶肉细胞原生质体后,NaCl诱导的线粒体荧光增强的效应被显著抑制。将MCP与胞质定位抗坏血酸过氧化物基因突变体 apx1和线粒体定位谷胱甘肽过氧化物酶基因突变体gpx3缺失突变体杂交,检测发现:当NaCl处理apx1MCP和gpx3MCP时,NaCl诱导的线粒体O2.-荧光强度均高于MCP本身对照。通过qPCR检测了ETC抑制剂对盐处理后抗氧化酶编码基因的表达,结果发现,在Antimycin A处理后GPX3表达量减少。外源150 mmol/L NaCl处理可以迅速诱导根尖线粒体内Ca2+浓度升高,且Ca2+螯合剂能抑制NaCl诱导O2.-的产生。而Antimycin A处理Yc3.6(m)后,NaCl诱导根尖线粒体内Ca2+浓度升高不受抑制。
  综上所述,本研究深入解析线粒体O2.-在盐胁迫等刺激下的动态变化、产生机制,有助于我们理解植物对盐胁迫等刺激的应答机制,为抗逆作物培育提供理论依据。
[博士论文] 李之勇
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2013(学位年度)
摘要:植物的生长发育与所在环境紧密相关,各种环境因素直接影响着植物的生长发育,这些因素如高盐、干旱、高温、冻害等。这些不利的环境条件严重影响了我国的农作物生长和农业生产。为了应对和适应这些不利的环境条件,植物内部自我进化发展形成了一系列的防御体系和应对措施,这其中有许多非生物胁迫应答基因的参与这一系列过程的调控。随着基因组测序技术和基因功能研究方法的不断发展和完善,许多与生物胁迫相关的基因逐步被人们所发现。例如有多个高盐,干旱和低温等逆境胁迫应答基因在非生物胁迫中行使的功能并已经被鉴定了他们在非生物胁迫中行使的功能,还将他们应用到作物改良中并取得了一定的成果并将他们应用到作物改良中,但仍有很多非生物胁迫相关的基因需要进行克隆鉴定。本研究主要内容是从大豆、拟南芥中分离两个蛋白激酶和一个大豆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因(CalcineurinB-likeprotein,CBL),以及用不同的遗传学方法分析了它们在响应逆境胁迫、调节植物生长发育等方面的功能。
  1,CBL基因家族广泛地参与植物非生物胁迫信号的应答,它们在多种植物中被克隆和报道,但在大豆中这类基因的研究尚未有报道。本研究克隆了大豆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因GmCBL1,研究表明,GmCBL1受到多种非生物胁迫和植物激素的诱导表达。GmCBL1氨基酸结构包含保守的豆蔻酰化位点和四个EF手型结构,同源比较显示它与拟南芥中AtCBL1同源性最高。亚细胞定位显示该基因定位在细胞膜上。过表达GmCBL1显著提高了转基因拟南芥的多种抗性,包括耐盐性和抗旱性。分子生物学分析表明GmCBL1过表达显著上调了多个非生物胁迫应答基因的表达。此外,过表达GmCBL1还促进了在光照条件下拟南芥下胚轴的伸长。进一步分析显示,GmCBL1的过表达提高了赤霉素合成相关基因的表达,表明GmCBL1可能参与了赤霉素和光介导的下胚轴的生长发育信号途径。
  2,本研究克隆了一个大豆蛋白激酶基因GmPK12,氨基酸序列分析显示该基因编码一个典型的蛋白激酶。它的表达受多种非生物胁迫和植物激素的诱导,用GmPK12-GFP融合蛋白将GmPK12定位在拟南芥叶片原生质体的质膜和细胞核中,GmPK12的启动子驱动β-葡糖醛酸酶基因(GUS)的表达主要分布在拟南芥植株的根尖分生组织、茎维管束系统、叶脉等。过表达GmPK12显著提高了转基因拟南芥和烟草的多种非生物胁迫抗性,包括耐盐性,抗寒性等;另外也提高了转基因植物种子的萌发能力。此外,过表达该基因也显著提高了小麦的抗逆性。分子生物学实验检测分析表明GmPK12过表达显著上调了多个非生物胁迫应答基因的表达。
  3,本研究分析了拟南芥中一个与植物抗逆相关的蛋白激酶AtBSK5,是油菜素内酯信号通路的成分之一。与GmPK12不一样的是,AtBSK5定位在植物细胞的细胞膜上,在细胞核内未观察到有它的表达。研究表明AtBSK5也受到多种非生物胁迫和植物激素的诱导表达。反向遗传学实验研究表明,AtBSK5突变造成了种子萌发和后期生长发育对盐和ABA都非常敏感。AtBSK5的突变引起的盐敏感有相当一部分是源于体内ABA合成上调,同时分子生物学研究表明AtBSK5的突变引起了多个ABA合成基因的表达变化。
  本研究克隆三个来自大豆和拟南芥中与逆境胁迫相关的基因,并分析了它们的生物学功能,这些研究结果可能为改善作物耐盐、抗旱性、耐低温等植物抗性提供基因资源和理论依据。
[硕士论文] 刘超
生物化学与分子生物学 石河子大学 2013(学位年度)
摘要:天山雪莲(SaussureainvolucrataKar.etKir)是具有代表性的高寒多年生植物。它具有很强的抗氧化和清除自由基的能力以适应极端环境。我们从天山雪莲cDNA文库中分别克隆到一种新的硫氧还蛋白和类萌发素蛋白基因,命名为SikTrxh和SikGLP。分别对这两类基因进行生物信息学分析和Realtime-PCR分析后构建植物过表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化烟草,对转基因烟草进行低温、干旱等逆境胁迫,通过生理指标的测定和形态的观察,分析转基因烟草的抗逆性。结果如下:
  对天山雪莲硫氧还蛋白基因SikTrxh的生物信息学分析表明,该基因cDNA全长565bp,包含一个长为354bp的开放阅读框(ORF),编码117个氨基酸,分子量为12.97kDa,理论等电点是5.34,属于硫氧还蛋白家族,并且是不含有信号肽定位于细胞质的亲水性蛋白,多序列比对发现保守性较高。Realtime-PCR检测表明,SikTrxh基因受低温、干旱、MV和NaCl胁迫诱导表达,在植物抗逆过程中发挥作用。通过构建植物过表达载体转化烟草,利用RT-PCR方法鉴定阳性植株,组培快繁获得转基因株系,进行低温、干旱、高温和NaCl胁迫,并对其生理指标和部分抗氧化酶活性进行测定。结果显示,逆境胁迫下MDA含量和REL均升高,但野生型上升幅度明显高于转基因型;转基因型PSⅡ光抑制程度低于野生型;抗氧化物酶类SOD、APX和CAT酶活性均高于野生型。这说明转SikTrxh烟草能降低ROS的毒害作用,保护质膜系统,增强了植物对逆境的抵抗能力。
  对天山雪莲类萌发素蛋白基因SikGLP的生物信息学分析表明,该基因包含1个633bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸。SikGLP分子量为21.6kDa,理论等电点是6.81,属于cupin家族蛋白,并且是具有信号肽的疏水性蛋白。氨基酸多序列比对发现GLP序列保守性较高,具有的GLP的典型特征。16个物种间的系统发育树可以看出与葡萄GLP进化关系最近。Realtime-PCR检测表明,SikGLP基因受低温、甲基紫精和PEG诱导表达,可能在胁迫初期对提高植物防御起作用。通过构建植物过表达载体转化烟草,利用RT-PCR方法鉴定阳性植株,组培快繁获得转基因株系,进行低温、干旱和NaCl胁迫实验,结果表明,转SikGLP基因烟草在逆境胁迫下未表现出较强的抗性,推测是作为受体参与植物的生理反应。
[博士论文] 陈利红
生物化学与分子生物学 华中科技大学 2013(学位年度)
摘要:促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases,MAP激酶,MAPK)级联途径是真核生物信号传递网络中的重要途径之一。该途径由3类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MAPKKK-MAPKK-MAPK家族组成,它们通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子。这些蛋白质参与了细胞生长、增殖、分化、生存、发育和抵御低温、高热、氧化胁迫、紫外辐射、干旱及病原菌侵害等多种信号转导过程。过去已经对模式植物拟南芥和水稻的MAPK、MAPKK基因家族的成员进行了系统的研究,然而对禾本科新型模式植物二穗短柄草这两个家族成员的系统研究还未见报道。二穗短柄草为一年生杂草,基因组小(272Mbp)、生长条件要求简单、植株矮小、生活周期短、自花授粉、易于培养和转化。近年来,随着二穗短柄草(Bd21)测序工作的完成,为其进行全基因组分析MAPK级联途径的家族成员提供了可能。
  本研究根据植物MAPK和MAPKK基因的保守性从二穗短柄草中分离了16个MAPK和12个MAPKK基因。对这两个基因家族成员的命名、分类、系统进化、蛋白保守基序、染色体分布、基因复制、基因结构、启动子区、与水稻和拟南芥直系同源基因的同线性、表达模式以及这两基因家族蛋白之间的相互作用进行了系统分析。其主要研究结果如下:
  1)通过同源比对和HMMER搜索,从二穗短柄草中鉴定了16个MAPK和12个MAPKK基因。多序列比对、进化和保守基序分析结果表明,二穗短柄草与拟南芥、水稻的MAPK基因家族的分类相似,也分为A,B,C,D四组。其中有6个成员含有TEY基序,9个成员含有TDY基序,一个成员含有MEY基序。二穗短柄草的MAPKK基因家族的成员也分为四组,其中有一组成员较多(5个),而其它组的成员数量相对比较均一。
  2)染色体定位分析结果显示:这两个基因家族在染色体上的分布不是随机的,而是在某个染色体或者染色体某个片段上分布密度较高。基因复制事件分析结果表明,串联重复和片段重复复制对于二穗短柄草MAPK和MAPKK基因家族成员的扩增起着重要的作用。二穗短柄草、水稻和拟南芥同线性分析结果显示:二穗短柄草中50%的MAPK和42%的MAPKK基因与水稻的中的直系同源基因存在同线性,而只有一个MAPK基因与拟南芥中的直系同源基因存在着同线性;这与我们所了解的植物进化史相一致。
  3)内含子外显子结构分析结果表明:MAPK基因家族所有成员均含有内含子,数目在3到11之间变化。而58.3%的MAPKK基因家族成员没有内含子,其余的MAPKK家族成员内含子数目平均为8.8个。亲缘关系较近的家族成员具有非常相似的内含子和外显子结构组成。另外我们还分析了这两个家族基因启动子区与植物抗逆、抗病有关的四个调控元件:WBOX,CBF,DRE和GCC,结果表明:这两个家族的所有成员均含有WBOX。在这四个调控元件中,每个成员含有WBOX数目最多,DRE最少。然而这四个调控元件在每个基因启动子区的排列组合和它所对应的EST数目的多少没有明显的相关性。
  4)将6个MAPK和4个MAPKK基因(5个蛋白,选择性剪接)分别克隆到对应的酵母双杂载体上用于研究它们之间的相互作用。结果表明一个MAPK可以与多个MAPKK之间有相互作用,反之亦然。这种MAPK-MAPKK之间的交叉相互作用反映出MAPK信号转导途径的多样性。
  5)利用RT-PCR和现有的芯片数据库,比较分析了二穗短柄草、水稻、拟南芥的MAPK和MAPKK基因在各个组织、非生物胁迫环境下的表达模式,以及水稻与二穗短柄草中的这两个基因家族直系同源基因或者旁系同源基因对在不同光照条件下表达模式。结果表明:每个基因的表达模式与其特有的功能有关,而与其对应的EST数目的多少以及其它同源基因序列相似性的高低无关。
  以上这些结果将为二穗短柄草和其它植物中MAPK、MAPKK家族基因分子进化的研究及后续功能的研究打下坚实的基础。
[硕士论文] 马月林
风景园林学 内蒙古农业大学 2016(学位年度)
摘要:树木的分枝发育在植物形态构成中具有十分重要的地位,决定着整株树木的空间结构,并对光合效率、树木生物量及园林造景等方面具有重要的影响。沙柳(Salix psammophila)的分枝角度多样,可形成直立型、标准型及柱形等多种树木空间结构,是挖掘调控树木空间结构变化基因资源的良好材料。
  本研究以沙柳为材料,克隆了SpsTAC1(Tiller Angle Control1)基因,进行了生物信息学分析,构建了进化树,并做了组织特异性表达分析。研究结果如下:
  1.沙柳TAC1基因的克隆及生物信息学分析。本研究利用同源克隆技术获得沙柳SpsTAC1基因,CDS序列全长819bp,编码272个氨基酸。蛋白分子量为65269.3Da,理论等电点为5.16,蛋白结构预测无跨膜结构,蛋白亚细胞定位预测位于细胞质中。
  2.不同物种TAC1蛋白质多序列比对及进化树分析表明沙柳与杞柳、毛果杨同源性较高,且共同具有五个保守区域。
  3.TAC1基因的组织特异性表达。定量qRT-PCR检测结果表明TAC1基因在沙柳的根、茎、叶片、顶芽、叶腋中均有表达,茎中表达最为丰富,其次是叶腋,而根中表达最低。
  研究结果表明克隆获得了沙柳SpsTAC1基因,该基因功能可能与分枝角度调控有重要关系,研究结果为进一步明确TAC1基因功能奠定了基础。
[硕士论文] 朱嘉诚
蓝藻生理生化 上海海洋大学 2017(学位年度)
摘要:对虾白斑综合症病毒(WSSV)自从1992年首次发现至今已在养虾业造成巨大损失。尚未见存在商业化的防治WSSV药物。至今对WSSV的防治手段主要是加强环境管理、筛选无病毒虾苗和选育抵抗力强的品种等。近15年来,已证明WSSV囊膜结构蛋白VP28在病毒感染细胞的过程中起关键作用。对虾摄入VP28后对虾的抵抗WSSV能力增强。我们研究团队已报导的对虾幼苗口服转vp28基因鱼腥藻后,再用WSSV攻毒表现出了对WSSV的抵抗力(成活率高达68-83%)。
  目前我们转vp28基因工程鱼腥藻的研发已经进入中试阶段。转基因鱼腥藻显示了它的一些优势,但仍然存在三方面制约工程藻效果和产量的因素:
  1)转基因鱼腥藻中vp28基因表达量较低,生长较慢;
  2)光反应器培养有待改进,以提高产品生产效率;
  3)生产过程还是有杂菌杂藻干扰。为此,本文从三方面做了探索,并取得以下结果:
  1.构建了生长更迅速vp28表达效率更高的转基因集胞藻6803:为了提高生物量,加快生长速度,减短生产周期。我们需要重新考虑vp28基因的宿主系统。集胞藻6803(Synechococcussp.PCC6803)的优势有:
  1)单细胞,结构简单;
  2)遗传上既可以用三亲接合转化法又可以用更简便的自然转化法;
  3)适应性强,是首先完成基因组测序的光合生物。
  本研究从Genbank中查得vp28基因的序列,让公司全合成。然后用质粒 pRL489连接目的基因 vp28,构建了穿梭表达载体。然后转入大肠杆菌扩增。通过三亲接合转移法或自然转化法得到转vp28基因的集胞藻6803。
  2.测定集胞藻的生长条件,以及vp28基因的表达:
  转入外源基因的工程藻在生理生化上与野生型藻种相差较大。本文从生理生化两个方面来探索工程藻生长需求和基因的表达峰值,从而调整生产条件(350-400μmol?m-2?s-2间,最适温度上调至35±5℃,最适pH=7.5-8.0)达到效益最大化通过氧电极检测不同条件下的净光合找到工程藻的最适生长条件。用实时荧光定量PCR检测到vp28基因最佳生长条件下工程藻不同时期中vp28的基因表达是对数生长期表达率最低稳定期最高。情况来分析基因表达的峰值,从而确定采收的时间为12-15天。在测定其表达的同时发现集胞藻的基因表达效率优于现阶段使用的鱼腥藻。
  3.纯化藻种,减少杂菌杂藻干扰
  规模化生产转基因蓝藻由于涉及人员多,生产环节复杂,增加了藻种受杂菌杂藻污染的机会。这会造成多种不利影响:
  (1)受到杂菌杂藻的干扰培养液pH会变酸,藻细胞变黄,生长慢。
  (2)不纯的转基因藻液混有杂质杂藻稀释转基因藻对产品的加工使工艺更复杂繁琐并使质量变差。
  (3)含杂菌杂藻的产品降低药效还会产生毒副作用。
  转基因藻种在形态上难以与野生藻区分,在生理生化上又难以和含转空载体的品系区分,所以需要从生理、生化和分子三个层面来分离这三种亚品系。过去报道的研究通常是从不同形态的物种中分离出所需的野生型藻种,而尚未见从相同形态的藻体中分离出转基因藻和野生藻种的报道,更未见转基因品系和转空载体品系纯化的报道,我们在本研究中开始做些探索。
  本研究中,以转WSSV病毒vp-28的鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC7120)为例,探讨转基因蓝藻纯化的方法。首先从传统的划板/涂布法来获得单藻落开始,进而需要利用荧光定量PCR、电泳、Western Blot等分子生物学手段来鉴定以及分离转基因藻和野生藻,最终达到分离三种不同亚品系的目的。
  研究中发现转基因集胞藻6803相对于野生型集胞藻表现出了对极端环境更强的适应性,尚需进一步做研究。本文中虽构建了转vp28基因的集胞藻6803但是对其抵抗WSSV病毒的效果尚未检测,望之后的研究中能对该藻进行大规模生产的试验并进行药效检测。
[硕士论文] 张晓晶
生物化学与分子生物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:DGKs(diacylglycerol kinases),又被称为二酰基甘油激酶,是一类特异、保守的脂质激酶家族成员,其主要功能是将二酰基甘油(DAG)磷酸化产生磷脂酸(PA)。DAG主要通过两种途径产生:一是由磷脂酶C(PLC)水解4,5-二磷酸肌醇(PIP2)而来;一是通过磷脂酸磷酸酶(PAP)移去PA的磷酸基团产生。PA和DAG都在脂类的生物合成和信号途径中扮演重要的角色,由DGKs和PAPs调节的PA和DAG之间的动态平衡就显得尤为重要,因此对于DGKs的功能研究也是非常重要的。在拟南芥中AtDGKs共有七个家族成员。已有研究发现拟南芥AtDGKs在多个部位表达,包括根、叶片和花等,并且其表达还会受到寒冷和伤害的诱导,在植物抵御寒冷刺激中发挥作用。DGKs在动物中的研究较为广泛,而在植物生长发育中的功能却鲜有研究。
  本论文运用分子生物学和反向遗传学的方法对AtDGKs的功能进行初步研究,获得结果如下:
  1.N端删除的DGKa+c和DGKa蛋白定位于细胞质中
  通过表达荧光蛋白融合载体,利用激光共聚焦显微镜观察发现,在拟南芥稳定的转基因植株的叶片和根中,DGKa+c和DGKa蛋白主要定位于细胞质中。
  2.过表达YFP-DGKa+c影响胚胎发育以及花发育和角果着生次序
  通过对YFP-DGKa+c过表达的转基因植株表型的分析与观察,发现该基因可能调控胚胎发育过程。YFP-DGKa+c的过表达植株在胚胎发育的各个时期都存在不同程度的缺陷,胚胎细胞的分裂紊乱,影响胚胎的早期发育和根极的建立;在胚后发育阶段,YFP-DGKa+c蛋白过量表达对于角果着生次序,茎干的正常发育以及花发育都有一定的影响。这些结果说明过表达YFP-DGKa+c会影响植物正常的生长发育过程。
  3.过量表达DGKa+c影响植物的胚胎发育过程
  利用胚胎特异表达的RPS5A启动子,构建了DGKa+c过表达的载体,发现与YFP-DGKa+c蛋白过量表达一样,RPS5A-DGKa+c植株后代的胚胎发育过程也受到影响,胚胎细胞的不正常分裂对于胚胎的早期发育及根极的建立过程都有一定的影响。
  4.AtDGKs T-DNA插入突变体影响侧根的发育
  通过对AtDGKs的T-DNA插入突变体根的表型进行分析,发现插入在第一个外显子上的突变体dgk2-3主根长度明显短于野生型,并且相对于野生型侧根密度有一定增加。这些结果说明该基因参与调控拟南芥根的发育,尤其是侧根的发育。
  以上结果显示,AtDGKs在植物胚胎发育过程中起着重要的作用,在胚后发育阶段,对根发育尤其是侧根发育以及花与角果着生次序具有一定的影响。这些都说明AtDGKs在拟南芥的生长发育过程中都发挥重要的作用。
[硕士论文] 刘银喆
医学生物信息学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:课题使用已测序的五种蔷薇科植物(桃、苹果、草莓、梨、梅)的全基因组作为研究对象,以双子叶植物代表葡萄基因组为外类群,对多物种进行联合比对,构建以葡萄和桃基因组为参考的共线性列表;结合同源片段的分类统计,从基因组丢失与保留的角度分析蔷薇植物的基因组进化过程。通过搜索基因组间和基因组内的同源片段,获得同源共线性信息。以基因组内与基因组间的直系基因和旁系基因为基础,构建以葡萄、桃基因组为参考的蔷薇科同源联合比对图谱;通过比对分析,确定各个蔷薇科植物基因组加倍的规模,获得不同进化事件的基因对集合。根据同源关系确定基因组进化过程,推测苹果基因组在加倍前有9条染色体;说明多倍化过程可能是基因组重组的原因之一;基于基因组内、间同源基因的同义核酸替换率Ks的分布,我们推断苹果与梨基因组共同的全基因组加倍事件发生在~16.7 Mya。
[硕士论文] 许洁婷
植物学 上海交通大学 2008(学位年度)
摘要:百合(Lilium)是世界上的五大鲜切花之一,深受人们的喜爱。 但是,百合与其它鲜切花一样随着花朵的开放而迅速衰老,如何延长百合花朵的保鲜期已成为近二三十年来百合研究的热点。据研究报道,百合花的衰老与乙烯的产生有关,而ACC 氧化酶是乙烯生物合成途径中的一个关键酶,克隆百合ACC 氧化酶基因(ACO)并进行调控研究和探索,利用基因工程技术改良百合保鲜期具有重要意义。 本研究以麝香百合为材料,克隆了百合ACO基因并对基因进行了表达分析,进而在ACO 反义载体构建、百合遗传转化受体系统建立及农杆菌介导外源基因转化等方面开展一系列工作,取得了以下结果: 1. 首次从麝香百合中克隆到了ACC 氧化酶基因LlACO1的cDNA全长序列(Genbank No. EU249333)。LlACO1 cDNA 全长为1,067 bp,带一短poly(A)尾巴,包含26 bp的5’非翻译区(UTR)和91 bp的3’ 非翻译区,以及954 bp 长的开放读码框(ORF),推导其编码一个含317氨基酸残基、分子量为36.18 kDa、等电点(pI)为5.26的蛋白质。 对LlACO1 氨基酸序列进行生物信息学分析和蛋白质结构预测,结果显示,LlACO1 与郁金香的同源性最高(86%),其蛋白质序列和结构比较保守,不同物种间的差异不大;具有与oxgenase家族的功能域同源的结构域,在进化关系上与郁金香、兰花等比较近。组织特异表达分析结果表明LlACO1 在百合不同器官中的表达有差异。 2. 首次从麝香百合基因组中克隆得到了LlACO1 全长序列。该基因含有4个外显子和3个内含子。内含子分别位于nt132-312、nt618-969、nt 1342-1671、大小分别为181bp,79bp,330bp。Southern杂交分析结果表明LlACO1 在百合基因组中呈低拷贝分布。 3. 建立了百合遗传转化愈伤组织受体系统。以麝香百合幼嫩花部组织为材料,研究筛选出了花丝做为最佳的诱导愈伤组织的外植体,并筛选出了最佳的诱导培养基、增殖培养基、分化培养基和生根培养基,确立了卡那霉素和潮霉素对百合愈伤组织的最佳筛选浓度,为百合的遗传转化奠定了基础。 4. 构建了LlACO1的反义表达载体。利用酶切和连接技术把LlACO1的反义片段antiLlACO1 连接到pCAMBIA1304 上,并保留了gus报告基因。将载体质粒转化至农杆菌EHA105菌种中,获得了用于百合转化的含antiLlACO1的工程菌。 5.利用农杆菌介导法对麝香百合进行了遗传转化,利用GUS 染色法研究了外源基因在受体愈伤组织中的瞬时表达,并通过潮霉素筛选及分化诱导获得了一批具有潮霉素抗性的愈伤组织和再生植株。
[硕士论文] 王亮
生物化学与分子生物学 山东农业大学 2011(学位年度)
摘要:二硫键是蛋白质链内或链间两个Cys之间的共价连接,二硫键的形成是氧化型蛋白质折叠和成熟过程中的重要步骤,它可以提高蛋白质的稳定性,避免蛋白质变性,降低蛋白水解酶对蛋白质的降解作用,为蛋白质形成正确的结构和行使正确的功能所必需。大肠杆菌中催化二硫键的系统现在已经研究的比较透彻,该系统主要通过DsbA蛋白和DsbB蛋白实现电子的传递过程。近年来,在微生物中发现了一条新的催化二硫键形成的途径(维生素K环氧化物还原酶途径,VKOR途径),其中VKOR蛋白是这条途径中催化二硫键形成的关键组分。高等植物中普遍存在编码VKOR同源蛋白的基因,但是该基因编码的蛋白其功能如何还几乎一无所知,为此,我们选取拟南芥VKOR作为研究对象,对高等植物VKOR催化二硫键形成功能进行了初步研究,并利用定点突变技术确定了植物VKOR催化二硫键形成所必需的半胱氨酸,主要结果如下:
   (1)拟南芥VKOR信号肽预测及结构分析。利用TargetP、PredSL和ChloroP在线程序预测该基因编码蛋白的信号肽为N-末端45个氨基酸。将拟南芥VKOR蛋白与已发现的催化二硫键形成的蛋白进行二级结构及拓扑结构比对,结果表明,拟南芥VKOR蛋白为一融合蛋白,有两个结构域即膜蛋白结构域和水溶性结构域组成,N-末端跨膜区与人类维生素K环氧化物还原酶(VKOR)同源,C-末端亲水区与大肠杆菌DsbA蛋白同源。我们将拟南芥VKOR全长命名为AtVKOR-DsbA,N-末端跨膜区命名为AtVKOR(45-214),C-末端亲水区命名为AtDsbA(204-376)。
   (2)AtVKOR-DsbA、AtVKOR-DsbA不带信号肽、AtVKOR结构域、AtDsbA结构域的克隆。从NCBI上查出拟南芥AtVKOR的基因序列,并依据该序列设计引物,以拟南芥的总cDNA为模板,分别扩增带信号肽AtVKOR-DsbA、去除信号肽AtVKOR-DsbA以及 AtVKOR(45-214位氨基酸)、AtDsbA(204-376位氨基酸)基因片段,并将基因片段分别连在表达载体pTrc99a,分别构建原核表达载体pTrc99a-TP-AtVKOR-DsbA(全长)、pTrc99a-AtVKOR-DsbA(不含信号肽全长),pTrc99a-AtVKOR和pTrc99a-AtDsbA。
   (3)用细胞运动性检测拟南芥VKOR催化二硫键形成的功能。大肠杆菌缺失DsbA或DsbB会丧失催化二硫键形成能力,不能为鞭毛蛋白FlgI引入对其功能必须的二硫键,造成细胞丧失运动性。我们上述表达载体分别转化二硫键形成缺陷型大肠杆菌细胞,检测了AtVKOR-DsbA及各结构域催化二硫键形成的能力。实验结果表明:缺失信号肽的AtVKOR-DsbA能够恢复二硫键形成缺陷型大肠杆菌的二硫键形成能力,形成有功能的鞭毛蛋白,使大肠杆菌细胞恢复运动性。说明AtVKOR-DsbA具有二硫键形成功能。但是带有信号肽的VKOR全长、AtVKOR、AtDsbA都不能单独恢复二硫键形成缺陷型菌株的二硫键形成功能。
   (4)用半乳糖苷酶活性检测拟南芥VKOR催化二硫键形成的功能。选用的受体大肠杆菌细胞其基因组整合了膜蛋白MalF与β-半乳糖苷酶的融合基因,膜蛋白MalF将β-半乳糖苷酶的N-末端固定于细胞膜上,当β-半乳糖苷酶形成二硫键时则失去活性。实验结果表明,当去除信号肽的AtVKOR-DsbA全长蛋白表达时,β-半乳糖苷酶以无活性形式存在,说明有二硫键的形成,而分别表达带信号肽的全长、AtVKOR或AtDsbA时,β-半乳糖苷酶以还原态存在时,能够分解X-gal生成深蓝色物质,说明带信号肽的全长、AtVKOR或AtDsbA不能催化二硫键的形成,该结果与细胞运动性实验结果吻合。
   (5)用基因定位突变技术确定必需半胱氨酸残基。我们利用Quickchange定点突变技术,在基因水平上分别将AtVKOR-DsbA的十个半胱氨酸突变为丙氨酸,并且将同一跨膜区的一对半胱氨酸双突变为丙氨酸,研究半胱氨酸对AtVKOR-DsbA功能的影响,实验结果表明:硫氧还蛋白典型原件C-X-X-C结构中的半胱氨酸(Cys195-Cys198,Cys293-Cys296)以及相距较远的两对保守半胱氨酸(Cys109-Cys116,Cys316-Cys331)对于AtVKOR-DsbA的二硫键形成功能是必需的。另外两个位点的非保守半胱氨酸(Cys46、Cys230)对于AtVKOR-DsbA的功能无明显的影响。
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