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[硕士论文] 卢光照
药剂学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着科学技术的发展,研究者针对肿瘤微环境探索出许多微环境特定响应型药物载体——刺激响应性载体,刺激响应性载体包括pH响应性载体、还原响应性载体、光响应性载体、超声响应性载体、磁场响应性载体和热响应性载体以及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)响应载体。ROS响应性载体已成为近年来药物载体研究的热点,相继出现了含硫多聚物ROS响应性载体、含硒多聚物ROS响应性载体、含碲多聚物ROS响应性载体和含不饱和磷脂ROS响应性载体等。在众多的ROS响应性载体中,含不饱和磷腊ROS响应性载体最具发展潜力,不饱和磷脂能被1O2快速氧化,从而实现载体中药物的快速释放。然而在具有多个病理情况时,单一地依靠ROS响应性载体并不能保证药物在特定部位释放,而光敏剂在光照后可以产生1O2,含不饱和磷脂载体能够实现1O2为基础的ROS响应。
  ROS响应脂质体材料DLPC是一种不饱和磷脂,具有四个不饱和双键,具有很强的ROS响应活性。PdPC(OBu)8是一种高效光敏剂,在光照的情况下可以产生大量1O2,能使不饱和磷脂快速氧化。光敏剂在特定波长光照射下能产生1O2,1O2不仅具有氧化不饱和磷脂的特性,而且具有光动力治疗的作用,从而改善ROS响应脂质体的治疗效果。
  因此,本研究设计并研究载光敏剂ROS响应性载体,以二亚油酰磷脂酰胆碱(1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DLPC)为ROS响应材料,1,4,8,11,15,18,22,25-八丁氧基酞菁钯[1,4,8,11,15,18,22,25-octabutoxypalladium phthalocyanine,PdPC(OBu)8]为产生1O2的光敏剂,构建以DLPC为响应物质的光敏ROS响应脂质体(LPD),探究LPD的体内外抗肿瘤活性。
  首先,合成了光敏剂PdPC(OBu)8并进行了结构鉴定,然后建立了盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride,DOX)和PdPC(OBu)8的含量检测方法。采用荧光分光光度法测定DOX含量,DOX浓度在1-20μg·mL-1时,线性回归方程为F=8.9337C+0.2412(R2=0.9995)。然后对DOX的HPLC方法进行了探索,DOX线性范围浓度为0.2-25μg·mL-1,线性回归方程为A=0.4494C+0.0100(R2=1)。采用紫外可见光分光光度法测定PdPC(OBu)8的含量,PdPC(OBu)8浓度在2-12μg·mL-1时,线性回归方程为A=0.0823C+0.0157(R2=0.9994)。本文还对PdPC(OBu)8的HPLC检测方法进行了探索,PdPC(OBu)8线性范围浓度为0.5-20μg·mL-1,线性回归方程为A=0.1002C-0.0054(R2=1)。
  其次,进行了LPD的处方筛选及表征。LPD的最优处方为DLPC用量为5%,胆固醇用量为40%,DSPE-PEG2000用量为5‰DSPC用量为50%(摩尔比),PdPC(OBu)8投药量为药脂比(m∶m)1∶200。LPD粒径为(169.3±1.2)nm,PDI为0.198±0.003,粒径均匀,分散性良好,zeta电位为(-39.8±0.8)mV。PdPC(OBu)8的包封率约为(84.43±3.12)%,载药量为(0.42±0.01)%。DOX的包封率为(91.03±3.33)%,载药量为(9.84±0.40)%。LPD具有良好的储存稳定性和良好的血清中稳定性。实验表明LPD在未光照的情况下,药物基本不释放;在光照(730nm,300mW·cm-2)的情况下,照射5min药物释放率达到(95.5±2.5)%(P<0.05),说明LPD具有ROS响应快速释放药物的特性。LPD光照前不产生1O2,光照(730nm,300mW·cm-2,3min)后产生大量1O2,因此LPD在光照时实现ROS响应。
  再次,以乳腺癌MCF-7细胞为模型细胞,探索了LPD的体外抗肿瘤活性研究。实验发现光照强度对MCF-7细胞没有毒性。PdPC(OBu)8脂质体(LP)在未光照前对MCF-7细胞具有较弱的毒性,光照(730nm,1200mW·cm-2,3min)后细胞毒性显著增强。LPD可以促进DOX在MCF-7细胞中的摄取,并且DOX经细胞摄取后主要分布于溶酶体。LPD进入细胞是通过小窝蛋白介导的能量依赖型内吞途径,并且LPD在活细胞内能产生少量ROS,光照(730nm,1200mW·cm-2,3min)后产生大量ROS。
  最后,以乳腺癌MCF-7细胞为模型细胞,以裸鼠为模型动物,探索了LPD的体内抗肿瘤活性研究。DOX的HPLC-MS分析方法特异性良好,线性范围在1-1000ng·mL-1,线性回归方程为ADOX/ADNX=0.0003C+0.0116,R2=0.9986,具有良好的基质效应和提取回收率,具有较好的准确度和精密度,因此,该DOX的HPLC-MS分析方法可以作为DOX药代动力学的检测方法。游离DOX的半衰期为1.42h,LPD的半衰期为7.16h,是游离DOX半衰期的5.04倍,具有显著性差异;非ROS响应脂质体(HPD)的半衰期为11.39h,是游离DOX半衰期的8.02倍,具有显著性差异;表明LPD与HPD均可以延长DOX的半衰期。相对于游离DOX,LPD具有清除率小,AUC大的特征。载Amplex UltraRed光敏ROS响应脂质体(LPU)在不光照时,经活体成像扫描发现肿瘤部位没有荧光,脂质体给药后光照(730nm,1200mW·cm-2,5min),经扫描发现肿瘤部位具有明显的荧光,表明LPU光照后能够产生ROS。游离DiR在肝、脾具有明显荧光,表明游离DiR主要分布在肝、脾部位。载DiR光敏ROS响应脂质体(LDiR)在肝、肿瘤具有明显荧光,表明DiR主要分布在肝、肿瘤部位。因此,说明LPD具有被动靶向性。空白脂质体(BP)和LP无抗肿瘤活性。游离DOX、DOX脂质体(LD)、光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的DOX脂质体(LD+hv)以及LPD具有相似的抗肿瘤活性,光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的LP具有较好的抗肿瘤活性,说明光照显著增强LP的抗肿瘤活性。光照处理(730nm,1200mW·cm-2,5min)的LPD(LPD+hv)具有最为显著的抗肿瘤活性,原因可能是DOX的化疗作用与PdPC(OBu)8光照产生的单线态氧光动力治疗的联合作用。未光照处理的HPD具有抗肿瘤活性,光照(730nm,1200mW·cm-2,5min)后抗肿瘤活性增强。然而LPD未光照时就具有与HPD光照后相似的抗肿瘤活性,光敏ROS响应脂质体光照(730nm,1200mW·cm-2,5min)后抗肿瘤活性显著增强。因此光敏ROS响应脂质体光照后具有最为显著的抗肿瘤活性。
  总之,本研究初步证明了LPD具有ROS响应特性,能够增强细胞毒性,增强细胞摄取,在动物体内的靶向特征明显,体内抗肿瘤活性显著,同时具有光动力治疗、化疗与光敏释药的作用,具有较好的发展前景。此外,LPD制备过程简单,对纳米药物产业化具有一定的指导意义。
[博士论文] 郭威
流行病与卫生统计学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  探讨处理/暴露因素与结局之间的因果效应是医学研究中的重要课题。随机对照试验通常被认为是因果效应估计的金标准。在观察性研究中,研究对象的处理分配机制通常不是随机发生的,而是会受到众多混杂因素的影响。在比较处理组间的暴露效应时,如果忽略这些混杂因素,效果估计就会发生偏倚。基于边际结构模型的逆概率加权法(inverse probability weighing,IPW)是一类可用于观察性资料处理效应估计的重要方法。IPW在应用时需要满足一些前提假设,比如无遗漏未观测混杂因素、非负性假设、稳定单元处理值假设以及要正确设定权重估计模型等。对于IPW而言,第一阶段的逆概率权重估计非常关键,这是因为最终的处理效应估计对于第一阶段的权重估计准确与否非常敏感。如果权重估计模型设定错误(如遗漏二次项或交互项等),估计的权重就不准确,且容易产生极端权重,导致最终的效应估计发生偏倚。近年来,越来越多的研究人员推荐采用包括许多统计学习算法在内的数据适应性方法估计逆概率权重,取得了良好的效果。然而,目前的研究大多局限于二分类处理因素资料以及单一结局纵向生存资料。
  医学实践中存在着许多处理/暴露因素为连续性变量的资料以及时依性竞争风险生存资料。对于处理因素为连续性变量的资料类型而言,采用IPW进行效应估计要比二分类处理因素的情况更复杂,比如要考察处理因素的分布类型、控制较多的极端权重对于效应估计的影响等。对于时依性竞争风险生存资料而言,传统的边际结构原因别风险模型(marginal structural cause specific hazard models,MSCSHM)中的逆概率权重是多次随访所得的权重累乘所得。即使权重估计模型设定发生了比较轻微的错误,最终处理效应估计都将可能发生严重的偏倚。有鉴于此,探索基于统计学习算法的逆概率加权法在连续性处理因素资料以及时依性竞争风险生存资料中的适用效果具有潜在的理论意义和实际应用价值。
  研究目的:
  1、针对连续性处理因素的资料,通过模拟研究比较包括一般线性模型在内的7种逆概率权重估计方法在不同数据情境下的估计效果。同时,以一般线性模型为例,探讨权重截断方法对于效应估计的影响。
  2、针对时依性竞争风险生存资料,在MSCSHM的基础上,引入8种统计学习方法估计逆概率权重。通过模拟研究比较logistic回归与这8种方法在不同数据情境下的估计效果,筛选出其中表现较优的方法。另外,探讨不同程度的权重截断水平对于各个估计方法的影响。
  研究方法:
  针对以上两个研究目的,均分别采用数据模拟→模型构建→模型筛选→实例应用的研究流程开展研究。分述如下:
  1、连续性处理因素的逆概率加权方法研究
  采用蒙特卡洛法模拟处理因素为连续性变量的观察性队列资料。模拟实验设置三种不同大小的样本量(250、1000和2500)和四种不同复杂程度的处理因素生成模型(线性可加、非线性、非可加以及非线性非可加模型),比较一般线性模型(general linear model,GLM)、gamma回归模型、分位数分组法(quantile binning,QB)、协变量均衡性倾向性评分(covariate-balancing propensity score,CBPS)、非参数CBPS(nonparametric CBPS,npCBPS)、boosted分类与回归树(boosted classification and regression trees,boosted CART)和随机森林(random forest,RF)等7种方法估计广义倾向性评分和逆概率权重,另外,对由GLM得到的稳定权重分别在双侧1%和5%分位点进行截断处理,得到相应的截断权重。进一步,利用得到的9个权重变量对原始样本加权,通过加权结局回归模型得到各自的处理效应估计量。采用平均绝对相关系数(average absolute correlation coefficient,AACC)、相对偏倚(relative bias)、经验标准差(standard deviation,SD)、模型输出的标准误(standard error,SE)、均方根误差(root mean squared error,RMSE)和95%置信区间(confidence interval,CI)覆盖率等指标评价估计效果。最后通过研究吸烟量对于医疗总支出的影响,比较不同的IPW估计方法在实际数据分析时的应用效果。
  2、时依性竞争风险生存数据的逆概率加权方法研究
  首先提出采用MSCSHM作为本研究的基础框架,引入LASSO、贝叶斯logistic回归、CART、bagged CART、boosted CART、随机森林、支持向量机(support vector machine,SVM)和EL(ensemble learner)算法等8种统计学习方法构造第一阶段的逆概率权重。然后采用蒙特卡洛法模拟时依性竞争风险生存数据。模拟设置了两种不同大小的样本量(250和1000)、不同强度的处理因素序列的自相关性(相关系数为log(4)和0.5)、不同的竞争终点事件数(2和3)以及四种处理因素生成模型(线性可加、非可加、非线性以及非线性非可加模型)。分别采用logistic回归和上述8种统计学习方法估计稳定权重。另外,分别在稳定权重分布的双侧1%、5%、10%、25%、35%和50%分位点进行截断处理,探讨不同的截断水平对于处理效应估计的影响。
  上述研究过程均采用统计分析软件R3.4.3中实现。
  研究结果:
  1、连续性处理因素的逆概率加权方法研究
  (1)模拟研究结果:①在均衡协变量的能力方面,CBPS在所有方法中表现最好,其次为npCBPS。直接采用GLM法得到的原始稳定权重对样本加权,协变量分布仍然不均衡,通过权重截断方法去除极端值后,采用GLM(1,99)加权后的样本的协变量均衡性显著改善。②Boosted CART和RF在不同程度的权重估计模型误设的情况下的估计偏倚均较小,在减小偏倚方面优于其他方法。③由GLM、GLM(1,99)和GLM(5,95)三者的SD可以看出,权重截断方法可以减小估计量的方差,且随着截断水平的提高,方差逐渐变小。④CBPS、npCBPS和boosted CART的RMSE较小,估计精度较高。由于权重截断减小了方差,致使GLM(5,95)和GLM(1,99)的RMSE小于前述三种方法。⑤随着处理因素生成模型复杂度的上升,各个方法的95%CI覆盖率均有不同程度的下降。GLM(1,99)、CBPS、npCBPS和boosted CART四种方法的表现相对稳健。
  (2)实例研究结果:通过“考察处理因素的分布-逆概率权重的估计-考察权重的分布-协变量均衡性的评价-剂量反应函数的估计”的分析流程研究了吸烟数量对于医疗总支出的影响。结果表明,随着吸烟量的增加,个人的医疗总支出也随之增加;在调整了相关混杂因素后,吸烟量对于医疗总支出的效应虽有所减弱,标准误增大,但是除了boosted CART(1,99)加权法得到的估计量具有临界统计学意义外,GLM(1,99)和RF(1,99)加权法得到的估计量仍具有显著的统计学意义。
  2、时依性竞争风险生存数据的逆概率加权方法研究
  (1)模拟研究结果:①当处理因素生成模型仅包括主效应项(线性可加)时,boosted CART估计量的偏倚较小,且在SD和RMSE方面表现最优,而基于参数logistic回归的估计量的SD较大,估计精度较差。②当处理因素生成模型仅包括二阶交互项(非可加)时,在大样本且处理因素序列强自相关时,boosted CART和RF的估计效果非常接近,且均优于其他方法;在小样本或处理因素序列中度自相关时,RF在偏倚和RMSE方面表现最优。③当处理因素生成模型包括非线性项时,boosted CART在偏倚、RMSE和95%CI覆盖率方面最优。④当处理因素生成模型同时包括二阶交互项和非线性项时,RF在RMSE和95%CI覆盖率方面表现最优。⑤低水平(如双侧1%分位点)的权重截断能够进一步减小boosted CART和RF两种方法的RMSE。⑥在相同的模拟情境下,多数估计方法的最优截断水平不尽相同;在不同的模拟情境下,同一种方法的最优截断水平也有差异。最优截断水平的选择具有数据依赖性。
  (2)实例研究结果:采用带有时依性协变量的Cox比例风险模型、分别基于logistic回归和boosted CART的MSCSHM分析硫唑嘌呤暴露对炎症性肠病患者的两个竞争终点事件的风险大小。结果显示,无论处理因素定义为过去3个月暴露还是累积暴露,各个模型的效应估计结果均未显示暴露效应具有统计学意义。
  研究结论:
  对于连续性处理因素资料,CBPS和npCBPS在均衡协变量方面的能力较强;在减小估计偏倚方面,boosted CART和RF等统计学习算法的表现较优;在采用IPW进行效应估计时,应首先考察权重变量的分布,若存在较多离群点,应首先对权重作截断处理,然后进行下一步的效应估计。
  对于时依性竞争风险生存资料,在采用MSCSHM模型进行效应估计时,由于实际资料中的处理分配机制往往未知,建议采用boosted CART和RF两种方法替代传统的logistic回归构建逆概率权重,以减小模型设定错误对于效应估计的影响。
[硕士论文] 王宾宾
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  因创伤、炎症、肿瘤、先天畸形等因素导致的寰枢椎生理关系破坏或运动功能异常称为寰枢椎不稳和/或寰枢椎脱位。作为常见的上颈椎疾患,因其易导致延髓、脊髓受压出现四肢感觉、运动功能障碍甚至死亡等严重后果。因此,对于寰枢椎脱位,临床上多采用手术治疗。主要的手术方式有经口前路复位植骨融合内固定、后路寰枢椎复位植骨融合内固定、后路枕颈融合内固定以及前后联合入路手术。后路手术因术野显露充分、固定切实牢靠、并发症少等优点在临床广泛应用。随着内固定器械的更新换代以及相关解剖学与生物力学知识的发展,内固定技术也由早期的线缆技术、椎板夹技术到一度被认为是金标准术式的经关节螺钉内固定技术(Magerl技术),再到如今应用最为广泛的钉棒技术。每一种内固定技术的出现都极大地促进了后路寰枢椎内固定水平及临床救治能力的提升。
  寰枢椎椎弓根螺钉或侧块螺钉固定因良好的生物力学稳定性、较高的植骨融合率及灵活多样的组合形式经久不衰,已成为后路寰枢椎内固定的首选术式。但因寰椎位置深在,毗邻复杂及解剖变异,显露及置钉过程中存在损伤椎动脉、C2神经根、静脉丛的风险导致术中出血增加及术后枕后区麻木,甚至出现无法置钉的情况。另外,现有的寰椎内固定方法对手术器械及术者的技术要求较高,且学习曲线长,不利于推广应用,导致相当一部分患者被迫接受了枕颈融合内固定手术,从而使颈部活动丢失,严重的影响了生活质量。因此,需要一种既能有效降低寰椎置钉风险与置钉难度同时又可提供足够稳定性的内固定技术。该技术既可作为寰椎椎弓根螺钉或侧块螺钉固定的良好补充,又可作为后路寰枢椎翻修的可选术式。国外曾有文献报导寰椎后弓锁定钉板系统,但其设计尚存部分缺陷且规格参数完全按照欧美人种设定,不完全适用于国人且国人相关解剖学数据尚属空白。为此,本课题通过CT与人寰椎骨标本两个方面测量健康成人寰椎后弓系列解剖参数并依据所测得数据初步设计成人寰椎后弓板,通过三维有限元分析探究后弓板的应力分布情况及三维稳定性,经过体外生物力学试验进一步探究其生物力学稳定性,为后续设计的改进及临床应用提供参考。
  目的:
  1、对健康成人寰椎三维螺旋CT及健康寰椎骨标本进行测量,获取寰椎后弓相关的解剖参数,并依据所测数据初步设计寰椎后弓板。
  2、建立寰枢椎不稳的三维有限元模型并分别模拟寰椎后弓板内固定及后路寰枢椎椎弓根钉棒内固定,初步探究后弓板的应力分布情况及三维稳定性。
  3、建立寰枢椎不稳的体外模型并分别进行寰椎后弓板与后路寰枢椎椎弓根钉棒内固定,测量并比较各组模型中C1-C2节段三维活动度(ROM),进一步评价寰椎后弓板的生物力学稳定性,为后续设计的改进及临床应用提供依据。
  方法:
  1、通过医学影像存档与通信系统(PACS),随机抽取60例(男30,女30)成人寰椎三维CT(simenz)影像资料并用自带测量工具测量后弓相关解剖结构。选取30例(年龄、性别不详)干燥寰椎骨标本,应用国产游标卡尺(精确度0.01mm)及角度测量仪(精确度0.01°)测量后弓相关解剖结构。测量内容为:后结节中央及距中央5mm、10mm、15mm处后弓高度(矢状面垂直距离)及厚度(轴位距离)、水平面后弓夹角、内侧面椎动脉沟半距、外侧面椎动脉沟半距,并根据测得数值初步设计寰椎后弓板。
  2、查阅相关文献,利用Mimics10.01、Geomagic Studio2013、SolidWorks2017、Abaqus6.14等有限元分析软件,设定相关参数,建立寰枢椎完整状态、失稳状态、寰椎后弓板+枢椎椎弓根钉棒内固定、寰枢椎椎弓根钉棒内固定的三维有限元模型并进行分析,探究后弓板的应力分布情况;测量各组模型在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个方向的C1-C2节段ROM,比较各组间ROM有无差异,初步评价寰椎后弓板的科学性及稳定性。
  3、应用人体颈椎骨标本建立寰枢椎完整状态、失稳状态、寰椎后弓板+枢椎椎弓根钉棒内固定、寰枢椎椎弓根钉棒内固定的体外模型,验证模型有效性后测量各组模型在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM,比较各组ROM值有无差异,进一步探究寰椎后弓板的生物力学稳定性,为后续设计的改进及临床应用提供参考。
  结果:
  1、获得了国人成人寰椎后弓系列解剖参数并据此初步设计了寰椎后弓板。
  2、建立了寰枢椎失稳的三维有限元模型,共包含53346个单元,62348个节点,较真实地模拟了相关材料特性,并进行了有效性验证。
  3、应用已建立的三维有限元模型,分别模拟了后弓板内固定与后路椎弓根钉棒内固定,并进行了应力分布测试及前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM测量。
  4、有限元分析结果显示寰椎后弓板应力分布均匀,未出现明显应力集中情况;失稳模型组在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM值均显著高于完整模型组;后弓板内固定组与后路椎弓根钉棒内固定组在上述各运动方向的C1-C2节段ROM值均显著低于完整模型组;后弓板内固定组在各运动方向的C1-C2节段ROM值与后路椎弓根钉棒内固定组在相应运动方向的C1-C2节段ROM值相比均未见明显统计学差异。
  5、建立了寰枢椎体外模型,分别测量了完整状态组、失稳状态组、后路椎弓根钉棒内固定组、后弓板固定组在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个方向的C1-C2节段ROM并进行了组间差异性比较。
  6、体外生物力学试验结果显示失稳模型组在前屈/后伸、左/右侧屈、左/右旋转6个运动方向的C1-C2节段ROM值均显著高于完整模型组;后弓板内固定组与后路椎弓根钉棒内固定组在6个运动方向的C1-C2节段ROM值均显著低于完整模型组及失稳模型组;后弓板内固定组在各运动方向的C1-C2节段ROM值与后路椎弓根钉棒内固定组在相应运动方向的C1-C2节段ROM值相比均未见明显统计学差异。
  结论:
  1、解剖学研究提示寰椎后弓板适用于90%以上人群,具有较高的可行性。
  2、三维有限元分析提示寰椎后弓板应力分布均匀,设计科学。
  3、生物力学研究表明寰椎后弓板内固定与传统后路椎弓根钉棒内固定生物力学稳定性相当,有望成为现有后路钉棒内固定技术的良好补充。
[博士论文] 王智巍
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:临床上多种骨科疾患需要骨移植替代物行植骨融合和骨结构修复重建,如创伤、肿瘤、骨折不愈合、骨组织发育不良、脊柱融合手术等等。骨结构修复重建是改善骨缺损患者日常生活质量、使其重新投入社会劳动的唯一有效方法,因此骨替代物的研究对社会发展具有极其重要的意义,也是骨组织工程的终极目标。
  目前已有数十种复合骨移植替代产品获美国FDA批准用于临床治疗,这些产品虽然具有良好的生物相容性,能一定程度上诱导成骨分化,但难以同时满足与宿主骨组织相匹配的机械性能和供成骨细胞渗透生长的合理三维孔隙结构,尤其在治疗大段骨缺损时,现有的骨移植替代物产品难以达到临床骨组织重建要求。鉴于天然骨组织特殊的生理微观结构,理想的骨替代产品应具备以下条件:(1)与宿主骨组织相匹配的机械强度;(2)恰当的孔隙率和孔隙结构;(3)利于细胞粘附、分化和增殖的表面结构;(4)良好的生物相容性以及与骨组织生长相适应的可控降解率。由此可见,当前的众多产品还远远达不到理想骨替代物的标准。如何改进骨替代原材料模拟构建骨组织结构技术,显得尤为重要。
  近年来,3D打印技术用于骨缺损的修复重建已成为一种新的热点及趋势,但单纯的3D打印支架成骨诱导和骨传导性能均欠佳,支架表面需要用一些具有骨诱导或成骨作用生物活性材料做修饰,才能改善其性能。目前用于表面修饰的材料主要是生物活性玻璃,生物陶瓷及纳米羟基磷灰石等,但上述材料成分均为无机物,且成骨诱导性能较差,表面修饰物中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)虽然能改善支架成骨诱导功能,但其确实效果有待进一步实验考证。
  脱钙骨基质(DBM)主要由93%的胶原(传导成骨表面活性物质)、5%的可溶性蛋白(诱导成骨的骨形态发生蛋白和转化生长因子、胰岛素样生长因子等协同蛋白)以及2%的残余矿化基质,是具有良好的诱导成骨、传导成骨特性的商业化生物材料。它以单独或联合其他材料的方式广泛用于骨折、骨不连、骨肿瘤、骨融合、股骨头坏死等手术。但是DBM缺少骨矿物质,因机械强度较差而难以成为理想的骨移植替代物。但若将DBM经过一定的物理方法进行颗粒尺度上的改变,而后作为3D打印支架的表面修饰,这有可能使支架在获得稳定机械强度的同时,增加支架的骨诱导性和骨传导能力。
  将材料纳米化并应用于骨缺损的修复成为近年来骨组织工程的研究热点。其研究方向主要集中于矿化机理、改善支架骨诱导性能、组织修复、药物载体、细胞载体及基因载体等医学领域的应用,国内外学者在这一领域已取得了良好的进展。但众多骨移植材料中鲜有关于纳米同种(异体)脱钙骨基质(nDBM)的研究报道。纳米材料具有特殊的比表面积效应,它极易与外来原子吸附键结合,表现的特性不同于它在整体状态时的性质。研究表明,骨髓间充质干细胞及成骨细胞对纳米尺度材料极其敏感,在60-150nm时尤为明显,纳米颗粒及粗糙的纳米凹槽结构可有效增加丝状伪足的感知能力,促进细胞扩散及粘附,使其在纳米纤维构成的三维微环境快速增殖。
  为此,本课首先通过改良Urist法制备冻干脱钙骨基质,运用二次低温物理研磨法将DBM研磨至纳米级别,电镜检测其粒径尺度并对其生物安全性进行系统评价。随后将实验组前期制备的PCL-TCP3D打印支架进行nDBM表面修饰,并通过体外细胞实验及动物骨缺损模型填充等实验,对其生物相容性及体内骨缺损修复效果进行评估。通过以上努力,发展具有中国自主知识产权的高生物安全性骨修复用生物材料的制备新方法,并为该种新型骨组织工程支架的进一步的应用提供科学依据。
  第一部分:nDBM的制备及性能检测
  目的:旨在通过物理研磨法将块状DBM处理至纳米级,并对研磨效果及材料的生物安全性进行检测
  方法:采用低温研磨法,先将DBM初步研磨至微米级别颗粒,再通过高能球磨机进行纳米尺度研磨,扫描电镜观测研磨效果及材料形貌。而后按医用生物植入材料安全标准ISO10993(GB/T16886)对nDBM行急性毒性实验、溶血实验、致敏试验及细胞毒性试验,评价材料的生物安全性。
  结果:经二次低温物理研磨后,所制得的nDBM底层致密,呈纤维状相互连接,纤维粗细不等,直径约40-80nm,表面充满不规则纳米颗粒,颗粒直径20nm-50nm左右,纳米颗粒相互团聚,表面密布纳米级别凹槽,纳米纤维结构间相互连接,内部形成大量相互连通的微米级别孔隙,其微观结构符合纳米生物材料范畴。实验结果证明,nDBM不引起实验动物急性毒性反应,溶血率复合生物材料安全性要求,无致敏现象发生,细胞毒性实验显示细胞增殖良好。因此,nDBM具有良好的生物相容性,可用于体内植入实验。
  结论:低温物理研磨法能成功将DBM纳米化,材料的生物安全性指标符合医用植入材料安全标准。
  第二部分:nDBM/PCL-TCP复合支架的构建及生物学性能检测
  目的:将nDBM修饰于PCL-TCP3D打印支架表面,并对各组材料的生物相容性及成骨诱导性进行检测。
  方法:采用浸泡冻干法将nDBM均匀负载于支架表面,通过扫描电镜观察复合支架构建效果,而后进行体外细胞学实验,CCK-8法检验骨髓间充质干细胞的增殖情况,实时荧光PCR、Westen bolt检测材料成骨诱导相关基因及蛋白的表达,并对统计结果进行分析。
  结果:采用75%的乙醇作为溶剂,按nDBM与稀释剂1∶5的比例浸泡后的支架,经冻干后,可使支架各纤维表面均匀覆盖nDBM颗粒,电镜扫描观察发现,nDBM与支架粘附良好,底层致密,表面布满大小不一的nDBM颗粒,纳米颗粒部分团聚,表面布满纳米级别凹槽,成功构建了一种新型的nDBM/PCL-TCP复合支架。通过CCK-8检测BMSCs的增殖情况,通过绘制细胞生长曲线,发现细胞在nDBM修饰的支架表面不断增殖,各时间点细胞增长数量均高于单纯PCL-TPC支架。Western blot、real-time PCR等多种实验表明nDBM修饰的复合支架各成骨相关基因及蛋白表达水平明显高于单纯支架组。
  结论:采用冻干法能成功制备具有纳米级别表面结构的nDBM/PCL-TCP复合支架。CCK-8、Western blot、real-time PCR等多种实验表明nDBM修饰的复合支架有利于BMSCs增殖并向成骨细胞方向分化。
  第三部分:nDBM对兔股骨和nDBM/PCL-TCP复合支架对兔桡骨大段骨缺损修复的实验研究
  目的:评价nDBM对兔股骨缺损及nDBM/PCL-TCP复合支架对兔桡骨大段骨缺损的修复能力。
  方法:建立兔股骨缺损模型,将nDBM填充入缺损部位并设立空白对照组;建立兔桡骨大段骨缺损模型,将nDBM/PCL-TCP复合支架植入缺损部位,对照组植入单纯PCL-TCP支架。术后一定的时间点处死动物取材,通过大体观察,Micro CT及组织切片染色等评价材料骨缺损修复情况。
  结果:大体观察见nDBM填充组骨缺损区皮质已基本愈合;nDBM/PCL-TCP复合支架组骨缺损两端已有骨痂形成。影像学检查提示nDBM组骨修复效果优于空白组;nDBM/PCL-TCP复合支架组骨痂明显生成,部分支架纤维表面甚至已形成骨桥,优于单纯PCL-TCP支架。组织切片染色显示nDBM修饰的复合支架孔隙内大量骨细胞长入、纤维形成,部分支架表面甚至形成板层骨,骨诱导及成骨性能均优于单纯PCL-TCP支架组。
  结论:nDBM/PCL-TCP复合支架能有效促进大段骨缺损区域骨再生与骨重建,PCL-TCP支架经nDBM修饰后,骨诱导与骨传导性明显增强,有利于新生骨向支架内长入。
[硕士论文] 曾敏
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  中国是终末期肝病(End stage liver disease,ESLD)的高发地区,肝移植是治疗终末期肝病最重要的有效手段,但由于供体不足,大量肝衰竭患者无法得到及时救治。随着再生医学的发展,工程化肝脏技术为终末期肝病的治疗带来了新的希望。虽然目前研究众多,但是种子细胞的来源、三维结构的构建、血管网络和胆管结构的重建等一系列技术问题仍未得到很好的解决,制约着肝脏组织工程的发展。至今为止,尚未有任何一款组织工程肝脏可在真正意义上走向临床。
  肝脏组织工程最佳的种子细胞选择当属人的原代肝细胞。但是,原代肝细胞在体外培养时会逐渐失去其形态学特征和肝细胞特异功能,且它的体外扩增一直是肝再生领域尚未解决的瓶颈问题,此外还必须考虑伦理限制和细胞来源匮乏的问题。现有的解决方法主要包括:使用永生化肝细胞株替代原代肝细胞;将各类干细胞在体外定向分化为功能性肝细胞;通过采用导入外源基因的方法使体细胞去分化为诱导多能干细胞再进行肝向分化;将体细胞(例如成纤维细胞)直接基因重编程为诱导肝细胞。此外,近期研究团队和日本科学家几乎同时发现,通过小分子重编程技术,可以将小鼠的原代肝细胞去分化形成肝脏前体样细胞,该细胞可在体外进行规模化扩增,且分化后可重新获得成熟肝细胞的功能。这些类肝细胞在体外虽然具有一定的肝功能,但是它们各自存在着成熟度不足、有限性扩增、功能不稳定、异种移植排斥、生物安全性不高和致瘤风险等应用障碍。
  肝芽是具有发育能力和肝功能的初期肝脏组织,是肝脏发育的起源。最近,Takebe团队将人类诱导多能干细胞诱导分化的肝脏前体细胞(iPSC-HEs)与人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)、人类骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)在体外进行混合培养,建立了一种培育肝芽的方法。将这些肝芽移植入小鼠体内后,会快速地生成血管结构并与小鼠本身的血管连接,还可以表现出部分人类肝脏所特有的功能。然而这些肝芽的规模太小了,不能形成胆管结构,无法在体外进行功能分化和长期维持,移植后也未能在体内发育成完整的肝脏功能模块,所以在将这种方法引入临床前还需要进行相当大量的研究及优化。
  结合上述问题,本研究通过实现人原代肝细胞的体外扩增,以及基于肝芽的形成构建了具有生理功能和三维立体形态的工程化肝脏。为肝脏组织工程提供了全新的种子细胞来源,并为肝脏组织工程的构建开辟了新思路及新策略,对人类重要器官的再生和重建具有重要的科学意义。
  方法:
  1.通过两步灌流法分离获取人的原代肝细胞,用改良的肝细胞转化增殖培养基(TEM)进行扩增,并对增殖的肝细胞进行验证;
  2.将HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs按比例在体外混合培养,对形成的肝芽进行观察,并对其培养条件进行摸索和优化;
  3.采用ELISA、CCK8、生化检测以及PCR等检测手段确定体外培养的肝芽的细胞活力、肝细胞功能、以及是否具有肝胆双向分化的潜能;
  4.通过低温化学方法制备肝脏脱细胞生物支架,并对其进行去细胞效果、生物成分、形态结构以及细胞学毒性的检验;
  5.每上述三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内,构建工程化肝脏,并在体外用搭好的循环灌注培养系统进行培养;
  6.对在体外构建的工程化肝脏在不同时间点进行肝功能评价和组织学评价。
  结果:
  1.发现在特定的培养条件刺激下,人的原代肝细胞可以在体外转化为HepLPCs来进行规模化扩增;
  2.来自于不同供体的、不同培养时间点的、不同代数的HepLPCs具有肝前体细胞的特征,且在长期的培养过程中能够保持稳定,具有高度的相似性;
  3.建立HepLPCs、HUVECs和hUC-MSCs三种细胞共培养体系,发现它们在体外混合培养后可以形成肝芽;
  4.肝芽在体外维持培养时细胞的损伤和凋亡情况不明显,肝功能没有稳定上升,但胆系转录因子有所提高,发现肝芽存在向胆管分化的潜能;
  5.制备有效去除细胞成分、形态结构以及基质成分保存良好的肝脏脱细胞生物支架;
  6.基于肝芽的形成,将上述三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内,在体外构建具有生理功能和三维立体结构的工程化肝脏,并进行维持培养。12天后,观察到类胆管结构。
  结论:
  本研究通过对培养条件进行改良和优化,用小分子重编程技术使得人的原代肝细胞在体外可以去分化为HepLPCs来进行增殖,为肝脏组织工程提供了全新的种子细胞来源。随后发现HepLPCs可以与HUVECs和hUC-MSCs在体外混合培养形成肝芽。基于这种肝芽的形成,将三种细胞按比例混合后输入肝脏脱细胞生物支架内,经过灌注培养构建了具有三维立体结构和生理功能的工程化肝脏。我们的研究能够为肝脏组织工程的构建提供新的思路,对人类重要器官再生和重建具有重要的科学意义。
[硕士论文] 张本金
数学 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:糖尿病是因为遗传、免疫功能紊乱等因素,致使人体出现胰岛素分泌功能减退或者胰岛素抵抗,打破血糖的平衡状态,出现了持续高血糖,是现代人常见的一种慢性疾病,糖尿病已经成为严重危害现代人健康的多发疾病.目前医学界还没有根治糖尿病的手段,人工胰岛由此产生,其中利用血糖闭环控制系统设计和测试的算法是人工胰岛的关键.由于葡萄糖-胰岛素系统是非线性的,传统的控制理论对于解决此类非线性系统的建模和控制问题有很大的难度.因此,研究对葡萄糖-胰岛素系统模型的控制具有重大意义.而Takagi-Sugeno(T-S)模糊模型可以以任意精度逼近非线性函数,对于非线性系统可以应用线性控制理论方法进行分析和控制.因此,T-S模糊方法可以成为研究血糖控制系统的手段之一.
  本文的研究目标是将葡萄糖-胰岛素系统模型辨识成T-S模糊模型,然后基于李雅普诺夫稳定性的理论方法,采用并行分布补偿技术设计控制器、利用线性矩阵不等式处理方法,研究血糖控制系统的H∞控制问题,以达到对糖尿病病人的血糖控制的目的.
  首先,介绍了葡萄糖-胰岛素系统及人工胰岛的结构和工作机理.
  其次,研究了T-S模糊系统的H∞控制问题,通过构造模糊李雅普诺夫函数,应用并行分布补偿方法设计了有约束条件的反馈控制器,给出了由一组线性矩阵不等式表示的系统全局渐近稳定条件,并且满足H∞性能.
  最后,将葡萄糖-胰岛素系统模型辨识成T-S模糊模型.通过应用前面得到的系统全局渐近稳定条件,设计了有约束条件的反馈控制器.并应用MATLAB工具箱对例子进行仿真,进而,所得理论的有效性得到了验证.
[硕士论文] 马林
药剂学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:比较聚氯乙烯(PVC)输液器与聚烯烃热塑性弹性体(TPE)输液器对4种常用注射液的稳定性与吸附性的影响。
  方法:将乳酸环丙沙星氯化钠、乳酸左氧氟沙星氯化钠、左氧氟沙星氯化钠和托烷司琼氯化钠四种常用注射液迅速充满输液器并封存或模拟临床输液正常流速流经输液器,计时采集样品后稀释。并采用HPLC法测定环丙沙星、左氧氟沙星和托烷司琼各时间点的样品浓度,比较各药组内及组间的含量变化,评价各药在两材质输液器中的稳定性和吸附性。
  结果:PVC和TPE输液器乳酸环丙沙星氯化钠注射液、乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液、左氧氟沙星氯化钠注射液、托烷司琼氯化钠注射液最终(90min)各药百分含量分别为94.56%、98.77%、98.35%、100.33%和101.04%、100.08%、99.68%、101.14%,两组含量变化无显著差异(P>0.05),提示各药稳定。PVC和TPE输液器90min各药百分含量分别为100.34%、100.38%、101.09%、99.42%和100.59%、101.76%、102.14%、101.19%,两组间含量变化无显著差异(P>0.05),提示两种输液器对四种药物均无明显吸附作用。
  结论:PVC和TPE输液器不影响乳酸环丙沙星氯化钠注射液、左氧氟沙星氯化钠注射液、乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液、托烷司琼注射液的稳定性,对四种注射液中各药亦无吸附发生,可常规使用。
[博士论文] 汪锡
控制科学与工程 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:营养不良是指因能量或营养素的不平衡而对人体产生有害影响的一种营养状态,营养不良及其造成的住院病人重要生命器官受损和大众健康领域的慢病高发已成为住院病人面临的巨大风险和重要的公共健康问题。通过测量人体代谢速率和代谢底物,确定营养需求,进而进行合适的营养支持,是防治营养不良的有效手段。在代谢测量方法中,间接测热法具有相对廉价、便捷等优点,已成为临床营养中营养评估和营养支持的重要方法。然而,我国间接能量测试仪(IC)的普及程度仍然很低,尤其对于中小型医院和大众健康领域。其原因主要在于:①测量仪器依赖于进口,价格昂贵,测量成本及器维护成本高;②测量相对耗时,不能满足我国医院病人服务高效率的需求;③测量需要专业操作人员。基于上述情况,本文开展如下研究:
  1、一种基于头罩式稀释法的间接能量测试方法的建立
  基于间接能量测试原理,本研究通过呼吸气体分析方法设计、气体采集与分析软硬件平台搭建,建立了具备自主知识产权的基于头罩式稀释法的间接能量测试方法。该方法采用了电子压力自动控制技术,通过反馈机制调节比例阀孔径,控制管路压力恒定,确保浓度测量的准确性;采用了稳定状态识别技术,不仅实时监测和显示被测试者呼吸交换参数VO2和VCO2的稳定程度指标(CV%),为操作者获取稳定状态下的代谢参数提供直观的参考,而且自动获取稳定状态区间的数据计算最终测量结果,降低了操作人员依赖性。
  2、间接能量测试系统的重复性与有效性研究
  重复性:通过38名受试者开展短期重复测量实验,用组内相关系数(ICC)、变异系数(CV%)、Bland-Altman分析的一致性范围(LoA)作为评价指标。结果显示,两次测量的VO2和VCO2的ICC分别为0.945和0.907,CV%分别为5.9%和8.3%,LoA分别为-21.0~29.1和-27.7~30.9,重复性较好且达到国际同类设备的水平。有效性采用两种方法:①体外模拟验证:模拟的呼吸交换参数与测量值的相关系数高(r=0.99,p<0.001),LoA范围窄(VO2:-1.14~6.48,VCO2:-0.87~8.11);②体内实验验证:采用本设备和同类设备(VO2000)对38人进行测量结果比较。结果显示,二者相关系数高(VO2:r=0.91,p<0.001,VCO2:r=0.89,p<0.001),均值差异小(VO2:5.9%,VCO2:5.5%),一致性尚可(VO2:-26.9~50.3,VCO2:-24.8~43.2)。上述结果表明,自主研制的间接能量测试仪有效性较好。
  3、静息代谢率快速获取方法研究
  针对当前静息代谢率(RMR)测量耗时的现状,本研究重点探索了RMR快速获取方法。首先,研究了当前RMR测量协议简化的可行性。提出1-min步长滑动时间窗法,通过32个受试者实验,观察分析RMR测量过程中人体状态稳定程度(CV%)和代谢率的动态变化过程。结果发现优化当前测量协议、缩短测量时间具有可行性。其次,研究了基于心率监测的RMR快速获取方法。基于心率与耗氧量、代谢率之间的关系,提出了一种基于心率监测的RMR快速获取方法。通过42名健康人群实验,验证了该快速获取方法的准确性。实验结果也表明,该方法不仅能够大幅减少平均测量时间(14分钟),而且能够根据被测试者个体状态进行判断,个性化测量时间。
  4、非肥胖健康成年人RMR最佳预测公式研究
  静息代谢率预测公式具有无成本、使用简单等特点,在缺乏IC的情况下能够发挥重要作用。RMR预测公式的适用与否在不同人群中存在差异。然而,针对我国非肥胖健康成年人群的RMR预测公式准确性研究仍然缺乏。因此,本研究应用所研制的间接能量测试仪,通过对46位该类人群RMR进行测量,评估14中常见预测公式的准确性。研究结果表明,该14个预测公式的准确性均不理想,IC法仍是评估该类人群RMR的首选方法。相对而言,Henry公式最适用,能够准确估算约70%该类人群的RMR,在缺乏IC的情况下,可将Henry公式作为IC的替代方法。未来的研究中,需要建立基于大样本、适用于我国特定人群的RMR预测公式。
[博士论文] 吴刚
外科学(整形外科) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本课题希望构建可注射式多重生物活性因子控释凝胶,由RADA肽(arginine[R]-alanine[A]-aspartate[D]-alanine[A])凝胶和纳米羟基磷灰石(nano-Hydroxyapatite,nHA)构成支架,聚乳酸-乙醇酸纳米颗粒(Poly Lactic-co-Glycolic Acid Nanoparticle,PLGA-NP)包裹重组人骨形成蛋白-2(Reconstruction human Bone Morphogenetic Protein-2,rhBMP-2)构成缓释细胞因子;人牙周膜干细胞(human Periodontal Ligament Stem Cells,hPDLSCs)构成种子细胞。以期通过复合支架材料中rhBMP-2的缓释有效诱导hPDLSCs向成骨细胞方向分化,并通过可注射式材料提高支架的塑形能力。
  方法:
  1)选择正畸过程中因治疗需要拔除的青少年第一前磨牙,收集牙周膜,进行原代细胞培养,并通过分离培养得到hPDLSCs,通过免疫荧光鉴定OCT4(Octamer-binding protein4)表达;流式鉴定hPDLSCs的相关因子表达,确定获得的hPDLSCs可用于后续研究。
  2)以rhBMP-2为模型药,以PLGA为载体材料,制备得到载rhBMP-2的PLGA纳米颗粒,通过电镜检测其粒子形态,并对其粒径的大小和分布进行测定,ELISA试剂盒检测rhBMP-2的缓释参数;探索RADA多肽触发条件的优化方案,筛选RADA胶凝的最佳条件。最后进行BMP-2、BMP-2/PLGA-NP,BMP-2/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA释放率的测定。
  3)将RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分别与hPDLSCs共培养观察细胞的成骨情况:7d检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)的活性;14d进行茜素红染色;分别于第7d和14d收取样本进行检测和比较两个成骨标志基因ALP和骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)经不同处理后的表达水平。
  4)将RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分别与hPDLSCs共培养后注射进入裸鼠体内,4周后进行检测成骨情况。Micro-CT扫描检测不同分组之间的差异。将小鼠处死后取组织进行HE染色观察组织的病理变化,观察到成骨现象后进行茜素红检测。RT-PCR检测成骨标志基因ALP和OCN的表达。
  结果:
  1)经有限稀释法分离培养获得的细胞,经显微镜观察呈多角型或梭型。对该类细胞的表面标志物进行检测:利用免疫荧光染色方法检测OCT4的表达,细胞发出明亮的红色荧光,OCT4阳性表达,提示该细胞具备干细胞特性;流式细胞仪检测显示细胞CD7表达量为93.1%、CD90表达量为95.7%、CD105表达量为94.8%,均为阳性,而CD34、CD45和CD79a表达则呈阴性。
  2)在透射电镜下,载BMP-2的PLGA纳米颗粒呈现为球形,粒径的分布相对较为均匀;激光粒度仪测定结果显示,其粒径约为100nm,pdi为0.231。经载药量测定BMP-2/PLGA-NP中BMP-2包载量为835ng,每毫克冻干粉含BMP-2约20.27ng,包封率约为17%。采用单因素考察筛选RADA的触发条件,确定了RADA凝胶触发的最佳条件为:RADA浓度1%,触发剂0.5%Tris,触发时间0.25h时。该条件下可以使RADA胶凝,有一定的弹性,并具有固定的形态,不具有流动性。BMP-2、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA在透析袋内的释放情况表明:PLGA有明显的药物缓释功能,RADA凝胶对药剂成分的扩散也有明显的阻滞作用,但他们单独作用时都不足以让BMP-2对牙周膜干细胞的生长产生持续性的促进作用。将二者结合,即将BMP-2包裹至PLGA纳米粒后再分散至RADA凝胶中,使纳米粒在静态环境中更加缓慢地释放药物,叠加凝胶的阻滞扩散作用,最终使得BMP-2的缓释作用超过21d。
  3)RADA和hPDLSCs共培养14d后,细胞未见明显的成骨分化:nHA对PDLSCs向成骨细胞分化有一定的促进作用。BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA、BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA与hPDLSCs共培养后均能使hPDLSCs向成骨方向诱导分化,诱导14d后观察BMP-2/PLGA-NP组、BMP-2/PLGA-NP/RADA组和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA组都能明显地观察到成骨现象。ALP检测发现,RADA凝胶并不能提高ALP的活性;BMP-2/PLGA-NP组、BMP-2/PLGA-NP/RADA组ALP活性增强,与RADA组相比差异有统计学意义(p<0.01);BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA组ALP活性增加最为明显,与RADA组相比差异有统计学意义(p<0.01)。在第14d的茜素红检测中发现,BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA染色后矿化结节最明显,nHA组有少量矿化结节,而RADA组无法观察到。对成骨标志基因ALP、OCN表达水平的检测结果显示,经RADA凝胶处理后ALP、OCN表达量均没有明显升高,较PDLSCs组差异没有统计学意义,而BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA组ALP、OCN的表达量明显升高,其中BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA组最高,三组较PDLSCs组差异均有统计学意义(p<0.01)。
  4)将RADA、nHA、nHA/RADA、BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA分别与hPDLSCs混合后接种于裸鼠背部,4周后Micro-CT检测发现,BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA、BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA能够观察到较为致密的组织形态;各实验组通过HE染色和茜素红染色都能够明显观察到有类似成骨组织和矿化结节。植入hPDLSCs+RADA凝胶的裸鼠中ALP和OCN表达量与接种hPDLSCs细胞组没有差异;而其他各组注射后裸鼠4周后OCN和ALP基因表达量均明显提高(p<0.01)。而BMP-2/PLGA-NP、BMP-2/PLGA-NP/RADA和BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA组ALP、OCN表达量明显升高,其中BMP-2/PLGA-NP/RADA/nHA组最高,三组较PDLSCs组差异均有统计学意义(p<0.01)。
  结论:
  本研究成功构建了多元RADA肽凝胶支架复合体,该复合体可以以溶液形式注射给药,到达给药部位后通过离子化胶凝机制形成凝胶支架。该支架可以为hPDLSCs提供三维生长环境。同时在该支架内,生物可降解的PLGA纳米粒可以缓慢释放BMP-2,与nHA协同作用促进hPDLSCs向成骨细胞分化,取得良好的成骨效果。
[博士论文] 孟晓丽
眼科学 解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:评价米赫国产人工角膜在兔及终末期角膜盲患者眼内的生物相容性,以及联合耳软骨加固,结膜(或唇粘膜)遮盖等手术技术,对预防角膜溶解渗漏的中长期效果。为国产人工角膜进一步推广应用奠定基础。
  方法:1、健康新西兰兔16只,分为单纯人工角膜支架植入组(n=6)及人工角膜植入联合第三眼睑软骨加固组(n=10),第一组植入人工角膜支架,术后观察3个月,了解宿主角膜组织愈合情况,进一步证实钛支架材料的生物相容性;第二组Ⅰ期植入人工角膜支架同时利用兔第三眼睑软骨组织对人工角膜进行加固,3个月后进行Ⅱ期手术,植入人工角膜镜柱,Ⅱ期术后观察6个月。最后行眼组织病理学检查。并与左眼进行对照。
  2、2015年5月至2015年12月期间解放军总医院眼科收治的双眼终末期角膜盲患者,严格遵照国产人工角膜临床试验的纳入排除标准,入组23例(23眼),其中男20例,女3例,年龄23~73岁,病程0.5~33年。致病原因包括碱烧伤11例,热烧伤5例,酸烧伤2例,Stevens-Johnson综合征(SJS)4例,爆炸伤1例。术前视力光感6例,手动12例,指数5例。手术根据患者临床表现不同分阶段完成,Ⅰ期全部行人工角膜支架植入,三个月后,Ⅱ期植入人工角膜镜柱,同时切除部分虹膜,晶状体及前部玻璃体,并给予自体结膜(或唇粘膜)遮盖。部分患者术中联合自体耳软骨加固。Ⅱ期术后随访1年,主要指标为脱盲率及人工角膜解剖在位率,观察项目包括裸眼视力(UCVA)、矫正视力(BCVA)、眼压、裂隙灯及照相、视野、眼后节OCT等,记录并分析各种并发症发生的原因,探讨相应的防治措施,同时随访期间监测患者全身情况。
  结果:1、人工角膜支架植入组6只兔观察期间钛支架全部存留于角膜内,角膜可见少量新生血管,未见角膜感染、溶解、渗漏等并发症,但3个月时支架前组织菲薄,人工角膜支架存在暴露脱出风险。组织病理学显示术后角膜少量炎性细胞浸润,支架周围较多的成纤维细胞聚集。
  人工角膜植入联合第三眼睑软骨加固组1只兔Ⅱ期术中因麻醉意外死亡外,其余9只兔均顺利完成手术和术后观察。术后各观察时间点人工角膜均在位,眼表血管化良好。未发生角膜组织溶解、房水渗漏、高眼压、感染等严重并发症。组织病理学检查显示:人工角膜支架处包绕较密集的成纤维细胞。第三眼睑软骨与角膜基质完全融合,角膜浅层组织仅有少量纤维血管增生及单核细胞浸润,未见异物巨细胞聚集。眼前节和后节结构没有明显的炎症反应和变化。对侧眼无异常。
  2、Ⅱ期术后1年观察期结束时:(1)脱盲率,即BCVA≥0.05(Log MAR1.30)者86.96%(20/23);(2)工角膜解剖在位率100%;(3)最佳矫正视力(BCVA)≥0.1(Log MAR1)者86.96%(20/23);BCVA≥0.5(Log MAR0.3)者60.87%(14/23);BCVA≥0.8(Log MAR0.1)者47.83%(11/23);(4)术后3、6、12个月视野指数及早均缺损相比术后1个月统计学无显著性差异(P<0.05);(5)并发症情况:高眼压及青光眼共6例,4例发展成青光眼,其中行睫状体光凝术3例;人工角膜前膜3例;人工角膜后膜5例,其中4例因影响视力行手术切除后膜;无菌性玻璃体炎3例;黄斑囊样水肿2例;视网膜脱离1例;全部病例未见组织溶解及支架暴露;(6)观察期内全身基本检查正常,较术前无异常指标。
  结论:国产化人工角膜具有良好的生物相容性,对于终末期角膜盲患者复明是有效的方法,联合耳软骨加固及自体结膜或唇粘膜遮盖等手术技术可降低角膜溶解和人工角膜脱出等严重并发症的发病率,有助于提高人工角膜稳定性和安全性。但如何减少青光眼、人工角膜后膜及眼后节并发症,仍需进一步深入研究探讨。
[博士论文] 董兴成
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  自新西兰大白兔股骨穿刺抽取兔骨髓液,贴壁法分离培养出兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),用流式细胞仪对兔BMSCs表面的阳性标记物和阴性标记物进行检测予以确定所得种子细胞为目标细胞;并对目标种子细胞的分化能力进行成骨、成软骨及成脂能力进行检测,以确定目标种子细胞的增殖分化能力。构建TGF-β1、Sox-9基因序列并鉴定其正确性,以pLVX-IRES-Puro为穿梭载体,构建TGF-β1(pLVX-TGF-β1)和Sox-9(pLVX-Sox-9)载体,以确定转染的可行性。联合TGF-β1、Sox-9共转染兔BMSCs,进行目的基因与下游基因的检测,以确定转染后新型干细胞作为种子细胞的可行性与优势。以Courtman脱细胞法对猪纤维环进行脱细胞处理得到脱细胞纤维环支架,并进行脱细胞效果检测,行脱细胞支架与共转染干细胞复合构建组织工程纤维环的实验研究。
  研究方法:
  骨穿获取兔骨髓液后行贴壁培养后分离培养出兔BMSCs,利用流式细胞术对细胞表面标记物CD29、CD31、CD44、CD45、CD90进行检测以确定其为本研究所需要的目标种子细胞。人工合成Sox-9、TGF-β1基因片段,并行其基因序列检测确定其正确性。
  以全骨髓贴壁法对获取的新西兰大白兔骨髓进行细胞培养处理,分离出兔BMSCs,通过兔BMSCs表面抗原检测来鉴定所分离培养的BMSCs的真实可靠性。人工合成Sox-9和TGF-β1基因片段,通过基因测序的方法来确定构建的基因序列。以pLVX-IRES-Puro为穿梭载体,构建TGF-β1慢病毒(pLVX-TGF-β1)和(pLVX-Sox-9),通过Real-time PCR对已构建的TGF-β1、Sox-9慢病毒进行检测,根据TGF-β1、Sox-9mRNA的表达情况来初步推断是否转染成功。将已成功获取并已鉴定的兔BMSCs传代培养后,分为:A.空载体组;B.TGF-β1基因单独转染组;C.Sox-9基因单独转染组;D.TGF-β1和Sox-9基因共转染组。四组培养条件相同,37℃、CO2浓度5%的环境下用普通的高糖培养基HG-DMEM对细胞培养2w,以Real-Time PCR、Western-Blot方法对A、B、C、D四组的目的基因TGF-β1和Sox-9表达情况进行检测。以Western-Blot法测定各组细胞下游产物的mRNA表达水平:ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenⅩ。用改良的Courtman法制备纤维环脱细胞支架,用HE、电镜扫描、GAG含量检测、DNA含量检测以及免疫源性等评估脱细胞纤维环支架,将纤维环脱细胞支架与TGF-β1和Sox-9共转染的干细胞混合培养,利用鬼笔环肽、DAPI及共聚焦显微镜来检测脱细胞纤维环支架及细胞在培养基中的生长情况。
  研究结果:
  课题组获取分离培养获取的兔BMSCs干细胞在经过不同的诱导条件处理后具有向成骨、成软骨以及脂肪细胞多向分化的能力。对兔BMSCs行流式细胞术分析鉴定,确定了兔BMSCs表面CD31、CD45标记物的阴性表达,CD29、CD44、CD90等表面标记物的阳性表达。TGF-β1和Sox-9基因测序证明合成基因序列正确无误。以pLVX-IRES-Puro为穿梭载体构建的TGF-β1和Sox-9慢病毒用PCR对DNA进行扩增,再行电泳对酶切片段检测,结果显示含有所构建的以慢病毒为载体TGF-β1、Sox-9片段。
  以TGF-β1和Sox-9重组慢病毒共同转染兔BMSCs,用普通的高糖培养基HG-DMEM孵育2w,细胞形态随着时间推移发生显著改变,成明显梭状改变。Western-blot方法检测Sox-9、TGF-β1蛋白表达增高显著。培养2w时,Western-Blot检测了下游产物的表达水平,ACAN和Sox-9在单独转染和共转染组中表达没有显著差异,CollagenⅡ的表达在共转染组中要显著高于各单独转染组;ACAN、CollagenⅠ、CollagenⅡ、Sox-9基因的表达水平较对照组明显上调。CollageⅩ基因的表达在Sox-9单独转染组和TGF-β1、Sox-9共转染组中都要明显低于空载体组和TGF-β1单独转染组。以改良Courtman法制备纤维环脱细胞支架后,将TGF-β1、Sox-9基因共转染的BMSCs与支架复合培养,细胞的增殖状态以及下游Ⅱ型胶原的表达明显高于普通BMSCs。转基因兔BMSCs能够均匀的分布于支架表面并生长良好。
  研究结论:
  全骨髓贴壁法在兔BMSCs分离培养的应用中具有显著的可行性,成功获取大量生长良好的兔BMSCs。以pLVX-IRES-Puro为穿梭载体可以成功构建TGF-β1和Sox-9慢病毒,且其可成功共同转染兔BMSCs,获得TGF-β1和Sox-9双基因蛋白的稳定表达。对于TGF-β1和Sox-9慢病毒共转染兔BMSCs后,下游基因CollagenⅩ胶原基因的表达呈降低趋势,ACAN、CollagenⅡ基因表达均明显升高,共转染后的干细胞具有明显的成软骨能力,表明兔BMSCs向类纤维环细胞方向表达转化。改良后的Courtman脱细胞法所制备的脱细胞纤维环支架能够适合转基因BMSCs在支架内正常的生长和增殖。
[博士论文] 石凯
计算机科学与技术 西安电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:随着科学技术的快速发展,生物医学研究利用网络医学作为工具系统地探索复杂疾病的分子机制,不断地涌现了疾病各个方面模式的探索研究,并以此来揭示复杂疾病相关生物显著标志物,从而找到疾病的药物靶标。与此同时,高通量技术快速发展和应用带来了丰富多组学数据的同时,也带来了对这些异质数据整合分析挑战。由于癌症复杂性,人们认识其致病机理变得困难,这就需要借助生物信息工具将生物问题转化为如何从多组学数据中分析、探索和抽取疾病相关模式,从而阐明疾病的致病机理。本研究集中在基于生物网络结合多组学数据挖掘复杂疾病相关致病模式,并分析相关模式,为疾病发现和治疗提供支持。本文工作和创新分别在疾病基因层面、通路层面和调控网络层面上展开研究,内容如下:
  1.针对疾病基因挖掘问题,本文提出了利用网络特征结合生物特性来挖掘致病基因,通过定义具有变化关系即差异甲基化和差异表达模式的网络模体得分指标,挖掘一致变化模式的网络模体,从而识别疾病相关基因。结肠直肠癌数据集上的验证结果表明在分类性能上该方法优于现有的方法;鉴别出的网络模体和预测的基因与结直肠癌的发生高度相关,功能富集癌症标志物。
  2.针对癌症驱动基因挖掘问题,本文提出了利用基因突变和基因表达之间的相关关系,突变基因与患者异构特性之间的关系,建立网络,结合网络扩散步骤和凝聚排序步骤算法进行挖掘。通过应用于三个癌症数据集(多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌),该方法在一些评价指标上明显优于对比的方法。同时,该方法分别预测58,55,13个潜在的驱动基因,其中大多数是已知的驱动基因,其余的基因通过功能分析和共同引用分析进一步证实与癌症相关联。尤其在低频突变的驱动基因识别上该方法获得较好的效果。
  3.针对癌症失调通路模式挖掘分析问题,本文提出了通过整合多组学数据采用优策略方法识别失调通路,并将该方法应用于TCGA中乳腺浸润性癌(BRCA)数据(DNA甲基化,DNA拷贝数,体细胞突变和基因表达谱),分别识别了该疾病亚型上的失调通路。结果表明不同亚型前30个失调通路显示出共同和特异的失调模式,同时还识别了特异亚型通路中在遗传和表观遗传方面失调的44个差异表达基因,文献验证和功能富集分析进一步验证了它们与BRCA高度相关。该方法在多组学数据整合识别失调的通路和疾病基因方面提供了新的思路。
  4.针对细胞周期基因调控网络构建与分析问题,本文提出了整合多平台转录数据样本,利用动态级联方法构建疾病各个发病阶段与细胞周期相关的转录因子调控网络。该方法应用于肺癌亚型-肺腺癌表达数据,构建了5个阶段的动态基因调控网络,进一步通过网络富集分析、功能分析、文献验证以及相关模式分析验证了肺腺癌恶化过程网络构建的可行性。
[博士论文] 万江山
生物制药工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:恶性肿瘤是危害人类身体健康的重大疾病之一。尽管化疗是其最常用的临床治疗手段之一,然而多年临床实践表明,由于大多数药物在体内缺乏特异性肿瘤组织蓄积能力,因此静脉给药方式下的全身化疗疗效有限且毒副作用大。为解决这些问题,近二十年来,联合多种模式的综合治疗已经成为临床肿瘤治疗的主要方法。特别是基于热疗的综合治疗,因热疗具备多种肿瘤杀伤增强机制受到越来越多的关注。如研究发现在相对较低温度下(39~43℃)热疗具有显著的化疗增敏作用,然而对于热疗的这种增敏机制,目前仍有待深入研究。在本工作中,我们设计了一种温度/pH敏感聚合物修饰的金纳米笼水凝胶载药系统(Dox-GNC@PNA-hls)。Dox-GNC@PNA-hls在近红外光照射下,金纳米笼产生高效光热转换,发挥光热治疗,同时,其表面修饰的温敏“开关”PNA-h在光热作用下打开,实现对负载药物的光热诱导“按需(On-demand)”释放。这种热疗与化疗的高度协同有效地增强了肿瘤治疗效果,可能发展成为新型的综合治疗纳米药物。研究主要结果如下:
  (1)温度/pH敏感聚合物的制备及表征。以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为温敏单体,丙烯酸叔丁酯(tBA)为pH敏感单体前体,采用原子转移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization,ATRP)制备了NIPAM与 tBA嵌段聚合物pNIPAM100-b-ptBAm(PNtB100-b-m,m=50,100)和无规共聚物pNIPAM400-co-ptBAn(PNtB400-co-n,n=6,8,10)。GPC测定结果显示两种嵌段聚合物PNtB100-b-100与PNtB100-b-50的分子量分别为51.3 kDa和37.5 kDa,与按照投料比计算的理论分子量相近。1H-NMR结果表明PNtB100-b-100和PNtB100-b-50中NIPAM与tBA单元比例为1:1和2:1,与投料比一致。其完全水解后得到温敏聚合物PNA100-b-100和PNA100-b-50,相对应的低临界溶解温度(Low Critical Solution Temperature,LCST)分别为37℃和36.5℃。进一步,通过调节PNtB100-b-100水解反应过程中三氟乙酸的用量及反应时间,可以获得四种不同水解度的聚合物PNAx(PNA30、PNA50、PNA75、PNA100)。PNAx聚合物在不同pH溶液中组装形成内部为疏水的丙烯酸核心、外壳为亲水的pNIPAM层纳米粒。三种无规共聚物pNIPAM400-co-ptBAn(PNtB400-co-n,n=6,8,10),GPC测定其分子量分别为41.6 kDa、46.1 kDa和45.6 kDa,与按照投料比计算的理论分子量相近。完全水解后所得到相应的温度/pH敏感聚合物PNA400-co-n,可通过改变溶液pH值对其LCST进行调控。其中PNA400-co-8聚合物在pH6.5环境下的LCST为39.9℃,介于体温37℃和热疗温度43℃之间,可用于光热诱导同步药物释放研究。
  (2)阿霉素(Doxorubicin,Dox)诱导组装的温度/pH敏感D-PNAx纳米凝胶及其抗肿瘤效果评价。以弱碱性的Dox诱导弱酸性PNAx自组装形成D-PNAx纳米凝胶,其中D-PNA100纳米凝胶具有最佳的分散稳定性(其zeta电位约为-32 mV)和最高的载药量(41.2%)。药物释放实验表明D-PNA100纳米凝胶具有良好的长效缓控释药特性。瓶倒转实验结果显示浓度为10% w/v的D-PNAx纳米凝胶以及相应的PNAx聚合物在体温下发生了溶胶-凝胶相转变。药效学研究表明瘤内注射D-PNA100纳米凝胶能够有效抑制肿瘤生长,10天后小鼠肿瘤体积降至原始大小的77%,而游离Dox和空白PNA100组分别为起始大小的113%和211%。生存率曲线显示D-PNA100纳米凝胶组的小鼠在14天实验时间内全部存活,而游离Dox组80%的小鼠死亡。瘤内Dox荧光图像和Dox滞留曲线表明,给药10天后D-PNA100纳米凝胶组仍有41%的药物滞留在瘤内,而游离Dox组仅有20%的滞留量。这些结果表明,D-PNA100可注射水凝胶用于肿瘤局部治疗具有微创、药物负载量高、缓控释药、药效持久且抑瘤效果显著以及生物相容性好等优点。
  (3)用于瘤内光热化疗协同的温度/pH敏感金纳米笼水凝胶载药系统(Dox-GNC@PNA-hls)的制备及表征。采用醇还原法制备银纳米立方(Silver nanocubes,SNCs),所制备的SNCs为尺寸45±5.0 nm的正方体纳米颗粒,颗粒大小均一,分散性好。以SNCs为模板,采用电化学置换法制备最大吸收峰在800nm的金纳米笼(Gold nanocages,GNCs),并对其形貌、粒径、zeta电位、元素组成及含量进行分析测定。结果显示GNCs颗粒尺寸为45±5.0 nm,流体力学直径为100 nm左右,zeta电位为-7.7 mV。TEM-MAPPING元素分析结果显示GNCs为金银合金纳米粒,金与银两种元素弥散分布于整个金纳米笼框架上。以LCST=39.9℃的PNA400-co-8作为高温配体(PNA-h),先修饰到GNCs表面孔周围,构成释药开关;以LCST=36.5℃的PNA100-b-50作为低温配体(PNA-l)修饰到GNCs表面其他区域,实现体内原位凝胶,最后得到GNC@PNA-hls。TEM及其EDS能谱表明GNCs表面修饰有厚度约为3.0 nm的PNA-hls聚合物层。其水溶液中的流体动力学直径从100 nm增大至130 nm。热重分析表明GNC@PNA-hls中,高低温配体PNA-h和PNA-l的重量分数分别为9.0%和25%。采用硫酸铵辅助载药技术将Dox负载于GNCs内得到Dox-GNC@PNA-hls,载药量高达8.0%。体外药物释放实验表明Dox-GNC@PNA-hls具有近红外光诱导的“按需”释药行为,且其释放量与激光功率、光照时间和光照次数正相关,而与溶液pH值和PNA-h的LCST负相关。Dox-GNC@PNA-hls水凝胶载药系统具有良好的温敏溶胶-凝胶相变行为,凝胶化温度为34℃,可用于瘤内注射。凝胶化后的聚合物的储能模量可达到1870 Pa,是未凝胶化溶胶储能模量(0.93 Pa)的2000多倍。
  (4)Dox-GNC@PNA-hls体内外抗肿瘤效果评价。MTT实验结果显示Dox-GNC@PNA-hls在808 nm激光照射下,能够有效的杀伤肿瘤细胞。更重要的是,细胞实验结果显示,与热疗化疗序贯治疗相比,两者同步作用具有更强的肿瘤细胞杀伤能力。通过瘤内给药方式将Dox-GNC@PNA-hls水凝胶分散体注射于小鼠瘤内,结果显示在功率为0.4 W/cm2的激光照射下,肿瘤组织温度可升至47℃左右。药效学评价数据表明,与单纯Dox组和GNCs光照组相比,Dox-GNC@PNA-hls处理组表现出更好的抑瘤效果。这些数据表明,由于具有近红外光诱导“按需”释药特性,Dox-GNC@PNA-hls实现了多次光热治疗与化疗的精准协同治疗,增强了肿瘤综合治疗效果。
  本论文构建的温度/pH敏感的金纳米笼水凝胶载药系统,在近红外激光照射下,实现了肿瘤治疗的长期多次光热-化疗精准协同,为肿瘤综合治疗提出了精准协同的新思路。
[博士论文] 刚亚栋
生物医学工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:在全脑范围内完整地获取神经元的精细结构和蛋白分布信息,对理解大脑复杂的神经网络连接和神经信号传递机制十分重要。荧光标记与大体积成像技术的发展为大脑中神经元结构和蛋白分布的可视化提供了有力的手段。由我们实验室发展的荧光显微光学切片断层成像技术,能够对小鼠全脑进行高分辨率的遍历式成像,以亚微米的分辨率获得了荧光蛋白标记的小鼠全脑高分辨率数据集,引起了国内外广泛地关注。
  取得这一进展的关键之一,是在成像前对荧光蛋白标记的小鼠全脑进行塑性包埋,以利于全脑范围内高分辨率切削成像。所用的包埋方法,是在实验室以前发展的大体积塑性包埋方法基础上改进而来,提高了立方厘米尺度的大体积样品的荧光保持率。然而,这种荧光样品的塑性包埋方法仍然存在包埋结果不稳定、脑组织局部出现神经元精细结构丢失等问题。此外,塑性包埋方法能否适用于大体积免疫荧光标记的样本,目前也尚不明确。
  围绕上述问题,本文首先发展和优化了现有的荧光蛋白标记大样本的塑性包埋方法,建立了标准化的样品制备流程,提高了样品制备的稳定性和可重复性。针对大体积免疫荧光标记样本,研究了大体积免疫荧光标记技术与塑性包埋技术的兼容性,建立了大体积免疫荧光标记样品的塑性包埋方法。主要的研究内容与结论如下:
  (1)建立能够保持神经元精细结构的大体积塑性包埋方法和标准化实验流程。对大体积塑性包埋工艺进行了测试和优化,通过延长PFA后固定时间至48小时减小了小鼠全脑样品中神经突起结构的扭曲变形。验证了在4℃环境下脱水有利于更好地保持神经突起的荧光信号。优选了Lowicryl HM20树脂,并对树脂的聚合工艺进行了改进,从而更好地保留了鼠脑皮层边缘的神经元顶树突等精细结构,同时还更好地保持了神经元的膜结构和亚细胞结构。本研究在此基础上制定出了标准化的小鼠全脑塑性包埋流程。
  (2)适用于高分辨成像的大体积免疫荧光标记样品塑性包埋方法研究。定量研究了免疫荧光探针在树脂中的荧光保持情况,发现免疫荧光探针在GMA和Lowicryl HM20树脂中保持较好,而在LR White树脂中荧光保持较差,荧光探针在树脂包埋前后荧光强度有不同程度的变化。评估了树脂的连续切片性能,结果显示Lowicryl HM20树脂具有更好的切片性能。研究了iDISCO免疫染色技术与Lowicryl HM20树脂包埋的兼容性,发现该包埋方法能够很好地兼容多种免疫标记抗体和荧光示踪剂标记的脑组织,能够用于高分辨率遍历性切削成像。进一步采用小鼠全脑和猴脑皮层组织进行了大体积免疫荧光标记与高分辨成像,验证了该方法的有效性。
  本研究建立的Lowicryl HM20树脂包埋方法,其包埋样品的质量稳定性与细节保持程度,较以前的方法有显著提高。现已稳定用于国内外多家科研机构,推进了相关的研究工作。该方法将为获取高分辨率的神经回路数据提供支撑作用,不仅在脑科学中有重要的应用前景,在生命科学的其它领域也有重要的意义。
[博士论文] 郭文炎
生物医学工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:神经元是大脑结构和功能的基本单元。众多的神经元通过从胞体发出的突起,构成神经回路并相互联系。基因表达、蛋白活动等分子事件,在神经元及其回路上不断发生。神经元的投射和分子活动,共同构成了脑结构和功能的基础。基因表达分析结合神经元单细胞形态,有利于更好地理解神经元的类型和功能。然而,针对组织整体目前没有研究报道在一个样本上同时获取了神经元单细胞完整形态和基因表达信息。
  fMOST系统的发展,为全脑尺度下神经元连接图谱和分子图谱的获取奠定了成像上的基础。GFP及其pH敏感衍生物的化学层析成像,使fMOST同时具备了宽场成像的速度和共聚焦成像的分辨率。然而,双色化学层析成像既是需求又是挑战。针对小鼠全脑这种整体生物组织,在化学层析成像获取神经元形态投射时,如何同时获取基因表达信息也存在方法上的困难。
  围绕全脑尺度下同时获取神经元单细胞完整形态及其基因表达信息的需求,针对这两方面研究在标记方法上的具体问题,本文的主要贡献如下:
  (1)确定了红色荧光蛋白pHuji兼容树脂包埋和化学层析成像,并将之与EGFP或 EYFP联合,实现了双色化学层析。本文根据树脂包埋和化学层析对荧光蛋白的要求,选择了可能满足这些要求的pH敏感红色荧光蛋白pHuji并将其编码基因构建到AAV病毒载体上,实现了稀疏高亮标记神经元完整形态。通过结合EGFP进行双色标记,实现了双色化学层析成像。
  (2)基于EGFP和pHuji的双色标记,实现了神经元形态和突触结构的同时高亮度标记,为fMOST双色化学层析同时获取神经元单细胞完整形态和突触分布奠定了基础。本文通过AAV介导pHuji标记神经元形态,完整的EGFP融合Synapsin标记突触前,完整的EGFP融合PSD95标记突触后,实现了突触的高亮度与高准确度标记。
  (3)基于iDISCO的组织通透方法与杂交链式反应的信号放大方法,建立了小鼠全脑荧光原位杂交的方法。以中高丰度内源或者外源基因的mRNA为靶标,设计多个寡核苷酸探针作为一级探针,荧光染料标记的发夹对作为二级探针,实现了特定mRNA的准确标记。这一整体原位杂交方法结合fMOST断层成像时核酸染料(PI或者 DAPI)实时复染,在同一个样本上同时获取了 mRNA分布信息和细胞构筑背景,从而发展了一种简单、快速、精确确定mRNA在全脑中表达位置的方法。
  (4)利用非甲醇依赖的iDISCO组织通透方法对 Thy1-EGFP-M小鼠脑块进行通透,然后进行组织整体原位杂交,既获得了基因表达信息,又保留了荧光蛋白标记的神经元形态投射信息,从而证明了基于iDISCO的整体原位杂交方法与荧光蛋白标记神经元形态投射的方法具有较好的兼容性。
[博士论文] 于珊
高分子材料 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:细胞迁移是生理学和病理学中十分重要的过程,与胚胎发育、血管生成、免疫应答以及肿瘤转移等过程息息相关。生物体内细胞能够对生物化学或生物物理信号刺激做出响应从而进行迁移。由于非必要的或过度的细胞迁移会导致组织不正确的修复甚至导致疾病,因此选择性调控细胞迁移非常重要。模拟一些信号分子对细胞的作用可望实现选择性调控细胞迁移,为生物材料设计提供理论支持和实验依据。
  通过聚酯胺解在表面引入氨基,再经过戊二醛偶联,接枝明胶分子。利用注射泵改变胺解时间,即可在表面构建明胶梯度。发现在明胶密度梯度的表面,内皮细胞(Endothelial cells,ECs)骨架沿梯度方向排列。内皮细胞在明胶密度梯度表面趋向于向明胶分子密度增加的方向迁移。最高有90%的内皮细胞向梯度正方向迁移,迁移速率达11μm/h。发现明胶分子密度梯度对于平滑肌细胞(Smooth muscle cells,SMCs)和成纤维细胞(Fibroblasts,FIBs)迁移的方向性影响较为显著,然而对细胞迁移速率影响并不明显。结果证实,单一明胶梯度对于不同细胞没有选择性。
  之前关于细胞选择性的表面修饰研究都基于模型材料表面,修饰方法较为复杂。基于第二章工作,提出了一个具有普适性、更简单的表面修饰方法。在聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)膜材料表面沉积一层聚多巴胺,使表面带有氨基。将透明质酸用甲基丙烯酸酐改性后(MA-HA)接枝在聚多巴胺表面以构建细胞阻粘层。精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(Arg-Glu-Asp-Val, REDV)多肽能够特异性识别内皮细胞。REDV多肽修饰巯基后通过迈克尔加成,接枝在MA-HA表面;结合注射法,构建出REDV多肽密度梯度。在REDV多肽接枝表面,内皮细胞粘附数量可达到平滑肌细胞的2.5倍。内皮细胞在REDV多肽密度梯度表面迁移定向性达到86%,同时迁移速率增大到细胞培养板(Tissueculture polystyrenes,TCPS)表面2倍;平滑肌细胞则表现出没有定向性的迁移,迁移速率下降50%以上。细胞片迁移结果表明内皮细胞片向梯度正方向迁移距离是均匀表面的3倍。
  成纤维细胞激活后向血管中层迁移是导致血管外膜纤维化的原因之一。因此,血管受损后选择性促进平滑肌细胞的粘附和迁移非常重要。在材料表面构建一层聚乙二醇的均匀阻粘分子层,通过共价接枝梯度固定细胞特异性多肽,能够实现细胞的选择性粘附和迁移。缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(Val-Ala-Pro-Gly, VAPG)多肽对平滑肌细胞具有特异选择性作用。首先通过盐溶液密度梯度在表面构建了一层均匀的聚乙二醇阻粘分子层,末端带有梯度的叠氮基团,再通过点击反应,将炔基修饰的VAPG多肽接枝在表面。VAPG多肽接枝实现了对于平滑肌细胞的选择性粘附,平滑肌细胞密度最高可达成纤维细胞2倍。VAPG多肽的接枝使平滑肌细胞迁移速率提高,成纤维细胞迁移速率降低。平滑肌细胞迁移速率(22μm/h)最高达到相同位置成纤维细胞迁移速率3倍以上;84%的平滑肌细胞趋向VAPG多肽接枝密度增加的方向迁移,且平滑肌细胞有效迁移距离显著性增大。
  三维环境下的细胞迁移与二维平面上有很大不同。因此模拟细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)构建相应材料来研究细胞迁移行为具有更重要的意义。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是在大部分细胞均有表达的一类能够降解细胞外基质的蛋白水解酶。在本章中,通过甲基丙烯酸酐改性的透明质酸双键和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)敏感的多肽序列上的巯基迈克尔加成反应,构建了一种对细胞分泌的MMPs产生响应从而降解的水凝胶。通过Transwell模型,考察了平滑肌细胞在水凝胶内的三维迁移情况。平滑肌细胞在有其他细胞诱导下,向酶敏感水凝胶内部迁移达120μm。进一步研究影响其迁移行为的因素发现,平滑肌细胞在水凝胶内主要以间充质方式迁移,MMP-2降解水凝胶导致网络结构疏松是细胞在水凝胶内部迁移的主要原因。体内实验结果说明,细胞向降解程度不同的水凝胶内部侵袭方式不同,且侵袭深度随水凝胶可降解程度增加而增大。
  在本文中,采用聚合物阻粘层结合细胞特异性多肽这一手段,构建了两种细胞选择性表面,并成功在生物降解材料聚己内酯表面实现了这一目标。多巴胺沉积进而偶联其他分子具有普适性,因而该表面修饰方法可适用于多种材料表面。进一步构建的模拟细胞外基质环境水凝胶,阐明细胞在其中的三维迁移行为,有助于发展具有特殊结构和功能的生物材料,以更好地实现组织再生。
[硕士论文] 王尧
外科学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:气管切除并端端吻合是当前气管重建的金标准,但仅限于病变气管段不超过成人总气管长度1/2或小儿1/3。当病变气管超过最大限度时,进行气管重建有一定难度,因为气管不仅仅是一个简单的圆柱状通气管道,而是由复杂的多层结构组成。气管是由15-20个C形软骨构成,在气管内表面覆有纤毛上皮,外表面含有平滑肌、血管等结缔组织。气管软骨维持着气管圆柱状形态,防止气管塌陷;而气管内表面呼吸上皮中的纤毛对气管的清洁有着重要作用;气管软骨周围的结缔组织则保证了气管的曲、伸以及收缩、扩张等机械运动。因此,还没有办法完全重建这样复杂的多层结构以及完全模拟其功能。近年来,3D打印技术的发展为气管重建提供了新的思路。3D打印技术依靠计算机辅助成像,以广泛使用的生物材料为打印介质,能够快速、精确的复制和重建缺损组织或器官的复杂结构,因此在组织工程领域的应用获得广泛关注。骨髓间充质干细胞易分离培养,且具有多向分化潜能,是气管组织工程首选的种子细胞。本研究旨在以聚己内酯为材料,利用3D打印技术打印出气管补片,通过生物力学测试评估其生物力学性能并与骨髓间充质干细胞共培养评估其细胞相容性,从而寻求合适的组织工程气管支架材料。
  第一部分3D打印气管补片的制备与生物力学性能检测
  目的:
  利用3D打印技术将聚己内酯打印成气管补片并研究其生物力学性能。
  方法:
  1.3D打印气管补片的制备;
  2.扫描电子显微镜观察3D打印气管补片超微结构;
  3.3D打印气管补片的生物力学性能测试。
  结果:
  1.扫描电子显微镜图(SEM)观察到3D打印气管补片拥有适宜的孔径大小,孔径为300~500μm;
  2.生物力学性能测试结果证实3D打印气管补片的最大应力及弹性模量明显优于离体新鲜气管,显示其具有良好的生物力学性能。
  结论:
  1.利用3D打印技术将聚己内酯制备成3D打印气管补片;
  2.3D打印气管补片具备合理的三维外形、适宜的孔径大小;
  3.3D打印气管补片具备良好的生物力学性能。
  第二部分骨髓间充质干细胞体外培养与3D打印气管补片细胞相容性检测
  目的:
  1.骨髓间充质干细胞的体外培养;
  2.检测3D打印气管补片与骨髓间充质干细胞共培养的细胞相容性。
  方法:
  1.兔骨髓间充质干细胞的获取;
  2.兔骨髓间充质干细胞的培养;
  3.兔骨髓间充质干细胞的鉴定;
  4.3D打印气管补片与骨髓间充质干细胞共培养的细胞相容性检测。
  结果:
  1.通过全骨髓培养及贴壁纯化法获取的骨髓间充质干细胞,培养至第3代细胞成簇贴壁生长,呈梭形、多角形,具有多向分化潜能,可以分化为软骨细胞和脂肪细胞;
  2.与骨髓间充质干细胞共培养后进行细胞相容性检测结果显示3D打印气管补片具有良好的细胞相容性。
  结论:
  3D打印气管补片具备良好的细胞相容性,是一种具有开发潜力的生物材料,可以用于组织工程气管的体外构建。
[硕士论文] 杨燕
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:随着纳米技术的快速发展,干细胞与纳米颗粒的相互作用正广泛用于组织工程研究,尤其是干细胞治疗方面。研究表明纳米材料的很多性质都对细胞摄取有重要影响。但目前对纳米颗粒内化的研究大都基于游离纳米颗粒,随着纳米颗粒越来越多地应用,当颗粒间存在弱相互作用时,细胞对纳米颗粒的摄取是个值得研究的问题。另外与细胞相关的很多因素也对纳米颗粒内化存在影响,但现在有关细胞代数对颗粒摄取的影响研究很少。在此基础上,我们提出当磁性纳米颗粒间存在相互作用时,其对细胞摄取会产生什么影响?细胞代数的选择是否是以后细胞摄取实验中的一个重要指标?我们首先将纳米颗粒在磁场下组装成条纹状组装体,并将SD大鼠脂肪间充质干细胞培养于组装体基底上,研究其对组装体上纳米颗粒及不同尺寸游离微纳颗粒的摄取作用。然后对不同代数的该细胞的性质及摄取做了一系列表征,主要研究了不同代数细胞的周期、活力、衰老水平、形貌改变等几方面的性质。通过ICP-OES及透射电镜对细胞摄取纳米颗粒进行了定量及定性的表征。具体工作如下:
  1、磁分离纯化裸γ-Fe2O3纳米颗粒胶体溶液,使颗粒水动力尺寸增大,并在透射电镜下呈现团簇现象。将磁分离后的纳米颗粒置于玻片上并放在磁场中组装成规则条纹状结构,作为后续细胞实验的基底用于研究。
  2、将SD大鼠脂肪间充质干细胞接种于不同磁场强度条纹状组装体上,检测其对纳米颗粒的摄取情况。发现当细胞培养于磁控组装基底上时,大量的纳米颗粒在细胞周围出现或吸附于细胞膜上,细胞内基本没有纳米颗粒标记,说明对于存在弱相互作用的磁性纳米颗粒,细胞对其基本没有摄取或摄取很少。
  3、将SD大鼠脂肪间充质干细胞培养于不同磁场强度组装体上,待其贴壁后,加入不同尺寸荧光游离微纳颗粒及小分子,通过检测颗粒及小分子入胞情况,发现与对照组相比,组装体基底对细胞摄取游离微粒及小分子具有抑制作用。
  4、对不同代数SD大鼠脂肪间充质干细胞的性质做了一系列表征。发现随着代数的增加,细胞活力逐渐降低,形貌发生显著变化,衰老水平逐渐增高。通过检测表面标志物,鉴定第12代细胞仍是脂肪间充质干细胞。
  5、对不同代数SD大鼠脂肪间充质干细胞对纳米颗粒的摄取做了一系列表征。发现当细胞与游离纳米颗粒共培养时,纳米颗粒在胞内呈离散形态,铁含量高于培养于组装基底上的细胞,随着代数增大,铁含量逐渐减少,培养于基底上的细胞随着代数增加,铁含量变化不明显,纳米颗粒在胞内呈条纹排列形态。
  6、RT-qPCR检测不同处理组细胞网格蛋白、清道夫受体蛋白及磁感应蛋白基因表达量。通过RT-qPCR检测发现,随着代数的增加,网格蛋白及SR-A蛋白基因表达量总体呈现降低趋势。对于同一代细胞,培养于120mT组装体上时网格蛋白及SR-A蛋白基因表达量较与游离颗粒共培养时表达量降低,对于SR-A蛋白而言,随着代数的增加,这种差异越来越小。当细胞培养于120mT组装体上时,对于第3代与第6代的细胞,SR-A基因表达量远高于网格蛋白的表达量,第9代与第12代的细胞这两种蛋白基因表达量没有明显差异,并且相较前两代表达量明显降低。随着代数增加,磁感应蛋白基因表达降低,培养于120mT组装体上时,磁感应蛋白基因表达最高。
[博士论文] 郑付印
生物医学工程 东南大学 2017(学位年度)
摘要:器官芯片(organ-on-a-chip)是近几年被提出的一种可用于药物评价和疾病模型等生物医学研究的新方法。它可以模拟人或动物器官的微结构、微环境、功能等特性,有望用于药物筛选和临床诊疗。载人航天任务中,为了保障航天员的健康并圆满完成航天飞行任务,及时开展在轨疾患治疗,亟需建立安全、有效的药物干预和评价措施。因此,使用器官芯片开展空间在轨的药物代谢研究也具有重要的科研价值。肝脏是人体最重要的解毒器官,也是药物代谢的主要器官,构建模拟肝脏器官结构和功能的生理和病理芯片将为生物医学研究提供良好的平台。本论文的研究内容即以构建肝脏芯片为目标,开展肝脏的生理和病理模型的研究。具体工作如下:
  (1)设计并构建了基于细胞聚集体的肝脏芯片,模拟了肝脏的功能单位肝小叶的复杂生理微结构和生理微环境。芯片中含有反蛋白石多孔膜可模拟类血管内皮层的屏障特性,并将芯片分隔为上层的仿生微脉管区和下层的原代肝脏细胞聚集体三维培养区和多细胞分区共培养区。此肝脏芯片内部的微结构设计可以实现原代肝脏细胞聚集体的捕获和定位培养,保持肝脏细胞特异性的白蛋白分泌和尿素合成等功能活性,并可以进行模式药物(对乙酰氨基酚)肝脏毒性的在线评估和应用。
  (2)设计并构建了面向空间应用的抽屉式三维血管化组织培养芯片,开展了三维类血管化肝脏组织的培养和在线药物评估。通过同轴针头制备了类血管中空纤维,在芯片的手臂式三维组织固定支架上进行三维有序排布,并形成三维类血管化组织,促进原代肝脏细胞的功能和活性维持。抽屉式设计可以实现三维类血管化肝脏组织与芯片系统的顺利组装和固定,用于药物肝脏毒性的在线评估,满足空间复杂环境中减少和避免手动操作等特殊需求。
  (3)设计并构建了三维血管功能化的肝脏肿瘤侵袭模型芯片,在芯片内的三维血管化功能组织中形成球形或椭球形聚集体,并逐渐形成侵袭位点,最终穿透凝胶基质的束缚,形成循环肝癌细胞。实验中,首先通过3D打印支架并排布玻璃管作为牺牲模板制备富含中空通道的三维组织;或者通过微流控技术制备负载细胞的中空纤维,进行手写式三维支架和组织的构建。在三维血管化组织中形成球形或椭球形细胞聚集体并形成侵袭位点,肝癌细胞冲破基质束缚并脱离松散肿瘤组织,进入血管通道内部,形成循环肿瘤细胞。该芯片可以模拟三维组织中的肿瘤侵袭和转移行为,开展盐酸阿霉素的抗癌活性评价。
  (4)利用光子晶体编码微球液相悬浮芯片进行了多种循环肿瘤细胞的捕获与分离,并可以集成到器官芯片上的微载体检测池,从而开展多元的生物分析与检测。通过乳液微流控技术制备光子晶体编码微球,轻微腐蚀微球形成图案化的“球-棒”桥联表面形貌,并在微球表面接枝树枝状大分子级联放大密度的DNA适配体探针。在不同结构色的光子晶体编码微球表面修饰不同的DNA适配体探针,与不同的循环肿瘤细胞表面的特异性受体进行靶向性结合,从而实现了对循环肿瘤细胞的主动靶向性捕获、释放和分离。
[硕士论文] 董晓强
流行病与卫生统计学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过模拟研究比较基于non-local先验的贝叶斯变量选择方法、ISIS-SCAD、ISIS-MCP在极高维数据分析中的表现,并将其应用到弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL, diffuse large B cell lymphoma)基因表达数据中,找出与DLBCL分型有关的基因,为临床上DLBCL的诊断和治疗提供依据。
  方法:基于non-local先验的贝叶斯变量选择方法—乘积逆矩先验(piMOM, product inverse moment)的基本原理,并将其与 ISIS-SCAD、ISIS-MCP方法应用到二分类logistic回归中。模拟研究中,根据协方差结构的不同将协变量间相关程度分为三种情况:相互独立、复合对称相关、自回归相关;样本量n=50、100、200、400、600;自变量维数 p=1000、3000,从模型相合性和模型预测准确性两个方面,评价不同极高维情况下三种变量选择方法的表现。实例分析中,将包含350个病人,3237个基因的 DLBCL数据分为训练集(n=245)和测试集(n=105),分别运用 piMOM、ISIS-SCAD、ISIS-MCP方法进行建模并验证,用AUC评价三种模型的优劣。
  结果:模拟研究发现:在 p=1000和 p=3000情况下,三种方法筛出的变量平均真阳性数大致相等,ISIS-SCAD、ISIS-MCP方法的平均假阳性数和预测均方误差、回归系数均方误差却明显高于non-local先验方法,且non-local先验方法随着维数的增加波动较小,较ISIS-SCAD、ISIS-MCP方法稳定。DLBCL基因表达数据经piMOM分析发现4个有意义的基因(MYBL1,CYB5R2,MAML3,BTLA),AUC为0.989;ISIS-SCAD发现7个有意义的基因(MYBL1,CYB5R2,MAML3,TNFRSF13B, S1PR2,SLC25A27,GAB1),AUC为0.981;ISIS-MCP发现5个有意义的基因(MYBL1,CYB5R2,MAML3,CHST2,SUB1),AUC为0.962。三种方法均筛出的基因为:MYBL1,CYB5R2,MAML3。
  结论:基于non-local先验的贝叶斯变量选择方法在模型选择和预测准确性方面优于传统的惩罚类方法,在一定程度上可以较好地控制假阳性率。MYBL1,BTLA, CYB5R2, MAML3可能与DLBCL分型有关。
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