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[硕士论文] 周媛
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大部分昆虫可在滞育诱导期感受光周期信号的变化从而进入滞育,而昆虫在滞育诱导期对光周期信号的分子响应尚不明确。二化螟Chilo suppressalis是一种重要的水稻害虫,受短光照诱导后可以幼虫形式进入滞育,幼虫3龄期是滞育诱导敏感期。本研究以滞育诱导光周期(LD12:12h)和非滞育诱导光周期(LD16:8h)下的二化螟幼虫为材料,采用了转录组测序、qRT-PCR、基因克隆等技术探究了二化螟滞育诱导期对光周期信号的分子响应,主要结果如下:
  1、二化螟滞育诱导期响应光周期信号的敏感日龄
  光周期转换试验结果表明,25℃条件下,二化螟幼虫响应光周期信号的敏感日龄为9-12日龄(幼虫3龄时期)。
  2、二化螟滞育诱导期响应光周期信号的差异表达基因
  将25℃下,LD12:12h和LD16:8h光周期下的二化螟10日龄幼虫进行比较转录组分析,共得差异表达基因1260个,在滞育诱导条件下上调基因664个,下调基因596个。结果分析表明,差异基因富集到显著富集在Cardiac muscle contraction和Parkinson's disease通路上,同时也富集在ECM-receptor interaction、Calcium signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、Phototransduction-fly等与光信号转导相关的通路上。研究结果为进一探讨二化螟滞育诱导期光信号转导过程提供了基础。
  3、二化螟滞育诱导期光信号转导基因的克隆与表达模式
  对inaD、myosin-Ⅲb(属“Phototransduction-fly”通路),PKG(属“cGMP-PKG signaling pathway”通路)和CBP E63-1这4个光信号转导相关基因进行克隆和表达模式分析。结果表明PKG、myosin-Ⅲb可能在滞育诱导期对光周期信号进行转导;CBP E63-1、inaD可能主要在滞育诱导后期对光周期信号进行转导。结果说明这4个基因可能参与二化螟滞育诱导期响应光周期信号的调控。
  本研究明确了二化螟滞育诱导期响应光周期信号的敏感日龄,获得了二化螟滞育诱导期响应光周期信号的差异基因,分析了与光信号转导相关基因在二化螟滞育诱导期的表达模式。研究结果为明确二化螟滞育诱导期对光周期信号的响应机制奠定了基础,同时可为昆虫滞育诱导期光信号转导机制的研究提供参考。
[硕士论文] 张俊英
生物化学与分子生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:昆虫是地球上数量最多、分布最广的动物群落。昆虫的生长发育主要由保幼激素和蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮,20E)协同调控。在昆虫取食生长时期,虫体内保幼激素滴度高,而在昆虫蜕皮变态时期,保幼激素逐渐降低直至零,蜕皮激素滴度逐渐增加。两种激素存在相互作用,既拮抗又统一,协同调控昆虫的蜕皮与变态过程。研究已证明20E存在着经典的基因组信号通路,20E通过自由扩散,或在细胞膜受体介导下,跨越细胞膜进入细胞内,与核受体EcR结合起始基因的转录表达。近些年,科学研究陆续发现了20E的非基因组途径。例如胞内蛋白的快速磷酸化及移位,胞内钙离子动员等。也有研究发现G蛋白偶联受体(GPCR)参与蜕皮激素的非基因组信号途径,而不同的GPCR的作用机制各异。因此GPCR参与20E的非基因组信号通路的问题成为人们的关注热点。本实验室已证明ErGPCR1、ErGPCR2参与20E的非基因组信号通路。在果蝇中发现多巴胺受体(DmDopEcR)也可以结合20E的类似物[3H]PonA,但是多巴胺受体在20E信号通路中的作用机制尚不清楚。本论文以棉铃虫为实验材料开展了相关研究,探究DopEcR在20E信号通路中的作用及机制。
  结果发现DopEcR在棉铃虫幼虫的不同组织均有表达,包括表皮、中肠、脂肪体和脑,且在脑中的表达量最高,在蜕皮及变态期的脑和中肠中有升高的趋势。20E促进DopEcR的表达。DopEcR参与调控20E诱导的胞内钙离子水平的快速增加、基因表达及昆虫的变态过程。DopEcR定位于细胞膜,且20E诱导下不发生内吞。RNA干扰DopEcR后降低了20E与细胞膜的结合水平,过表达DopEcR后增加了20E与细胞膜的结合水平,纯化后的DopEcR能与20E发生结合,但是其结合位点突变体与20E的结合能力显著降低。我们的研究表明20E上调DopEcR的表达,DopEcR通过结合20E调控昆虫的变态发育。
  本论文以生化与分子生物学的技术方法进行研究,针对GPCR动态结合20E的特性,设计建立了新的方法,首次在鳞翅目昆虫中证明了DopEcR可以结合20E,为鉴定GPCR结合其它配体提供了借鉴。该研究阐明了DopEcR主要分布在脑,说明了组织分布不同可能是多个GPCR参与20E信号途径的机制之一。本研究首次报道类固醇激素20E可以促进神经系统的分子DopEcR表达,而DopEcR又参与20E途径调控昆虫取食及发育,说明20E与多巴胺系统存在正反馈调控关系,共同调控昆虫生长发育。该研究丰富和完善了蜕皮激素调控昆虫生长发育的理论知识,为20E的非基因组信号途径提供了新的实验证据,为害虫防治提供了新的靶标基因。
[硕士论文] 潘静
生物化学与分子生物学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:胰岛素与蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)是调控昆虫生长发育及变态的重要激素。胰岛素在生物进化过程中高度保守,广泛参与到昆虫的生长发育和细胞的生长增殖当中。胰岛素通过胰岛素信号途径起作用,在胰岛素信号途径中,3-磷酸肌醇依赖激酶-1(PDK1)起到十分重要的中介作用。在受到胰岛素刺激时,胰岛素首先会与胰岛素受体(insulin receptor,IR)结合,使胰岛素受体发生自体磷酸化,进而激活下游的胰岛素受体底物(insulin receptor structure,IRS)使其与携带SH2结构域的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)结合,催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol4,5-bisphosphate,PIP2)形成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate,PIP3)。PIP3能够招募带有PH结构域的PDK1和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)上膜,PDK1能够将AKT磷酸化进而磷酸化下游的叉头框蛋白O(forkhead box,FoxO)。磷酸化的FoxO不能够入核,失去了对靶基因的负调控功能,起到促进细胞生长,抑制细胞凋亡的作用。有研究发现抑制胰岛素信号通路能抑制昆虫的化蛹,例如在果蝇中抑制胰岛素信号途径能够抑制幼虫生长,延迟化蛹时间。在果蝇中过表达PDK1能够通过活化AKT增大细胞或器官的体积。
  昆虫化蛹时发生组织重建,中肠重建包括幼虫中肠的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)以及成虫中肠的形成过程。中肠重建发生在完全变态昆虫的变态阶段,受到蜕皮激素20E的调控。20E的主要功能是促进昆虫幼虫蜕皮和变态,包括促进幼虫组织的凋亡和成虫组织形成,从而拮抗胰岛素的功能。20E是一种类固醇激素,通过与其核受体EcR(Ecdysone recepter)结合,然后形成EcR/USP(Ultraspiracle)复合体,从而激活下游相关基因的表达。此外,20E还能够通过抑制FoxO磷酸化促进其入核与DNA结合元件(FoxO binding element,FoxOBE)结合,促进促皮层溶离蛋白酶(carboxypeptidase A,CPA)的表达进而在昆虫蜕皮时促进皮层溶离。蜕皮激素在前胸腺中产生,在组织中加工成20-羟基蜕皮激素。胰岛素能够促进全身细胞的增殖和生长,促进昆虫生长达到临界体重。前胸腺在胰岛素的刺激下也生长到一定大小从而为变态过程产生更多的20E。因此,胰岛素和20E之间存在复杂的相互调控关系,但其中的分子机理尚不完全清楚。由于PDK1是胰岛素信号通路中的关键蛋白,推测胰岛素能够通过PDK1促进前胸腺生长和20E合成,从而促进昆虫的变态发育,因此,本论文选择PDK1为靶标,研究PDK1在昆虫变态发育中的功能,研究胰岛素和20E对PDK1表达的调控,揭示20E拮抗胰岛素途径的分子机制,从而了解昆虫变态发育的激素调控机理。
  以鳞翅目昆虫棉铃虫为实验材料,发现PDK1和FoxO参与了昆虫化蛹这一过程。发现,PDK1在棉铃虫幼虫取食期转录水平上高表达。胰岛素能够促进PDK1在转录水平的表达,而20E能够抑制PDK1在转录水平的表达。在棉铃虫幼虫敲降PDK1能够延长幼虫化蛹的时间,同时使幼虫化成了小蛹。检测胰岛素途径下游基因在转录水平的表达发现,敲降PDK1导致下游蛋白激酶AKT/PKB表达量下降,但是FoxO的表达量上调。此外,敲降PDK1了阻断棉铃虫中肠重建过程,20E滴度降低。在虫体上回补20E能够恢复敲降PDK1所带来的影响,中肠重建也得以恢复。在棉铃虫表皮细胞系上过表达FoxO够促进自噬,抑制凋亡,抑制细胞增殖。
  以上研究结果表明,PDK1在幼虫的取食期高表达,能够在胰岛素的调控下通过抑制FoxO的表达促进细胞增殖和幼虫生长,促进20E水平的升高。高浓度的20E抑制PDK1的表达,从而解除对FoxO的抑制,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。其中充足的20E是起始变态和中肠凋亡的关键因子。
  通过一系列实验证明了PDK1是昆虫化蛹的关键基因,受胰岛素和20E拮抗调控。20E是引起昆虫起始变态及凋亡发生的关键因子,阐明了一种胰岛素和20E调控昆虫变态的分子机理。
[硕士论文] 骞蕾阳
细胞生物学 河北大学 2017(学位年度)
摘要:海藻糖是由两个D-吡喃葡萄糖以α1-α1糖苷键连接形成的非还原性二糖,在高温、寒冷、缺氧、干燥、脱水和营养匮乏等恶劣环境胁迫下,昆虫体内海藻糖能有效地稳定脱水酶,保护细胞膜和蛋白。本研究为海藻糖在提高昆虫抗逆性方面的研究提供理论基础。
  基于高通量转录组数据筛选,从优雅蝈螽中克隆TPS和Tre基因cDNA全长。旨在研究模拟野外温度骤变和缓慢升降温驯化对优雅蝈螽 Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶(TPS)基因表达量、血淋巴海藻糖和总糖含量的影响和三者间的相关性,以及海藻糖水解酶(Tre)基因组织特异性表达。采取模拟野外温度骤变和缓慢升降温两种温度驯化策略,以热电偶温度计测得优雅蝈螽体温与环境温度最为接近的温度值作为最适温度,实时荧光定量PCR测定优雅蝈螽TPS不同温度表达和Tre表达的组织特异性,硫酸蒽酮法测定血淋巴海藻糖和总糖含量(以25℃最适温度作为对照)。
  克隆得到一个TPS基因,一个水溶性海藻糖水解酶(Tre1)基因和一个类膜结合型海藻糖水解酶(Tre2-like)基因。TPS基因命名为GgTPS(GenBank登录号:KU578006),全长3225 bp,包含2430 bp的开放阅读框,5′-非编码区(5′-UTR)153 bp和3′-非编码区(3′-UTR)642 bp。共编码809个氨基酸,预测的蛋白分子量(Mw)91.35 ku,理论等电点(pI)6.28。两个Tre基因分别命名为GgTre1,GgTre2-like。分离到3个不同的GgTre1转录本(GenBank登录号:KY400001~KY400003),全长分别为2107,2021,1914 bp,5'-UTR33 bp,3'-UTR长度分别为322,248,129 bp。转录本1和转录本3编码区长度为1752 bp,编码583个氨基酸。蛋白分子量和等电点分别为67.88 ku和6.59。转录本2编码区长度1740 bp,编码579个氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为67.29 ku和6.34。得到3个不同的GgTre2-like转录本亚型( GenBank登录号:KY400004~KY400006),全长分别为2491,2460,2381 bp,5'-UTR284 bp,3'-UTR分别为398,367,285 bp。开放阅读框1809 bp,编码602氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为67.88 ku和6.59。
  骤然降温阶段 TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃最高,与最适温度25℃差异显著。海藻糖相对含量在0℃显著高于25℃。总糖相对含量在0℃和10℃显著高于25℃。骤然升温阶段,TPS相对表达量呈先降低后升高,再降低的变化趋势,40℃达到最高且与25℃差异显著。缓慢降温阶段 TPS相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃和20℃显著高于25℃;海藻糖含量表现出先降低后升高的变化趋势,0℃显著高于25℃,总糖含量在0℃、10℃和20℃与25℃差异显著。缓慢升温阶段TPS相对表达量呈先降低后升高的变化趋势,但与25℃无显著差异。海藻糖相对含量在40℃显著低于25℃。总糖相对含量呈先升高后降低的变化趋势,40℃和45℃显著高于25℃。不同温度驯化策略比较TPS相对表达量在15℃、40℃差异显著。海藻糖相对含量在40℃和45℃差异显著。总糖相对含量在10℃和20℃差异显著。体温在30℃差异显著。GgTre1在雌性卵巢和雄性附腺表达量最高。GgTre2-like在卵巢中高表达,在雄性肌肉和马氏管高表达。
  实验结果表明,温度驯化能够提高昆虫的抗逆能力,昆虫体内TPS表达量和海藻糖合成量与其所处环境温度及作用时间密切相关。低、高温条件下TPS的表达和海藻糖的积累模式不同。基因组DNA序列表明2个GgTre基因3'-UTR逐渐增长由可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)引起。GgTre2-like较GgTre1有相对稳定的表达趋势。两个GgTre基因表达的组织特异性不同。
[硕士论文] 齐亚蒙
植物保护 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:蚊虫是我国重要的卫生害虫,是传播疟疾、黄热病、登革热等疾病的媒介,严重威胁人类健康。杀虫剂是防治卫生害虫的主要方式,而拟除虫菊酯作用于卫生害虫而被广泛使用。由于杀虫剂的大量使用,蚊虫产生抗药性。为了明确致倦库蚊对目前常用挥发性拟除虫菊酯的抗性现状,以便制定防治卫生害虫的科学用药策略,为抗性治理提供科学依据,本文监测了广东中山、江西大余、重庆璧山致倦库蚊对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的抗性水平。采用毛细管微量点滴法测得两种酶抑制剂对四氟甲醚菊酯的增效作用;通过实时定量PCR技术,比较广东中山东凤致倦库蚊成虫和敏感致倦库蚊成虫体内10种基因的mRNA表达水平;采用三联圆筒法分别筛选出20种植物精油和2种驱蚊剂对致倦库蚊和敏感致倦库蚊的驱避效果。采用毛细管微量点滴法测定10种植物精油、驱蚊剂埃卡瑞丁和昆虫生长调节剂吡丙醚对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的增效作用。
  本研究主要内容包括:⑴采用毛细管微量点滴法测定了不同时间采集的广东中山、江西大余、重庆璧山致倦库蚊对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的抗性水平,结果表明,与敏感致倦库蚊相比,供试的致倦库蚊种群均对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯产生不同程度的抗性。其中9、11、12月份采集中山东凤致倦库蚊第一代(田间收集致倦库蚊幼虫,室内培养为成虫作为试虫,即为第一代)对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的抗性分别为6.56、3.11、1.86和9.15、3.10、2.32;中山东凤9月份采集的致倦库蚊抗性最强。9、10、11、12月份采集中山垺西致倦库蚊第一代对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的抗性倍数分别为3.33、3.98、1.82、2.97和3.96、4.63、2.30、2.38;5月份采集中山阜沙致倦库蚊第一代对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的抗性倍数分别为3.71和3.52;7月份采集江西大余致倦库蚊第一代对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的抗性倍数分别为3.62和5.71;6月份采集重庆璧山致倦库蚊第一代对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的抗性倍数分别为3.00和3.07。不同地区不同时间采集的致倦库蚊传代培养不同代数后,其抗性水平整体有下降趋势,其中东凤地区田间致卷库蚊的抗性下降比值最大。⑵采用先给酶抑制剂后给药和同时给酶抑制剂和药两种毛细管微量点滴法,比较了酶抑制剂PBO(胡椒基丁醚)和S2(八氯二丙醚)对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯的增效作用,结果表明,中山东凤致倦库蚊种群中,采用先给4μg/头酶抑制剂,后给药的方法, PBO对四氟甲醚菊酯增效作用最显著,增效比7.27。对氯氟醚菊酯增效比为2.50。采用酶抑制剂与拟除虫菊酯按1∶1质量比混配同时给药法得出,PBO对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯增效比分别为1.34和1.76;而无论采用先给酶抑制剂后给药还同时给酶抑制剂和药方法,S2对四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯增效作用均不明显;表明采用先给酶抑制剂后给药法,酶抑制剂对拟除虫菊酯的增效作用优于同时给酶抑制剂和药的方法。⑶采用实时定量PCR技术,测定了10个代谢基因在东凤致倦库蚊种群和敏感致倦库蚊种群中mRNA的表达水平,结果表明,细胞色素氧化亚基Ⅰ、胰凝乳蛋白酶、细胞色素b、磷酸化酶、谷胱甘肽S-转移酶、固醇载体蛋白2、Hzc4靡蛋白酶、幼虫血清蛋白1β链8种代谢基因表达量明显高于敏感致倦库蚊种群,其表达量分别为敏感致倦库蚊种群的2.0、1.8、2.5、2.5、2.0、8.0、3.3、1.8倍,脂肪酶3和线粒体核糖体大亚基这2个基因表达量低于敏感致倦库蚊种群,其表达量分别为敏感致倦库蚊种群的0.8和0.6。⑷采用三联圆筒法两种不同浓度筛选20种植物精油和2种驱蚊剂对致倦库蚊的驱避活性,结果表明,同一种精油对不同蚊子产生的驱避效果不同,对于田间致倦库蚊种群,在2.2μg/cm3剂量下,90 min时,驱避率达到90%以上的是薄荷脑、丁香罗勒油、桂醛、绿花白千层、香茅醇、α–甲位蒎烯、猫薄荷、樟醇(特)和白千层油,驱避率分别为100%、93.7%、96.5%、100%、98.8%、98.6%、92.4%、98.7%、90.6%;120 min时,驱避率达到90%以上的是薄荷脑、丁香罗勒油、桂醛、绿花白千层和香茅醇,驱避率分别为100%、93.2%、93.9%、96.1%、94.6%。对于田间库蚊种群,在0.22μg/cm3剂量下,90 min时,驱避率达到90%以上的是绿花白千层、薄荷脑、薄荷油和猫薄荷,驱避率分别为96.7%、95.3%、90.9%、94.7%。120 min时,驱避率达到90%以上的是绿花白千层、薄荷脑、薄荷油,驱避率分别为95.5%、92.6%、91.1%。对于敏感致倦库蚊种群,在0.22μg/cm3剂量下,90 min时,驱避率达到90%以上的精油是猫薄荷和薄荷脑两种,驱避率为98.3%和97.3%。120min时,驱避率达到90%以上的精油是猫薄荷和薄荷脑两种,驱避率为93.5%和91.2%。⑸采用毛细管微量点滴法测得10种植物精油、驱蚊剂埃卡瑞丁和昆虫生长调节剂吡丙醚与四氟甲醚菊酯按1∶1质量比混配对四氟甲醚菊酯的增效作用结果。结果表明,中山东凤致倦库蚊种群中,薄荷脑、桂油醛、丁香罗勒油、α-蒎烯、椒样薄荷油和昆虫生长调节剂吡丙醚对四氟甲醚菊酯增效比为4.63、2.81、14.68、1.31、1.93和1.16,具有一定的增效作用,其余精油均不表现增效作用。中山阜沙致倦库蚊种群中,薄荷脑对四氟甲醚菊酯的增效比为2.18,具有一定的增效作用。
[博士论文] 卢文才
农药学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:二斑叶螨(Tetranychus urticae)和朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)同属于蛛形纲、叶螨科、叶螨属,都是重要的农业害螨,但二者的分类地位长期存在争议。在中国,一般认为朱砂叶螨为国内本地种,二斑叶螨为外来入侵种。二斑叶螨在中国相对于朱砂叶螨竞争性扩张是一例典型的生物入侵事件,但有关其持续扩张并逐渐替代本地种朱砂叶螨的原因,迄今缺乏系统的研究和报道。现有的关于二斑叶螨和朱砂叶螨的零星比较研究中,比较一致的结果是相对于朱砂叶螨,二斑叶螨更耐药。据此,我们提出一个科学假设,即二斑叶螨更强的药剂胁迫适应能力是其持续扩张并逐渐成为叶螨优势种群的重要原因。因此,本文以二斑叶螨和朱砂叶螨为比较研究对象,以验证上述科学设想为研究目的,拟从毒理学的独特视角研究并阐明二斑叶螨在中国持续扩张的机制。本研究主要内容包括:
  ⑴通过检索与整理国内(1975-2014年)有关朱砂叶螨和(或)二斑叶螨的研究文献(CNKI及SCI引文数据库),追溯每篇文献中叶螨的采集地绘制不同历史时期的地理分布图。发现以1983年为起点至上世纪末,二斑叶螨的分布由北京市扩大至长江以北9省市,朱砂叶螨在全国17省市有分布;进入本世纪后,二斑叶螨已越过长江,其分布由9省市继续扩大至18省市,朱砂叶螨的分布范围则缩至12省市。通过文献检索间接重现二斑叶螨扩张趋势,结果表明入侵中国后,二斑叶螨相对于朱砂叶螨存在明显的竞争性扩张现象。
  ⑵野外混合种群采集于云南省昆明市郊的玫瑰上,首先根据体色将叶螨初步区分为朱砂叶螨(红色)和二斑叶螨(绿色);再采用文献报道的足Ⅰ胫节刚毛数量统计法结合杂交试验鉴定两种叶螨。研究结果表明:二斑叶螨种群所有个体足Ⅰ胫节刚毛数量为10根,朱砂叶螨野外种群和室内品系足Ⅰ胫节刚毛数量为10根的个体比例分别为70%和66.7%,与报道的朱砂叶螨和二斑叶螨种群足Ⅰ胫节刚毛数量差异相吻合。杂交试验结果表明野外红色叶螨与室内朱砂叶螨,野外绿色叶螨与室内二斑叶螨能正常繁殖后代,而体色不同的两种叶螨间存在生殖隔离。
  ⑶组建16、26和33℃叶螨实验种群生命表,比较朱砂叶螨和二斑叶螨生物学特性和种群参数:在低温16℃,二斑叶螨相对朱砂叶螨生长发育较快且相对适合度较大(Rf为1.44),存在适合度优势;在26℃,两种叶螨发育历期和相对适合度无明显差异;33℃时,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨的相对适合度为0.55,表明二斑叶螨在高温下存在适合度劣势。
  ⑷生物测定结果表明来源相同背景的二斑叶螨相对朱砂叶螨,对阿维菌素、甲氰菊酯、炔螨特、哒螨灵、溴虫腈、吡螨胺、丁氟螨酯、联苯肼酯和乙螨唑等9种常用杀螨剂更加耐药,其中二者对阿维菌素的耐药力差异高达8.5倍。室内外模拟药剂胁迫对两种叶螨混合种群结构变化的影响:混合种群(两种叶螨个体初始比例为1:1)在室内豇豆上饲养2个月后,对照(不接触药剂)处理中朱砂叶螨数量显著多于二斑叶螨(P<0.05)(前者与后者个体数量的比例为1:0.46),而在阿维菌素和丁氟螨酯的胁迫处理中,二斑叶螨逆转为混合种群的优势种群(比例分别逆转为1:4.44和1:1.85);混合种群在田间分别在豇豆和茄子上生长一个种植季节后,对照组中的朱砂叶螨数量显著多于二斑叶螨(P<0.05),在豇豆和茄子上朱砂叶螨与二斑叶螨的比例分别为1.53:1和1.83:1,而处理组(阿维菌素防治2次)中两种叶螨数量没有显著差异。室内、外实验都表明杀螨剂的使用能显著影响混合种群中两种叶螨的比例结构,主要是表现为药剂能相对多地压制朱砂叶螨而间接促进二斑叶螨逐渐占优。分别选用丁氟螨酯和甲氰菊酯对朱砂叶螨和二斑叶螨进行室内抗性筛选,25代后,朱砂叶螨和二斑叶螨对丁氟螨酯的抗性倍数分别发展到了13.52和29.35倍,对甲氰菊酯的抗性倍数分别发展到了28.04和39.57倍。
  ⑸酶活性检测发现二斑叶螨的P450s和CarEs活性均显著高于朱砂叶螨(P<0.05),分别为朱砂叶螨的1.81和2.80倍,二者的GSTs活性没有显著差异。分别以LC30剂量的阿维菌素、甲氰菊酯、吡螨胺诱导处理朱砂叶螨和二斑叶螨6h,三种解毒酶活性(P450s、GSTs和CarEs)均呈现不同程度的变化:阿维菌素处理后,二斑叶螨的P450s和CarEs活性分别为诱导前的1.54和1.23倍,朱砂叶螨的P450s和CarEs活性分别为诱导前的1.14和0.96倍,且二斑叶螨酶活性升高倍数显著大于朱砂叶螨(P<0.05),两种叶螨 GSTs活性变化倍数无显著差异;甲氰菊酯处理后,二斑叶螨的P450s和GSTs活性分别为诱导前的1.32和2.55倍,朱砂叶螨的分别为诱导前的1.07和1.98倍,二斑叶螨的酶活性变化倍数显著大于朱砂叶螨(P<0.05),两种叶螨的CarEs活性变化无显著差异;吡螨胺处理后,二斑叶螨的P450s活性提高幅度显著大于朱砂叶螨(P<0.05)(变化倍数分别为1.17和1.04倍),而朱砂叶螨GSTs活性变化倍数大于二斑叶螨(P<0.05)(变化倍数分别为2.32和1.61倍),两种叶螨CarEs活性变化幅度无显著差异。总体上,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨解毒酶对药剂胁迫的响应变化更大。使用甲氰菊酯分别对朱砂叶螨和二斑叶螨筛选20代后,朱砂叶螨的GSTs活性显著升高2.41倍,P450s和CarEs活性无显著性变化;二斑叶螨的P450s和GSTs活性分别显著升高1.48和3.19倍。使用丁氟螨酯筛选20代后,朱砂叶螨的P450s和GSTs活性分别显著升高1.72和2.21倍;二斑叶螨的P450s、GSTs和CarEs升高幅度分别为1.92、5.40和2.15倍。抗性种群解毒酶活性测定结果表明,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨中的解毒酶对药剂选择的反应更积极。
  ⑹数字基因表达谱(DGE)测序结果表明,相对于朱砂叶螨,二斑叶螨有974条差异表达基因(DEGs)(538条基因表达上调,436条基因表达下调),其中58条注释为解毒代谢相关基因(39条基因上调表达,20条基因下调表达)。分别选用LC30剂量的阿维菌素、甲氰菊酯、吡螨胺胁迫处理朱砂叶螨和二斑叶螨,并进行表达谱测序,结果表明:阿维菌素处理后,朱砂叶螨有168条 DEGs(35条基因上调表达,133条基因下调表达),二斑叶螨有268条DEGs(89条基因上调表达,179条基因下调表达);甲氰菊酯处理后,朱砂叶螨有65条 DEGs(32条基因上调表达,33条基因下调表达),二斑叶螨有168条DEGs(74条基因上调表达,104条基因下调表达);吡螨胺处理后,朱砂叶螨有71条 DEGs(21条基因上调表达,50条基因下调表达),二斑叶螨有179条DEGs(59条基因上调表达,120条基因下调表达)。对DEGs进行功能注释,发现二斑叶螨受杀螨剂胁迫后上调表达的解毒代谢相关基因的数量明显多于朱砂叶螨。从表达谱测序、比较可以看出,二斑叶螨相对朱砂叶螨耐药性/抗药性更强的分子基础是二斑叶螨本身拥有更多上调表达的基因,更为重要的是,遭受药剂胁迫时二斑叶螨参与响应的基因也显著多于朱砂叶螨。
[硕士论文] 孙新新
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:白蚁能够高效降解木质纤维素,其降解木质纤维素的速率超过了木腐真菌和其他的食草动物。白蚁肠道中存在多种共生微生物,根据白蚁后肠有无鞭毛虫,将白蚁分为低等白蚁(有鞭毛虫)和高等白蚁(无鞭毛虫)两大类。高等白蚁根据食性分为食木/草白蚁、食土/腐殖质白蚁和培菌白蚁。
  培菌白蚁属于大白蚁亚科,其在菌巢中培养真菌鸡枞菌。在干旱的热带地区培菌白蚁可以降解90%以上的木质材料,所以培菌白蚁在碳循环中具有重要的作用。培菌白蚁和许多的微生物共同进化,不仅包括具有木质纤维素降解能力的鸡枞菌,还包括肠道共生微生物以及菌巢中的细菌。白蚁-真菌-共生微生物系统将木质纤维素彻底降解。为了探究白蚁肠道微生物如何帮助白蚁消化食物,本研究以培菌白蚁—黄翅大白蚁为研究材料,对其肠道微生物进行研究。
  首先,采用高通量测序的方法,比较分析了黄翅大白蚁前肠、中肠和后肠共生微生物(细菌、真菌和古菌)的多样性。分析结果发现,白蚁前肠和中肠的优势细菌菌门为Proteobacteria(变形菌门),后肠的优势细菌菌门为Bacteroidetes(拟杆菌菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)和Proteobacteria(变形菌门);白蚁肠道的优势真菌菌门为Ascomycota(子囊菌门);白蚁肠道的古菌85%为未知古菌,鉴定到的古菌大多数与甲烷的产生有关。Alpha多样数指数表明,后肠细菌多样性高于中肠和前肠;中肠真菌多样性高于后肠和前肠;前肠古菌多样性高于中肠和后肠。黄翅大白蚁不同肠道区域的肠微生物菌群结构存在明显的差异。
  然后,利用传统的分离纯化方法,以几丁质为唯一碳源的培养基分离培养能够降解几丁质的后肠微生物。根据胶体几丁质水解圈的大小筛选可以降解几丁质的微生物。然后通过形态学、生理生化以及16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定。从黄翅大白蚁后肠中筛选到8株能够降解胶体几丁质的细菌,它们分别属于Flavobacterium(黄杆菌属)、Dactylosporangium(指孢囊菌属)、Brevibacillus(短芽孢杆菌属)、Sphingomonas(鞘氨醇单胞菌属)、Paenibacillus(类芽孢杆菌属)、Cellulomonas(纤维单胞菌属)、Stenotrophomonas(寡养单胞菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)。纯化的8株菌,均具有几丁质、EG和BG酶活。这一研究为了解白蚁肠道微生物协助白蚁消化食物机制提供了依据。
  最后,将第二部分得到的新菌Cellulomonas macrotermitis进行分类鉴定。
  本文以培菌白蚁黄翅大白蚁为研究材料,比较分析了黄翅大白蚁前肠、中肠和后肠微生物菌群结构的差异;从后肠中分离培养了8株能够降解几丁质的细菌,为肠道微生物协助白蚁降解食物提供了依据;对新菌Cellulomonasmacrotermitis进行了鉴定。通过上述研究表明,黄翅大白蚁肠道中存在许多的共生微生物,这些微生物在参与白蚁的碳代谢、氮代谢以及抵御病原体的侵染方面均具有潜在的作用,但具体作用还需进一步研究。
[硕士论文] 韩晓林
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景及意义:
  昆虫发育是一个受到激素调控高度协调的过程,激素调节特定蛋白质的表达,表达后的蛋白质行使功能,完成昆虫的发育。昆虫发育分为完全变态发育昆虫和不完全变态发育昆虫。不完全变态昆虫的幼虫和成虫有一定的差异,而完全变态昆虫幼虫和成虫的形态差异十分巨大。完全变态昆虫的生活史包括卵、幼虫、蛹和成虫,在幼虫向成虫的转变过程中,涉及到组织重建。通过程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD),将幼虫的组织降解掉,同时特定的细胞分化增殖来形成成虫的组织。组织重建过程中,幼虫中肠的重建十分重要,在幼虫中肠PCD过程当中,多种蛋白酶参与到这一过程当中,目前研究发现的蛋白酶包括组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、及组织蛋白酶F以及组织蛋白酶D,这些组织蛋白酶在昆虫的发育中起着非常重要的作用。组织蛋白酶的活性位点不同,依据活性位点,组织蛋白酶分为精氨酸组织蛋白酶(D,E)、半胱氨酸组织蛋白酶(B,C,H,F,K,L,O,S,V,W)、以及丝氨酸组织蛋白酶(A,G)。其中,组织蛋白酶B、D、L等在鳞翅目昆虫的发育中有着重要的作用,参与到虫体的组织重建以及免疫过程当中。
  存在的科学问题:
  虽然有研究表明在虫体中肠组织重建的过程中,CathD的mRNA表达会升高,但是CathD作为一种蛋白酶,有着酶原形式和活性形式,它们的表达有着什么变化?它在组织重建过程中的中肠的定位情况如何?它对于棉铃虫的中肠重建中起着什么功能?
  研究结果:
  1.CathD具有组织特异性分布,表达在虫体的表皮和中肠。
  2.CathD表达有时空差异,表皮中只在蛹期有表达,中肠中在变态蜕皮期和蛹期有表达。
  3.CathD在虫体中肠重建过程中定位于虫体的旧中肠中。
  4.干扰之后虫体虫体化蛹延迟,幼虫中肠的PCD受到抑制。
  结论及意义:
  在虫体中肠重建过程中,CathD主要以活性形式存在,定位于幼虫中肠当中,有着促进幼虫中肠PCD的作用;在蛹期成虫的表皮形成过程中,CathD以酶原形式存在,它的定位以及作用还需实验验证。
  我们首次使用免疫印迹的方法对CathD在虫体发育中的表达情况作了检测,发现酶原形式出现在表皮组织当中而活性形式出现在中肠当中。活性的CathD定位于幼虫中肠中,有着促进幼虫中肠PCD的作用。
[硕士论文] 康玮楠
动物学 中南林业科技大学 2017(学位年度)
摘要:打斗行为在动物界广泛存在,个体之间常常为食物、领地、异性等资源发生打斗。长颚斗蟋雄成虫具极为发达的打斗武器,在争夺领地或配偶时会发生打斗,且打斗获胜雄成虫获得更高的资源占有优势。本文以长颚斗蟋(Velarifictorusaspersus Walker)为材料,检测了不同经历(飞行、获胜、失败)和雌虫资源对雄成虫打斗行为的影响,探讨了章鱼胺受体激活剂—杀虫脒(chlordimeform,CDM)对其打斗及打斗获胜后呜叫行为的调控,观察了雌成虫的打斗行为及不同资源(洞穴和雄成虫)对其打斗行为的影响。
  获得以下主要结果:
  1不同经历对长颚斗蟋雄成虫打斗行为的影响
  飞行经历和获胜经历可以明显提高长颚斗蟋雄成虫的斗性,但打斗等级均未达到最高等级,而失败经历则显著抑制其斗性;在有雌虫资源存在的情况下,雄成虫斗性显著提高,出现激烈的身体搏斗行为,其打斗等级显著高于具飞行和获胜经历的雄成虫,显示长颚斗蟋雄成虫的打斗行为具明显的可塑性。
  2章鱼胺特异性受体激活剂—CDM对长颚斗蟋雄成虫打斗行为的影响
  浓度梯度的实验结果显示,以0.15 mol/L的CDM丙酮溶液处理长颚斗蟋雄成虫,其打斗等级和打斗时长的提升效果最为明显。CDM能显著提升失败者的斗性,而对胜利者的斗性无显著影响;CDM处理,可以显著抑制飞行经历及雌虫资源对斗性的提升效果。说明章鱼胺仅是调控长颚斗蟋雄成虫打斗行为的生物胺之一,要达成打斗的最高等级,还有其他的通路的参与。
  3章鱼胺特异性受体激活剂—CDM对长颚斗蟋雄成虫呜叫行为的影响
  飞行、获胜经历和雌虫资源能够显著降低打斗后获胜者胜利声呜叫次数。经CDM处理,不同社会经历雄成虫打斗后呜叫行为均受一定程度的抑制,其中,具飞行经历的抑制效果最为显著。说明章鱼胺系统的激活可抑制长颚斗蟋雄成虫的呜叫行为。
  4洞穴资源对长颚斗蟋雌成虫打斗行为的影响
  长颚斗蟋雌虫之间一般不发生打斗行为,但是有洞穴资源存在的情况下,为占据洞穴,其斗性显著提升。无论是长翅型组合还是短翅型组合,占穴者的胜率超过70%,均高于进攻者,且长翅型防守者胜率显著高于短翅型防守者。说明洞穴被长颚斗蟋雌虫视为重要的资源,不同翅型的长颚斗蟋雌虫存在打斗策略差异。
[硕士论文] 傅慧静
林学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)是松树的重大害虫,除能直接钻蛀危害造成松树衰弱甚至死亡外,还是松材线虫病的主要传播媒介。木质纤维素是木食性昆虫的主要营养来源,包含细菌在内的肠道微生物在帮助昆虫降解吸收木质纤维素中有着重要作用。本研究利用形态学、生理学和分子生物学测定等方法,研究了松墨天牛幼虫、蛹和成虫3个发育阶段肠道细菌的多样性,筛选出具有木质素降解功能的肠道细菌,探讨了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的木质素降解功能,以期为深入理解松墨天牛的营养利用特性及其与寄主的协同关系提供基础。
  本研究主要内容包括:⑴利用Illumina MiSeq技术对松墨天牛肠道细菌16S rDNA-V4变异区序列进行扩增、测序,发现肠道细菌群落共有24个菌属,幼虫、蛹和成虫肠道分别有13、10和17个菌属,分别隶属于拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、脱铁杆菌门、疣微菌门、蓝藻门和浮霉菌门。松墨天牛肠道优势细菌种类及其相对丰度在不同发育阶段具有差异,幼虫、蛹和成虫的优势菌属(丰度)分别是伊丽莎白菌属(61.12%)、金黄杆菌属(61.38%)和沙雷氏菌属(43.92%)。颤杆菌属、Ruminiclostridium和螺杆菌属为幼虫特有菌属,土地杆菌属、根瘤菌属、贪噬菌属和鞘氨醇盒菌属为蛹特有菌属,土壤杆菌属、肠球菌属、Nubsella、Blautia和短波单胞菌属为成虫特有菌属。Serratia在幼虫(12.6%)、蛹(0.85%)与成虫(43.92%)3个发育阶段均有分布。松墨天牛成虫细菌群落多样性最高,然后依次是幼虫和蛹。⑵以滤纸为唯一碳源进行液体培养,经分离、纯化和分子鉴定,从松墨天牛3个不同发育阶段的肠道中筛选出20株具有木质素降解功能的细菌,隶属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门的15个菌属,包括沙雷氏菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、丛毛单胞菌属、克雷伯氏菌属、节杆菌属、金黄杆菌属、根瘤菌属、肠杆菌属、寡养单胞菌属、苍白杆菌属、土壤球菌属、链霉菌属、无色杆菌属和泛菌属。进一步利用羧甲基纤维素钠(CMC)刚果红染色法和滤纸降解实验复筛,发现1株可高效降解木质素优势细菌—粘质沙雷氏菌。⑶以粘质沙雷氏菌为对象,通过硫酸盐木质素培养基液体培养并测定该菌株的木质素降解性能,发现在第4天其降解率达到峰值(15.16%),该菌能同时产生木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)3种胞外木质素降解酶。以其中的优势木质素降解酶—LiP木质素过氧化物酶为研究对象,采用控制变量的单因素试验法,探究体外不同培养条件对源于松墨天牛肠道粘质沙雷氏菌产木质素过氧化物酶活性的影响。结果表明:木质素浓度、pH值、氮源种类、氮源浓度和金属离子及其浓度均对其产酶以及酶活性有显著影响。木质素浓度为3 g·L-1时酶活性最强,pH值为5时最适于产酶,有机氮源更有利于产酶,且酵母膏为最佳氮源,其最适浓度为5 g·L-1;最佳Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+离子浓度分别为0.20 g·L-1,0.40 g·L-1,0.15 g·L-1,0.04 g·L-1,0 g·L-1。
[硕士论文] 陈伟军
生物学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:代谢组学是系统生物学的重要组成部分,是对某一生物体组织或细胞在某一特定生理时期或条件下所有代谢产物进行定性和定量分析,以寻找出差异目标代谢物的一种组学研究手段。目前代谢组学研究主要集中在疾病诊断、药物筛选或病理等医学领域,在昆虫对杀虫剂的解毒代谢方面的研究则相对较少。小菜蛾是重要的农业害虫,抗性发展快,已有对小菜蛾抗药性的研究主要集中在解毒酶基因上调、靶标敏感性降低或环境适应等方面,而利用代谢组方法研究代谢改变或信号通路等方面的研究尚未见报道。本文利用代谢组学分析手段,比较氟虫腈抗性品系与敏感品系小菜蛾的代谢组差异,从中挖掘差异代谢物并映射到其对应的代谢通路,在 KEGG通路中找到与差异代谢物直接相关的关键酶或蛋白,并结合转录组数据验证其在两品系中的差异表达情况,最后利用RNAi验证该基因对小菜蛾药剂敏感性的影响。
  本研究主要内容包括:⑴通过核磁共振、液质联用仪和气质联用仪的检测,我们在两个品系共14组小菜蛾样品中检测到了82种差异代谢物。其中氟虫腈抗性品系中有37种代谢物浓度增加,而其余45种代谢物的浓度有所下降。统计学分析表明敏感品系与氟虫腈抗性品系的代谢物轮廓有明显区别,而造成代谢物差异的主要代谢物则包括多个脂肪酸和氨基酸等,涉及谷氨酸代谢、脂肪酸代谢等多条通路。这一结果帮助我们从氨基酸代谢、能量代谢、脂肪酸代谢等方面解释了代谢物变化对小菜蛾的生理意义及潜在解毒机制。⑵在敏感与氟虫腈抗性品系中筛选了6条差异通路,通过代谢联络图与KEGG图,我们找到了差异代谢物的代谢网络,在 KEGG通路中定位与差异代谢物直接相关的关键酶。结合转录组数据发现,谷氨酸代谢中的两个关键酶在氟虫腈抗性品系内大幅上调表达,分别是 L-谷氨酸合成酶和谷氨酸脱羧酶,暗示着它们可能与小菜蛾对氟虫腈的解毒代谢有密切联系。⑶RNAi分析谷氨酸脱羧酶(PxGAD)在小菜蛾中的作用利用现有小菜蛾基因组数据库中的谷氨酸脱羧酶基因(Px004382)序列设计引物、克隆和测序,序列分析表明PxGAD具有天冬氨酸转氨酶保守域。利用实时荧光定量PCR检测PxGAD的表达模式,发现其在1龄幼虫和脂肪体中显著高表达。按照测序结果设计引物合成dsRNA,显微注射氟虫腈抗性小菜蛾,经实时荧光定量 PCR测定发现小菜蛾幼虫在注射12与24 h后mRNA表达量均有显著下降,说明干扰效果显著。注射dsPxGAD的小菜蛾幼虫,点滴LD20的氟虫腈药剂,结果死亡率显著高于对照组,说明PxGAD可能参与了小菜蛾对氟虫腈的解毒过程。
[硕士论文] 杨一帆
生物学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:小菜蛾Plutella xylostella(L.)(鳞翅目菜蛾科Lepidoptera, Plutellidae)是危害十字花科蔬菜的世界性害虫,生殖能力强是其成为全球分布最广的鳞翅目害虫的重要因素之一。保幼激素(juvenile hormone, JH)是参与昆虫生殖调控的重要物质,在昆虫卵子发生中起着至关重要的作用,但对其分子机制的了解仍然有限,尤其是在非模式昆虫中。保幼激素受体(methoprene-tolerant, Met)作为JH的关键受体之一,对JH发挥功能效应起着重要调节作用,但具有明显的物种特异性。
  本研究围绕生殖调控决定昆虫生殖潜能这一科学问题,以激素调控生殖为核心,采用生物化学与分子生物学、解剖形态学与实验生物学等方法,从JH的作用受体方面开展研究,重点研究:小菜蛾Met基因的分子结构特征与进化关系,小菜蛾Met基因在不同龄期与不同组织的表达模式,以及Met基因在小菜蛾生殖调控中的作用。PxMet-1与PxMet-2开放阅读框(ORF)全长分别为1575和2100 bp,预计编码524和699个氨基酸,理论分子质量为60.5和70.7 kDa,预测等电点为6.73和5.50。PxMet-1和PxMet-2都具有4个保守结构域,分别是Helix-Loop-Helix结构域(bHLH)以及两个PAS保守结构域及一个PAC保守基序。氨基酸序列同源比对分析结构显示,PxMet-1与PxMet-2与鳞翅目昆虫中的家蚕、棉铃虫、冬尺蠖蛾的相似性均大于50%。进化树分析结果显示,小菜蛾PxMet-1,PxMet-2聚为不同的两支,说明PxMet-1,PxMet-2可能具有不同的生物学功能以及进化模式,但两者均与鳞翅目昆虫聚在一起,且分别与家蚕的PxMet-1与 PxMet-2聚在一起,说明PxMet-1与PxMet-2与鳞翅目昆虫Mets可能发挥相同作。PxMet-1与PxMet-2在蛹期(1-3 d)与雌成虫期(0-72 h)均有表达,PxMet-1在蛹期的表达量无明显差异,但均显著高于雌成虫期(0-48 h);而PxMet-2在雌成虫期(0-48 h)的表达量呈先上升后下降的趋势,在羽化后12 h出现表达高峰,且成虫期(0-36 h)的表达量显著高于蛹期;PxMet-1与PxMet-2均在雌虫羽化后72 h出现一个明显的表达升高,推测可能与小菜蛾生殖与寿命维持的能量权衡相关。PxMet-1与PxMet-2在脂肪体的表达量显著高于其他组织(头、肠道、卵巢、残渣)。利用RNAi技术同时干扰PxMet-1和PxMet-2,结果显示,在注射Met-1+Met-2 dsRNA24 h后,PxMet-1和PxMet-2的表达量均受到显著抑制,但48 h与72 h时,干扰效应明显减弱,处理组与对照组表达量无显著差异。干扰PxMet-1和PxMet-2后,小菜蛾卵巢发育受到明显抑制,卵黄沉积减缓,成熟卵子数目减少,产卵量也随之下降。
[硕士论文] 陈晨
生物学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:目前针对半翅目褐飞虱等刺吸性口器害虫具有明显毒性的Bt Cry毒素鲜有报道。已知的作用模型显示Cry毒素在靶标昆虫消化道内的作用机制包括晶体蛋白的溶解、原毒素的活化、毒素与中肠受体蛋白的结合及中肠上皮细胞膜穿孔的生成等步骤。在上述过程中Cry原毒素蛋白在靶标昆虫消化道内的活化及活化后的毒素片段与中肠受体蛋白的正确结合是引发Cry杀虫作用的最关键步骤。
  本研究选取对鳞翅目、鞘翅目及双翅目蚊子有效的 Cry1Ac、Cry3Aa和 Cry4Ba毒素蛋白,并对 Cry1Ac进行改造,得到了删除Helixα1的突变株Cry1Ac-α,利用膜饲喂法分别测定了上述Cry蛋白及突变株对褐飞虱若虫的毒力。结果显示所有供试Cry毒素均无法对褐飞虱产生较好的毒性作用。其中,Cry1Ac对褐飞虱的毒力作用相对较好,Cry1Ac原毒素的LC50为198.92μg/mL,Cry1Ac活化毒素的LC50为450.18μg/mL,改造后的Cry1Ac-α毒素的LC50为166.92μg/mL,毒性作用较原毒素有小幅提高,但只有 Cry1Ac对鳞翅目原始靶标的近1/200;而 Cry3Aa毒素对褐飞虱则显示出极其微弱的毒性作用,其原毒素及活化毒素对褐飞虱的 LC50分别达到了1810.50μg/mL和2895.55μg/mL;此外Cry4Ba对褐飞虱的毒性作用也不明显,其原毒素和活化毒素对褐飞虱的LC50分别为760.83μg/mL及523.16μg/mL。因此,从生测结果来看,褐飞虱对上述Cry毒素均不敏感。从Cry毒素发挥杀虫作用的两个关键环节(毒素的水解活化及其与昆虫中BBMV的结合)对褐飞虱若虫的不敏感性机制进行了分析。首先,分别对3种Cry毒素在褐飞虱中肠酶作用下的水解及稳定性进行了研究。结果显示Cry1Ac原毒素能够顺利地被褐飞虱肠道酶液水解成为稳定的~65 kDa片段,且与半胱氨酸蛋白酶的激活与否无关,但活化片段略大于胰蛋白酶水解产生的~60 kDa的 Cry1Ac毒性片段;从Cry3Aa的情况来看,无论有没有激活半胱氨酸蛋白酶,肠腔酶液对Cry3Aa都没有水解作用,不能将Cry3Aa正确水解至~55 kDa的活性片段,而肠膜酶液对其也只具有很有限的水解作用;而激活了半胱氨酸蛋白酶活性的肠腔酶液则能够对 Cry4Ba原毒素进行水解,并达到胰蛋白酶水解的活性片段大小,但在16 h时水解也并不完全。其次,分析了预活化的3种Cry毒素与褐飞虱中肠的结合特异性。结果显示经胰蛋白酶活化后的Cry1Ac、Cry3Aa、Cry4Ba毒素均能够与褐飞虱及其原始靶标昆虫中肠 BBMV在不同的程度上特异性结合。其中, Cry4Ba与褐飞虱中肠BBMV的结合能够被N-乙酰葡萄糖胺竞争,而Cry1Ac毒素与褐飞虱中肠 BBMV的结合并未被 N-乙酰半乳糖胺所竞争。Cry3Aa毒素与黄粉虫及褐飞虱中肠BBMV的结合则并未被上述两种糖所竞争,即Cry1Ac及Cry3Aa虽然能够与褐飞虱中肠BBMV产生特异性结合,但其结合的位点并非常规Cry作用机制中的糖蛋白。研究证实了3种典型Cry毒素对非Bt靶标昆虫褐飞虱没有明显毒性作用,分析了造成褐飞虱对Cry毒素不敏感的潜在因素。研究结果揭示了Cry毒素在褐飞虱等半翅目刺吸式口器昆虫消化道内的作用情况,初步解释造成3种Cry毒素对褐飞虱无法产生毒性作用的原因。不但为通过分子技术改造Cry毒素、开发对褐飞虱等非 Bt靶标昆虫具有明显毒性的新型毒素提供依据,也为进一步拓展Bt Cry毒素的杀虫谱,扩大Cry毒素应用范围研究奠定基础。
[硕士论文] 李强
生物学 福建农林大学 2017(学位年度)
摘要:稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée)(Rice leaf folder, RLF)是一种世界范围内危害水稻、大麦、小麦、甘蔗等作物的重要害虫。肠道微生物在宿主的食物消化、生长发育、免疫以及代谢方面起着重要的作用,近年来新一代测序技术大大推动了肠道微生物的研究。为分析稻纵卷叶螟肠道微生物对宿主的功能,本文综合运用传统微生物培养技术、变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)、16S rRNA基因测序技术以及宏基因组测序技术对稻纵卷叶螟肠道细菌多样性及其功能进行了分析,
  本研究主要内容包括:⑴采用传统微生物培养方法,共分离得到10种不同的细菌,其中变形菌门 Proteobacteria和厚壁菌门 Firmicutes所占比例分别为70%和30%,表明变形菌门为稻纵卷叶螟肠道可培养细菌中的优势菌群。采用 DGGE方法,分离得到的变形菌门所占比例为77%,厚壁菌门所占比例为23%,在门的水平上肠道微生物的组成与传统微生物培养方法一致。利用16S rRNA基因测序技术分析稻纵卷叶螟肠道细菌组成,结果表明,稻纵卷叶螟肠道细菌主要由变形菌门(55.2%)和拟杆菌门Bacteroidetes(6.2%)组成,其中变形菌门主要由假单胞菌目Pseudomonadales(16.9%)、黄色单胞菌目Xanthomonadales(8.3%)、立克次氏体目Rickettsiales(4.9%)和肠杆菌目Enterobacteriales(4.6%)组成;拟杆菌门主要是由鞘脂杆菌目Sphingobacteriales(4.3%)和拟杆菌目Bacteroidales(1.1%)组成。利用宏基因组测序技术分析稻纵卷叶螟肠道细菌多样性,结果表明稻纵卷叶螟肠道细菌丰度最高的是变形菌门(89%),其次是厚壁菌门(8%)。其中变形菌门主要是由肠杆菌目(65%)、立克次氏体目(23%)和假单胞菌目(4%)组成;厚壁菌门主要是由芽孢杆菌目 Bacillales(5%)组成。综合上述四种方法发现,稻纵卷叶螟肠道细菌的多样性在门的分类水平上是一致的,但是在(纲、目、科、属)分类水平上,利用16S rRNA基因测序技术和宏基因组测序技术的分析结果存在一些差别。⑵利用16SrRNA基因测序技术分析不同品系水稻(明恢82、明恢2155、甬优15)对稻纵卷叶螟肠道细菌多样性的影响。结果表明,取食三个品系水稻的稻纵卷叶螟肠道细菌主要由黄色单胞菌目、假单胞菌目、立克次氏体目、肠杆菌目组成。假单胞菌目和肠杆菌目的相对丰度在三个品系之间均存在显著性差异,黄色单胞菌目和立克次氏体目的相对丰度在明恢82与甬优15品系间和明恢2155与甬优15品系间存在显著性差异,表明食物改变了稻纵卷叶螟肠道细菌的相对丰度。⑶利用16SrRNA基因测序技术分析转crylAb基因水稻对稻纵卷叶螟肠道细菌多样性的影响,结果表明,转 crylAb基因水稻显著影响稻纵卷叶螟肠道细菌的相对丰度。其中γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、肠杆菌属在处理组中的相对丰度均大于对照组,这可能是由于Bt毒素破坏了肠道内环境,机体的正常代谢紊乱,而这些菌在维持机体的正常代谢中起到了积极的作用。
[硕士论文] 唐帅
生物学 浙江师范大学 2016(学位年度)
摘要:γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种非蛋白质氨基酸,于动植物、藻类、细菌和真菌中广泛存在。在动物神经组织中,作为一类抑制性神经传递物质,具有降血压、增进神经营养、增加采食行为、增进生长、抗衰老、治疗癫痫、活化肾功能、肝功能等多种生理功能。常作为食品及饲料等领域中的一种添加剂。
  本研究为探索发现新型药用发酵生产菌,从昆虫肠道特境入手,筛选产γ-氨基丁酸等活性氨基酸的昆虫肠道共生菌并作相关实验研究。
  首先,本研究从白蚁、蜜蜂、蝗虫、蜻蜓等数十种昆虫肠道中分离得到昆虫肠道共生菌270多株。采用薄层层析定性分析法(TLC)初筛,Berthelot比色法及高效液相色谱法(HPLC)复筛,获得多株产γ-氨基丁酸(GABA)菌株。对从昆虫肠道筛选得到的产GABA共生菌株进行显微形态及生理生化特性研究初始鉴定,对三株产量较高的菌株进行了分子生物学鉴定,对其中一株高产FE-7菌株扩增序列系统发育分析,鉴定FE-7为芽孢杆菌属(Bacillus)的一个可能的新种,并作为后续研究菌株。该菌发酵液中GABA含量初测为2.1 g/L以上,表明从昆虫肠道特境中筛选产γ-氨基丁酸菌株具有挖掘开发前景。
  其次,以实验确定的最佳诱变条件对菌株FE-7进行了硫酸二乙酯(DES)化学诱变和紫外复合诱变处理,选取数株诱变处理菌株进行发酵试验,得到1株产量提高的突变株,编号UD-36,传代后其遗传特性较为稳定,其GABA产量为2.64 g/L,比菌株FE-7提高24.7%。
  其中对三株昆虫肠道共生菌进行了单因素发酵试验,分析比较了他们最佳碳源和氮源利用情况,得出突变株UD-36利用葡萄糖作为碳源,蛋白胨作为氮源时GABA产量较高,之后以单因素实验结果对突变株UD-36发酵转化条件中的四个主要影响因素进行了L9(3)4正交优化实验,确定该菌最佳发酵条件为葡萄糖5 g/L,蛋白胨25g/L,谷氨酸10 g/L,pH5.5。优化发酵后GABA产量可达3.31 g/L。
  最后,对昆虫肠道共生菌UD-36的发酵产物中其它氨基酸组分进行了测试分析,测试结果显示发酵物中18种氨基酸种类齐全,分析比较了其中必须氨基酸和非必须氨基酸成分比例及药用氨基酸成分比例情况,并对菌体发酵物的营养价值进行分析评估。其中菌体发酵物中含量最高的前五氨基酸为Glu(2.51 mg/100g),Asp(1.64mg/100g),Leu(132 mg/100g),Lys(1.30 mg/100g),Ala(1.06 mg/100g),第一限制氨基酸为Val。其含有的7种必须氨基酸含量占氨基酸总量的48.60%,高于WHO/FAO的规定标准(40%);药用氨基酸含量占氨基酸总量的61.69%,高于漆枯草(43.31%)和松茸(60.09%)。
[博士论文] 李尧
生物学;动物学 南京师范大学 2016(学位年度)
摘要:变态发育是昆虫发育中最具特色和最为重要的现象,也是昆虫对外界环境长期适应进化的结果。根据发育过程中是否存在蛹期把昆虫分为完全变态与不完全变态两大类。完全变态昆虫被认为是昆虫纲中进化程度最高的一群,其一生要经历卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段。通常完全变态昆虫的成虫形态和大小是由蛹个体长度大小来决定的。然而,哪些因素影响了昆虫蛹体长度的大小呢?已有的研究发现蛹体长度大小的形成涉及一系列的基因表达、网络调控和激素调节,其发育调控机制极其复杂。目前,人们对于这一机制的了解还只是冰山一角,特别是miRNA如何调控昆虫蛹期发育更是知之甚少。miRNA是一类21~24nt的非编码小RNA,其通过调控靶基因的转录后表达水平发挥生物学功能。由于成熟miRNA的片段较短以及靶基因众多等特点导致目前对miRNA确切的和多样化的功能研究较为困难,因此利用生物信息学和分子生物学实验相结合方法对miRNA调控昆虫蛹体长度大小进行深入研究,不仅对深刻揭示miRNA在昆虫变态发育中的调控机制具有重要的理论意义,而且对农业昆虫的防治也具有重要的实践价值。
  黑腹果蝇是完全变态昆虫同时也是经典的模式生物,因此本论文选取黑腹果蝇为研究对象,对miRNA调控黑腹果蝇的蛹体长度大小进行研究。分析黑腹果蝇miRNA的表达谱,发现miR-11在三龄幼虫后期到预蛹期均出现表达量的增加,而在其它阶段表达量较低。进一步对miR-11所属家族进化分析发现miR-11只在完全变态昆虫中保守,而不完全变态昆虫中没有发现miR-11的存在,这些结果暗示miR-11可能参与了黑腹果蝇蛹期发育调控。为了验证这一假设,论文进行了以下研究:
  1.利用RMCE技术和Gal4/UAS系统构建了miR-11的敲除或缺失品系以及miR-11的过表达品系,并且对miR-11突变品系进行表型观察,发现miR-11的敲除或功能性缺失突变体品系会导致黑腹果蝇蛹体长度和重量均变大,而miR-11全身过表达品系则出现蛹期致死。对一龄幼虫、二龄幼虫、三龄幼虫、蛹和成虫五个不同发育阶段表型观察及体长测量排除了发育延迟导致蛹变长的可能,同时发现miR-11的敲除会导致蛹和雌雄成虫的体长均出现增长,而幼虫期的miR-11敲除品系与野生型相比没有显著性差异。敲除或者抑制miR-11活性能够使黑腹果蝇在变态过程中形成体长较大的蛹,暗示miR-11可能参与了黑腹果蝇蛹体长度大小的调控。
  2.为了揭示miR-11调控黑腹果蝇的蛹体长大小的机制,利用生物信息学技术对miR-11的189个靶基因进行信号通路富集性分析,发现这些靶基因主要涉及Ras/MAPK信号通路,并且miR-11能够靶向Ras/MAPK通路中的Ras85D和Sos基因。进一步对miR-11与Ras85D、Sos基因的靶标关系进行体内和体外验证,发现miR-11能够作用Ras85D基因的3'UTR区域,而无法靶向Sos基因的3'UTR区域,表明miR-11可能是通过靶向Ras85D基因来调控蛹体长度大小。
  3.为了证明是否miR-11直接靶向Ras85D来调控蛹体长度大小的形成,对靶基因Ras85D在miR-11诱导的蛹缺陷表型中的作用进行了研究。我们运用基础遗传学方法构建双突变体:同时敲除miR-11和抑制的Ras85D的功能品系,发现双突变株能够挽救了miR-11敲除株的表型缺陷。对Ras85D和miR-11的时间表达模式分析,发现m iR-11和Ras85D的表达量在化蛹以后的呈现此消彼长表达模式。这些结果表明miR-11在整个变态发育过程中抑制Ras85D的表达,并且通过直接靶向Ras85D调控蛹体长度大小的形成。
  综上所述,我们利用生物信息学结合分子生物学实验的有效手段,证明了黑腹果蝇miR-11可以通过直接靶向Ras85D的3'UTR进而调控蛹体长度大小的形成,最终参与了蛹期变态发育的调控。论文结果为miRNA调控昆虫变态发育提供了有力的和切实的实验证据;为深入揭示昆虫变态发育的调控机制提供了新视角和有益的启示;生物信息学和分子生物学技术相结合的手段能有效地发现miRNA的靶基因和功能,这为进一步研究miRNA的潜在功能提供了新的研究策略;揭示miR-11调控昆虫变态发育的机制将对于农业害虫防治也具有深远意义。
[博士论文] 赵文丽
生物化学与分子生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:随着分子生物学技术的发展,人类研究昆虫发育的机制有了更好的平台。通过阐明昆虫发育的分子机理,可以为人类研究与疾病相关的生理过程提供参考和理论依据。全变态昆虫的整个生命周期要经历多次蜕皮,包括幼虫各龄期之间的蜕皮、幼虫向蛹过渡的变态蜕皮以及蛹到成虫的羽化蜕皮。昆虫的发育和蜕皮变态过程主要受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)共同调控。因此,阐明20E膜信号通路终止机制和JH胞内受体Methoprene耐受基因1(Met1)传导JH信号的机制具有重大意义。
  国内外研究进展及科学问题
  目前关于昆虫JH功能的研究主要集中在对其受体功能机制的研究上,关于最有可能的JH受体Methoprene耐受基因(Met)的研究结果有很多。Met结合JH后和bHLH-PAS家族其他蛋白一起作为复合体结合到Krh1基因启动子区域JH响应元件(JHRE)中的E-Box上,启动Krh1的转录,进而传导JH信号;在赤拟谷盗中干扰Met,会引起幼虫的早熟变态。超气门蛋白(USP)参与20E信号通路的同时还能与JH结合。Met作为JH的胞内受体如何传导JH信号,USP如何与Met相互作用一起参与JH通路,这些科学问题的答案尚不明确。20E膜信号通路是目前的研究热点,20E最有可能的膜受体是GPCR。G蛋白偶联受体激酶(GRK)最著名的功能是磷酸化G蛋白偶联受体(GPCR),使GPCR信号脱敏。棉铃虫中的GRK2分布在细胞质中,GRK2如何在20E的诱导下由细胞质移位至细胞膜终止GPCR的功能,GRK2是否介导20E膜信号的终止都是目前研究的热点科学问题。
  结果:
  本文以棉铃虫及其表皮细胞系为实验材料,通过体内和体外实验,运用分子生物学技术,深入研究了Met1和GRK2在棉铃虫生长发育中的功能及机制,获得如下结果和结论:
  1.磷酸化的Met1和非磷酸化USP1形成转录复合体促进基因转录维持幼虫状态Met1的表达被JHⅢ上调,但是被高浓度的20E抑制。虫体干扰Met1导致提前化蛹。Met1通过促进JH通路基因转录和抑制20E通路基因转录来维持幼虫状态。无激素时,存在Met1-Met1-USP1复合体;JHⅢ诱导下,Met1的PAC结构域发生磷酸化导致Met1同源二聚体解离,Met1和Hsp90,USP1一起以复合体形式结合到Krh1基因启动子中的JHRE序列上起始Krh1的转录;在20E诱导下,USP1的第21位丝氨酸发生磷酸化,打破Met1与USP1的结合并破坏Met1-Met1的二聚化,Met1以单体形式存在,磷酸化的USP1与20E的核受体EcR-B1结合形成转录复合体传导20E信号。
  2.GRK2终止GPCR在细胞膜上传导20E信号的功能
  GRK2蛋白在虫体变态时期高表达,GRK2的表达被20E上调。在虫体干扰GRK2导致化蛹进程加速、20E通路基因转录上调和凋亡变态过程的提前。20E通过细胞膜上的ErGPCR-2调控PKC磷酸化GRK2的第680位丝氨酸,导致GRK2的膜转位;位于细胞膜上的GRK2结合ErGPCR-2并使之磷酸化导致ErGPCR-2的内吞,进而终止ErGPCR-2传导20E信号的功能。20E和GRK2之间存在负反馈调控机制。
  结论:
  Met1通过抑制20E通路并促进JH通路基因转录来维持幼虫状态,磷酸化的Met1和非磷酸化USP1一起传导JH信号,本文的研究结果为JH维持昆虫幼虫状态抑制变态发生提供了新的实验证据和理论支持。通过对GRK2的功能研究,揭示了类固醇激素20E终止的机制,阐明了GRK2和ErGPCR-2相互作用使20E通路在虫体中正常的发挥作用不致过量。为昆虫发育及蜕皮变态提供了新的理论知识,为害虫防治提供的新的靶标。
[硕士论文] 裴旭阳
生物化学与分子生物学 山东大学 2016(学位年度)
摘要:背景、科学问题和研究意义:
  钙离子是一种十分重要的信号分子,它参与调节生物各种生理活动,包括细胞分裂生长、程序性死亡、组织分化和发育等。钙离子水溶性较差,因此细胞中自由的钙离子浓度被严格控制在大约100nM的极低水平,而胞外钙离子浓度可以达到1mM。在信号来临时,钙离子通过钙通道从内质网释放或从细胞外进入,结合钙调蛋白并激活钙调蛋白激酶,调控基因表达。而进入细胞的钙离子通过钙泵被储存在内质网中或排除胞外。生物体内主要有3类钙离子通道,包括电压门控钙通道、受体控制钙通道和钙库控制钙通道。其中,钙库控制钙通道又称为储存调控型钙离子通道(store-operated calcium channel,SOC)是非神经兴奋性细胞中的钙通道,在细胞接收信号后由磷脂酶产生三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate,IP3),IP3结合内质网上的IP3受体(IP3R),导致细胞内质网中储存的钙离子排空,内质网膜上的Stim蛋白感受到内质网中钙离子减少发生聚集,与细胞膜上的钙离子通道Orai结合使Orai开放,使细胞外的钙离子流入到细胞内。钙离子在昆虫的变态发育中起到重要作用,在变态期,钙离子主要受到20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(juvenile hormone,JH)的调控。前期研究发现20E调控细胞内钙离子增加,但调控机制不清楚。本文主要研究了Orai1是否参与了20E诱导的钙流动,若是参与,它的开放机制又是什么,对昆虫的生长发育又产生什么影响。本研究有助于了解20E调控的钙离子加的机制,进一步揭示昆虫的生长发育机理,为害虫的防治提供新的靶标基因。
  结果:
  棉铃虫是一种完全变态的鳞翅目夜蛾科昆虫,我们以棉铃虫幼虫和表皮细胞系为研究材料,通过激素刺激和干扰、细胞系上过表达等方法,探索了Orai1在棉铃虫的虫体生长发育中的作用,并探明了20E所诱导的钙离子流动的钙通道的类型,并初步了解了Orai1的开放激活机制。以下是研究的结果:
  在虫体中,Orai1的表达量在变态期达到峰值,20E在虫体和表皮细胞系均可以诱导Orai1的基因高表达;而在虫体中干扰Orai1可以影响棉铃虫的变态,推迟棉铃虫的化踊时间;在虫体和表皮细胞系中干扰Orai1可以抑制20E下游的基因的表达。结果说明Orai1受到20E调控并参与变态。20E诱导的钙离子增加有内钙释放和外钙内流两个峰,用IP3受体的抑制剂处理细胞后,钙离子的两个钙峰均下降。表皮细胞系上干扰Orai1后,20E诱导的钙峰的第二个峰受到抑制。说明20E诱导的钙离子内流是Orai1介导的SOC型钙离子内流。在表皮细胞系上单独过表达Orai1或Stim1,20E诱导的钙流峰并没有明显变化,而同时过表达Orai1和Stim1后,20E诱导的钙流峰大幅上调,说明Orai1需要Stim1来激活钙离子流。在表皮细胞系中共转染Orai1-GFP和Orai1-RFP,利用免疫共沉淀实验,可检测到二者有相互作用,而20E刺激后,两者的相互作用量明显上调;20E的上调作用可以被GPCR的抑制剂和PLC的抑制剂所抑制,干扰掉ErGPCR1、PLCG1和Stim1也可以抑制这种上调作用。说明Orai1至少是以二聚体存在,20E可诱导Orai1的聚集和开放。
  结论:
  通过以上实验结果可以得出结论:20E诱导的钙离子内流是一种Orai1所介导的SOCE,并由,Orai1通过聚集来开放。
  创新点和意义:
  本研究揭示了20E诱导的钙离子增加是Orai1介导的SOCE;丰富和完善了20E调控途径;阐明了Orai1在昆虫生长发育中的作用,并为害虫控制提供了新的靶标分子。
[硕士论文] 李静
生态学 河北师范大学 2016(学位年度)
摘要:蜱是世界上仅次于蚊子的第二大吸血节肢动物。吸血过程中不但破坏宿主(包括人)皮肤组织造成多种病原体侵染,同时蜱类也是多种极其危险病原体的传播媒介,如伯氏疏螺旋体、粒细胞无性体、斑疹伤寒等。因此对其研究具有重要的意义。雌蜱在吸血过程中身体会经历巨大的变化,特别是交配完成后,雌蜱体积会迅速增大数十倍,最终依靠大量的血液提供原料和能量来完成产卵活动,因此全面了解蜱类不同吸血期的标志性分子对于分析这一物种特殊的生活史具有重要的意义。除此之外蜱类的重要器官----唾液腺具有特殊的生理机能,可以促进蜱类在短时期内大量吸血,因此解析唾液腺的分子机能对于全面了解并开展蜱类的综合防治具有重要意义。
  本研究采用高通量第二代测序技术(Illumina HiSeq2500)对饥饿期、交配前吸血期、交配后半饱期和饱血期的亚洲璃眼蜱进行了转录组测序,以期找到不同吸血期蜱类所表达的特殊基因,为全面了解蜱类吸血和交配过程中的生理机能奠定基础,同时该数据作为后期开展唾液腺的定量蛋白质组研究的Database,为全面分析唾液腺的生理机能奠定基础。测序结果共得到16.39 GbClean Data,各样品Q30碱基百分比均不小于82.91%。将Clean Data中的Reads进行拼接组装,共得到71586条Unigene。Unigene的N50为2109,预示着基因的组装完整性较高。将这些Unigene与Nr、Uniprot、GO、COG、KOG、KEGG、Pfam七个数据库分别进行BLAST比对,其中在Uniprot库中注释上相关功能的基因数为15414个,同时对差异基因进行GO分析,从“细胞组分”、“分子功能”和“代谢过程”三方面,来对亚洲璃眼蜱生长过程中出现的差异变化进行描述。最终将这些基因翻译成相应的氨基酸序列,作为定量蛋白质组学研究的Database。通过计算Unigene的FPKM值寻找亚洲璃眼蜱体内的表达基因,并比较同一Unigene在四个时期表达值的高低变化,共发现6448个在四个吸血时期均出现表达量变化的基因。同时利用iTRAQ定量蛋白质组学方法对四个吸血时期的雌蜱唾液腺中所有蛋白质进行了高通量定量研究,用114~117四标iTRAQ试剂分别标定四个吸血时期的雌蜱唾液腺蛋白,结果显示在这四个时期表达量均出现变化的蛋白有617个。通过对结果中差异蛋白的分析,使得我们能够更加全面的了解亚洲璃眼蜱唾液腺的生理机能,以及更深层次的调控机制和部分物质的代谢规律,为研究和探寻蜱类的综合防治提供了有力的理论支撑。
[博士论文] 吴忠霞
细胞生物学 中国科学技术大学 2016(学位年度)
摘要:保幼激素(juvenile hormone,JH)除了在昆虫幼虫阶段拮抗蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的作用而决定昆虫蜕皮或变态之外,它还在许多昆虫的成虫羽化后起促进生殖的作用,但对JH促进生殖的的分子机制仍缺乏了解。飞蝗(Locusta migratoria)是世界性的重要农业害虫,有很强的繁殖能力。不同于果蝇、伊蚊、家蚕、赤拟谷盗等研究对象的生殖由JH和20E共同调控,飞蝗的卵黄发生、卵巢发育和卵成熟则由JH调控。因此,飞蝗也是研究JH调控昆虫生殖分子机制的一个理想模式。飞蝗的卵巢属于无滋式(panoistic),即卵小管没有滋养细胞或滋养丝,卵成熟所需的卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)等由脂肪体合成,通过血淋巴和卵泡细胞的胞间隙运送到成熟过程中的卵母细胞。早期的研究发现,飞蝗羽化后到产卵前的第一个促性腺周期内,脂肪体和卵泡细胞进行内分裂(endocycle),形成高达16倍体的多倍性(polyploidy)细胞,为飞蝗生殖发育所必需,也受JH调节,但不清楚其中的分子调控机制。
  为了解码JH调控飞蝗生殖的分子机制,课题组通过RNA-seq方法获取了JH缺失和JH诱导脂肪体的差异基因表达谱。KEGG通路分析表明,DNA复制和细胞周期信号通路分别位列第一和第四。QRT-PCR验证了DNA复制通路的16个基因和细胞周期通路中的13个基因都在JH诱导下显著上调。本论文首先选择在DNA复制中起核心作用的6个复制解旋酶基因(Mcm2-7)开展进一步的研究。对JH受体Met基因进行RNAi后,发现Mcm3、Mcm4和Mcm7表达水平显著下降。对Mcm4和Mcm7的启动子区域进行序列分析,分别鉴定到Met结合的E-box-like和E-box元件。荧光素酶报告和电泳迁移实验均证明JH受体复合体(Met/SRC)可以结合Mcm4和Mcm7上游的E-box或E-box-like序列,直接调控Mcm4和Mcm7的转录。通过RNAi沉默Mcm4或Mcm7,脂肪体细胞的DNA复制和细胞多倍化严重受阻,Vg表达大幅度下调,卵巢发育和卵母细胞成熟受到显著抑制,表型与JH缺失和Met RNAi相似。这些研究结果表明,Mcm4和Mcm7在JH调控的飞蝗生殖发育中发挥重要作用,JH通过其受体复合体Met/SRC直接调控Mcm4和Mcm7的表达,影响细胞的DNA复制和多倍化,进而调节卵黄生成、卵巢发育和卵母细胞成熟。
  Mcm2-7加载到DNA复制起点形成复制前体依赖于Cdc6,而Cdc6在JH诱导的差异基因表达谱中也显著上调。鉴于Cdc6在DNA复制和细胞周期检控中的重要作用,本论文也对Cdc6在JH调节的飞蝗生殖发育中的功能和调控机理进行了研究。QRT-PCR结果显示,Cdc6的表达不但受JH诱导上调,也在MetRNAi后显著下调。对Cdc6基因上游的DNA序列进行克隆和分析,在启动子区域-1063到-1058处发现一个E-box-like元件。利用飞蝗脂肪体和果蝇S2细胞进行电泳迁移实验都证明Met可以结合Cdc6启动子区域含E-box-like元件的20bpDNA序列。荧光素酶报告实验表明,JH/Met/SRC直接调控Cdc6的转录。Cdc6RNAi和流式细胞实验显示,Cdc6缺失不但显著降低脂肪体细胞和卵泡细胞的倍性,也导致这些组织的细胞分裂;同时,Vg表达、卵巢发育和卵母细胞成熟都受到非常显著的抑制;而且,上述表型缺陷在JH处理后并不能恢复到正常水平。这些研究结果表明,Cdc6参与JH调节的飞蝗细胞多倍化和生殖发育,在JH诱导下,Cdc6与Mcm4、Mcm7协同提高DNA复制和细胞的倍性,可能增加包括Vg在内的所有基因的拷贝数,进而促进Vg的大量合成,同步满足所有首卵的成熟。
  此外,本论文还对调控细胞内分裂的E2f1开展了初步研究。E2f1 RNAi造成脂肪体细胞和卵泡细胞的双核或多核化,并显著降低细胞的倍性。与Cdc6、Mcm4或Mcm7 RNAi相似,E2f1 RNAi后飞蝗的Vg表达、卵巢发育和卵母细胞成熟也受到显著抑制。论文的初步研究结果表明,E2f1在JH调控的飞蝗细胞多倍化过程中也发挥着非常重要的作用。以后对E2f1的进一步研究将会阐明JH怎样调控E2f1的表达,E2f1如何作用于飞蝗细胞的内分裂和多倍化。
  综合上述研究结果,特别是对JH通过Met/SRC直接调控Mcm4、Mcm7和Cdc6的表达,提高脂肪体细胞和卵泡细胞的多倍化,进而促进Vg的大量合成和卵成熟的解析,揭示了JH促进昆虫生殖的一个重要机制。
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