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[硕士论文] 马天宇
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:分娩启动是一个复杂的生理过程,影响因素有很多,包括机体内部环境和外界环境两方面。外界因素包括摄入食物、不当的机械运动等;内在调节主要包括激素、免疫炎症以及细胞凋亡等。目前关于分娩启动过程具体分子机制的研究鲜有报道。在本实验室大白猪分娩前后胎盘组织转录本测序中筛选出GPX1差异表达基因,有研究表明GPX1可以缓解氧化应激反应,GPX1缺乏会导致非正常分娩。本试验旨在探究谷胱甘肽过氧化物酶GPX1在分娩启动的进程中的作用。
  为了探究GPX1是否在分娩启动中发挥作用,我们在怀孕15.5天孕鼠腹腔注射LPS构建小鼠早产模型,检测胎膜中ROS水平、氧化标志基因HSP90、炎症因子TNFα、IL1β以及分娩相关基因COX2的表达变化。在WISH细胞中分别转染干涉片段si-GPX1和超表达质粒,检测分娩相关基因HSP90、COX2、Caspase3、IL1β以及NFκB。为了判断GPX1发挥作用的通路,采用NFκB通路抑制剂CAPE处理WISH细胞,通过细胞免疫荧光检测NFκB以及COX2的表达变化。通过ELISA检测清平猪有无分娩征兆的羊水中PGE2的浓度。在WISH细胞中转染重组质粒pCMV-GPX124小时和48小时后,分别检测细胞上清液中的PGE2浓度。最后,通过PGE2处理WISH细胞,检测对GPX1、NFκB和COX2的影响。试验主要研究结果如下:
  1)小鼠早产模型中实验组小鼠胎膜ROS水平显著增强,氧化应激标志基因HSP90表达水平显著高于对照组,同时炎症因子TNFα、IL1β和COX2呈现高表达,蛋白结果表现一致。表明分娩启动时,氧化应激水平加剧,并出现炎症反应。在三类抗氧化标志基因GPX1、Catalase和SOD2中,实验组与对照组相比,表达水平分别是1.80、1.27和1.18倍。其中GPX1相对变化最剧烈,推断GPX1作为主要抗氧化基因。
  2)在长妊娠期及短妊娠期清平猪种中,有分娩征兆组羊水中PGE2浓度均显著高于无分娩征兆组,结果表明PGE2对分娩启动发挥重要作用。高水平GPX1可以降低HSP90的水平,表明GPX1可以降低氧化应激反应,同时激活NFκB通路上调COX2的表达,在24以及48小时后,PGE2水平均显著上升。低水平GPX1使HSP90水平升高,氧化应激水平加剧,上调炎症因子IL1β水平。GPX1从激素水平以及免疫炎症两方面参与妊娠以及分娩启动的调节。
  3)PGE2处理WISH细胞后,对GPX1产生促进作用,对NFκB以及COX2有负反馈抑制作用。这种机制可以防止PGE2水平通过NFκB通路进一步升高,避免PGE2高峰提前引发早产。GPX1的稳定表达是正常妊娠分娩的必要条件。
[硕士论文] 镇景开
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:哺乳动物的精子相关抗原16(Spag16)有两种转录子Spag16L和Spag16S,它们编码的蛋白在纤毛/鞭毛形成和运动中发挥重要作用。生物信息学分析表明小鼠和人的SPAG16L启动子区均存在多个潜在的SOX5结合位点,而SOX5基因可编码48kD转录子(S-SOX5),本研究重点关注转录因子S-SOX5对精子相关抗原基因16L(SPAG16L)的转录调节作用,为全面了解精子发育过程中鞭毛的形成提供理论基础。
  方法:(1)用Consite方法分析人SPA G16L启动子区域的序列,查找潜在的SOX5结合位点。(2)质粒构建:以实验室留存的人睾丸组织cDNA为模版,构建含有SPA G16L启动子的荧光素酶报告转录融合质粒(SPAG16L/pGL3)、S-SOX5蛋白的表达质粒(S-SOX5/pcDNA3和S-SOX5/pTarget)以及抑制其表达的siRNA质粒。(3)SPAG16L和S-SOX5在真核细胞中的表达:将SPAG16L/pGL3转染至BEAS-2B细胞,以pGL3空载体为对照,荧光素酶报告系统比较两组荧光素酶的活性以评估SPAG16L表达;将S-SOX5/pcDNA3转染至BEAS-2B细胞,以pcDNA3空载体为对照,Western blot和real-time PCR分别检测内源性S-SOX5蛋白和SPAG16L mRNA的表达水平。(4)以转染了S-SOX5过表达质粒S-SOX5/pcDNA3的BEAS-20细胞为对象,用SOX5RNAi腺病毒感染细胞,以未感染SOX5RNAi的细胞为对照,检测S-SOX5表达降低是否会使SPAG16L的表达下调。(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)实验验证S-SOX5是否直接结合SPA G16L启动子区域的SOX5结合位点,从而实现其对SPAG16L的调控作用。(6)对SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点进行点突变,检测结合位点突变后S-SOX5对SPAG16L的激活作用是否消失。
  结果:生物信息学分析表明,人的Spag16L基因近端启动子区域存在多个转录因子SOX5的结合位点。而Spag16L启动子在BEAS-2B细胞中有活性,因此使研究S-SOX5对其的转录调节成为可能。RT-PCR实验表明在BEAS-2B细胞中S-SOX5是SOX5基因的主要表达亚型,WB实验进一步证实48kDa的S-SOX5蛋白在该细胞株中表达丰富。共转染实验表明外源性的S-SOX5能显著提高BEAS-2B细胞中Spag16L启动子的活性,腺病毒感染实验进一步证实,外源性的S-SOX5能提高SPAG16LmRNA的水平。SOX5RNAi转染BEAS-2B细胞后,S-SOX5的表达降低使SPAG16L的表达明显下降。ChIP和突变实验证实S-SOX5与SPAG16L的启动子区域的SOX5结合位点直接结合并激活SPA G16L的表达。
  结论:SPAG16L是S-SOX5的靶基因,S-SOX5对SPA G16L的转录调节是通过与SPAG16L启动子区域的SOX5结合位点直接结合而实现的。
[硕士论文] 张世阳
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究鞭毛内转运蛋白172(Intraflagellartransportprotein172,IFT172)在小鼠生精细胞中的功能以及精子鞭毛形成过程和生育能力中的作用。
  方法:1、将成年的Ift172flox/flox雌性小鼠与Stra8-iCre雄性小鼠杂交,建立的Ift172生精细胞条件敲除小鼠为实验组小鼠,以野生型小鼠为对照。2、用10对六周以上的Ift172条件敲除雄鼠或野生型雄鼠分别与成年的野生型雌鼠交配两个月以上,评估其生育力及繁殖能力。3、收集附睾精子,精子计数,检测精子活力,光镜下观察精子形态。4、收集小鼠睾丸和附睾进行HE染色,观察精子发生过程的各个阶段。5、透射电镜(TEM)观察两组小鼠精子的超微结构。6、蛋白印迹(WesternBlot)检测IFT25、IFT27、IFT81、AKAP4、ODF2、SPAG16L等相关蛋白的表达水平。7、分离小鼠睾丸生精细胞,免疫荧光染色染色检测IFT172的定位以及Ift172条件敲除小鼠体内IFT172敲除水平,并观察精子中纤维鞘蛋白AKAP4和外周致密纤维蛋白ODF2的定位。
  结果:Ift172floJflox;Stra8-iCre条件敲除小鼠都能够生长至成年。1、与正常的小鼠相比较,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的睾丸重量/体重比例没有明显差别。其中有六成的成年雄性纯合子小鼠是不育的。2、组织学检测显示,与野生型小鼠相比,Ift172flox/flox;Stra8-iCre条件敲除小鼠的精子形成阶段发生异常。3、Ift172被敲除后,小鼠附睾中仅残存少量发育完全的精子,大部分精子出现精子尾卷曲。且精子数目比野生型小鼠减少了10倍左右,精子活力较野生型小鼠有明显降低。4、与野生型小鼠相比,在Ift172条件敲除小鼠的睾丸内,其他的几种IFT家族B复合物的成员IFT20、IFT25、IFT27和IFT81以及IFT家族A复合物中的IFT140的表达水平没有明显的变化。此外,轴丝蛋白SPAG16L的表达量也没有明显变化。但是外周致密纤维结构蛋白ODF2以及线粒体鞘蛋白AKAP4的表达量显著下降。5、免疫荧光染色结果显示,在野生型小鼠中IFT172定位在生精细胞中定位在长形精子细胞的精子领处,而AKAP4和ODF2在Ift172条件敲除小鼠精子中的定位与野生型小鼠相比没有明显改变。
  结论:IFT172在生精细胞中表达量减少导致小鼠精子数目、活力以及生育能力下降,IFT172是一个对于雄性小鼠的生育能力以及精子发生所必需的蛋白,它很可能参与精子发生过程中特殊的结构蛋白的运输和组装。
[博士论文] 杨艳
转基因生物安全学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:任何转基因作物在进入商业化应用之前都必须经过严格的环境风险评价。评价转基因作物特别是抗虫作物对农田重要非靶标节肢动物的生态影响是其中一项重要内容。非靶标安全评价需要以农田中栖居的节肢动物群落知识等作为依据。此外,田间节肢动物种类繁多,不可能对所有节肢动物进行评价。因此,需要遴选合适的节肢动物代表种。基于系统的文献检索和Microsoft Access2010(结构化查询语言SQL)软件,构建了我国主要作物田节肢动物数据库。该数据库可用于转基因作物环境风险评价的四个方面1)非靶标物种的识别,2)辅助实验量物种的确定;3)辅助高级Tier试验物种的选择,4)为商业化后的环境监测确定合适的物种。
  该数据库收集了来自中国34个省级行政区域超过900篇的文献,包括2520种节肢动物18375条物种丰富度的记录。数据库提供了我国主要作物水稻、玉米、大豆、棉花和小麦五种作物田节肢动物的详细生物学信息及地理分布信息,主要包括节肢动物物种的拉丁名、异名、分类、地理分布、丰富度、生态功能、栖息习性及取食习性等,还包括了不同研究中采集物种的经纬度信息、节肢动物的调查取样方法和时间等信息。
  数据库收集的节肢动物种类涵盖了25个目、255个科。其中,蜘蛛目(458种)、半翅目(436种)和鞘翅目(417种)是记录物种最多的三个目。来自蜘蛛目、膜翅目、半翅目、鞘翅目、鳞翅目和双翅目六个目的节肢动物数量占总物种数的93%。所记录的节肢动物中,植食性节肢动物1091种,捕食性节肢动物938种;寄生性节肢动物502种。有关传粉类节肢动物的研究记录很少,本数据库仅收录28种传粉类节肢动物。分解类节肢动物(土壤昆虫)的研究记录极少,该数据库仅收录9种分解类节肢动物。
  结合我国各省五种作物的种植分布情况,绘制了我国节肢动物分布图。每种作物在每个省因种植情况的不同,其田间节肢动物物种的研究情况也不相同。其中,水稻田节肢动物物种数量最多的省份是湖南省(1198种)、其次是福建省(993种)、广东省(785种)、贵州省(602种)及湖北省(478种),棉花田节肢动物记录最多的省份是湖北省(553种)、其次是新疆维吾尔自治区(401种)、河南省(293种)、山东省(256种)和安徽省(236种),大豆田节肢动物记录最多的省份是吉林省(363种)、其次是安徽省(349种)、黑龙江省(158种)、福建省(144种)和江苏省(124种),玉米田节肢动物记录最多的省份是山东省(175种),其次是吉林省(146种)、湖北省(110种)、河南省(101种)和黑龙江省(84种),小麦田节肢动物记录最多的省份是河南省(132种)、其次是新疆维吾尔自治区(108种)、河北省(103种)、陕西省(49种)、宁夏回族自治区(45种)及黑龙江省(45种)。不同省份不同作物上的节肢动物被研究和记录频次与该作物在本地区的种植面积和重要性相关。
  为了阐明该数据库的功能和作用,通过5个假设案例和2个实际案例演示了如何利用该数据库科学遴选节肢动物指示种以支持转基因作物的生态风险评价工作。基于数据库中数据的分析,初步提出了在转基因作物非靶标效应评价中应该重点关注的物种名单,为精准评价转基因作物的生态风险奠定了基础。同时,分析了该数据库在查询田间濒危物种及田间节肢动物种群动态监测方面可发挥的作用。最后,分析了数据库的不足之处及需要进一步完善的地方和方法。
[博士论文] 王泽祥
预防兽医学 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:弓形虫是专性细胞内寄生的顶复门原虫,具有复杂的两宿主生活史,速殖子和包囊是其在中间宿主体内产生的两种形态,卵囊是终末宿主体内产生的形态。弓形虫分为四种主要的基因型(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和12型),中国1型(Chinese1,ToxoDB#9)是中国大陆占主导地位的基因型,不同基因型的分布和对宿主的致病性有较大差异。本课题应用定量蛋白质组学技术和修饰蛋白质组学技术,对弓形虫不同发育期、不同虫株孢子化卵囊的蛋白质组和不同虫株速殖子的磷酸化修饰和乙酰化修饰蛋白质组进行了研究。
  应用iTRAQ技术研究了Ⅱ型(ToxoDB#1)PRU虫株速殖子、包囊、孢子化卵囊三种不同发育阶段的比较蛋白质组。毒力因子和核糖体蛋白呈现出独特的表达方式,毒力因子在孢子化卵囊阶段表达量最高,包囊次之,速殖子最低。孢子化卵囊和包囊与速殖子相比,分别有33个、46个核糖体蛋白上调表达,无核糖体蛋白下调表达,这可能与孢子化卵囊和包囊的宿主适应性有关。
  应用iTRAQ技木研究了Ⅱ型(ToxoDB#1)PRU虫株和ToxoDB#9PYS虫株孢子化卵囊的比较蛋白质组。与PYS虫株相比,PRU虫株2个毒力因子上调表达,13个毒力因子下调表达,10个与孢子化卵囊对外界环境抵抗力相关的卵囊壁蛋白上调表达,3个卵囊壁蛋白下调表达,提示PRU虫株和PYS虫株孢子化卵囊在毒力和对外界环境抵抗力方面存在差异。
  应用定量磷酸化修饰蛋白质组学技术,研究了不同基因型弓形虫速殖子之间的磷酸化修饰蛋白质组学差异。共鉴定到759个磷酸化蛋白,在RH/PRU组、PRU/PYS组、PYS/RH组中分别鉴定到392个、298个和436个差异磷酸化蛋白。在RH/PRU组、PRU/PYS组、PYS/RH组中分别有3个基序、3个基序、5个基序差异表达,这在一定程度上揭示了弓形虫不同基因型速殖子表达激酶种类和激酶识别底物特性的差异。
  应用非标记定量乙酰化修饰蛋白质组学技术,研究了不同基因型弓形虫速殖子之间的乙酰化修饰蛋白质组学差异。共获得566个乙酰化蛋白,在RH/PRU组、PRU/PYS组、PYS/RH组中分别鉴定到15个、3个和26个差异乙酰化蛋白。与PYS虫株和PRU虫株相比,RH虫株速殖子中的组蛋白乙酰转移酶和甘氨酰-tRNA合成酶上调表达,这在一定程度上反映了不同虫株弓形虫应对外界压力和发育万面的差异。
  综上所述,本课题首次对弓形虫Ⅱ型(ToxoDB#1)PRU虫株不同发育期的比较蛋白质组、Ⅱ型(ToxoDB#1)PRU虫株和ToxoDB#9PYS虫株孢子化卵襄的比较蛋白质组,以及Ⅰ型(ToxoDB#10)RH虫株、Ⅱ型(ToxoDB#1)PRU虫株和ToxoDB#9PYS虫株速殖子的磷酸化及乙酰化修饰蛋白质组进行了研究,揭示了弓形虫不同发育期、不同虫株孢子化卵囊的蛋白质组差异和不同虫株速殖子的蛋白质翻译后修饰特征。研究结果为进一步深入研究弓形虫的生物学特性和基因型多样性奠定了基础。
[硕士论文] 尹晓燕
化工过程机械 山东大学 2017(学位年度)
摘要:马蹄蝙蝠有一个积极的超声波声纳系统,允许动物在结构丰富的自然环境中导航和捕捉猎物。这种生物声纳系统的组件包含一个不寻常的动态系统,在实现动物的优良的感官性能中起着关键性作用。马蹄蝙蝠生物声纳采用精心设计的挡板形状来对传出和传入的超声波进行衍射,超声从被鼻叶包围的鼻孔发出然后被大外耳接收。当超声衍射发生时,鼻叶和耳朵就被驱动。在发射端,两鼻叶即前叶和鞍,已被证明是与超声发射同步运动。在接收侧,外耳已显示在约100毫秒内发生高达20%的相对于耳朵总长度的形变。由于这些形变的产生,传入和传出超声的衍射变成了一个动态的过程。动态的衍射过程导致类似的动态装置特性,如果这种额外的动态维度被发现在本质上提高了感官信息的编码,那么马蹄蝙蝠生物声纳可以作为一个动态的过程应用于传感技术。本文将会介绍目前已知的关于蝙蝠生物声纳的动态效果,同时将会对生物声纳和类似工程的感官系统如声纳和雷达进行对比。
  蝙蝠种群中的马蹄蝠(Rhinolophidae)和相关的旧大陆鼻叶蝠(Hipposideridae)都显示出将明显的耳朵动作作为其生物体行为的一部分。在当前的工作中,通过耳朵上标记点的三维重建来定量分析这些耳朵运动。在两种物种中观察到的耳朵运动都分为两类:在“刚性旋转”运动中,耳朵的几何形状保持不变,仅仅改变在空间中的旋转方向。在“柔性运动”中,耳朵的几何形状发生变化,这在标记点之间的距离变化中是明显的。线性判别分析结果表明,两种类型的运动可以在分析的数据集中没有任何重叠的情况下分离。因此,来自两个物种的蝙蝠有两种独立类型的耳朵运动,它们之间显然没有过渡。两种不同运动在动物生物体行为中的作用仍有待确定。
  已知蝙蝠通过多普勒频移补偿机制来进行捕猎和追踪,本文将通过实验的方法来探究快速耳朵运动能否对回声产生较大的多普勒频移值,从而激发蝙蝠启动其多普勒频移补偿机制。
[硕士论文] 陈璐
林学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:健康的河流生态系统对人类社会的可持续发展具有重大意义。河流的水环境污染被公认为世界上最重要的环境问题之一,许多研究表明,河流污染严重影响河流生态系统和人类身体健康。底栖动物是淡水生态系统的一个重要组分,对了解生态系统的结构和功能有重要意义,相对来说底栖动物生活区域比较狭窄,有较长的生命周期,具有多种生态功能,对污染物表现出一系列的敏感性,是生物评价中应用最为广泛的类群之一。展开对河流底栖动物的群落结构调查以及河流健康评价对我国河流生态系统的保护与可持续利用具有重要的应用价值。基于此,本研究于2012年1月至2015年9月间在海南和广西选取四条河流对底栖动物进行了全面调查,主要结果如下:
  (1)万泉河流域中共采集到底栖动物5门9纲58科102属种,其中水生昆虫67种,寡毛类属5种,软体动物19种,其它类群11种。
  (2)松涛水库入库的六条河流(南开河、南美河、南溪河、南叉河、南湾河和南春河)中共采集到底栖动物128属种,其中枯水期采集到5门8纲61科120属种,平水期采集到3门5纲50科94属种,丰水期3门6纲45科84属种。
  (3)刁江冬季采样记录底栖动物45个属种,其中水生昆虫共33属种,软体动物5种,寡毛类仅记录3属种,春季采样共记录底栖动物58个属种,其中水生昆虫共49属种,软体动物,共记录6种,其它类群3种。
  (4)龙江共计采得底栖动物64种,隶属于4门8纲30科58属种。水生昆虫占总种类数的45.3%,其中摇蚊是种类数最多的类群,占总种类数的26.6%,共有17种。寡毛类和腹足纲软体动物分别占总种类数的25%和15.6%。
  (5)本文通过大型底栖动物多样性综合指数来评估流域生态健康情况。松涛水库入库河流的多样性较高,且三个时期的多样性指数相差不大,枯水期健康情况优秀,平水期优秀,丰水期良好。万泉河流域生物多样性较高,各主干支流中,共有3条河流达到良好标准,3条河流健康情况一般。综合来说,万泉河和松涛水库入库河流健康情况都为良好。
  (6)我们将刁江不同位点根据重金属分值分为对照组,低浓度组,中浓度组和高浓度组。不同重金属浓度对底栖动物大多数指标,如种类数和现存量具有不同的影响。
  (7)随着发生重金属污染时间的推移,许多生物多样性指标有所回升,其中水生昆虫种类数,总种类数,每个样点的种类数,累积种类数和Shannon-Wiener多样性指数与重金属污染事件时间呈正相关。
[硕士论文] 陈军
林学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:羚牛(Budorcas taxicolor)隶属于牛科,是一种大型的草食性动物。由于其形体特及地理位置分布的差异,羚牛被分为四个亚种,分别为:高黎贡羚牛(Budorcas taxicolortaxicolor)、不丹羚牛(Budorcas taxicolorwhitei)、四川羚牛(Budorcas taxicolortibetana)以及秦岭羚牛(Budorcas taxicolorbedfordi)。其中四川羚牛与秦岭羚牛是中国特有。秦岭羚牛也称金毛扭角羚,与其它三个亚种相比,它体型最大,长相最美丽,威武,而且数量也最为稀少,全世界不足5000头。近年来,由于自然环境的恶化以及人类活动的影响,羚牛的栖息地受到了严重的破坏,此外还有捕猎等原因,致使了羚牛种群数量的急剧下降。因此这一珍稀物种的栖息地保护与种群恢复的问题亟待解决。
  哺乳动物的肠道菌群是一个复杂的系统并在宿主健康和肠道内环境稳定上扮演了重要的作用。随着测序技术的不断进步,高通量测序技术让我们能够深层次的了解肠道菌群的结构与多样性。本研究选取羚牛中最为珍贵的秦岭羚牛为研究对象,通过高通量测序的方法对其肠道多样性进行研究,试图揭示秦岭羚牛的肠道微生态。
  本研究通过高通量测序技术对9只来自济南的健康金毛扭角羚进行肠道菌群16S rRNA基因片段V3-V4区进行深入研究,共得到有效序列670356条,以97%的一致性(Identity)进行聚类,获得12992个OTUs。结果显示,金毛扭角羚的肠道菌群包含20个门,40个纲,62个目,96个科和216个属。其中,Firmicutes(67.59%)是丰度最高的菌门,其次为Bacteroidetes(23.57%)与Proteobacteria(2.37%)。其中肠道中前三的优势菌科分别为:Ruminococcaceae(49.61%),Rikenellaceae(10.93%)和Lachnospiraceae(6.41%)。除此之外,与冬季相比,春季金毛扭角羚肠道菌群具有更高的菌群丰富度(P<0.05),其菌群多样性与均匀程度不存在显著的差异。我们猜测冬春两季肠道菌群组成和结构的差异可能是由于食物质量的变化造成的。本研究提供了秦岭羚牛肠道微生物的基础理论数据,同时能够为我们对这一濒危物种的保护和利用提供新的见解。
[硕士论文] 孙国雷
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:本研究中的三种羊亚科动物包括:喜马拉雅塔尔羊、欧洲盘羊和岩羊。国家Ⅰ级和Ⅱ级保护动物喜马拉雅塔尔羊和岩羊的数量在不断的减少,栖息地的改变与破坏使现存的塔尔羊数量仅500只左右,世界濒危物种欧洲盘羊的数量在1000只左右。资源过度利用或盗猎,都是导致其种群大幅下降的原因。
  在动物的消化道中存在着数量极其庞大的微生物群落,并构建成动物体内部最为复杂的生态系统;消化道内部微生物与宿主之间经过相互作用使两者之间发生协同进化。动物体内微生物对生物体物质代谢,能量传递,信号传导以及动物的免疫系统有着重要的影响。动物肠道微生态的研究已经在部分家养动物体内展开,但对于野生物种的研究相对较少。利用二代高通量技术可以克服传统分离培养和传统分子生物学方法存在的弊端,可以对肠道微生物群落结构进行更精确的鉴定并得到系统的数据分析;利用二代高通量技术对塔尔羊、岩羊和欧洲盘羊的肠道微生物的研究还未见报道。
  本研究利用采自青海西宁野生动物园和山东济南动物园的岩羊8只,欧洲盘羊9只,喜马拉雅塔尔羊11只作为研究对象,对其肠道微生物16S rRNA基因序列进行扩增,构建小片段文库并进行双末端高通量测序,共得到超过185万条非嵌合体序列。以97%的序列一致性将得到的非嵌合体的序列进行OUTs的聚类并进行物种注释。28个样本平均划出OTUs数目为1382。物种注释结果显示:喜马拉雅塔尔羊肠道微生物结构分属16个门224个属;低海拔盘羊组分属21门218个属,高海拔盘羊组分属28门298属;低海拔岩羊组分属17门210属,高海拔岩羊组分属20门246属。按丰度排在前两名的分别是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),且厚壁菌门在研究的所有样本中丰度占比均在50%以上,占绝对优势。拟杆菌门与厚壁菌门丰度占比之和均在在80%,厚壁菌门与拟杆菌门丰度占比最高的分别为梭菌目(Clostridiales)和拟杆菌目(Bacteroidales),而这两个目与纤维素、半纤维素等粗纤维的消化密切相关。
  统计分析发现,同一海拔同一饲养条件下,三种羊亚科动物的肠道微生物群落结构存在一定的差异性,喜马拉雅塔尔羊的厚壁菌门与拟杆菌门的比值和梭菌目的丰度占比显著高于其他两种动物;说明塔尔羊具有比盘羊和岩羊更加高效的将草本中粗纤维转变为机体可吸收并为机体提供能量的短链脂肪酸的能力,这也使塔尔羊具有适应更高海拔与更恶劣环境的能力。岩羊与欧洲盘羊之间的差异性并未达到显著性的水平(P=0.064)。对塔尔羊样本进行性别差异分析发现,雄性样本组较雌性样本组的物种多样性略高,但肠道微生物在物种多样性和丰度上均没有达到显著性的差异水平。这可能是因为在相同饲养条件和无环境胁迫压力下,雌雄个体肠道微生物群落结构具有趋同发展的趋势。对采自高低海拔的盘羊和岩羊样本分析发现,高海拔样本组的厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著高于低海拔样本组,并且与粗纤维消化相关的梭菌目(Clostridiales)与纤维杆菌目(Fibrobacterales)丰度占比显著高于低海拔,这说明高海拔样本肠道微生物具有更强的消化纤维素、半纤维素等物质的能力,使高海拔的机体获得更多的能量适应高寒、低氧以及低能量的粗纤维的进食环境。
  本课题旨在从三种羊亚科动物的肠道微生物群落结构出发,通过统计分析动物肠道微生物的菌群结构差异探究海拔、物种、性别等因素对物种肠道微生物的影响,并为三种羊亚科动物的保护提出科学依据。
[硕士论文] 王耀新
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:哺乳动物的受精作用需要经历精子的获能、精子与透明带的结合、精子发生顶体反应和精卵细胞膜的融合四个过程。精卵细胞膜的融合是整个受精作用中最为关键的一步,此过程中精卵膜上都有大量的膜蛋白参与。目前已知精卵膜融合过程中最重要的蛋白相互作用是精子表面的精卵融合蛋白IZUMO1与卵子表面的精卵融合蛋白JUNO的结合。但仅仅IZUMO1-JUNO结合还不足以引起精卵膜融合,我们猜想应该还需要精子或卵子表面的其他蛋白之间的相互作用。
  本研究用免疫共沉淀和酵母双杂交技术探明绵羊精子表面的IZUMO1、PDIA3和TMEM190三个蛋白之间是否存在相互作用。以绵羊睾丸cDNA为模板首次克隆到779 bp的绵羊TMEM190 cDNA,包括543 bp的开放阅读框,并提交NCBI GeneBank获得登录号:KY914491。同时克隆了绵羊Izumo1和PDIA3的eDNA序列。将克隆得到的三个基因的cDNA分别与pGEX-4T-1连接构建了原核表达载体,转入大肠杆菌表达TMEM190-GST(43.9 kDa)、IZUMO1-GST(60.2 kDa)和PDIA3-GST(80.6 kDa)融合蛋白。以纯化的IZUMO1-GST蛋白为抗原免疫家兔得到兔抗羊IZUMO1抗血清;以纯化的PDIA3-GST蛋白为抗原免疫小鼠得到鼠抗羊PDIA3抗血清。Western Blot检验证明得到的两种抗血清均能识别GST和GST融合蛋白。为了进行免疫共沉淀实验,我们用pCMV-HA-C、pCMV-Flag-C构建了真核表达载体:pCMV-IZUMO1-HA、pCMV-IZUMO1-Flag、pCMV-PDIA3-HA、pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA和pCMV-TMEM190-Flag。将pCMV-IZUMO1-HA与pCMV-PDIA3-Flag、 pCMV-TMEM190-HA与pCMV-PDIA3-Flag、pCMV-TMEM190-HA与pCMV-IZUMO1-Flag分别共转染293T细胞,用兔抗HA多克隆抗体为IP抗体,用自制的鼠抗羊PDIA3抗血清检测IZUMO1-HA与PDIA3-Flag和TMEM190-HA与PDIA3-Flag的相互作用,出现预期共沉淀蛋白条带。用自制的兔抗羊IZUMO1抗血清检测TMEM190-HA与IZUMO1-Flag的相互作用,没有出现预期共沉淀蛋白条带。为了进行酵母双杂交实验,我们用pGAD-T7、pGBK-T7构建了酵母双杂交载体:pGAD-IZUMO1、pGBK-IZUMO1、pGAD-PDIA3、pGBK-PDIA3、pGAD-TMEM190和pGBK-TMEM190,并将连pGAD的载体转化Y2H Gold,连pGBK的载体转化Y187,将IZUMO1(Y187)与PDIA3(Y2H Gold)、IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)和PDIA3(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交。出现了三叶草结构的杂交体后,涂SD/-Trp-Leu二缺平板, IZUMO1(Y2HGold)与TMEM190(Y187)杂交平板生长一个蓝色菌落,另外两组大部分为蓝色菌落。继续涂SD/-Ade-His-Leu-Trp四缺平板后,IZUMO1(Y2H Gold)与TMEM190(Y187)杂交平板没有菌落生长,另外两组有大量蓝色菌落生长,表明IZUMO1与TMEM190不能发生相互作用,而IZUMO1与PDIA3、PDIA3与TMEM190存在相互作用。最后免疫共沉淀实验和酵母双杂交实验得到了一致的结论,即在酵母和293T细胞中,IZUMO1和PDIA3、PDIA3和TMEM190存在相互作用,而IZUMO1和TMEM190不存在相互作用。
[硕士论文] 许铁龙
动物学 贵州师范大学 2017(学位年度)
摘要:本研究至2016年12月止共对贵州省包括毕节市、大方县、盘州市、威宁彝族回族苗族自治县、纳雍县、水城县、兴义市、道真仡佬族苗族自治县、务川仡佬族苗族自治县、绥阳县、赤水市、习水县、金沙县、遵义县、凤冈县、兴仁县、惠水县、关岭布依族苗族自治县、开阳县、修文县、安顺市、长顺县、清镇市、贵阳市花溪区、贵阳市乌当区、贵定县、织金县、息烽县、龙里县、平坝县、黔西县、余庆县、荔波县、榕江县、从江县、三都水族自治县、独山县、丹寨县、江口县、印江土家族苗族自治县、松桃苗族自治县、施秉县、黎平县、雷山县、凯里市、沿河土家族自治县、思南县、安龙县、贞丰县、望谟县、罗甸县在内的共计51个县、市、区进行了野外翼手目动物标本采集,采集翼手目动物标本共计2036号,结合文献记录,现贵州省共有翼手目动物7科18属59种。与《贵州兽类志》相比增加19种。其中,中国特有种8种。经过实地调查,贵州省分布最为广泛的大蹄蝠Hipposiderideros armiger,其在贵州省的分布地共计47个县市。在贵州高原山区省的5个动物地理亚省中均有分布的翼手目物种分别为:托氏菊头蝠Rhinolophusthomasi、菲菊头蝠Rhinolophus pusillus、皮氏菊头蝠Rhinolophuspearsonii、贵州菊头蝠Rhinolophusrex、云南菊头蝠Rhinolophusyunanensis、大蹄蝠Hipposiderosarmiger、黄大蹄蝠Hipposiderospratti、三叶蹄蝠Aselliscusstoliczkanus、西南鼠耳蝠Myotisaltarium、中华鼠耳蝠Myotischinensis、中华山蝠Nyctalusplancyi、南蝠Iaio、印度伏翼Pipistrelluscoromandra、东亚伏翼Pipistrellus abramus,共计14种。五个动物地理亚省之中,翼手目种类最多的是黔东南低山丘陵盆地亚省,共计48种,占贵州省总数59种的81.4%;另黔西高原中山亚省共有翼手目动物31种,占贵州省总数59种的52.54%;黔北中山峡谷亚省的翼手目种类为31种,占贵州省总数59种的52.54%;黔中山原丘陵亚省的翼手目共计38种,占贵州省总数59种的64.41%;黔南低山河谷亚省的翼手目种类共计33种,占贵州省总数59种的55.93%。贵州省翼手目分布型以东洋型为主要类型,为27种,南中国型13种排列第二,云贵高原及附近山地型6种,东亚季风区型4种,旧大陆热带-亚热带型3种,古北型2种,东北型、岛屿型、喜马拉雅-横断山区分布型各1种,不易归类的分布型1种(由于其分布比较广泛,不能视为某一类),即大耳黄蝠Nycticeiusemarginatus。
[硕士论文] 陈佳丽
生物学 牡丹江师范学院 2017(学位年度)
摘要:本文综述了东北林蛙(Rana dybowskii)的生物学分类地位、地理分布、生活习性、形态特征、食性、消化酶的研究进展和经济价值,从生物化学的角度研究了东北林蛙消化酶的性质。文中探讨了①pH和温度对东北林蛙消化系统(将东北林蛙的消化系统分为食道、胃、肠道和肝脏4部分)中主要消化酶的影响;②8种金属离子(K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、Pb2+、Hg2+)对东北林蛙肝脏中消化酶活性的影响;③采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法对东北林蛙消化系统的6种同工酶(酯酶同工酶(Esterase)、乙醇脱氢酶同工酶(Alcohol dehydrogenase)、超氧化物酶同工酶(Superoxide)、过氧化物酶同工酶(Peroxidase)、苹果酸脱氢酶同工酶(Malate dehydrogenase)、淀粉酶同工酶(Amylase))和组织蛋白进行分离分析。结果如下:
  1.在37℃条件下,设定21个pH梯度(2、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8、8.4、8.8、9.2、9.6和10.0),测定东北林蛙食道、胃、肠道和肝脏的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力。食道、胃、肠道和肝脏的蛋白酶最适pH分别为6.0、5.6、7.2和8.0;脂肪酶最适pH分别为5.6、4.4、5.2和7.6;淀粉酶最适pH分别为6.0、5.6、6.4和8.0。
  2.在最适pH条件下,设定11个温度梯度(20℃、23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、38℃、41℃、44℃、47℃和50℃),测定东北林蛙食道、胃、肠道和肝脏的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力。食道、胃、肠道和肝脏蛋白酶最适温度分别为38℃、38℃、32℃和41℃;脂肪酶最适温度分别为38℃、35℃、26℃和26℃;淀粉酶最适温度分别为29℃、41℃、26℃和35℃。东北林蛙消化系统4种组织中,蛋白酶在肝脏中活力最强,活力大小为:肝脏>食道>胃>肠道,差异显著(P﹤0.05);脂肪酶在肠道中活力最强,活力大小为:肠道>肝脏>胃>食道,差异显著(P﹤0.05);淀粉酶在胃中活力最强,活力大小为:胃>食道>肝脏>肠道,差异显著(P﹤0.05)。
  3.选用8种金属离子(K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、Pb2+、Hg2+),设定6个金属离子浓度(2×10-6 mol/L、2×10-5 mol/L、3×10-4 mol/L、3×10-3mol/L、3×10-2 mol/L、4×10-2 mol/L),测定其对东北林蛙肝脏中3种主要消化酶活力的影响。结果显示:蛋白酶在Na+、Mg2+、K+和Fe3+浓度为3×10-4mol/L,Ca2+、Hg2+、Zn2+、Pb2+浓度分别为3×10-3mol/L、2×10-5 mol/L、3×10-2mol/L、2×10-6mol/L时活力最强;脂肪酶在Na+和K+浓度为3×10-4mol/L,Mg2+和Pb2+浓度为3×10-3mol/L,Ca2+、Fe3+和 Zn2+浓度为2×10-5mol/L,Hg2+浓度为2×10-6mol/L时活力最强;淀粉酶在Na+和Pb2+浓度为3×10-4mol/L,Mg2+和Ca2+浓度为3×10-2mol/L,K+浓度为3×10-3mol/L、Zn2+浓度为2×10-5mol/L,Fe3+和Hg2+浓度为2×10-6mol/L时活力最强。各种金属离子在不同浓度条件下对酶活力的影响表现为激活或抑制。
  4.分别采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳(PAGE)方法和十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳(SDS-PAGE)方法对东北林蛙消化系统中的EST、ADH、POD、SOD、MDH和AMY等6种同工酶和组织蛋白进行分离分析,结果如下:
  东北林蛙消化系统中共分离出电泳迁移率为0.464~0.753的EST1~EST18的18条谱带,活力顺序为肝脏﹥肠道﹥食道﹥胃;共分离出电泳迁移率为0.181~0.275的ADH1~ADH5的5条谱带,活力顺序为肝脏﹥食道﹥胃﹥肠道;共分离出电泳迁移率为0.034~0.649的SOD1~SOD16的16条谱带;共分离出电泳迁移率为0.093~0.814的POD1~POD13的13条谱带,4种组织中SOD和PPO活力顺序均为肝脏﹥食道﹥肠道﹥胃;共分离出电泳迁移率为0.067~0.326的MDH1~MDH9的9条谱带,活力顺序为肝脏﹥肠道﹥胃﹥食道;共分离出电泳迁移率为0.138~0.304的AMY1~AMY8的8条谱带,活力顺序为肝脏﹥食道﹥胃﹥肠道。
  东北林蛙消化系统4种组织中同工酶表达具有明显的组织特异性:EST、ADH、SOD和POD同工酶在肝脏中谱带最多,活性最强,在胃中谱带最少,活性最弱,与东北林蛙食性和动物肝脏主要吸收消化脂肪相一致;MDH同工酶的表达与肝脏排毒、消除机体疲劳机能相一致;AMY同工酶的表达与蛙类的摄食习性相一致。
  东北林蛙消化系统4种组织中组织蛋白电泳分离结果为:共分离出迁移率为0.275~0.978的56条组织蛋白谱带。将电泳图谱从阴极至阳极划分为6个区域(Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区、Ⅳ区、Ⅴ区以及Ⅵ区),对各蛋白谱带在这6个区域中的分布情况进行分析。Ⅰ区有2条谱带,分子量大于200KD;Ⅱ区有13条谱带,分子量位于130~200KD之间;Ⅲ区有6条谱带,分子量位于97.4~130KD之间;Ⅳ区有13条谱带,分子量位于66.2~97.4KD之间;Ⅴ区有8条谱带,分子量位于43~66.2KD之间;Ⅵ区有14条带,分子量小于43KD。蛋白质是动物组织中重要的组成成分,东北林蛙消化系统的4个组织中蛋白谱带数分别是:食道有34条谱带,胃有35条谱带,肠道有36条谱带,肝脏有33条谱带。
[硕士论文] 刘欢
生物学 牡丹江师范学院 2017(学位年度)
摘要:本文通过对中鼩鼱、长爪鼩鼱、扁颅鼩鼱的消化道解剖结构的测量、脏器系数的比较、头骨变量及尾部针毛超微结构的测量进行分析比较,展开对三个物种鼩鼱形态学的初步研究。
  制作头骨标本后,分别对三个物种间及长白山山脉、大、小兴安岭三个地区的中鼩鼱之间、中鼩鼱种内雌雄个体之间的颅全长、上颌长、齿列长等17个变量进行测量分析,结果表明:1.长爪鼩鼱和中鼩鼱的头骨指标除颅高之外,长爪鼩鼱其他指标均大于中鼩鼱,P<0.01,存在显著差异,扁颅鼩鼱头骨指标测量值均大于中鼩鼱,与长爪鼩鼱相近,通过判别函数发现,主要是颅全长、基长、下颌长等变量导致了这种差异。2.分布于长白山山脉、大小兴安岭地区的中鼩鼱头骨变量大部分指标未出现显著差异,只有分布在长白山山脉和大兴安岭地区的中鼩鼱头骨指标中的眶间距、上颌宽、腭前部宽等5个指标 P<0.05,差异明显,经聚类分析得到大、小兴安岭两个地区的种群相关系数为2.106,最后与长白山山脉合为一类,相关系数为3.962,说明大、小兴安岭关系更近,与 SPSS统计结果吻合;3.对中鼩鼱雌雄个体头骨指标分析,结果为:雄性个体的下颌长(不含第一门齿)为(7.65±0.09)mm,雌性为(7.01±0.09)mm,雄性下颌齿列长(不含第一门齿)为(4.18±0.16)mm,雌性为(3.57±0.12)mm,雄性大于雌性且差异显著,而在基长、上齿列长等少部分指标,测量值雌性大于雄性,产生这种结果的原因是繁殖期间,生命活动差异导致的,可能是性二型自然选择的结果。
  对三种鼩鼱的消化道长度和重量进行测量和称重,结果显示:中鼩鼱的胃长为(11.04±0.46)mm,胃重(含内容物)为(0.11±0.01)g,胃重(不含内容物)为(0.03±0.005)g,小肠长、小肠重(含内容物)、小肠重(不含内容物)分别为(123.87±5.54)mm、(0.25±0.01)g和(0.07±0.008)g,大肠长、大肠重(含内容物)、大肠重(不含内容物)分别为(99.70±9.44)mm、(0.19±0.01)g、(0.06±0.01)g,每个指标均是三种鼩鼱值最小的,这与中鼩鼱的食性和对能量的需求有关。
  由于扁颅鼩鼱其中一个样本脏器腐坏,无法称重,故对中鼩鼱和长爪鼩鼱的脏器进行观察描述、称重、计算脏器指数,同时也对中鼩鼱雌雄个体的脏器系数进行统计,结果表明:长爪鼩鼱的每个脏器系数均大于中鼩鼱,但只有心脏出现了极显著差异,P为0.001;对中鼩鼱的雌雄个体脏器系数比较分析后发现并无显著差异,说明在中鼩鼱种内,脏器系数未体现明显的性二型。
  在扫描电子显微镜下观察三个物种尾部的针毛结构,判断针毛鳞片类型,利用 MB-RULER测量软件对鳞片高度、密度进行测量,SPSS对测量结果进行统计,结果如下:三种鼩鼱针毛鳞片类型有4种,分别是条纹型、规则扁平型、规则镶嵌型和简单冠状型,从鳞片高度上来看,扁颅鼩鼱近根部、主体部、近梢部鳞片高度分别为(12.24±0.75)μm、(7.22±0.27)μm、(3.20±0.20)μm,均大于中鼩鼱、长爪鼩鼱三个部位的鳞片高度,且差异显著,从鳞片密度来说,未出现某一物种的三个部分均大于另外两个物种的现象,由于鳞片高度和密度都受到遗传和环境的影响,所以出现了种间差异性;对于三个物种的鼩鼱来说,针毛的鳞片密度由近根部、主体部、近梢部的顺序依次增大,这与鳞片功能有关,排列越紧密的鳞片对光的反射作用越强,对机体产生更好的保护作用,主体部与近梢部针毛与外界环境接触几率较近根部大,所以拥有相对较大的鳞片密度。
[硕士论文] 赵焕乐
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:机场及其周边鸟类种类调查及其多样性研究对于新建机场开展鸟击防范工作具有重要意义。2015年1-12月,采用样线法和固定半径样点法对内蒙古扎兰屯成吉思汗机场及其周边8km范围内的区域进行鸟类多样性调查。调查结果如下:
  (1)调查期间共记录到鸟类有15目31科82种。
  (2)扎兰屯成吉思汗机场围界内麻雀、喜鹊、家燕、白鹊钨为主要鸟类。鸟类四季活动的共同高峰期为早晨6点到8点,其中春季4点到6点的鸟类种类最高,为6种,夏季的6点到8点鸟类数量最多,为363只。
  (3)根据对鸟类的群落结构分析:机场围界内春季的鸟类多样性指数(0.740)和均匀度指数(0.819)最高;冬季的优势度(0.683)最高;夏季的平均密度(2.826ind· hm-2)最高。机场围界外:夏季湿地的多样性指数最高,为1.576;冬季的草地均匀度指数最高,为0.902;冬季的居民区优势度最高,为2.113;春季的湿地平均密度最高,为28.600 ind·hm-2。
  (4)本文在前人研究的基础上综合鸟类的体积、数量、出现次数、飞行高度、与机场的距离、出现的样带数以及是否集群7个因子对鸟类的危险值重新赋值并计算得出危险值。严重危险鸟类有普通鸬鹚Phalacrocorax carbo、麻雀、赤麻鸭Tadorna ferruginea等14种。
  根据调查结果提出不同季节,不同区域以及不同鸟种的针对性防范措施以及机场管理对策,为今后的扎兰屯机场鸟击防范工作提供重要的科学依据。
[硕士论文] 高群
动物学 聊城大学 2017(学位年度)
摘要:本研究通过对2015.2016年夏季多个站位沉积物的分析,对胶州湾小型底栖动物生态学和自由生活线虫的群落结构、多样性和分类进行研究。结果表明,胶州湾小型底栖动物的平均丰度为2651±707(ind/10cm2),生物量为1284.8±423.5(μgdwt/10cm2),该区域共有11个小型底栖动物类群被分选出来,自由生活线虫的丰度最占优势,可达95.7%。各站位自由生活海洋线虫的平均丰度和生物量分别为2538±6768(ind/10cm2)和1015.1±270.6(μgdwt/10cm2)。自由生活线虫的生物量同样最占优势(79.2%),其次为底栖桡足类(10.8%)、多毛类(5.9%)和双壳类(2.0%)等。垂直分布上,小型底栖动物和自由生活线虫的丰度在沉积物表层(0-2cm)分别占总量的56.5%、53.1%。本研究海区,包含4个潮间带站位,16个浅水站位(5.5-22.5米),多数站位位于人种养殖点附近,底栖环境相对不稳定,线虫在0-2cm表层和2-8cm底层的分布相差不大。从2015、2016年夏季胶州湾采集的多个站位样品中,共鉴定出198种自由生活海洋线虫,隶属于87个属,27科,4目。不同站位种类数差别较大:站位JZW-8最多(85种),站位JZW-10最少(26种)。整个研究海域主要的优势种有Parodontophora marina Zhang,1991,Terschellingia longicaudata De Man,1907,Dorylaimopsis turneri Zhang,1992, Setosabatieria coomansi Huang et Zhang,2006, Leptolaimus sp1, Sphaerolaimus gracilis De Man,1884。建立了1个新属(Ptycholaimelloides gen. nov.),描述了5个新种(青岛拟折咽线虫 Ptycholaimelloides qingdaoensis sp. nov.,异带矛咽线虫 Dorylaimopsis hetoroapophysis sp. nov,关节萨巴线虫Sabatieria articulata sp.nov.,大交接刺萨巴线虫Sabatieria macrospicula sp.nov.,周氏韦氏线虫Wieseriazhoui sp.nov.),20个新记录,列出了胶州湾自由生活线虫的种名录。
[硕士论文] 崔荣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:本研究在前期实验研究中获得一种由四因子c-Myc,Klf4,E-cadherin,Glis1诱导的,形态、体外增殖和体内外分化能力类似于胚胎干细胞,但不具有嵌合能力的部分重编程细胞,KMEG-prCs。该细胞虽具有一定多能性,但oct4,sox2,nanog,AKP并不表达,且SSEA1只在部分细胞中被激活。经转录物组分析显示,KMEG-prCs处于重编程的中间状态。该细胞可以作为一个新的细胞模型来研究重编程过程中内源多能性信号网络激活的分子机制。本研究旨在利用KMEG-prCs细胞,筛选可激活该细胞中内源多能性基因表达的小分子化合物或组合,为进一步探讨内源多能性调控网络的激活和发现新的小分子化合物组合建立新的小分子诱导体系奠定理论和技术基础。通过流式细胞分析显示,重编程不同阶段的表面标记蛋白Thy1(CD90)完全下调,CD54(ICAM-1)完全上调,CD44和SSEA1分别部分上调,CD31仅少数上调。结合转录物组的分析,进一步确定KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞。分选获得SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs,并用含有不同小分子化合物的培养液进行培养,内源多能性基因激活显示,加入HDAC抑制剂TSA、VPA、Oct4激活剂(OAC1)与腺苷酸环化酶活化剂(Forskolin)后激活了多能性基因AKP的表达,并且使一部分SSEA1阴性细胞转变为SSEA1阳性细胞。随后加入EZH2蛋白胞内增强子抑制剂(DZNeP)进一步诱导后,在小分子组合PCA+FD处理下, SSEA1+KMEG-prCs和SSEA1-KMEG-prCs内源oct4均被激活,SSEA1+KMEG-prCs中oct4高水平表达。获得了一个新的细胞状态,KMEG-prCs-O+,该细胞仍然保持体内外分化能力。随后,虽然将PCA+FD中的A-83-01替换为E-616452,并联合LiCl,构成PCE+FD+Li小分子化合物组合可有效激活nanog的表达,但oct4的表达被下调。综上所述,KMEG-prCs是一个处于重编程中段的中间态细胞,通过小分子化合物的处理其内源多能性调控网络可以被激活。该研究为探讨小分子化合物对重编程的作用机理以及进一步获得完全重编程的iPSCs奠定了基础,同样对于细胞在重编程过程中信号通路,代谢途径,表观遗传修饰等的研究提供依据。
[硕士论文] 蒋连玉
神经生物学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:单宁酸作为一种重要的多酚类植物次生代谢物,通过影响动物的摄食中枢和奖赏中枢从而改变动物的摄食行为。但单宁酸味觉信息是否通过传统味觉通路到达摄食和奖赏中枢以及单宁酸是否影响味觉传导通路相关基因的表达,至今鲜有研究。谷氨酸(glutamate,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)分别是中枢系统重要的兴奋性和抑制性神经递质,在味觉信息传递中起着重要作用;即刻表达基因fos家族的表达是神经元被激活标志。本实验以捕捉自内蒙古草原并室内配对繁殖的布氏田鼠为研究对象,以不同浓度的单宁酸溶液(0 mg·mL-1、30 mg·mL-1和60 mg·mL-1,分别为对照组、低剂量组和高剂量组)连续不同时间(1d、5d、10d和20 d)滴灌500μL到布氏田鼠的口腔中,用实时荧光定量PCR法(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测布氏田鼠孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)、臂旁核(parabrachial nucleus,PBN)和中央杏仁核(central amygdala,CeA)三个脑区的fosB/△fosB、谷氨酸囊泡型转运体3(vesicular glutamate transporter3,Vglut3)和GABA囊泡型转运体(vesicularGABA transporter,Vgat) mRNA的表达量,用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测三个脑区FosB/△FosB、VGLUT3和VGAT蛋白的表达量,并隔天测定布氏田鼠20 d内的体重变化,以分析单宁酸对布氏田鼠味觉传导腹侧通路相关基因表达的影响,探讨单宁酸影响植食性动物摄食行为的神经机制,为单宁酸味觉信息的传导通路研究提供依据。研究结果如下:
  1、RT-qPCR检测fosB/△fosB mRNA表达量的结果显示,在NTS、PBN和CeA中,TA处理1d、5d和10d后,低剂量组和高剂量组的表达量均显著高于对照组;但处理20 d后,各剂量组之间无显著性差异。IHC检测FosB/△FosB表达量的结果发现,在三个脑区,TA处理5d和10d后,高剂量组均显著高于对照组;而处理1d和20 d后,各剂量组之间无显著性差异。表明TA能够激活布氏田鼠味觉传导腹侧通路相关脑区神经元,但长期处理后,动物会产生一定的适应。
  2、RT-qPCR检测Vglut3 mRNA表达量的结果显示,TA处理1d、5d和10d后,高剂量组三个味觉相关脑区的表达量均显著高于对照组;而处理20 d后,各剂量组之间无显著性差异。IHC检测VGLUT3表达量的结果发现,在三个脑区,TA处理5d和10d后,低剂量组和高剂量组的表达量均显著高于对照组;而处理1d和20 d后,各剂量组之间均无显著性差异。说明一定时间内一定剂量的TA溶液促进布氏田鼠味觉相关脑区Vglut3基因和蛋白水平的表达。
  3、与Vglut3转录和翻译水平相反,RT-qPCR检测Vgat mRNA表达量的结果显示,在三个味觉相关脑区,TA处理1d、5d和10d后,高剂量组的表达量均显著低于对照组;而处理20 d后,各剂量组之间无显著性差异。IHC检测结果表明,TA处理5d和10d后,高剂量组三个脑区的VGAT表达量均显著高于对照组;而处理1d和20 d后,各剂量组之间无显著性差异。说明一定时间内一定剂量的TA溶液抑制布氏田鼠味觉相关脑区Vgat基因和蛋白水平的表达。
  4、雌雄布氏田鼠口腔滴灌不同剂量TA溶液连续20 d,每隔一天称量布氏田鼠的体重共11次,结果发现在每个时间点各剂量组之间布氏田鼠的体重没有显著性差异,说明口腔滴灌一定剂量TA溶液没有影响布氏田鼠的体重。
  结果表明,一定剂量的TA溶液能够激活布氏田鼠味觉传导腹侧通路相关脑区神经元,并通过促进相关脑区Vglut3 mRNA和蛋白水平以及抑制Vgat mRNA和蛋白水平来传递单宁酸的味觉信息并影响动物的摄食行为。
[硕士论文] 陈磊磊
生物化学与分子生物学 安徽师范大学 2017(学位年度)
摘要:水螅体内除了刺细胞、腺细胞和神经细胞外,其他细胞都具有干细胞特性。其中,间质干细胞可以分化成皮肌细胞以外的所有细胞,外胚层皮肌细胞可以不断分裂形成新的外胚层皮肌细胞,内胚层皮肌细胞亦可以不断分裂形成新的内胚层皮肌细胞,这就是水螅具有强大再生能力的物质基础。但水螅身体不同部位的再生能力并非均衡。水螅极性化体轴的主体为体柱,体柱一端为头区,头区由口、垂唇及触手组成;另一端为足区,足区末端为水螅的固着器官基盘。一般认为分别位于体柱两端的触手和基盘位置的细胞分化程度较高。在水螅体柱任何位置通过切割手术得到的身体片段均能再生成一条水螅体,基盘组织已被证明具备一定程度的再生能力,但触手组织的再生能力目前未知。基于此,本研究开展如下工作:
  通过切割手术,获得纯粹的水螅触手组织、1根触手连带垂唇组织、2根触手连带垂唇组织、3根触手连带垂唇组织、4根触手连带垂唇组织及整个头区组织(5或6根触手连带垂唇组织)。再生实验结果表明,纯粹的水螅离体触手组织实验组所有样本全部分解;1根触手连带垂唇组织实验组中的大部分样本完成再生,而小部分样本分解,其余实验组样本全部完成再生。结果显示,纯粹的水螅离体触手组织已失去再生能力,但切割手术时保留在离体触手基部的垂唇组织能促进离体触手的再生。
  水螅触手的形态结构及细胞组成与体柱位置类似,但离体的纯粹触手组织为何失去了再生能力?这个现象内在的细胞及分子机理值得深入研究。动物再生主要涉及伤口附近原有旧结构的改造及新生结构的形成。旧结构的改造势必有部分细胞要凋亡,伤口附近的干细胞进行细胞分裂产生新细胞为新生结构提供物质基础。因此,水螅再生进程直接相关的细胞活动主要包括细胞凋亡和细胞分裂。本研究通过实时定量荧光PCR技术对水螅离体触手组织(纯粹触手组织和2根触手连带垂唇组织)在再生进程中细胞凋亡相关基因(Bak和Bcl-2)和细胞分裂相关基因(Pcna)的表达水平的变化进行了测定。纯粹触手组织实验组在8h后的Bak和Bcl-2基因表达量的比值明显低于触手连带垂唇组织实验组,这表明纯粹触手组织实验组细胞凋亡程度较低,这样看手术后离体的水螅纯粹触手组织丧失再生能力的主因并不是其细胞凋亡程度提高。水螅纯粹触手组织实验组在切割手术后Pcna基因表达量波动较小,而触手连带垂唇组织实验组Pcna基因表达量随着再生进程逐渐提高,8h后所有时段表达量均是0h时的2倍以上。
  为深入研究水螅纯粹触手组织失去再生能力的细胞和分子机理,本研究还对切割手术后24 h时的水螅纯粹触手组织及2根触手连带垂唇组织进行了比较转录组的测定和分析。纯粹的水螅触手组织与触手连带垂唇组织相比,表达上调的基因共435个,表达下调基因共1007个。所有差异表达基因共涉及79个代谢通路,以富集分析检验P值递增排序的前6个代谢通路分别是嘧啶代谢(Pyrimidine metabolism)、细胞周期(Cell cycle)、核糖体生物合成(Ribosome biogenesis)、DNA复制(DNA replication)、碱基切除修复(Base excision repair)及嘌呤代谢(Purine metabolism),其中仅核糖体生物合成代谢通路与蛋白质合成有关,其余5个通路均与核酸合成和细胞分裂相关,并且涉及这5个通路的所有差异表达基因在触手连带垂唇组织实验组中为表达上调,而在纯粹触手实验组中为表达下调。在DNA复制和碱基切除修复代谢通路中均为重要节点的增殖细胞核抗原(Pcna)基因在纯粹触手组织与触手连带垂唇组织之间表达量差异显著,触手连带垂唇组织中Pcna基因表达量是纯粹触手组织的120倍左右。纯粹水螅触手组织中Pcna基因表达水平与触手连带垂唇组织相比较显著下调,说明离体的纯粹水螅触手组织内的3种干细胞分裂指数很低或未启动细胞分裂。另外,在差异表达基因所涉及的79个代谢通路中,有15个细胞信号通路,这些信号通路绝大部分与细胞分裂增殖、细胞分化、细胞凋亡、个体发育和伤口愈合等生命活动直接相关。值得注意的是,Ras信号通路(Ras signaling pathway)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Aktsignaling pathway)的主要功能都是抑制细胞凋亡,而这涉及这两个信号通路的差异表达基因都在纯粹触手组织中上调,这个现象暗示纯粹触手组织细胞凋亡程度较低。
  综上所述,无论是通过实时定量荧光PCR技术对水螅纯粹触手组织和触手连带垂唇组织之间在再生进程中细胞凋亡相关基因和细胞分裂相关基因表达水平的比较研究,还是水螅纯粹触手组织和触手连带垂唇组织之间的比较转录组的研究均表明离体的纯粹触手组织中细胞凋亡程度和细胞分裂指数都较低,可能是水螅纯粹触手组织缺乏细胞凋亡和细胞分裂诱导因子;而触手连带垂唇组织中细胞凋亡程度和细胞分裂指数均较高,保证了其再生时旧结构的重组以及新生结构的形成,连在触手上的垂唇组织可能带有细胞凋亡和细胞分裂诱导因子。
[硕士论文] 张淑熠
生物学 河南师范大学 2017(学位年度)
摘要:圆线虫是马属动物体内最重要的寄生虫,严重危害宿主的健康,使其患病乃至死亡,对畜牧养殖业造成较大损失。大量使用驱虫药使盅口线虫出现抗药性,增加了患病率。马属动物寄生圆线虫的分类鉴定和系统发育学研究,对于有针对性地控制圆线虫病具有重大意义。目前,国外学者为圆线虫的研究提供了丰富的数据资料,国内对于圆线虫的研究较少,且主要是形态学方面的研究,缺乏相关分子资料。本研究以采自河南新乡地区的35种圆线虫为研究对象,经光学显微镜初步鉴定后,通过PCR技术扩增其线粒体COⅠ和nad1基因,探究马圆线虫的系统发育关系。35种圆线虫的扩增产物经测序共获得39条COⅠ序列和32条nad1序列。通过使用多种生物学软件,对所得目的片段进行了碱基组成、遗传距离等分析。采用最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)分别基于COⅠ和nad1序列构建系统发育树,并且构建基于COⅠ和nad1联合数据集的系统树。发现BI法更适合马圆线虫的系统发育学研究。
  本研究主要内容包括:⑴所测样品的COⅠ序列长度均为393 bp,通过多序列比对显示,其中保守位点、变异位点、简约信息位点、单核苷酸位点分别占总位点的64.63%、35.37%、29.52%、5.85%。A+T平均含量(67.3%)明显高于G+C(32.7%),表现出明显的AT碱基偏好性。从氨基酸密码子来看,第三位点的A+T平均含量最高(78.6%),第二位点(63.1%)稍高于第一位点(61.2%)。转换和颠换比值R最大的是第1密码子位点,其次是第3密码子位点,进化最快,第2密码子位点没有发生碱基替换,进化最慢。基于COⅠ序列构建的系统树显示,种内个体均聚为独立分支,对于属以上分类阶元的区分结果不够理想,但仍有一定的参考价值。⑵测序所得32条nad1序列的总长度均为354 bp,对序列进行多序列比对分析,其中保守位点218个,变异位点136个,简约信息位点115个,单核苷酸位点21个。A、C、G、T四种碱基的平均含量为25.4%、9.8%、21.7%、43.1%,A+T平均含量(68.5%)明显高于G+C(31.4%),表现出AT碱基偏倚性。就氨基酸密码子来看,A+T平均含量最高(74.2%)的是第3位点,第1位点(66.1%)和第2位点(65.1%)相差不大。三个密码子位点的转换和颠换比值R最小的为第3密码子位点,进化最快,其次是第1密码子位点,第2密码子位点的R值最大,进化速率最慢。在构建的系统树中,31种圆线虫形成两大类群:一个大类群包括圆形属、三齿属和卡拉干斯齿线虫、不等齿杯口线虫以及伊氏双齿口线虫;另一大类群包括杯冠属、杯环属、冠环属、盅口属和杯状彼得洛夫线虫、拉氏杯口线虫、双冠双冠线虫、头似辅首线虫。其中冠环属、盅口属和杯冠属的亲缘关系较近;长形杯环线虫和外射杯环线虫与杯环属的亲缘关系较远。基于COⅠ+nad1序列构建的系统发育树拓扑结构与之类似,仅支持率存在差异。采用ML法重建圆线虫的系统进化关系自展支持率较低,BI法构建的系统树支持率高,说明依据COⅠ和nad1序列进行圆线虫的系统发育分析时,BI法更加适合。⑶在河南省发现卡拉干斯齿线虫(Skrjabinodentus caragandicus),对其进行了形态学观察和分子序列测定与分析。结果表明:卡拉干斯齿线虫中等大小,口囊壁呈“S”状,前端极度膨大,厚10~12μm,后端稍薄,约4~6μm,外叶冠由8个长而宽的小叶组成,内叶冠由16~18个短而宽的小叶组成,食道漏斗发达,雄虫生殖锥长337μm,引器长245μm;所测核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)及5.8S片段长度为853 bp,其中ITS1长369 bp,ITS2长331 bp,从GC含量上看,ITS1区(47.2%)明显高于ITS2区(40.7%);线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因长度为393 bp,A、T、G、C碱基含量分别为25.2%、42.7%、21.4%、10.7%; nad1序列长354 bp,其中A、T、G、C碱基的含量分别为24.9%、43.5%、21.5%、10.2%。卡拉干斯齿线虫在河南省属首次报道,为河南省新记录种。
[硕士论文] 沈妍其
海洋生物学 辽宁师范大学 2017(学位年度)
摘要:Vav家族蛋白最主要的功能是它们可以作为Rho/ Rac蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子起调节作用。Vav鸟嘌呤核苷酸交换因子3(Vav3),Vav家族的第三个成员,广泛表达在各个组织中,在脊椎动物中调节多种细胞信号转导通路,其中包括T、B细胞受体介导的Rho家族成员的信号转导过程。目前对Vav3的研究更多的集中于高等脊椎动物,而对无颌类脊椎动物是否存在Vav3及其功能研究尚无报道。由于七鳃鳗是一种重要的低等无颌类脊椎动物的代表,因此本文主要通过克隆日本七鳃鳗Vav3基因进而进行原核细胞表达、抗体制备,为更深入了解Vav3基因在七鳃鳗免疫调节过程中的作用奠定基础。
  日本七鳃鳗Vav3分子(Lja-Vav3)开放阅读框的长度为2568bp,编码含有855个氨基酸残基的蛋白质。Lja-Vav3含有典型的Vav家族蛋白8个保守结构域,通过对26条Vav3和Vav2的蛋白质序列进行比对分析,Lja-Vav3与有颌类脊椎动物Vav3分子的序列一致性(大约53%)比与有颌类及无颌类脊椎动物Vav2分子(大约51%)的序列一致性更高。为更深入的明了其进化关系,采用了构建进化树的方法和保守基序排布模式分析的方法进行了分析。结果显示,Vav3和Vav2这两种分子的8个保守结构域中最显著的差异体现在它们的SH3结构域。由此推测,Vav3和Vav2起源于一个共同的祖先基因的基因复制过程,并可能通过各自所作用底物的特异性选择分化而来。
  为了更好地了解Vav3在免疫调节中的作用,我们制备了七鳃鳗Vav3兔源多克隆抗体。首先构建了Vav3-pET32a(+)重组质粒,将重组质粒导入E.Coli BL21表达菌诱导蛋白表达并进行了纯化,以纯化后的Vav3蛋白做为抗原免疫刺激新西兰兔制备抗体,采用颈动脉取血的方式将抗血清分离并纯化,得到了特异性较好的兔抗Lja-Vav3多克隆抗体。使用实时定量PCR和Western blot实验分别检测Lja-Vav3在基因转录水平和在蛋白水平的表达,结果表明,Lja-Vav3在白细胞和髓样小体组织中其mRNA水平和蛋白水平在免疫刺激后显著增加。另外,Lja-Vav3的表达水平在受到LPS的刺激后上调显著,而在PHA刺激后无明显变化。这些结果证明,Lja-Vav3可能参与了七鳃鳗VLRB+淋巴细胞(类B细胞)的免疫应答过程,我们的研究结果为进一步研究Vav3分子在七鳃鳗淋巴细胞免疫应答过程中的作用奠定了基础。
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