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[硕士论文] 范宇
动物遗传育种与繁殖 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:睾丸是雄性动物产生睾酮和精子发生的重要场所,睾酮不仅可以促进精子发生和维持雄性动物第二性征,并且对机体生长发育非常重要。在动物生产中,将雄性动物去势会使其更加温顺,生长速度更快。在医学上,去势诱导睾酮缺乏是研究雄性动物生殖障碍的重要模型。研究表明,在雄性动物初情期前进行半去势手术可导致睾酮缺缺乏,从而显著降低精子质量。MicroRNAs(miRNAs)是一类真核细胞中广泛存在的小分子非编码RNA,可以在转录后水平调控基因表达从而参与多种生物学过程。到目前为止,还没有从miRNAome角度系统研究初情期前的半去势手术对精子的作用,以及miRNA是如何通过相关调控和功能变化影响精子质量。本研究对大白猪进行半去势手术以构建睾酮缺乏模型,通过small RNA-seq技术分别对半去势组和对照组的精子和精液外泌体中的miRNA转录组进行测序,鉴定miRNAome的差异,并对候选miRNA进行功能验证。本研究主要结果如下:
  (1)通过半去势手术构建睾酮缺乏模型,通过将HC组(n=15)和CT组(n=15)之间的各项参数进行比较,结果发现体重、体长、脏器指数变化不显著,但睾酮水平显著下降,睾丸重量显著增加,精液质量显著下降(P<0.01),表明成功构建睾酮缺乏模型构建成功。
  (2)采用small RNA-seq对HC组(n=3)和CT组(n=3)精子进行测序,经过一系列比对,最终在6个测序文库中鉴定出396种已知的前体miRNA编码206种成熟的miRNA。以miRNA表达量Fold-change<0.5或>2,且两组之间P value≤0.05为标准,发现文库中有16个差异表达的miRNA,且在两个测序文库之间有不同的表达方式,与此同时,两个测序文库之间所有差异表达的miRNA都是被下调的。
  (3)与此同时,分别将两组之间的miRNA按照表达量进行排序,并用不同的颜色显示表达量Top10位的miRNA,结果显示,两组之间精子测序文库中的Top10位的miRNA中共同存在的miRNA有8个,表明精子细胞中高表达的miRNA在维持精子细胞功能有着显著的作用。
  (4)通过DIANA功能富集分析软件对16个差异表达的miRNA进行功能富集分析,结果发现,差异表达的miRNA富集在HIF-1通路、细胞循环通路以及细胞凋亡相关的通路中,包括:p53、MAPK和mTOR途径,且75%(12/16)差异表达的miRNA富集在p53通路中。
  (5)为验证差异表达的miRNA能否影响精子的质量,通过上游法筛选出高质量精子用于精子转染试验,转染结束后测定包括精子直线运动速度(VSL)、精子曲线运动速度(VCL)、精子路径运动速度(VAP)在内的相关参数。结果表明,包括miR-26a-5p,let-7g-5p都具有潜在的抗凋亡效果。
  (6)通过双荧光素酶报告系统证明证实PTEN和PMAIP1分别是miR-26a-5p和let-7g-5p的靶基因。miRNA过表达和抑制试验显示miR-26a-5p和let-7g-5p分别通过抑制凋亡相关的靶基因PTEN和PMAIP1,进而通过p53等通路影响精子细胞的凋亡。
  (7)利用超高速离心法从精子精清中分离出精子外泌体,通过sperman corrlation证实精子miRNAome与精清外泌体miRNAome之间的相关性CT组r=0.733,HC组r=0.719,两者的相关系数显示两者为中度相关。与此同时,精清外泌体miRNAome中HC组和CT组聚类分析亦显示出与精子miRNAome类似的分离效果。
  综上所述,研究结果表明,精清中可能会产生包括miRNA在内的遗传调控物质,充当信号传导介质,并在p53信号通路中发挥功能调节作用,用于帮助精子延长与卵子结合的时间,并最终繁衍下一代的目的。
[博士论文] 胡佳
医学细胞与分子生物学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:Kisspeptin是由KISS1基因编码的前体蛋白水解得到的一系列小肽,是GnRH分泌最强有效的促进剂。在哺乳动物中,Kiss1的定时激增决定了GnRH的定时激增:Kiss1神经元表达大量雌激素受体,介导了排卵前的雌激素正反馈和非排卵期的雌激素负反馈作用;Kiss1基因表达呈脉冲式,在雌激素条件下,脉冲表达的均值呈现昼夜节律;脉冲式的Kiss1使得GnRH神经元同步化。依赖于Kisspeptin神经元对雌激素信号和生物钟信号的整合作用,使GnRH的分泌高峰呈现雌激素依赖性的日节律模式。然而,Kisspeptin系统和功能在不同物种间差异很大。在斑马鱼等大多数脊椎动物中kisspeptin有两个拷贝。斑马鱼Kisspeptin的功能目前还不明确。斑马鱼中kisspeptin是否还受到生物钟的调控,是否响应雌激素信号?斑马鱼的kisspeptin有什么样的功能?斑马鱼两个Kiss1同源基因的表达模式和在生殖中的具体功能还未有阐明。因而,本论文旨在探索1.斑马鱼kisspeptin基因在斑马鱼生殖中的具体作用;2.生物钟是否直接调控kisspeptin基因的表达及如何调控?3.kisspeptin基因如何响应雌激素的刺激?4.生物钟蛋白是否与雌激素受体协同调控kisspeptin基因表达?5.以斑马鱼bmallb-/-为模型,探索生物钟紊乱如何对kisspeptin基因表达产生影响,从而影响生殖。
  构建了热激诱导过表达kiss1和kiss2转基因鱼。通过多肽注射和热激诱导kiss1和kiss2过表达后的产卵实验,研究揭示了斑马鱼kisspeptin通路对生殖可能的作用机制。从而发现,Kiss1是一种gnrh3/lhb的激活因子,Kiss2是一种gnrh3/lhb的抑制因子。
  利用RT-qPCR发现斑马鱼两个kisspeptin基因的mRNA水平都存在明显的振荡,但模式不同,kiss1和kiss2的表达峰值分别在ZT4和ZT3。用生物信息学软件对比分析了人,小鼠和斑马鱼的启动子区域,发现不同基因间调控元件有一定差异。双荧光素报告酶实验与ChIP实验从体外和活体两个水平揭示生物钟对两个kisspeptin基因调节的不同方式:生物钟通过钟控元件E-box调节kiss1基因;通过钟控元件D-box和RRE元件调节kiss2基因;在活体内不同生物钟蛋白对相应的功能性钟控元件的结合呈现日节律,但时相各不相同。Bmallb对kiss1启动子E-box结合峰值在ZT20;Tefa和Rorαa对kiss2的D-box和RRE的结合峰值分别在ZT8和ZT16。构建了kiss1和kiss2启动子驱动的虫荧光素酶基因转基因鱼,观察到了kiss1与kiss2基因在生物钟bmal b-/-突变体的表达改变,kiss1和kiss2的振幅都降低,kiss2振幅的降低更显著,同时kiss2的表达峰值在ZT0,相位后移约4h。
  雌激素处理实验发现雌激素可能是通过Esr2a对kisspeptin起作用。双荧光素报告酶实验表明雌激素受体在雌激素存在条件下激活kiss1基因表达,并通过与生物钟蛋白Crylaa的直接结合,一起调控kiss1基因表达;雌激素受体可以在雌激素存在下激活kiss2基因表达,虽不与调控kiss2基因的生物钟蛋白直接结合,但它们的激活有加成。还发现了不依赖于雌激素的雌激素受体相关受体对kiss2基因表达激活作用,可能涉及代谢通路对kiss2的调控。
  综上所述,研究发现生物钟可以直接调控斑马鱼kiss1与kiss2基因的表达,在雌激素存在的情况下,生物钟蛋白可以与雌激素受体共同作用调节kisspeptin基因的表达。生物钟的紊乱导致bmallb-/-中kisspeptin基因的表达的变化,影响了gnrh3/lhb的表达,产卵量降低。研究为以斑马鱼为模型研究生物钟蛋白与雌激素受体协同作用导致Kiss1定时激增的具体机制提供了基础。同时,研究结果扩充了比较生物学的知识:D-box调节kisspeptin基因是小鼠和斑马鱼共有的机制;E-box调节kisspeptin基因是人和斑马鱼共有的机制,小鼠不具有。人或小鼠Kiss1基因启动子没有钟控元件RRE,生物钟通过该元件对kiss2基因调控,是斑马鱼独有的一种调节机制。此外,构建的kiss1和kiss2启动子驱动的荧光素酶基因转基因鱼,以及热激诱导过表达kiss1和kiss2转基因鱼,为后续生物钟对kisspeptin基因调控机制,对kisspeptin基因功能,及生物钟紊乱对kisspeptin基因功能所造成影响的深入研究提供了有力的工具。
[硕士论文] 刘鑫鑫
野生动植物保护与利用 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:梅花鹿(Cervus nippon)和马鹿(Cervus elaphus)分别为国家 I级、II级重点保护动物,不仅具有很高的经济药用价值,而且还有重要的生态保护价值。由于生境受到人类破坏日益严重,导致野生梅花鹿和野生马鹿数量急剧下降,近年来发现东北野生梅花鹿和野生马鹿的活动区域有重叠。如何研究和保护现有的两个种群成为今后研究的重点,本研究对于东北地区野生马鹿和梅花鹿遗传多样性进行研究。分别于2015年1月~2015年12月和2016年1月~2016年12月在老爷岭地区的吉林省汪清林业局与黑龙江省穆棱林业局共采集了240份疑似野生梅花鹿和疑似野生马鹿粪便样品,使用粪便 DNA提取试剂盒 Qlamp DNAstool Mini Kit进行 DNA提取。
  本研究利用线粒体DNA cyt b基因序列鉴定在中国东北地区采集的疑似野生梅花鹿和疑似野生马鹿粪便样品是否属于梅花鹿和马鹿,利用微卫星标记对野生梅花鹿和野生马鹿样品进行个体识别,利用线粒体DNA cyt b基因、微卫星比较野生梅花鹿和野生马鹿的遗传多样性差异,得到结果如下:⑴通过基因Bank Blast比对线粒体DNA cyt b基因序列确认粪便样品的物种来源,鉴定240份样品中有23份是梅花鹿粪便样品,其中37份马鹿粪便样品。⑵分别采用9对和12对微卫星引物,通过基因分型进行梅花鹿和马鹿个体识别。确定23份是梅花鹿粪便样品来自于17个个体,37份马鹿粪便样品来自于22个个体。⑶野生梅花鹿单倍型为6个,野生马鹿种群单倍型为5个,单倍型多样性和核苷酸多样性,比其他研究者得出的东北亚种单倍型多样性和核苷酸多样性要低。
[硕士论文] 白俊
生物学 南昌大学;南昌大学医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.尝试运用DNA条形码鉴别秦岭山脉华溪蟹属(Sinopotamon)淡水蟹类,以探讨DNA条形码在华溪蟹属淡水蟹中的适用性,同时初步揭示大型山脉在淡水蟹类群分布中具有阻隔作用抑或充当走廊。
  2.获取我国特有修水华溪蟹(Sinopotamon xiushuiense)、黎川华南溪蟹(Huananpotamon lichuanense)线粒体全基因组;运用短尾下目线粒体全基因组数据进行系统发生分析,探讨淡水蟹在短尾下目中的分类地位及亲缘关系、分化时间及进化过程中受到的选择压力。
  方法:
  1.选择秦岭山脉南北侧采集样本,进行形态学鉴定。选择COI及ITS2基因作为DNA条形码候选标准序列,提取样本的总DNA,经PCR扩增及测序,获得实验数据,结合GenBank已有华溪蟹属数据,共同组成数据集。经数据筛选及检验,做遗传距离及系统发生分析。
  2.检索GenBank数据库,下载已有短尾下目线粒体全基因组数据。获取中国特有修水华溪蟹、黎川华南溪蟹线粒体全基因组,分析其基因组特征,将碱基组成、基因组成及排列、密码子利用情况等特征与其它短尾类比对;依据线粒体蛋白质编码基因产物在线粒体呼吸链中执行的功能,将13个蛋白质编码基因分为4组(复合体I,复合体III,复合体IV,复合体V),结合2个rRNA基因,分别进行系统发生分析;使用BEAST软件估算短尾下目各类群的分化时间;使用PAML软件分别计算13个蛋白质编码基因的平均选择压力,使用分枝模型分别计算淡水蟹类群及其它短尾类的选择压力,计算结果均进行LRT(Likelihood Ratio Test)显著性检验。
  结论:
  1.基于COI基因构建的系统发生树可明确鉴别凹肢华溪蟹(S.depressum)、福建华溪蟹(S.fukienense)、光泽华溪蟹指名亚种(S.davidi davidi)、兰氏华溪蟹(S. lansi)、长江华溪蟹指名亚种(S.yangtsekienseyangtsekiense)。
  2.本研究涉及的华溪蟹类群中“DNA条形码间隙”的差异现象依然存在:长安华溪蟹(S.changanense)与尖叶华溪蟹(S.acutum)聚为一支,结合两物种的种内种间遗传距离存在重叠,即这两个物种间的条形码间隙消失;长江华溪蟹桐柏亚种(S.yangtsekiense tongbaiense)、陕县亚种(S.yangtsekiense shanxianense)与陕西华溪蟹(S.shensiense)共同聚为一支,且种内种间遗传距离出现重叠。
  3.长安华溪蟹及尖叶华溪蟹基本按照采样点位置以秦岭为界分为南北两支,提示秦岭山脉在一些华溪蟹物种迁移活动中具有阻隔作用。
  4.ITS2基因获取效率低,双峰序列占比较高(37.97%),本研究不支持其作为DNA条形码标准序列。
  5.修水华溪蟹线粒体基因组全长18460bp,黎川华南溪蟹线粒体基因组全长15380 bp,均编码了后生动物常见的37个基因。与泛甲壳动物(Pancrustacean)原始排列相比,两种淡水蟹均出现两处特异性tRNA重排(tRNAHis和tRNAGln),该重排此前仅出现在汉氏泽蟹中,在基因组层次支持溪蟹总科的单系性。
  6.使用复合体V(ATP6和ATP8)及复合体III(CYTB)构建的系统发生树与当前分类体系有较大差异,且各分支置信度极低,不适宜作为高阶元系统发生分析的分子标记。其它三组均显示出与当前分类体系较一致的结果,且置信度较高,提示后期可在这些基因中寻找分子标记。
  7.基于线粒体13个蛋白质编码基因的分歧时间估算显示:短尾下目约发生于三叠纪早期(约254.41Ma),而淡水蟹中的溪蟹总科分化于约133.58Ma。
  8.复合体IV(COX1~III)及复合体III(CYTB)受到较强的选择压力,而复合体I(ND1~6,ND4L)及复合体V(ATP6,ATP8)受到较弱的选择压力;除ATP6及ND4L基因外,淡水蟹的11个蛋白质编码基因dN/dS值均大于其它海洋蟹(差异显著),更多非同义替换的积累提示淡水蟹出现对陆地环境的适应性进化。
[硕士论文] 逯金瑶
动物遗传育种与繁殖 东北林业大学 2017(学位年度)
摘要:紫貂(Marteszibellina)曾是一种广泛分布的鼬科动物,现仅在6个国家有分布。由于人类经济活动的干扰,栖息地环境破坏以及生境分布呈斑块状,国内野外种群数量急剧减少,被中国列为国家Ⅰ级保护动物。紫貂物种起源中心地区一直是紫貂研究的热点问题,俄罗斯南部远东地区及中国东北部多次被认定为紫貂起源的中心地带,目前的研究中,研究的种群多局限于该物种的局部分布区,而缺乏从全局角度的研究,或所研究紫貂种群涉及的分布区域比较广泛,但所用的标记比较单一。本文通过测定国内大兴安岭、小兴安岭、长白山地区和蒙古以及邻近俄罗斯多个地区44只个体的紫貂种群完整线粒体基因组(除去D-loop)序列及43只个体线粒体部分控制区序列,结合GenBank公布的俄罗斯地区27条紫貂种群完整线粒体基因组(除去D-loop)序列数据,通过对线粒体基因组序列分析来探讨紫貂遗传结构及进化历史。
  本研究主要内容包括:⑴紫貂的种内差异主要表现在ND2、ND3、ND5和CYTB以及控制区基因,线粒体基因A+T含量明显大于G+C含量,表明出现了明显的AT偏好。⑵中国大兴安岭和小兴安岭地理种群遗传多样性较高且遗传分化较小,长白山地理种群遗传多样性较低;毗邻的国外 KMSU和 KU地理种群遗传多样性较低,UR、WS、BCK、PL和KR地理种群遗传多样性较高。⑶所涉及的紫貂三个分支中 A和 B分支经历过扩张,C分支未呈现出扩张趋势;所有地理种群未呈现出扩张趋势。⑷以现有数据为基础,建议大、小兴安岭地理种群作为一个独立 ESUs,建议长白山地理种群作为一个独立ESUs。
[博士论文] 王拓一
免疫学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:核心生物钟基因Bmal和Per的分子研究揭示在下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic Pituitary-Gonadal axis,HPG轴),雌性生殖功能受到分子时钟的调控。生物钟通过一个极其复杂的神经和内分泌网络调控着性荷尔蒙的分泌和生物节律。但是这个复杂网络的详细信息以及生物钟如何通过这个网络调控性激素分泌的分子机制依然模糊。本文以作为发育生物学领域广泛使用的模式生物-斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,探索生物钟基因bmal1b对HPG轴上性激素分泌调控的分子机制。
  核心生物钟蛋白,包括CLOCK、BMAL、PER和CRY的最基本功能是在真核细胞形成的组织和机体中,形成转录/翻译负反馈环路来驱动和调节基因的节律表达,以及相关的生物化学、生理和行为功能。BMAL1是helix-loop-helix(bHLH)Per-aryl hydrocarbon receptor nuclear transporter(ARNT)Sim(PAS)domain的家族成员,BMAL1通过PAS(PER-ARNT-SIM)结构域和CLOCK形成异二聚体(BMAL1∶CLOCK),驱动哺乳动物体内三个Per(Per1,Per2和Per3)基因和两个Cry(Cry1和Cry2)基因的有节律转录。作为一个关键的节律振荡器,BMAL1:CLOCK控制着大量的基因,包括那些编码生物节律振荡器蛋白的基因表达。
  虽然Bmal1基因在免疫和炎症反应,肿瘤进发生和机体寿命等逐渐被了解,但是Bmal1基因对生殖发育的影响引起了更广泛的研究兴趣。在哺乳动物中只有一个Bmal1基因,而斑马鱼有两个bmal1基因,bmal1a/arntl1a和bmal1b/arntl1b。Pair-wise比较昆虫和哺乳动物Bmal1基因和蛋白序列表明,斑马鱼的bmal1b和bmal1a密切相关。但是到目前为止,仍然不清楚这两个基因的生物学功能及其调节细节。
  首先核实了bmal1b对斑马鱼生物钟调控的重要性,然后观察到在bmal1b突变体中发现产卵数量减少,并伴有整个群体偏向雄性性别逆转的发育状况。发现这种现象主要是由于在bmal1b突变体斑马鱼中,性激素在转录水平和分泌的下降造成的。双荧光素酶报告基因实验和ChIP实验表明,通过E-box或者E'-box,Bmal1b蛋白对gnrh3、gnrhr2、star、lhb、fshr和esr1进行调控,而这种调控对于控制性激素在下丘脑-垂体-性腺轴上的分泌节律是非常重要的。特别是,在斑马鱼HPG轴上,Bmal1b对gnrh3的强调节可能是控制GnRH信号释放水平和触发其他性激素释放的最重要的因素。总之,研究揭示了在HPG轴上,生物钟蛋白Bmal1b通过E-box和E'-box调控斑马鱼性激素分泌,进而调节相应的生殖功能和以性激素分泌为特征的第二性征所导致的性别分化中的分子机制。
[硕士论文] 韩江媛
生物学·动物学 兰州大学 2017(学位年度)
摘要:全球气候变暖,平均温度不断升高是近几年时刻受到关注的气候变化。气温上升导致生境的变化,生物圈中动物的生理机能、个体大小和生存期缩短。对于性别决定依赖环境的物种而言,温度是影响部分鱼类、两栖类和爬行类等动物群体性别比例的主要因素。在近几年的室内室外研究中,均表明温度的上升对变温动物的性比产生了影响。而温度主要在温敏期影响基因的表达。相关的研究表明是温度影响了性别相关基因的表达变化和性激素的产生,导致性比发生变化,也有少数的研究进一步表明性反转和性比变化中,表观遗传参与了性比基因表达的调控。其中DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA的调控均有报道,但相关研究只是个别几个基因的表观修饰或DNA甲基转移酶的表达上调,还有很多方面是不清楚的,且发生甲基化的具体位点也不清楚。
  为了探讨上述问题,本研究采用模式动物斑马鱼为对象,通过正常温度(28℃)、相对低温(23℃)和相对高温(33℃),采用恒温半静态流水培养斑马鱼(10-60天)至性成熟,研究不同温度对斑马鱼群体性别比例的影响。在性比变化的前提下,探索了温敏期的时间。进一步在温敏期检测了性别相关基因的表达和热激蛋白的表达。然后,检测了DNA甲基转移酶的表达变化和DNA甲基化修饰对性别相关基因表达的调控。以确定温度对性别变化的影响是由DNA甲基化调控的。结果表明:在正常温度(28℃)下,斑马鱼的雌雄比例接近1:1;而在相对低温(23℃)下,斑马鱼的雌雄比例为7:3;而在相对高温(33℃)下,雌雄比例为3:7,进一步的温敏期研究确定为斑马鱼受精后的20-30天。在20-30天检测性别相关基因表达后,结果显示在23℃条件下,雌性相关基因卵巢芳香化酶(cyp19a1a,Cytochrome P450family19subfamily A member1a),叉头转录因子(foxl2,Forkhead box L2),雌激素受体1(esr1,Estrogen receptor1)和性别决定域9b(sox9b,Sex determining region Y-box9a)的表达明显升高,雄性相关基因抗穆勒氏荷尔蒙(amh,Anti-Müllerian Hormone),双性和mab-3相关转录因子(dmrt1,Doublesex and mab-3related transcription factor gene1),性别决定域(sox9b,Sex determining region Y-box9b),雄激素受体(ar,Androgen receptor)表达降低;而在33℃条件下,雄性相关基因amh,dmrt1,sox9b,ar高温作用下表达显著升高,而雌性相关基因cyp19a1a,foxl2,esr1和sox9b的表达降低。热激蛋白hsp90,hspb1的表达随着温度的升高而升高。而在高温联合了甲基化抑制剂5-AZA处理后,dnmts甲基转移酶dnmt3a2和dnmt3b4的表达降低,性别相关基因esr1和sox9b的表达也降低,表明esr1和sox9b可能受到DNA甲基化的调控。在甲基化特异性PCR和单克隆检测后发现,esr1基因启动子部分的chr20:26459670-26460005区域和sox9b基因启动子部分的chr3:62343318-62343367区域发生了DNA甲基化的修饰。同时,预测了结合在启动子部位CpG岛片段结合的转录因子,其中,可能调控转录的转录因子有环腺苷酸应答原件连接蛋白(CREB,cAMP-responsive element binding proteins),GATA连接蛋白(GATA,GATA binding factors),SP1转录因子(SP1,GC-Box factors SP1),叉头转录因子(FOX,Fork head domain factors),核因子NFκB及一些锌指结合域(NFκB,Nuclear factor kappa B/c-rel)和性别决定相关的HMG盒因子(SORY,SOX/SRY-sex/testis determing and related HMG box factors),可能发生关键调控的甲基化位点分别为esr1的CpG5(chr20:26459832),CpG73(chr20:26459910),及sox9b的CpG8(chr3:62343326),CpG34(chr3:62343352),CpG67(chr3:62343385)。
  综上所述,本文研究结果证明低温可以使斑马鱼群体雌性化和高温可以使斑马鱼群体雄性化。斑马鱼性比改变的温敏期在20-30天,而温度在温敏期改变性比的原因可能是由于改变了dnmts的变化和性别相关基因esr1和sox9b启动子部位的甲基化来改变群体的性别比率。
[硕士论文] 吕绍巾
水产养殖 大连海洋大学 2017(学位年度)
摘要:达氏鳇,俗称鳇鱼。物种起源于距今一亿三千万年的白垩纪,是全世界惟有黑龙江流域才有的珍贵鱼类。作为白垩纪时期保存下来的古生物群之一,曾与恐龙在地球上共同生活过,其原始古朴的外形1亿多年来几乎没有改变,具有珍贵的科研价值。达氏鳇现为国家二级野生保护动物,1998年联合国华盛顿公约将其认定为濒危物种。除此之外,达氏鳇具有很高的经济价值,其鱼卵被称为―黑黄金‖,鱼子酱是极其美味。而达氏鳇的生长尤为缓慢,性成熟周期在18年以上,因此探究达氏鳇的繁育生理势在必行。
  促性腺激素(gonadotropin hormone,GtH)是由脊椎动物脑垂体分泌的促进性腺发育和繁殖的主要内分泌因素。主要包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormon,LH)、促甲状腺素(throtroid stimulating horme,TSH)同构成的糖蛋白激素家族。由垂体分泌的促性腺激素的生成和释放受促黄体生成素释放激素(LH-RH)和促卵泡激素释放激素(FSH-RH)直接调控。鱼类的性成熟与促性腺激素的分泌直接相关,因此利用生物学手段,加快开展促性腺激素基因的研究至关重要。
  本实验对达氏鳇促性腺激素FSHβ亚基和LHβ亚基进行了基因克隆,采用的是反转录法(RT-PCR)和快速cDNA末端扩增法(RACE),并对其cDNA全长的序列进行了生物信息学分析,构建系统进化树以及对其氨基酸进行了同源对比分析。同时,应用实时荧光定量PCR技术,分别对达氏鳇促性腺激素FSHβ亚基和LHβ亚基在十种组织中的表达量进行了分析。此外,将促性腺激素的开放阅读框导入大肠杆菌中进行了原核表达。实验结果如下:
  (1)设计特异性引物扩增中间片段,并用RACE方法扩增3‘端和5‘端,最后拼接cDNA全长,LHβ亚基cDNA全长596bp,FSH亚基cDNA全长1090bp,开放阅读框为414bp和387bp,分别编码了137和129个氨基酸。经过Blast比对分析,与其它鲟鳇鱼类相比,其氨基酸相似性均高达98%以上。对蛋白质的二级结构、三级结构、疏水性、跨膜区进行了分析,并构建了系统进化树。构建了系统进化树发现,其与中华鲟亲缘关系较近,与其它硬骨鱼类较远,与哺乳动物中的人和小鼠最远。
  (2)对达氏鳇脑垂体、脑、肌肉、精巢、卵巢、肝、肾、肠、胃、鳃10个组织进行了荧光定量分析。结果表明,FSH亚基和LH亚基在大多数的组织表达量上具有一致性,脑垂体表达量最高且尤为显著,在精巢和卵巢中有所表达,在脑中有微量的表达,在其他组织中几乎不表达。而两个亚基的差异主要体现于性腺上,FSH亚基在精巢中表达较高,而LH亚基在卵巢中表达量较高。
  (3)将达氏鳇促性腺激素LHβ亚基和FSHβ亚基的开放阅读框导入Blunt-E1中,再将其质粒提取转入BL21(DE3)里构建成原核表达载体,之后再用IPTG诱导进行蛋白表达,蛋白大小均在14kDa左右。优化其表达条件,结果表明IPTG的浓度对蛋白表达量几乎没有影响,而最优表达条件为:37℃诱导5h。再以此条件进行蛋白大量培养,经过蛋白纯化和western blot鉴定,结果显示出融合蛋白可以与克隆抗体相结合,免疫学活性良好,表明融合蛋白可以在BL21(DE3)中成功表达。
[硕士论文] 隋伊宁
生化与分子生物学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1, LRH-1, NR5A2),隶属于核受体NR(nuclear receptor)5A亚家族,是一种重要的转录因子。LRH-1的结构在脊椎动物中十分保守。其在机体代谢、发育、胆汁酸动态平衡和类固醇生成中起着重要的作用。
  LRH-1在垂体、肾上腺、脂肪、胰腺、肝脏、肠道、精巢、卵巢等器官中表达。在哺乳动物中,LRH-1主要表达在各发育阶段卵巢的滤泡颗粒细胞(Granulosa cells)和黄体细胞中,在鞘膜细胞(Theca cells)中没有表达;在精巢生殖细胞和莱氏细胞(Leydig cells)中有表达,在支持细胞(Sertoli cells)中没有表达。在小鼠中,LRH-1纯合敲除致死。杂合突变雄鼠的附睾和精囊体重比正常小鼠低,Star、Scc、3β-HSD等类固醇生成因子表达含量下降;杂合突变LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等类固醇基因表达水平降低而导致小鼠不能排卵。颗粒细胞特异性条件敲除LRH-1雌鼠不育,不能排卵。在硬骨鱼类中,利用RT-PCR的方法证实了LRH-1在脑、垂体、鳃丝、鳔、肝脏、肠道、脂肪、血液、卵巢以及肾脏和头肾中均有表达。在石斑鱼中,LRH-1表达在卵巢的滤泡细胞和生殖细胞中。有体外实验证明LRH-1可以结合在cyp19a1a和cyp19a1b的启动子上并激活它们的表达。在脊椎动物中,至今没有LRH-1在小鼠以外的功能研究报道,也没有对罗非鱼LRH-1的表达和功能进行系统的研究报道。
  在本研究中,利用RT-PCR,Western blot以及免疫组织化学方法研究了LRH-1在罗非鱼不同组织和雌雄性腺不同发育阶段中的表达以及细胞定位;并利用CRISPR/Cas9系统对尼罗罗非鱼中的LRH-1进行突变,获得了F0代阳性鱼和F1代杂合子,进一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究结果如下:
  通过中山大学张为民教授实验室获得斑点石斑鱼LRH-1抗体,利用ClustalX软件对用于制作石斑鱼LRH-1多克隆抗体的抗原氨基酸序列(172-288)和罗非鱼肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1, LRH-1, NR5A2),隶属于核受体NR(nuclear receptor)5A亚家族,是一种重要的转录因子。LRH-1的结构在脊椎动物中十分保守。其在机体代谢、发育、胆汁酸动态平衡和类固醇生成中起着重要的作用。
  LRH-1在垂体、肾上腺、脂肪、胰腺、肝脏、肠道、精巢、卵巢等器官中表达。在哺乳动物中,LRH-1主要表达在各发育阶段卵巢的滤泡颗粒细胞(Granulosa cells)和黄体细胞中,在鞘膜细胞(Theca cells)中没有表达;在精巢生殖细胞和莱氏细胞(Leydig cells)中有表达,在支持细胞(Sertoli cells)中没有表达。在小鼠中,LRH-1纯合敲除致死。杂合突变雄鼠的附睾和精囊体重比正常小鼠低,Star、Scc、3β-HSD等类固醇生成因子表达含量下降;杂合突变LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等类固醇基因表达水平降低而导致小鼠不能排卵。颗粒细胞特异性条件敲除LRH-1雌鼠不育,不能排卵。在硬骨鱼类中,利用RT-PCR的方法证实了LRH-1在脑、垂体、鳃丝、鳔、肝脏、肠道、脂肪、血液、卵巢以及肾脏和头肾中均有表达。在石斑鱼中,LRH-1表达在卵巢的滤泡细胞和生殖细胞中。有体外实验证明LRH-1可以结合在cyp19a1a和cyp19a1b的启动子上并激活它们的表达。在脊椎动物中,至今没有LRH-1在小鼠以外的功能研究报道,也没有对罗非鱼LRH-1的表达和功能进行系统的研究报道。
  在本研究中,利用RT-PCR,Western blot以及免疫组织化学方法研究了LRH-1在罗非鱼不同组织和雌雄性腺不同发育阶段中的表达以及细胞定位;并利用CRISPR/Cas9系统对尼罗罗非鱼中的LRH-1进行突变,获得了F0代阳性鱼和F1代杂合子,进一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究结果如下:
  通过中山大学张为民教授实验室获得斑点石斑鱼LRH-1抗体,利用ClustalX软件对用于制作石斑鱼LRH-1多克隆抗体的抗原氨基酸序列(172-288)和罗非鱼的LRH-1相应蛋白氨基酸序列进行比对,发现石斑鱼抗原部分98%的氨基酸序列都可以比对到罗非鱼的蛋白氨基酸序列上。证明石斑鱼的LRH-1抗体可以用来检测罗非鱼的LRH-1蛋白。我们通过Western blot结果显示:石斑鱼的LRH-1多克隆抗体能特异识别罗非鱼的LRH-1天然蛋白(85 kDa),并发现LRH-1在罗非鱼的精巢、卵巢中均有一条主带,且在心脏、脑、肝脏中表达。RT-PCR结果显示LRH-1可在罗非鱼脑、鳃丝、心脏、脾、肝脏、肠、卵巢、精巢、肌肉等组织中表达。此外,免疫组化结果显示:LRH-1主要表达在早期生殖细胞和类固醇生成细胞,在卵巢中表达于卵原细胞、卵母细胞、间质细胞和鞘膜细胞,在精巢中表达于精原细胞、精母细胞和莱氏细胞。且LRH-1与Cyp19a1a/Cyp17a1/Cyp17a2共表达于卵巢的间质细胞和鞘膜细胞。LRH-1和Sf-1表达模式基本一致。
  利用CRISPR/Cas9技术在尼罗罗非鱼突变LRH-1基因,获得F0代XX与XY的阳性鱼,尾鳍突变率最高为98%,最低为50%。对F0代阳性鱼分析表明:与对照XX雌鱼相比,120 dah时,XX阳性鱼卵巢出现空腔,且Cyp19a1a/cyp19a1a、scc、starI表达下调。同时,通过EIA检测显示,XX阳性鱼雌激素水平下调;210 dah时,XX阳性鱼卵巢相比对照组卵巢表现为发育延迟,卵巢中还保留大量类固醇阳性细胞。通过LRH-1突变的阳性F0代XY雄鱼与野生型XX雌鱼杂交产生F1代杂合子LRH-1+/-。性腺组织检测结果表明,与对照雌鱼相比,在90 dah LRH-1+/-XX雌鱼卵巢中,间质细胞减少,Cyp19a1a/cyp19a1a表达下调,雌激素水平下调。在210 dah LRH-1+/-XX雌鱼卵巢中,卵子发育延迟,有大量卵母细胞停留在I、II时相,迟迟不能积累卵黄,且有空腔出现,卵巢性腺成熟系数(GSI)显著降低;与对照XY雄鱼相比,90 dah时,LRH-1+/-XY雄鱼精巢内部结构紊乱,但在180 dah时精巢内部恢复正常,产生的精子可育。精巢芳香化酶Cyp19a1b/cyp19a1b表达下调,雌激素水平下调,雄激素水平没有显著变化。由于F1代雌鱼不育,所以尝试用两种方法建立LRH-1纯合突变鱼,第一种方法为用F0代LRH-1突变雌鱼和F0代突变雄鱼杂交,尝试在杂交后代中筛选纯合子;第二种方法为用F0代突变雌鱼和F1代突变雄鱼杂交,尝试在杂交后代中筛选纯合子,但酶切结果显示杂交后代均为杂合子和野生型,没有发现纯合子,表明纯合突变致死。
  综上所述,本研究结果证实在罗非鱼性腺中LRH-1的表达模式与哺乳动物基本一致:在生殖细胞和类固醇生成细胞中表达。并且在硬骨鱼类雌激素生成和卵子生成中具有重要作用。这反映出LRH-1在脊椎动物中的表达和功能具有保守性。
[硕士论文] 先木西努·莫合德
动物学 新疆大学 2017(学位年度)
摘要:种群的遗传多样性水平反映该种群适应环境的能力。明确种群遗传多样性与环境因子的关系,对种群进行有效保护极其重要。近年来,由于气息地环境的变化、偷猎、过度放牧、开垦等人类活动的频繁发生导致鹅喉羚栖息地面积不断的缩小,直接或间接的影响鹅喉羚的遗传多样性。因此,研究新疆鹅喉羚遗传多样性与环境因子之间的关系并确定影响遗传多样性的主导环境因子,以期为新疆鹅喉羚有效合理保护与管理提供理论依据已成为研究的重点。
  1.本研究以mtDNA Cytb与D-loop基因选作遗传标记,应用统计学软件SPSS19.0及生态学软件Canoco4.5探讨了全疆鹅喉羚遗传多样性与环境因子的关系。首先利用线粒体DNA两种基因评价新疆鹅喉羚分布的11个地理种群的遗传多样性,其中基于Cytb基因的核苷酸多样性和单倍型多样性最高的是艾比湖种群(π=0.00223、h=0.967),最低的是阿图什种群(π=0.00025、h=0.467)。基于D-loop基因的核苷酸多样性最高与最低的分别为艾比湖种群(π=0.03312)与阿图什种群(π=0.00372),而单倍型多样性最高的是尉犁种群(h=1.000),最低的是阿图什种群(h=0.667)。新疆鹅喉羚各种群的基于D-loop基因的遗传多样性明显高于基于Cytb基因的遗传多样性,两种分子标记得到的遗传多样性结果基本相同。两种基因片段的四种碱基含量也有差异,基于Cytb与D-loop基因碱基序列的平均A+T含量分别为(58%、60.9%)明显高于G+C含量(42%、39.1%),基因序列富含A+T,表示具有较强的偏向性。
  2.通过SPSS19.0统计学软件,选取的10个环境因子与各种群遗传多样性参数进行相关性分析,结果表明,基于mtDNA Cytb的核苷酸多样性与年均气温(r=0.521,p<0.05)、海拔(r=-0.663,p<0.05)、年均降水量(r=-0.540,p<0.05)、平均人口(r=-0.522,p<0.05)呈显著相关;基于mtDNA D-loop基因核苷酸多样性与年均气温(r=0.491,p<0.05)、海拔(r=-0.529,p<0.05)、年均降水量(r=-0.468,p<0.05)、平均人口(r=-0.416,p<0.05)呈显著相关,与核苷酸多样性相关程性度较大的4个环境因子做回归分析得到以下方程:y=2.318-1.63X1-1.46X2+1.21 X3-0.96 X4(y:鹅喉羚遗传多样性,X1:海拔,X2:年均降水量,X3:年均气温,X4:平均人口),海拔、年均降水量、年均气温、平均人口的标准化回归系数分别为-3.48、-3.17、2.97、-1.69,因此环境因子对鹅喉羚遗传多样性的影响程度为海拔>年均降水量>年均气温>平均人口。
  3.应用Canoco4.5生态学软件对遗传多样性参数与10环境因子进行RDA分析,结果表明,基于mtDNA Cytb的核苷酸多样性与海拔(F=6.10,p=0.018),平均降水量(F=5.70,p=0.024),平均气温(F=5.32,p=0.036),平均人口(F=4.65,p=0.041)有显著相关;基于mtDNA D-loop的核苷酸多样性与海拔(F=6.34, p=0.011),平均降水量(F=5.92,p=0.020),平均气温(F=5.67,p=0.022),平均人口(F=5.11,p=0.038),以上因子对遗传多样性的影响达到显著水平(p<0.05)而与其他环境因子相关性不显著(p>0.05),因此可以推出海拔、年均降水量、年均气温,平均人口是影响新疆鹅喉羚遗传多样性的主要因子,其中海拔是关键的环境因子。
  4.经Canoco4.5软件对鹅喉羚准噶尔亚种遗传多样性与环境因子进行RDA分析,结果表明,mtDNA Cytb与D-loop基因的遗传多样性与海拔及年均将水量的相关程度较大而达到显著水平(p<0.05),因此推出海拔与年均降水量是影响鹅喉羚准噶尔亚种遗传多样性的主要环境因子。
  5.同样的方法对鹅喉羚叶尔羌亚种遗传多样性与环境因子进行RDA分析,结果表明,mtDNA Cytb与D-loop基因的遗传多样性与海拔及年均气温的相关程度较大而达到显著水平(p<0.05),因此推出海拔与年均气温是影响鹅喉羚叶尔羌亚种遗传多样性主要的因子。
[硕士论文] 刘治隆
生物化学与分子生物学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:基因复制是物种进化的一个基本过程。基因可以通过全基因组复制、串接复制、片段复制及基因转座等方式产生两个或多个拷贝。复制基因为生物体适应外部环境提供了大量的遗传物质,这些新产生的基因会经历新功能化、亚功能化或者去功能化的不同命运。所以说,基因复制是基因组进化最主要的驱动力之一,是产生新功能基因和进化出新物种的重要过程。
  在上述各种复制方式中,串接复制和全基因组复制是两种主要的复制形式。虽然已有大量的研究探讨了动植物不同类群中的全基因组复制事件,但迄今为止,对串接复制基因的研究大多集中在个别的串接复制基因或者家族,而缺乏在全基因组水平上的认识。随着基因组数据的不断积累,比较基因组学作为一种重要的工具学科目前己经成为研究生物基因组最主要的手段之一。根据序列相似性和位置关系确定出各物种复制基因的类型和数目,通过比较基因组学分析,将不同类群物种的串接复制基因进行比较,有助于确定串接复制基因的产生与物种适应性进化之间的关系。因此,本研究全面分析了以下23种不同进化地位脊椎动物的串接复制基因:人,大猩猩,猩猩,小鼠,大鼠,豚鼠,原鸡,火鸡,斑胸草雀,安乐蜥,非洲爪蟾,腔棘鱼,斑点雀鳝,斑马鱼,墨西哥脂鲤,斑点叉尾鮰,南方鲇,新月鱼,三刺棘鱼,青鳉,尼罗罗非鱼,黑青斑河鲀,红鳍东方鲀,比较了各物种之间串接复制基因种类和数目的异同,以尼罗罗非鱼和南方鲇为例分析了串接复制基因的功能及组织表达模式,并对一些典型的串接复制基因做了进一步分析,得到以下结果:
  从数据库获取23种脊椎动物的基因注释信息,去掉长度小于25个氨基酸的基因注释,分别获取每个基因所对应最长的氨基酸序列以及各物种基因的染色体定位信息。使用Blast+工具和MCScanX分别进行序列比对及共线性分析,将各物种基因分为以下五种类型:Singleton(单拷贝基因);WGD/segmental(在共线性区域的共线性基因);tandem(串接复制基因);proximal(同一染色体附近但不相邻的复制基因);dispersed(其它复制基因)。23种脊椎动物的串接复制基因占全部基因数的平均比例为10.6%,占全部复制基因数的平均比例为13.5%。在哺乳动物中,两者的比例分别为15.3%和19.9%;鸟类为7.7%和10.1%;鱼类为8.7%和10.8%。哺乳动物中,小鼠的串接复制基因最多,共4833个;鱼类中,斑马鱼的串接复制基因最多,共3955个。串接复制基因所形成的基因簇中,含有2个串接复制基因的基因簇比例最高,从小鼠的55.7%到红鳍东方鲀的87.1%不等。在多数的脊椎动物中,嗅觉受体(Or, olfactory receptor)和原钙粘连素(Pcdh, protocadherin)基因均串接复制了10次以上(含10次)。有意思的是,角蛋白(Krt, keratin)基因只在四足动物中普遍串接复制了10次以上,而在鱼类中则是晶状体蛋白(Crygm, crystallin gamma)基因。其他串接复制了10次以上的基因并没有一定的规律,如微量胺相关受体(Taar, trace amine associated receptor)和趋化因子受体(Cxcr, c-c chemokine receptor)基因均只在四足类和鱼类的部分类群发生了10次以上的串接复制。上述结果表明,串接复制基因的数目和类型可能与类群或物种对环境的适应性相关。
  根据序列的相似性,本研究将23种脊椎动物的串接复制基因分成了2045个不同的基因家族。韦恩图显示遗传距离越近的物种具有越多共同的串接复制基因家族,表明串接复制基因并不是完全随机的,可以在一定程度上反映物种的进化关系。GO富集分析显示真骨鱼类共同的串接复制基因与四足动物共同的串接复制基因在生物过程和分子功能上并不完全相同,真骨鱼类拥有更多具有应对刺激和信号传导功能的串接复制基因。基于罗非鱼成鱼的8个组织和南方鲇的11个组织转录组的分析发现,大多数的串接复制基因都表达在具有免疫功能的器官,如鳃、脾脏、肾脏以及头肾等。此外,在脑、肝脏等组织中呈现出特异性的表达模式。说明串接复制基因对于物种适应外界环境是必不可少的,一方面帮助物种提升基本的生命活动能力,另一方面提高免疫以及应对外界刺激的能力。
  本研究还对一些典型的串接复制基因进行了具体分析。脊椎动物共同的串接复制基因Hox基因簇与DMRT1/2/3基因簇的共线性都具有一定的保守性,两者在物种身体发育和生殖活动中扮演着重要的角色。硬骨鱼共同的串接复制基因簇cldn10和olfm4可能参与到鱼类在水环境中的免疫活动,这两类串接复制的产生分别发生在真骨鱼特有的基因组复制(TSGD)事件的前后,从而导致前者串接复制基因之间的序列相似性明显低于后者,说明复制发生时间的早晚与序列的变异程度有直接的关系。对于物种特异的串接复制基因簇fbxw12(F-box and WD repeat domain containing12)和ZPC(zona pellucida C)对物种的生殖和代谢调节等活动具有重要作用。说明串接复制基因的确为物种应对外界环境的变化提供了丰富的遗传物质基础。
  本研究为全面理解串接复制基因的进化和功能提供了新的视角,为厘清基因复制与脊椎动物进化之间的关系提供了新的思路。特定串接复制基因的筛选为研究脊椎动物应对环境压力的适应性进化提供了研究基础。
[硕士论文] 陈健
生态学 贵州师范大学 2017(学位年度)
摘要:大蹄蝠(Hipposideros armiger)广泛分于贵州省境内。关于大蹄蝠(H. armiger)的分子系统地理学的研究已有报道,本文使用线粒体DNA控制区(D-loop区)作为分子标记,针对这一物种进行了省级区域范围内的遗传多样性、种群遗传结构、历史动态等方面的研究,阐述了贵州省大蹄蝠的种群扩散中心,初步探讨了小尺度范围内大蹄蝠(H. armiger)是否存在偏性扩散现象,分析了贵州省内当今的大蹄蝠种群分布情况。
  本研究主要内容包括:⑴按照《贵州兽类志》所划分的兽类地理区划将贵州分为五个地理省,对这五个地理省及相邻的云南和广西地区进行大蹄蝠标本采样,在这七个样区,共采集到大蹄蝠样本(翼膜或肌肉)475号。将所采集的样本分为三个类群分别进行分析:475个不分性别群体、261个全雄性群体、194个全雌性群体。结果显示相较于全国范围大蹄蝠的遗传多样性,本研究中的三个类群的遗传多样性均较低。不分性别群体的单倍型多样性 Hd=0.555,核苷酸多样性 Pi=0.00295;全雄群体的单倍型多样性 Hd=0.653,核苷酸多样性 Pi=0.00293;全雌群体的单倍型多样性 Hd=0.449,核苷酸多样性 Pi=0.00345。说明了贵州省大蹄蝠种群进化历史较近。在所有的种群中,VIB4种群的遗传多样性是最高的(不分性别群体:Hd=0.832,Pi=0.00431;全雄群体Hd=0.876,Pi=0.00392;全雌群体Hd=0.743,Pi=0.00494),暗示了该地区可能是贵州省大蹄蝠种群扩散的中心。⑵Arlequin软件计算得到的遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)显示,贵州的五个种群及广西种群间产生了较小的遗传分化,各种群间存在较频繁的基因流,表明遗传分化发生在近期;而这六个种群与云南种群间则产生了显著的遗传分化,存在有限的基因流。遗传分化分析还显示全雄群体各种群间的遗传分化较雌性群体中各种群的遗传分化系数显著,暗示了雌性种群间持续的基因流。⑶对于三个类群中大蹄蝠种群结构的分析显示了相同的结果,系统发育树和单倍型网络结构分析呈现了高度的一致性,贝叶斯树被分为两个明显的分化支(A、B支)。网络结构图也产生了两个明显的聚类,其中VA1、VIB4种群的部分单倍型与云南种群的单倍型聚在一起,而贵州各种群则与广西聚为一支,显示了贵州种群与广西种群较近的亲缘关系。⑷遗传分化分析和分子方差分析(AMOVA)显示全雌群体中47%的种群间存在小而不显著的遗传分化,且雌性群体中各种群间的基因流要大于全雄群体中各种群的基因流,雌性群体并未形成稳定系统地理结构。说明了在省级区域范围内雌性群体参与了种群扩散并存在较频繁的基因交流。但由于D-loop控制区为母系遗传,在此并不能完全说明大蹄蝠是否存在显著的偏性扩散。⑸贵州地区喀斯特地貌发达,存在较多的岩溶洞穴,为大蹄蝠提供了理想的栖息场所。其中VIB4地区包括了贵州的一个高温区,有较好的植被环境和较多的大洞长洞,良好的环境、丰富的资源使该地区成为现今贵州省大蹄蝠种群主要的分布区。
[博士论文] 李扬威
生物信息学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:氧是地球上大多数生物赖以生存的必需元素,低氧(Hypoxia)环境会造成生物体内部组织或细胞缺氧,继而引起机体的应激反应,产生生理病理变化并影响生长发育过程。地下鼠长期生活于氧气含量较低的地下洞道系统中,在形态、生理、行为和遗传等方面形成了良好的低氧适应。棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)终生营地下生活,是一种典型的地下鼠,其近缘种布氏田鼠(L. brandtii)则以地面活动为主,二者是地下低氧环境适应比较研究的理想对象。
  本论文以棕色田鼠为研究对象,以布氏田鼠为对照;通过对棕色田鼠野外环境参数的调查,获得了不同季节洞道系统中O2/CO2含量、温度、湿度等数据;通过构建基于线粒体基因组序列的进化树,确定了棕色田鼠和布氏田鼠的分类地位与亲缘关系;在低氧舱内模拟慢性低氧和急性低氧状态,完成不同氧环境下棕色田鼠和布氏田鼠脑组织转录组的测序、de novo组装和注释;采用比较转录组方法,分析不同低氧处理对棕色田鼠和布氏田鼠脑组织转录组基因表达的影响;结合棕色田鼠的全基因组测序、de novo组装和注释结果,对棕色田鼠有参和无参转录组差异表达结果的一致性进行了研究;最后,系统整理了棕色田鼠和布氏田鼠低氧转录组数据以及棕色田鼠全基因组数据,构建具有存储、管理、查询和局域网远程访问功能的数据库,实现数据的共享和可视化操作。
  主要结果分述如下:
  1)棕色田鼠洞道长约40 m,分支较少,取食与活动洞道深度为20~30 cm,主巢和粮仓深度为60~80 cm。洞道内温度恒定为24±2℃、湿度保持90%以上;正常洞道内氧气含量为17.24%~19.48%,雨后最低达到16.04%;洞道内CO2含量在0.03%~2.55%之间,与氧气浓度呈显著负相关(r=-0.85,p<0.001)。
  2)基于线粒体基因组序列系统进化分析结果表明,棕色田鼠与布氏田鼠同隶属于毛足田鼠属(Lasiopodomys),该属独立成枝,与田鼠属(Microtus)分枝有明显区分,与狭颅田鼠(Microtus gregalis)和凉山田鼠(Proedromys liangshanensis)共同构成单独进化枝。
  3)通过高通量测序,获得棕色田鼠和布氏田鼠的18个脑组织样品的135Gbp高质量转录组数据;使用合并组装法分别获得了两种鼠转录本的unigene集,N50长度均大于2,200 bp,组装效果较好;转录本注释后分别得到棕色田鼠的20,172和布氏田鼠的19,215个注释结果,其中,棕色田鼠Nr注释结果中有2%的基因与同为地下鼠的盲鼹形鼠(Spalas galili)相似性较高。
  4)与常氧处理相比,10%慢性低氧处理48 h后,棕色田鼠有695个基因表现出差异表达,布氏田鼠则仅为158个;进一步采用差异表达基因的功能注释、代谢通路富集及蛋白互作网络分析等方法研究,结果显示,棕色田鼠上调了氧气运输、血管生成、抑制血管生成、DNA修复、细胞凋亡、细胞自噬等功能的调控基因,脑神经保护和修复、CO2防护、血压和神经兴奋性升高等功能也有相应上调,此外,下调了蛋白水解、辅酶代谢等耗氧功能调控基因;布氏田鼠氧气运输、血管生成和抑制、脑神经保护和修复及 CO2防护等功能的调节基因有所上调,神经递质多巴胺合成及传递相关的多个基因表达下调。比较两物种慢性低氧应答发现,布氏田鼠细胞水平的应答较少,暗示棕色田鼠对慢性低氧的敏感性和应答强度均较高。
  5)与常氧处理相比,5%急性低氧处理6 h后,棕色田鼠有1,386个基因表现出差异表达,布氏田鼠则高达1,878个;进一步分析发现,二者差异基因的功能注释、代谢通路富集结果较为接近,均在血管生成、无氧呼吸激活、DNA修复和细胞增殖与凋亡等方面有大量功能基因表达上调。不同的是,棕色田鼠急性低氧下神经细胞生成与保护和多个抑制血管生成相关基因上调、多巴胺合成与运输相关基因下调,且有多个癌症相关基因和抑癌基因表现出与肿瘤微环境相反的表达模式;布氏田鼠的主要上调功能集中于血管生成和免疫应答,调控功能较为单一,神经细胞生成与保护相关基因出现下调表达,暗示棕色田鼠的急性低氧应答策略可能更为高效。
  6)棕色田鼠全基因组测序获得140X基因组覆盖度的高质量数据,组装后得到总长为2.10Gbp的Contigs,N50为51.15kbp,补洞后得到代表基因组全长的Scaffolds共2.15Gbp,N50达到6.15Mbp;reads回比分析获得777万余个SNP位点;同源比对和从头预测共获得33.93%的重复序列、21,229个编码基因和7,000余个非编码RNA序列,共有19,801个编码基因得到注释;基于棕色田鼠全基因组的有参/无参转录组结果呈极显著的正相关关系(r=0.836,p<0.0001)。
  7)使用Access软件将棕色田鼠和布氏田鼠的转录本拼接和注释结果归类整理为本地化数据库;通过BLAST+和Sequenceserver构建两个转录组和棕色田鼠全基因组的本地BLAST比对数据库;最后使用过Java语言和Apache+ Tomcat服务器实现数据库信息的局域网远程访问。
  结论:
  1)棕色田鼠洞道系统温度稳定,湿度较高,氧气含量较低,二氧化碳含量较高,与Spalax属物种的野外洞道环境参数相似;
  2)棕色田鼠与布氏田鼠均隶属于毛足田鼠属,与田鼠属分枝区分明显,与狭颅田鼠和凉山田鼠共同构成单独进化枝;
  3)棕色田鼠和布氏田鼠的转录本 unigene集各参数均比较相似,可能与二者亲缘关系接近有关;棕色田鼠 Nr注释结果中有2%与盲鼹形鼠相似性较高,推测与地下低氧环境适应产生的趋同进化有关;
  4)与布氏田鼠相比,棕色田鼠对急性和慢性低氧均具有较强的适应能力,分子机制主要包括高效的能量利用、严格的血管生成调控以及多层面的细胞修复与凋亡调节;
  5)布氏田鼠具有一定的低氧适应能力,主要表现在低氧时血管生成调控及氧气运输能力的提升,但能量代谢和细胞增殖/凋亡水平的调控少于棕色田鼠,与地面动物常见的低氧应答机制类似;
  6)棕色田鼠全基因组测序得到高质量的组装和注释结果,有参转录组分析与无参转录组分析结果拥有较高的一致性;
  7)构建的棕色田鼠转录组和棕色田鼠基因组数据库实现了数据的局域网访问及可视化查询。
[硕士论文] 周辉
设施农业 浙江海洋大学 2017(学位年度)
摘要:南麂列岛国家级海洋自然保护区是1990年创建的5个国家级海洋自然保护区之一。它是我国建立的第一个海岛海域生态系统自然保护区,其保护对象主要包括海洋贝类和藻类资源,以及海岛海域生态环境。相对来说鱼、虾、贝、藻等,对此地多毛类生物的研究比较匮乏,因此本文主要对多毛纲动物进行着重研究。
  随着对生物学认识和探索的不断深入,单一的形态学方法已不能适应现代分类学发展的需要。加拿大分类学者Hebert等从2003年开始把线粒体COI基因作为动物界的DNA条形码,进而拉开了以形态和分子分类相结合的崭新分类时代的序幕。近年来,DNA条形码技术的不断完善,已经广泛应用于生态环境学及相关领域的科学研究工作中。多毛纲是环节动物门最大的一个纲,是海洋中极为常见的动物类群,不仅是鱼类及其他动物的重要饵料,也是海洋资源调查的重要组成部分。
  本文根据2015年10月、2016年3月、2016年5月、2016年8月春、夏、秋、冬四个季节在南麂列岛国家级海洋自然波保护区的设立的9个采样点进行的采样,对共获得底栖动物多毛类环节动物360个个体,经过形态及分类学鉴定,共得到多毛类36种。在形态学的基础上,运用了分子生物学方法对部分样本进行了DNA条形码分析,获得的COⅠ DNA与GenBank上的其他研究者上传同源序列进行比对,再通过聚类和遗传距离分析,得出了6个确定的物种的条形码数据,并进行确切的描述。最后,本文主要计算了4个季节的生物多样性指数,对4个季节的指数进行了比较。2016年8月(夏季)的丰富度指数(D)最高,2015年10月(秋季)次之,2016年3月(冬季)和2016年5月(春季)较低;生物多样性指数(H'),基本都在2左右,生物多样性较好。不同的采样地点及季节会出现不同的多样性指数。
[硕士论文] 孙海坤
水产养殖 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本文以三个不同地理鲇(Silurus Asotus)群体(黄河郑州段ZZ、松花江哈尔滨段 HEB和大洋河东港段 DG)为研究对象,通过形态学和分子标记的方法研究了三群体的形态差异、遗传结构和遗传多样性,并比较了三个鲇群体背部肌肉的营养成分差异,旨在为鲇的资源保护和利用提供基础资料。
  本研究主要内容包括:⑴以三个鲇群体形态学的可数性状、可量性状和框架数据为研究对象,通过四种多元统计方法比较了三群体的形态学差异。三鲇群体间可数性状卡方检验表明其可数性状已出现分化。单因素方差分析结果表明,三群体的可量性状和框架数据有不同程度的差异,性状间的差异系数均小于1.28,三群体差异属于不同地理间差异。聚类分析结果表明,DG群体和 HEB群体形态相似程度高,两群体和ZZ群体相似程度较低。判别结果表明判别方程取得了良好效果,可以初步判别三群体的归属。影响第一主成分的11个性状主要集中在头部和鱼体的部分框架数据。四种分析方法的结果表明三群体在形态学上有一定的差异,多元统计方法可以有效地区分三群体。⑵通过国家标准方法对三个鲇群体背部肌肉的一般营养成分、脂肪酸和氨基酸进行了测定。结果表明,DG群体与ZZ和HEB两群体在一般成分上有较明显差异。对三群体的一般营养成分进行了体重和体长的协方差检验表明,体重和体长对一般营养成分的影响未达到显著水平。ZZ、DG和HEB三群体脂肪酸间比例接近理想模式。三群体的氨基酸均符合FAO/WTO的理想模式。三群体中HEB群体的必需氨基酸指数(EAAI)评分最高。缬氨酸为第一限制性氨基酸,异亮氨酸为第二限制性氨基酸。通过主成分分析三群体差异,表明三群体背部肌肉的差异主要体现在C20:5n-3、C22:5n-3、甘氨酸、丙氨酸、TDAA/TAA、∑n-3/∑n-6、C22:6n-3、粗脂肪和∑EPA+DHA。三群体均有较高的营养品质,能较好的满足人们的营养需求。⑶选取线粒体 D-loop区作为标记对三个自然河段鲇群体的遗传多样性进行比较分析。三个鲇群体碱基G+C含量显著(P<0.05)低于A+T含量。三群体单倍型数、多态位点数和核苷酸多态性从高到低依次为DG、HEB和ZZ。三群体共有21种单倍型,单倍型邻接树和中介网络图均得到单倍型3、8和19构成一支,其它单倍型构成一支的结果。三群体中HEB群体和DG群体间的遗传距离最大,DG群体和ZZ群体亲缘关系近。三群体ZZ群体和HEB群体间的遗传分化系数最高,ZZ群体和DG群体间遗传分化系数最低,群体间平均基因流(Nm)为1.532。三群体各群体的Fu'Fs中性检验和Tajima's D检验都为负值,但差异不显著(P>0.05)。碱基错配分布的实测值曲线没有一个明显地峰值。三群体均有较高的遗传多样性,群体间不存在显著(P>0.05)的遗传分化,三群体群体稳定,过去没经受种群扩张。⑷通过AFLP标记对三个自然河段鲇群体的遗传多样性进行比较分析,结果表明,DNA模板的提取、酶切连接、预扩增和选择性扩增均取得了良好的效果,64对引物中共筛出7对引物,扩出3700条AFLP条带。HEB群体的多态位点比例和Shannon遗传指数结果最高,ZZ群体结果最低。三群体变异的主要来源于群体内部。三群体具有较高的遗传多样性和较好的环境适应能力。三个鲇群体间和群体内的分子变异都存在显著性(p<0.001)。三群体中ZZ群体和DG群体间的遗传分化系数最小为0.118,ZZ群体和DG群体间的基因流最大为1.869。Structure分析、PcoA分析和UPGMA进化树三种方法均得到三个鲇群体明显地分为两大类群的结果,DG群体和ZZ群体为一类群,HEB群体为另一类群。
[硕士论文] 宫亚运
生物学·生态学 暨南大学 2016(学位年度)
摘要:鲱形目(Clupeiformes)是硬骨鱼纲(Osteichthyes)辐鳍亚纲(Actinopterygii)中的一个目,普遍生活在温带及热带的海水、咸淡水和淡水中,在世界和我国的渔业中都占有重要地位,具有极高的经济价值、医疗价值和科研价值。银鲈属(Gerres)是隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲈形目(Perciformes)银鲈科(Gerreidae?)的肉食性鱼类,在我国主要分布在南海和东海海域,因营养丰富、肉质美味,也具有较高的经济价值。目前,随着全球海洋环境的不断恶化和酷渔滥捕,鲱形目鱼类和银鲈属鱼类的产量愈发减少甚至部分种类濒临灭绝,亟待采取措施以更好地保护和合理利用鲱形目和银鲈属鱼类资源。准确的物种鉴定是深入开展海洋生态和渔业资源评估以及相关政策制订的前提,但由于鲱形目和银鲈属鱼类种类多,一些近缘种外部形态相似,且同一物种自身形态受外界环境和发育阶段的影响而有较大变化,基于传统的形态鉴定往往不能准确鉴定物种。DNA条形码是一项可对物种进行快速、准确鉴别的分子标记技术,已被广泛应用于物种的鉴定。本文以动物分类鉴定中广泛使用的标准序列线粒体COI基因652bp的序列作为DNA条形码,分析了鲱形目2亚目4科24属48种407条序列和银鲈属6种405条序列,其中本文测定的鲱形目有3科11属25种共317尾鱼类,鲈形目银鲈科银鲈属6种共399尾鱼类;GenBank中下载的鲱形目有4科19属32个种共90条序列,鲈形目银鲈科银鲈属5种共6条序列,以探讨中国近海鲱形目和银鲈属鱼类的分类地位以及DNA条形码在鲱形目和银鲈属鱼类鉴定中的有效性,分析近缘种的的系统发育关系,得到的结果如下:
  (1)鲱形目全部48个种的种内平均遗传距离为0.6%,其中有45个种的种内遗传距离小于2%,存在明显的条码间隔,满足Hebert提出的种内遗传距离标准,确定了它们的物种有效性,表明DNA条形码能对鲱形目绝大部分物种进行准确鉴定。全部24个属中有18个属形成了各自的单系分支,表明COI基因序列也能在属的水平上对鲱形目大部分类群进行很好的区分。鲚属中的凤鲚分为了2个种,刀鲚、短颌鲚为同一个种,与前人研究结论相一致;棱鳀属中的黄吻棱鳀和中颌棱鳀在NJ树上各为单系但聚为一支,可能为2个亚种或近期分化形成的种;青鳞小沙丁鱼分为2个单系支,推测可能存在2个种亦或是GenBank中序列的命名有误;洁白鲱属中的洁白鲱和鳓属中的鳓聚为一支,小沙丁鱼属中的长头小沙丁鱼和中华小沙丁鱼聚在一支,推测有可能是GenBank中鉴定的错误或是受到种间杂交、近期辐射进化的影响。
  (2)银鲈属全部6个种聚类为7个分支,除长棘银鲈外,其余5个种的种内遗传距离均小于2%,种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的62倍,远大于Hebert提出的10倍标准,表明线粒体COI基因适合作为银鲈属的DNA条形码对大部分银鲈属鱼类进行区分。长棘银鲈分为2个不同的支系,分支间的遗传距离13.8%为分支内平均遗传距离0.15%(0.1%-0.2%)的93倍,远远大于种内种间的10倍标准,表明可能存在2个不同的种,短棘银鲈和来自GenBank的缘边钻嘴鱼处于同一分支,二者系同物异名。
  (3)COI基因能够作为DNA条形码对鲱形目和银鲈属绝大部分种类在种间种内水平上进行较好的区分,但COI基因在对近期分化形成物种、杂交物种以及高阶分类水平上的类群进行鉴别时存在不足,今后对鲱形目和银鲈属的研究应结合多种分子标记和多学科进行深入探讨。
[硕士论文] 袁晓立
动物学 河南大学 2016(学位年度)
摘要:基因组编辑技术尤其是新兴的 CRISPR/Cas9系统,能高效地对基因组进行靶向修饰,理论上可以实现任何物种任何基因的编辑,对生命科学、医学等都展示出巨大的研究价值。传统的基因打靶技术依赖于DNA片段的同源重组,效率低(低于10-6)。相对于ZFNs和TALENs的复杂组装,CRISPR/Cas9系统依靠guide RNA和Cas9蛋白就可以实现基因定点编辑,具有构建简单、打靶效率高、成本低等优点。本实验设计利用CRISPR/Cas9系统分别在小鼠ES细胞和胚胎水平实现基因定点敲除,并获得单等位基因敲除小鼠模型。
  本课题以小鼠母源印记基因Kcnq1ot1作为敲除对象。该基因位于Kcnq1ot1印记基因簇中并起调控作用。本课题第一条技术路线为ES细胞介导的囊胚注射法制备转基因小鼠,策略为敲除Kcnq1ot1启动子以及其起始部位共3.7 kb长DNA片段,并敲入puro-eGFP。在敲除片段5’和3’端各找了3个靶位点并成功构建基于靶位点的6个gRNA和打靶载体 Kcnq1ot1-puro-eGFP-pGalk。将打靶载体、Cas9表达质粒和5’gRNA-1及3’gRNA-1共转染至小鼠ES细胞,得到单等位基因敲除ES细胞株。将单等位基因敲除细胞株扩大培养以后进行囊胚注射。采用CD1小鼠作为供胚鼠,共注射1836枚囊胚,移植826枚,共出生138只小鼠,出生率为16.7%,成功获得4只嵌合体小鼠,但没有生殖系嵌合。
  第二条技术路线采用受精卵原核注射法制备转基因小鼠。同样敲除3.7 kb长DNA片段,敲入mCherry荧光报告基因。为了增加同源重组效率,将同源臂长度提高至1.5 kb,构建了基于受精卵的打靶载体 Kcnq1ot1-mCherry-pGEM-3CZF。通过本实验室建立的荧光报告基因法在质粒水平检测了6个gRNA位点同源重组修复效率,筛选出同源重组效率较高的5’gRNA-2、3’gRNA-3和打靶载体及Cas9表达质粒进行原核注射。供胚鼠为D6B2F1,共注射583枚胚胎,移植327枚,出生66只,出生率20%。因同源重组修复效率低,经初步鉴定,未发现阳性鼠,目前准备增加注射胚胎的数量以获得基因敲除小鼠。
[硕士论文] 张容宇
遗传学 内蒙古农业大学 2016(学位年度)
摘要:红腹锦鸡羽毛色彩鲜艳,是闻名中外的观赏鸟类,近几年,从遗传学、解剖学等方面对红腹锦鸡进行了很多的研究。但对红腹锦鸡胚胎期类胡萝卜素的代谢途径却鲜有报道。因此本文对其胚胎不同时期发育的形态学进行了研究。在此基础上利用原位杂交技术研究了BCO2基因在其胚胎不同时期的表达含量及特征,为红腹锦鸡类胡萝卜素代谢的分子机制提供必要的理论基础,主要结果如下:
  (1)红腹锦鸡背部羽毛发育的HE染色结果显示,发育到7日胚龄时,背部皮肤呈多层结构,而此时背部的羽毛芽还没有发育;9日胚龄时,背部真皮细胞在表皮囊泡的下方聚集,并形成羽毛芽表皮基板;10日胚龄时,背部表皮开始增厚;在胚胎发育的第11日胚龄时,背部表皮的羽毛芽进入了短芽阶段。到13日胚龄时,背部表皮的羽毛芽进入了长芽阶段,同时可观察到黑色素在羽毛芽生成。
  (2)红腹锦鸡眼睛发育的HE染色结果显示,发育到7日胚龄时,可观察到视网膜跟脉络膜生成;9日胚龄时,视网膜开始增厚;10日胚龄时,可观察到少量黑色素在脉络膜上面生成,此时的巩膜开始增厚;11日胚龄时,视网膜不断增厚,黑色素在脉络膜上面大量生成;到第13日胚龄时,黑色素在脉络膜上大量沉积,巩膜增厚。
  (3)原位杂交结果显示BCO2基因在红腹锦鸡胚胎各个器官和组织均有不同程度的表达,表明红腹锦鸡胚胎期器官发育和生长需要降解卵黄中的类胡萝卜素。背部羽毛芽和眼睛视网膜中,BCO2基因的表达明显高于周围组织,说明红腹锦鸡胚胎期不同组织对于卵黄中类胡萝卜素的利用以及沉积于组织的量有所不同。
[硕士论文] 张赛赛
水产养殖 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本研究以我国辽宁地区刀鲚(Coilia nasus)为主要研究对象,以太湖群体刀鲚做对照。从形态学、肌肉生化组成和分子遗传三个层次,由浅入深的对辽河群体、大洋河群体和鸭绿江群体刀鲚的遗传多样性做了较为全面的研究。
  本研究主要内容包括:⑴通过统计传统可量性状数据和框架测量数据共40个比例参数研究了大洋河群体(DYH)、鸭绿江群体(YLJ)和太湖群体(TH)形态差异。通过软件使用主成分分析、聚类分析和判别分析三种多元分析方法,发现不同群体刀鲚形态存在差异。主成分分析表明3个群体刀鲚形态差异发生在背鳍以后的尾部。判别分析建立的判别函数对群体内判别准确率均为100%,群体间综合判别准确率为96.74%,能有效判别各群体刀鲚归属。聚类分析将鸭绿江和太湖群体聚为一支,说明在形态上两群体较接近。由此可知,3个群体刀鲚在不同的生长环境中形态发生了变异,主成分分析、判别分析和聚类分析方法一定程度能鉴别出它们的形态差异,判别分析能有效的将3个群体区分开。⑵对框架数据加以改进,有效的增加了群体内和群体间的判别准确率。改进的刀鲚框架数据中水平隔膜长度(D13)对主成分2的贡献负荷值0.804>0.500,具有显著贡献作用;反映刀鲚身体中部厚度的参数D14-14′在判别分析中从40个参数中被筛选出来,用于构建判别函数并提升了各群体内判别准确率,使准确率高达100%,群体间判别率提升至96.74%。在框架测量法中增加了不同位置鱼体体厚的数据建立,使反映鱼体体型的框架更加全面,这是对现有框架测量法的改进,值得在其它鱼类的形态学研究中进一步研究和探讨。⑶通过生化分析法比较了辽河群体、大洋河群体、鸭绿江群体和太湖群体刀鲚在肌肉营养组成上的差异。辽河群体粗蛋白含量是辽宁地区3个群体中最低(78.10%)。辽宁地区刀鲚粗脂肪含量从高到低顺序为:辽河群体>鸭绿江群体>大洋河群体,三者间相互差异显著(P<0.05)。鸭绿江群体刀鲚灰分含量最小(3.76%),其它3个群体灰分含量较高,三者之间差异不显著(P>0.05)。鸭绿江群体刀鲚的饱和脂肪酸(SFA)和多不饱和脂肪酸和(PUFA)是辽宁地区群体中含量最高的,其 EPA+DHA含量是4个群体中最高的,且均差异显著(P<0.05)。鸭绿江群体刀鲚肌肉中总氨基酸(TAA)、总必需氨基酸(TEAA)和总呈鲜味氨基酸(TDAA)含量均显著低于太湖群体,但均显著高于辽宁各群体(P<0.05)。以 AAS评数分析,缬氨酸(val)和半胱氨酸+甲硫氨酸(Met+Cys)是4个群体的第一、二限制氨基酸。以 CS评分分析,4个群体第一限制氨基酸均为半胱氨酸+甲硫氨酸(Met+Cys),第二限制氨基酸大洋河群体为异亮氨酸(Ile),其它3个群体为缬氨酸(Val)。必需氨基酸指数(EAAI)中鸭绿江群体和大洋河群体是辽宁地区中较高的,分别为75.03%和74.87%,两者间差异不显著(P>0.05)。⑷应用线粒体基因测序法,获得了辽河、大洋河、鸭绿江和太湖4个地理群体34尾刀鲚的mtDNA D-loop区域部分基因序列(长度为489bp),分析了4个群体刀鲚的遗传多样性和遗传结构。结果显示,辽河群体、大洋河群体和鸭绿江群体刀鲚的单倍型多样性指数分别为0.85700、0.84400和0.85700,核苷酸多样性指数分别为0.00263、0.00318和0.00351,都明显高于太湖群体刀鲚0.41700和0.00091。鸭绿江群体的Tajima′s D值为-1.76179,显著偏离中性(P<0.05),其历史上可能经历过种群扩张。4个群体间的遗传距离范围为0.00177~0.00323,明显低于刀鲚与七丝鲚(Coilia grayi)种间的遗传距离0.0528。Fst值为0.00543<0.05,说明4个群体间未发生分化。以NJ和MP两方法构建的分子系统分支树结果支持4个群体刀鲚间未发生分化这一结果。
[硕士论文] 刘贤曦
海洋生物学 大连海洋大学 2016(学位年度)
摘要:本研究以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)自交9代家系为实验材料,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、最小显著差法(LSD)多重比较分析,对三疣梭子蟹连续多代自交家系的繁殖性能和生长性能进行了比较分析,评估自交对人工养殖的三疣梭子蟹的繁殖、生长、存活及与存活相关的产量等若干生长性状方面是否有影响,以及自交家系间免疫及抗氧化能力等抗病相关能力的影响。
  本研究主要内容包括:⑴通过人工定向交尾的方式建立三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)连续1~9代家系内自交全同胞家系为材料评价连续多代自交幼体发育和形态性状的影响。实验结果表明,在幼体发育方面,F1~F9各家系之间的排幼量并不呈线性关系,也无明显上升或下降的趋势,但在幼体变态率的测定中发现,在溞状幼体和大眼幼体2个阶段中总体呈现衰退趋势,尤其自交家系程度高的F9代变态率最低,F9代Z1-Z2变态率为74.87%±13.18%, Z2-Z3变态率为73.50%±14.77%,Z3-Z4变态率为59.17%±13.58%,Z4-M变态率为41.96%±18.74%;在形态学方面,在80日龄时,F1~F9家系的各个形态学指标差异不大(P>0.05),但随着生长日龄的增加,随着自交代数的增加,F3~F9代各项指标均低于F1、F2代家系,其中F9各项指标皆是最小且与其他各代差异显著(P<0.05),但在150日龄时对梭子蟹整齐度的研究中发现,F9的全甲宽变异系数为7.5444,甲宽变异系数7.6365,甲长变异系数7.5591,体高变异系数8.3282,体质量变异系数22.6644,其中甲宽、甲长、体高变异系数在所有家系中最小,整齐度最好。9代家系所有实验结果均指明自交对三疣梭子蟹的幼体变态、个体形态大小以及梭子蟹150日龄时个体的生长特性产生的影响程度不同,造成一定程度的衰退,除了F2代家系以外,随着自交系数的增加,相对于F1代,全甲宽出现-6.12%~-21.95%的衰退,甲宽出现-1.85%~-16.36%的衰退,甲长发生-10.08%~-27.66%的衰退,体高发生-9.39%~-22.7%的衰退,而体质量和排幼量的衰退系数相较于其他几个性状衰退较高,体质量的衰退系数为-13.39%~-47.99%,排幼量的衰退系数为-9.03%~-45.13%。实验结果将为三疣梭子蟹的繁育工作中提供数据支持。⑵研究了不同体质量三疣梭子蟹在进行人工侵染后的免疫相关指标以及抗氧化参数的变化。结果显示大个体梭子蟹的总血细胞数量(THC)、噬菌率、酚氧化酶原以及酚氧化酶在侵染溶藻弧菌72h之后皆比小个体的三疣梭子蟹水平高。抗氧化参数皆呈现出类似的趋势:无论血淋巴还是肝胰腺中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物岐化酶活力(SOD)以及还原型、氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)都与体质量密切相关(P<0.05)。血淋巴中的α2-巨球蛋白、抗菌和溶菌活力,以及血淋巴和肝胰腺中的谷胱甘肽过氧化物酶活力之间的差异都不明显。血细胞的酚氧化酶原和crustin基因表达水平,以及血细胞与肝胰腺中的 SOD基因表达量都呈随着体重增加而上升的水平。结果表明,相比小个体三疣梭子蟹来说,大个体梭子蟹对溶藻弧菌有更高的抵抗能力来防御弧菌的侵染。⑶研究了不同程度的自交对三疣梭子蟹家系生长过程中的免疫及抗氧化能力的影响。结果表明,自交九代之后,引起了梭子蟹总血细胞数量、噬菌活力、酚氧化酶原、酚氧化酶以及抗菌活力的的下降。相关抗氧化指标显示:血淋巴和肝胰腺的总抗氧化能力( T-AOC)、超氧化物岐化酶活力( SOD)以及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)呈下降趋势,而游离在血淋巴中的过氧化氢酶活力(CAT)呈上升趋势(P<0.05)。在九代自交家系血淋巴中的α2-巨球蛋白和溶菌活力,以及血淋巴和肝胰腺中的谷胱甘肽过氧化物酶活力都没有明显的差异。血细胞的酚氧化酶原(proPO)、crustin,与血细胞及肝胰腺中的超氧化物岐化酶的基因表达水平都呈随着自交代数的增加而明显下降。本实验结果说明,高水平的自交会严重影响三疣梭子蟹生理健康的各项指标。实验结果将为三疣梭子蟹的繁育工作中提供数据支持。
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