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[硕士论文] 刘瑞振
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是中国传统大宗类药材之一,野生群体在我国中东部广泛分布,为唇形科鼠尾草属多年生草本植物。由于在治疗心脑血管疾病上具有显著疗效,导致近年来丹参药材的需求量持续增加。然而在如今,野生丹参由于多种原因,数量正在急剧下降,远远不能满足市场需求,与此同时,各产地栽培丹参质量参差不齐,品质退化严重,各种丹参替代品导致市场鱼龙混杂。因此,搞清丹参遗传背景,保护野生丹参种质资源显得尤为重要。近年来关于丹参种质资源遗传多样性研究虽然陆续有所报道,但大多数仅限于栽培群体或者少量野生群体,尤其是对全国范围内野生丹参种质资源尚未研究。基于此,本研究以全国范围内野生丹参群体为研究对象,利用SSR分子标记和生物学性状等指标对丹参资源进行系统多样性研究与评价,为丹参种质资源保存、分类鉴定、合理应用奠定基础。
  本研究主要内容包括:⑴野生丹参种质资源库的构建。已完成对全国15个省份野生丹参样品收集,完全覆盖丹参自然分布区域。共计获得1432份丹参分子材料,获得234份标本,获得358份活体材料。⑵野生丹参群体遗传多样性研究。基于转录组数据大规模开发丹参微卫星标记中,共计获得16895个SSR位点,并成功开发出40对SSR引物(PIC>0.3)。基于SSR分子标记野生丹参种质资源遗传谱系分析表明,所有野生丹参种质资源分为两大遗传谱系,一类为南丹参,另一类为丹参。群体结构分析结果与谱系分析结果基本一致。⑶野生丹参群体形态多样性研究。选用13个质量性状和9个数量性状对84份丹参种质资源的形态多样性进行评价。主成分分析显示,所有选择性状均参与有效主成分的构成。变异系数分析显示,质量性状变异系数在0.257-0.579之间;数量性状变异系数在0.145-0.421之间。聚类分析结果显示,利用所选质量性状可将南丹参和丹参群体完全分开,其中丹参和南丹参内部大多数群体可分开。利用所选数量性状仅可以将南丹参和丹参大致分开。因此,在鉴定各地丹参和南丹参优先选择质量性状,同时把数量性状作为补充。
[硕士论文] 李东海
生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:半夏,Pinellia ternata(Thunb.)Breit,天南星科半夏属多年生草本植物,块茎可入药,是我国常用中药之一,2015年最新药典记录其有湿痰寒痰,咳喘痰多,痰饮眩悸,风痰眩晕,痰厥头痛,呕吐反胃,胸脘痞闷,梅核气;外治痈肿痰核等功效。半夏凝集素为半夏中提取分离出的一种具有高度专一性凝结甘露糖的蛋白,常与草酸钙晶体伴生,或佚散于细胞粘液中。根据现有报道,半夏凝集素也具有抗肿瘤作用,糖基识别作用,免疫应激和免疫刺激作用。当前半夏凝集素的研究主要集中在四个方面:半夏凝集素的结构,功能,以及提取和分离纯化的方法;半夏凝集素的生物反应器高效表达与变构半夏凝集素的表达;半夏凝集素的抗肿瘤研究,包括其抗肿瘤机制,抗肿瘤细胞范围,抗肿瘤佐剂效应,抗肿瘤活性等等;半夏凝集素的转基因抗虫研究,抗菌研究,以及半夏凝集素的抗虫机制和机理。
  本研究以组织培养为基础和实验体系,研究半夏在非生物胁迫下的生理周期的改变,包括半夏的倒伏,恢复,块茎的成熟,探讨其潜在的抗逆基因和调控方式;然后分析和克隆了半夏凝集素基因,并参考其保守区域,设计了若干个单点突变和双点突变,估测其凝集糖基的潜在位点,并改造其前段信号肽,和后部的半胱氨酸位置,设计了类似的环肽结构,也根据半夏凝集素序列设计RACE扩增,用以后续的基因沉默,启动子,终止子的研究;最后,建立了浮萍生物反应器体系,并尝试转化了半夏凝集素。实验发现,6-BA3.5 mg/L适宜半夏珠芽的萌发,NAA0.5 mg/L适宜半夏根的萌发,半夏珠芽的分化需要光照的参与,暗培养下2,4-D1.0 mg/L适宜于半夏愈伤组织的分化。实验中通过对野生浮萍的驯化,建立起浮萍生物反应器,将半夏基因转入浮萍,并能检测出相应基因。构建的多组突变基因可用于后期检测半夏凝集素的活性位点,通过分析突变半夏凝集素的活性,和对甘露糖的专一性,判定保守序列是否为甘露聚糖结合位点,而RACE片段的合成有益于半夏凝集素基因的沉默与过表达从而来判断半夏凝集素于半夏植株的生理功能的相关性,而浮萍反应器的建立,对同比其他蛋白的生物反应器表达起到了起始作用,为后续浮萍生物反应器高效表达其他产物,培养基优化,高效转化等研究奠定了一定的基础。
[博士论文] 孙丹
生理学 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:芒草是优质能源作物,生物质产量高,对环境适应能力强。由于木质纤维乙醇生产成本高,转化效率低,故必须寻找可提高生物质酶解效率的理想预处理方式和酶解条件,并筛选出优质的芒草材料。本研究利用10份有代表性的芒草材料,分析了汽爆预处理对芒草秸秆细胞壁成分、细胞壁结构因子和孔隙度的影响;揭示了影响汽爆材料酶解效率的细胞壁关键因子和酶解产糖的优化条件,鉴定了高效降解产糖的优质芒草材料,并提出了优质芒草材料高效降解的模型。此外,本研究还比较了三种表面活性剂对芒草汽爆材料酶解效率和乙醇产量的影响,初步探讨了三种表面活性剂作用的特异性。主要结果如下:
  1.经过汽爆预处理,10份芒草材料直接酶解效率可增加1.30-5.97倍,纤维素含量相对增加,半纤维素和木质素含量降低;此外,汽爆后材料纤维素的结晶度(CrI)提高,聚合度(DP)降低,半纤维素主要单糖(Ara,Xyl)的含量降低,且Xyl/Ara比率(即半纤维素分支度的倒数)相应提高;木质素单体含量不同程度降低。
  2.关联分析发现:木质素H-单体是影响原材料直接酶解的唯一负向因子;纤维素DP,半纤维素含量及Xyl和Ara的含量、木质素S-单体的含量,是影响汽爆材料酶解效率的负因子。汽爆材料的Xyl和木质素S-单体含量负向影响DY值;纤维素DP、Xyl和Ara含量、S-单体含量皆负向影响DY/DB比率,解释了DY/DB是芒草汽爆材料直接酶解效率的关键正因子。
  3.芒草汽爆材料孔隙度的测定,得出大孔隙(DY)与小孔隙(DB)的比率(DY/DB)是影响汽爆材料酶解效率的关键正向因子。
  4.三种表面活性剂(Tween-80、PEG4000、Silwet L-77)提高酶解效率的最适浓度分别为:2%、0.5%和1%。其中1% Silwet L-77能够有效提高原材料的酶解效率,2% Tween-80对汽爆材料的酶解效率最高。
  5.1% NaOH预处理汽爆材料,酶解添加2% Tween-80处理(1% NaOH+2%Tween-80),可使优质秸秆材料完全降解。扫描电镜观察发现,该处理使木质纤维素结构破坏最严重,导致酶解效率最高。
  6.添加三种表面活性剂后,乙醇产量均高于对照,其中1% NaOH+2% Tween-80和1% NaOH+0.5% PEG4000处理,乙醇产量均达到最高(约16.2%),比对照增加2.2倍。蛋白浓度测定发现,1% NaOH+2% Tween-80酶解液中的纤维素酶的浓度最高,表明该处理能最大程度的利用纤维素酶,并初步解释了该处理产糖产醇的效率最高。
[硕士论文] 谯利军
微生物学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:植物内生真菌是一类重要的真菌资源,是植物微生物系统中的天然组成成分,在生态系统的循环过程中扮演着重要的角色。马比木是一种重要的药用植物,含有重要药用成分喜树碱,其内生真菌作为新的药物资源受到了广泛关注。本研究以贵州省的马比木为研究对象,分别采集贵阳市修文县、铜仁市万山区与遵义市播州区三个地区四个季节的不同组织部位马比木样本,进行马比木内生真菌的分离纯化及生物学鉴定,进而对贵州省马比木的内生真菌的多样性进行评价。
  本研究主要内容包括:⑴从1444个马比木组织块中,分离出1037株内生真菌,隶属于子囊菌门的3个纲,9个目,31个属。其中从贵阳市修文县分离的菌株656株,其中春季151株,夏季114株,秋季247株,冬季144株;铜仁市万山区分离得到的菌株有223株,遵义市播州区则有258株,共1037株菌。分别提取纯化菌株的ITS rDNA,采用通用引物ITS1/ITS4对ITS基因片段进行PCR扩增测序,通过BLAST搜索相关序列,再进行系统发育分析,结合序列碱基相似性的比对来确定马比木内生真菌的分类地位。通过分子生物学鉴定,其中58.1%(18/31)的属分布于座囊菌纲(Dothideomycetes),32.3%(10/31)的属分布于粪壳菌纲(Sordariomycetes),9.68%(3/31)的属分布于散囊菌纲(Eurotiomycetes)。优势属为间壳座属Diaporthe,分离的菌株数为679株,超过了总数的一半,其分离率与分离频率分别达到40.24%与57.58%。其次是刺盘孢属Colletotrichum、叶点霉属Phyllosticta,但比例都不高。⑵在分离到的31个属的内生真菌中,通过多种促产孢方式对菌株进行刺激,有13个属的产孢结构及孢子形态被观察到,分别为Colletotrichum、Alternaria与Fusarium, Bipolaris、Periconia、Zasmidium、Phyllosticta、Hypoxylon、Cercophora、Australiasca、Penicillium和Aspergillus。⑶从不同季节上来看,各个季节的内生真菌的分布是有所差异的。分离内生真菌数量最多的是秋季,且秋季的多样性指数与辛普森指数也高于其他三个季节。从不同地区上来看,贵阳的定殖率最高,而铜仁市万山区的分离率最高,三个地区均有自己单独分离得到的属种,贵阳市、铜仁市各有7个,遵义市只有2个。贵阳市修文县马比木组织块分离到的内生真菌的多样性指数、辛普森指数与均匀度指数都是最高的,铜仁市马比木内生真菌的丰富度最高。此外,茎的定殖率与分离率都高于叶,而叶片的多样性指数、辛普森指数与丰富度指数都明显的高于茎及其他组织部位。另外,马比木特定组织中有其单独分离得到的属种,具有强的宿主组织专一性。
[硕士论文] 陈芳
生态学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科石斛属多年生附生草本植物,是国家重点保护的中药材,由于长期掠夺性的滥拔滥采和人为破坏,野生的铁皮石斛资源已濒临灭绝。为更好地弥补和保护野生铁皮石斛资源的不足,满足市场对于铁皮石斛的需求,仿野生铁皮石斛栽培技术是保障其实现资源可持续利用的重要举措,而气候是影响仿野生栽培技术的重要因子,目前铁皮石斛的气候适宜性鲜见报道。本研究以贵州丰富的水热和光照资源为基础,结合气候相似理论,引入二值模型隶属度模糊函数,采用GIS技术对贵州铁皮石斛的气候适宜性进行研究分析,有利于全省各地充分发挥其优越的气候资源引种和调整产业结构,遵循中药材产地适宜性优化原则,避免盲目引种,因地制宜,合理布局,为贵州铁皮石斛仿野生栽培供理论依据和科学指导。本文利用贵州省84个气象台站1965~2015的气象资料对贵州省50a间的温度、降水和日照的时间变化特征和空间分布规律进行了分析;在贵州省不同地理位置选取11个地方采取铁皮石斛鲜样品,并对其有生物量和有效成分进行测定分析;借鉴了前人的研究结果、当地的实际情况和专家意见,选取了年平均气温、1月平均气温、1月最低温、7月平均气温、7月最高温、≥10℃积温、降水量、相对湿度和日照时数等9个气候因子作为区划指标;对11个采样地铁皮石斛的有效成分与当地气象台站9个气候因子做了相关性分析;同时建立铁皮石斛有效成分与气象因子之间的多元回归模型,确定了影响铁皮石斛生长发育的区划指标及其权重,在此基础上利用ArcGIS对贵州铁皮石斛的气候适宜性进行了区划。
  本研究主要内容包括:⑴贵州省50a的年平均气温、极端最低气温和≥10℃活动积温均表现出明显的年际波动,且都有着明显的上升趋势,而日照时数和年降水量表现出不断波动下降的趋势。高纬度高海拔的省北部的遵义、铜仁地区及西部的威宁和赫章等地区,年平均气温、平均极端最低气温和≥10℃活动积温相对较低,热量条件相对较差,低纬度低海拔的黔西南的兴义、册亨和望谟、黔南的罗甸、北部赤水的河谷地带等热量条件相对较好。年日照时数呈西南部高、东北部低的分布,年降水量呈现南部多于北部、东部多于西部的分布趋势。⑵铁皮石斛茎的含水率在65.98%左右,叶的平均含水率在67.06%左右,其茎高在12.07~17.83cm之间,基茎粗3.01~5.56mm,其主要要用有效成分是多糖、生物碱和氨基酸等,除贞丰以外,其余10个地方样品的多糖含量均达到了25%,多糖含量和生物碱含量差异显著。铁皮石斛鲜品均含有17种氨基酸,除色氨酸外,含有人体所须的全部氨基酸。其中甲硫氨酸、酪氨酸、亮氨酸和赖氨酸的含量较低,仅占总氨基酸的11.51%,谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸的含量相对较高,占总氨基酸的37.05%。⑶铁皮石斛多糖含量与年平均气温、1月份平均气温、1月最低温及≥10℃积温和日照时数均呈负相关,与7月平均气温、7月最高温和相对湿度、海拔高度、降水量呈正相关。生物碱含量与年平均气温、1月平均气温、1月最低温、7月平均气温、7月最高温和≥10℃积温均呈正相关,与降水量、日照时数和海拔高度均呈负相关。总氨基酸含量与年平均气温、1月平均气温、1月最低温、7月平均气温、≥10℃积温、降水量和相对湿度呈正相关,与7月最高温、日照时数和海拔高度均呈负相关。茎高与1月平均气温呈显著性正相关,与7月最高气温、经度、纬度呈显著负相关。基茎粗与7月平均温、7月最高温、经度、纬度呈显著性负相关,与降水量和日照时数呈显著性正相关。⑷以≥10℃积温、年平均气温、1月平均气温、1月最低温、7月平均气温、7月最高温、相对湿度、日照时数、降水量等9个气候因子作为铁皮石斛区划的指标,其指标权重分别为0.17、0.16、0.18、0.16、0.19、0.03、0.05、0.04、0.12。贵州省最适宜发展铁皮石斛的区域主要集中在省的南部地区及北部地区的个别县市。适宜区主要集中在省的南部、中部和东部的一些县市。基本适宜区主要集中在省的中部和东部。不适宜区主要集中在省的西部和北部部分地区。
[硕士论文] 王蕾
生物化学与分子生物学 遵义医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:通过观察千里光双受精(double fertilization)过程以及自交不亲和(self-incompatibility)相关基因(I类和II类SLG基因)在千里光不同器官的转录累积水平,为千里光遗传性状改良的人工杂交育种和合子发育的胚胎学研究提供理论依据。
  方法:⑴取千里光人工授粉后1、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48、72和96 h的雌蕊和雄蕊放入FAA固定液中固定24h以上。使用苯胺蓝染色法和石蜡切片观察千里光双受精过程和花器官的基本结构。⑵基于双受精观察结果,利用实时荧光定量PCR技术检测class-I SLG和class-II SLG在千里光叶片、花瓣和柱头在授粉24h后SLG基因转录累积水平。
  结果:①千里光柱头2裂,闭合型花柱,下位子房,一室,聚药雄蕊。千里光开花时胚囊尚未发育成熟,在授粉后8h,可见“败育胚囊”,授粉后12h,可以看到成熟胚囊里含有3个反足细胞、1个中央细胞(含有2个极核)和1个成熟卵细胞,2个极核有呈上下排列,此时助细胞已经退化;②花粉萌发和花粉管生长:人工授粉后1h,未见花粉粒萌发;授粉后2h,花粉粒萌发并形成花粉管;授粉后4h,花粉管进入花柱道;授粉后6h,花粉管在花柱道中继续向子房方向延伸;授粉后8h,花粉管穿过花托,进入子房;授粉后10h,花粉管进入胚囊并释放出花粉粒内容物。③雌雄配子融合:授粉后12h,两个精核分别向卵细胞和次生核靠近;授粉后18h,一个精核靠近卵细胞,一个精核和次生核融合完成,并且在次生核中出现小的雄性核仁;授粉后24h,精子和卵细胞融合,形成合子;授粉后36h,合子分裂完成,形成二细胞原胚。④胚的发育:二细胞原胚后形成梨形原胚,随着原胚分化,在梨形原胚上出现凹沟,凹沟程度较深,最终胚发育成熟。⑤胚乳的发育:初生胚乳核在卵细胞受精之前就已经开始分裂,从2、4个胚乳游离核到自由胚乳核时期,游离胚乳核越来越多,胚乳游离核逐渐细胞化,胚囊被胚乳细胞充满,最终,胚乳细胞核和细胞壁解体,胚乳被胚吸收。⑥qPCR检测受精完成后SLG基因在千里光各器官mRNA表达量,class-I SLG引物在花瓣上相对表达量较高,差异显著性分析表明花瓣中的表达量与叶片、柱头存在显著性差异,叶片和柱头之间无显著性差异。class-II SLG基因在叶片和柱头上表达量无显著性差异,而花瓣中的表达量与叶片和柱头均有显著性差异(p<0.05)。
  结论:⑴千里光双受精过程为:1-10h花粉萌发为花粉管并穿过花柱道,经过花托和子房,最终到达胚囊,释放花粉粒内容物;12-24h精卵细胞融合形成合子,另一精细胞与极核融合形成初生胚乳核,完成双受精过程;24h-36h合子分裂形成二细胞原胚,并发育形成胚,初生胚乳核进一步分裂、细胞化、充满胚囊形成胚乳,在胚的发育过程中逐渐被吸收解体。⑵千里光开花时胚囊尚未发育成熟;在授粉后12h,可观察到成熟胚囊,包含3个反足细胞、1个中央细胞(含有2个极核)和1个成熟卵细胞,此时2个助细胞已经退化,表明可能是授粉触发了千里光胚囊逐渐发育成熟。⑶千里光中存在class-I SLG基因和class-II SLG基因,并且在授粉后显示出组织表达差异性,表明其可能参与千里光有性繁育过程。
[硕士论文] 杨娜娜
药用植物资源保护与利用 西北农林科技大学 2017(学位年度)
摘要:贯众始载于《神农本草经》,有清热解毒、止血、杀虫功效,用于妇产科的出血、肠道蛔、绦虫病的治疗。药理研究表明,贯众具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤等作用,但历代本草学中的中药贯众的原植物是几种不同的植物而不是一种植物。本研究通过实地调查和查阅相关文献资料,对秦巴山区的贯众资源进行了全面而详细的调查研究,特别对秦巴山区中心地域18个县的贯众资源的种类分布、生态环境、土壤状况、气候特征、海拔等信息进行调查记录;同时,对西安药材市场进行了走访调研,了解市场的贯众来源、销售去向、商品贯众的常用种类等;此外,以秦巴山区的贯众属植物为材料,研究了叶表皮细胞形态的特征,对一些疑难种类进行了研究,以期为秦巴山区贯众资源的分类鉴定及开发利用提供理论参考。其主要结果如下:
  1.依据调查,秦巴山区作贯众用的原植物占全国各省市实际作贯众用原植物的92.6%,隶属5科10属25种,包括鳞毛蕨科4属17种、球子蕨科2属3种、蹄盖蕨科2属3种、紫萁科1种、乌毛蕨科1种。
  2.通过对秦巴山区中心地域18个县的贯众资源的生态环境、土壤状况、气候特征、海拔等的调查分析发现,该地区贯众资源多生长于海拔500-3400m,喜温暖湿润,有细微散射阳光的林下、山谷林下阴湿处、灌木丛下、溪沟边或石灰岩缝处,其分布区域通常生态环境良好、人口稀少、农业耕种模式原始。
  3.通过对西安药材市场调查结果显示,该地区作为商品贯众的常用种类有贯众(Cyrtomium fortune)、荚果蕨(Matteuccia struthiopteris)、紫萁(Osmuuda Japonica)、单芽狗脊(Woodwardia unigemmata)、陕西蛾眉蕨(Deparia giraldii),它们在秦巴山区陕西境内分布面广,但局限于部分地区自产自销;贯众的市场价格仅在预防“非典”期间价格上涨到55元/公斤,之后平稳,处于5-13元/公斤。
  4.对秦巴山区贯众属(Cyrtomium)6种1变种2变型植物的上、下表皮细胞的研究表明,其细胞形状均为不规则形,气孔分布于叶片下表皮,与叶脉平行。气孔器类型可分为无规则型、横列型、极细胞型和不等型四种,且多为无规则型,并对一些疑难种类进行了分析研究,确定秦巴山区贯众属植物为6种。
[硕士论文] 齐婉桢
生物化学与分子生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:人类的活动导致大气层的臭氧层变得稀薄,UV-B(280-320nm)辐射到达地球表面的射线增加,对植物的生长发育、生理生化、次生代谢及基因的表达等都会产生一定的影响。药用植物中次生代谢产物的合成与生长环境有直接的关系,UV-B辐射必然影响植物中次生代谢产物的合成。因此本研究以盆栽的怀牛膝(Achyranthes bidentata Bl.)幼苗为试验材料,在温室培养条件下采用UV-B辐射进行不同的处理,研究了UV-B辐射对怀牛膝幼苗的生长、生理生化、内源激素、主要药用成分及相关基因表达的影响。
  本研究主要内容包括:⑴随着UV-B辐射时间的增加,怀牛膝幼苗的生长受到显著的抑制,主要表现为:植株矮化、根长变短、生物量降低,伴有叶片白斑等症状;抑制程度与辐射时间成正比。UV-B辐射时间越长,根冠比越高;⑵不同时间的UV-B辐射,叶片中SOD和POD的活性明显高于对照组,而CAT的活性随着辐射时间增加先升高后降低;MDA的含量随着辐射时间的积累逐渐增加,H2O2的含量则表现为先升高后降低;⑶叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的含量都表现为处理组低于对照组,且UV-B辐射时间越长,降低的幅度越大;⑷UV-B辐射使牛膝叶和根中齐敦果酸和蜕皮甾酮的含量增加。辐射3-4h有利于叶中齐敦果酸的积累,辐射4h对根中齐敦果酸的积累反而具有抑制;辐射2h最有利于叶和根中蜕皮甾酮的积累;⑸UV-B辐射可促使怀牛膝叶和根中齐敦果酸和蜕皮甾酮代谢通路上的关键酶基因HMGS、HMGR、PMK、FPS、SS、SE、β-AS和CAS表达上调,GGPPS基因表达下调;⑹牛膝叶片中内源激素IAA和GA3的含量随辐射时间的增加和恢复生长天数的延长而不断下降;ZR和ABA含量随着辐射时间的增加和恢复生长天数的延长而逐渐升高。内源激素呈现的这种变化是对UV-B辐射的适应,但最终抑制了牛膝幼苗的生长;⑺UV-B辐射使怀牛膝叶片中内源激素IAA合成通路中的相关基因ASA、PAT1、IGS、TSB和TAR与GA3合成通路中的相关基因HMGS、HMGR、PMK、KS和KO均为表达下调;ZR合成通路中的相关基因DXS、CMK、ZOGT、N-GT和CKX与ABA合成通路中的相关基因DXR、HDR、ABA4、ABA2和AAO3均表达上调。
[硕士论文] 尤红
微生物学 浙江理工大学 2017(学位年度)
摘要:丹参(salviae miltiorrhizae)是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物,广泛用于心血管疾病的治疗。有效提升丹参活性成分的含量是目前丹参种植的目标之一,微生物对植物生长和次生代谢物合成具有促进作用。本论文研究了野生丹参植株中的微生物对丹参毛状根生长和次生代谢的诱导效应,以为生产中提高丹参品质提供新思路。
  本研究主要内容包括:⑴系统分析了多地区多生境的野生丹参微生物资源并重点研究了它们对丹参次生代谢的影响。分离了7个不同地区的丹参微生物,共1022株,鉴定了240株,它们属于63种细菌及7种真菌;多数细菌归属于Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、rthrobacter、Rhizobium和Sphingobium等属,真菌归属于Aspergillus、Purpureocillium、Aspergillus、Mucor、Hypocrea和Trichoderma等属。研究微生物对丹参毛状根药用活性成分的影响,发现一些细菌促进丹酚酸的合成;多数试验真菌显著促进丹参酮的合成。显著促进丹酚酸合成的细菌包括Pantoea dispersa14DSR23、Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaCaHYR1、 Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaCaHYR26、Pseudomonas chlororaphis subsp.piscium SCR22和Pseudomonas chlororaphissubsp.aureofaciens LNHR13,诱导后丹酚酸B(SAB)的含量为对照组的1.21-2.28倍,诱导后迷迭香酸(RA)的含量为对照组的1.38-2.50倍;显著促进丹参酮合成的真菌有Aspergillus japonicus L74、Purpureocillium lilacinum R75、Aspergillus insuetus R77、Mucor irregularis R78、Hypocrea nigricans S79、Aspergillus japonicus S80、Trichoderma atroviride S81,此外还有部分细菌Pseudomonas sp.DS3G2、HYR1、Pseudomonas vancouverensis DS6,诱导后的总丹参酮含量为对照组1.62-10.14倍。促进总酚酸合成效果最好的菌株是细菌LNHR13,促进总丹参酮合成效果最好的是真菌L74,同时显著促进两类成分合成的是细菌DS3G2、HYR1和DS6。⑵分析了菌株LNHR13促进丹酚酸合成的主要活性成分。菌株LNHR13发酵液的水溶性成分以及多糖成分对毛状根的鲜重有显著的促进作用,同时显著促进丹参素钠、RA和SAB三类丹酚酸及总丹酚酸的合成。基于GC-MS,从LNHR13的水溶性成分中鉴定出植物生长激素(IAA)、水杨酸(SA)和玉米素(t-ZOG),进一步分析发现促进丹酚酸积累的菌株均含有丰富的植物激素,其中含量最高的为IAA(559.182-71543.05ng/mL),含量次高的为SA(28.86-379.21 ng/mL)和t-ZOG(33.619-88.027ng/mL)。采用外源IAA和SA验证发现,IAA和SA均可促进丹参毛状根的生长,SA显著促进丹酚酸的合成。验证LNHR13中的胞外多糖对丹参毛状根的诱导作用,发现该胞外多糖显著促进丹酚酸的合成,其最佳浓度为20mg/L和40mg/L,诱导时间为9d。⑶研究了活体菌株LNHR13对丹参毛状根的诱导效应。活菌均抑制毛状根的生长和丹酚酸的合成,但促进丹参酮的生物合成,0.01%的菌体接种时显著促进四种丹参酮的积累。
[硕士论文] 柯杰
遗传学 中南民族大学 2016(学位年度)
摘要:内标基因是物种在分子水平上的特异性标记,具有多种用途,目前,已经有许多物种开发出内标准基因,但暂无红花内标基因相关报道;核基因组rDNA的转录间隔序列ITS对植物鉴定和系统发育分析具有重要意义。本研究主要从两个方面展开,一方面是开发特种经济作物红花的内标基因;另一方面是利用ITS序列对菜蓟族牛蒡属牛蒡进行野生种和栽培种的鉴定及系统发育分析,此外,基于ITS序列及其二级结构深入探讨菜蓟族演化规律及系统发育。
  本研究主要内容包括:⑴根据Genebank中红花的基因信息,筛选出特异性强的CTOS基因作为内标候选基因,根据该基因序列信息,设计了多对引物。建立定性 PCR体系,并筛选出了两对引物,在红花各品种中的扩增片段大小分别为171 bp和280 bp,且具有红花特异性,能有效的鉴别红花,且检测灵敏度较高,检测浓度可达到0.05 ng。此外,建立了红花相对定量检测体系,标准曲线决定系数R2大于0.996,扩增效率大于90%。所建立的检测体系成功的从混合样品中检测出红花源成分。⑵利用ITS序列分别对10个不同来源的野生种和栽培种牛蒡进行分析。结果显示,ITS序列在牛蒡中高度保守,在10个品种的牛蒡中仅有7个突变位点,ITS序列在牛蒡中的差异值小于1%,因此,ITS序列可作为牛蒡分子样品鉴定的依据;ITS序列在5个野生种牛蒡中完全一样,5个栽培种中均有碱基突变,根据ITS序列碱基的变异情况,能有效的区分野生种与栽培种;利用ITS序列对10个不同来源的牛蒡进行聚类分析,可以划分为两个类群,一个类群与野生种保持着相对较近的亲缘关系,另外一个类群与野生种亲缘关系相对较远,且均在ITS1区域内的229 bp处发生碱基的颠换。⑶利用ITS序列分别对33个菜蓟族物种和3个紫菀族物种的ITS序列进行分析。结果显示,ITS序列在不同群体间有明显差异,亲缘关系相对较近的差异性小,亲缘关系相对较远的差异性较大,且差异性主要体现在序列ITS1和ITS2上,5.8S最为保守;利用ITS序列对36个样品的聚类分析显示,各属样品基本能聚类到相同节点处,与传统系统分析结果基本相吻合,能有效的区分各种属;飞廉亚族的各属间差异性较大,其中蓟属和飞廉属保持相对较近的亲缘关系,而菜蓟属、风毛菊属、川木香属、肋果蓟属和牛蒡属保持着自身独特的演化方式,而自成一类;矢车菊亚族各属能较好的聚类到一起,差异性相对较小;通过对各样品间ITS2序列的二级结构预测,并比对分析表明,36个样品均能形成由A、B、C和D四条臂组成的四叶草状的基本结构;其中D臂结构最为保守,具有族的特异性;A臂结构相对保守,具有属的特异性;B臂与C臂变化性最大,本次实验对B臂与C臂的预测结果在部分样品中与理想的茎环结构有所出入,暂无讨论B臂与C臂在种属间的差异性与亲缘关系,其中C臂最长,变异性最大,推断其在品种的鉴别及低阶元的系统发育分析中能发挥重要的作用。
[硕士论文] 戴智慧
生物化学与分子生物学 宁波大学 2016(学位年度)
摘要:换锦花(Lycoris sprengeri)为石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris)植物,具有极好的观赏价值和极高的药用价值。为了保护野生植物资源,合理开发和利用宁波地区的野生换锦花,对换锦花种子的生物学特性和贮藏特性,6个地区野生换锦花鳞茎中主要成分的含量以及6个地区野生换锦花居群的遗传多样性水平和遗传结构进行了研究。
  本研究主要内容包括:⑴以换锦花种子为实验材料,观察了种子的形态特征及测定了种子的千粒重、含水量、种子生活力、发芽特性等种子的生物学特性,并对其种子贮藏的最佳条件进行了研究。结果表明:换锦花果实为蒴果,种子大小差异较大,种子长度为3.14mm~7.16mm;宽度为3.08mm~7.08mm;厚度为2.12mm~6.20mm。种子多数为桔瓣形,约占62%;少数为球形。鲜种子千粒重为180.1g,平均含水量为64.86%,平均生活力为83.33%。4℃湿沙、4℃和-80℃冰箱中贮藏都可以保持种子的生活力。⑵以采自舟山大猫岛及宁波市北仑洋涨岙、奉化萧王庙、象山鹤浦、镇海招宝山、慈溪海黄山等6个地区的野生换锦花鳞茎为实验材料,以石蒜碱计总生物碱的含量,采用分光光度法测定其总黄酮、非淀粉粗多糖及总生物碱的含量;采用 HPLC法测定其加兰他敏的含量。实验结果表明,6个地区的野生换锦花鳞茎中主要成分的含量存在一定的差异。不同地区的野生换锦花鳞茎中的总黄酮、总生物碱、加兰他敏的含量及非淀粉粗多糖的得率变化幅度分别为1.095mg·g-1~1.751 mg·g-1、2.691 mg·g-1~5.559 mg·g-1、0.686mg·g-1~1.476 mg·g-1和11.590%~14.182%。其中采自象山鹤浦的总黄酮含量最高,为(1.751±0.116) mg·g-1;慈溪海黄山的非淀粉粗多糖的得率最高,为(14.182±0.523)%;镇海招宝山的总生物碱的含量最高,为(5.559±0.394) mg·g-1;北仑洋涨岙的加兰他敏的含量最高,为(1.476±0.018)mg·g-1。同一地区的总生物碱与加兰他敏的含量呈一定的正相关,相关系数为0.601,但并不显著。⑶采用ISSR分子标记技术,对宁波6个地区的野生换锦花居群的遗传多样性水平和遗传结构进行分析。10个ISSR引物共扩增出74个条带,其中多态性条带67个,多态性位点百分比(PPL)为90.54%。野生换锦花在物种水平上的遗传多样性很高,多态位点百分比(PPL)为90.54%,Nei’s基因多样性(H)为0.2700,Shannon’s指数(I)为0.4144;在居群水平上的遗传多样性较低,多态位点百分比(PPL)平均值为76.35%,Nei’s基因多样性(H)平均值为0.2517,Shannon’s指数(I)平均值为0.3800。Nei’s基因分化系数 Gst为0.0679,基因流 Nm为6.8654,AMOVA分子变异分析结果表明在总的遗传变异中,有95.85%的变异发生在居群内,仅有4.15%的变异发生在居群间,居群间较高的基因流水平可能是居群间遗传分化程度很低的主要原因。UPGMA聚类结果表明6个居群间的亲缘关系较近,6个换锦花居群可分为两大类群,即北仑、慈溪和象山3个居群聚成一类;奉化、镇海和舟山3个居群聚成另一类。Mantel检验的结果表明,居群间的地理距离和遗传距离之间没有显著相关性。
[硕士论文] 刘秋宇
遗传学 中南民族大学 2016(学位年度)
摘要:金腰属植物全球约65种,中国有35种8变种,中国是全球金腰分布的核心区域,但对该属植物野外调查及系统分类研究自1982年以后一直少有报道。金腰属植物因含黄酮醇类化合物而具有显著的药效,近二三十年来多有其化学成分的研究发现,但缺少该属植物的调查更新及系统分类的相关研究。武陵山脉是一座绵延湖北、湖南、重庆、贵州四省市,面积约17万平方公里的褶皱大山脉,区域内密布24个国家级自然保护区。1987-1989年间中科院对该区进行过一次比较系统的野外科考,二十多年后,武陵山区的面积、人口、行政区域及植被等情况均发生了较大变化,当时统计武陵山区内金腰属植物只有3种:大叶金腰(Chrysosplenium macrophyllum)、绵毛金腰(Chrysosplenium lanuginosum)和中华金腰(Chrysosplenium sinicum)。
  本研究主要内容包括:⑴ITS1和ITS2的GC含量相近,5.8S的GC含量最高,平均值达到50.15%。ITS1的信息位点与变异位点数比ITS2要高。在对叶亚属(Oppositifolia)的13个种间,ITS1的GC平均含量为48%,ITS2的GC含量为42.7%,ITS1高于ITS2,二者的GC含量有极显著差异(P<0.000);在互叶亚属(Alternifolia)的9个种间, ITS1的GC平均含量为43.3%,而ITS2的GC含量为46.3%,二者的GC含量差异极显著(P<0.000)。对叶亚属的ITS1 GC含量高于互叶亚属,两者差异极显著(P<0.000);对叶亚属ITS2 GC含量小于互叶亚属,两者差异极显著(P=0.002)。⑵研究发现,除中华金腰C. sinicum和山溪金腰C. nepalense以外,两亚属内种间遗传距离比两亚属之间的遗传距离小。对叶亚属中的C. sinicum和 C. nepalense之间的遗传距离最小,只有0.013,但它们与其它金腰的遗传距离都大于0.1。⑶采用了MP法、NJ法、UMPGA法、ML法和Bayes法5种方法构建了21种金腰的系统进化树,综合5种建树方法比较,本研究认为Bayes法给出进化树与形态学分类结果最为接近,其置信度和种间的分辨率也最高。MP法构建的树则与形态学分类的差异最大。⑷通过对21种金腰ITS1和ITS2的二级结构一致性预测比对,从碱基配对的稳定性结果来看,ITS1的结构变化比 ITS2大。从同一结构在不同亚属间的结构变化来看,互叶亚属内ITS1的结构变化较小,对叶亚属内ITS1结构变化较大;而 ITS2的结构变化在两亚属内都很小。综合以上情况,本研究认为金腰属植物ITS2二级结构比ITS1更保守和更稳定,且互叶亚属的ITS二级结构比对叶亚属保守。⑸金腰属和其近缘属(涧边草属,涧边草Peltoboykinia tellimoides)的ITS1都有一段连续的保守序列,这段序列在二级结构上稳定形成了H3、H12、H13、T4、L8和L7多分枝环的整块二级结构区域,我们推测此结构可能与其功能的关联较大。5.8S的二级结构在两亚属所有样本中仅在一个内环结构处表现出差异,互叶亚属为L1内环,对叶亚属为L2和L3两个相连的内环,这有可能是两亚属叶对生或互生形态学上产生差异的一个原因。在ITS2中,HIII发卡环目前在金腰中只发现了T3a和T3b两种形态结构,而在涧边草P. tellimoides中的HIII发卡环与金腰都有差异。此外,ITS2二级结构的CBCs,互叶亚属内没有发现CBCs,而对叶亚属内CBCs存在情况较普遍。根据Coleman和 Vacquier(2002)提出的CBC criterion假说,当两个种间有足够的进化距离累积产生即使一个CBC在ITS2二级结构的保守区域上时,它们也无法杂交产生后代[1-3]。因此我们认为对叶亚属内种间杂交的可能性远比互叶亚属内少,对叶亚属更趋向于各自独立进化,而互叶亚属可能更容易发生种间杂交产生新变种等。⑹C. sinicum和C. nepalensel与其它金腰的整体差异较大,这两个物种的ITS整体GC含量高于其它金腰,尽管二者属于对叶亚属,但它们与互叶亚属金腰的遗传距离更小,系统进化树的聚类分析中它们单独被归于另一个与对生、互生分支并列的第三分支上。此外,我们还发现只有这两种金腰存在碱基插入位点(或是其它金腰在这个位点集体碱基缺失)。在 CBCs的分析中发现,C. sinicum和C. nepalensel及其它对生叶种都存在CBCs,与互生叶种却没有,它们与互叶亚属杂交的可能性比和对叶亚属内其它金腰杂交的可能性更大,C. sinicum和C. nepalense在进化上可能处于更靠近金腰属基部起源的位置,在它们之后才分化产生了互生亚属和对叶亚属。
[硕士论文] 石涛
动力工程 重庆大学 2016(学位年度)
摘要:近年来,能源短缺和环境污染已经成为影响世界经济和社会发展的重大问题。微藻作为一种新型的生物质能源,具有光合作用效率高、生长周期短、占地面积小、生产成本相对较低、油脂产率高以及二氧化碳固定率高,且与玉米、油菜籽等传统生物燃料相比,具有不与人争粮、不与粮争地的巨大优势,因而越来越受到重视。
  用于微藻培养的反应器主要包括开放式和封闭式两种。跑道池反应器是目前使用最为广泛的开放式微藻培养系统,其优势是成本低,容易进行扩大化培养。跑道池的发展受到微藻光合效率、传质以及光照等因素的限制,生产效率低。目前针对跑道池反应器的研究主要集中在对反应器性能的强化以及培养条件的优化层面上,而对如何科学的设计反应器研究较少。
  本文对不同类型的跑道池反应器进行了分类整理,基于生化反应动力学中的单一限制性光生物反应动力学模型,提出了传统结构跑道池反应器的设计计算方法,并且以普通小球藻为培养对象,进行了跑道池光生物反应器的设计计算。基于设计计算的结果,作了电厂烟气培养微藻生产生物柴油系统的全生命周期评价。对生物法、物理法、化学法三种固定CO2法进行了全生命周期评价的对比分析。在跑道池反应器设计方法的基础上,根据全生命周期评价的结果,提出了跑道池反应器的设计和运行的改进方案。
  主要研究内容和成果如下:
  ①研究了利用单一限制性光生物反应动力学模型求解跑道池反应器的生物质产量。在单一限制性光生物反应动力学模型中,把平均光强作为限制因素,利用平均光强和培养液浓度以及液深的关系,通过单一限制性光生物反应动力模型和长直管道模型研究得到了微藻收获时的浓度和液深的关系式。研究跑道池反应器的结构尺寸对功耗的影响,得到了跑道池反应器功耗和其结构尺寸的关系式。利用跑道池反应器单位面积生物质产量和功耗的关系式,以跑道池单位面积能量净收益最大为标准确定跑道池的相关参数。基于跑道池相关几何结构参数和运行工况参数进行跑道池反应器曝气系统和动力系统的设计,得到跑道池反应器的设计方法。
  ②利用普通小球藻降解电厂烟气中的 CO2进行跑道池反应器实例设计计算,得到了液面处光强为300μmol/m2·s时,跑道池反应器直槽道宽为3m,长为30m,培养液液深为0.25m,流速为0.21m/s时其单位面积净收益最大为0.377MJ/m2,单个跑道池反应器的年生物质产量为1289.754kg。
  ③研究了电厂烟气培养微藻生产生物柴油系统的生命周期情况,系统的边界范围是从电厂烟气除杂脱硫开始到生产出生物柴油结束,生产1kg生物柴油为功能单位,将电厂烟气培养微藻生产生物柴油系统划分为电厂烟气的除杂脱硫过程、高温烟气余热回收过程、微藻的培养过程、微藻的采收过程、微藻制取生物柴油过程、运输过程。利用生命周期评价方法和OPENLCA软件计算得出了如下结果:电厂烟气培养微藻系统生产生物柴油1kg的生命周期中,消耗电力6.226kW·h,柴油9.832×10?3g,石灰石0.441kg,水泥0.536kg,钢材0.319kg,混凝土0.735kg, CO26.321kg。产生CO2为-5.115kg,SO2为4.613×10?3kg,NOx为1.319×10?3kg, ethylene为5.049×10?4kg。
  ④研究了电厂烟气培养微藻生产生物柴油系统各单元过程的能耗占比以及整个生命周期各种环境影响潜值的占比情况,研究结果表明,在生产1kg生物柴油的生命周期中,微藻培养过程是能量消耗最大的单元过程,该单元过程的能耗占到了总能耗的50.272%;其次是微藻制取生物柴油的过程,占总能耗的32.151%;微藻采收过程占总能耗的12.376%;电厂烟气除杂脱硫过程占总能耗的2.819%;运输过程占总能耗的2.382%。在生产1kg生物柴油的生命周期中,全球变暖对环境的影响潜值是负的,这说明在整个利用电厂烟气培养微藻生产生物柴油的过程中是吸收环境中的 CO2的,整个生命周期中是降低了全球变暖对环境的影响。对于另外三类环境影响都是对环境排放危害物,其中光化学烟雾的影响最大,占总的环境影响潜值的78.261%;其次为酸化的影响,占总的环境影响潜值的18.577%;环境影响潜值最小的为富营养化,占总的影响潜值的3.162%。如果把全球变暖的环境影响潜值考虑在内,则总的环境影响潜值为0.018 mPET2000。
  ⑤对生物法、物理法、化学法三种固定CO2法进行了生命周期评价对比分析,研究结果表明,每处理1kg CO2的生命周期过程中,生物固定CO2法的净能值最大,为2.153MJ,其次为化学固定 CO2法,为1.1MJ,净能值最小的是物理固定CO2法,为-3.6MJ。对于总的环境影响潜值,生物固定CO2法最小,为0.004 mPET2000,化学固定CO2法最大,为0.114 mPET2000,物理固定CO2法为0.019 mPET2000。
[硕士论文] 夏倩华
微生物与生化药学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:青蒿素是药用植物黄花蒿(Artemisia annuaL.)中倍半萜内酯成分,是速效、低毒和安全的治疗脑型疟疾和抗氯喹疟疾的药物。目前,青蒿素主要是直接从黄花蒿植株中提取,但野生黄花蒿资源有限且分布零散品质、质量无法保障,从而限制了青蒿素的大规模生产。目前已有大量研究表明:植物内生菌能够产生新的生物活性物质,同时提高植物次生代谢的产量,是具有重要应用前景的生物资源。因此,本文研究了一株黄花蒿内生放线菌对黄花蒿生长、生理及青蒿素生物合成的影响,并对其影响青蒿素生物合成的机制作了初步探讨。
  本文从野生的黄花蒿植株中分离获得了一株形态明显、生长较快的内生菌,通过形态观察及16S rDNA基因测序结果,进行同源性比对并构建了系统发育树,发现该菌株属于放线菌目链霉菌属,与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、索马里链霉菌(Streptomyces somaliensis)、黄抗霉素链霉菌(Streptomyces flavofungini)相似性达到99%。该菌株16S rDNA基因序列在Genbank上注册获得登录号为KJ589646,定名为内生链霉菌(Streptomyces sp.)。我们发现该菌没有溶解无机磷的能力,但能够产生少量植物生长激素吲哚乙酸(IAA),且其产IAA的生物途径主要是L-色氨酸依赖型的。通过回接分离确认了内生链霉菌能够定殖在黄花蒿内部。内生链霉菌回接后对黄花蒿植株生长影响较小,能够轻微促进根的生长但对地上部分各生长指标均无影响。内生链霉菌回接后在植物生长后期,H2O2的含量达到对照的1.12倍,超氧化物歧化酶(SOD)的活性降低而H2O2的清除酶类(包括抗坏血酸过氧化物酶APX、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD)活性增加,提示内生链霉菌处理后,黄花蒿植株的防御反应增强。探究了在内生链霉菌回接66天后黄花蒿幼苗中青蒿素含量的变化及其机制。我们发现内生链霉菌处理后青蒿素含量相比对照提高了1.98倍(0.07 mg/g)。回接引起黄花蒿叶片腺毛数量变少但长度增大,同时,青蒿素生物合成途径中上游甲羟戊酸(MVA)途径关键酶基因表达提高,2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径中1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因表达提高但1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因表达降低,内生链霉菌对青蒿素生物合成下游的关键酶基因及腺毛相关转录因子表达并无明显影响,因此内生链霉菌处理后青蒿素含量的提高主要是因为链霉菌影响了青蒿素合成上游MVA途径产生了更多的异戊二烯,另外,腺毛的变化及MEP途径的变化可能也与青蒿素含量的提高有一定的关系。
[硕士论文] 王聪慧
微生物与生化药学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:黄花蒿(Artemisia annua L.)是菊科(Asteraceae)蒿属(Artemisia)一年生草本植物,主治恶疮、疟疾和寒症等各种发热症。青蒿素是其主要抗疟成分,在黄花蒿腺毛中合成。由于青蒿素化学合成工艺复杂不能用于商业生产,野生黄花蒿资源日益匮乏且青蒿素含量偏低,青蒿素的生物合成研究受到了研究工作者的广泛重视。WD40转录因子基因与植物叶片表面腺毛发育、次生代谢相关。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate Reductoisomerase,DXR)是青蒿素合成中的关键限速酶。对黄花蒿转录因子和关键酶的研究,对了解青蒿素的的生物合成及其调控具有重要的理论意义。本研究利用RACE技术克隆出了AaWD40基因;并利用RNAi探讨了DXR基因与黄花蒿生长发育及青蒿素合成的关系。
  本研究利用RACE技术从黄花蒿中克隆出AaWD40基因,并对其进行了生物信息学分析。AaWD40基因的cDNA全长1498 bp,其中5'末端非翻译区为209bp,3'末端非翻译区为183 bp。开放阅读框(ORF)的长度为1106 bp,编码368个氨基酸残基,DNAMAN分析预测其等电点为4.64,分子量为41.29 kDa。对AaWD40氨基酸序列进行同源性分析,发现其与多种植物具有较高的同源性。生物信息学分析发现AaWD40氨基酸序列含有4个典型的WD40重复区域,符合WD40基因的特征,所以命名为AaWD40。利用Swiss-Model对AaWD40蛋白进行三级结构分析,AaWD40蛋白空间结构错综复杂,与多种植物 WD40空间结构域非常相似。系统发育树分析AaWD40与其他WD40均源于同一祖先,并且AaWD40与DpWDR、GhTTG4的亲缘关系最为接近。利用Gateway克隆的技术构建了DXR-RNAi载体,我们根据BLAST的结果选取了一段523 bp的干扰片段。通过BP反应,成功地把目的基因导入到入门载体 pDONR221,并通过LR反应构建了目的载体pSGRNAi-DXR,即本实验所需要的RNAi载体。我们应用PCR鉴定、酶切鉴定、测序的方法,确认了载体的成功构建。同时,我们运用冻融法将重组质粒转入农杆菌LBA4404,PCR鉴定结果显示目的载体成功导入农杆菌。根据以上实验基础,我们利用农杆菌介导的叶盘法成功地诱导出了转基因黄花蒿,经过kan抗性筛选共获得36株抗性转基因黄花蒿,并将其和野生型黄花蒿一起炼苗。为后续研究黄花蒿DXR基因功能奠定了基础。利用PCR反应对36株kan抗性植株进行检测,其中有5株获得目的条带,并以黄花蒿Actin为内参,用黄花蒿DXR基因的特异引物进行荧光定量PCR检测,发现转基因植株DXR的表达量比野生型植株显著下调(平均下调了68%),RNAi显著地影响了黄花蒿内源DXR基因的表达。观察发现DXR-RNAi后,转基因黄花蒿的根和茎明显伸长;叶片面积明显减小;腺毛密度明显下降,腺毛大小显著增加。HPLC检测结果表明,DXR-RNAi后青蒿酸和青蒿素含量显著下调,平均减少了39%和58%。研究结果初步证明了DXR基因在黄花蒿根、茎、叶生长和腺毛发育中发挥重要作用,DXR基因能够调控青蒿酸和青蒿素的生物合成。通过本研究,从黄花蒿中克隆出AaWD40基因,并对其进行了生物信息学分析,为进一步研究 AaWD40与黄花蒿生长发育,尤其是与黄花蒿腺毛发育的潜在关系提供了理论基础。同时本研究利用RNAi技术,分析了DXR基因在黄花蒿生长及青蒿素代谢中的重要调控功能,发现其影响黄花蒿生长、腺毛发育及青蒿素生物合成。
[硕士论文] 侯宇荣
植物学 安徽师范大学 2016(学位年度)
摘要:本文从物候学、形态解剖学、繁育生物学等方面研究凤丹皮基原植物的生物学特性。具体结果如下:⑴物候特征:1月下旬至2月中旬芽萌动期;2月上旬至下旬萌发期;2月中旬至2月下旬显叶期;2月下旬至3月上旬张叶期;3月上旬到3月下旬展叶期;3月中旬至4月上旬风铃期;3月下旬至4月中旬透色期;3月下旬到4月下旬开花期;凤丹单花花期5-9天,整体花期23-25天;4月中旬进入果实生长期;7月上旬至8月上旬秋叶变色期;9月上旬至10月中旬枯叶期,之后凤丹进入漫长的休眠期。⑵石蜡切片的观察结果表明,三年生凤丹根由周皮、维管束和维管形成层组成,初生维管束不明显,次生木质部处于中央,次生韧皮部占根横切面70.4%,且其内部薄壁细胞中含有大量晶体,并随着年限的增加而增加。茎由表皮、皮层、维管束和髓组成,外韧维管束,散孔材型木质部,髓腔占横切面的53.57%,髓细胞中含有晶体,一并随着年限的增加而增加。叶是由表皮、叶肉和叶脉构成的异面叶,表皮细胞外被角质膜,气孔分布于下表皮,含有多级叶脉。成熟雄蕊的中层细胞纤维状加厚,属于比较原始的特征。雌蕊柱头乳突细胞分布均匀,花柱分化明显,属于比较进化的特征。⑶雄蕊自内轮向外轮依次散粉,花粉活力持续时间较长,不同阶段花粉活力从高到低依次是初开期、盛开期、绽口期、透色期和谢花期,谢花期仍保留20.8%的花粉活力。雌蕊盛花期成熟,此时柱头分泌粘液,雌蕊后于雄蕊成熟,凤丹单瓣,无雄蕊瓣化现象,花盘革质,心皮5离生,凤丹果实为蓇葖果,成熟时沿腹缝线开裂,表面布满棕黄色的绒毛,顶端有喙。⑷花粉柱头萌发的荧光观察表明,花粉落到柱头即刻萌发,1h形成花粉管,8-10h后进入子房,12h沿腹缝线随机进入胚珠,珠孔受精。⑸扫描电镜下凤丹花粉长球形,外壁表面纹饰是穴网状纹饰,极轴长度为42.47~45.88μm,赤道轴长度为20.69~23.58μm;柱头和花柱呈圆环状,受粉面积是狭长型,宽约1mm左右,凤丹种皮是不规则五边形的网格纹饰。
[硕士论文] 张萍
生物化工 大连理工大学 2015(学位年度)
摘要:高脂血症(Hyperlipemia,HLP)是指血脂代谢紊乱、升高的状态,是冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要发病因素之一。目前,用于治疗高脂血症的西药主要有他汀类、烟酸类、贝特类、胆酸螯合剂等,但是西药都会给机体带来一定的副作用。因此,研究安全、有效、毒副作用小的降血脂中草药已成为目前的研究热点。金花茶Camellia nitidissima Chi是山茶科植物,不仅具有极高的观赏价值,因其富含多种天然活性成分,具有很高的保健价值,被誉为“国宝神茶”。已有文献报道金花茶叶具有很好的降血脂作用,但是关于其花的降血脂作用以及金花茶降血脂机制尚未有人报道。因此,本论文旨在研究金花茶花提取物对高脂血症小鼠的降血脂作用,并初步探讨金花茶花降血脂作用机制。具体研究内容和结果如下:
  (1)首先通过对金花茶花水溶性成分和醇溶性成分进行提取,并分析金花茶花提取物的活性成分。结果显示,金花茶花水提取物中含有总黄酮、总多糖、总多酚和总皂苷各31.03%、30.71%、5.11%和7.39%;金花茶花醇提物中含有总黄酮、总多糖、总多酚和总皂菅各44.54%、16.14%、8.88%和10.65%。
  (2)通过建立高脂血症小鼠模型,考察金花茶花体内降血脂作用。结果表明金花茶花提取物能够改善高脂血症小鼠毛发竖立、发黄、油腻的状态;显著性(P<0.05)降低小鼠血清中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平,升高高密度脂蛋白胆固醇水平,金花茶花提取物对机体内的抗氧化能力也有所改善;金花茶花提物还能够显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶水平,改善肝细胞损伤。
  (3)为进一步观察金花茶花提取物对肝脏脂肪积累的影响及其防治脂肪肝的作用机理,我们通过油红O染色、HepG2细胞内TG水平以及RT-PCR法,考察不同浓度金花茶花提取物对油酸诱导HepG2细胞脂肪积累的影响。实验结果表明,金花茶花提取物能够有效地减少油酸诱导HepG2细胞脂肪的积累(P<0.05)。金花茶花水提物可减少油酸诱导HepG2细胞脂肪积累过程中FAS、HMGCR和GPAT mRNA的表达,金花茶花醇提物可减少油酸诱导HepG2细胞脂肪积累过程中HMGCR mRNA的表达。因此,金花茶花可能是通过调控FAS、HMGCR和GPAT的表达,抑制脂肪在肝脏的积累。
  综上所述,本研究证实了金花茶花提取物的降血脂功效,初步探究了金花茶花的降血脂机理,为金花茶花用于预防治疗高脂血症提供了理论依据。
[硕士论文] 王丽
植物学 佳木斯大学 2015(学位年度)
摘要:龙葵(Solanum nigrum L.)为茄科茄属一年生草本植物,是传统的中草药,全草可入药,所含生物碱能诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞转移,所含多糖可增强机体的免疫能力,临床中龙葵具有抗炎、抗休克、抑菌抗病毒、解热镇痛和祛痰止咳等作用。毛状根在有效药物成分上要比天然栽培植株中含有的有效成分偏高,并且毛状根具有生长迅速、周期短并且生长条件简单等特点,因此可以利用毛状根生产中草药药物成分。以黑龙江省龙葵为实验材料,利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) A4、C58C1和A1476进行毛状根诱导,主要研究了发根农杆菌种类、外植体类型、菌液浓度、侵染时间、预培养时间和共培养天数等因素对龙葵毛状根诱导的影响,其次还研究了龙葵毛状根对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌的抑菌作用,分析了龙葵毛状根与龙葵实生根对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌的抑菌活性差异。
  本研究主要内容包括:⑴发根农杆菌A4、C58C1和A1476侵染龙葵叶片均能诱导出毛状根,C58C1和A4诱导率较高,分别为56%和54%,但A4诱导的毛状根粗壮且生长较快。⑵用菌株A4对龙葵的叶片、茎段和叶柄进行侵染诱导。结果显示:叶片诱导率>茎段诱导率>叶柄诱导率,叶片的毛状根诱导率为51.7%,叶片生根也最早。⑶以不同浓度的A4菌液侵染龙葵叶片,OD600的值为0.6时诱导率为58%,诱导率最高。⑷用菌株A4对龙葵叶片分别选择不同侵染、预培养和共培养时间进行毛状根诱导,筛选的较佳侵染时间为5 min,预培养和共培养时间均为2 d时诱导率较高。⑸龙葵毛状根PCR的检测结果显示,发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA已经整合到了龙葵的毛状根基因组中。⑹龙葵毛状根水提物对3种供试菌均有抑制作用,龙葵毛状根对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著优于龙葵实生根;在3种供试菌中龙葵毛状根水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较强。⑺建立了黑龙江龙葵毛状根诱导体系,并利用产生的毛状根进行了抑菌实验,为大量生产毛状根以及龙葵毛状根的后续研究提供实验基础。
[硕士论文] 朱玉兰
微生物学 兰州交通大学 2015(学位年度)
摘要:本文通过阐述冬虫夏草的分类地位、形态特征、生活史、寄主蝙蝠蛾幼虫等几个方面的研究概况,针对冬虫夏草菌存在多种学说以及到目前为止还未实现科赫法则的情况,提出研究冬虫夏草相关菌株这一问题的必要性;此外,文章中还详细阐述了冬虫夏草无性型、冬虫夏草相关菌株和微生物相互作用的研究情况。在此基础上,明确本研究的目的和意义,即通过普通生物学研究,了解相关菌株的生理特性并发现相关菌株对冬虫夏草菌的影响,为相关菌株的开发利用和侵染蝙蝠蛾幼虫提供一定的理论基础。利用实验室已有的冬虫夏草菌、蝙蝠蛾幼虫等资源以及中国被毛孢实验室培养技术。以甘肃省甘南榨油沟产冬虫夏草虫体为实验材料,分离得到13株相关菌株,用平板划线和显微镜挑取单个菌丝的方法对13株菌分别进行纯化,通过平板对峙试验的方法筛选出对冬虫夏草菌产生明显抑制作用的7株真菌,提取总DNA后以此为模板进行ITS序列扩增,测序并建立系统发育树。同时,对筛选的供试菌株进行最适温度、pH、最优碳源和氮源的生物学特性研究。另外,采用平板对峙的研究方法,分别和不同接菌时间的中国被毛孢进行3次对峙培养研究,观察共同生长时对中国被毛孢产生的影响,用供试相关菌株侵染蝙蝠蛾幼虫,观察记录相关菌株对蝙蝠蛾幼虫侵染力以及侵染后蝙蝠蛾幼虫的形态特征。最后,以上述结果为基础,分析相关菌株的生物学特性、对中国被毛孢的影响以及对蝙蝠蛾幼虫的侵染力。
  本研究通过相关菌实验筛选实验得到了7株相关菌株,本研究对相关菌株定义为分离自冬虫夏草,对中国被毛孢的生长产生一定影响并对寄主幼虫有侵染力的菌株。形态学和分子生物学鉴定结果显示:3-2-1、3-4-2和3-5-2分别是曲霉属的杂色曲霉、肉色曲霉和田纳西曲霉,2F-2是棒束孢属的玫烟色棒束孢,JC-1是拟青霉属的蝙蝠蛾拟青霉,1-1是白僵菌属的白僵菌,其相似性均为99%以上。生物学特性研究表明:3-2-1、3-4-2和3-5-2的最适生长温度为23℃,最适pH为6.5,3-2-1的最优碳源为麦芽糖,3-4-2和3-5-2的最优碳源为蔗糖,这三株菌的最适氮源均为麸皮;2G-3-2的最适生长温度为23℃,最适pH为6.5,最优碳源为麦芽糖,最优氮源为牛奶;2F-2的最适生长温度为20-23℃,最适pH为7.5,最优碳源为可溶性淀粉,最优氮源为黄豆粉;JC-1的最适生长温度为20-23℃,最适pH为7.5,最优碳源为麦芽糖,最优氮源为牛奶和黄豆粉;1-1的最适生长温度为20-23℃,最适pH为7.5,最优碳源为蔗糖,最优氮源为麸皮。平板对峙实验结果显示:同时接菌时,相关菌株对中国被毛孢均产生了抑制作用,当中国被毛孢提前接菌30天时,相关菌株对中国被毛孢的抑制作用发生变化。三次试验中,3-2-1和3-4-2对中国被毛孢的抑制作用随着中国被毛孢生长稳定而减弱,甚至会转化成促进作用;而3-5-2对中国被毛孢的抑制作用同样随着中国被毛孢生长的稳定而减弱,但总体来说,3-5-2对中国被毛孢产生了抑制作用。2G-3-2和2F-2对中国被毛孢有强烈的抑制作用,但产生抑制的机制各不相同:2G-3-2对中国被毛孢的抑制作用是由于产生了抑制性代谢产物引起的,2F-2对中国被毛孢的抑制作用是营养竞争或重寄生作用引起的,这种抑制作用会随着中国被毛孢生长的稳定而减弱,但不会转变成促进作用。JC-1和1-1对中国被毛孢的抑制作用较强,这种抑制作用是因为相关菌株对中国被毛孢产生了营养竞争的作用或重寄生作用引起的,该抑制作用会因为中国被毛孢菌落直径的增大而减弱,但总体来说,相关菌株对中国被毛孢均有抑制作用。证明供试相关菌株可侵染蝙蝠蛾幼虫,和中国被毛孢均是寄主蝙蝠蛾幼虫的致病菌;供试菌株与中国被毛孢在蝙蝠蛾幼虫体内至少存在营养竞争的关系;侵染力各不相同,由高到低依次为:JC-1、1-1>2F-2>3-4-2>3-5-2>3-2-1,说明各供试菌与中国被毛孢之间还存在其他关系,需要进一步研究证实。
[硕士论文] 路鑫龙
生物工程 兰州理工大学 2015(学位年度)
摘要:近年研究表明,植物内生真菌种属众多,数量庞大,从其次生代谢产物中已分离出许多结构新颖的活性物质,具有良好的药理活性。本文选用甘草为研究材料,对甘草内生真菌及其代谢产物进行活性研究。内容主要包括:甘草内生真菌的分离鉴定;抑菌活性的研究;抗氧化活性的研究;抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究;化学成分的分离和活性的研究。
  本研究主要内容包括:⑴利用组织切块法从生长状况良好的新鲜甘草中分离得到36株内生真菌,经形态学鉴定及分子生物学鉴定,36株内生真菌分别为青霉属(Penicillium sp.)4株、根霉属(Rhizopus sp.)8株、木霉属(Trichoderma sp.)11株、镰孢霉属(Fusarium sp.)5株、曲霉属(Moniliales sp.)7株和小鼻枝霉属(Rhinocladiella sp)1株。⑵内生真菌发酵液利用正丁醇和乙酸乙酯萃取;菌丝体利用乙醇回流提取,共得108个样品。对样品进行抑菌实验结果显示,47个样品对6种指示菌有不同程度的抑制作用,占全部样品的43.52%,其中4个样品对6种指示菌全部具有较强的抑制作用,对4个样品进行最小抑菌浓度实验结果显示其对指示菌的最小抑制浓度为0.25mg/mL。⑶所有样品在浓度为0.05mg/mL时均表现出了一定的还原能力,G-207正丁醇萃取物和G-601菌丝体提取物的还原力分别达到2.607和2.656,略低于阳性对照Vc的还原力2.693。⑷样品在0.25mg/mL时对·OH清除率较强,有11个样品对·OH的清除率在75%以上,占样品总数的10.12%。其中G-504的菌体部为和G-603的正丁醇部萃取物对·OH的清除率分别达到93.65%和94.76%,都高于阳性对照 Vc清除率的92.86%,显示出极强的清除活性。⑸当样品浓度在0.025mg/mL时,108个样品中,101个样品都显示出对DPPH·不同程度的清除作用,53个样品对DPPH·的清除率在50%以上,占总体的49.07%,其中G-102、G-105、G-202、G-504的正丁醇部位;G-207、G-402、G-601的菌丝体部位;G-203、G-304的乙酸乙酯部位对DPPH·的清除率在75%以上,G-601菌丝体部位的清除率是96.07%,高于阳性对照Vc的95.75%。⑹当样品浓度在1mg/mL时,绝大多数粗提物对α-葡萄糖苷酶的活性具有一定的抑制作用。其中G-203、G-207和G-602的乙酸乙酯粗提物,G-208、G-302的正丁醇粗提物,G-304的菌丝粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制率均在45%以上,抑制率最高的G-203的乙酸乙酯粗提物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50是0.878mg/mL,大于阳性对照阿卡波糖的0.817 mg/mL。⑺利用硅胶柱层析、薄层层析、制备薄层色谱等分离方法,从内生真菌 G-207和G-504发酵液的乙酸乙酯、正丁醇萃取物和菌丝粗提物中分离得到6种化合物,经1H-NMR、13C-NMR以及HSQC等技术对化合物鉴定结果为:5-羟基-7,3‘,4‘-三甲氧基黄酮(1)、ent-考兰烷-16,17-二醇(2)、1-亚油酸-3-棕榈酸-甘油酯(3)、邻苯二甲酸二丁酯(4)、豆甾醇(5)和3,4,5-三甲氧基苯基丙酮(6)。⑻对分离得到的6种化合物进行抑菌试验,结果显示:化合物3、5、6具有较好的抑菌活性。其中化合物3对指示菌的抑制作用最为明显,其对肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和乳链球菌的最小抑菌浓度为0.25mg/mL。⑼样品浓度在0.025 mg/mL时,所有样品都具有不同程度的还原能力,化合物1、6的吸光度值分别为2.074和2.113,略低于阳性对照Vc的吸光值2.187,具有较强的还原力。⑽以水杨酸作为Fenton试剂反应产生的·OH的捕捉剂来测定样品对·OH的清除能力,当样品浓度为0.1 mg/mL时,所有样品都具有一定的·OH清除率,化合物1、3、6的清除率在50%以上。⑾样品浓度为0.025mg/mL时,样品对 DPPH·具有一定的清除效果,化合物1、2、3、6对 DPPH·的清除率达到70%以上。化合物1、6的 IC50值分别是0.0384、0.0367(mg/mL),高于阳性对照Vc的IC50值0.0295 mg/mL。
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