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[硕士论文] 时静
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:艾滋病在世界范围内迅猛传播,严重威胁着人类的健康和社会的发展。人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)具有变异快、耐药性强和难以清除的特点,至今仍无有效的防控手段。因此,基于新型作用机制的抗逆转录病毒治疗靶点的研发迫在眉睫。丝氨酸整合因子Ser5是最新发现的能抑制HIV-1感染性的宿主限制性因子,而HIV-1编码的附属蛋白Nef可以拮抗Ser5的限制作用,但其作用机制尚不明确。本课题将深入探索Nef如何拮抗Ser5,揭示二者相互博弈的分子机理,以期为开发艾滋病的治疗方法提供借鉴。
  首先,为验证Ser5的抗病毒活性可以被Nef拮抗,本研究检测了Ser5对HIV-1感染性的影响,结果发现过表达Ser5时,与HIV-1WT相比,HIV-1ΔNef毒株的感染性降低约20倍;在293T细胞以及HIV-1的靶细胞Jurkat-TAg中,Nef能同时降低病毒粒子、细胞膜表面和整个细胞Ser5的表达;抑制剂实验结果表明Nef能直接降解Ser5,二者具有直接相互作用,并且利用构建的不同Nef突变体初步筛出Nef与Ser5蛋白相互作用的功能区。以上研究表明Nef在细胞中直接降解Ser5,阻止其进入出芽的子代病毒粒子中,从而拮抗Ser5的限制作用。
  另外,为进一步探究Nef降解Ser5的通路,我们首先检测了内吞相关蛋白在Nef下调细胞膜表面Ser5的作用,结果表明细胞表面的Ser5内吞从是由AP-2接头复合物介导,其中AP-2σ2亚基发挥重要作用。为进一步确定细胞内Nef介导的内吞Ser5的去向,我们检测了早期、晚期内吞体和循环内体表面的Marker蛋白Rab5、Rab7和Rab11与Ser5的共定位。结果表明Nef明显促进了Ser5与这些Rab GTP酶家族蛋白的共定位。干扰AP-2、Rab5、Rab7和Rab11会减轻Nef介导的Ser5的降解,相反,过表达这些蛋白则会促进Nef对Ser5的降解。泛素可以介导膜蛋白从晚期内吞体进入到溶酶体,我们发现Ser5本身可以发生泛素化,K48和K63两种泛素连接形式均参与了Nef介导的Ser5的降解。最后,激光共聚焦呈像显示Ser5在Nef的作用下与溶酶体蛋白标志LAMP-1出现了明显共定位,使用溶酶体抑制剂NH-4Cl和bafilomycin A1可以明显阻止Nef对Ser5的降解。以上结果说明Nef拮抗Ser5是通过将其靶向内体-溶酶体途径进行降解来实现的。
  综上所述,我们的研究表明Nef主要通过下调细胞膜上Ser5表达量以及改变细胞内的蛋白转运途径来发挥拮抗作用。进一步研究发现,Nef能够介导Ser5在AP-2接头蛋白复合物的作用下完成内化,随后进入早期内吞体、晚期内吞体,最后在溶酶体中被降解,这表明HIV-1相关蛋白可以通过主动降解细胞内的限制性因子而逃避宿主的天然免疫,揭示这种作用机制将为将来开发特异性疗法提供借鉴。
[博士论文] 田斌
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的疾病,一直对全世界的公共卫生造成极大的威胁,并导致每年约59000死于狂犬病。狂犬病的致病原为狂犬病毒(Rabies virus,RABV),其逃逸宿主中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)天然免疫的机制目前仍未完全清楚。我们之前的研究发现,在小鼠和犬感染模型中,狂犬病毒实验室固定毒株(弱毒株)能够激活天然免疫反应,而野毒株则不能激活。星状胶质细胞是组成血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)的重要元件,其被证实可在中枢神经系统中通过激活天然免疫和调控BBB通透性来限制或清除病原微生物的感染,对中枢神经系统起到重要的保护作用。
  本文研究中,我们重点探索了星状胶质细胞在狂犬病毒感染时发挥的各方面功能。首先,为了验证本研究中所使用的狂犬病毒(DRV-AH08,简称DRV)具有野毒株的特性,我们建立了小鼠感染模型,发现DRV感染的小鼠死亡时间明显早于弱毒株B2c感染的小鼠,且DRV感染小鼠后并未表现出炎症反应和外周免疫细胞入侵中枢神经系统的现象,表明本研究中所使用的野毒株DRV具有野生型狂犬病毒的特性,符合后续实验需求。其次,我们分离、纯化和培养了原代星状胶质细胞(Primary astrocyte),并用DRV和B2c分别对原代星状胶质细胞进行感染,我们发现B2c表现为暂时性感染,而DRV则可以持续的感染星状胶质细胞。我们进一步比较了DRV和B2c感染星状胶质细胞后MAVS通路关键分子的表达水平,结果显示B2c感染后的MAVS通路激活水平显著高于DRV,且这种激活是由于病毒复制转录过程中产生的RNA引起的。因此,我们继续对狂犬病毒两种不同毒株感染星状胶质细胞后dsRNA的产生水平进行了分析,结果表明B2c感染星状胶质细胞后产生的dsRNA水平要明显高于DRV感染组。我们进一步利用MAVS和TLR7基因敲除小鼠进行了体内、体外的感染实验,发现B2c能够持续感染从MAVS基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,但依旧不能感染TLR7基因敲除小鼠中分离的星状胶质细胞,验证了MAVS通路是狂犬病毒强弱毒株感染星状胶质细胞后产生差异的关键通路。此外,我们还发现B2c感染星状胶质细胞后产生的与MAVS通路相关的炎症因子要明显高于DRV,与DRV感染相比,狂犬病毒B2c感染星状胶质细胞后能够显著增加体外BBB模型对大分子物质的通透性,且B2c感染的星状胶质细胞培养上清能显著降解紧密连接蛋白ZO-1。
  总之,本研究发现星状胶质细胞在限制狂犬病毒感染中发挥这重要作用,具体表现在它可以通过活化MAVS通路产生IFN和ISG来直接限制狂犬病毒弱毒株的复制,同时可以产生大量的炎症因子促使BBB通透性增加来促进中枢神经系统中的病毒清除;与之相反的,狂犬病毒的野毒株在感染星状胶质细胞后则可通过限制dsRNA的产生来逃避MAVS通路的激活,从而实现持续性感染,不改变BBB的通透性,使病毒逃避被清除。本研究结果为阐明狂犬病毒的野毒株逃逸天然免疫的机制奠定基础,并对狂犬病的临床治疗提供了新的思路。
[博士论文] 雷卫强
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:寄生线虫不仅给养殖业造成严重的经济损失,而且还可以感染人,严重影响人类的健康。WHO组织评估全球有超过10亿人口感染寄生线虫,在伤残调整生命年中,寄生线虫的影响超过了糖尿病和肺癌患者。大规模和长期抗寄生虫药物的使用已经诱导出寄生虫抗药性的产生,因此新药的开发迫在眉睫,而新型抗寄生线虫药物以及疫苗的研发需要对寄生线虫发育过程中关键基因的功能进行深入研究。蛋白激酶在寄生线虫发育生物学和生殖发育学等过程中发挥着重要作用,以蛋白激酶作为药物靶标治疗疾病的研究已有报道,但在寄生线虫中的研究还寥寥无几。
  RIOK-2蛋白激酶是一种新发现的非典型蛋白激酶,在酵母和人细胞核糖体生物合成、细胞周期调节等过程中发挥着重要作用。尽管如此,该分子在线虫中的功能还所知甚少。本项目选取人兽共患寄生线虫粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)作为研究对象,从结构和功能两方面对粪类圆线虫RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2进行了研究;同时利用模式生物自由生活的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的转基因和RNAi技术研究了Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ce-riok-2的功能。
  (一)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的结构分析
  本研究通过RACE-PCR获得了Ss-riok-2基因的cDNA序列,其中编码区为1572bp,共编码523个氨基酸。通过氨基酸比对发现编码的Ss-RIOK-2蛋白具有保守的功能结构域。利用生物信息学软件对Ss-RIOK-2蛋白三级结构进行同源建模,预测了Ss-RIOK-2蛋白与ATP、金属离子结合的关键活性位点,为开发以RIOK-2蛋白作为潜在的抗寄生虫药物靶标奠定理论基础。通过Genomewalker PCR获得Ss-riok-2基因的gDNA,其长度为1620bp,包含一个48bp的内含子。预测的Ss-riok-2基因启动子序列全长1308bp,含有真核生物保守的调控元件。
  (二)粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因的表达、转录水平及定位分析
  体外原核表达和纯化了Ss-RIOK-2融合蛋白,进一步的激酶活性实验验证了Ss-RIOK-2蛋白激酶具有自我磷酸化作用。通过转录组分析,Ss-riok-2基因在虫体各个阶段都有转录且在寄生雌虫中最高。转基因实验表明Ss-riok-2基因启动子可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。
  (三)秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶编码基因的功能分析
  预测的Ce-riok-2基因启动子序列全长1269bp,转基因实验表明Ce-riok-2基因启动子也可以驱动gfp基因表达在F1代幼虫的肠道组织。当幼虫进入deaur时期时表达减弱。反转录PCR检测到Ce-riok-2基因在性腺组织中也有转录。通过dsRNA饲喂法干扰Ce-riok-2基因在秀丽隐杆线虫中的表达,结果导致Ce-riok-2基因转录水平下调,同时引起Ce-vit-2基因转录水平上调且导致虫体发生以下表型变化:1.虫体的发育减慢;2.虫体不育;3.虫体的阴门突出;4.成虫的性腺细胞减少和细胞大小紊乱。
  本研究首次研究了寄生线虫粪类圆线虫Ss-RIOK-2蛋白激酶编码基因Ss-riok-2基因的结构和功能,并验证了自由生活线虫秀丽隐杆线虫Ce-RIOK-2蛋白激酶的功能。以上结果为进一步阐明RIOK蛋白激酶在秀丽隐杆线虫、粪类圆线虫及相关寄生线虫生长发育过程中的分子生物学功能奠定了基础。
[硕士论文] 胡锦阳
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)是一种常见且分布广泛,危害严重的肠道寄生线虫,主要感染犬、人和其它灵长类动物。由于粪类圆线虫独特的生活史,它可以在宿主体内和体外进行交替繁殖。同时粪类圆线虫自由生活雌虫具有性腺合胞体结构,与雌雄同体的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)结构非常相似,因此可以将转基因质粒显微注射至其性腺,达到研究其基因的目的。针对寄生线虫,目前没有有效的疫苗,只能依靠化学药物进行杀灭和控制。但是由于几十年来重复使用几种常用杀虫药物,使得虫体对其产生了耐药性,因此开发抗寄生线虫疫苗和寻找新的潜在的药物作用靶点迫在眉睫,而转基因技术则是应用于研究寄生线虫基因功能所必须的一种重要工具。
  起源于细菌和古细菌经过长期适应性免疫逐步形成的Ⅱ型成簇的有规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9(Cas9),CRISPR/Cas9],配合向导RNA(gRNA)成为CRISPR/Cas9系统,近年来被改造成为基因组高效定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、修饰效率高、成本低廉和适用于多种真核、原核生物等多种优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。目前CRISPR/Cas9遗传修饰技术在非寄生性的秀丽隐杆线虫中有很多应用,近几年来,该系统也己应用于在几种寄生原虫中。但是,CRISPR/Cas9是否能在寄生线虫中运用,并研究打靶基因的功能仍然是未知数。为此本课题主要进行了以下几个方面的研究:
  (1)改进和优化长爪沙鼠、建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型
  本实验对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,包括感染所使用的iL3数量(从1000条降至170条),缩短粪便的排虫时间(从35天缩短至11天),提高了感染率(从6.5%提高至77.8%),使粪类圆线虫感染长爪沙鼠实验动物模型更加适应我们的研究目的。同时首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型,DAPI染色寄生雌虫并观察细胞状态,测定宿主感染前后血液生理,血清生化等多个指标,发现阳性相比阴性嗜酸性细胞百分比增加,血红蛋白和红细胞计数都出现下降,说明虫体成功感染宿主并引起了宿主出血。对感染的比格犬,长爪沙鼠和子午沙鼠的十二指肠进行组织病理检查,可以观察到虫体。对沙鼠体内的寄生雌虫(PF),自感染三期(L3a),后寄生四期(PL4)进行形态学描述。
  (2)粪类圆线虫自由生活的雄虫的生殖细胞进行转基因研究
  以Ss-rps-21为启动子,构建表达GFP的转基因质粒pAJ20,用来分别注射自由生活的雌性成虫和雄性成虫。首先尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺,观察到P0代的性腺和子宫内的卵表达了GFP蛋白,其F1代L1全身广泛表达GFP蛋白,并且在其生殖原基(GP)处表达量最高。接着尝试将转基因质粒pAJ20通过显微注射到粪类圆线虫自由生活雄虫的睾丸,然后挑野生型雌虫与其交配,观察其后代表型。经过不断尝试虫体发育时期、注射部位和质粒浓度,发现虫体在体外23.5℃温箱发育40h,注射部位在雄虫咽部下方,质粒浓度为900-1000ng/ml时,可以观察到F1代L1表达GFP蛋白,虽然也是全身广泛表达以及在生殖原基处表达量较高,但是在虫体的头部和咽部表达量也较高。
  (3)CRISPR/Cas9系统在粪类圆线虫中应用
  本实验统计粪类圆线虫密码子使用情况,并分析了其使用密码子的偏好性,对CeCas9蛋白进行了优化,使其更好的在粪类圆线虫体内表达。在Wormbase上找到15个鼠类圆线虫(Strongyloides ratti)U6基因,多序列比对它们的蛋白序列,找到相对保守的位点,然后再往其上下游延伸,得到512bp大小的序列作为gRNA的启动子。同时利用软件和文献报道的规律设计8条gRNA打靶于Ss-dpy-2第一个外显子。为了验证软件设计的8条gRNA是否具有良好的打靶效率,做了spCas9/gRNA体外酶切效率检测实验,发现gRNA4、7和8切割效率较高。为了验证经优化的SsCas9和gRNA是否都在粪类圆线虫发生转录,我们将pAJ50-Cas9质粒和pXL-BACII-gRNA4显微共注射到粪类圆线虫自由生活的雌虫性腺中。提取后代虫体的RNA进行反转录PCR扩增。发现扩增得到SsCas9和gRNA片段,说明SsCas9和gRNA完成了转录,也表明构建的质粒的启动子Ss-rps-21和Sr-U6具有催化转录活性。我们针对gRNA4、7和8这3个打靶位点,构建相应的同源修复模板。将pAJ50-Cas9分别与pXL-BACII-gRNA4、pXL-BACII-gRNA7和pXL-BACII-gRNA8及其相应的同源修复模板进行显微共注射,提取后代的基因组,进行巢式PCR扩增鉴定,凝胶电泳没有发现扩增条带。扩增Ss-dpy-2第一个外显子测序,没有杂峰现象,说明Ss-dpy-2没有发生突变,CRISPR/Cas9系统仍然需要进一步探究。
  本研究对长爪沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型进行了改进和优化,首次建立子午沙鼠感染粪类圆线虫实验动物模型。通过粪类圆线虫雄虫的生殖细胞实现转基因,并解析Ss-rps-21启动子通过雄虫生殖细胞进行转基因F1代的表达谱。初步尝试构建适用于粪类圆线虫的CRISPR/Cas9系统,验证了Ss-rps-21和Sr-U6启动子活性,为后续的粪类圆线虫CRISPR/Cas9基因敲除系统的建立奠定了坚实的基础。
[硕士论文] 刘志祥
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大脑作为人体最为复杂、精密的器官,由数百亿个神经元构成。单个神经元通过突触结构与其他神经元连接并形成具有功能的神经网络,从而赋予动物个体意识与行为。基于组织样本投入的传统建库测序技术会掩盖神经元彼此间存在的异质性,不适用于单神经元研究,同时,不同神经元的形态、功能以及基因表达存在的差异性由表观遗传因素所决定。因此研究提出了一种对单神经元示踪标记及其细胞核分离的研究方法,并选取表观遗传的重要形式——DNA甲基化作为研究对象。
  在对重组腺相关病毒(rAAV)的构建工作中,本课题首先构建了表达目的核膜蛋白的腺相关病毒重组载体pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag,分别用广谱启动子CMV和神经元特异性启动子hSyn在细胞系转染实验体外表达和鼠脑神经元活体表达表达目的核膜蛋白。构建载体被转染进HEK-293T细胞以进行验证,转染后的细胞通过荧光显微镜观察,可见荧光信号呈圆形分布、边缘更加明亮,说明目的核膜蛋白如预期实现核膜定位标记。但通过病毒鼠脑注射实验对所包装重组病毒载体进行验证,未能在脑切片上观察到荧光信号。由于可能存在因启动子差异或是实验操作因素造成阴性结果的可能,本研究也构建包装了腺相关病毒重组载体rAAV-hSyn-eGFP-NLS,并对其进行活体注射,在脑切片可观察到大量被荧光标记的神经元,成功实现对海马投射内嗅皮层神经元的逆向标记,从而排除上述可能性。
  在分离被标记细胞核的研究过程中,本课题通过细胞转染的方式模拟被重组病毒标记的神经元。研究过程中,首先对转染后的细胞进行匀浆处理及密度梯度离心,以分离细胞核。分离到的细胞核形态完整且杂质较少。之后通过免疫共沉淀的方式对被标记细胞核细胞核进行捕获,所捕获细胞核阳性率约为70%,捕获率在65%~85%。同时对照组阴性细胞核漂洗后的残留率仅为0.18%,因此可认为实验组中阴性细胞核已基本漂洗干净,该实验方法可己满足后续研究需求。
  在利用单细胞进行DNA甲基化测序建库的研究过程中,本课题参照单细胞亚硫酸盐测序(scBS-seq)的方法,先后分别以寡量细胞及单个神经元作为建库投入,成功获得DNA甲基化测序建库。所建文库经琼脂糖凝胶电泳检测,文库片段分布大小与预期相符(300bp~500bp),同时条带明亮,满足上机测序要求。同时对测试样本的测序结果进行生物信息学分析,发现文库测序质量较好,且组间因建库操作造成的差异较小,因此认为该方法具有较好的可重复性。
  针对本课题所遇到AAV载体装载容量受限的问题,本文最后还对如何现有提高AAV装载容量的研究进行论述,并提出对衣壳蛋白编码基因cap进行人工进化的改进的新思路。此外也单细胞DNA甲基化测序技术在医学检测中的应用进行论述。
[硕士论文] 尹馨
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:自2013年H7N9亚型禽流感病毒在我国出现以来,该病毒不仅对我国的养禽业造成了重大的经济损失,而且严重威胁着人类的生命健康。截止到2018年3月2日,H7N9亚型禽流感病毒已经造成了1567人感染,死亡615人。
  为了解2013年以后H7N9亚型禽流感病毒在我国的流行情况及其生物学特性的变化。本研究选取了2013年7月-2017年1月期间分离到的84株H7N9亚型流感病毒,对它们进行了系统的评价。通过遗传演化以及关键分子特征的分析,H7N9病毒的表面基因HA,NA核苷酸的同源性分别为88%-100%和90%-100%,其余6个内部基因PB2,PB1,PA,NP,M和NS基因的核苷酸同源性分别为84.8%-100%,88.6%-100%,86.8%-100%,86.4%-100%,88.5%-100%和87.8%-100%。根据各基因的进化关系,可以将84株病毒划分为23个基因型,且以基因1,2型为主。最为重要的是,对病毒的分子特征进行分析发现,我国已经出现对禽类呈高致病性分子特征(裂解位点PKGKRTA↓R)的H7N9亚型禽流感病毒。
  家禽感染性试验表明,具有高致病性禽流感分子特征的H7N9亚型禽流感代表株A/chicken/Guangdong/SD008/2017(简称CK/SD008)对鸡只呈现高致病性(IVPI=3.0),并在鸡体内高效复制,在鸭的复制感染试验中,低致病性H7N9病毒和高致病性H7N9病毒均对鸭呈现低致病力,但低致病性H7N9病毒对鸭的适应性和在鸭群中的传播能力正逐渐的加强。
  选取代表不同基因型的28株低致病性H7N9病毒进行小鼠感染性试验,显示目前我国流行的低致病性H7N9病毒对小鼠呈现不同的致病力。所有毒株均能在小鼠的鼻甲和肺脏复制,其中15株病毒能引起小鼠不同程度的体重下降。高致病性H7N9亚型禽流感代表株CK/SD008病毒虽也能在小鼠的鼻甲和肺脏高效复制,但同样并不致死小鼠。然而,我们发现CK/SD008病毒在雪貂体内复制的过程中,能够发生PB2基因E627K,D701N的突变,纯化获得的两株具有PB2蛋白627K,701N的突变株,则表现出比2013年人源H7N9病毒更强的对小鼠的致病力。
  以上研究结果对于我们了解2013年以后我国H7N9亚型禽流感病毒的生物学特性变化具有非常重要的意义。为我国H7N9防控措施的制定提供了理论和实验依据,同时,也对人类感染H7N9病毒起到了预警作用。
[硕士论文] 徐海峰
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:H5亚型禽流感病毒大多数都是高致病性的病原,一旦发生感染可造成家禽的大规模死亡,使养殖户蒙受巨大的损失,同时H5亚型禽流感病毒也能感染人,甚至造成人员死亡。我国鸡群中存在的H5亚型禽流感病毒,按照HA基因的亲缘关系划分,主要是Clade2.3.2、Clade7.2和Clade2.3.4.4分支的病毒。禽流感病毒一直不断的发生基因变异,2015年零星发现Clade2.3.2分支出现新的小分支Clade2.3.2.1e,2016年在我国多个省份大范围监测到Clade2.3.2.1e分支,H5亚型不同分支之间抗原差异较大,并且随着时间的推移,差异性越来越大,原来以单抗为基础的检测方法逐渐出现更大的偏差和漏检现象,因此,需要不断的更新单抗来修订。为此,本研究用H5亚型高致病性禽流感Clade7.2、Clade2.3.4.4分支和C1ade2.3.2.1e分支的疫苗株,纯化后作为免疫原,结合单抗制备技术制备和筛选覆盖面较广的H5亚型禽流感单抗,进一步建立了以单抗为基础的免疫胶体金试纸条和渗透卡检测方法。
  本研究利用将Clade7.2分支疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7),Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(HSNl)(Re-10)作为免疫原,混合免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫之后,无菌取其脾细胞,将其与骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下进行细胞融合,经过间接ELISA方法及HI方法筛选得到6株能稳定分泌抗血凝素蛋白HA的单抗杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能与当前流行的分支反应,具有较好的广谱性。
  选用两株反应性较好的单抗2A10和2C8,用20nm大小的胶体金颗粒对2A10抗体进行标记,10000转离心纯化,得到金标抗体,以1∶8倍稀释喷涂于试纸条加样孔附近的玻璃纤维上;2C8以1.5mg/mL的浓度喷涂于检测线;羊抗鼠二抗以1mg/mL的浓度喷涂于质控线,组装成胶体金试纸条。利用免疫层析技术(GICA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现该胶体金试纸条能检出我国流行的H5亚型禽流感病毒,广谱性较好,对其他亚型不反应,特异性较好,最小检出的病毒量为24。为了进一步提高它的敏感性,我们将2C8单抗和羊抗鼠二抗点到渗透卡中,制备斑点金免疫渗滤卡,利用斑点金免疫渗滤法(DIGFA)检测H5亚型禽流感病毒,结果发现其最小检出的病毒量为22,敏感性得到提高。
  总之,本研究通过杂交瘤技术筛选出6株1B10、2A10、2C8、H2B1、3E6和4G9抗HA单抗;以单抗为基础材料,初步建立H5亚型禽流感病毒胶体金试纸条检测方法和H5亚型禽流感病毒斑点金免疫渗滤卡检测方法,渗透卡比胶体金试纸条灵敏性有所提高。
[硕士论文] 孙君帅
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:联合抗逆转录病毒疗法(Combmation antiretroviral therapy,cART)对静息CD4+T细胞、巨噬细胞等细胞中呈潜伏感染状态的HIV-1病毒很难发挥清除作用,其原因是呈潜伏感染的HIV-1病毒处于转录沉默状态,很难被靶向药物识别。HIV-1潜伏感染的形成与转录因子例如NF-κB、AP-1等的生物学活性密切相关。这些转录因子调控HIV-1前病毒DNA的转录作用受抑制或丧失,是静息CD4+T细胞中病毒转录起始受到抑制的主要原因之一。JunD是激活蛋白-1(Activating protein-1,AP-1)家族的成员之一,与c-Jun、JunB等家族其他成员相类似,其通过结合靶基因的启动子区调控基因转录。已有研究证明,AP-1家族的c-Jun等转录因子可以结合不同HIV-1亚型LTR上的AP-1结合位点,参与对HIV-1前病毒转录的调控。然而,JunD是否可通过结合LTR参与调控HIV-1前病毒转录,并借由此在HIV-1潜伏感染与病毒储存库的形成中发挥作用?尚未见相关研究。
  为回答上述科学问题,本研究基于可支持HIV-1复制的T细胞系Jurkat,采用CRISPR/Cas9技术,构建了敲除JunD细胞系,同时基于慢病毒载体系统,建立了稳定(过)表达JunD细胞系。借助上述细胞系,对JunD参与调控HIV-1前病毒DNA的转录激活作用进行了研究。首先,拯救HIV-1假病毒并分别感染敲除JunD、稳定(过)表达JunD和对照组细胞系,通过荧光素酶检测技术和real-time qPCR对HIV-1前病毒DNA转录水平的变化进行评价。荧光素酶活性检测结果显示,与对照组相比,敲除JunD可下调HIV-1前病毒DNA的转录水平约57.05±7.80%;稳定(过)表达JunD则可上调HIV-1前病毒DNA转录3.50±0.88倍。同时,qPCR结果显示,与对照细胞相比,敲除JunD的细胞系中HIV-1mRNA水平显著下调约85.15±4.90%;而稳定(过)表达JunD的细胞系中HIV-1mRNA水平则显著上调约1.64±0.12倍。此外,使用AP-1特异性抑制剂T5224处理JunD敲除的Jurkat细胞系并进行HIV-1假病毒感染。结果显示,JunD对HIV-1前病毒DNA转录激活的贡献率约占全部AP-1家族成员总体贡献的40.40±8.45%。
  其次,基于预测的LTR上JunD结合基序和报告质粒pGL3-Luc构建的荧光素酶报告系统,证实JunD可通过TGACATC基序与HIV-1LTR结合并激活转录;而对LTR上该基序进行突变后拯救获得的HIV-1假病毒,对Jurkat细胞系的感染水平则明显下降。再次,使用SAHA处理细胞,可基于激活细胞内JNK-JunD信号通路上调JunD磷酸化水平,并可剂量依赖性的显著提高HIV-1前病毒DNA的转录。而该激活作用在JunD敲除细胞系中则受到部分抑制。
  基于以上全部研究数据,本研究首次评价并初步证明了转录因子JunD参与调控HIV-1前病毒DNA的转录激活。该激活作用是通过特异性结合HIV-1的LTR来实现的,且激活强度与内源性JunD的磷酸化水平呈剂量依赖性。本研究发现的JunD参与HIV-1前病毒DNA的转录调控,很可能成为激活潜伏感染的HIV-1转录的新靶点,一方面促进对HIV-1潜伏感染形成机制的深入理解,另一方面,有助于探索激活潜伏感染HIV-1和清除其病毒储存库的新策略。
[硕士论文] 李彬酉
兽医公共卫生与食品安全 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一类特殊的人兽共患和食源性病原菌,它存在于正常的肠道菌群中,但却能够导致机体其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生儿脑膜炎等,严重威胁着人和动物的健康。有效疫苗的缺乏、耐药性的增加和生物被膜的形成给ExPEC防控带来了巨大的困难。
  生物被膜(Biofilm)是细菌的一种特殊生存形式。与浮游菌不同,生物被膜能够抵御机体的免疫清除作用,导致抗生素和消毒剂的作用效果下降,引起机体感染的反复发生。在食品加工设备和食品原料表面的生物被膜给食品安全造成严重危害。因此,研究生物被膜形成机制和控制对策具有重要意义。
  外膜蛋白TolC是构成革兰氏阴性菌外排泵的重要的成分,是细菌对多种抗菌药的抗性的重要原因。本实验室前期研究表明TolC蛋白缺失会造成ExEPC在M9高渗培养基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,转录组学分析发现TolC缺失后会引起Cpx双组份系统周质间隙蛋白CpxP编码基因的上调表达。Cpx双组份系统可响应细菌对高渗信号的识别,激活后能够抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系统可能在tolC缺失后影响ExPEC生物被膜形成中发挥作用。本研究通过对ΔtolC菌株中Cpx双组份系统感应蛋白CpxA和效应蛋白CpxR进行突变,探究其在ΔtolC菌株影响生物被膜形成中的作用。主要研究内容和结果如下:
  1.基因缺失菌株的构建
  设计引物以ExEPC PPECC42基因组为模板扩增cpxA上下游同源臂,并通过Overlap PCR方法连接,将同源臂插入自杀性载体pRE112,转化大肠杆菌x7213感受态细胞构建x7213-pRE-ΔcpxA。并以此为供体菌,分别以ExEPC PPECC42野生株及ΔtolC株为受体菌进行同源重组,利用Cm和SacB筛选得到ΔcpxA基因缺失株和ΔtolCΔcpxA双基因缺失株。利用同样方法,构建ΔcpxR基因缺失株和ΔtolCΔcpxR双基因缺失株。
  2.回补菌株和CpxA磷酸化位点定点突变菌株的构建
  以PPECC42基因组为模板,设计引物扩增cpxA基因全长,并插入pHSG396质粒,构建pHSG-cpxA表达载体,电转化至ΔtolCΔcpxA菌株中,构建回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA。运用同样的方法构建出Cm-R-ΔtolCΔcpxR。
  通过预测和翻译分析,找出CpxA磷酸化位点对应的核酸序列位点,设计点突变引物以pHSG-cpxA质粒为模板扩增出突变的质粒,测序鉴定后电转化ΔtolCΔcpxA菌株中,以构建CpxA磷酸化位点突变菌株M-A-ΔtolCcpxA。
  3.实验菌株的部分生物学特性研究
  首先测定试验菌株的生长情况,在M9和1/2M9培养基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失对ExPEC的生长速率无影响,试验菌株在8h后可以达到稳定期。
  其次使用7种抗菌药测定了试验菌株的MIC,结果表明ΔtolC和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR菌株对氯霉素和环丙沙星的敏感性显著升高,而cpxA和cpxR单缺失对这7种抗菌药的敏感性并未发生明显变化。
  4.试验菌株生物被膜形成能力分析
  使用结晶紫染色法测定试验菌株生物被膜形成能力,发现在M9高渗培养基中与WT相比ΔtolC菌株生物被膜形成能力显著下降;双基因缺失株ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR与WT相当;回补菌株Cm-A-ΔtolCΔcpxA和Cm-R-ΔtolCΔcpxR生物被膜形成能力恢复到ΔtolC的水平;M-A-ΔtolCΔcpxA生物被膜形成能力与WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培养基中均无差异。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培养基中试验菌株的生物被膜形成能力与M9中类似。
  5.扫描电子显微镜观察生物被膜细菌微观形态
  使用扫描电镜观察试验菌株生物被膜细菌微观形态发现在1/2M9+0.06mol/LNaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高渗培养基中ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈现与WT相似大量黏附于玻片表面,且菌体之间存在大量黏连,但ΔtolC菌株在玻片上黏附较少,细菌菌体之间黏连情况也较少。
  6.Curli菌毛合成能力分析
  刚果红平板试验表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培养基中,ΔcpxA和ΔcpxR单基因缺失突变株和ΔtolCΔcpxA、ΔtolCΔcpxR双基因缺失株能够形成与野生型菌株WT类似的rdar菌落形态,而Cm-A-ΔtolCΔcpxA、Cm-R-ΔtolCΔcpxR的菌落形态与ΔtolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA则可以形成与WT类似的菌落。在1/2M9-CR平板上试验菌株的菌落形态均与WT相似。这表明Cpx双组份系统确实在高渗条件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的过程中发挥了作用,而且是通过抑制Curli菌毛合成而影响的。
[硕士论文] 赵青青
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:流感病毒是引起人类流行性感冒的病原体。近年来随着流感病毒的流行,新的变异株不断产生,宿主范围不断扩大,病毒的致病性和传播能力也有不断增强的趋势,对公共卫生安全的危害日趋严重。流感病毒结构简单,基因组较小,可以通过移码及可变剪接等方式表达多种蛋白,但在宿主体内,仍需要借助宿主的蛋白质合成及运输系统、能量系统和可变剪接系统等完成自身的复制。另一方面,流感病毒入侵宿主后,可以被宿主的免疫系统识别,宿主免疫相关蛋白可以通过与病毒蛋白的相互作用,限制流感病毒的复制。由此可见流感病毒与宿主的相互作用是一个非常复杂的过程,深入研究宿主蛋白与流感病毒蛋白的相互作用,对于理解流感病毒的复制机制和致病机理,从而实现流感的有效防控至关重要。
  流感病毒M2蛋白是一个多功能的蛋白分子,它的离子通道活性可以在病毒复制早期介导病毒脱壳从而使核糖核蛋白复合体(vRNP)具备入核能力,也可以在反式高尔基体中协助HA蛋白成熟。另外,M2蛋白在病毒复制后期促进子代病毒粒子出芽释放。鉴于M2蛋白在流感病毒复制周期中具有重要作用,本实验室前期利用酵母双杂交系统筛选与M2蛋白相互作用的宿主因子,其中之一为Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing proteinα(SGTA)。本研究通过酵母回交验证表明SGTA蛋白与M2蛋白可以在酵母系统中发生相互作用,免疫共沉淀实验证实M2蛋白与SGTA在293T细胞中存在互作,进一步研究发现SGTA蛋白C端91-313位氨基酸是与M2蛋白互作的关键区域。激光共聚焦实验结果显示外源转染的SGTA蛋白和M2蛋白主要共定位于细胞质内。过表达SGTA蛋白可以促进流感病毒复制,而siRNA下调SGTA蛋白表达或CRISPR-Cas9敲除SGTA后则显著抑制流感病毒复制,由此可见,SGTA蛋白对流感病毒复制发挥正调控作用。在此基础上,我们发现siRNA干扰下调表达SGTA后不影响病毒NP蛋白进入细胞核,表明SGTA蛋白不影响流感病毒早期复制。重要的是,我们发现SGTA蛋白可以增加M2蛋白的稳定性,随着SGTA蛋白转染量的增加M2蛋白表达呈递增趋势。本研究部分阐明了宿主蛋白SGTA通过与流感病毒M2蛋白互作正调控流感病毒复制的机制,丰富了流感病毒与宿主相互作用的网络。
[硕士论文] 宋甲宝
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:布鲁氏菌病是由布鲁氏菌感染引发的重要人兽共患病,给畜牧业发展和人畜健康带来极大危害。马耳他种布鲁氏菌作为一种兼性胞内寄生菌,进化出多种逃避宿主免疫策略,可在宿主细胞内建立持久的感染。
  MicroRNA是一类长约18~25个核苷酸的非编码小分子RNA,主要在细胞转录后水平调控基因表达,在宿主体内发挥重要调控作用。本实验室前期将马耳他种布鲁氏菌强毒株M28和疫苗株M5-90感染BALB/c小鼠,获得强弱毒感染后不同时间的microRNA表达谱,初步研究发现microRNA-363-5p(miRNA-363-5p)参与布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡。
  为了筛选更多对布鲁氏菌复制和细胞凋亡有影响的microRNAs,利用巨噬细胞过表达或抑制microRNA表达,然后感染布鲁氏菌。通过细菌分离计数和细胞生长状态初步筛选microRNA。结果显示,过表达miRNA-29c-5p,胞内分菌数显著低于对照组,过表达miRNA-335-5p和miRNA-329-3p,胞内分菌数显著高于对照组(均p<0.05);过表达miRNA-676-3p、miRNA-674-5p和miRNA-18b-5p,巨噬细胞生长缓慢并脱落。结果表明,miRNA-29c-5p、miRNA-335-5p和miRNA-329-3p显著影响布鲁氏菌胞内复制;miRNA-676-3p、miRNA-674-5p和miRNA-18b-5p可能参与布鲁氏菌诱导宿主细胞凋亡,需进一步证明。
  本研究在前期工作基础上,利用双荧光素酶基因报告系统证明和Western-blot验证miRNA-363-5p对靶基因表达调控作用。荧光干扰结果显示,重组Prkacb、Lgf1、Pdpk1、Pik3cg、Cycs、Wnt7a和Sema6a的pmirGLO质粒与miRNA-363-5p mimic共转染后可显著降低萤火虫荧光素酶在293细胞的表达(p<0.001)。将靶基因种子序列突变后,萤火虫荧光素酶的表达量可恢复;Western blot验证结果显示,转染miRNA-363-5p后,巨噬细胞中Prkacb、Cycs和Sema6a的表达量显著降低(p<0.001)。结果表明,Prkacb、Cycs和Sema6a为miRNA-363-5p的靶基因。
  为研究miRNA-363-5p对马耳他种布鲁氏菌M28致病力及体内复制的影响,利用BALB/c小鼠为模型,尾静脉注射miRNA-363-5p的模拟物和抑制物,并感染布鲁氏菌。然后测定小鼠脾重及脾脏分菌数。结果显示,过表达miRNA-363-5p对小鼠脾重和脾脏分菌数均无显著影响。但抑制miRNA-363-5p表达小鼠脾脏含菌量显著高于对照组(p<0.01)。结果表明,抑制miRNA-363-5p的表达可显著促进布鲁氏菌在小鼠体内的复制。
  另外,为了探索OmpR(EnvZ/OmpR二元调控系统元件)基因对布鲁氏菌有何功能。利用同源重组,构建了M28OmpR基因缺失株(M28ΔOmpR)。菌落生长实验显示:M28ΔOmpR生长速度显著低于亲本株M28(p<0.001),回补株M28ΔOmpR-com可恢复菌落生长速度。巨噬细胞感染实验显示:M28ΔOmpR与M28相比,细菌分离数显著降低100倍(p<0.001),回补株M28ΔOmpR-com可恢复其在巨噬细胞中复制能力。小鼠感染实验显示:感染1周后,M28ΔOmpR比M28接种小鼠脾重显著降低(p<0.001);第4周,细菌分离数显著降低0.8Log10(p<0.001)。结果表明,OmpR基因缺失显著抑制马耳他布鲁氏菌体外生长,显著降低其在巨噬细胞和小鼠体内的复制能力,相关机制仍需进一步研究。
  综上所述,miRNA-29c-5p、miRNA-335-5p和miRNA-329-3p影响布鲁氏菌胞内的复制;miRNA-363-5p通过作用于靶基因Prkacb、Cycs和Sema6a参与细胞凋亡;抑制miRNA-363-5p表达有利于布鲁氏菌在小鼠体内复制;OmpR基因缺失抑制马耳他布鲁氏菌体外生长,显著降低其在巨噬细胞和小鼠体内的复制能力。
  本研究为探宄布鲁氏菌的致病机制和布鲁氏菌与宿主作用奠定了基础,为寻找布鲁氏菌病的诊疗方法提供新的思路。
[硕士论文] 李娜
生物医药工程 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在Aβ25-35诱导人源性SH-SY5Y损伤细胞上,筛选能差异化表达并与MRTF-A相关的miRNA,探讨MRTF-A介导miRNA对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制。
  方法:
  1.在Aβ25-35诱导SH-SY5Y损伤细胞模型中,用基因芯片筛选与MRTF-A调控相关的miRNA:建立细胞模型;细胞分组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理,24h后,用western blot方法检测MRTF-A的蛋白表达水平,并提取RNA。用Agilent RNA6000Nano/Pico Assay法检测各组RNA质量合格后,使用miRNA OneArray芯片技术分析各组中发生显著差异变化的miRNA。得到各组显著变化的miRNA,再通过各组间相互比较得到MRTF-A调控的miRNA。筛选出差异性表达最为显著的miRNA,并用RT-qPCR检测MRTF-A对目标miRNA的调控作用。
  2.MRTF-A对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制:
  1)MRTF-A对细胞自噬的影响:实验分为4组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  2)miR-1273g-3P对细胞自噬的影响:实验分为4组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic,miR-1273g-3p mimic control+Aβ25-35,miR-1273g-3pmimic+Aβ25-35)。转染miR-1273g-3p48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白检测LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  3)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p有关:实验分为5分组(control,Aβ25-35,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予Aβ25-35处理24h后,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  4)miR-1273g-3p对靶基因mTOR的作用:采用mirwalk、targetscan软件预测其靶基因,并验证其对靶基因(自噬上游靶基因)mTOR表达的影响。实验分为2组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic);转染miR-1273g-3p mimic48h后,提取RNA和蛋白,分别检测mTOR蛋白表达水平。
  5)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p抑制mTOR有关:实验分为5组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3pinhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测mTOR的蛋白表达水平。
  结果:
  1.基因芯片筛选miRNA:在给予Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,MRTF-A蛋白表达水平明显降低,转染MRTF-A质粒使细胞过表达MRTF-A,将各组通过RNA质检的RNA进行miRNA基因芯片杂交,依据|Fold change|≧0.585且P-value<0.05的条件筛选条件,共筛选出295个显著差异的miRNA。将得到的295个miRNA在各组间交集比较,共得到8个与MRTF-A调控相关的miRNA;其中上调的有miR-1273g-3p,下调的有hsa-miR-6772-3p、hsa-miR-6736-3p、hsa-miR-6740-3p、hsa-miR-7106-3p、hsa-miR-6747-3p、hsa-miR-6776-3p及hsa-miR-3653-5p。我们选择上调明显的miR-1273g-3p,用RT-qPCR验证显示MRTF-A能明显上调miR-1273g-3p的表达,与芯片结果一致。
  2.MRTF-A调控miR-1273g-3p促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生:结果显示,在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,过表达MRTF-A能明显增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,说明MRTF-A促进经Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,转染miR-1273g-3p mimic也能明显促进LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,表明miR-1273g-3p也能够促进自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,共转染MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达较单转MRTF-A有明显降低,提示miR-1273g-3p参与了MRTF-A促进自噬的的作用。
  3.MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现:利用mirwallk、Targetscan软件总共预测到1090个miR-1273g-3p靶基因,并找到负性调控自噬的靶基因mTOR。RT-qPCR和western blot结果显示,单转miR-1273g-3p能明显抑制了mTOR的mRNA和蛋白表达水平;另一方面,单转MRTF-A也能抑制mTOR的表达,而共转MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后能逆转MRTF-A对mTOR表达的上调,提示MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现。
  结论:
  MRTF-A能够促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生,而miR-1273g-3p通过抑制mTOR的表达促进细胞自噬的发生;另一方面,MRTF-A能够上调miR-1273g-3p的表达,MRTF-A促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬可能与其上调miR-1273g-3p抑制mTOR的表达相关。
[博士论文] 沈奇骢
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:表观转录组学(Epitranscriptome)是生命科学领域新兴的前沿研究热点,主要关注各种RNA水平的修饰,及其在细胞转录组中的分布和表观调控作用,如近年来被广泛研究的6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)修饰在生理状态下存在于包括mRNA的多种RNA中。然而作为一种可逆的化学修饰,其动态调控机制还不清楚,特别是还没有发现其特异性的去甲基化酶。另外,作为一种在哺乳动物RNA中普遍存在的修饰方式,其生理和病理功能尚不清楚,特别是其在基因表达调控中的功能尚有待于深入研究。研究mRNA中5-mC的调控及其功能是表观转录组的一个重要方向。Tet蛋白(Ten-eleven Translocation,Tet)作为DNA甲基化的氧化酶,也能够在体外氧化RNA中5-mC。Tet蛋白是否在哺乳动物细胞中调控mRNA中的5-mC修饰,其在不同的生理过程中发挥着怎样的调控作用?这些科学问题有待进一步研究。
  天然免疫是抵御病原体的第一道防线,如何快速高效的识别和清除病原体,并维持免疫稳态,是天然免疫的根本科学问题。病原体感染激活免疫系统,诱导炎症反应,产生各种细胞因子进一步动员造血干细胞向髓系细胞分化,放大天然免疫应答效应是机体快速清除病原体的重要手段。髓系发生(Myelopoiesis)是急性或慢性感染的关键应答反应,其表观遗传学机制尚未见报道,值得探究。Tet2不仅在造血干细胞的自我更新和分化中发挥着重要的调控作用,多项研究也发现Tet2在造血系统多种恶性肿瘤中存在多位点突变,且Tet2基因突变导致的催化功能缺失与造血系统恶性肿瘤的发生发展密切相关,特别是在髓系恶性肿瘤中,表明Tet2可能是一种重要的抑癌基因。此外,Tet2在炎症消退过程中也发挥着重要的调控作用。Tet2是否也参与病原体感染诱导的髓系免疫细胞分化还有待研究。
  本课题围绕Tet2是否参与感染诱导的髓系发生及其表观调控机制展开研究。发现,Tet2能够通过抑制Socs3的mRNA水平而促进脓毒症感染和寄生虫感染诱导的髓系免疫细胞的分化扩增。Tet2通过Adar1抑制Socs3的表达,Adar1通过结合双链RNA并以RNA编辑非依赖的方式降低Socs3mRNA的稳定性。进一步机制研究发现Tet2抑制了mRNA上5-mC的水平,Tet2缺失导致Socs3mRNA3'-UTR区域5-mC水平上升,可能通过5-mC特异性的结合蛋白影响该区域RNA双链的形成,从而减少Adar1的结合。本研究揭示了DNA甲基化氧化酶Tet2分子能够促进感染诱导的髓系天然免疫细胞的发生,从而促进机体对病原体的抵抗能力,为机体抵抗病原体感染的效应机制提出了新观点,也为有效防治感染性疾病提供了新思路和潜在药物研发靶标。同时,Tet2一直被认为是通过调控染色质状态来介导基因转录水平的调控,而本研究首次提出了Tet2作为RNA结合蛋白能够在mRNA修饰水平参与转录后调控的全新功能,为进一步研究Tet2的生理病理功能开辟了新的研究方向。
  第一部分 Tet2通过抑制Socs3的表达而促进感染诱导的髓系免疫细胞分化
  在病原体感染过程中,机体需要从骨髓大量动员免疫细胞到外周血,以快速高效地清除入侵的病原体。同时,刺激造血的细胞因子以及炎性细胞因子促进了更多髓系细胞的发生。为了观察Tet2在此过程中的作用,首先构建了盲肠结扎穿孔诱导脓毒症的小鼠模型,发现Tet2缺失显著降低小鼠脓毒症CLP模型的死亡率和临床评分,其原因主要是Tet2缺失使得髓系终末细胞的动员显著降低而避免了炎症因子风暴导致的组织器官损伤;另外还构建了血吸虫感染(慢性感染模型)诱导肥大细胞分化扩增的模型,发现Tet2缺失也能够抑制寄生虫感染诱导的肥大细胞的分化。说明Tet2在病原体感染诱导的髓系细胞分化中起着关键作用。为了进一步探究Tet2促进髓系发生的分子机制,对野生型和Tet2敲除的骨髓来源的肥大细胞进行了表达谱分析,发现PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路的多个基因在Tet2缺失细胞中表达有显著变化,其中包括JAK-STAT信号通路的关键抑制分子Socs3。进一步检测发现Tet2敲除的造血祖/干细胞和肥大细胞中IL-3诱导的Socs3mRNA和蛋白水平显著增高,并且Tet2敲除细胞中,IL-3信号通路活化障碍,STAT5和AKT的磷酸化水平降低。而在Tet2敲除的细胞中通过siRNA沉默Socs3的表达后,IL-3信号通路活化水平有所恢复。这些结果提示Tet2通过抑制Socs3的表达,从而促进IL-3等细胞因子信号通路的活化,这可能是Tet2促进病原体感染诱导髓系免疫细胞发生的关键机制。
  第二部分 Tet2通过Adar1在转录后水平抑制Socs3的表达
  进一步研究Tet2抑制Socs3表达的分子机制,发现Tet2抑制Socs3的表达并不是通过调控Socs3基因区的DNA甲基化水平,而是在转录后水平。这一结果提示了Tet2作为一种RNA结合蛋白可能具有广泛的转录后调控功能。通过构建紫外交联免疫共沉淀结合高通量测序体系,在全基因组范围内寻找Tet2结合的靶RNA分子。结果发现Tet2结合的RNA种类中,80%属于已知基因转录的mRNA,其中包括Socs3的3'-UTR区域。同时在RNA-seq数据中,发现野生型对照组中A-to-G突变的数目显著高于Tet2敲除组,且更多富集于mRNA的3'-UTR区。Socs3mRNA的3'-UTR区域也包含A-to-G突变位点。Adar1结合双链RNA并介导A-to-I编辑,提示Adar1可能参与这些位点的编辑。在野生型细胞中干扰Adar1后Socs3表达上升,但报告基因结果显示Adar1对Socs3的调控不依赖其酶催化活性。有文献报道Adar1能够其他RNA结合蛋白在转录后水平调控基因表达,而不依赖其RNA编辑功能。通过免疫共沉淀联合质谱检测发现,Adar1能够与调控mRNA稳定性的RNA结合蛋白结合,可能通过这些蛋白发挥抑制Socs3的功能。通过进一步探究Tet2在Adar1介导的Socs3抑制功能中的作用,发现在Tet2敲除细胞中干扰Adar1不能升高Socs3的表达,结合过表达实验发现,Tet2以酶活性依赖的方式促进Adar1对Socs3表达的抑制作用,而同时又不依赖于其DNA结合功能。
  第三部分 Tet2通过抑制mRNA中5-mC的水平而参与Socs3的转录后抑制
  Tet2能将DNA上的5-mC催化氧化成为5-hmC,同时,RNA上的5-mC修饰也被发现存在果蝇和人类细胞系中。为了研究Tet2能否通过氧化的方式降低mRNA中5-mC,构建了Tet2体外催化体系,通过质谱和点杂交检测发现Tet2能够在体外和体内以底物依赖的方式降低mRNA上的甲基化修饰水平,并且在Tet2敲除细胞中,发现mRNA上的5-mC修饰水平升高。而野生型细胞中胞嘧啶上的其他甲基化氧化修饰5-hmC、5-fC和5-caC的含量则很低。通过建立RNA甲基化组分析,发现在mRNA上存在5-mC修饰,且在Tet2敲除细胞中5-mC水平显著升高。以上结果说明Tet2能够以氧化依赖的方式抑制mRNA上5-mC的水平。进一步实验发现5-mC的存在能够抑制Adar1与其靶RNA的结合。DNA或者RNA的修饰能够招募特异性蛋白发挥表观调控功能,通过RNA5-mC结合蛋白实验分析,发现5-mC能够结合一些ATP依赖的RNA解旋酶,这些蛋白跟RNA二级结构的改变和双链解旋有关,而Adar1结合双链RNA。以上结果说明mRNA上的5-mC修饰能够抑制Adar1功能,可能是通过抑制双链RNA的形成使Adar1结合减少的原因。
  综上所述,Tet2能够通过氧化依赖的方式降低mRNA上5-mC修饰的水平,Tet2的缺失使mRNA上5-mC修饰的水平升高,从而抑制Adar1的功能。发现Tet2可能通过抑制5-mC水平促进双链RNA的形成,而双链RNA是Adar1结合所必需的。结合野生型和Tet2敲除细胞中转录组突变位点的对比分析,也揭示了Tet2和Adar1功能上的广泛联系。此外,还发现,内源性mRNA上5-hmC的数量远远少于5-mC,说明从5-hmC如何转换为未甲基化的胞嘧啶需要其他的酶或者更多催化步骤。Tet2在转录后水平降低JAK-STAT信号通路的关键负调控分子Socs3的mRNA的稳定性,维持了细胞因子如IL-3信号通路的持续活化,促进了病原体感染诱导的髓系天然免疫细胞的分化,为抗感染免疫的表观调控提供了新的机制。
[硕士论文] 陈梦佳
神经生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:嗅觉是动物重要的感官之一。哺乳动物的嗅觉系统主要由位于中枢的嗅球、嗅皮质和位于外周的嗅粘膜组成。嗅粘膜又分为嗅上皮层和固有层。嗅上皮层主要包含基底细胞,嗅受体神经元和支持细胞。其中,基底细胞位于嗅上皮的基底层,紧贴固有层,是嗅上皮的干细胞。嗅受体神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)是嗅觉系统的一级神经元,它位于嗅上皮基底层的上方,由基底细胞分化而来。伴随着ORNs分化成熟的过程,其胞体从上皮基底层向顶端迁移,使得不同分化程度的ORNs位于不同的细胞层面,其中未成熟ORNs的胞体靠近基底层,而成熟ORNs的胞体位于未成熟ORNs上方接近上皮顶端。嗅上皮的发育对于维持动物正常嗅觉功能至关重要。嗅神经元的发生是一个极其复杂的过程,包括嗅上皮干细胞的增殖、分化和成熟等几个阶段,每个阶段都受到严格的调控,但是人们目前对其调控机制了解十分有限。
  血红素结合蛋白Hemopexin是一种血浆糖蛋白,属于炎症相关的急性期蛋白家族。有趣的是,hemopexin在外周神经系统中也有表达,并且在神经轴突变性的过程中表达上调,提示hemopexin可能参与了神经损伤的再生过程。Hemopexin分子和基质金属蛋白酶和玻连蛋白都有一个由两个四叶β-螺旋组成的相同结构域,称为血红素结合蛋白样结构域。研究表明,后两者可通过其参与调节多种细胞的增殖和分化并能调节神经发生过程等。目前尚没有Hemo、exin参与了神经发生的相关报道。为了深入认识Hemopexin在神经系统发育中的作用,本研究运用基因敲除小鼠模型,分析了Hemopexin在嗅上皮神经发生过程中的作用及机制。
  取得的主要结果如下:
  1、对hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮形态学分析显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮变薄、上皮的细胞总数减少;嗅上皮的成熟ORNs减少,而未成熟ORNs增加,并且未成熟的ORNs结构层次产生异常。
  2、运用免疫组化等方法,进一步发现hemopexin基因敲除小鼠的嗅上皮增殖细胞数量无明显改变,而凋亡细胞增多;嗅上皮的干细胞HBCs无明显异常。
  3、嗅觉功能检测显示,hemopexin基因敲除小鼠的嗅觉识别能力仍然存在,但是区别结构相似气味的精细嗅觉功能丧失。
  综上所述,我们发现hemopexin在嗅上皮的神经发生过程中发挥了重要作用,具有促进ORNs的成熟,抑制其凋亡以及维持精细嗅觉的功能。本研究不仅助于揭示嗅上皮神经发生调控过程的新机制,有助于深入认识神经发育的机理,而且为hemopexin蛋白对嗅觉功能障碍相关疾病的潜在治疗价值提供理论依据。
[硕士论文] 卢光照
药剂学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着科学技术的发展,研究者针对肿瘤微环境探索出许多微环境特定响应型药物载体——刺激响应性载体,刺激响应性载体包括pH响应性载体、还原响应性载体、光响应性载体、超声响应性载体、磁场响应性载体和热响应性载体以及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)响应载体。ROS响应性载体已成为近年来药物载体研究的热点,相继出现了含硫多聚物ROS响应性载体、含硒多聚物ROS响应性载体、含碲多聚物ROS响应性载体和含不饱和磷脂ROS响应性载体等。在众多的ROS响应性载体中,含不饱和磷腊ROS响应性载体最具发展潜力,不饱和磷脂能被1O2快速氧化,从而实现载体中药物的快速释放。然而在具有多个病理情况时,单一地依靠ROS响应性载体并不能保证药物在特定部位释放,而光敏剂在光照后可以产生1O2,含不饱和磷脂载体能够实现1O2为基础的ROS响应。
  ROS响应脂质体材料DLPC是一种不饱和磷脂,具有四个不饱和双键,具有很强的ROS响应活性。PdPC(OBu)8是一种高效光敏剂,在光照的情况下可以产生大量1O2,能使不饱和磷脂快速氧化。光敏剂在特定波长光照射下能产生1O2,1O2不仅具有氧化不饱和磷脂的特性,而且具有光动力治疗的作用,从而改善ROS响应脂质体的治疗效果。
  因此,本研究设计并研究载光敏剂ROS响应性载体,以二亚油酰磷脂酰胆碱(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DLPC)为ROS响应材料,1,4,8,11,15,18,22,25-八丁氧基酞菁钯[1,4,8,11,15,18,22,25-octabutoxypalladium phthalocyanine,PdPC(OBu)8]为产生1O2的光敏剂,构建以DLPC为响应物质的光敏ROS响应脂质体(LPD),探究LPD的体内外抗肿瘤活性。
  首先,合成了光敏剂PdPC(OBu)8并进行了结构鉴定,然后建立了盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride,DOX)和PdPC(OBu)8的含量检测方法。采用荧光分光光度法测定DOX含量,DOX浓度在1-20μg·mL-1时,线性回归方程为F=8.9337C+0.2412(R2=0.9995)。然后对DOX的HPLC方法进行了探索,DOX线性范围浓度为0.2-25μg·mL-1,线性回归方程为A=0.4494C+0.0100(R2=1)。采用紫外可见光分光光度法测定PdPC(OBu)8的含量,PdPC(OBu)8浓度在2-12μg·mL-1时,线性回归方程为A=0.0823C+0.0157(R2=0.9994)。本文还对PdPC(OBu)8的HPLC检测方法进行了探索,PdPC(OBu)8线性范围浓度为0.5-20μg·mL-1,线性回归方程为A=0.1002C-0.0054(R2=1)。
  其次,进行了LPD的处方筛选及表征。LPD的最优处方为DLPC用量为5%,胆固醇用量为40%,DSPE-PEG2000用量为5‰DSPC用量为50%(摩尔比),PdPC(OBu)8投药量为药脂比(m∶m)1∶200。LPD粒径为(169.3±1.2)nm,PDI为0.198±0.003,粒径均匀,分散性良好,zeta电位为(-39.8±0.8)mV。PdPC(OBu)8的包封率约为(84.43±3.12)%,载药量为(0.42±0.01)%。DOX的包封率为(91.03±3.33)%,载药量为(9.84±0.40)%。LPD具有良好的储存稳定性和良好的血清中稳定性。实验表明LPD在未光照的情况下,药物基本不释放;在光照(730nm,300mW·cm-2)的情况下,照射5min药物释放率达到(95.5±2.5)%(P<0.05),说明LPD具有ROS响应快速释放药物的特性。LPD光照前不产生1O2,光照(730nm,300mW·cm-2,3min)后产生大量1O2,因此LPD在光照时实现ROS响应。
  再次,以乳腺癌MCF-7细胞为模型细胞,探索了LPD的体外抗肿瘤活性研究。实验发现光照强度对MCF-7细胞没有毒性。PdPC(OBu)8脂质体(LP)在未光照前对MCF-7细胞具有较弱的毒性,光照(730nm,1200mW·cm-2,3min)后细胞毒性显著增强。LPD可以促进DOX在MCF-7细胞中的摄取,并且DOX经细胞摄取后主要分布于溶酶体。LPD进入细胞是通过小窝蛋白介导的能量依赖型内吞途径,并且LPD在活细胞内能产生少量ROS,光照(730nm,1200mW·cm-2,3min)后产生大量ROS。
  最后,以乳腺癌MCF-7细胞为模型细胞,以裸鼠为模型动物,探索了LPD的体内抗肿瘤活性研究。DOX的HPLC-MS分析方法特异性良好,线性范围在1-1000ng·mL-1,线性回归方程为ADOX/ADNX=0.0003C+0.0116,R2=0.9986,具有良好的基质效应和提取回收率,具有较好的准确度和精密度,因此,该DOX的HPLC-MS分析方法可以作为DOX药代动力学的检测方法。游离DOX的半衰期为1.42h,LPD的半衰期为7.16h,是游离DOX半衰期的5.04倍,具有显著性差异;非ROS响应脂质体(HPD)的半衰期为11.39h,是游离DOX半衰期的8.02倍,具有显著性差异;表明LPD与HPD均可以延长DOX的半衰期。相对于游离DOX,LPD具有清除率小,AUC大的特征。载Amplex UltraRed光敏ROS响应脂质体(LPU)在不光照时,经活体成像扫描发现肿瘤部位没有荧光,脂质体给药后光照(730nm,1200mW·cm-2,5min),经扫描发现肿瘤部位具有明显的荧光,表明LPU光照后能够产生ROS。游离DiR在肝、脾具有明显荧光,表明游离DiR主要分布在肝、脾部位。载DiR光敏ROS响应脂质体(LDiR)在肝、肿瘤具有明显荧光,表明DiR主要分布在肝、肿瘤部位。因此,说明LPD具有被动靶向性。空白脂质体(BP)和LP无抗肿瘤活性。游离DOX、DOX脂质体(LD)、光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的DOX脂质体(LD+hv)以及LPD具有相似的抗肿瘤活性,光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的LP具有较好的抗肿瘤活性,说明光照显著增强LP的抗肿瘤活性。光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的LPD(LPD+hv)具有最为显著的抗肿瘤活性,原因可能是DOX的化疗作用与PdPC(OBu)8光照产生的单线态氧光动力治疗的联合作用。未光照处理的HPD具有抗肿瘤活性,光照(730nm,1200mW·cm-2,5min)后抗肿瘤活性增强。然而LPD未光照时就具有与HPD光照后相似的抗肿瘤活性,光敏ROS响应脂质体光照(730nm,1200mW·cm-2,5min)后抗肿瘤活性显著增强。因此光敏ROS响应脂质体光照后具有最为显著的抗肿瘤活性。
  总之,本研究初步证明了LPD具有ROS响应特性,能够增强细胞毒性,增强细胞摄取,在动物体内的靶向特征明显,体内抗肿瘤活性显著,同时具有光动力治疗、化疗与光敏释药的作用,具有较好的发展前景。此外,LPD制备过程简单,对纳米药物产业化具有一定的指导意义。
[硕士论文] 陈翔
口腔医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  上颌第三磨牙萌出时间较晚,而且位于上颌牙弓最末端,往往由于萌出空间不足而埋伏或阻生,常引起一系列的并发症。在临床上处理其根管时多面临视野不佳、操作难度大、根管形态结构变化大及牙根存在弯曲等因素而影响治疗效果,故一般建议拔除。上颌第三磨牙拔除术虽相对简单,但由于其解剖结构变异性大,仍有可能发生严重的并发症。同时随着口腔技术的提高与器械材料的发展,将上颌第三磨牙作为自体牙移植供牙、作为基牙修复邻近牙缺失,甚至纳入正畸范畴的技术广泛应用于临床,对上颌第三磨牙进行根管治疗也成为常规操作。无论是上颌第三磨牙拔除术或是对其进行根管治疗都需要医师对上颌第三磨牙的解剖学结构熟悉掌握。锥形束CT(cone beam computed tomagraphy,CBCT)可构建高精度的三维影像,且属于非侵袭性操作,近年来在阻生牙拔除术术前检查及根管系统研究中应用较多。本研究通过CBCT对上颌第三磨牙解剖学结构进行观测及分析,以期为各种临床操作尤其是以上颌第三磨牙为供体的自体牙移植术提供参考依据,以达到提高诊疗效果的目的。
  方法:
  回顾性分析本院口腔种植门诊2016年2月~2017年2月收治的620例患者的第三磨牙(708颗)CBCT的影像学资料。数据经由计算机软件导入,观察第三磨牙两侧牙根数目、根管形态分类、根管类型分布等数据,并分析上颌第三磨牙根管数目与性别的关系、牙根与上颌窦窦底的关系(A类:牙根根尖和上颌窦窦底处于同一水平;B类:牙根根尖水平比上颌窦窦底高;C类:牙根根尖水平比上颌窦窦底低)。采取SPSS21.0统计学软件对所得数据进行统计学分析。通过本次研究结果作为解剖学的依据,来指导临床进行以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植手术。
  结果:
  708颗上颌第三磨牙牙根数目方面,三根牙占40.40%,其次依次是融合根牙占39.26%,双根牙占18.36%,四根牙占1.98%;按照左右位置的不同可分为:三根牙(左侧占40.11%,右侧占40.69%)最多,融合根牙(左侧占38.44%,右侧占40.11%)次之,后面依次是双根牙(左侧占18.94%,右侧占17.77%)与四根牙(左侧占2.51%,右侧占1.43%),左右两侧牙根数目比较差异无统计学意义(P>0.05);
  708颗上颌第三磨牙根管形态分布方面,三根管占48.73%,其次依次为单根管占27.12%,双根管占17.09%,四根管占7.06%;单根管的男性占26.94%,女性占27.30%;双根管的男性占17.22%,女性占16.95%;三根管的男性占48.33%,女性占49.14%;四根管的男性占7.50%,女性占6.61%,男、女上颌第三磨牙根管形态比较差异无统计学意义(P>0.05);
  低位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占15.29%、4.55%、80.16%,中位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占33.19%、10.21%、56.60%,高位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占55.84%、14.72%、29.44%。
  上颌第三磨牙萌出方向为垂直位关系的数量最多,占72.04%,其中腭向倾斜位较为少见,仅为2.41%;萌出方向为远中位关系的牙齿数量其次,占22.88%;萌出方向为近中位关系的数量最少,占5.08%。
  上颌第三磨牙各侧骨壁中腭侧的厚型骨壁的数量最多,占55.80%;远中骨壁的厚型骨壁数量最少,占15.12%。
  在以CBCT提供的上颌第三磨牙的解剖学资料的指导下,将其作为供牙的自体牙移植术成功率较高。
  结论:
  上颌第三磨牙的解剖形态与位置复杂多样且变异较大,运用CBCT可明确了解其牙体形态和与相邻解剖结构之间的关系,能为阻生牙拔除术提供重要的指导并减少并发症的发生;同时通过CBCT对上颌第三磨牙根管形态的研究,能指导临床医师了解上颌第三磨牙根管形态的类型,明显提高对其根管治疗的成功率。因此能提高以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植术及其他临床治疗的成功率。
[硕士论文] 刘清桂
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:细胞衰老是指在DNA损伤、端粒酶活性丢失等内在因素和细胞间通讯改变、体液循环因子改变等外在条件的刺激下,细胞发生一系列形态结构的改变,导致细胞永久性退出分裂周期,无法发挥正常生理功能。而衰老细胞的累积会导致组织器官的衰老,进而引发组织器官衰老问题,如机体的结构和功能异常和各种衰老相关疾病的发生。
  肝脏是一个以代谢为核心功能的器官,而肝细胞是肝脏组织中最主要的实质细胞。胆汁合成、肝糖贮存、脂质代谢等多种肝功能都是由肝细胞来承担的。随着年龄增长,老年肝脏肝细胞的形态、结构和功能发生了一系变化,比如肝细胞体积变大,数量减少、增殖能力降低、肝细胞核出现空泡,胞质出现脂褐素沉积、DNA含量异常,巨核肝细胞比例升高等。然而,由于衰老肝细胞的结构改变和功能异常,导致老年个体更容易发生各种肝脏疾病。比如老年个体容易出现肝脏脂肪性病变,老年小鼠中应对CCl4等化学药物的能力下降,肝脏的炎症水平升高,加速肝脏纤维化病症的发生发展。由此可见,肝细胞衰老与肝脏疾病发生发展紧密相关。因此,探寻肝细胞衰老逆转的途径是老年肝脏疾病治疗的必然要求。然而由于肝脏衰老模型小鼠缺乏等各种困难,目前仍无法获得肝细胞衰老逆转的深入研究。
  本项目研究中,基于联体共生模型,使得联体的两只小鼠可以共享彼此的血液微环境途径而用来探讨微环境对肝细胞衰老逆转的作用。首先,分别建立了2月龄和24月龄小鼠间联体(联体的2月龄为Het-Y,联体的24月龄小鼠为Het-O)、相同月龄的年轻小鼠间联体(联体的同月龄小鼠都称为Iso-Y)和相同月龄的老年小鼠间联体(联体的老年小鼠都称为Iso-O)3种联体共生模型。通过流式分析结果显示联体小鼠间血液交换率接近50%。成功构建联体共生模型后,使得联体小鼠共同生活5周,然后分别对不同组联体小鼠肝脏肝细胞进行生物学特征和肝细胞功能的分析,评价年轻微环境对衰老肝细胞逆转的作用。细胞衰老相关指标的检测结果显示,在年轻血液微环境的作用下,与Iso-O小鼠相比,老年小鼠SA-β-gal阳性率从38.23%±1.86%降低到4.84%±0.71%;γ-H2A.X阳性率从53.98%±3.78%降低到15.46%±1.86%;衰老指标细胞周期抑制因子P53、P21和P16的表达明显降低(p<0.01);炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平也降低(p<0.01)。其次,老年小鼠肝脏多倍体肝细胞数量增加,而多倍体肝细胞发生衰老的可能性增加。通过肝细胞比例分析发现,在年轻微环境的作用下,与Iso-O相比,老年小鼠八倍体肝细胞比例从33.35%±0.85%降低到15.97%±0.84%;二倍体肝细胞比例从7.41%±0.54%升高到27.27%±0.71%。进一步对肝细胞数目和大小进行分析,结果显示,在年轻微环境作用下,相同视野范围内,老年肝脏肝细胞数目从402±18个增加到617±42个,细胞面积也从645.99±32.72μm2减小至356.93±22.33μm2。前期的研究表明随着年龄的增加肝细胞增殖能力降低,体现在小鼠肝脏肝切后肝脏再生能力减弱和衰老肝细胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年轻小鼠血液的影响下,其增殖能力发生了明显变化。原位肝组织增殖能力检测和原代肝细胞体外短期培养结果都显示,年轻微环境作用下,衰老肝细胞增殖能力得到恢复,增殖水平与年轻小鼠相类似。上述结果证实:在年轻微环境作用下,衰老肝细胞的衰老指标消失了,衰老肝细胞的形态、结构发生了衰老逆转,且重新获得了类似年轻肝细胞的增殖潜能。
  衰老肝细胞发生系列形态结构和功能的改变,导致其对外界刺激的耐受力下降,因而慢性肝炎、肝纤维化、肝癌等肝脏疾病在老年个体中发生机会增加。随着年龄的增长,衰老肝细胞出现脂质代谢障碍,肝脏内脂肪累积的水平提高,老年肝脏脂肪病变的发生几率明显增加。在联体共生模型中,发现老年小鼠在年轻血液微环境的调控下,老年肝脏脂肪累积程度得到明显的缓解。肝脏脂滴原位染色结果显示,年轻微环境的作用下,于Iso-O相比较,油红O的阳性面积从24.01%±3.48%降低到4.15%±2.95%,且尼罗红的阳性面积也降低4倍。血清学指标也显示老年小鼠TG、胆固醇和LDL-c水平明显降低(p<0.01),且肝损伤指标ALT和AST的表达水平也降低(p<0.01)。
  综合上述实验结果,可以得出结论:在年轻血液微环境的作用下,老年衰老肝细胞的衰老表型发生逆转,多倍体肝细胞比例降低,增殖能力得到提高。而且年轻血液微环境促进了衰老肝细胞脂肪累积水平的降低,不仅提高了肝细胞的脂质代谢能力,也改善了衰老肝脏的肝功能水平。这一重要发现,为解决衰老肝细胞增殖缓慢和老年个体肝衰竭相关疾病高频病发而难治愈问题提供新的思路,也为理解衰老和微环境的关系、衰老肝细胞发生“返老还童”机制和延缓或有效控制肝细胞衰老提供了理论基础。
[硕士论文] 蔡晓敏
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  由于上颈椎周围的神经血管结构复杂,上颈椎前外侧入路手术在技术上要求很高。临床上可以采取高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)处理上颈椎病变。上颈椎前外侧入路的解剖结构对于进行安全的上颈椎手术至关重要,通过以上两种入路显露上颈椎,记录入路中遇到的重要解剖结构,并对比两种入路区别。
  研究方法:
  使用经10%福尔马林充分固定的颅颈完整的成人湿性尸体标本10具,对左右侧均先进行高位颈前咽后入路解剖,显露上颈椎,而后模拟标准颈前路显露上颈椎,获得共20组数据。在解剖过程中,记录所有解剖标志、重要的神经血管结构,特别是限制暴露的结构。测量神经血管结构出动脉鞘和入内脏鞘点至喉结的垂直距离、直接距离等解剖数据,分析他们与颈椎体、椎间盘解剖关系,并对比两种入路中区别。最后将数据进行统计学分析。
  研究结果:
  1、上颈椎前外侧入路中的重要神经血管结构,不存在左右侧显著性差异;舌下神经、喉上神经等是限制暴露的主要结构。2、有4例喉结相当于C5水平。3、舌下神经和舌动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,鞘膜之间走行部分大多位于枢椎水平。喉上神经内支与喉上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C3,入内脏鞘点大多位于C4。喉上神经内支和舌下神经伴行的垂直距离及直接距离具有显著性差异。喉上神经外支与甲状腺上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C4,入内脏鞘点大多位于C5,与喉结相当靠近,且13/20位于喉结下方。喉上神经内外支入内脏鞘点的垂直距离、直接距离及椎体水平具有显著性差异。
  研究结论:
  1、在上颈椎前外侧入路中,二腹肌为寻找舌下神经的重要标志。2、舌下神经和喉上神经是妨碍上颈椎前外侧入路的重要解剖结构。3、在前外侧入路中,喉结是定位神经血管结构、椎体水平及选择手术切口的重要参考。4、高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)均是处理上颈椎病变的有效方法。高位颈前咽后入路能够更好地显露,可提供C2/3椎间盘处的垂直视角,向上可显露至斜坡下1/3,但需将喉上神经、喉上动脉及舌下神经、舌动脉完全解剖游离,并分别向下、向上牵拉。5、标准颈前路无需特意将血管、神经解剖游离,选择距喉结上方垂直距离约13~21.8mm的切口,从靠内脏鞘一侧进入,一般上从喉上神经外支和甲状腺上动脉上方及舌下神经和舌动脉下方,显露上颈椎,损伤血管神经的概率较低,较为安全。但标准颈前路只能提供C2/3椎间盘处的斜视角,且显露寰枢椎及斜坡困难,易损伤神经血管。所以当病变局限于枢椎体或C2/3椎间盘病变时可考虑采用标准颈前路。
[博士论文] 李朋
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:布鲁菌是人畜共患布鲁菌病的病原菌,主要引起动物流产和人的波状热。布鲁菌的毒力主要体现在入侵吞噬细胞并在胞内存活和复制的能力。布鲁菌侵入宿主细胞后通过表达一系列的毒力相关因子来完成胞内存活和复制过程,脂多糖(LPS)和Ⅳ型分泌系统(T4SS)是布鲁菌最为关键的两个毒力相关因子。根据LPS的完整性,将布鲁菌分为光滑型(S型)和粗糙型(R型)。R型布鲁菌能够诱导巨噬细胞死亡,并且该过程依赖于T4SS。然而,R型布鲁菌致死巨噬细胞的分子机制还不清楚。本研究利用Luciferase报告基因、Western blotting、qPCR等方法对其进行了探究,并且利用Label-free蛋白组学技术对T4SS关键效应蛋白进行筛选鉴定。
  本研究中,为确定T4SS在R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,我们利用FITC-Annexin V/propidium iodide双荧光染色法和检测乳酸脱氢酶释放量两种方法对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123感染巨噬细胞后的细胞毒性分别进行定性和定量检测。结果显示,R型布鲁菌ΔrfbE诱导巨噬细胞死亡依赖于T4SS。
  为探究T4SS在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建T4SS分泌蛋白BPE123和VceC的融合Luciferase报告菌株对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB123的T4SS分泌水平进行检测,结果表明ΔrfbE融合蛋白BPE123-Luc或Luc-VceC的分泌水平明显高于S2308。进一步对S2308和ΔrfbE的T4SS表达差异分别用qPCR和Western blotting进行检测,结果显示,在TSB、酸性和营养匮乏条件下,R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS表达量显著高于S型布鲁菌S2308。T4SS启动子virB的Luciferase报告菌株的检测结果表明,ΔrfbE的virB启动子活性显著高于S2308。上述试验结果表明,T4SS的表达和分泌能力在R型布鲁菌中显著高于S型布鲁菌。
  为探究R型布鲁菌ΔrfbET4SS上调表达的原因,我们利用qPCR分析了T4SS的调控相关基因的转录水平。结果显示,与S2308相比,ΔrfbE的VjbR上调表达,MdrA和BlxR下调表达。为确定VjbR、MdrA和BlxR在ΔrfbE致死巨噬细胞中的作用,构建了ΔrfbE的VjbR缺失株以及MdrA和BlxR的过表达菌株,并对这些菌株的细胞毒性进行了定性和定量检测。结果表明,ΔrfbE缺失VjbR后不再具有细胞毒性;ΔrfbE过表达BlxR后细胞毒性显著降低;但ΔrfbE过表达MdrA后细胞毒性仍然很强。为研究VjbR和BlxR对T4SS的调控作用,我们利用qPCR分析了ΔrfbEΔvjbR和ΔrfbE(pBlxR)菌株的virB4的表达水平。结果显示,VjbR对ΔrfbE的T4SS过表达起到了关键的作用,而BlxR只起到了一定的作用。R型布鲁菌激活巨噬细胞凋亡或焦亡与细胞内质网压力应激IRE1α信号通路相关,为探究R型布鲁菌ΔrfbE的T4SS分泌上调对内质网应激的影响,利用Western blotting鉴定了S2308和ΔrfbE感染巨噬细胞后IRE1α磷酸化(p-IRE1α)水平。结果显示,与S2308相比,ΔrfbE引起更强烈内质网应激。运用p-IRE1α专性抑制剂4μ8c处理细胞后检测ΔrfbE对巨噬细胞毒性。结果显示,抑制p-IRE1α后ΔrfbE对巨噬细胞的毒性显著降低。该系列结果表明,R型布鲁菌通过VjbR上调和BlxR下调表达协同调控T4SS的转录并激活IRE1α信号通路致死巨噬细胞。
  我们对S2308、ΔrfbE和ΔrfbEΔvirB12进行了差异分泌蛋白质组学分析,以期筛选到致死巨噬细胞中起到关键作用的T4SS效应蛋白。将三个菌株在RPMI-1640营养缺乏培养基中诱导8h制备分泌蛋白样品,发现R型布鲁菌的蛋白分泌量明显高于S型布鲁菌。质谱分析共鉴定肽段数9020个,蛋白质组数1131个。GO分析发现,差异蛋白主要参与细胞过程和代谢过程等重要的生物学过程,集中分布在细胞和细胞组分,具有催化活性和结合活性的分子功能。KEGG分析发现,差异蛋白主要位于氨基酸的生物合成、双组份系统、碳代谢、嘌呤代谢、核糖体、NOD样受体信号通路、细菌分泌系统等重要通路。运用细菌的定向缺失和过表达技术分析了差异分泌蛋白对S型和R型布鲁菌细胞毒性的影响,结果显示,OmpW蛋白(BAB1_1579)和假定蛋白(BAB11185)与布鲁菌的细胞毒性密切相关。同时,我们发现R型布鲁菌ΔrfbE致死巨噬细胞与其T4SS的组分无关,而是T4SS分泌的某些效应蛋白起到了关键作用。
  综上所述,本研究揭示了R型布鲁菌ΔrfbE通过上调表达VjbR和virB操纵子的转录而导致T4SS的过表达并分泌过量的T4SS效应蛋白,在VceC、OmpW蛋白(BAB1_1579)和假定蛋白(BAB1_1185)等多种分泌蛋白的作用下过激活p-IRE1α引起内质网压力应激最终导致巨噬细胞死亡。本研究为粗糙布鲁菌诱导巨噬细胞死亡的分子机制提供了新的见解。
[博士论文] 郭威
流行病与卫生统计学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  探讨处理/暴露因素与结局之间的因果效应是医学研究中的重要课题。随机对照试验通常被认为是因果效应估计的金标准。在观察性研究中,研究对象的处理分配机制通常不是随机发生的,而是会受到众多混杂因素的影响。在比较处理组间的暴露效应时,如果忽略这些混杂因素,效果估计就会发生偏倚。基于边际结构模型的逆概率加权法(inverse probability weighing,IPW)是一类可用于观察性资料处理效应估计的重要方法。IPW在应用时需要满足一些前提假设,比如无遗漏未观测混杂因素、非负性假设、稳定单元处理值假设以及要正确设定权重估计模型等。对于IPW而言,第一阶段的逆概率权重估计非常关键,这是因为最终的处理效应估计对于第一阶段的权重估计准确与否非常敏感。如果权重估计模型设定错误(如遗漏二次项或交互项等),估计的权重就不准确,且容易产生极端权重,导致最终的效应估计发生偏倚。近年来,越来越多的研究人员推荐采用包括许多统计学习算法在内的数据适应性方法估计逆概率权重,取得了良好的效果。然而,目前的研究大多局限于二分类处理因素资料以及单一结局纵向生存资料。
  医学实践中存在着许多处理/暴露因素为连续性变量的资料以及时依性竞争风险生存资料。对于处理因素为连续性变量的资料类型而言,采用IPW进行效应估计要比二分类处理因素的情况更复杂,比如要考察处理因素的分布类型、控制较多的极端权重对于效应估计的影响等。对于时依性竞争风险生存资料而言,传统的边际结构原因别风险模型(marginal structural cause specific hazard models,MSCSHM)中的逆概率权重是多次随访所得的权重累乘所得。即使权重估计模型设定发生了比较轻微的错误,最终处理效应估计都将可能发生严重的偏倚。有鉴于此,探索基于统计学习算法的逆概率加权法在连续性处理因素资料以及时依性竞争风险生存资料中的适用效果具有潜在的理论意义和实际应用价值。
  研究目的:
  1、针对连续性处理因素的资料,通过模拟研究比较包括一般线性模型在内的7种逆概率权重估计方法在不同数据情境下的估计效果。同时,以一般线性模型为例,探讨权重截断方法对于效应估计的影响。
  2、针对时依性竞争风险生存资料,在MSCSHM的基础上,引入8种统计学习方法估计逆概率权重。通过模拟研究比较logistic回归与这8种方法在不同数据情境下的估计效果,筛选出其中表现较优的方法。另外,探讨不同程度的权重截断水平对于各个估计方法的影响。
  研究方法:
  针对以上两个研究目的,均分别采用数据模拟→模型构建→模型筛选→实例应用的研究流程开展研究。分述如下:
  1、连续性处理因素的逆概率加权方法研究
  采用蒙特卡洛法模拟处理因素为连续性变量的观察性队列资料。模拟实验设置三种不同大小的样本量(250、1000和2500)和四种不同复杂程度的处理因素生成模型(线性可加、非线性、非可加以及非线性非可加模型),比较一般线性模型(general linear model,GLM)、gamma回归模型、分位数分组法(quantile binning,QB)、协变量均衡性倾向性评分(covariate-balancing propensity score,CBPS)、非参数CBPS(nonparametric CBPS,npCBPS)、boosted分类与回归树(boosted classification and regression trees,boosted CART)和随机森林(random forest,RF)等7种方法估计广义倾向性评分和逆概率权重,另外,对由GLM得到的稳定权重分别在双侧1%和5%分位点进行截断处理,得到相应的截断权重。进一步,利用得到的9个权重变量对原始样本加权,通过加权结局回归模型得到各自的处理效应估计量。采用平均绝对相关系数(average absolute correlation coefficient,AACC)、相对偏倚(relative bias)、经验标准差(standard deviation,SD)、模型输出的标准误(standard error,SE)、均方根误差(root mean squared error,RMSE)和95%置信区间(confidence interval,CI)覆盖率等指标评价估计效果。最后通过研究吸烟量对于医疗总支出的影响,比较不同的IPW估计方法在实际数据分析时的应用效果。
  2、时依性竞争风险生存数据的逆概率加权方法研究
  首先提出采用MSCSHM作为本研究的基础框架,引入LASSO、贝叶斯logistic回归、CART、bagged CART、boosted CART、随机森林、支持向量机(support vector machine,SVM)和EL(ensemble learner)算法等8种统计学习方法构造第一阶段的逆概率权重。然后采用蒙特卡洛法模拟时依性竞争风险生存数据。模拟设置了两种不同大小的样本量(250和1000)、不同强度的处理因素序列的自相关性(相关系数为log(4)和0.5)、不同的竞争终点事件数(2和3)以及四种处理因素生成模型(线性可加、非可加、非线性以及非线性非可加模型)。分别采用logistic回归和上述8种统计学习方法估计稳定权重。另外,分别在稳定权重分布的双侧1%、5%、10%、25%、35%和50%分位点进行截断处理,探讨不同的截断水平对于处理效应估计的影响。
  上述研究过程均采用统计分析软件R3.4.3中实现。
  研究结果:
  1、连续性处理因素的逆概率加权方法研究
  (1)模拟研究结果:①在均衡协变量的能力方面,CBPS在所有方法中表现最好,其次为npCBPS。直接采用GLM法得到的原始稳定权重对样本加权,协变量分布仍然不均衡,通过权重截断方法去除极端值后,采用GLM(1,99)加权后的样本的协变量均衡性显著改善。②Boosted CART和RF在不同程度的权重估计模型误设的情况下的估计偏倚均较小,在减小偏倚方面优于其他方法。③由GLM、GLM(1,99)和GLM(5,95)三者的SD可以看出,权重截断方法可以减小估计量的方差,且随着截断水平的提高,方差逐渐变小。④CBPS、npCBPS和boosted CART的RMSE较小,估计精度较高。由于权重截断减小了方差,致使GLM(5,95)和GLM(1,99)的RMSE小于前述三种方法。⑤随着处理因素生成模型复杂度的上升,各个方法的95%CI覆盖率均有不同程度的下降。GLM(1,99)、CBPS、npCBPS和boosted CART四种方法的表现相对稳健。
  (2)实例研究结果:通过“考察处理因素的分布-逆概率权重的估计-考察权重的分布-协变量均衡性的评价-剂量反应函数的估计”的分析流程研究了吸烟数量对于医疗总支出的影响。结果表明,随着吸烟量的增加,个人的医疗总支出也随之增加;在调整了相关混杂因素后,吸烟量对于医疗总支出的效应虽有所减弱,标准误增大,但是除了boosted CART(1,99)加权法得到的估计量具有临界统计学意义外,GLM(1,99)和RF(1,99)加权法得到的估计量仍具有显著的统计学意义。
  2、时依性竞争风险生存数据的逆概率加权方法研究
  (1)模拟研究结果:①当处理因素生成模型仅包括主效应项(线性可加)时,boosted CART估计量的偏倚较小,且在SD和RMSE方面表现最优,而基于参数logistic回归的估计量的SD较大,估计精度较差。②当处理因素生成模型仅包括二阶交互项(非可加)时,在大样本且处理因素序列强自相关时,boosted CART和RF的估计效果非常接近,且均优于其他方法;在小样本或处理因素序列中度自相关时,RF在偏倚和RMSE方面表现最优。③当处理因素生成模型包括非线性项时,boosted CART在偏倚、RMSE和95%CI覆盖率方面最优。④当处理因素生成模型同时包括二阶交互项和非线性项时,RF在RMSE和95%CI覆盖率方面表现最优。⑤低水平(如双侧1%分位点)的权重截断能够进一步减小boosted CART和RF两种方法的RMSE。⑥在相同的模拟情境下,多数估计方法的最优截断水平不尽相同;在不同的模拟情境下,同一种方法的最优截断水平也有差异。最优截断水平的选择具有数据依赖性。
  (2)实例研究结果:采用带有时依性协变量的Cox比例风险模型、分别基于logistic回归和boosted CART的MSCSHM分析硫唑嘌呤暴露对炎症性肠病患者的两个竞争终点事件的风险大小。结果显示,无论处理因素定义为过去3个月暴露还是累积暴露,各个模型的效应估计结果均未显示暴露效应具有统计学意义。
  研究结论:
  对于连续性处理因素资料,CBPS和npCBPS在均衡协变量方面的能力较强;在减小估计偏倚方面,boosted CART和RF等统计学习算法的表现较优;在采用IPW进行效应估计时,应首先考察权重变量的分布,若存在较多离群点,应首先对权重作截断处理,然后进行下一步的效应估计。
  对于时依性竞争风险生存资料,在采用MSCSHM模型进行效应估计时,由于实际资料中的处理分配机制往往未知,建议采用boosted CART和RF两种方法替代传统的logistic回归构建逆概率权重,以减小模型设定错误对于效应估计的影响。
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