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[硕士论文] 张伟东
卫生毒理学 河北医科大学 2011(学位年度)
摘要:己烯雌酚和双烯雌酚是结构相近的人工合成的非甾体雌酚类激素,临床上用于补充体内雌激素不足,治疗乳腺癌、前列腺癌、闭经和绝经期综合症等,并能够促使女性器官及副性征正常发育,促使子宫内膜增生,增强子宫收缩,提高子宫催产素的敏感性;小剂量刺激垂体前叶促性激素及催乳素的分泌,大剂量则起到抑制作用。双烯雌酚是己烯雌酚的体内代谢产物。在畜牧业中,己烯雌酚和双烯雌酚主要用于牛奶产量、促进蛋白质合成,具有增加蛋白质沉积和减少脂肪沉积的作用。长期使用己烯雌酚和双烯雌酚或食用含有己烯雌酚和双烯雌酚的奶制品或肉制品会导致妇女更年期紊乱、生育能力下降、女性性早熟、男性女性化,并能导致女性产生乳腺癌、子宫癌等。因此建立方便、快捷的己烯雌酚和双烯雌酚检测方法具有重要意义。
   在碱性介质中,Ag(Ⅲ)配合物氧化鲁米诺产生稳定的化学发光信号,某些物质能显著增强或抑制鲁米诺-Ag(Ⅲ)体系的化学发光,并且发光强度与物质浓度在一定范围内呈良好的线性关系。本试验将Ag(Ⅲ)-鲁米诺化学发光新体系与流动注射技术相结合,建立了检测己烯雌酚的新方法,并将此方法应用于己烯雌酚片剂的含量测定。
   毛细管电泳将电泳技术与现代微柱分离技术相结合,以高压直流电场为驱动力,在毛细管中按各组分的淌度和分配行为的不同进行高效、快速的分离。毛细管电泳的分离通道为中空的毛细管,对样品的预处理要求较低,本研究旨在建立毛细管电泳法测定育发产品中己烯雌酚和双烯雌酚。
   一、流动注射-Ag(Ⅲ)-鲁米诺化学发光新体系测定己烯雌酚片剂中己烯雌酚含量
   目的:建立流动注射-Ag(Ⅲ)-鲁米诺化学发光新体系测定己烯雌酚片剂中己烯雌酚含量的新方法。
   方法:在碱性条件下,鲁米诺被Ag(Ⅲ)氧化产生稳定的化学发光信号,己烯雌酚能显著抑制Ag(Ⅲ)-鲁米诺体系的化学发光作用,且发光强度与样品的浓度在一定范围内呈良好的线性关系。通过对鲁米诺溶液浓度、碱度和Ag(Ⅲ)溶液浓度、碱度等一系列发光条件进行优化选取,在最佳发光条件下绘制己烯雌酚的标准曲线,并对样品进行含量测定。
   结果:流动注射-化学发光法测定己烯雌酚的最低检出限为3.0×10-7mol/L。线性范围为5.0×10-7-5.0×10mol/L,回归方程为△I=5.84×108C+548,线性相关系数r=0.9989。对1.0×10-5mol/L的己烯雌酚连续进行平行测定7次,RSD为3.4%,加标回收率在88.6%-100.0%之间,RSD为3.7%。
   结论:流动注射化学发光法测定己烯雌酚片剂中己烯雌酚含量,方法简便快捷、准确可靠,可用于己烯雌酚片剂生产过程己烯雌酚的质量控制。
   二、毛细管电泳法测定育发产品中的己烯雌酚和双烯雌酚
   目的:建立毛细管电泳-紫外检测法测定育发产品己烯雌酚和双烯雌酚含量的新方法。
   方法:采用未涂层弹性熔融石英毛细管(75μmi.d.×55 cm,有效长度50cm)为分离通道,20mmol/L硼砂(含体积分数为30%的N,N-二甲基甲酰胺)为运行缓冲液,采用重力进样,进样时间10s,分离电压为20kv,紫外检测波长254nm。
   结果:己烯雌酚和双烯雌酚在9min内达到基线分离,在2.0×10-6-2.0×10-4mol/L,2.0×10-6-2.0×10-4mol/L浓度范围内呈良好的线性关系,线性相关系数分别为0.9991、0.9994,检出限为6.7×10-7mol/L和3.3×10-7mol/L,回收率分别在89.6-94.6%和88.7-104.8%之间,相对标准偏差为3.97%和4.54%。
   结论:该方法简便、快速、准确,用于市售育发产品中己烯雌酚和双烯雌酚的检测,结果令人满意。
[硕士论文] 张文改
卫生毒理学 中山大学 2007(学位年度)
摘要:本文对基于细胞的眼刺激性体外替代方法建立与化妆品眼刺激性逐步检测策略进行了研究。文章成功建立了3T3-NRU细胞毒性试验和红细胞溶血试验两种基于细胞的眼刺激性体外替代方法。结果表明:3T3-NRU细胞毒性试验结果客观量化,能检测包括有色物质在内的多种化学物质,适用于评价强刺激性化学物质,但不宜评价酸、碱及胺类物质,应用于评价醇类及难溶的物质时应慎重;红细胞溶血试验简单快速,尤其适用于评价表面活性剂,但不宜评价酸、碱、不溶于水和含染料的物质;该策略与传统的急性眼刺激性/腐蚀性试验的检测结果接近,认为可用于洗发护发类、染发类化妆品的眼刺激性评价。
[硕士论文] 张永路
卫生检验与检疫 华中科技大学 2013(学位年度)
摘要:一、目的和意义:
  近年来,国内蓝藻水华的爆发频度逐年增加。当蓝藻死亡后,藻细胞破裂释放大量的藻类毒素,其中以微囊藻毒素的存在最为普遍,且与人类健康的关系最为密切,成为目前研究最多的一类藻类毒素。其毒理学、免疫学以及降解和去除等成为研究的热点,需要大量微囊藻毒素纯品。但因其价格昂贵且主要依靠进口,成为困扰研究人员进一步深入开展上述研究的瓶颈。
  本文旨在开展微囊藻毒素-RR(MC-RR)纯化以及急性毒性的研究,通过选择与优化提取方法、固相萃取、Sephadex LH-20凝胶色谱层析各种参数,获得纯度超过90%的MC-RR。再用纯化的MC-RR作为受试物经腹腔注射和经口两种不同的途径,测定LD50值,初步评价MC-RR对机体的急性毒性效应特征、靶器官、剂量-反应关系,为今后自主提取、纯化、收获藻毒素纯品提供一套较为成熟的方法,并为其他毒性实验的剂量设计和观察指标选择提供参考依据。
  二、方法:
  1.化学提取与鉴定以野外采集的蓝藻水华为原料,通过比较反复冻融、水浴法和70%甲醇细胞破碎法提取效率,确定70%甲醇提取法为最优方法后,对后者提取重复次数,每次提取时间及提取温度等参数进行优化。获得的粗提液经旋转蒸发去除甲醇后,经固相萃取初步纯化和浓缩,上样至Sephadex LH-20凝胶层析柱,以甲醇为流动相,用自动部分收集器收集洗脱液,紫外分光光度计测定每管洗脱液在238nm的吸收值。以A238为纵坐标,以管编号为横坐标绘制洗脱曲线。对上样量,洗脱液流速进行优化,获得最优洗脱条件。用高效液相色谱对峰值组分进行鉴定,并同时利用紫外分光光度计对毒素光谱特征进行鉴定。
  2.生物毒性鉴定采用改进寇氏法计算MC-RR经腹腔注射小鼠LD50值。根据预实验的结果,分为400μg/kg、282.84μg/kg、200μg/kg、141.42μg/kg、100μg/kg五个剂量组,对照组为生理盐水组,每组10只昆明小鼠,雌雄各半。染毒后观察急性中毒行为表现,记录小鼠死亡数及死亡时间,并对死亡小鼠及时取心肝肾以计算脏器系数以及进行组织病理学检查。用序贯法测MC-RR经口的LD50值,并根据测定的LD50值染毒,测定小鼠在其开始发生中毒反应时间和平均死亡时间这两个时点的血清酶学、肝脏脏器指数以及病理组织学的改变。
  三、结果:
  1.用70%的甲醇溶液溶解35g藻浆,经离心等系列处理,得粗提液,旋转蒸发去除甲醇;经HLB柱固相萃取后,7.5mL洗脱液含4.92mg MC-RR和0.53mg微囊藻毒素-LR(MC-LR),然后将其浓缩至2mL;再用Sephadex LH-20凝胶过滤层析进一步纯化,通过测定流出组分在238nm处的吸光度值,确定MC-RR在第一个洗脱峰,最终获得3.65mg样品纯度超过90%的MC-RR,产品得率为74.1%。其吸收光谱在238nm处有特征吸收。
  2.小鼠经腹腔注射染毒LD50=192.75μg/kg,95%的置信区间为176.59~206.89μg/kg。400μg/kg、282.84μg/kg、200μg/kg、141.42μg/kg、100μg/kg五个剂量组小鼠死亡率分别为10/10,9/10,6/10,1/10,0/10。随着剂量增加,肝脏脏器系数显著增加,组织病理学肝细胞坏死、肝窦充血逐渐加重。经口染毒LD50为12.10mg/kg,95%的置信区间为10.75~13.45mg/kg。以LD50剂量给小鼠染毒后,约45min后开始有中毒反应,平均死亡时间为4h。与对照相比,血清中ALT、AST、ALP及LDH的水平在45min时明显上升,4h后进一步上升。肝脏脏器系数与血清酶学的变化一致,而心脏和肾脏脏器系数未见明显改变。组织病理学变化显示染毒45min后,肝细胞呈点状坏死和肝脏组织少量充血,4h后肝细胞大面积坏死,肝窦大面积充血。
  四、结论:
  以野外收集的水华蓝藻为原料,采用75%的甲醇溶液提取,经过固相萃取初步浓缩纯化后,再通过Sephadex LH-20凝胶层析,获得纯度超过90%的MC-RR。MC-RR具有明显的肝毒性,在急性毒性中未观察到肾脏和心脏毒性。
[硕士论文] 张钰
公共卫生与预防医学 天津医科大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  探讨出生前较低剂量 DEHP暴露对子代雄性大鼠生殖系统发育和功能的影响及其可能的作用机制。
  方法:
  40只健康SD孕鼠随机分为4组,分别为对照(玉米油)组和2mg/kg、10mg/kg和50 mg/kg DEHP染毒组,每组10只。自G14至G19,每天灌胃染毒。孕鼠从G0至分娩,每天早上称重,并记录孕鼠孕期。孕鼠分娩后,测量雄性幼鼠的体重和肛门生殖孔距离(AGD);此后雄鼠每周测量体重和AGD,断乳后每天观察睾丸下降情况。雄鼠第十周龄时,每窝随机选取1只,每组8只断头处死,取血分离血清,并摘取生殖器官和其他主要脏器,观察各脏器的外观形态,测量其脏器系数。其余雄鼠继续喂养到第十二周龄时,每窝随机选取1只,每组10只进行性行为实验。
  采用放射免疫分析法测定雄鼠血清睾酮、孕酮、雌二醇和黄体生成素的含量。提取睾丸间充质细胞的mRNA,逆转录成cDNA后采用荧光实时定量PCR分析睾丸甾体类激素合成酶相关基因及胰岛样因子3(insl3)和过氧化物酶体激活物增殖受体γ(PPARγ)的基因表达水平。
  结果:
  1.染毒后孕鼠外观无异常,各组孕期和妊娠增重间的差异无统计学意义。
  2.新生雄鼠10mg/kg和50mg/kg暴露组的平均体重低于对照组,2mg/kg暴露组的平均AGD高于对照组。
  3.10mg/kg和50mg/kg暴露组的睾丸下降平均日龄与对照组相比出现延迟;各组体重从出生第一周到第八周间的差异有统计学意义,10mg/kg与50mg/kg暴露组的平均体重要低于对照组;出生后到青春期,10mg/kg与50mg/kg暴露组AGD均低于对照组;2mg/kg组前列腺的脏器系数高于对照组。
  4.2mg/kg组与50mg/kg暴露组骑跨和射精能力低于对照组。
  5.成年子代雄鼠各组血清睾酮、孕酮和黄体生成素含量之间的差异无统计学意义,50mg/kg暴露组雌二醇含量出现下降。10mg/kg暴露组3β羟化酶(3β-HSD)和胰岛素样因子3(insl3)的基因表达水平低于对照组。
  结论:
  1.出生前10mg/kg和50mg/kg剂量DEHP暴露对子代雄鼠的体重和AGD在不同发育阶段有不同影响,具体机制还有待进一步研究。
  2.出生前2mg/kg剂量DEHP暴露对子代雄鼠生殖系统的生长发育可能具有低剂量效应。
  3.出生前2mg/kg和50mg/kg剂量DEHP暴露会对子代雄鼠的性行为产生影响,使其交配能力减弱。
  4.出生前50mg/kg剂量DEHP暴露使雄鼠血清雌二醇含量出现下降。
  5.出生前10mg/kg剂量DEHP暴露会使成年雄鼠睾丸组织甾体类激素合成关键酶3β羟化酶及胰岛素样因子3基因表达水平下降,但是该基因表达水平变化与血清甾体激素水平的关系还有待进一步研究。
[硕士论文] 王秀会
公共卫生与预防医学 河北联合大学 2015(学位年度)
摘要:目的:通过探讨丙烯酰胺(acrylamide,ACR)对突触素I(SynapsinI)蛋白表达的影响、对N-甲基马来酰亚胺敏感因子(NSF)附着蛋白受体(SNARE)复合体结合/解离的影响和对SynapsinI上游磷酸化激酶的影响,明确ACR致神经元突触损伤对SynapsinI上下游蛋白调控的作用机制;通过对突触损伤的神经元进行脑源性神经营养因子(BDNF)的干预,进一步阐明BDNF对神经元突触损伤的保护作用。
  方法:1、将NB-1细胞通过二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)诱导为成熟神经元细胞后,MTT检测ACR不同染毒浓度(0、25、50、100、150、200和250μg/ml)在不同染毒时间(24、48和72h)对 NB-1细胞相对存活率的影响;免疫印记(western blot)技术检测Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表达,免疫共沉淀(Co-IP)试验检测神经元突触损伤前后SNARE复合体的结合/解离的变化,并使用Spearman对其进行相关性分析;使用光镜和电镜分别检测神经元突触损伤前后细胞形态、结构变化;通过western blot技术分别检测ACR染毒前后丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、环磷酸腺苷(PKA)和Ⅱ型钙离子/钙调素依赖蛋白激酶(Ⅱ型 Ca2+/CaM激酶)蛋白表达变化。2、将诱导为成熟神经元的NB-1细胞经60μg/ml ACR染毒后给予不同浓度BDNF(50、75、100和125ng/ml)干预后通过MTT检测细胞相对存活率;使用荧光定量PCR技术检测BDNF给予干预前后Synapsin I mRNA表达的变化,Co-IP试验检测BDNF给予干预前后SNARE复合体结合/解离的变化。
  结果:10、25、50和100μg/ml的ACR染毒剂量染毒NB-1细胞48h后,随着ACR染毒剂量的增加Synapsin I磷酸化和非磷酸化蛋白表达降低(P<0.05);随着ACR染毒剂量的增加,SNARE复合体中突触融合蛋白(syntaxin)和突触小体相关蛋白(SNAP-25)逐渐解离;ACR染毒损伤NB-1细胞后,SNARE复合体中syntaxin和SNAP-25结合状态与Synapsin I、磷酸化Synapsin I(P-Synapsin I)蛋白表达呈正相关(Spearman相关系数 r分别为0.897和0.935),与 P-Synapsin I/Synapsin I差异性表达呈负相关(Spearman相关系数r为-0.250);从电镜图可知,25μg/ml ACR染毒浓度下观察到清亮球形突触小泡和含有高电子密度的致密颗粒的突触小泡;50μg/ml ACR染毒浓度下观察到含有高电子密度的致密颗粒的突触小泡;ACR对NB-1细胞染毒48h后,在100μg/ml ACR染毒浓度下MAPK蛋白表达降低(P<0.05),在25μg/ml ACR染毒浓度下PKA蛋白表达降低(P<0.05),随着ACR染毒剂量的增加,Ⅱ型Ca2+/CaM依赖蛋白激酶表达增加(P<0.05)。2、荧光定量PCR试验结果表明75ng/ml BDNF+60μg/ml ACR试验组与60μg/ml ACR试验组相比,Synapsin I mRNA表达升高(P<0.05);Co-IP试验结果表明BDNF干预前后SNARE复合体中两个单体syntaxin和SNAP-25结合/解离状态未发生变化。
  结论:1、突触内特异性神经递质的传递和释放可能与P-Synapsin I/Synapsin I差异性表达所调控的SNARE复合体的解离状态导致的突触功能损伤相关;ACR导致NB-1细胞神经元突触损伤后,Synapsin I上游磷酸激酶 MAPK、PKA和Ⅱ型Ca2+/CaM依赖蛋白激酶的表达受到影响。2、 BDNF对神经元突触损伤具有一定的干预作用,但在本实验系统条件下结果表明BDNF的干预作用未能调控SNARE复合体解离状态。
[硕士论文] 李红丽
公共卫生与预防医学 河北联合大学 2015(学位年度)
摘要:目的:焦炉逸散物(coke oven emission,COE)是在焦化生产过程中释放的主要环境污染物,除颗粒物外,具有多种致突变和致癌性的多环芳烃。长期暴露于COE容易引发机体产生慢性炎症和肿瘤,而炎症又可以促进肿瘤细胞的转化、生长和转移。本研究应用不同染毒剂量的焦炉逸散物有机提取物作用于16HBE细胞建立24h和5d细胞染毒模型。初步探讨焦炉逸散物有机提取物对支气管上皮细胞的损伤情况。为后续COE暴露人群的效应性生物标志物分析提供依据和线索。
  方法:1 COE有机提取物作用于16HBE细胞建立24h染毒模型:将人支气管上皮细胞系16HBE接种在含有10%的胎牛血清的MEM培养基中,在37℃和5% CO2的条件下传代培养。当细胞融合率达70%时用不同浓度的焦炉逸散物有机提取物处理24h,作用浓度依次为5mg/L、10mg/L、20mg/L,胎牛血清浓度为5%。同时设置0.1%DMSO的COE溶剂对照,每个剂量组均设置平行样。2 COE有机提取物作用于16HBE细胞5d染毒模型建立:细胞培养条件、染毒物质的剂量与24h模型相同,连续染毒5d,每次更换新的含COE有机提取物的培养基,每个剂量组均设立平行样。3应用MTT和乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评估COE对16HBE细胞的细胞毒性。4应用流式细胞仪检测16HBE细胞内活性氧(ROS)的释放水平。5应用彗星实验检测16HBE细胞的DNA损伤情况。6应用悬液芯片 Human Th17 Cytokine Panel15-Plex检测上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、可溶性细胞表面分化抗原40配体(sCD40L)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达情况。7应用蛋白免疫印迹方法检测IκBα、P-IκBα、P65和P-P65蛋白表达水平。
  结果:120mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后,细胞存活率为89.38%(P<0.05),LDH释放量为147.68%(P<0.05)。10 mg/L和20 mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后,LDH释放量分别为124.39%和149.64%(P<0.01)。说明 COE有机提取物可以损伤16HBE细胞,染毒周期增加,毒性亦增加。2 COE有机提取物无论24h染毒还是5d染毒均能检测到活性氧的释放,随着染毒剂量的增加而逐渐升高(P<0.01)。在24h染毒的模型中,5mg/L低剂量组的细胞平均荧光强度相较对照组增加的倍数值比在5d模型中低。在24h模型中增加的倍数是14.47倍,5d模型中为17.85倍。3单细胞凝胶电泳结果显示,细胞出现DNA损伤。20mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后,尾部DNA百分含量增加83.51%(P<0.01),Olive尾距指标增加76.47%(P<0.05)。20mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后,尾部DNA百分含量与对照组相比较增加89.28%(P<0.01),Olive尾距指标值增加量为照组的117.07%(P<0.01)。4 COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后,IL-10的表达量分别是1.25±0.54、1.39±0.13和(1.90±0.73) pg/mL,具有良好的剂量-效应关系(r=0.98,P<0.05)。IL-23仅在该模型的中、高剂量组表达。COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后,IL-10在各剂量组的表达量依次为1.71±0.02、1.49±0.13和(2.82±0.16) pg/mL。IL-1β仅在该模型中表达。表明 COE有机提取物影响16HBE细胞炎性因子的表达。5 COE有机提取物染毒24h对16HBE细胞中NF-κB通路蛋白表达的影响:IκBα蛋白表达量呈现下降趋势,在5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L COE组下降量分别为对照组的26%、33%和56%(P<0.05)。P-IκBα蛋白表达量在中、高剂量组上升显著,在10mg/L COE组中的增加量为对照组的79%(P<0.05),在20 mg/L COE组的表达量是对照组的2.02倍(P<0.05)。P-P65在10 mg/L COE组的表达量为对照组的3.84倍(P<0.05),在20 mg/L COE处理组,其表达量为对照组的6.43倍(P<0.05)。P65蛋白表达量无明显变化。
  结论:1、IL-23和IL-1β分别反映焦炉逸散物染毒24h和5d的炎性损伤,IL-10可以反映焦炉逸散物有机提取物染毒16HBE细胞24h和5d的炎性损伤。2、炎性和免疫损伤可能是焦炉逸散物致癌的早期效应改变。3焦炉逸散物有机提取物致16HBE细胞损伤与NF-κB信号活化有关。
[硕士论文] 范治国
环境科学 上海交通大学 2011(学位年度)
摘要:世界各国的专家和学者都在努力寻找一种快速检测大肠杆菌的新方法,目前已经发展了分子生物学检测方法、酶底物法及免疫学方法等。
  本文从医药废水中筛选出大肠杆菌,制备免疫原,采用多克隆抗体制备技术制备了抗大肠杆菌抗体,并建立了间接竞争酶联免疫吸附法,并在此基础上研制了间接ELISA试剂盒,具体成果如下:
  1.从医药废水中筛选大肠杆菌,制备大肠杆菌全菌体免疫原,然后,使用该免疫原对新西兰大白兔免疫,获得兔抗大肠杆菌免疫血清,经过辛酸-硫酸铵两步法纯化后获得抗血清,其效价为12800,经过计算纯化后抗体的蛋白质的含量为2.50mg/mL。
  2.建立了大肠杆菌的间接ELISA快速检测方法,优化确定了具体实验参数:包被抗原的最佳使用稀释度为200倍,酶标二抗和一抗的最佳稀释度分别为2000倍和12800倍;0.5%BSA为最佳封闭液,封闭2h作为最佳封闭时间;选择37℃温育60min,含4%PEG稀释液作为最佳的抗原与一抗的反应条件;选择37℃温育60min,含4%PEG稀释液作为最佳的一抗与二抗的温育条件。
  3.进行了大肠杆菌的梯度实验,浓度在1012cfu/mL-10cfu/mL之间,用所建立的间接竞争ELISA法测定,结果表明在103cfu/mL-109 cfu/mL有良好的线性关系,表明ELISA的检测限为103cfu/mL。将预处理后的医药废水梯度稀释,用所建立的间接竞争ELISA法测定,同时与国标法(MPN法)和活菌计数法做比较,结果表明间接ELISA测得结果与MPN所测结果一致,但是由于间接ELISA对死菌能检出,所以检测值较MPN法大。
  4.制备了间接ELISA试剂盒,对所组建试剂盒进行了包被时间的优化,试验结果表明该试剂盒在37℃下包被1h,与在4℃下包被过夜所测的OD值相近,所以本试剂盒选择在37℃下包被1h作为包被时间;对自制的试剂盒进行了方法学评价,包括:特异性、重复性及灵敏度。对分别含有大肠杆菌(所筛选)、E.coli、酵母菌、雷氏普罗威登斯菌(ProvidenciaRettgeri)、粪产碱杆菌(Alcaligenes Faecalis)的样品进行检测,结果表明非大肠杆菌对检测结果没有影响,说明该法具有较强的特异性;用五种不同样品对板间和板内分别做了重复性实验,仅有很少几分样品变异系数超过10%,说明该试剂盒具有良好的重复性;对大肠杆菌的最低检出限为103cfu/mL。
[硕士论文] 黄爱博
微生物与生化药学 暨南大学 2015(学位年度)
摘要:目的:
  观察三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)对人正常肝细胞(L-02细胞)亚细胞蛋白质组的影响,探讨其潜在肝毒性作用机制。
  方法:
  (1)细胞增殖水平的测定及膜蛋白富集的验证。采用CCK-8的方法建立TCE致L-02肝细胞剂量-反应关系,通过SPSS软件计算其半数抑制浓度(IC50)。在IC50确定的基础上,以IC50值倍减的浓度梯度进行TCE染毒,进行细胞增殖实验,以测定细胞的增殖活性。利用ProteoExtractTM subcellular proteome extraction kit试剂盒提取膜蛋白组分、核蛋白组分和胞浆蛋白组分。以Na+/K+-ATPase作为膜蛋白的标志物,通过Western Blot分析膜蛋白组分和胞浆蛋白组分中Na+/K+-ATPase的表达水平,总蛋白组分作为对照组进行膜蛋白富集的验证。以Lamin B1作为核蛋白的标志物,同样通过Western Blot分析其表达水平,总蛋白做对照。
  (2)2D-DIGE(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis)结合MALDI-TOF/TOF-MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)技术分析筛选并鉴定差异表达亚细胞蛋白。具体方法是2.0 mmol/L和8.0 mmol/L TCE处理L-02细胞后提取膜蛋白组分和核蛋白组分,未经TCE处理的L-02细胞所提取的膜蛋白组分作为对照组,共分成4批细胞提取。提取的膜蛋白组分经过准确定量后,进行荧光标记和双向电泳。获得的图像经过扫描后使用 DeCyder software package进行分析,寻找到差异表达的蛋白点后进行普通双向考染,接着对考染的胶进行挖胶酶解,最后获得的样品进行MALDI-TOF/TOF-MS鉴定分析,核蛋白组分也按照上述方法进行处理分析。
  (3)生物信息学分析。通过在线分析软件TMpred program对鉴定出来的膜蛋白组成差异蛋白进行跨膜结构域(transmembrane domain)的预测。STRING数据库构建L-02细胞经过TCE处理与未经过TCE处理差异表达的膜蛋白及核蛋白的相互作用网络。利用DAVID数据库对差异蛋白进行生物过程富集分析。
  (4)TCE染毒 L-02细胞后差异表达亚细胞蛋白的验证。分别以0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、8.0 mmol/L剂量的TCE染毒L-02肝细胞,24 h后,用Western Blot去检测差异表达膜蛋白和核蛋白,验证前期亚细胞蛋白质组学筛选鉴定结果的可靠性。
  结果:
  (1)TCE染毒L-02细胞24 h后的半数抑制浓度为16.0 mmol/L。采用1/2的IC50为最大染毒剂量,发现2.0 mmol/L,4.0 mmol/L,8.0 mmol/L TCE染毒组与对照组(0 mmol/L)相比均具有显著性差异,TCE对细胞的增殖活性产生影响显著。Na+/K+-ATPase在膜蛋白组分中的表达水平显著高于在全蛋白组分和胞浆蛋白组分(全蛋白质、胞浆蛋白和膜蛋白质的相对浓度分别为1.0±0.10、0.12±0.01和1.5±0.16,P<0.01)。Lamin B1在核蛋白组分的表达水平显著高于全蛋白和胞浆蛋白组分(全蛋白质、胞浆蛋白和核蛋白质的相对浓度分别为1.0±0.05、0.08±0.01和2.3±0.28,P<0.01)。这些结果表明膜蛋白质和核蛋白质均在各自组分得到良好的富集,可用于后续分析。
  (2)利用2D-DIGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法共鉴定出15个差异蛋白。通过TMpred数据库分析,发现在膜蛋白组分的15个差异蛋白中,有10个具有1个以上的跨膜结构域,说明这10个蛋白为膜蛋白。另外4个蛋白没有跨膜区,但它们的亚细胞定位与细胞膜相关。而在核蛋白组分的24个差异蛋白中,有22蛋白的亚细胞定位与细胞核相关。DAVID富集分析表明差异表达蛋白主要与 RNA过程相关,尤其在RNA剪接这一生物学过程出现明显的聚集。通过STRING分析,膜蛋白功能富集较松散,核蛋白功能富集较紧密。
  (3)不同浓度TCE处理前后膜蛋白ATP合成酶β亚基(ATP5B)、蛋白二硫键异构酶(P4HB)、核蛋白核不均一性核糖核蛋白H2(HNRNPH2)和上游识别序列结合蛋白(FUBP1)的表达水平。所有验证的蛋白变化趋势与蛋白质组学结果一致(P<0.05或P<0.01)。
  结论:
  (1)本研究应用一种提取亚细胞器的方法,该方法能有效地富集 L-02细胞的膜蛋白和核蛋白组分,2D-DIGE结合 MALDI-TOF/TOF-MS技术可实现差异亚细胞蛋白的鉴定分析,为外源性化合物致细胞的亚细胞蛋白质组学研究提供了新思路和新方法。
  (2) TCE染毒可以引起L-02肝细胞中膜蛋白质组表达水平的改变,这些差异蛋白在细胞死亡调节、细胞凋亡调节及细胞稳态出现聚集,相互作用分析显示功能富集比较松散。Western Blot结果显示ATP5B和P4HB的变化水平和蛋白质组学结果一致。
  (3)TCE染毒可以引起L-02细胞核蛋白质组表达水平的改变,这些差异蛋白主要在RNA剪切过程中出现聚集,相互作用分析显示功能富集比较密集。Western Blot结果显示HNRNPH2和FUBP1的变化水平和蛋白质组学结果一致。
[硕士论文] 钱秋梅
劳动卫生与环境卫生学 南华大学 2013(学位年度)
摘要:金属硫蛋白(Metallothioneins, MTs)具有重要的生物学功能,诸如清除自由基、重金属解毒、抗电离辐射及抑制细胞凋亡等。此外,金属硫蛋白还可作为环境中重金属污染的生物标志物。因此,建立简便、灵敏、快速、实用的金属硫蛋白的检测新方法不仅对于环境污染的监测、评价,而且对于MTs生物学功能的研究都具有重要意义。
  本文第二章建立了基于Hg-富T寡核苷酸和金纳米比色法检测MTs的新方法。在pH=8.0的B-R缓冲溶液中,Hg2+与富T寡核苷酸(TRO)形成T-Hg2+-T复合物,加入MTs后,MTs可与T-Hg2+-T复合物中的Hg2+结合,释放出TRO,且吸附在AuNPs表面上,导致体系的颜色发生改变。据此建立了比色传感测定MTs的新方法。在优化的实验条件下, MTs的浓度为2.56×10-8–3.39×10-7 mol·L-1时,体系的(A620/A520)与MTs浓度有良好的线性关系,且体系颜色发生由蓝到红变化,可用裸眼进行定量测定。回归方程为(A620/A520)=0.092+0.242c(×10-7mol·L-1),r=0.9841,检出限为7.67×10-9 mol·L-1。该方法操作简便、快速、灵敏、成本低,已成功应用于尿样中痕量MTs的测定。
  本文第三章基于8-羟基喹啉-5-磺酸(HQS)-镉配合物,建立了荧光猝灭法测定尿样中MTs的新方法。实验发现,在B-R缓冲溶液及阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化胺(CTMAB)存在时,镉离子(Cd2+)与8-羟基喹啉-5-磺酸形成HQS-Cd2+配合物,加入MTs后可使HQS-Cd2+配合物的荧光强度显著减弱。据此建立了一种测定尿液中MTs的荧光猝灭新方法。在最佳的实验条件下,体系的最大荧光峰位于524 nm。MTs的浓度在3.12×10-8–1.23×10-6 mol·L-1范围内与体系的荧光强度变化值呈良好线性关系,线性回归方程为ΔF=12.79+20.20 c(×10-7 mol·L-1),r2=0.9919,检出限为9.36×10-9 mol·L-1。该方法简便快速,灵敏度高,选择性好,用于尿样中MTs的测定,结果满意。
  本文第四章研究了8-羟基喹啉-5-磺酸-镉配合物与金属硫蛋白的反应机制。结果表明,HQS-Cd(II)配合物与MTs的相互作用主要由疏水作用力驱动,形成的HQS-Cd(Ⅱ)-MTs复合物中,HQS-Cd(Ⅱ)和MTs的结合比为11.9:1。依据Stern-Volmer方程和荧光寿命测定获得的结果,推测 HQS-Cd(Ⅱ)配合物的荧光被MTs猝灭的过程主要是一个静态猝灭过程。
[硕士论文] 岳霞
流行病与卫生统计学 宁波大学 2014(学位年度)
摘要:目的:采用小鼠上皮细胞株(JB6细胞),通过体外实验探索八种常见重金属混合污染物对细胞产生的毒性作用及机制,同时选用抗氧化剂茶多酚(-Epigallocatechin gallate,EGCG)探讨其对多种重金属体外联合毒性是否具有拮抗作用,为多种重金属的联合毒性的研究和防治提供科学依据。
  方法:检索相关文献,配置与宁波养殖水体中八种常见重金属污染物的混合浓度比例相似的毒物;由MTT试验检测不同浓度的重金属混合污染物对细胞生存率的影响,并确定后续试验的浓度;通过流式细胞仪检测染毒后细胞的周期和凋亡情况;荧光染料处理染毒后的JB6细胞,借助激光共聚焦显微镜观察其氧化应激产生情况;荧光素酶试验检测细胞中转录因子AP-1和NF-kB的表达情况;运用蛋白免疫印迹法检测细胞中蛋白的表达情况;在重金属混合污染物暴露细胞的基础上加或者不加10μM抗氧化剂EGCG,检测抗氧化剂组与未加抗氧化剂组细胞毒性、细胞周期、细胞内氧化应激的情况、Nrf2和HO-1蛋白的表达情况。
  结果:不同浓度的重金属混合污染物染毒细胞24h后,随染毒浓度的增加细胞毒性增大,处理组2-9与对照组相比差异均有统计学意义;流式细胞仪检测发现,细胞周期出现S期阻滞,细胞凋亡率增加;在H2DCFDA、DHA和Hoechst共同染色下经共聚焦显微镜发现细胞内ROS产生量增多,并且随浓度增高,ROS逐渐增多;不同浓度的重金属混合污染物暴露细胞12h后,经荧光素酶检测发现能够上调JB6细胞中转录因子AP-1和NF-kB的表达水平。染毒24 h后提取细胞蛋白,经蛋白免疫印迹实验检测发现C-jun蛋白和p65蛋白表达量随浓度的增大而逐渐升高。
  加入10μM抗氧化剂EGCG后,与未加抗氧化剂组相比,抗氧化剂组的细胞毒性得到一定抑制,细胞内ROS的产生量减少ROS期的阻滞作用有所下降,蛋白检测发现Nrf2和HO-1蛋白的表达减弱,这些结果证实了EGCG对重金属混合污染物的毒性有一定的拮抗作用。
  结论:重金属混合物可以阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,诱导细胞发生氧化应激,增加ROS的产生量,使JB6细胞转录因子AP-1和NF-kB表达水平增加,蛋白免疫印迹试验检测C-jun和p65蛋白的表达增加,由此可能促使细胞发生癌变。EGCG可以对重金属混合物引起的细胞毒性起到一定保护作用,减轻细胞周期的阻滞,对细胞内ROS的产生起到一定的拮抗作用,并能下调Nrf2和HO-1蛋白的表达。
[博士论文] 王大朋
卫生毒理学 苏州大学 2015(学位年度)
摘要:【目的】:无机砷是人类确认致癌物,但由于砷与机体作用十分复杂,加之无机砷化合物至今尚未成功复制出致癌动物模型,其确切的致癌机制仍未明确。目前砷致氧化应激机制与砷致表观遗传改变是砷致癌机制的两大热点假说。Keap1-Nrf2/ARE是机体最重要的抗氧化信号通路,其能够有效地保护机体免受各类氧化损伤。然而,近年来研究发现该信号通路持续活化则与肿瘤的发生、发展及耐药性密切相关。但该信号通路在肿瘤发生过程中的不同阶段是如何变化及其变化机制目前尚不清楚。本课题以低剂量亚砷酸钠(NaAsO2)长期染毒人皮肤角质形成细胞(Human keratinocyte cell, HaCaT)诱发恶性转化为载体,研究ROS及Keap-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白在恶性转化过程中不同阶段的动态变化,进而更深一步探讨导致该信号通路表达变化可能的分子机制,为砷致癌机制研究提供新思路,同时为为癌症的预防和治疗过程中合理有效地利用和控制该通路提供新策略。
  【方法】:1.建立低水平NaAsO2长期暴露诱发HaCaT细胞发生恶性转化模型:常规培养HaCaT细胞至贴壁并恢复形态后,换用含0.0和1.0μM NaAsO2的DMEM完全培养基连续培养至35代(约18周)。在该过程中不同阶段(21代、28代、35代)进行细胞生长动力学及MMP-9分泌活性检测,软琼脂克隆实验检测其克隆形成能力。2.低水平NaAsO2致HaCaT细胞恶性转化不同阶段(0、1、7、14、21、28、35代) Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关指标检测:采用流式细胞仪检测ROS水平变化;生化法检测MDA含量及SOD酶活力变化;采用Western-Blot方法检测细胞总蛋白及核浆蛋白中Nrf2、HO-1、Keap1及Bach1蛋白表达水平。3.低水平NaAsO2致HaCaT细胞恶性转化中后期(14、28、35代) Keap1基因启动子区DNA甲基化检测:提取相关代数 HaCaT细胞基因组 DNA,采用亚硫酸氢盐修饰后测序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)检测 Keap1基因启动子区 DNA甲基化情况。4.5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-dC)处理后各指标检测:将正常HaCaT细胞及1.0μM NaAsO2诱导的恶性转化的HaCaT细胞(T-HaCaT)分别培养于含有0或10μM5-Aza-dC的DMEM培养基中5天后,采用BSP法进行Keap1基因启动子区DNA甲基化检测,采用Western-Blot法检测Keap1-Nrf2/ARE信号通路各蛋白在总蛋白与核浆蛋白中的表达变化,软琼脂克隆法检测细胞克隆形成能力。
  【结果】:
  1.用1.0μM NaAsO2对HaCaT细胞进行连续染毒后发现:随着染毒代数的增加,HaCaT细胞生长速率逐渐加快,其倍增时间在35代时明显少于传代对照组细胞,MMP-9分泌水平在35代也明显升高,染毒35代细胞能够在软琼脂中形成明显的克隆集落,而正常HaCaT细胞在软琼脂中几乎不能生长(p均<0.05)。2.对低水平NaAsO2致HaCaT细胞恶性转化不同阶段ROS及Keap1-Nrf2/ARE信号通路各相关指标进行检测发现:在染毒初期(1代) HaCaT细胞内ROS水平明显升高,随后到染毒14代其表达呈轻微下降后上升趋势,而在14代以后随代数增加即恶性程度增加其ROS水平逐渐降低,在35代时其活力明显低于初代(0代) HaCaT细胞(p<0.05)。MDA含量在染毒1代时达到峰值,随后呈缓慢下降趋势,但与同代数传代对照组细胞相比均无统计学差异。在染毒初期(1代)细胞内的Nrf2及HO-1表达水平和SOD酶活力水平均有所上升。随后至暴露14代呈现先上升后下降趋势,在砷暴露后期(21代以后) Nrf2在细胞核中持续累积,且HO-1表达水平及SOD酶活力也呈持续升高趋势。相反的,Keap1蛋白表达水平在暴露14代以后则呈持续下降趋势。Bach1在胞浆中的表达水平随着染毒代数的增加逐渐升高,而总蛋白中Bach1表达水平与传代对照组相比则无明显变化。3.对低水平NaAsO2致HaCaT细胞恶性转化中后期Keap1基因启动子区甲基化水平检测发现:在0.0μM NaAsO2组14、28及35代细胞中,Keap1基因启动子区(TSS之前,-433bp~-1bp)存在较少的甲基化CpG位点,其甲基化率分别为6.0±3.1%、7.1±2.8%和6.3±3.8%,相互之间均无统计学差异。而在1.0μM NaAsO2组14、28及35代细胞中,Keap1基因启动子区(TSS之前,-433bp~-1bp)则呈现明显甲基化状态,且随着染毒代数的增加,其甲基化程度逐渐增加,其甲基化率分别为51.1±6.5%、77.1±6.5%和90.6±4.3%,与同代数0.0μM NaAsO2组细胞相比均有明显统计学差异(p<0.05),且三组之间比较也均有统计学差异(p<0.05)。而在TSS之后的第一启动子区内(+1bp~+159bp)的16个CpG位点无论在0.0μM NaAsO2组还是在1.0μM NaAsO2组均无甲基化发生。4.对亚砷酸钠所致的恶性转化的HaCaT细胞(T-HaCaT)进行5-Aza-dC处理后发现:经5-Aza-dC处理后T-HaCaT细胞中Keap1启动子区(TSS之前,-433bp~-1bp)甲基化位点明显减少,甲基化率下降至9.7±2.4%,较T-HaCaT细胞(93.1±2.4%)相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。5-Aza-dC能够明显恢复T-HaCaT细胞中Keap1在总蛋白和核、浆蛋白中的表达水平,降低T-HaCaT细胞Nrf2的核累积水平和HO-1的表达水平。此外,经5-Aza-dC处理后的T-HaCaT细胞软琼脂克隆形成能力也较未处理的T-HaCaT细胞明显降低(p<0.05)。
  【结论】:
  1.低水平亚砷酸钠长期染毒HaCaT细胞能够诱导其发生恶性转化。
  2.低水平亚砷酸钠长期暴露致HaCaT细胞恶性转化过程中伴随氧化-抗氧化系统的逐渐失衡,恶性转化中后期ROS水平逐渐降低,而Nrf2介导的抗氧化水平则持续升高。
  3. Keap1基因启动子区甲基化水平在恶性转化中后期逐渐升高导致Keap1蛋白表达降低是Nrf2介导的抗氧化水平持续升高的诱因。
  4.降低Keap1基因启动子区甲基化水平能够恢复Keap1蛋白表达水平,进而降低恶性转化细胞内Nrf2介导的抗氧化水平,最终减轻其恶性程度。
  5.砷致氧化应激机制与砷致表观遗传改变两大热点假说之间可能相互影响,共同参与到砷致肿瘤发生和发展过程中。
[硕士论文] 王亚萍
营养与食品卫生学 南昌大学 2015(学位年度)
摘要:近年来,由于农药和塑化剂在农业和工业生产过程中的大量应用以及不受控制和不合理的使用,这两类重要化学污染物对食品安全和人类健康产生的不利影响引起越来越多的关注。蛋白质作为生命体的必要组成成分,其结构的变化可能会造成生命体产生结构性或功能性的损伤,导致某些疾病。污染物小分子通过直接或间接途径进入机体后,可能会对机体蛋白质产生毒性作用,诱导蛋白质结构发生变化,进而影响蛋白质的生物学功能。
  本文以人血清白蛋白和胰蛋白酶为蛋白模型,运用多种光谱学手段结合分子模拟等技术研究了农药扑草净以及几种邻苯二甲酸酯类塑化剂与蛋白质的结合机制,探讨了这几种化学污染物对蛋白质结构功能的影响。本研究对从分子水平上了解污染物小分子在体内的分布、转运、代谢及毒性作用提供重要信息。
  本文主要内容如下:
  1.简要介绍了蛋白质的结构、功能及生物学性质,同时对小分子与蛋白质相互作用的主要研究方法进行了概述。
  2.运用多种光谱学方法包括荧光光谱法、紫外?可见吸收光谱法、圆二色谱法和红外光谱法结合分子模拟技术,在模拟生理条件下(pH7.4)研究了扑草净与人血清白蛋白(HSA)的结合特性以及蛋白质结构的变化。荧光数据显示扑草净对HSA的荧光猝灭为静态猝灭过程,两者之间的结合常数达103数量级,说明扑草净与HSA具有中等强度的结合能力。负的焓变值和正的熵变值表明扑草净与HSA的结合过程主要由疏水作用和氢键驱动。位点竞争实验显示扑草净的结合位点为site I,分子模拟结果显示,扑草净结合在HSA亚域IIA的疏水空腔,即site I,证实了位点竞争实验结果。紫外?可见吸收光谱、同步荧光光谱、圆二色谱和红外光谱分析表明,扑草净的加入导致HSA多肽链部分伸展,结构发生变化,α-螺旋含量降低伴随着β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量的增加。
  3.采用多种光谱方法和分子模拟技术测定了塑化剂邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)与HSA的相互作用模式。结果表明,DnOP和DEHP对HSA内源荧光的猝灭机制为形成复合物的静态猝灭,疏水作用和氢键为主要作用力,DEHP与HSA的亲和力略强于DnOP。DnOP和DEHP均结合于HSA亚结构域IIA(site I位),导致HSA二级结构发生变化,降低了HSA的α-螺旋的含量,并且DEHP诱导 HSA多肽链的伸展程度强于DnOP。蛋白质表面疏水性研究发现两种塑化剂的结合导致蛋白质表面疏水性增加,即蛋白质疏水空腔的暴露程度增加。同时,以吖啶橙(AO)作为荧光探针,通过优化实验条件,利用荧光光谱法对DnOP和DEHP进行定量分析,AO的荧光强度差值与DnOP和DEHP含量在1.20?11.76×10?5 mol L–1范围内呈良好线性关系,检出限分别为1.15×10?5 mol L–1和1.02×10?5 mol L–1。
  4.在模拟人体生理条件下(pH7.4),应用荧光光谱法、紫外光谱法和圆二色谱法并结合原子力显微镜和分子模拟技术,研究了邻苯二甲酸二甲酯(DMP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对胰蛋白酶的光谱性质、结构及催化活性的影响。DMP和DBP通过与胰蛋白酶结合形成基态复合物而猝灭胰蛋白酶的内源荧光,且在胰蛋白酶上都只有一个结合位点。298 K时,两者与胰蛋白酶相互作用的结合常数分别为3.92×103 L mol?1和4.94×103 L mol?1,DBP与胰蛋白酶的亲和能力略强于DMP。同步荧光光谱、紫外光谱、圆二色谱和红外光谱分析表明,DMP、DBP的加入均导致酶构象发生变化,蛋白质多肽链重排。分子模拟和酶活性测定结果显示,DMP、DBP主要与胰蛋白酶的催化三联体(His57,Asp102和Ser195)发生相互作用,导致酶活性被抑制。原子力显微镜图像显示,DMP、DBP的存在引起胰蛋白酶的表面形态发生变化,蛋白质发生聚集。在pH7.0的BR缓冲液中,DMP、DBP的荧光强度与浓度之间存在线性关系,线性范围为3.32?47.62×10–7 mol L?1,DMP和DBP的检出限分别为1.58×10–7 mol L?1和2.43×10–7 mol L–1。
[硕士论文] 季星岐
生物学 江苏大学 2016(学位年度)
摘要:镉是一种具有很强生物毒性的重金属。它可通过饮食进入人体,并在人体内积累,造成机体损伤。镉在人体内积累后不但能导致骨骼畸形,肾脏损伤和癌症的发生,而且还能导致机体脂代谢紊乱,而脂代谢紊乱会导致心脑血管疾病的发生。近年来,有越来越多的统计学分析结果发现镉能诱导哺乳动物产生心脏病、高血压等疾病,然而其分子机制却不是很清楚。本课题从脂代谢过程中血清胆固醇的运输问题入手,着重研究了镉是如何导致血清中胆固醇含量发生变化的,并且通过分子生物学方法解释血清中胆固醇含量发生变化的机制。
  本研究以小鼠为模式动物,通过喂养小鼠含不同镉浓度的食物来模拟环境镉污染现象,然后取小鼠血清和组织进行胆固醇含量的检测,并进行脂代谢相关蛋白的检测,同时在细胞水平进行验证。
  我们首先建立小鼠模型,用含有不同镉剂量的有脂或无脂饲料(0ppm、10ppm、100ppm、1000ppm)喂养小鼠7天。比较对照小鼠和镉暴露小鼠,发现镉暴露小鼠血清中胆固醇和甘油三酯显著上升,且上升幅度与镉剂量线性相关,脂肪组织中胆固醇下降显著,且下降幅度与镉剂量线性负相关。有脂饲料喂养小鼠肝脏中胆固醇上升,但不呈剂量依赖关系;无脂小鼠肝脏中胆固醇略微下降。分析胆固醇代谢相关蛋白ABCA1、OSBP、LDLR、HMGCR,结果表明镉处理后胆固醇输出途径的两个蛋白,ABCA1蛋白上升,OSBP蛋白下降,并且在HepG2细胞和Huh7细胞上得到验证。镉处理后能导致人细胞HepG2、Huh7培养基上清中胆固醇量上升。RNAi干扰技术沉默ABCA1的表达逆转了镉对细胞胆固醇输出的促进。同样,过表达OSBP能部分逆转镉对细胞胆固醇输出的促进。镉导致小鼠肝脏、脂肪、肾脏、脾脏、肺中LDLR mRNA显著下降,但是,胆固醇在小鼠肝脏和脂肪中的变化不一致,所以 LDLR在各个组织中的功能还有待进一步研究。HMGCR是细胞内胆固醇合成途径的限速酶,镉导致它在肝脏中的mRNA下降,但是与镉导致小鼠肝脏中胆固醇的增加不一致,所以 HMGCR在镉机体毒性中的作用同样有待进一步研究。
  由此我们推断,镉促进ABCA1的积累及OSBP的下降是导致小鼠血浆内胆固醇上升的一个重要原因,这也可能是镉导致脂肪代谢紊乱从而导致心血管疾病的因素。
[硕士论文] 刘洪茂
劳动卫生与环境卫生学 安徽医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:以体外培养小鼠睾丸间质细胞系 TM3细胞为模型,研究镉对 TM3细胞的毒性作用,进而探讨镉对TM3细胞毒作用的分子机制。
  方法:(1)给予不同浓度的CdCl2(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)处理TM3细胞,分别孵育不同时间(4h,8h,12h,16h,24h),采用CCK-8法检测各组细胞活力。
  (2)给予20μM CdCl2处理TM3细胞不同的时间(4h,8h)后收集细胞及上清液,采用ELISA法测定细胞上清液中睾酮的水平,采用western blot和RT-PCR法检测睾酮合成通路关键酶蛋白和mRNA的表达水平。
  (3)给予20μM CdCl2处理TM3细胞不同的时间(4h,8h)后收集细胞,采用western blot和RT-PCR法检测氧化应激相关蛋白和mRNA的表达水平。
  (4)给予20μM CdCl2处理TM3细胞不同的时间(4h,8h)后收集细胞,采用western blot和RT-PCR法检测内质网应激相关蛋白和mRNA的表达水平。
  结果:(1)不同浓度的镉(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)处理4h后,5μM、10μM和20μM组细胞的存活率与同一时间点对照组比较没有差异,40μM组细胞的存活率明显低于同一时间点对照组(p<0.01);不同浓度的镉(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)处理8h后,5μM组细胞的存活率与同一时间点对照组比较略有降低,10μM、20μM和40μM组细胞的存活率与同一时间点对照组明显降低(p<0.01);不同浓度的镉(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)处理12h、16h、24h后,各处理组细胞的存活率均低于同一时间,并具有明显的剂量效应关系(p<0.01)。
  (2)给予20μM CdCl2处理TM3细胞不同的时间(4h,8h),镉处理组细胞上清睾酮含量明显低于对照组睾酮含量(p<0.01);镉处理组TM3细胞的StAR、P450scc和17β-HSD mRNA的表达水平与对照组比降低(p<0.05, p<0.01),且显著下调镉处理组TM3细胞StAR、P450scc、3β-HSD、P45017α和17β-HSD的蛋白的表达水平(p<0.05, p<0.01)。
  (3)给予20μM CdCl2处理TM3细胞不同的时间(4h,8h),显著诱导镉处理组TM3细胞HO-1蛋白和mRNA的表达水平,并具有明显的时间效应关系(p<0.01);然而镉处理对TM3细胞HO-2的蛋白表达没有明显的影响;镉处理8h组SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px及CAT的mRNA表达水平与对照组的差异均具有统计学意义(p<0.05, p<0.01)。
  (4)给予20μM CdCl2处理TM3细胞不同的时间(4h,8h),显著性上调镉处理组内质网分子伴侣GRP78蛋白和mRNA的表达,具有明显的时间效应关系(p<0.01);此外,镉显著诱导GRP94 mRNA表达,也具有明显的时间效应关系(p<0.05, p<0.01),提示ATF6信号通路被激活。镉处理显著诱导TM3细胞PERK蛋白的磷酸化水平(p<0.01);镉处理明显增加TM3细胞eIF2α蛋白的磷酸化水平,具有时间效应关系(p<0.05, p<0.01);此外,CHOP的蛋白表达水平在镉处理组也明显增加,并且随镉处理的时间延长,诱导作用更加明显(p<0.01),提示PERK信号通路被激活。镉处理诱导TM3细胞IRE1α蛋白的磷酸化水平,具有明显的时间效应关系(p<0.05, p<0.01);此外,镉处理组JNK蛋白的磷酸化水平明显高于对照组,也具有明显的时间效应关系(p<0.01),提示IRE1信号通路被激活。
  结论:(1)镉处理能够抑制TM3细胞的睾酮合成和分泌,镉对TM3细胞睾酮合成的抑制作用可能与镉下调睾酮合成酶mRNA和蛋白的表达有关。
  (2)镉处理诱导TM3细胞发生氧化应激和内质网应激,氧化应激和内质网应激可能在镉诱导的TM3细胞损伤中起重要作用。
[博士论文] 严茂胜
劳动卫生与环境卫生学 华中科技大学 2013(学位年度)
摘要:甲状腺干扰物(Thyroid disrupting chemicals,TDCs)是指能够作用于下丘脑-垂体-甲状腺轴或直接作用于甲状腺激素受体(Thyroid Hormones Receptor,TR),影响体内甲状腺激素(Thyroid Hormones,THs)代谢及作用的外源性化合物。PCB153是生物和人体组织中含量最高的PCBs同系物,其含量与机体总PCB负荷具有很好的相关性;p,p’-DDE是DDT在环境和机体内存留时间最持久、浓度最高的代谢产物,是环境中DDT长残留期的标志物。PCBs和p,p’-DDE对人和实验动物甲状腺功能具有明显的干扰作用。
  本研究以PCB153和p,p’-DDE作为受试物,以新生期SD大鼠作为研究对象,给予不同低剂量的PCB153和p,p’-DDE,建立大鼠暴露模型;本研究主要观察PCB153和p,p’-DDE单独或联合染毒对大鼠甲状腺生长发育,血清THs的影响,并探讨与THs合成、分泌、代谢密切相关的机制,旨在为进一步研究此类TDCs对甲状腺系统的毒性作用及其机制提供科学依据。
  第一部分:PCB153和p,p’-DDE单独及联合染毒对大鼠甲状腺及THs的影响
  目的:PCB153和p,p’-DDE单独或联合染毒对大鼠甲状腺及THs的影响。
  方法:对新生期的仔鼠从出生后第3天至第15天进行染毒,隔天一次,共7次。按照1ml/kg体重的剂量,经口灌胃进行染毒。PCB153单独暴露实验:溶剂对照组,0.025mg/kgPCB153,0.25mg/kgPCB153,2.5mg/kgPCB153。p,p’-DDE单独及与PCB153联合暴露实验:溶剂对照组,0.1mg/kg,p’-DDE,1mg/kg,p’-DDE,10mg/kgp’-DDE,0.25mg/kgPCB153+1mg/kgp,p’-DDE,2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE。每次染毒前,称取动物体重(哺乳期);染毒结束后,每周称取动物体重一次。所有动物处死后分离甲状腺、大脑、肝等器官,称重后计算脏器系数。采用ELISA试剂盒检测血清中TT4、FT4、TT3、FT3、TSH、TRH。Morris水迷宫定位航行实验、空间探索实验衡量动物空间学习记忆能力。
  结果:与对照组相比,2.5mg/kgPCB153组大鼠定位航行实验的潜伏期和总路程明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。在出生后21天时,与对照组相比:0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组甲状腺脏器系数,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比:p,p’-DDE单独及与PCB153联合组甲状腺脏器系数、2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组肝脏脏器系数升高,差异有统计学意义(P<0.05)。对大鼠出生后21天(PND21)血清甲状腺激素影响:与对照组相比,0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组大鼠血清TT4、FT3、TT3水平、各染毒组TRH水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各暴露组大鼠血清TT4,FT3(除0.1mg/kgp,p-DDE暴露组)明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在出生后50天时,与对照组相比,各暴露组大鼠血清TT4、TT3、FT4(2.5mg/kgPCB153组)、FT3(0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153)、TSH(0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153)水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各PCB153组大鼠血清TRH水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,大鼠血清TT4(各暴露组)、FT4(10mg/kgp,p'-DDE组)水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与PCB153同剂量单独暴露组相比:大鼠血清TT3、FT3水平在0.25mg/kgPCB153+1mg/kgp,p’-DDE、2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明PCB153与p,p’-DDE联合对大鼠(PND50)血清FT3水平影响存在交互作用(F=9.49,P<0.05)。
  结论:PCB153、p,p’-DDE单独和/或联合暴露,会对大鼠甲状腺的生长发育产生影响。PCB153、p,p’-DDE单独和/或联合暴露后,大鼠体内甲状腺激素稳态的遭到破坏。PCB153可能会对大鼠的学习、空间记忆能力产生不良影响。
  第二部分:PCB153和p,p’-DDE单独及联合染毒甲状腺干扰机制探讨
  目的:研究探讨PCB153和p,p’-DDE单独及联合染毒对甲状腺的干扰机制。
  方法:采用ELISA试剂盒检测血清中NIS、TG、TPO、TTR、ROS、MDA、GSH-PX、SOD水平。用RealtimeRT-PCR技术检测出生50天后大鼠肝脏组织中TR(TRα1、TRβ1、TRβ2),脱碘酶(D1,D2),肝组织代谢酶(CYP1A1、CYP2B3、UGT1A1、UGT1A9)、甲状腺激素跨膜转运蛋白(MCT8)、视黄醇类X受体(RXRα)、ERK1/2信号通路(Kras1、KRaf1、MEK1、ERK1、ERK2)等基因mRNA表达情况,用Western blot检测出生50天后大鼠肝脏组织中TRβ1、RXRα、总ERK1/2、磷酸化ERK1/2的蛋白表达情况。
  结果:21天时,与对照组相比:大鼠血清TPO(各PCB153组)、NIS(0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组)水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。PCB153染毒对大鼠血清TG、TTR水平有性别差异,与对照组同性别相比,雄与雌性大鼠在0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组TG、TTR水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各PCB153染毒组大鼠血清ROS、MDA水平上升,差异有统计学意义(P<0.05);0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组GSH-PX、SOD水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各染毒组大鼠血清ROS(除0.1mg/kgp,p’-DDE暴露组)水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。50天时,与对照组相比,大鼠血清TPO水平在各PCB153组,TG水平在10mg/kgp,p’-DDE组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);PCB153染毒TTR水平影响有性别差异,与对照组同性别相比,雌性大鼠在0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组大鼠血清TTR水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各PCB153暴露组大鼠血清ROS、MDA水平上升,差异有统计学意义(P<0.05);各PCB153暴露组大鼠血清GSH-PX、SOD水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。
  与对照组同性别相比:雄性大鼠中,肝脏组织TRα1mRNA表达水平在各PCB153、10mg/kgp,p’-DDE,TRβ1mRNA表达水平在各PCB153(除0.25mg/kgPCB153组)、p,p’-DDE组(除1mg/kgp,p’-DDE组),TRβ2mRNA表达水平在各p,p’-DDE组中及联合组明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);雌性大鼠中,TRα1mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组、TRβ1mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE中,TRβ2mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153,各p,p’-DDE(除1mg/kgp,p’-DDE组)组及联合组明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明,p,p’-DDE与PCB153联合对雄性大鼠(PND50)肝脏组织TRβ1mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=10.00,P<0.05)。
  与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织D1mRNA表达水平在各PCB153组中、p,p’-DDE单独及与PCB153联合组中,D2mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);雌性大鼠肝脏组织,D2mRNA表达水平在0.25mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153、1mg/kgp,p’-DDE、10mg/kgp,p’-DDE、2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。
  与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织CYP1A1mRNA表达水平在各PCB153组、UGT1A1mRNA表达水平在各PCB153组、各p,p’-DDE单独组,UGT1A9mRNA表达水平在0.025mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组、各p,p’-DDE组中,CYP2B3mRNA表达水平在0.025mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153组、各p,p’-DDE单独组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。雌性大鼠肝脏,CYP1A1mRNA表达水平在各p,p’-DDE单独组,UGT1A1mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组中、UGT1A9mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明,p,p’-DDE与PCB153联合对雄性大鼠(PND50)肝脏组织CYP1A1mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=10.28,P<0.05)。
  与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织MCT8在各PCB153组中、1mg/kgp,p’-DDE、10mg/kgp,p’-DDE组中,RXRαmRNA表达水平在各PCB153组,10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);雌性大鼠肝脏组织,MCT8mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE组中明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),RXRαmRNA表达水平在各个PCB153组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。
  与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织Kras1mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE组中、Kraf1mRNA表达水平在0.25mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组,ERK1mRNA表达水平在10mg/kgp,p’-DDE组,ERK2mRNA表达水平在0.1mg/kgp,p’-DDE、10mg/kgp,p’-DDE暴露组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05);而MEK1mRNA表达水平在各PCB153暴露组中表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),在10mg/kgp,p’-DDE组中表达水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。雌性大鼠肝脏组织Kras1mRNA表达水平在1mg/kgp,p’-DDE组中,Kraf1mRNA表达水平在2.5mg/kgPCB153组,MEK1mRNA表达水平在1mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。析因分析表明,p,p’-DDE与PCB153联合对雄性大鼠(PND50)肝脏组织Kraf1、Kras1、MEK1mRNA表达水平的影响存在交互作用(F=8.33、6.53、8.19,P<0.05)。
  与对照组同性别相比,雄性大鼠肝脏组织总ERK1/2蛋白表达水平在0.025mg/kgPCB153、2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中,p-ERK1/2蛋白表达水平在2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中,TRβ1蛋白表达水平在2.5mg/kgPCB153、10mg/kgp,p’-DDE组中,RXRα蛋白表达水平在0.25mg/kgPCB153+1mg/kgp,p’-DDE蛋白表达水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。雌性大鼠肝脏组织中RXRα蛋白表达水平在2.5mg/kgPCB153+10mg/kgp,p’-DDE组中明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1)PCB153单独暴露可以抑制TPO、NIS、TG,而p,p’-DDE则对TPO产生抑制作用,对合成THs产生影响。
  2)PCB153抑制大鼠体内TTR水平,影响大鼠体内甲状腺激素转运。
  3)PCB153和p,p’-DDE能上调雄性大鼠MCT8表达。
  4)PCB153和p,p’-DDE能上调脱碘酶和代谢酶的基因表达,干扰THs代谢。
  5)PCB153和p,p’-DDE能干扰肝脏TR及核受体RXRα,干扰THs稳态。
  6)PCB153和p,p’-DDE能改变机体氧化应激状态,并激活ERK1/2信号通路,调节基因表达。
[硕士论文] 杨莉
劳动卫生与环境卫生学 华中科技大学 2013(学位年度)
摘要:随着纳米材料的发展,人们对纳米颗粒的暴露机会越来越多。纳米颗粒广泛见于纳米材料的生产和使用。此外,工业环境的热加工生产,以及大气环境污染,使得生产工人和普通人群均可接触到它,因此其潜在的健康影响将成为一个重要的研究领域。已有研究证明,纳米颗粒可进入血液系统,分布全身,导致心血管疾病。有研究表明,炎性复合体(a protein complex)可介导炎性反应的发生;胞内K+外流,即降低胞内K+离子浓度,是炎性体激活的前提条件之一。本实验旨在为外向K+通道在炎性反应中的作用提供一定的实验依据。
  目的:研究探讨电压依赖性外向K+通道(voltage dependent potassium channel,Kv)在纳米二氧化硅(SiO2)致人脐静脉内皮细胞毒性反应中的作用,以及K+外流与炎性反应的关系。
  方法:第一部分实验体外培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)。以细胞正常培养为阴性对照组。单独添加20mg/ml纳米SiO2为阳性对照组。在20mg/ml纳米SiO2基础上,再添加不同剂量的特异性K+通道阻断剂斑蝎毒素MGTX(Margatoxin,终浓度为0.1、1、10、100nM)处理细胞为阻断剂组,检测各组细胞存活率,以及细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、肿瘤坏死因子(TNF-a)以及白介素-6(IL-6)释放量,探讨通道阻断与否对各项指标的影响。第二部分实验运用全细胞膜片钳测定细胞上外向Kv电流,即时加入K+通道阻断剂(TEA、4-AP以及MGTX)验证。由拟合曲线求得各阻断剂该K+电流的半数抑制浓度(ID50)。以正常培养的细胞为对照组,加入不同浓度(20mg/ml、40mg/ml)的纳米SiO2处理细胞,记录Kv最大电流幅值得到最低作用剂量,电流-电压曲线以及通道动力学变化。同时运用免疫荧光技术初步观察细胞膜外向K+通道亚型Kv1.3通道的表达。
  结果:加入K+通道阻断剂MGTX后,与阳性对照组比较,随着阻断剂剂量增高细胞存活率有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。LDH漏出率先降低后升高,最终仍显著低于阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。MGTX作用下纳米SiO2诱导细胞释放TNF-a量显著降低,与阳性对照比较差异有统计意义(P<0.05)。低剂量MGTX(0.1nM)即可显著降低细胞IL-6的释放量(P<0.05)。指标标化分析表明,三种K+通道阻断剂中4-AP对纳米SiO2毒性的作用最为显著,MGTX则处于中间位置,TEA的作用最弱。通过全细胞膜片钳模式记录到HUVECs细胞膜上存在一个激活和失活都较缓慢、具有电压依赖性和延迟整流特性的外向电流。K+通道阻断剂TEA、4-AP以及MGTX使得该外向K+电流受到不同程度的抑制。5mM4-AP可完全阻断该电流,且冲洗去除后电流不能恢复。100nM MGTX可部分阻断该电流,且冲洗后电流能部分恢复,这说明所记录的电流是Kv1.3通道的电流。与对照组比较,20mg/ml纳米SiO2使Kv电流最大幅度值增加了63.9%,但差异尚无统计学意义(P>0.05);而40mg/ml纳米SiO2使之增高了120.2%,差异有统计学意义(P=0.0385)。给予细胞不同电压刺激,在纳米SiO2作用下外向Kv电流逐渐增大,与对照比较差异有统计学意义(P<0.05)。通道动力学分析发现,纳米SiO2可使外向Kv通道稳态激活曲线显著左移,半数激活电压V1/2由11.96±1.17mV左移至4.25±1.55mV,斜率因子k由13.54±1.16显著降低至11.45±1.49,与对照比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光实验观察到,加入纳米SiO2后细胞变为不规则形,细胞膜断裂,细胞核破碎等,表现明显的细胞毒性变化。在细胞膜完整部位荧光强度增强,Kv1.3表达量升高。
  结论:MGTX可抑制纳米SiO2诱导的人血管内皮细胞毒性反应,且广泛外向型K+通道阻断剂4-AP的抑制作用更显著。HUVECs细胞上存在外向Kv通道,表现延迟整流特性。纳米SiO2可诱导细胞发生毒性反应,外向Kv通道表现为活性增强,开放速率增高,外向K+电流增加。外向Kv通道可能在纳米SiO2致人血管内皮细胞炎性反应中发挥早期信号作用。
[硕士论文] 刘燕敏
生物学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:随着现代化工业的不断发展,镉暴露到空气、土壤等越来越多,造成严重的环境污染。镉通过食物链进入人体,其在体内清除时间长达40年。镉暴露会对肝、肾、肺等多种器官造成毒性损伤,引发多种疾病,如高血压、高血脂等。重金属会对免疫系统产生毒副作用,但对于脾脏的毒性研究较少。因此本研究探讨镉暴露诱导小鼠脾脏及人B淋巴细胞系Ramos细胞中自噬的产生以及镉毒性的机理。
  本研究中,以小鼠和Ramos细胞为模型。通过连续喂养一周含镉饲料对小鼠进行镉暴露,建立小鼠镉中毒模型;采用0-5μM的镉处理Ramos细胞24 h,建立细胞模型,通过Western blot确定小鼠和Ramos细胞中自噬生物标识蛋白LC3-II增加,而P62的蛋白水平下降,并呈剂量依赖性。镉暴露致使细胞内绿色荧光强度增强,表明镉诱导细胞内酸性小体增多,以上实验结果说明镉可以促进脾脏组织及Ramos细胞的自噬过程。
  前期的实验发现VMP1蛋白在镉暴露的小鼠脾脏和Ramos细胞中累积,VMP1是一种含有6个疏水结构的穿膜蛋白,在哺乳动物中发现其与自噬有关。本研究利用RNA干扰技术检验VMP1在镉诱导自噬中的作用,利用siRNA抑制Ramos细胞中VMP1的表达,进而抑制镉暴露诱导的LC3-II上升,说明镉诱导Ramos细胞自噬依赖于VMP1。利用放线菌酮CHX抑制蛋白质的合成,检测Ramos细胞中VMP1蛋白的降解,镉暴露细胞CHX处理后,VMP1的稳定性显著增强,这可能是镉暴露诱导细胞中VMP1蛋白上升的主要原因。
  据报道活性氧(ROS)是诱发自噬的主要原因之一,本研究发现镉可以诱导细胞中ROS和钙离子上调,用ROS的清除剂生育酚TCP处理Ramos细胞后,镉诱导的ROS和钙离子上调受到抑制,同时镉诱导的自噬也被抑制。用钙离子通道IP3受体抑制剂2-氨基乙基二苯硼酸酯2-APB预处理Ramos细胞后,检测发现ROS没有显著变化,然而细胞质中钙离子的上调受到抑制,镉诱导的VMP1和LC3-II上升也受到抑制。这些结果表明镉产生的ROS对自噬的诱导依赖于细胞内钙离子的上调和VMP1蛋白的增加,并且在镉激活自噬的信号通路中,钙离子和VMP1蛋白是ROS的下游。
  采用流式细胞仪和Western blot研究镉暴露的Ramos细胞发现镉存在时Aninxin V阳性细胞增多并且凋亡标识蛋白表达PARP、Caspase3上升。自噬抑制剂CQ能够减缓镉诱导凋亡蛋白PARP、Caspase3的表达,阻止Aninxin V阳性细胞增多。并且抑制镉导致细胞膜破裂释放乳酸脱氢酶(LDH)。这些结果说明镉在Ramos细胞中诱导的自噬可以促进细胞凋亡。
[硕士论文] 徐春燕
公共卫生 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:氟是地球上广泛存在且人体必需的一种微量元素,与我们日常生活息息相关。随着研究的深入,氟对生殖系统等非骨相器官损害已日益受到人们关注。本研究旨在探讨活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介导的自噬在氟化钠(sodium fluoride,NaF)致卵巢凋亡中的作用,为氟化物生殖毒性的进一步研究提供思路。
  方法:40只初断乳SD雌鼠,适应饲养一周后随机分为四组(对照组,10 mg/L NaF染毒组,50 mg/L NaF染毒组,100 mg/L NaF染毒组),每组各10只。自由饮水染毒六个月后,采集卵巢组织。HE染色观察大鼠卵巢组织形态,TUNEL法检测SD大鼠卵巢组织总体凋亡水平,Western blot检测SD大鼠卵巢组织LC3和P62表达水平,免疫组化法检测卵巢组织caspase3和LC3的蛋白表达水平。体外原代培养大鼠卵巢颗粒细胞,经不同浓度NaF(对照组,0.2 mM,0.4 mM,0.6 mM)染毒24h后,流式细胞术检测卵巢颗粒细胞内ROS表达水平,Western blot检测不同剂量 NaF对卵巢颗粒细胞内自噬与凋亡相关蛋白的表达水平的影响。同时,用自噬抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)和ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)联合NaF对大鼠卵巢颗粒细胞进行染毒,24 h后Western blot检测自噬与凋亡相关蛋白表达水平。
  结果:与对照组比,NaF染毒组大鼠卵巢脏器系数无统计学差异(P>0.05)但HE染色发现,100 mg/L NaF染毒组卵泡数量减少且多闭锁,卵泡膜变薄或破损,颗粒细胞排列错乱,数量减少,细胞核萎缩或不规则,以及 TUNEL显示,100 mg/L NaF染毒组凋亡水平明显增强。Western blot结果显示,与对照组比,100 mg/LNaF染毒组LC3-II和P62蛋白表达水平显著升高,有统计学意义(P<0.05),而10 mg/L和50 mg/LNaF染毒组差异不明显(P>0.05),提示NaF不仅可导致卵巢组织损伤,而且还可诱导卵巢组织自噬体蓄积和凋亡。体外原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞NaF染毒结果显示,与对照组比,随着NaF染毒浓度的升高,ROS水平逐渐升高,且0.6 mM NaF染毒组ROS水平有显著性升高(P<0.05);0.6 mM NaF染毒组自噬与凋亡相关蛋白表达水平显著性升高(P<0.05),但0.2 mM和0.4 mMNaF染毒组自噬与凋亡相关蛋白表达差异不明显(P>0.05)。与单独NaF染毒组比,NaF+渥曼青霉素联合组颗粒细胞的自噬与凋亡相关蛋白表达水平显著降低(P<0.05),NaF+NAC联合组自噬与凋亡相关蛋白表达水平也显著降低(P<0.05)。提示NaF不仅可诱导卵巢组织凋亡,还可导致自噬体降解受阻,致使自噬体蓄积。NaF导致颗粒细胞的自噬由ROS介导,ROS介导的自噬参与了NaF致大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡。
  结论:NaF可引起卵巢组织ROS升高,致使卵巢组织发生凋亡和自噬体的蓄积,导致卵巢组织损伤。NaF致颗粒细胞的自噬由ROS介导,ROS介导的自噬参与了NaF致大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡。
[硕士论文] 杨凯
公共卫生与预防医学 重庆医科大学 2017(学位年度)
摘要:第一部分:亚慢性B[a]P暴露对SD大鼠海马中SNAP-25及GluR的影响
  目的:
  通过建立苯并[a]芘(Benzo(a)pyrene,B[a]P)所诱导的动物神经毒性模型,观察其对SD大鼠海马组织中谷氨酸(glutamate,Glu)含量的改变及对突触小体相关蛋白(Synaptosome-associated proteinof25 kDa,SNAP-25)、谷氨酸受体(glutamate receptor,GluR)表达的影响,为揭示SNAP-25及Glu在B[a]P所致神经毒性中所扮演的重要作用提供理论依据。
  方法:
  80只雄性SD幼鼠,日龄5天,随机分为溶剂对照组、B[a]P低剂量组(0.02 mg/kg)、B[a]P中剂量组(0.2 mg/kg)和B[a]P高剂量组(2.0 mg/kg),按分组及其体质量连续灌胃处理7周,溶剂对照组给以等量花生油处理。染毒结束后采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力;采用1H-磁共振波谱法(1H-MRS)检测Glu在相关脑区的代谢参数;电镜观察海马组织神经元、突触及细胞超微结构等变化。分别于染毒1周及7周末,分离海马组织,并采用免疫组化法及Western-blot测定海马组织中SNAP-25及谷氨酸受体(glutamate receptor,GluR)的表达情况。
  结果:
  (1)当B[a]P处理35天后,B[a]P处理组老鼠体重较对照组明显下降,尤以0.2和2.0 mg/kg组下降明显,差异具有统计学意义[F(3,76)=3.881,P=0.008];
  (2)Morris水迷宫显示,B[a]P处理组较溶剂对照组逃避潜伏期及游泳距离增加,而跨平台次数及在目标象限停留时间显著减少;
  (3)电镜结果示,B[a]P暴露组较溶剂对照组海马组织内质网和胞浆肿胀、扩大,形态不规则,海马组织中突触间隙明显增宽;
  (4)1H-MRS结果显示,与对照组(0.996±0.236 ppm)相比,随着染毒浓度的增加,海马中Glu的含量呈下降趋势(各染毒组分别为0.722±0.185,0.687±0.172和0.583±0.154 ppm);
  (5)与溶剂对照组相比,B[a]P暴露1周及7周后,海马组织中GluR1及GluR2表达均明显降低,而SNAP-25表达增加。
  结论:
  B[a]P亚慢性暴露可引起新生幼鼠学习记忆能力缺陷,改变海马组织的超微结构,其可能的神经毒作用机制在于通过降低Glu水平而改变Glu的传输,降低GluR的表达,增强SNAP-25的表达。
  第二部分:SNAP-25及GluR在B[a]P诱导神经毒作用机制的研究
  目的:
  探讨B[a]P对U87细胞活性及凋亡的影响,并通过观察改变SNAP-25蛋白的表达后其对GluR表达的影响。
  方法:
  采用MTT法观察B[a]P对U87细胞活性的影响;并通过AO-EB染色法、Hoechst33258染色法及annexinV-FITC/PI双染法进一步观察B[a]P对U87细胞的凋亡情况;B[a]P染毒后,采用Fluo-3 AM荧光探针检测细胞内[Ca2+]i含量;通过siRNA转染技术抑制SNAP-25蛋白的表达后,采用Western-blot及RT-PCR进一步观察其对GluR的影响。
  结果:
  (1)B[a]P染毒24 h后,U87细胞的细胞活性明显降低,呈明显的剂量-反应关系;
  (2)AO-EB染色法、annexin V-FITC/PI双染法结果显示B[a]P暴露组较对照组细胞凋亡率明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);Hoechst33258染色法显示,B[a]P暴露组部分细胞核固缩,染色质浓集,致密浓染,呈强蓝色荧光;
  (3)流式细胞术示,U87细胞各细胞周期比例(G0/G1:56.04%±2.78%;G2/M:12.44%±2.71%;S:9.05%±0.79%)较对照组(G0/G1:56.44%±2.44%;G2/M:11.79%±3.66%;S:8.57%±0.36%)无明显改变;
  (4)B[a]P可显著增加细胞内[Ca2+]i浓度;
  (5)下调SNAP-25蛋白表达后,细胞内GluR1和GluR2在mRNA及蛋白水平较B[a]P处理组明显增加。
  结论:
  B[a]P可降低细胞活性、引起细胞凋亡。通过下调SNAP-25的表达,细胞内GluR水平增加,表明B[a]P的神经毒性作用至少部分归因于SNAP-25表达的改变,进而影响Glu神经递质传递。
[硕士论文] 张家宇
劳动卫生与环境卫生学 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨α-LA对HepG2细胞中Nrf2信号通路的作用,并从谷胱甘肽合成过程中的限速酶——γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(γ-GCL),氧化型谷胱甘肽(GSSG)转变成还原型谷胱甘肽(rGSH)的限速酶——谷胱甘肽还原酶(GR)两个角度来探究α-LA通过Nrf2信号通路再生rGSH,拮抗CdCl2致HepG2细胞氧化损伤的作用机制。
  方法:本实验以HepG2细胞为研究对象,实验分组分别为对照组(不施加任何处理因素);25μM CdCl2单独作用组;50μMα-LA单独作用组;25μMCdCl2+50μMα-LA联合作用组;25μM CdCl2+50μMα-LA+5×10-4mg/mlBrusatol联合作用组;5×10-4mg/ml brusatol单独作用组。CdCl2和α-LA联合作用组按照50μMα-LA浓度进行预处理8h,CdCl2+α-LA+ brusatol联合作用组按照50μMα-LA和5×10-4 mg/ml brusatol浓度进行预处理8h,brusatol单独作用组按照5×10-4mg/ml brusatol浓度进行预处理8h,然后按上述分组中α-LA、CdCl2和brusatol相应的浓度进行染毒,染毒16h后收取细胞。采用Western blot技术检测HepG2细胞内Nrf2、p-Nrf2、GCLC、GCLM和GR的蛋白表达水平,用荧光定量PCR技术检测GCLC、GCLM和 GR的 mRNA表达水平;用 rGSH和 GSSG检测试剂盒检测 rGSH的水平及rGSH/GSSG比值;用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测HepG2细胞的活力。
  结果:与对照组相比,CdCl2单独作用组Nrf2和p-Nrf2蛋白表达水平下降,GCLC、GCLM和GR的mRNA表达水平下降,蛋白表达水平下降,rGSH的水平及rGSH/GSSG比值显著降低,细胞活力显著降低;与CdCl2单独作用组相比,α-LA和CdCl2联合作用组的Nrf2和p-Nrf2蛋白表达水平升高,α-LA和CdCl2联合作用组的GCLC、GCLM和GR的mRNA表达水平升高,蛋白表达水平升高,rGSH的水平及rGSH/GSSG比值显著升高,细胞活力显著升高;与α-LA和CdCl2联合作用组相比,CdCl2+α-LA+ Brusatol联合作用组的Nrf2和p-Nrf2蛋白表达水平下降,GCLC、GCLM和GR的mRNA表达水平下降,蛋白表达水平下降,rGSH的水平及rGSH/GSSG比值显著降低,细胞活力显著降低。
  结论:α-LA可以促进HepG2细胞Nrf2和p-Nrf2蛋白的表达,brusatol可有效的阻断Nrf2信号通路,同时可抑制α-LA对CdCl2致HepG2细胞中Nrf2和p-Nrf2的蛋白损伤的保护作用;α-LA能够通过Nrf2信号通路来增加GCLC、GCLM和GR的mRNA的表达,促进GCLC、GCLM和GR蛋白表达量的增加,进而促进rGSH的再生,升高rGSH/GSSG比值,拮抗CdCl2致HepG2的细胞毒性,提高HepG2细胞活力。
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