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[硕士论文] 李娜
生物医药工程 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  在Aβ25-35诱导人源性SH-SY5Y损伤细胞上,筛选能差异化表达并与MRTF-A相关的miRNA,探讨MRTF-A介导miRNA对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制。
  方法:
  1.在Aβ25-35诱导SH-SY5Y损伤细胞模型中,用基因芯片筛选与MRTF-A调控相关的miRNA:建立细胞模型;细胞分组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理,24h后,用western blot方法检测MRTF-A的蛋白表达水平,并提取RNA。用Agilent RNA6000Nano/Pico Assay法检测各组RNA质量合格后,使用miRNA OneArray芯片技术分析各组中发生显著差异变化的miRNA。得到各组显著变化的miRNA,再通过各组间相互比较得到MRTF-A调控的miRNA。筛选出差异性表达最为显著的miRNA,并用RT-qPCR检测MRTF-A对目标miRNA的调控作用。
  2.MRTF-A对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的影响及机制:
  1)MRTF-A对细胞自噬的影响:实验分为4组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRF-A+Aβ25-35)。转染MRTF-A质粒48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  2)miR-1273g-3P对细胞自噬的影响:实验分为4组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic,miR-1273g-3p mimic control+Aβ25-35,miR-1273g-3pmimic+Aβ25-35)。转染miR-1273g-3p48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白检测LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  3)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p有关:实验分为5分组(control,Aβ25-35,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予Aβ25-35处理24h后,提取蛋白,检测自噬相关基因LC3和Beclin1的蛋白表达水平。
  4)miR-1273g-3p对靶基因mTOR的作用:采用mirwalk、targetscan软件预测其靶基因,并验证其对靶基因(自噬上游靶基因)mTOR表达的影响。实验分为2组(miR-1273g-3p mimic control,miR-1273g-3p mimic);转染miR-1273g-3p mimic48h后,提取RNA和蛋白,分别检测mTOR蛋白表达水平。
  5)MRTF-A对自噬的作用与miR-1273g-3p抑制mTOR有关:实验分为5组(control,Aβ25-35,MRTF-A,MRTF-A+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3pinhibitor control+Aβ25-35,MRTF-A+miR-1273g-3p inhibitor+Aβ25-35)。单独转染MRTF-A或者共转染miR-1273g-3p inhibitor48h后,给予40μmol/L Aβ25-35处理24h,提取蛋白,检测mTOR的蛋白表达水平。
  结果:
  1.基因芯片筛选miRNA:在给予Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,MRTF-A蛋白表达水平明显降低,转染MRTF-A质粒使细胞过表达MRTF-A,将各组通过RNA质检的RNA进行miRNA基因芯片杂交,依据|Fold change|≧0.585且P-value<0.05的条件筛选条件,共筛选出295个显著差异的miRNA。将得到的295个miRNA在各组间交集比较,共得到8个与MRTF-A调控相关的miRNA;其中上调的有miR-1273g-3p,下调的有hsa-miR-6772-3p、hsa-miR-6736-3p、hsa-miR-6740-3p、hsa-miR-7106-3p、hsa-miR-6747-3p、hsa-miR-6776-3p及hsa-miR-3653-5p。我们选择上调明显的miR-1273g-3p,用RT-qPCR验证显示MRTF-A能明显上调miR-1273g-3p的表达,与芯片结果一致。
  2.MRTF-A调控miR-1273g-3p促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生:结果显示,在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,过表达MRTF-A能明显增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,说明MRTF-A促进经Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,转染miR-1273g-3p mimic也能明显促进LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达,表明miR-1273g-3p也能够促进自噬的发生;在Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞中,共转染MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达的比率和Beclin1的蛋白表达较单转MRTF-A有明显降低,提示miR-1273g-3p参与了MRTF-A促进自噬的的作用。
  3.MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现:利用mirwallk、Targetscan软件总共预测到1090个miR-1273g-3p靶基因,并找到负性调控自噬的靶基因mTOR。RT-qPCR和western blot结果显示,单转miR-1273g-3p能明显抑制了mTOR的mRNA和蛋白表达水平;另一方面,单转MRTF-A也能抑制mTOR的表达,而共转MRTF-A及miR-1273g-3p inhibitor后能逆转MRTF-A对mTOR表达的上调,提示MRTF-A促进自噬发生的机制可能是通过上调miR-1273g-3p,从而抑制其靶基因mTOR表达实现。
  结论:
  MRTF-A能够促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬的发生,而miR-1273g-3p通过抑制mTOR的表达促进细胞自噬的发生;另一方面,MRTF-A能够上调miR-1273g-3p的表达,MRTF-A促进Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞自噬可能与其上调miR-1273g-3p抑制mTOR的表达相关。
[硕士论文] 刘清桂
细胞生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:细胞衰老是指在DNA损伤、端粒酶活性丢失等内在因素和细胞间通讯改变、体液循环因子改变等外在条件的刺激下,细胞发生一系列形态结构的改变,导致细胞永久性退出分裂周期,无法发挥正常生理功能。而衰老细胞的累积会导致组织器官的衰老,进而引发组织器官衰老问题,如机体的结构和功能异常和各种衰老相关疾病的发生。
  肝脏是一个以代谢为核心功能的器官,而肝细胞是肝脏组织中最主要的实质细胞。胆汁合成、肝糖贮存、脂质代谢等多种肝功能都是由肝细胞来承担的。随着年龄增长,老年肝脏肝细胞的形态、结构和功能发生了一系变化,比如肝细胞体积变大,数量减少、增殖能力降低、肝细胞核出现空泡,胞质出现脂褐素沉积、DNA含量异常,巨核肝细胞比例升高等。然而,由于衰老肝细胞的结构改变和功能异常,导致老年个体更容易发生各种肝脏疾病。比如老年个体容易出现肝脏脂肪性病变,老年小鼠中应对CCl4等化学药物的能力下降,肝脏的炎症水平升高,加速肝脏纤维化病症的发生发展。由此可见,肝细胞衰老与肝脏疾病发生发展紧密相关。因此,探寻肝细胞衰老逆转的途径是老年肝脏疾病治疗的必然要求。然而由于肝脏衰老模型小鼠缺乏等各种困难,目前仍无法获得肝细胞衰老逆转的深入研究。
  本项目研究中,基于联体共生模型,使得联体的两只小鼠可以共享彼此的血液微环境途径而用来探讨微环境对肝细胞衰老逆转的作用。首先,分别建立了2月龄和24月龄小鼠间联体(联体的2月龄为Het-Y,联体的24月龄小鼠为Het-O)、相同月龄的年轻小鼠间联体(联体的同月龄小鼠都称为Iso-Y)和相同月龄的老年小鼠间联体(联体的老年小鼠都称为Iso-O)3种联体共生模型。通过流式分析结果显示联体小鼠间血液交换率接近50%。成功构建联体共生模型后,使得联体小鼠共同生活5周,然后分别对不同组联体小鼠肝脏肝细胞进行生物学特征和肝细胞功能的分析,评价年轻微环境对衰老肝细胞逆转的作用。细胞衰老相关指标的检测结果显示,在年轻血液微环境的作用下,与Iso-O小鼠相比,老年小鼠SA-β-gal阳性率从38.23%±1.86%降低到4.84%±0.71%;γ-H2A.X阳性率从53.98%±3.78%降低到15.46%±1.86%;衰老指标细胞周期抑制因子P53、P21和P16的表达明显降低(p<0.01);炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的表达水平也降低(p<0.01)。其次,老年小鼠肝脏多倍体肝细胞数量增加,而多倍体肝细胞发生衰老的可能性增加。通过肝细胞比例分析发现,在年轻微环境的作用下,与Iso-O相比,老年小鼠八倍体肝细胞比例从33.35%±0.85%降低到15.97%±0.84%;二倍体肝细胞比例从7.41%±0.54%升高到27.27%±0.71%。进一步对肝细胞数目和大小进行分析,结果显示,在年轻微环境作用下,相同视野范围内,老年肝脏肝细胞数目从402±18个增加到617±42个,细胞面积也从645.99±32.72μm2减小至356.93±22.33μm2。前期的研究表明随着年龄的增加肝细胞增殖能力降低,体现在小鼠肝脏肝切后肝脏再生能力减弱和衰老肝细胞移植后再殖能力的下降。然而老年小鼠在年轻小鼠血液的影响下,其增殖能力发生了明显变化。原位肝组织增殖能力检测和原代肝细胞体外短期培养结果都显示,年轻微环境作用下,衰老肝细胞增殖能力得到恢复,增殖水平与年轻小鼠相类似。上述结果证实:在年轻微环境作用下,衰老肝细胞的衰老指标消失了,衰老肝细胞的形态、结构发生了衰老逆转,且重新获得了类似年轻肝细胞的增殖潜能。
  衰老肝细胞发生系列形态结构和功能的改变,导致其对外界刺激的耐受力下降,因而慢性肝炎、肝纤维化、肝癌等肝脏疾病在老年个体中发生机会增加。随着年龄的增长,衰老肝细胞出现脂质代谢障碍,肝脏内脂肪累积的水平提高,老年肝脏脂肪病变的发生几率明显增加。在联体共生模型中,发现老年小鼠在年轻血液微环境的调控下,老年肝脏脂肪累积程度得到明显的缓解。肝脏脂滴原位染色结果显示,年轻微环境的作用下,于Iso-O相比较,油红O的阳性面积从24.01%±3.48%降低到4.15%±2.95%,且尼罗红的阳性面积也降低4倍。血清学指标也显示老年小鼠TG、胆固醇和LDL-c水平明显降低(p<0.01),且肝损伤指标ALT和AST的表达水平也降低(p<0.01)。
  综合上述实验结果,可以得出结论:在年轻血液微环境的作用下,老年衰老肝细胞的衰老表型发生逆转,多倍体肝细胞比例降低,增殖能力得到提高。而且年轻血液微环境促进了衰老肝细胞脂肪累积水平的降低,不仅提高了肝细胞的脂质代谢能力,也改善了衰老肝脏的肝功能水平。这一重要发现,为解决衰老肝细胞增殖缓慢和老年个体肝衰竭相关疾病高频病发而难治愈问题提供新的思路,也为理解衰老和微环境的关系、衰老肝细胞发生“返老还童”机制和延缓或有效控制肝细胞衰老提供了理论基础。
[硕士论文] 蔡晓敏
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  由于上颈椎周围的神经血管结构复杂,上颈椎前外侧入路手术在技术上要求很高。临床上可以采取高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)处理上颈椎病变。上颈椎前外侧入路的解剖结构对于进行安全的上颈椎手术至关重要,通过以上两种入路显露上颈椎,记录入路中遇到的重要解剖结构,并对比两种入路区别。
  研究方法:
  使用经10%福尔马林充分固定的颅颈完整的成人湿性尸体标本10具,对左右侧均先进行高位颈前咽后入路解剖,显露上颈椎,而后模拟标准颈前路显露上颈椎,获得共20组数据。在解剖过程中,记录所有解剖标志、重要的神经血管结构,特别是限制暴露的结构。测量神经血管结构出动脉鞘和入内脏鞘点至喉结的垂直距离、直接距离等解剖数据,分析他们与颈椎体、椎间盘解剖关系,并对比两种入路中区别。最后将数据进行统计学分析。
  研究结果:
  1、上颈椎前外侧入路中的重要神经血管结构,不存在左右侧显著性差异;舌下神经、喉上神经等是限制暴露的主要结构。2、有4例喉结相当于C5水平。3、舌下神经和舌动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,鞘膜之间走行部分大多位于枢椎水平。喉上神经内支与喉上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C3,入内脏鞘点大多位于C4。喉上神经内支和舌下神经伴行的垂直距离及直接距离具有显著性差异。喉上神经外支与甲状腺上动脉伴行,垂直距离、直接距离及椎体水平无显著性差异,出动脉鞘点大多位于C4,入内脏鞘点大多位于C5,与喉结相当靠近,且13/20位于喉结下方。喉上神经内外支入内脏鞘点的垂直距离、直接距离及椎体水平具有显著性差异。
  研究结论:
  1、在上颈椎前外侧入路中,二腹肌为寻找舌下神经的重要标志。2、舌下神经和喉上神经是妨碍上颈椎前外侧入路的重要解剖结构。3、在前外侧入路中,喉结是定位神经血管结构、椎体水平及选择手术切口的重要参考。4、高位颈前咽后入路及标准颈前路(Smith-Robinson标准的方法)均是处理上颈椎病变的有效方法。高位颈前咽后入路能够更好地显露,可提供C2/3椎间盘处的垂直视角,向上可显露至斜坡下1/3,但需将喉上神经、喉上动脉及舌下神经、舌动脉完全解剖游离,并分别向下、向上牵拉。5、标准颈前路无需特意将血管、神经解剖游离,选择距喉结上方垂直距离约13~21.8mm的切口,从靠内脏鞘一侧进入,一般上从喉上神经外支和甲状腺上动脉上方及舌下神经和舌动脉下方,显露上颈椎,损伤血管神经的概率较低,较为安全。但标准颈前路只能提供C2/3椎间盘处的斜视角,且显露寰枢椎及斜坡困难,易损伤神经血管。所以当病变局限于枢椎体或C2/3椎间盘病变时可考虑采用标准颈前路。
[硕士论文] 陈翔
口腔医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  上颌第三磨牙萌出时间较晚,而且位于上颌牙弓最末端,往往由于萌出空间不足而埋伏或阻生,常引起一系列的并发症。在临床上处理其根管时多面临视野不佳、操作难度大、根管形态结构变化大及牙根存在弯曲等因素而影响治疗效果,故一般建议拔除。上颌第三磨牙拔除术虽相对简单,但由于其解剖结构变异性大,仍有可能发生严重的并发症。同时随着口腔技术的提高与器械材料的发展,将上颌第三磨牙作为自体牙移植供牙、作为基牙修复邻近牙缺失,甚至纳入正畸范畴的技术广泛应用于临床,对上颌第三磨牙进行根管治疗也成为常规操作。无论是上颌第三磨牙拔除术或是对其进行根管治疗都需要医师对上颌第三磨牙的解剖学结构熟悉掌握。锥形束CT(cone beam computed tomagraphy,CBCT)可构建高精度的三维影像,且属于非侵袭性操作,近年来在阻生牙拔除术术前检查及根管系统研究中应用较多。本研究通过CBCT对上颌第三磨牙解剖学结构进行观测及分析,以期为各种临床操作尤其是以上颌第三磨牙为供体的自体牙移植术提供参考依据,以达到提高诊疗效果的目的。
  方法:
  回顾性分析本院口腔种植门诊2016年2月~2017年2月收治的620例患者的第三磨牙(708颗)CBCT的影像学资料。数据经由计算机软件导入,观察第三磨牙两侧牙根数目、根管形态分类、根管类型分布等数据,并分析上颌第三磨牙根管数目与性别的关系、牙根与上颌窦窦底的关系(A类:牙根根尖和上颌窦窦底处于同一水平;B类:牙根根尖水平比上颌窦窦底高;C类:牙根根尖水平比上颌窦窦底低)。采取SPSS21.0统计学软件对所得数据进行统计学分析。通过本次研究结果作为解剖学的依据,来指导临床进行以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植手术。
  结果:
  708颗上颌第三磨牙牙根数目方面,三根牙占40.40%,其次依次是融合根牙占39.26%,双根牙占18.36%,四根牙占1.98%;按照左右位置的不同可分为:三根牙(左侧占40.11%,右侧占40.69%)最多,融合根牙(左侧占38.44%,右侧占40.11%)次之,后面依次是双根牙(左侧占18.94%,右侧占17.77%)与四根牙(左侧占2.51%,右侧占1.43%),左右两侧牙根数目比较差异无统计学意义(P>0.05);
  708颗上颌第三磨牙根管形态分布方面,三根管占48.73%,其次依次为单根管占27.12%,双根管占17.09%,四根管占7.06%;单根管的男性占26.94%,女性占27.30%;双根管的男性占17.22%,女性占16.95%;三根管的男性占48.33%,女性占49.14%;四根管的男性占7.50%,女性占6.61%,男、女上颌第三磨牙根管形态比较差异无统计学意义(P>0.05);
  低位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占15.29%、4.55%、80.16%,中位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占33.19%、10.21%、56.60%,高位阻生的上颌第三磨牙,A类、B类、C类关系分别占55.84%、14.72%、29.44%。
  上颌第三磨牙萌出方向为垂直位关系的数量最多,占72.04%,其中腭向倾斜位较为少见,仅为2.41%;萌出方向为远中位关系的牙齿数量其次,占22.88%;萌出方向为近中位关系的数量最少,占5.08%。
  上颌第三磨牙各侧骨壁中腭侧的厚型骨壁的数量最多,占55.80%;远中骨壁的厚型骨壁数量最少,占15.12%。
  在以CBCT提供的上颌第三磨牙的解剖学资料的指导下,将其作为供牙的自体牙移植术成功率较高。
  结论:
  上颌第三磨牙的解剖形态与位置复杂多样且变异较大,运用CBCT可明确了解其牙体形态和与相邻解剖结构之间的关系,能为阻生牙拔除术提供重要的指导并减少并发症的发生;同时通过CBCT对上颌第三磨牙根管形态的研究,能指导临床医师了解上颌第三磨牙根管形态的类型,明显提高对其根管治疗的成功率。因此能提高以上颌第三磨牙为供牙的自体牙移植术及其他临床治疗的成功率。
[硕士论文] 苗卉
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:出生缺陷是一项影响广泛的重要全球公共卫生问题,同时在一些国家出生缺陷也是引起早期自然流产,终止妊娠,婴幼儿致死和残疾的主要原因。据报道,近70%的出生缺陷可以被预防,或者在良好的护理下治愈或改善。叶酸作为一种重要的微量元素,叶酸的补充在预防出生缺陷方面的作用已被公认。基于以上原因,许多国家开始将全人口的强制性的叶酸添加作为一项预防出生缺陷的公共卫生政策加以实施。然而,叶酸与发育之间的确切关系尚未明确,尤其是不同个体的叶酸摄取能力差异巨大,叶酸补充对出生缺陷的益处或叶酸过量所造成的危害也有待进一步澄清。
  在本研究中,建立了不同叶酸饲料喂养小鼠的动物模型,发现,其子代小鼠肝脏组织中的干性标记物分子的表达随体内叶酸水平的升高而增加。高叶酸摄入对子代小鼠干性标志物的表达影响巨大。因此,进一步利用E14小鼠胚胎干细胞(mESCs)作为研究对象,检测了不同叶酸浓度培养6个月mESCs的生物学特性、干性和多能性的改变。并成功建立了mESCs注射裸鼠皮下形成的畸胎瘤模型。通过上述实验发现,相对于常规培养的mESCs,叶酸的补充可增强其体外增殖,集落形成和干性相关标志物的表达,并能在体内良好的促进其多能性。在明确叶酸对于mESCs的相关作用的基础上,进一步探索了补充叶酸促进mESCs增殖的机制。通过转录组测序技术,对培养的细胞的差异表达的转录本进行分析,最终筛选并确认一种在高叶酸水平下,mESCs中上调表达的重要的母源印记基因印记长非编码RNA(lncRNA)Meg3(母系表达基因3,以下简称Meg3)。结合重亚硫酸的测序发现,这种Meg3的上调是由启动子的低甲基化所导致的,同时通过调控细胞中Meg3的表达可以回复叶酸补充的作用。通过进一步的筛选和机制研究,成功证实了Meg3和其靶蛋白LYAR(Cell growth-regulating nucleolar protein)的相互作用关系,结果显示Meg3通过抑制LYAR的泛素化降解来稳定LYAR,进而促进mESCs的干性和分化潜能。
  综上所述,认为,母体高叶酸摄入可能对子代的生长发育带来一系列影响,我们的研究阐释了长期高叶酸摄入与后代出生缺陷的相关性以及母系印记LncRNAMeg3参与长期叶酸摄入异常导致后代发育异常、出生缺陷的具体机制。高叶酸水平可以引起Meg3启动子区域的低甲基化水平,诱导了Meg3上调表达,进而维持了LYAR的稳定性,促进了mESCs的干细胞分化能力和多能性。我们的研究结果为辩证看待叶酸补充在预防出生缺陷中的作用提供了理论依据,我们的研究成果将能够对于指导临床的叶酸补充带来帮助。
[博士论文] 魏婷婷
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)作为一类条件致病菌,主要寄居在人体的皮肤和粘膜(如口腔、消化道和阴道)表面。在机体免疫功能正常时,白念珠菌与免疫系统维持相对稳态,不会引发感染;而当机体的免疫功能受到抑制时,白念珠菌与机体共存的稳态被打破,白念珠菌迅速繁殖,由共生菌转为致病菌。白念珠菌感染作为最常见的真菌感染,可有不同的临床表现,轻者常引发局部粘膜损伤,重者可穿透组织、侵入外周血液循环,表现为播散性念珠菌病,严重威胁患者生命。近些年来,由于抗生素滥用的现象仍未得到有效解决,且肿瘤放化疗患者以及HIV感染病人的日益增多,导致白念珠菌感染的发病率不断增高,而且播散性感染的病死率居高不下,这些至今仍是难以解决的临床问题。因此,研究白念珠菌的致病机制、特别是深入研究机体免疫系统抗白念珠菌感染的调控过程,可为其相关的感染性疾病的治疗提供帮助。
  机体抵抗白念珠菌感染的第一道防线是由树突状细胞(dendritic cells,DCs)、中性粒细胞、巨噬细胞等组成的固有免疫应答系统。该系统可以在第一时间通过非特异杀伤的方式清除致病菌,但持续时间不长而且不具备免疫记忆功能。DCs作为专职的抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs),其表面表达较高水平的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。这些PRRs的主要生物学功能在于可以识别病原体表面的保守结构,即病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并由此开启针对病原体感染的免疫应答。白念珠菌细胞壁的PAMPs一旦被DCs表面的PRRs识别,可迅速活化DCs,分泌多种炎症因子和趋化因子,促进对白念珠菌的非特异性免疫清除。DCs的活化机制十分复杂,其核心事件是NF-κB、核转录因子激活蛋白-1(nuclear transcription factor activation protein-1,AP-1)等转录因子的核转位,最终调节多种细胞因子和趋化因子的表达。另一方面,DCs还可以通过PRRs吞噬病原体,并将病原体抗原加工、递呈给T细胞,诱导T细胞分化,指导后续的特异性免疫应答的类型和持续时间。固有免疫是获得性免疫的起点和驱动,而获得性免疫可在固有免疫的基础上发挥更持久且具有记忆功能的免疫效应。值得注意的是,机体抗白念珠菌的免疫应答过程需要多种机制的精细调控,若免疫反应强度过弱,则无法有效清除病原体;但若免疫应答强度过高或持续时间太长,则容易导致机体组织的炎症性损伤。
  microRNAs(miRNAs)是一类长度约20个碱基左右的单链非编码RNA,可以与靶基因mRNA的3'非编码区(3'UTR)的碱基不完全互补结合,导致mRNA发生降解,或者直接抑制mRNA的蛋白质翻译过程,从而发挥转录后水平的调节作用。miRNAs的作用特点是一个miRNA可以同时在转录后水平对多个基因进行调节,而一个基因的表达强度也可以受到多个miRNAs的调节,miRNAs对靶基因的调节具有明显的时空特异性。近些年来,越来越多的研究表明,miRNAs在免疫细胞的发育和免疫应答的进程中发挥不可忽视的调控作用。在前期的研究中,我们采用microRNA芯片分析了白念珠菌刺激单核源DCs内miRNAs的表达谱变化,结果发现多种miRNAs异常表达,其中miR-155表达显著上调。再者,以往的研究表明miR-155在抗细菌、病毒的免疫反应中具有活跃的调节功能,但目前miR-155在真菌感染免疫中的生物学功能尚不明确。基于以上研究背景,本课题探讨了miR-155在树突状细胞抗白念珠菌感染的固有免疫应答中的调节作用及其作用机制。
  第一部分 热灭活的白念珠菌对树突状细胞及CD4+Th细胞的活化作用及功能影响
  目的:研究白念珠菌感染对树突状细胞的成熟及其功能的影响,进而对CD4+Th细胞的活化和分化的影响。
  方法:采用磁珠分选的方法从人外周血中分离CD14+单核细胞和CD4+Th细胞,加入GM-CSF和IL-4诱导CD14+单核细胞分化为未成熟的DCs。用热灭活的白念珠菌刺激DCs,检测DCs的成熟表面标志物的表达及炎症因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌。然后将负载了白念珠菌的DCs与CD4+Th细胞共培养,通过流式细胞术检测Th细胞的活化及IFN-γ、IL-17等细胞因子的表达变化。
  结果:热灭活的白念珠菌可以显著上调DCs表面的成熟标志物CD83、CD86的表达,促进细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的释放。负载白念珠菌的DCs与CD4+Th细胞共培养后,T细胞表面的活化标志物CD69表达上调,胞内细胞因子IFN-γ、IL-17的分泌水平明显升高。
  结论:热灭活的白念珠菌可以促进树突状细胞成熟,并诱导CD4+Th细胞活化分化,发挥有效的抗真菌效应。
  第二部分 热灭活的白念珠菌可以上调树突状细胞内miR-155的表达
  目的:研究热灭活白念珠菌能否促进miR-155的表达和分泌。
  方法:用热灭活的白念珠菌刺激DCs,qRT-PCR检测胞内miR-155的表达。收集白念珠菌刺激DCs后的培养上清液,并提取外泌体,检测上清液和外泌体中miR-155的表达。通过qRT-PCR检测白念珠菌刺激DCs后不同时间点炎症因子的变化情况,以及在DCs、单核细胞、THP-1细胞和RAW264.7细胞中miR-155的表达变化。
  结果:热灭活的白念珠菌可以显著上调DCs内miR-155的表达,并且白念珠菌刺激DCs的培养上清及外泌体中miR-155表达也明显上调。白念珠菌诱导的炎症因子的表达呈先升高后降低的趋势,而miR-155的表达呈持续上升趋势,后期与炎症因子的表达趋势相反。此外,在单核细胞、THP-1和RAW264.7细胞内,白念珠菌同样可以持续上调细胞内miR-155的表达。
  结论:热灭活的白念珠菌可以持续上调miR-155的表达,且miR-155可以通过外泌体分泌到细胞外基质中。同时白念珠菌刺激下炎症因子的表达呈先升高后降低的趋势,在炎症后期与miR-155的表达趋势相反。
  第三部分 miR-155对DCs分泌炎症因子的调节作用及机制研究
  目的:探究miR-155对白念珠菌诱导的DCs分泌炎症因子的调节作用以及分子机制。
  方法:将miR-155的模拟体和抑制体转染DCs,然后加入热灭活的白念珠菌,分别采用qRT-PCR和ELISA检测炎症因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的变化。采用生物信息学软件TargetS can、miRDB和microRNA.org预测miR-155的靶基因,并通过western blotting和荧光素酶报告基因的方法检测miR-155对靶基因的调节作用,最后转染siRNA干扰靶基因的表达,检测对下游炎症因子分泌的影响。
  结果:转入miR-155的模拟体后,白念珠菌诱导的炎症因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌明显降低;而转入miR-155的抑制体后,炎症因子的变化趋势与之相反。在白念珠菌刺激的DCs中,miR-155可以与转录因子NF-κB p65和上游BCL10的3'UTR端靶向结合抑制其表达。此外,干扰BCL10可明显抑制NF-κB信号通路的激活,减弱白念珠菌上调炎症因子的表达能力。
  结论:在白念珠菌感染中,持续表达上调的miR-155对炎症因子的分泌具有明显的负向调节作用,其作用机制可能与靶向抑制BCL10及NF-κBp65的表达,进一步影响NF-κB通路的激活有关。
  第四部分 白念珠菌活化的DCs内miR-155表达上调的机制研究
  目的:探究热灭活白念珠菌上调miR-155表达的相关机制。
  方法:加入Dectin-1的激动剂,采用qRT-PCR检测miR-155的表达变化。在白念珠菌刺激DCs前加入Dectin-1的抑制剂或siRNA预处理,然后检测miR-155的表达变化。分别采用细胞免疫荧光、Western blotting检测热灭活白念珠菌刺激DCs后转录因子NF-κB p65的核转位情况以及MAPK信号通路相关分子的磷酸化表达。在白念珠菌刺激的DCs之前预先加入NF-κB或MAPK信号通路的特异性抑制剂,研究这两条通路对白念珠菌上调miR-155表达的影响。
  结果:加入Dectin-1的激动剂可以明显上调miR-155的表达,而加入Dectin-1受体的特异性阻断剂或siRNA均会抑制白念珠菌上调miR-155表达的能力。热灭活的白念珠菌可以促进NF-κB p65的磷酸化和核转位,并激活MAPK的ERK、JNK通路及下游转录因子c-Jun的磷酸化;进一步加入NF-κB p65的活化抑制剂可明显抑制miR-155的表达,而ERK、JNK通路的抑制剂可通过抑制c-Jun的活化,降低白念珠菌诱导miR-155表达的能力。
  结论:DCs表面受体Dectin-1的激活及胞内NF-B和MAPK信号通路均参与了白念珠菌诱导miR-155表达上调这一过程。
[硕士论文] 纪逸萱
妇产科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胚胎的成功植入和胎盘的正常发育对正常妊娠至关重要。胎盘滋养层细胞侵入子宫内膜,为胚胎发育所必须的营养、激素环境提供条件。胎盘发育需要经历一系列复杂的细胞事件,首先从绒毛外滋养层细胞的形成和分化开始。滋养层细胞干分化成绒毛外滋养层细胞,它是人类胚胎中最先分化、最先发育的细胞类型之一,为母体-胎儿界面仅有的可与母体免疫系统直接接触的胎儿细胞。该细胞具有多种功能,涉及细胞增殖、胚胎着床。在胚胎植入过程中、母体-胎儿免疫耐受的过程中发挥重要作用。滋养层细胞增殖、迁移、侵袭不足和过度均造成早期胎盘发育异常,进一步导致胚胎、胎儿死亡,引起流产和其他妊娠相关疾病。因此滋养层细胞功能的研究一直受到广泛关注。
  同源框基因在胚胎发育过程中具有重要的调控作用,含同源域因子GATA-3表达于滋养层细胞中,妊娠高血压疾病发展中,破坏Th1/Th2平衡,与妊娠高血压疾病的发展及严重程度密切相关。绒毛膜癌BeWo细胞系中,HOXA11低表达促进细胞滋养层向合体滋养层分化,促进了绒毛膜癌的发生发展。提示同源框基因对滋养层细胞发育具有重要调控作用。HOXA10在胚胎发育过程中若发生基因突变可引起苗勒管发育异常,引起双子宫、子宫纵隔等畸形。而它在胚胎早期发育阶段,即早期胎盘发育阶段所发挥的作用尚未有相关研究。
  本研究通过基因芯片技术发现HOXA10在早期胎盘组织中表达量显著高于中、晚期胎盘组织,提示它对早期胎盘发育有重要影响,进一步探讨了HOXA10对滋养层细胞增殖能力调控的必要性及相关分子机制。
  方法:
  1.以小鼠胎盘发育为模型,取小鼠胎盘发育的第6.5d,14.5d和19.5d的组织各3例,进行mRNA芯片检测。差异基因筛选条件为Fold change>2.0,P<0.05,筛选出与早期胎盘发育过程相关的同源框基因HOXA10。
  2.在C57小鼠胎盘组织、人胎盘组织中通过RT-PCR及western blot验证芯片结果。
  3.在滋养层细胞系HTR-8/SVneo中进行功能实验,利用小干扰RNA干扰HOXA10表达后,进行增殖功能实验,并检测细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物p57表达量变化。
  4.通过免疫组化法检测葡萄胎绒毛组织、人工流产绒毛组织、自然流产绒毛组织中HOXA10表达情况。验证HOXA10对滋养层细胞增殖力调控的重要性。
  结果:
  1.HOXA10在人早期胎盘组织中的表达量显著高于中、晚期胎盘组织;
  2.人滋养层细胞HTR-8中干扰HOXA10表达后,细胞增殖能力明显减弱。
  细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物p57是人早期滋养层细胞中表达最高的周期调节剂,干扰HOXA10后p57高表达,抑制细胞周期;流式细胞仪检测各周期细胞数结果:G1期细胞数显著增加,S期细胞数明显减少;CCK8实验结果进一步验证干扰后细胞增殖能力明显减弱(P<0.05)。
  3.人滋养层细胞中干扰HOXA10表达后,细胞凋亡水平无明显变化。
  滋养层细胞中干扰HOXA10后,通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平,差异无统计学意义,HOXA10表达量改变不影响滋养层细胞凋亡(P>0.05)。
  4.免疫组化法检测出人工流产绒毛组织中HOXA10表达明显低于完全性葡萄胎组织,显著高于自然流产绒毛组织。
  结论:
  1、HOXA10在胎盘发育过程中的表达具有时间特异性,主要参与早期胎盘发育。
  2、HOXA10通过调控细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制物p57,影响滋养层细胞增殖能力,避免过度增殖和增殖不足,是保证妊娠顺利的基础。
[硕士论文] 牛筱雯
营养与食品卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  通过体外实验了解铁过负荷引起的HNF4α表达下降的生物学特点,阐明铁过负荷导致HNF4α表达下降的分子机制,为更深入的研究铁过负荷对肝脏组织细胞的影响提供线索,并为研究铁过负荷相关肝脏疾病的防治措施提供理论基础。
  研究方法:
  1、细胞的培养
  L02细胞在含10%胎牛血清,1%双抗的1640培养基中培养。Huh7、G2细胞以及Hepa16细胞均在含10%胎牛血清,1%双抗的高糖DMEM培养基中培养。根据实验目的,各组分别加入Apo-Tf(终浓度30uM)、Holo-Tf(终浓度30uM)及FeSO4(终浓度100uM)对细胞进行干预培养(5%CO2,37℃)。
  2、RT-PCR
  用Trizol提取细胞、组织的总RNA,测定其浓度,再用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,与引物,SYBR green,水混匀后,在StepOne Plus实时定量PCR仪上进行扩增,得到结果,统计分析。
  3、Western blot
  用全蛋白提取试剂盒提取细胞、组织的总蛋白,测定浓度,变性后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,孵育一抗及荧光二抗,显像,分析。
  4、检测细胞内的铁含量
  细胞接种于12孔板,37℃培养至融合度为80%左右时,在培养液中加入终浓度为30uM的Holo-Tf,培养0.5h。去除含Holo-Tf的培养基,用适量PBS洗3次,加入PGFL(phen Green FL)二价铁荧光染料(DMSO配制),终浓度为5uM,避光孵育20min,加入适量PBS洗3次,在共聚焦显微镜下观察绿色荧光(波长490nm,发射波长520nm)强度的变化。
  5、甲基化检测
  将L02细胞铺于24孔板,并分为两组,IO组和IO+5-Aza-CdR(5-aza-2'-deoxycytidine,5-脱氧杂氮胞苷)组,IO组加入终浓度为30uM的Holo-Tf,IO+5-Aza-CdR组除了加入相同量的Holo-Tf,同时还加入了终浓度为2.5uM的5-Aza-CdR。细胞干预后,依次在0、1、2、4、8h进行收集。并通过实时定量PCR检测各组HNF4α的表达变化。
  6、转录因子结合活性芯片
  采用转录因子结合活性芯片,对对照组,Holo-Tf-1h(Holo-Tf干预1h)组,HNF4α组(加入了HNF4α片段)的L02细胞转录因子结合活性进行检测,筛选。
  7、染色质免疫共沉淀(ChIP)
  L02细胞接种于6cm2培养皿中,分为对照组,Apo-Tf组和Holo-Tf组,培养1h,按照CST公司染色质免疫共沉淀说明书的步骤进行实验。
  8、蛋白稳定性检测
  放线菌酮(CHX)可以抑制蛋白合成,通过用CHX(终浓度0.6uM))干预对照及铁过负荷组的L02细胞,并在0、0.5、1、2、4、8h收集细胞,提取总蛋白,用Western blot检测比较两组细胞蛋白的表达量变化,观察铁过负荷后YY1蛋白的稳定性情况。
  9、siRNA及过表达质粒转染
  L02细胞接种培养板,当融合度为80%时,按说明书进行转染。将siYY1或YY1过表达质粒以及转染试剂按体积1∶1混匀后,室温静置15min,再加入各组培养基中,培养48-72h后收集细胞检测。
  10、实验动物小鼠分组及造模方法
  铁过负荷小鼠:
  50只雄性,四周龄,C57小鼠适应2天后,随机分为3大组:对照组,0.3%高铁饲料组,3%高铁饲料组。对照组与0.3%高铁饲料组又分为4个亚组:1月组,3月组,6月组,12月组。饲养期间,小鼠自由饮水。分别于1月,3月,6月,12月处死,采集血清及肝脏组织标本备用。
  腺相关病毒小鼠:
  40只雄性C57小鼠随机分为八组:①阴性对照组②YY1干扰组③过表达YY1组④喂养3%高铁饲料组⑤喂养3%高铁饲料+干扰YY1组⑥喂养3%高铁饲料+过表达YY1组⑦喂养0.3%高铁饲料组⑧喂养0.3%高铁饲料+过表达YY1组。
  病毒通过尾静脉注射,注射量分别为,NC病毒:2×1011vgs;YY1干扰病毒:2×1011vgs;过表达YY1病毒:2×1010vgs。各组小鼠均于尾静脉注射四周后处死,并取样本检测。
  11、小鼠肝铁含量检测
  将小鼠肝脏消化后的液体定容至10ml,再将样本溶液导入火焰原子吸收仪,测定吸光度,并计算出样本铁含量。
  12、肝脏组织普鲁士蓝染色,HE染色
  肝脏样本固定在4%多聚甲醛中,包埋石蜡,然后切片,用普鲁士蓝染色,苏木精和伊红染色,显微镜观察并采集图像。
  13、血清生化指标的检测
  血清ALT、AST,血清铁,总铁结合力,转铁蛋白饱和度,均采用血生化自动分析仪进行测定。
  研究结果:
  1.铁过负荷下调入肝原代细胞、人和鼠肝癌细胞HNF4α表达
  1.1不同时间铁干预对肝细胞HNF4αmRNA表达的影响
  将人肝细胞L02和人肝癌细胞Huh7在添加30uM HOLO-Tf或100uM FeSO4的培养液中分别暴露1~8h,结果显示暴露1h,HNF4αmRNA表达即明显下降。延长暴露时间,两种细胞的HNF4αmRNA表达未见进一步明显下降。
  1.2铁干预1h对多种肝细胞株HNF4αmRNA及蛋白表达的影响
  将人原代肝细胞、人肝细胞L02、人肝癌细胞Huh7、G2和小鼠肝癌细胞Hepa16在含30uM Holo-Tf的培养基培养1h,结果发现,上述细胞HNF4αmRNA和蛋白表达均明显下降。
  1.3Holo-Tf干预0.5h对细胞内铁含量的影响
  用PGFL(Phen Green FL)荧光染料对铁干预的细胞进行了染色,结果显示用Holo-Tf干预人原代肝细胞、人肝细胞L02、人肝癌细胞Huh7、G2以及鼠肝癌细胞Hepa160.5h,与对照组相比,其细胞内荧光减弱,表明干预0.5h,铁已进入细胞内;另外,实时定量PCR结果也显示,30uM Holo-Tf干预1h,上述肝细胞铁调节分子表达发生了铁过负荷的相应变化,即Hamp、FTL1mRNA表达升高,TRFC mRNA表达下降。
  2.转录因子YY1与HNF4α基因结合位点结合活性下降是铁过负荷导致HNF4α表达下降的重要原因
  2.1铁干预不同时间对细胞miR-34a表达的影响
  通过生物信息学分析,miR-34a与HNF4α基因有结合位点,因此,将L02细胞在含30uM Holo-Tf的培养基中分别暴露了0.5、1、2、4、8h,结果显示,各时间点细胞miR-34a的表达均没有明显变化,提示,铁干预1h肝细胞HNF4αmRNA表达下降可能与miR-34a无关。
  2.2铁过负荷对HNF4αDNA甲基化的影响
  采用5-AZA-CdR抑制HNF4αDNA甲基化的方法,了解铁干预是否通过改变L02细胞HNF4αDNA甲基化进而影响其基因的表达,结果显示,与单独用Holo-Tf干预组比较,铁干预同时加入5-AZA-CdR组细胞HNF4αmRNA的表达没有明显变化,提示,L02细胞铁过负荷HNF4α表达下降可能与其DNA甲基化程度改变无关。
  2.3铁过负荷对HNF4α转录因子的影响
  2.4不同时间铁干预对L02细胞YY1表达的影响
  对铁干预不同时间后,YY1的表达变化进行了检测。结果显示,在铁干预0.5、1、2、4、8h后,与0h相比,YY1mRNA表达并没有出现明显变化,而YY1蛋白则从0.5h开始就出现明显表达下降,且在1h进一步下降后基本保持不变。
  2.5铁过负荷对YY1蛋白稳定性的影响
  放射菌酮(CHX)可以抑制蛋白合成,用于观察蛋白降解速率,分析蛋白稳定性。向对照组和铁过负荷组的细胞培养基中分别加入CHX(终浓度0.6uM),并通过Western blot检测不同时间点的蛋白表达量,结果发现,铁过负荷组的YY1蛋白与对照组比较,降解速率明显增加。说明铁过负荷是通过使YY1蛋白稳定性下降,降解增加,从而导致蛋白表达量减少的。
  2.6体外实验干扰及过表达YY1对HNF4α表达的影响
  通过分别向L02细胞、铁过负荷L02细胞转染siYY1和过表达质粒,观察HNF4α表达的变化,结果显示YY1表达被抑制时,HNF4αmRNA表达也下降,相应的YY1过表达时HNF4αmRNA表达升高,并且过表达YY1还可以逆转由铁过负荷引起的细胞HNF4α表达下降。
  研究结论:
  1、铁过负荷可以在细胞水平和整体动物水平下调HNF4α表达;
  2、转录因子YY1可以在转录水平调控HNF4α的表达;
  3、铁过负荷可以通过影响YY1蛋白的稳定性使其蛋白量减少,与HNF4α的结合活性减弱,导致HNF4α表达下降;
  4、过表达YY1可以缓解铁过负荷对小鼠肝脏HNF4α表达的抑制作用以及炎症反应的发生。
[博士论文] 王钢
生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 主要围绕11β-HSD2在子痫前期发病机制中的作用进行研究。
  子痫前期是妊娠期特有的疾病,严重影响着母体和胎儿的健康,是导致孕产妇和胎儿发病死亡的主要原因之一。目前,针对子痫前期并没有有效的诊断和治疗措施,临床上最有效的治疗方法仍然是提前终止妊娠。胎盘被认为在子痫前期发病过程中起着至关重要的作用,因为随着胎盘的娩出,子痫前期的相关症状也会随之消失。但是,胎盘是通过何种机制参与到子痫前期的发病过程中,尚未完全阐明。近年来,子痫前期二元发病理论被广泛接受,即在子痫前期发病机制的第一阶段,由于胎盘发育不良滋养层细胞侵入能力受损,使胎盘滋养层细胞无法侵入子宫肌蜕膜和子宫螺旋动脉,从而子宫螺旋动脉无法从高阻力,低容量的血管转变为低阻力,高容量的血管。由于子宫螺旋动脉重构障碍,胎盘无法得到充足的氧气和血液供应致使胎盘处于缺血缺氧的不良状态。之后,在子痫前期发病机制的第二阶段,胎盘处于缺氧缺血的状态下会释放大量有害的细胞因子进入到母体循环中,造成母体广泛的内皮功能紊乱,继而造成母体出现高血压,蛋白尿等症状。
  糖皮质激素在妊娠期间很多过程如胚胎着床,胎盘胎儿的生长发育以及胎儿的分娩中都发挥着重要的调节作用。糖皮质激素可以作用到胎盘、胎儿、胎膜等妊娠期组织。随着妊娠期的进行,母体和胎儿血液循环中的糖皮质激素水平都会随之升高,但母体循环中的糖皮质激素升高水平是胎儿侧的数倍。如果胎儿暴露在母体过量的糖皮质激素水平之下,会导致胎儿生长发育不良。胎盘中的11β-HSD2可以将有活性的糖皮质激素转变为无活性的糖皮质激素,从而可以阻止母体过量的糖皮质激素进入胎儿循环中。有研究显示,子痫前期产妇胎盘中的11β-HSD2表达是降低的,糖皮质激素水平是升高的。也有研究发现,妊娠期SD大鼠皮下注射地塞米松会导致大鼠出现高血压,蛋白尿等子痫前期相关症状。这些研究提示11β-HSD2可能参与到子痫前期的发病机制当中,但是11β-HSD2是通过何种机制参与到子痫前期的发病过程中,尚未阐明。由于子痫前期二元发病理论被广泛认可,那么,胎盘中11β-HSD2表达异常是否是通过抑制胎盘滋养层细胞侵入功能和促进胎盘释放有害细胞因子进入母体等过程参与到子痫前期发病过程中呢?因此,为了探究11β-HSD2在子痫前期发病机制中的作用,分别在整体动物和离体细胞水平上,进行了相关实验探索。
  结果:
  1、妊娠期间抑制11β-HSD2活性可以导致大鼠产生子痫前期相关症状。在大鼠妊娠期间(GD7.5-19.5)皮下注射11β-HSD2抑制剂CBX180μg/d、360μg/d、720μg/d,3种剂量观察抑制11β-HSD2之后是否会直接导致大鼠出现子痫前期的相关症状。结果显示:(1)CBX皮下注射给药之后360μg/d和720μg/d两组胎盘中11β-HSD2蛋白表达减少并且活性受到抑制。(2)CBX皮下注射给药之后360μg/d和720μg/d两组妊娠期大鼠出现高血压、蛋白尿、肾损害和胎儿生长受限等子痫前期相关症状。
  2、胎盘特异性抑制11β-HSD2活性导致妊娠期大鼠产生子痫前期相关症状。由于胎盘在子痫前期的发病过程中起着至关重要的作用,建立了胎盘特异性抑制11β-HSD2活性的妊娠期大鼠模型。动物实验分为五组:空白对照组(CON)、CBX180μg/2d、CBX-NPs、CBX-SRC、CBX-CSA。从GD7.5开始尾静脉给药处理,每两天1次持续到GD19.5。结果显示:(1)只有带有胎盘靶向多肽标签的CBX-CSA组大鼠胎盘中11β-HSD2的蛋白表达和酶活性是减少的。(2)胎盘特异性抑制11β-HSD2之后妊娠期大鼠出现高血压、蛋白尿、肾损害和胎儿生长受限等子痫前期相关症状。
  3、妊娠期(GD7.5-19.5)皮下注射地塞米松(DEX)导致大鼠产生高血压、蛋白尿、肾损害等子痫前期相关症状。
  4、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以抑制胎盘滋养层细胞的侵入。PAS、α-actin、CK免疫组化染色结果显示,360μg/d和720μg/d两组全身给药动物模型和CBX-CSA组靶向给药动物模型胎盘中,滋养层细胞侵入子宫肌蜕膜和子宫螺旋动脉功能受损。
  5、胎盘中11β-HSD2表达及其活性的异常可以导致子宫胎盘血流灌注不足。多普勒超声结果显示,全身给药模型中360μg/d和720μg/d两组妊娠期大鼠中子宫螺旋动脉,胎盘中母体通道,胎儿侧脐动脉内血流速度均受到抑制。
  结论:
  动物模型和离体细胞实验结果都表明,胎盘中11β-HSD2表达异常可以导致胎盘滋养层细胞侵入功能受损和血管生成因子与抗血管生成因子表达失衡,进而参与到子痫前期的发生发展当中。
  第二部分 主要围绕H2S对红细胞携氧功能的调节作用进行研究。
  H2S是继NO、CO之后被发现的第三类气体信号分子,可以参与调节人体很多生理和病理过程。H2S可以参与调节血管舒张,血管形成,炎症反应以及氧化应激等过程。机体是在L-半胱氨酸的相关代谢通路中产生H2S,其介导H2S产生的两种酶分别是胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)。CSE和CBS两种酶可以将同型半胱氨酸和胱硫脒代谢产生L-半胱氨酸,在产生L-半胱氨酸的过程中会伴随着H2S的释放。CSE与CBS两种酶在人体心血管系统,呼吸系统,神经系统之中广泛表达。有研究显示,在缺氧应激的环境下,机体很多组织和细胞如脑、肺、内皮细胞、心肌细胞等都会出现H2S生成减少的现象。课题组前期的研究也显示,胎盘在缺氧的状态下,CBS和CSE的蛋白表达降低,H2S的生成也随之减少。
  红细胞是人体血液中最常见的细胞,其主要的生理功能是负责氧气的运输。红细胞可以在肺脏中结合氧气使细胞内血红蛋白转变为氧合血红蛋白,之后红细胞随血液流经外周组织将血红蛋白携带的氧气释放到外周组织之中。氧气与血红蛋白的亲和性和氧分压的关系可以用氧离曲线表示。氧气与血红蛋白结合为50%时的氧分压称之为P50,其可以反应血红蛋白与氧气的亲和能力。血红蛋白与氧气的结合和释放受到很多因素如pH、温度、2,3-二磷酸甘油酸(2,3-BPG)的调节。2,3-BPG可以变构调节血红蛋白的构象,使其与氧气亲和性降低,利于氧气的释放。2,3-BPG是通过红细胞内糖酵解通路产生的1,3-BPG在2,3-二磷酸甘油酸变构酶(bisphosphoglycerate mutase,BPGM)的作用下生成的。2,3-BPG可以被2,3-二磷酸甘油酸磷酸酶降解,但是由于磷酸酶的活性较低,因此2,3-BPG在红细胞内蓄积并发挥作用。有研究显示,人体在缺氧的环境下,红细胞内的2,3-BPG表达升高,使血液在流经外周组织时释放更多的氧气。也有研究显示,人体在高海拔缺氧的环境下,随着缺氧时间的增加,血清中H2S的水平也随之减少。那么,H2S是否可以调节红细胞中2,3-BPG的表达进而调节红细胞的携氧功能呢?为了解决上述问题,设计了相关实验。
  结果:
  1、首先建立了Cse-/-基因敲除小鼠模型,之后收集野生型小鼠和Cse-/-小鼠的红细胞进行代谢组学的分析,结果显示,两组红细胞有30种差异代谢物,其中Cse-/-小鼠红细胞中的2,3-BPG水平明显升高。代谢组的结果提示,H2S的减少可以导致红细胞中2,3-BPG表达升高。
  2、为了进一步验证H2S对红细胞携氧功能的调节,采用2,3-BPG检测试剂盒检测红细胞中2,3-BPG水平,结果与代谢组分析一致,Cse-/-小鼠红细胞中的2,3-BPG水平明显升高。之后,外源性的注射H2S供体GYY4137之后可以逆转这一现象。同时,通过血气分析检测了红细胞的携氧功能指标氧离曲线和P50。结果显示,H2S减少同样会导致红细胞氧离曲线右移和P50升高。GYY4317处理Cse-/-小鼠之后可以逆转这一现象。
  3、为了探究血清中H2S的来源,建立了Cse-/-基因敲除小鼠与野生型小鼠骨髓移植模型,分为3组:野生型小鼠骨髓移植到野生型小鼠(WT-WT),野生型小鼠骨髓移植到Cse-/-小鼠(WT-Cse-/-)以及Cse-/-小鼠骨髓移植到野生型小鼠(Cse-/-WT)。结果显示,红细胞本身H2S的减少不会导致血清中H2S的改变,然而,外周组织H2S的减少会影响血清中的H2S水平。同时,红细胞携氧能力检测显示,外周组织H2S减少会导致红细胞2,3-BPG以及P50升高。GYY4317处理WT-Cse-/-组小鼠之后,可以逆转2,3-BPG以及P50的升高。
  4、为了探究H2S对红细胞的直接作用,离体培养了人和小鼠的红细胞,应用GYY4137(250μM,500μM)处理之后,检测红细胞携氧功能,结果显示,H2S可以抑制红细胞2,3-BPG和P50的水平并导致氧离曲线左移。
  5、为了探究H2S是通过何种机制调节2,3-BPG的水平,在整体动物模型和离体细胞水平检测了红细胞中BPGM酶活性的变化,结果显示,Cse-/-基因敲除小鼠红细胞中BPGM的酶活性升高,GYY4137注射处理之后可以逆转这一现象。人和小鼠离体细胞GYY4137处理之后,同样可以抑制红细胞中BPGM的酶活性。
  结论:
  H2S通过影响红细胞中BPGM的活性进而改变2,3-BPG的表达导致红细胞携氧功能的改变。
[博士论文] 向虹
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:脂肪细胞主要是由起源于中胚层的多能间充质干细胞逐渐分化或发育而来。由间充质干细胞发育为成熟脂肪细胞包含定型和分化两个过程,这两个过程受到高度协调而且复杂的网络调控。动物从胚胎发育持续到成年都存在脂肪形成的过程。近年来,研究报道锌指蛋白基因参与成脂分化的关键转录调节,不仅能够调节细胞的成脂定型,也能调节细胞的成脂分化和脂肪沉积。值得注意的是,与脂质代谢相关的锌指蛋白基因受miRNA调控,进而影响脂肪细胞分化的研究逐渐被报道。本课题组在前期的研究中,将猪原代脂肪来源的血管基质细胞体外诱导成脂分化,利用转录组测序及实时定量PCR技术筛选出1个保守的脂肪SV细胞成脂分化的差异表达基因Zfp217,通过RNAi技术初步确定了其在猪源脂肪SV细胞成脂分化过程中的作用。但其在细胞成脂定型和分化上的功能以及如何受miRNA调控而影响脂肪细胞的分化作用尚不清楚。主要研究结果如下:
  1.锌指蛋白Zfp217的生物信息学分析
  运用生物信息学技术分析了Zfp217的多级结构和序列特征,结果显示:在三个物种(hsa、mmu和ssc)中,Zfp217均含有8个锌指结构,且第6个和第7个锌指结构在三个物种中的序列相似性最高;利用同源建模方法构建了构象符合立体化学规则的Zfp217蛋白序列三维结构模型;Zfp217蛋白质理化性质分析表明其在三个物种中均为亲水性蛋白,热稳定性低且其氨基酸序列不稳定;分析Zfp217的跨膜结构域发现,只在鼠和猪中预测到跨膜结构域;转录后修饰显示:在人、鼠和猪中都预测到了O-GalNAc蛋白质糖基化位点和磷酸化位点。
  利用NCBI数据库检索Zfp217在真核生物多个物种中的蛋白序列,构建同源进化树,分析各物种蛋白序列的锌指结构基序。结果显示:从系统进化树来看,哺乳动物纲是其中最大的一类,各个纲或目之间界限分明,相同的纲或目内物种的序列具有更好的同源性且高度保守。C2H2类锌指结构基序广泛地分布在各个物种的序列中,并且数目从5到8个不等,数目为8的物种占绝大多数。
  利用GEO数据库检索Zfp217功能获得或功能缺失条件下的芯片数据集,对检索的数据集利用R语言分析获得了4个基因与fp217表达水平的变化相一致,33个基因相反。对这些获得的差异表达基因进行功能富集分析,发现它们富集在具有较高的生物活性过程中,并且富集在肿瘤癌症相关的生物学过程上。利用GEO数据挖掘获得121个乳腺癌差异表达miRNA,其中19个预测到在人和鼠Zfp217的3'UTR存在结合位点。在严格的筛选条件下,共预测到164个保守的miRNA靶向作用Zfp217,进一步文献挖掘发现,其中102个miRNA与癌症相关,关联性最大的癌症是乳腺癌。此外,数据挖掘还显示Zfp217与肥胖和成脂分化标记基因高度相关。因此,推测Zfp217可能参与成脂分化过程,并受miRNA的调控。
  2.Zfp217的表达与功能研究
  利用QPCR或Western blot分析了Zfp217在C3H10T1/2细胞成脂分化过程、猪和鼠不同组织以及肥胖小鼠模型脂肪组织中的表达模式。结果显示:Zfp217在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中的上调表达与成脂分化核心转录因子基因Pparg2相一致。在内脏脂肪组织中,Zfp217与Pparg2的表达趋势相一致,并呈现出相似的显著性。Zfp217的表达与一些促进成脂分化的早期标志基因(Cebpb,KLF4,Ebf1和ZNF395)的表达模式相一致。
  克隆了鼠Zfp217基因编码区,探讨了在Zfp217功能获得或功能缺失情况下对细胞成脂分化的影响,结果显示:Zfp217功能获得或缺失与C3H10T1/2细胞成脂分化的脂滴形成以及甘油三酯含量呈正相关。利用QPCR、流式细胞术、哺乳动物双杂交等试验分析了Zfp217调控细胞成脂分化的机制,结果显示:Zfp217超表达能够显著抑制Wnt信号基因的mRNA水平。此外,细胞成脂诱导4d时,成脂标记基因在Zfp217的不同处理组发生显著性改变。双杂交试验显示在鼠源背景下,Zfp217与Ezh2存在蛋白互作。表明Zfp217促进细胞成脂分化是通过抑制细胞DNA合成,影响细胞周期,并与Ezh2互作抑制Wnt信号基因的表达而实现的。
  3.靶向作用Zfp217的miRNA筛选、验证及功能研究
  利用多种生物信息学预测网站预测靶向作用fp217的miRNA:在人中共预测到176个,在鼠中共预测到213个,在人和鼠中共同出现的miRNA有42个。利用功能注释和进化分析进一步筛选出了5个候选miRNA:miR-503、miR-135a、miR-26a、miR-19a/b和miR-1a。利用双荧光素酶试验、QPCR和Western blot验证了miR-503、miR-135a和miR-19a可以通过靶向结合Zfp2173'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)降低Zfp217在细胞内的表达。
  分析了候选miRNA在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中、猪和鼠不同组织中以及肥胖小鼠模型五种脂肪组织中的表达模式。利用多种实验技术检测了miR-503和miR-135a对细胞增殖、细胞周期和细胞DNA合成的作用。结果表明:miR-503、miR-135a和miR-19a靶向作用Zfp217并抑制细胞的成脂分化过程。
[博士论文] 李羡
人体解剖与组织胚胎学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:神经干细胞(Neural stem cells NSCs)是一类来源于中枢神经系统(CentralNervous System,CNS)的干细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能,能够在胚胎发育中和成年脑中分化生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。哺乳动物CNS发育早期,脑室区的NSCs首先进行对称分裂,以增加自身数量。随后,NSCs通过不对称分裂的方式分化生成神经元,可以直接生成神经元,也可以通过生成中间前体细胞间接生成神经元,新生成的神经元会迁移到特定的位置,发育成熟具备特定的形态和功能。神经元分化结束后,NSCs还可以分化形成星形胶质细胞和少突胶质细胞,胶质细胞与神经元一起组成复杂的脑结构。NSCs的增殖与分化、成熟与迁移及由此引起的组织生长、分层等过程是CNS发育的细胞学基础。因此,NSCs自我更新和分化命运决定的调控机制的研究,成为NSCs领域中重要的基础科学问题。
  褪黑素是一种主要由松果体合成分泌的吲哚类激素,在许多外周组织中也有合成,例如皮肤、视网膜、胃肠道等。褪黑素的合成受光周期的调控,视网膜光感细胞接受外周光信号后,首先通过视网膜下丘脑纤维传入,传给视交叉上核,之后通过颈上神经节后交感神经纤维传出,支配松果体分泌褪黑素,呈现为白天分泌减少,黑夜分泌增加的昼夜节律性变化。褪黑素在生物体内具有广泛且重要的生理作用,包括调节生物节律,改善睡眠,抗氧化、调节免疫,抑制肿瘤等等。最重要的是,褪黑素由脑组织分泌,且易于穿越血脑屏障,因此褪黑素在脑内含量非常丰富,褪黑素对中枢神经系统有显著的保护作用。褪黑素对中风、阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫等引起的脑部的病理改变均有保护作用。越来越多的文献表明,褪黑素的神经保护作用,从细胞层面上讲,可能与其对NSCs的调控有关,特别是褪黑素对NSCs分化命运的调控。
  笔者利用小鼠胚胎NSCs为研究对象,深入探究了褪黑素对NSCs分化命运的影响,及其对决定性因子bHLH因子转录水平的调控作用。并从表观遗传学机制角度入手,证明了褪黑素通过受体MT1激活ERK1/2信号通路,提高了CBP/p300的HAT活性,增加了Ngn1和NeuroD1启动子区组蛋白H3第14位赖氨酸乙酰化水平,增强了两者的转录,从而促进了神经元分化。研究更加印证了表观遗传学调控在NSCs细胞命运决定中的重要作用,并将褪黑素和表观遗传学调控联系起来。本研究首次揭示了褪黑素通过改变启动子区域染色质结构,促进NSCs分化命运决定因子Ngn1和NeuroD1的转录,构建了外源信号与内部转录因子协同调控NSCs分化命运的调控网络。笔者的研究首次发现了褪黑素可以通过ERK1/2信号通路提升表观遗传学因子CBP/p300的HAT活性,有助于加深对褪黑素在NSCs命运决定中作用及在中枢神经系统发育中作用的理解,推进其临床应用的进程。
  第一部分 褪黑素对神经干细胞分化命运的影响
  为了探讨褪黑素对NSCs分化命运的调控作用,于NSCs分化的多个阶段,分别检测了NSCs的多能性、细胞周期、及终末分化比例等变化情况。结果显示,于分化培养基中培养3,5,7天的NSCs,与对照组相比,褪黑素处理组中多能性标记基因nestin阳性细胞数目显著降低,这说明具有多种分化潜能的NSCs数目降低,褪黑素可能促进了NSCs的分化进程。NSCs的分化过程,伴随着细胞周期的退出,PHH3可以特异性标记处于M期的细胞,褪黑素处理后的NSCs中PHH3阳性率显著下降,说明更多的细胞退出细胞周期。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21,P27的m RNA水平显著上升,也说明了这一点。终末分化的神经元的标记基因Tuj1和星形胶质细胞的标记基因GFAP,可以进一步确定褪黑素对NSCs分化的影响。结果显示褪黑素处理后,神经元数目显著增加。而星形胶质细胞数目没有显著变化。因此说明,在分化较早期,褪黑素可以显著促进NSCs向神经元分化,并不影响NSCs向星形胶质细胞分化。为详细分析褪黑素调控NSCs分化的分子机制,我们检测了分化命运决定性因子的转录水平的变化,主要是bHLH因子中的Ngn1、NeuroD1、Hes1和Hes5。结果表明,Ngn1和NeuroD1的表达显著升高。说明褪黑素影响了两者的表达,而这很有可能是褪黑素促进NSCs分化的根本原因。Hes1,Hes5是NSCs干性状态下高表达的两种抑制性bHLH因子,两者表达降低体现了NSCs分化程度的增加。
  哺乳动物神经系统中主要有两种褪黑素受体MT1,MT2。在分化过程中,MT1和MT2的表达没有显著性变化。Luzindole是MT1和MT2的抑制剂,4P-PDOT是MT2的特异性抑制剂。我们利用这两种抑制剂发现,同时抑制掉MT1和MT2,褪黑素丧失了对NSCs分化的调控作用,而特异性抑制掉MT2,褪黑素还仍然可以促进NSCs向神经元分化。因此褪黑素通过受体MT1调控NSCs分化。
  本实验结果显示,褪黑素可以通过受体MT1影响神经干细胞的分化命运决定过程,褪黑素处理后,更多的NSCs选择向神经元方向分化,具体表现为,细胞多能性下降,退出细胞周期,Tuj1以及MAP2等神经元的标记基因表达增加。但是不影响NSCs的胶质细胞分化进程。褪黑素通过对bHLH因子转录水平的调控,实现上述生物学效应。褪黑素可以促进Ngn1和NeuroD1的转录,抑制Hes1和Hes5的转录。本研究首次揭示了褪黑素对胚胎NSCs分化命决定因子bHLH因子的调控作用,证明褪黑素可以通过促进Ngn1和NeuroD1的转录水平,从而影响NSCs分化命运决定。
  第二部分 褪黑素调控神经干细胞的表观遗传学机制
  随着干细胞研究的开展,越来越多的证据表明,新的表观遗传机制参与到调控干细胞分化命运转变过程中。组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学调节中研究最早最透彻的转录后修饰,与基因活化关系密切。研究表明,组蛋白乙酰化修饰在神经发育过程中发挥着重要的作用,参与了NSCs的增殖、分化命运决定等多个过程,参与调控神经发生的过程。而且有文献报道,褪黑素可能会促进小鼠海马脑区组蛋白H3、H4乙酰化水平增加。
  首先检测了与基因转录激活最相关的几个组蛋白乙酰化位点的变化。组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)、组蛋白H3第14位赖氨酸(H3K14)、组蛋白H4第8位赖氨酸(H4K8)、组蛋白H4第16位赖氨酸(H4K16)。我们发现褪黑素处理后,只有H3K14乙酰化的水平显著上升,Western Blot和免疫荧光的结果都证实这一点。其他位点并没有显著变化。然后我们利用ChIP实验,特异性检测了Ngn1和NeuroD1启动子区域,结果发现褪黑素处理后,这两者启动子区域H3K14乙酰化水平显著上升。这说明褪黑素改变了Ngn1和NeuroD1启动子区域染色质结构,促进两者转录激活。
  组蛋白修饰离不开修饰酶的调控,组蛋白乙酰化修饰是由HATs和HDACs共同调控的。CBP/p300是一类HATs,两者在氨基酸序列和功能上非常相似,除了参与组蛋白乙酰化外,还可以募集转录激活因子到特定基因上,调控基因表达。这两者在神经系统发育中也发挥重要作用。CBP/p300虽然可以催化多个赖氨酸位点的乙酰化修饰,但是对组蛋白H3K14这个位点的特异性最高。首先我们利用Western Blot技术检测其两者的蛋白表达变化情况,发现褪黑素处理后并没有显著性变化。然后,我们利用HAT活性检测试剂盒检测CBP/p300的HAT活性,发现褪黑素处理后两者的HAT活性显著性上升。为进一步证明上述结论,我们利用C646抑制掉CBP/p300HAT活性。C646处理之后,H3K14的乙酰化水平显著下降,值得注意的是,Ngn1和NeuroD1的转录激活现象也消失了,同时下游的MAP2和Tuj1的表达上调的现象也消失了。这说明褪黑素确实是通过CBP/p300的HAT活性来调控组蛋白修饰的,从而进一步影响NSCs分化命运。
  前面已经证明褪黑素通过MT1调控NSCs分化,而MT1激活胞内多条信号通路,其中ERK1/2和AKT是两条比较研究透彻的与细胞分化有关的,因此我们首先对这两条通路进行了筛选。分别加入这两个通路的抑制剂,PD98059是可以抑制ERK1/2通路,LY294002可以抑制AKT通路。结果发现抑制ERK1/2通路后,可以有效抑制褪黑素促进神经元分化的效果,而抑制AKT通路没有显著变化。有文献报道,ERK1/2可以促进CBP/p300的HAT活性,因此又进一步检测了CBP/p300 HAT活性变化,发现抑制ERK1/2通路后,褪黑素处理不能引起两者HAT活性上升。同样WB结果也证明H3K14乙酰化水平不能被褪黑素所调节。这说明褪黑素通过ERK1/2通路,激活了CBP/p300的HAT活性活性,进而产生后续的生物学效应。
  本文的研究首次证明了在NSCs分化过程中,褪黑素可以特异性提高组蛋白H3K14乙酰化水平,更加印证了表观遗传学调控在NSCs细胞命运决定中的重要作用。本文的研究首次揭示了褪黑素通过改变启动子区域染色质结构,促进NSCs分化命运决定因子Ngn1和NeuroD1的转录,构建了外源信号与内部转录因子协同调控NSCs分化命运的调控网络。有助于加深对褪黑素在NSCs命运决定中作用及在中枢神经系统发育中的作用的理解,推进其临床应用的进程。
[硕士论文] 高亚坤
外科学(整形) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  颌面部是人体美学的重要组成部分,颌面部软组织缺损的修复有一定的的美学要求。颞浅动脉蒂耳后皮瓣是修复颌面部缺损的理想皮瓣。目前,国内外关于该皮瓣的解剖学研究仍不全面。
  计算机三维重建技术可以高度还原人体立体结构,并可实现多种虚拟操作。利用计算机技术重建的三维耳后皮瓣可以直观、准确地观察研究耳后皮瓣精细、复杂的解剖结构;通过计算机软件测量工具对重建皮瓣模型进行虚拟解剖测量和研究,有助于加深对颞浅动脉蒂耳后皮瓣大体解剖结构的理解。
  目的:
  本研究拟通过尸体解剖对颞浅动脉蒂耳后皮瓣内各种解剖结构进行测量、研究,对皮瓣内的血管联系方式进行分类,为该皮瓣在临床上的推广应用提供精确可靠的解剖学参考。基于多排螺旋CT血管造影技术获取人活体头颅部数据集,构建颞浅动脉蒂耳后皮瓣三维模型。通过对模型虚拟解剖数值和大体解剖数值进行对比分析,评价重建皮瓣的真实性。为今后该皮瓣的基础研究、临床应用和解剖教学提供平台和动态资料。
  方法:
  第一部分:模拟临床皮瓣设计方式,按层次解剖方法对尸体标本耳后区域进行大体解剖研究,记录皮瓣内血管来源、口径、走行、分布以及吻合情况,并重新分类颞浅动脉和耳后动脉之间的吻合方式,测量吻合区域分布范围,同时研究同名动静脉间伴行情况。
  第二部分:利用多层螺旋CT血管造影扫描技术(CTA),将扫描得到的人体活体头颅部位二维数据集导入飞利浦星云3D影像数据中心(PHILIPS IntelliSpace Portal),构建耳后皮瓣三维模型。观察研究模型各项解剖学特征,进一步通过虚拟解剖测量,对比分析三维模型与大体解剖的吻合情况,评价模型的真实性。
  结果:
  第一部分:耳后皮瓣的血供主要源自颞浅动脉和耳后动脉。颞浅动脉与耳后动脉起源、口径、走形、分支、分布等解剖结果与既往研究相符。二者的吻合方式呈阶梯状和网状两种类型,部分颞浅动脉发出耳后直接分支支配耳后区域,少数尸体标本耳后动脉耳支缺如。颞浅、耳后静脉与同名动脉伴行并不紧密,静脉间未见规律的解剖联系。
  第二部分:以人体活体头颅部位CT扫描图片为数据集,成功构建出颞浅动脉蒂耳后皮瓣的三维模型,模型生动逼真,完整清晰的再现了皮瓣内解剖结构和皮瓣内血管吻合关系,吻合关系分类与大体解剖结果一致,各项虚拟解剖测量结果与尸体解剖结果基本相符。
  结论:
  通过对多例人体尸体标本耳后区域进行大体解剖研究,对颞浅动脉蒂耳后皮瓣的各种解剖结构进行了较精确的测量,对皮瓣内颞浅动脉与耳后动脉的吻合关系作出进一步分类,获得了多项对临床工作和解剖研究具有重要参考意义的解剖学数据。
  利用多排螺旋CT血管造影技术和重建软件,成功的构建出颞浅动脉蒂耳后皮瓣模型,首次以三维模型的形式对皮瓣内血管吻合方式进行展示。皮瓣模型的虚拟解剖数值与大体解剖基本相符和,构建的皮瓣真实可靠。
[硕士论文] 丁晨
外科学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是来源于中胚层的干细胞,具有多向分化的潜在能力、低免疫源性及自我复制等优点,在一定的体内或者体外环境中能够发育成造血细胞、成骨细胞、神经细胞等,对于受损器官组织的修复及再生具有极其重要的影响。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem,BMSCs)作为存在于骨髓中的一类间充质干细胞,其具有易于向成骨细胞分化,在体外具有良好的克隆增殖能力及在体内大量存在等优势,常常作为治疗骨不连或者骨缺损理想的种子细胞。
  随着BMSCs在临床治疗中的广泛应用,发现其增殖和成骨分化能力是影响临床疗效的重要因素。干细胞移植部位的炎性微环境是影响其移植效果及骨再生的关键因素。微环境中的炎性分子常分为两类,一类是外源性分子如脂多糖、磨损颗粒等,另一类是内源性的炎性介质如TNF-a,PGE2等。在骨折愈合的过程中,特别是针对开放性骨折、免疫力低下或者内固定术后患者,骨折断端周围容易合并感染。如感染长期得不到有效控制,细菌所释放的致病因子会破坏骨折断端血供,致使骨质的吸收,严重影响骨痂的生长及骨折愈合,最终导致感染性骨不连。革兰氏阴性菌为感染性骨不连最常见的致病菌之一。细菌内毒素脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)作为G-菌主要的致病因子之一,G-菌在崩解或者凋亡时产生一定量的LPS,所以临床中感染性骨不连骨折断端周围组织可检测出一定量的LPS。将BMSCs移植到骨不连部位,BMSCs将不可避免会处于内毒素环境当中,与脂多糖发生接触。因此,在骨再生过程中,内毒素环境对于BMSCs的增殖和成骨分化的影响及其机制需要深入的研究。本研究采用全骨髓贴壁法分离及培养骨髓间充质干细胞,然后使用有限稀释法对其进行提纯,观察以不同浓度的脂多糖刺激骨髓间充质干细胞时对BMSCs定向成骨分化能力和体外增殖能力的作用,并对这种影响的信号通路作初步探索,旨在观察LPS对BMSCs生物学特性的影响,以便更好地将BMSCs应用于骨不连的临床治疗中。我们的研究结果如下:
  一、人BMSCs的分离、培养、提纯和鉴定
  第一部分实验采取贴壁法分离及培养原代的骨髓间充质干细胞,然后再采用有限稀释法提纯原代细胞,得到相对比较均一的BMSCs细胞系。针对BMSCs生物学特性,采用特定的方法鉴定所获得的BMSCs。首先通过仪器检测发现所获得细胞的白细胞分化抗原29、90表达阳性,而白细胞分化抗原34、45表达阴性,与BMSCs的表型相符,同时通过检测发现所获得的细胞具有成脂及成骨方向的分化能力,与BMSCs的生物学特征一致,说明获得相对比较均一的BMSCs细胞系。
  二、LPS对人BMSCs增殖能力的影响
  通过不同浓度的LPS刺激BMSCs不同时间以检测其对BMSCs增殖能力的影响。使用不同浓度的脂多糖(浓度分别为0.01-100ug/ml)分别作用于骨髓间充质干细胞12小时、24小时及48小时之后再加入噻唑蓝染色,最后通过OD值检测显示:刺激12小时后,培养各组不同浓度LPS刺激的骨髓间充质干细胞与对照组间的增殖能力相比,无明显差异;当如果脂多糖的作用时间为24小时、48小时,0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml这三组脂多糖的刺激组与对照组相比,BMSCs的增殖能力显著提升,其中以1ug/ml LPS刺激组增殖能力的增加最为显著;10ug/ml LPS刺激组BMSCs增殖能力较对照组有所减弱,但两者之间的差异没有明显的统计学意义;然而100ug/ml LPS刺激组细胞增殖能力明显减弱,与对照组的差异具有明显统计学意义。综上所述,当低浓度的LPS刺激BMSCs时,其增殖能力获得增强,但随着LPS浓度逐渐升高,高浓度的LPS可能会减弱BMSCs的增殖能力。
  三、LPS对人BMSCs定向分化能力的影响
  通过不同浓度的LPS(0.01-100ug/ml)刺激BMSCs以检测其对BMSCs成骨分化能力的影响。与对照组(0ug/ml)相比,加入含有不同浓度LPS的成骨分化诱导液2周以后检测BMSCs成骨分化相关基因的表达,结果表明:当脂多糖的浓度为0.01、0.1、1ug/ml时,成骨分化相关基因OCN、Runx2、OPN、ALP mRNA的表达提升,其中当脂多糖浓度为0.1ug/ml时,成骨分化相关基因的表达提升最为明显;但10ug/ml和100ug/ml这两组浓度的脂多糖刺激BMSCs时,成骨分化相关基因表达下降,其中OPN在脂多糖浓度为100ug/ml,ALP在脂多糖浓度为10ug/ml和100ug/ml时,与对照组差异具有统计学意义。随后,利用茜素红染色分别检测不同浓度的LPS在BMSCs成骨分化过程中对矿化结节形成的影响,与对照组(0ug/ml)相比,加入含有不同浓度LPS的成骨分化诱导液14d以后,检测结果表明示:低浓度的脂多糖能够显著促进骨髓间充质干细胞矿化结节的形成,但随着脂多糖浓度的升高,则使BMSCs矿化结节的形成减少。以上结果证实低浓度LPS能够促进BMSCs分化为成骨细胞,但高浓度的LPS可能会减弱BMSCs的定向成骨分化能力。
  四、MAPK信号通路在LPS调控的BMSCs成骨分化过程中作用及机制的研究
  这部分实验对LPS调控骨髓间充质干细胞成骨分化的相关机制进行探究,分析了MAPK信号通路对于此过程的影响。首先利用相关激酶抑制剂同时阻断MAPK信号通路中ERK1/2信号通路、p38MAPK信号通路和JNK信号通路,通过检测矿化结节形成量及成骨分化相关基因表达量发现阻断ERK1/2信号通路、p38MAPK信号通路后两者表达量明显减少,但是将JNK信号通路阻断后与对照组相比两者表达量的差异无明显统计学意义。同时蛋白质印迹法检测发现脂多糖能够活化p38激酶和ERK1/2激酶,且酶的活性与脂多糖的作用时间呈正相关。说明ERK1/2和p38MAPK信号通路在LPS对BMSCs的成骨分化过程起正向调控的作用,但JNK信号通路对这一调控过程无明显作用。
  综上所述,LPS对于BMSCs的增殖和成骨分化能力均具有可塑性的调节作用,进一步研究发现ERK1/2和p38MAPK信号通路信号通路在LPS对BMSCs的成骨分化过程起正向调控的作用。本项研究针对内毒素环境对于BMSCs的增殖及分化的影响进行了一定研究,也为在临床上使用干细胞移植治疗感染性的骨不连提供了依据。
[硕士论文] 刘东
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  间充质干细胞是20世纪末发现的一种成体干细胞,经研究发现该种细胞可由多种成体组织中获得。因其具有多向分化潜能及免疫调控等功能,该细胞具有较广阔的临床应用前景。现在,临床研究的间充质干细胞以脐带来源最为常见。自2015年《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》下发以来,临床研究的间充质干细胞多采用无血清培养体系进行体外培养。但与之相伴随的问题则是细胞增殖能力偏弱且容易老化。鉴于本实验室以前的研究成果,本文着重研究小分子化合物ABO联合D609在无血清体系中对脐带间充质干细胞的老化是否有抑制作用,并探讨联合作用下脐带间充质干细胞的应用优势。
  内容:
  1.从脐带组织中分离获得间充质干细胞(MSCs),并对细胞相关基础指标进行鉴定。
  2.确定ABO及D609的使用浓度,并验证这两种化合物的使用对脐带间充质干细胞老化的影响。
  3.研究ABO及D609的使用对脐带间充质干细胞长时间运输抗凋亡能力的影响。
  4.检测ABO及D609的使用对脐带间充质干细胞核型和细胞表型的影响。
  方法:
  1.使用组织块贴壁培养的方法获得脐带间充质干细胞(MSCs),并按照常规方法进行细胞培养。取第三代细胞进行HE染色观察细胞形态并进行体外诱导分化等基本检测。
  2.用流式细胞仪检测细胞表型。
  3.将培养的脐带间充质干细胞分为实验组和对照组,取第八代细胞,实验组额外添加ABO及D609,检测细胞增殖情况,并利用半乳糖苷酶染色方法检测细胞老化情况,流式方法检测细胞长时间运输后的凋亡水平。
  4.验证ABO和D609联合培养是否会对间充质干细胞的核型和细胞表型产生影响。
  结果:
  1.使用组织块贴壁法可以从脐带中分离得到间充质干细胞,细胞形态为纺锤状且贴附于培养瓶壁生长。
  2.间充质干细胞表面标志物CD34、CD45、HLA-DR阴性表达(低于2%),CD44、CD73、CD90、CD105高表达(高于95%),符合间充质干细胞细胞表型特征;间充质干细胞在体外诱导培养条件下可向成骨方向、成指方向及成软骨方向分化。
  3.与对照组相比,实验组(添加ABO及D609组)的细胞增殖活性更强,且活性减退速度慢,经保存放置后细胞凋亡比率水平更低;同时对第8代细胞进行半乳糖苷酶染色检测后发现,实验组比对照组细胞老化比率低;
  4.从原代培养开始添加ABO及D609培养脐带间充质干细胞至第八代后细胞表型及核型检测均正常。
  结论:
  1.通过直接贴壁法获得的脐带间充质干细胞生物特征符合常规要求。
  2.在本实验室使用的无血清培养体系中添加ABO及D609后对脐带间充质干细胞的增殖有促进作用,能够抑制细胞老化且细胞在生理盐水中长时间保存的活率更高。
  3.使用ABO及D609培养脐带间充质干细胞不会对其安全性造成影响。
  4.使用ABO和D609培养脐带间充质干细胞对于细胞的临床应用前细胞的制备运输均有更好的效果。
[硕士论文] 李建华
口腔医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:牙髓病和根尖周病是口腔临床中常见的细菌性、感染性疾病,其有效的治疗方法是根管治疗。根管治疗的关键是对根管系统进行彻底清理、适当成形、严格消毒、严密充填,防止根尖周病的发生或促进根尖病变愈合。上颌磨牙位于牙弓后方,操作时可视性差,而上颌磨牙的根管系统复杂多样,给临床治疗带来了困难,因此口腔医生需要全面系统掌握上颌磨牙根管系统的解剖形态。目前,根管系统的研究方法有多种,其中锥形束CT(CBCT,cone-beam computedtomography)可以在冠状位、矢状位、水平位上清晰、立体、直观的显示上颌磨牙根管系统的解剖结构。
  目的:
  应用CBCT技术研究山东地区人群上颌第一、第二磨牙牙根及根管系统的解剖结构,分析牙根数目,根管数目、类型、长度及根管口间距与年龄、性别之间的关系,为上颌第一、第二磨牙根管系统的进一步研究提供第一手资料,并为临床治疗提供理论依据。
  方法:
  收集2015年9月至2017年8月于山东大学口腔医院放射科拍摄CBCT的患者的影像资料,共490名患者1321颗上颌第一及第二磨牙,记录患者姓名、性别、年龄、牙位等基本信息,同时分析并研究以下内容:①牙位;②牙根数目;③根管数目及类型;④根管口到解剖性根尖孔的距离;⑤根管口之间的距离,并分析以上研究内容与年龄、性别之间的关系。
  结果:
  1.山东地区人群上颌第一磨牙牙根及根管解剖形态
  1.1牙根数目
  714颗上颌第一磨牙中3根700颗,发生率为98.04%;2根13颗,发生率为1.82%;4根1颗,发生率为0.14%;1根0颗。
  1.2根管数目
  714颗上颌第一磨牙中四根管368颗,发生率为51.54%,其中MB2367颗,发生率为51.40%,DB21颗,发生率为0.14%;三根管344颗,发生率为48.18%;双根管2颗,发生率0.28%;单根管发生率为0。
  1.3根管类型
  根据Vertucci根管形态分型,714颗上颌第一磨牙中数量最多的是Ⅷ型共344颗,比例为48.18%。本研究中发现双根管2例,均为Ⅰ型;三根管各根管类型如下:
  MB:变异较多,以Ⅰ型数量最多共344颗(48.31%),其次是Ⅴ型共143颗(20.08%),再次是Ⅲ型共136颗(19.10%)。
  DB:以Ⅰ型数量最多共708颗,比例为99.44%。本研究中还发现远中颊根管变异4例,分别为Ⅱ型1例、Ⅴ型2例和1-2-1-2-1-2-1-2型1例。
  P:均为Ⅰ型,比例为100%。
  1.4根管口到解剖性根尖孔的距离
  范围在4mm~18mm之间,分布频率最高的范围是7.1~12mm,比例为87.31%;其余依次是12.1~15mm,比例为8.15%;5.1~7mm,比例为4.26%;15.1~18mm,比例为0.19%;4~5mm,比例为0.09%。
  1.5根管口之间的距离
  范围在0~8mm之间,MB-DB分布频率最高的范围是1.1~3mm,比例为29.56%;其余依次是3.1~4mm,比例为1.00%;0~1mm,比例为0.39%;4.1~5mm和7.1~8mm,比例均为0.04%。MB-P分布频率最高的范围是4.1~6mm,比例为25.54%;其余依次是3.1~4mm,比例为3.66%;6.1~7mm,比例为1.74%;7.1~8mm,比例为0.09%。DB-P分布频率最高的范围是2.1~5mm,比例为29.73%;其余依次是5.1~6mm,比例为0.96%;1.1~2mm,比例为0.31%;6.1~7mm,比例为0.04%。MB-MB2分布频率最高的范围是1.1~3mm,比例为2.88%;其余依次是0~1mm,比例为0.48%;3.1~4mm,比例为0.09%。MB2-P分布频率最高的范围是2.1~5mm,比例为3.23%;其余依次是5.1~6mm,比例为0.17%;1.1~2mm,比例为0.04%。
  2.山东地区人群上颌第二磨牙牙根及根管解剖形态
  2.1牙根数目
  607颗上颌第二磨牙中3根423颗,发生率为69.69%;2根109颗,发生率为17.96%;1根73颗,发生率为12.03%;4根2颗,发生率为0.33%。
  2.2根管数目
  607颗上颌第二磨牙中三根管439颗,发生率72.32%;四根管109颗,发生率17.96%,其中MB2108颗,发生率为17.79%,P21颗,发生率为0.16%;双根管45颗,发生率为7.41%;单根管14颗,发生率2.31%。
  2.3根管类型
  根据Vertucci根管形态分型,607颗上颌第二磨牙中数量最多的是Ⅷ型共421颗,比例为69.36%。本研究中还发现有双根管及单根管,均以Ⅰ型为主;三根管各根管类型如下:
  MB:变异较多,以Ⅰ型数量最多共422颗(77.01%),其次是Ⅲ型共62颗(11.31%),再次是Ⅴ型共19颗(3.47%)。
  DB:以Ⅰ型数量最多共547颗,比例为99.82%。
  P:以Ⅰ型数量最多共592颗,比例为99.83%。本研究中还发现腭根第二根管1例,其根管类型为2-1-2-1。
  2.4根管口到解剖性根尖孔的距离
  三根管各根管口到解剖性根尖孔的距离范围在4mm~18珈m之间,分布频率最高的范围是7.1~11mm,比例为79.77%;其余依次是11.1~14mm,比例为13.10%,5.1~7mm,比例为6.34%;14.1~15mm,比例为0.37%;4~5mm,比例为0.31%;15.1~18mm,比例为0.12%;双根管各根管口到解剖性根尖孔的距离范围在7mm~13mm,主要集中在8.1~12mm,比例为91.11%;其余依次是7.1~8mm,比例为6.67%;7mm和12.1~13mm,比例均为1.11%。
  2.5根管口之间的距离
  范围在0~9mm之间,MB-DB分布频率最高的范围是1.1~3mm,比例为30.09%;其余依次是0~1mm,比例为1.10%;3.1~4mm,比例为0.46%。MB-P分布频率最高的范围是4.1~6mm,比例为24.19%:其余依次是3.1~4mm,比例为5.15%;6.1~7mm,比例为1.68%;2.1~3mm,比例为0.52%;7.1~9mm,比例为0.12%。DB-P分布频率最高的范围是3.1~5mm,比例为24.48%;其余依次是2.1~3mm,比例为5.38%;5.1~6mm,比例为1.27%;1.1~2mm,比例为0.41%;6.1~7mm,比例为0.12%。MB-MB2分布频率最高的范围是1.1~2mm,比例为0.81%;其次是2.1~3mm,比例为0.29%;0~1mm,比例为0.12%。MB2-P分布频率最高的范围是2.1~4mm,比例为0.75%;其余依次是1.1~2mm和4.1~5mm,比例为均0.17%;5.1~8mm,比例为0.12%。B-P(双根管)分布频率最高的范围是2.1~4mm,比例为2.08%;其余依次是1.1~2mm,比例为0.29%;4.1~5mm,比例为0.17%;5.1~6mm,比例为0.06%。
  结论:
  山东地区人群上颌第一、第二磨牙牙根及根管解剖形态复杂多样,尤其是近中颊根管,但远中颊根管和腭根根管也会发生变异,而CBCT技术可以清晰、真实地显示上颌第一、第二磨牙牙根及根管系统的解剖结构。本研究的研究结果如下:①上颌第一、第二磨牙均以3根数量最多;②上颌第一磨牙主要为四根管,发生率为51.54%,其中MB2发生率为51.40%;上颌第二磨牙则以三根管为主,发生率为72.32%,其中MB2发生率为17.79%;③上颌第一、第二磨牙根管类型均以Ⅷ型为主;④上颌第一、第二磨牙根管口到解剖性根尖孔的距离虽然主要分布在7.1~13mm;⑤上颌第一、第二磨牙根管口之间的距离MB-DB主要分布在1.1~3mm,DB-P主要分布在2.1~5mm,MB-P主要分布在4.1~6mm,MB-MB2主要分布在1.1~3mm,MB2-P主要分布在2.1~5mm,B-P主要分布在2.1~4mm。本研究结果有助于口腔医生了解山东地区人群上颌第一、第二磨牙牙根及根管形态和结构,从而更加准确的定位根管口,确定工作长度,为临床治疗及深入研究提供理论依据。
[硕士论文] 刘焱
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)的遗传物质稳定性对于遗传信息的准确传递和机体的正常生命活动至关重要。多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)与诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。胚胎干细胞在无限增殖过程中能保持遗传物质高度稳定性。迄今为止,对维持遗传物质稳定性的相关机制研究主要集中在体细胞上,而我们对胚胎干细胞维持遗传物质稳定性的相关机制研究并不全面,因此深入开展胚胎干细胞在遗传物质稳定性维持方面的相关研究有助于我们认识并了解胚胎干细胞的特性,为胚胎发育、胚胎干细胞的医学应用提供基础理论依据。Filia,又名Khdc3(KH domain containing 3),特异性表达于小鼠生长中的卵母细胞、囊胚以及胚胎干细胞中,是ESC维持遗传物质稳定性的关键多功能蛋白分子。Filia可通过两个方面的作用来维持小鼠胚胎干细胞遗传物质的稳定性。一、Filia能与多能干细胞特异性蛋白Floped相互结合,促进停滞复制叉的重启,减少由复制压力所引起的细胞内源性损伤。二、Filia参与调控小鼠胚胎干细胞的DNA损伤反应(DNA damage response,DDR),从而维持遗传物质的稳定性。实验室前期工作基础发现,Filia S151位点以及Filia S349位点对Filia的功能发挥至关重要。Filia第349位丝氨酸残基与蛋白的入核相关,在损伤诱导情况下,Filia S349能被相关激酶磷酸化修饰,磷酸化的Filia能顺利转运至细胞核中,参与DNA损伤修复过程。Filia第151位丝氨酸残基的磷酸化修饰参与复制叉重启的过程,当复制叉受阻时,Filia-Floped聚集到受阻的复制叉上,在蛋白激酶ATR的调控下,Filia的第151位丝氨酸发生磷酸化,重启复制叉。FILIA蛋白除了能被磷酸化修饰外,还能被泛素化修饰。前期FILIA的P-MS(免疫共沉淀-质谱)结果发现Filia有四个泛素化位点,但我们还不清楚这四个泛素化位点是否参与调控细胞的损伤修复功能,调控方式是否独立。在本论文中,我们探究了Filia泛素化修饰在Filia蛋白调控胚胎干细胞遗传物质稳定性及DNA损伤反应的相关功能。
  为探究泛素化修饰是否和怎样调控Filia在胚胎干细胞中的功能,本论文用分子克隆构建出9个Filia泛素化位点突变的慢病毒表达载体,利用慢病毒包装与感染等手段,得到9个Filia泛素化位点突变的小鼠胚胎干细胞系。功能研究发现,Filia第141位赖氨酸的泛素化是Filia蛋白调控DNA损伤反应的关键,该泛素化位点突变后,小鼠胚胎干细胞系维持较高的内源性DNA损伤。并且FiliaK141突变后影响Filia DNA损伤修复的能力。深入探究Filia第141位赖氨酸的泛素化对损伤修复的影响机制,我们发现Filia K141的突变后并不影响Filia与PARP1(细胞质中与DDR调控相关的重要蛋白修饰酶)的结合,但Filia K141突变后,Filia S349不能被磷酸化,且Filia不能转运到细胞核中。综上,Filia泛素化修饰对Filia调控胚胎干细胞遗传物质稳定性十分重要。当胚胎干细胞发生DNA双链断裂时,Filia能定位到断裂处,调控同源重组修复双链断裂。FiliaK141泛素化位点突变后,使Filia S349位点不能被磷酸化修饰,进而FILIA蛋白的入核受影响,FILIA不能定位到受损的DNA位点,修复损伤位点。
  尽管我们已经发现Filia K141位点十分重要,但是现有的证据并不能揭示Filia泛素化修饰的调控机制。因此,我们需要开展进一步的工作,寻找Filia K141泛素化的上游E3连接酶,Filia泛素化修饰在不同细胞周期中是否处于动态变化过程,Filia泛素化修饰如何影响催化Filia S349磷酸化的激酶等。这个分子网络机制有待进一步完善,为多能干细胞在再生医学领域的应用提供基础理论依据。
[博士论文] 鲁兴
外科学(骨外) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:骨组织的变化在很大程度上是由两种骨细胞联合作用的,即成骨细胞和破骨细胞。成骨细胞是主要负责新骨形成,而破骨细胞则负责清除骨化组织。他们的形成和活动受到多种激素和细胞因子的严格控制。干扰这些细胞能形成许多病理骨状况。特别是在成人骨骼疾病中,如骨关节炎,类风湿性关节炎,破骨细胞活动异常。促炎分泌物如TNF-α、IL-6产生于病理骨组织中,并逐渐调节破骨细胞活动,促进疾病发展,因此靶向抑制这些促炎症分泌物的对于疾病的治疗至关重要。最近的研究进展显示了肿瘤坏死因子受体(TNFR)/TNF样蛋白质的重要性:骨保护素(OPG),核因子激活受体(RANK)和RANK配体(RANKL)共同调控破骨细胞功能。目前的研究表明RANKL或TNF-α联合巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)能从骨髓巨噬细胞体外引起破骨细胞生成,但机制不完全清楚。所以,进一步阐明RANKL或TNF-α信号通路生理和病理的调整,对于骨溶解的临床干预治疗具有重要的意义。
  整合蛋白是介导细胞和细胞及细胞和基质间相互作用的异二聚体受体,他们在破骨细胞分化和活化中起到重要作用。破骨细胞的表达的整合蛋白经分析确定至少有三种主要的集成类型——α5β3,α5β1,α2β1。尽管α5β3整合蛋白在破骨细胞生成中有至关重要的作用,其他的类型仍然未知。但考虑到大部分都涉及到整合蛋白β1,通过整合蛋白β1可以分析其他亚类型和整合蛋白β1参与破骨细胞分化的作用。
  α肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子,并参与正常炎症反应和免疫反应。α肿瘤坏死因子在许多病理状态下产生增多,包括败血症、恶性肿瘤、心脏衰竭和慢性炎性疾病。在重症类风湿关节炎患者的血液及关节中都可发现肿瘤坏死因子增多。在本研究中TNF-α具有诱导破骨细胞分化的重要作用。而研究中另外一种具有诱导破骨细胞分化的重要作用的因子为RANKL,RANKL全称为Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand(核因子κB受体活化因子配体),又名为TNF-related activation-induced cytokine(TRANCE),TNF相关激活诱导细胞因子;osteoprotegerin ligand(OPGL),骨保护素配体osteoclast differentiation factor(ODF),破骨细胞分化因子。为避免不同命名在学术上引起不便,美国骨矿研究学会(ASBMR)将其标准化命名为RANKL。其在成骨细胞中表达(osteoblast),激活破骨细胞。RANKL过表达,可导致一系列骨疾病,如风湿性关节炎,银屑病性关节炎等相关疾病。
  虽然RANKL和TNFα诱导破骨细胞分化的作用是已知的,但是其具体的作用机制还不完全清楚,尤其是TNFα的机制,报道很少。TNFα诱导破骨细胞生成的下游信号传导通路没有一致的研究结论。然而,我们越来越多的证据证实了在TNFα作用时和整合素β1作用密切相关。
  因此,本项目拟研究整合素β1在细胞因子诱导的破骨细胞分化中的作用及其机制。我们首先构建了整合素β1沉默表达细胞系,用RNA干扰技术进行整合素β1的基因敲除,成功构建了所需要的细胞系。然后通过这种细胞系,探索整合素β1是对破骨细胞分化是否具有作用。我们用两种诱导剂诱导破骨细胞分化,分别为RANKL和TNF-α。在两种诱导剂处理组中,结果明显不同。在TNF-α诱导破骨细胞生成中,稳定的敲除整合素β1后,TRAP阳性破骨细胞数量明显减少,而RANKL处理组中,TRAP阳性破骨细胞数量没有显著变化。为了进一步验证结果,我们做了破骨细胞陷窝形成实验,实验结果和TRAP阳性检测结果类似,TNF-α诱导后,整合素β1敲除组陷窝形成显著下降,RANKL处理后,未见显著变换。最后,我们对破骨细胞分化的标志性基因Cathespinκ和Osterix进行检测,结果显示,同样的,在TNF-α诱导后,整合素β1敲除组中Cathespinκ和Osterix的表达都显著降低,而RANKL处理后,两种基因的表达未发现显著变化。以上结果表明,在TNF-α诱导破骨细胞分化的过程中,整合素β1起着重要的作用,它可以促进这一分化过程,而在RANKL诱导破骨细胞分化的过程中,整合素β1则没有这一作用。
  为了阐明整合素β1在破骨细胞分化中的分子机制,我们进一步研究与破骨细胞分化有关的信号通路的变化,我们选择了三种信号通路,NF-κB信号通路、MAPK信号通路、JNK信号通路。分别应用RANKL,TNF-α作用于细胞,检测两种因子作用下对照组与整合素β1敲除组之间NF-κB、MAPK以及JNK三种信号通路中关键因子的变化。在TNF-α作用的反应中,整合素β1敲除组MAPK信号通路关键因子p38激酶磷酸化明显减少,而NF-KB和JNK信号通路中的关键因子均没有显著变化。相比之下,在RANKL作用下,对照组和整合素β1敲除组NF-κB、MAPK以及JNK三种信号通路中各关键因子均没有发生显著变化。这一结果提示我们,在TNF-α诱导的破骨细胞分化中,整合素β1的作用可能与MAPK信号通路有一定关系。为了进一步验证我们的实验结论,我们用MAPK抑制剂作用于β1敲除组细胞,仍然分别用RANKL和TNF-α进行诱导处理,结果发现,抑制MAKP后,只在TNF-α处理的β1敲除组中观察到破骨细胞分化显著降低。令人惊讶的是,尽管在RANKL处理中我们也增加了MAPK抑制剂,但是没有显示破骨细胞分化显著减少。通过推测,这意味着与TNF-α诱导破骨细胞的形成相比,MAPK信号通路在RANKL诱导的破骨细胞中的作用很小。而以上结果也进一步证实了,在TNF-α诱导的破骨细胞分化中,整合素β1的作用与MAPK信号通路有关。
  最后,我们又应用了整合素β1抑制剂进行作用,分为空白对照组,2.5μg/mL组和5.0μg/mL组,结果显示,在RANKL处理中,破骨细胞分化数量没有显著变化,而在TNF-α处理时,整合素β1抑制剂组破骨细胞分化数量显著下降,而且5.0μg/mL组比2.5μg/mL组破骨细胞数量下降更加显著。这一结果进一步证明了整合素β1在TNF-α诱导的破骨细胞分化过程中起着重要的促进作用,而且提示我们这种促进作用和整合素β1的含量呈现一个正相关。同样,我们用MAPK激酶抑制剂做相同的实验,结果整合素β1抑制剂实验结果类似,在RANKL处理中,破骨细胞分化数量没有显著变化,而在TNF-α处理时,整合素β1抑制剂组破骨细胞分化数量显著下降,而且5.0μg/mL组比2.5μg/mL组破骨细胞数量下降更加显著。这也进一步说明了MAPK信号通路在TNF-α在诱导破骨细胞分化的过程中起着重要作用,抑制此通路可以减少破骨细胞分化。
  总之,我们的研究结果表明,整合素β1可促进破骨细胞分化,而且是在TNF-α诱导破骨细胞形成中起着重要作用,并且这一作用可能是通过MAPK信号通路来实现的。这一研究结果可以为进一步寻找治疗相关疾病的靶向药物提供理论支持和实验基础。
[博士论文] 王方
外科学;创伤骨科 山东大学 2017(学位年度)
摘要:针对小腿远端、踝跟部和足部的软组织缺损修复,因周围可以利用的软组织有限,对骨科创伤、足踝外科、整形外科等相关科室医生,曾经是个棘手的问题,乃至于是挑战。该部位软组织缺损曾经使用过植皮、交腿皮瓣、局部任意皮瓣、牺牲主干血管的带蒂皮瓣或复合组织瓣、显微外科皮瓣技术等方法来修复,但存在创伤大、固定时间长、手术风险大等缺点。
  1983年Donski等首次介绍了远端蒂腓肠筋膜皮瓣(sural fasciocurtaneous flap,以下简称:腓肠皮瓣)的临床应用。1992年Masquelet等通过对小腿多根皮神经研究进一步阐明了皮神经营养血管蒂皮瓣的概念,开启了远端蒂腓肠神经血管皮瓣在世界各国的广泛应用。
  1998年以后,国内外对有关解剖和临床研究文献逐年增多,并出现很多改进类型,以提高该皮瓣的成活率、扩大供区取瓣范围、修复更远、更大的软组织缺损。临床研究和进展多涉及手术方式的改进,如小隐静脉蒂部远端结扎或近端吻合、分叶皮瓣、皮瓣延迟技术、游离穿支皮瓣修复上肢(前臂、腕、手部)、口腔、咽食管部等部位软组织缺损等。该皮瓣主要用于骨科(创伤骨外露、内植物外露)、足外科(肿瘤和骨髓炎清除后)、手外科、烧伤外科、整形外科等专业。
  腓肠皮瓣的优点有:腓肠皮瓣可以重建感觉,减少负重行走后的溃疡、按受区面积大小设计灵活、不牺牲主干血管、手术一期完成、切取简快速、一般不需要显微外科技术等。
  多数文献认为跟部和足底的软组织缺损修复,需要供区移植组织的感觉重建,有利于早期行走、避免发生冻伤、再发溃疡等。吻合腓肠神经的腓肠皮瓣满足了这一要求。因此,一些相关专业医生将感觉重建的腓肠皮瓣作为跟部、足底部软组织缺损修复的首选方法。
  目前,很多作者认同腓肠皮瓣是可以感觉化的皮瓣,认为将腓肠皮瓣内“神经血管轴内”的腓肠神经切断与创面周围的感觉神经吻合,就可以获得满意的感觉重建临床疗效。对此观点,尚未发现有文献对采用上述方法进行腓肠皮瓣感觉重建的可靠性和可能性,进行过深入的解剖研究的报道。笔者根据自己多年临床手术体会,对上述观点提出了问题。
  本研究结论,虽然可以对过去的相关文献作回顾性评价,但更希望能为相关专业的医师今后实施该类手术时,对腓肠皮瓣内神经支的选择提供参考。
  目的:
  2.1通过解剖标本观察腓肠神经构成分支(MS CN、PCB)、腓总神经分支LSCN对小腿后部支配,探讨其与腓肠皮瓣感觉重建的相关性,为相关领域医生实施该类手术时的神经选择提供依据;
  2.2通过对上述皮神经解剖结果的统计分析,评价上述皮神经出现率对皮瓣感觉重建疗效获得可能性的影响;
  2.3通过对小腿后方与腓肠皮瓣有关的皮神经支配点在小腿后部中上段相对水平(位置)分布的分析,探讨腓肠皮瓣切取上界位置与吻合有关神经重建皮瓣感觉疗效之间的关系。为有关医生术前设计感觉化皮瓣,提供前瞻性的参考;
  2.4对标本皮瓣区的隐神经,和部分标本小腿后侧的股后皮神经进行解剖观察,初步探讨其对皮瓣感觉重建的作用。
  3.材料对象本实验研究对象取自30具自愿捐献的中国人成人尸体,共40例小腿标本。本实验排除标准:标本有畸形、质地异常、小腿后部有损伤痕迹。
  方法:
  4.1切口按照腓肠皮瓣理论上最大切取范围设计。在全部标本中,探查浅筋膜内的腓肠外侧皮神经(LSCN);探查深筋膜内的腓肠内侧皮神经(MSCN)、腓总神经交通支(PCB)、追踪腓肠神经(SN)及其分支至外踝尖水平,部分到跟部和足背外侧;探查隐神经,和8例标本股后皮神经(PFCN)。
  4.2分别观察、测量和记录腓肠神经分支MSCN、PCB和SN,及LSCN、隐神经和PFCN的有无、起始、走行、层次、穿出、吻合、小腿后外侧感觉支分布、变异;重点测量和记录可用来吻合的直径0.5mm以上的神经皮肤感觉支支配点(supply point,简称SP)。
  4.3在每个小腿后外侧建立坐标系(方法见正文);定位、标记小腿后外侧LSCN、PCB、MSCN等神经的皮肤感觉支配点SP坐标位置,依次对SPA、SPB、SPC等坐标值进行测量和记录,获得测量值。
  4.4制作本文所有SP点在小腿后外侧相对位置的百分位分布图(图9A—9C);建立百分位为单位的右小腿坐标模型图(图9D)。将(图9C)与(图9D)百分位等位叠合,得到本组所有小腿SP相对位置百分位分布图(图9E)。过程如下:
  4.4.1将上节每个小腿的SP(±X,Y)坐标点实际测得值,转换为百分数为单位的SP(±X,y)坐标值;再标入百分位坐标图(图9A)。
  4.4.2图9A是X∶y=1∶1的百分位单位坐标图,尚不能与本组右小腿x∶y=1∶5.17百分位单位坐标模型图进行叠合,它的X轴的百分单位需按(OM∶ML=本组皮瓣平均最大长度∶本组皮瓣平均最大1/2宽度=5.17∶1)的比例进行压缩,再进行叠合。X轴的百分单位压缩后的小腿的SP坐标图(图9B、9C)
  4.4.3建立百分位为单位的右小腿坐标模型图(图9D):
  百分位为单位的右小腿坐标模型图的建立,应符合下列两个标准:O(0,0%),M(0,100%);y轴单位∶x轴单位=OM∶ML=5.17∶1(OM∶ML=本组皮瓣平均最大长度∶本组皮瓣平均最大1/2宽度)。
  4.4.4将X轴的百分单位压缩后的小腿的SP分布坐标图(图9C),与百分位为单位的右小腿坐标模型图(图9D),进行百分位等位叠合。得到本组所有SP点在小腿相对位置百分位分布图(图9E)。
  (注释:每个小腿神经支支配点即SP坐标点测得值均为实数值,因标本长短肥瘦不等,如果将所有SP坐标点直接标记在右小腿模型图上,会产生明显失真。经4.4.1-4.4.4步骤处理,SP坐标点测得值转化为针对其所在小腿的百分数SP坐标点,并将所有小腿SP坐标点百分数值计入百分位小腿坐标图;再将百分位小腿坐标图X轴百分单位按照小腿OM∶ML比例被压缩后,将本组压缩后的所有SP坐标点的百分位坐标图与右小腿百分位坐标模型图叠合后,通过百分位等位叠合,避免了SP坐标点实数数值分布图与小腿模型图叠合后的失真。可以真实地反映本组所有SP坐标点在小腿后外侧的相对分布位置。便于客观地讨论分析)
  4.5实验工具:常规手术器械、游标卡尺、钢卷尺、照相机。照片标识工具采用Photoshop6。
  4.6采集数据的记录方法:外径单位(mm),长度、宽度单位(cm),神经移行部位精确到0.5 cm;部分非本研究重点的指标如范围和距离测量值单位,直接用数值范围或平均数表示;神经支PCB、MSCN、LSCN等的出现率,以“x%”表示。
  结果:
  5.1腓肠外侧皮神经(LSCN) LSCN出现在(77.5%)31/40的小腿中。LSCN和腓肠神经交通(PCB)多以共干或多干或单支各自发自腓总神经,LSCN下行在腓骨头上后方穿过深筋膜进入浅筋膜层,由外上向下方行走,向周围发出感觉支支配小腿后侧和外侧皮肤。LSCN缺如率9/40(22.5%)。
  LSCN进入和支配小腿后皮肤的方式和位置笔者将其分为两型:1.支-末梢型分布,比例为25%(10/40),LSCN可为单支或双支,在深浅筋膜之间潜行,分裂成感觉末梢前产生支配点SPA、或SPA和SPB;2.支-亚支-末梢型分布:比例为52.5%(21/40),LSCN进入浅筋膜后,分为数支稍粗的感觉亚支在浅筋膜内向下潜行,感觉亚支产生SPA—SPE等支配点,变成感觉末梢支配皮肤。
  本组LSCN小腿后所有SP测得值(±X,Y)、ML、OM、转换后的百分数SP(±x,y),见表1。
  表1数据显示:本组所有支配点SP(平均y值)分布于小腿后方从外踝尖至腘窝(近似尸体小腿长度)或腓肠皮瓣理论最大长度OM上73.2%的水平(位置);偏y轴外侧25.5%的ML弧长位置上。小腿的SP坐标图与右小腿坐标模型图的叠合图(图9E),显示所有支配点SP相对位置集中于小腿后部上中段稍外侧,SP相对集中分布在小腿近端1/4段和中远3/4段交界点稍下方,并上下弥散;略偏皮瓣半宽约1/4外侧,并左右弥散;远近1/2段交界以下少有LSCN支配点。
  5.2腓总神经交通支(PCB) PCB出现在75%(30/40)的小腿中。其中,在45%(18/40)的小腿中,PCB和LSCN在腘窝上方以共干或多个分支发自腓总神经;在30%(12/40)中PCB独自发自腓总神经。有2例可见PCB有感觉分支到小腿中段后外侧皮肤;另外28例PCB(其中26例在小腿深筋膜下行走),均未见PCB有感觉分支穿越深筋膜到小腿上中段后外侧皮肤。
  本组PCB小腿后皮肤支配点SP坐标图分析,参照上节LSCN采用的方法。
  5.3腓肠内侧皮神(MSCN) MSCN出现在85%(34/40)的小腿标本中。MSCN在腘窝上方起源于胫神经,与小隐静脉伴行;此后,进入腓肠肌内外侧头间肌腱膜下(深筋膜下)、腓肠肌间或腓肠肌内下行(图10—图12);最后,MSCN与PCB在小腿中下段1/3交界附近汇合成腓肠神经。腓肠神经下行至跟腱水平发出5-8支分支支配小腿下1/4段、跟腱、外踝和跟部以远皮肤(图17)。在MSCN和PCB汇合点上方,本组标本中没有发现MSCN有感觉分支到小腿上中段后外侧皮肤。
  5.4股后皮神经(PFCN)本组解剖8例小腿后部近端股后皮神经支,观察到该神经在8例中均出现,在腘窝正中沿小隐静脉周围分布下行,1-2支,直径在0.3-0.5mm,支配小腿后部腘窝横纹下3-5cm的浅筋膜和皮肤。
  5.5隐神经(saphenous nerve)本组40例小腿中,只发现1例粗大变异的隐神经,直径1.5mm,由膝内后方的膝下分支支配到小腿近1/5后内侧皮肤。其他39例未见肉眼可见的隐神经腿后分支。
  结论:
  6.1 LSCN是腓肠皮瓣感觉重建的关键神经支,为神经吻合首选,位于浅筋膜内。
  6.2 LSCN的出现率在65%-77.5%之间,将LSCN与受区神经吻合,不考虑其他影响因素,理论上获得腓肠皮瓣感觉重建的可能性约在65%-77.5%之间。
  6.3腓肠皮瓣感觉重建疗效还取决于皮瓣上界在小腿后方的切取水平(位置),即取决于LSCN皮肤感觉支最低支配点水平。术者设计感觉化腓肠皮瓣时,上界切取位置最好靠近或高于小腿近端1/4段和中远3/4段交界点以上。
  6.4 PCB对腓肠皮瓣感觉重建的相关性较低,通过其吻合,提供的可能性为5%(2/40)。腓肠皮瓣供区内PCB基本位于深筋膜下。
  6.5 MSCN无感觉分支支配小腿上中段后外侧皮肤,所以,吻合MSCN无助于腓肠皮瓣感觉重建。在既往文献中MSCN最常被称作腓肠神经,用来与受区神经吻合。腓肠皮瓣供区内MSCN基本位于深筋膜下。
  6.6隐神经感觉支在腓肠皮瓣切取范围内肉眼难以发现可供吻合的神经,本组只有1例有较大感觉支可供吻合,出现率占2.5%。
  6.7股后皮神经因直径过于细小、支配范围有限、靠近小腿后侧较近端,故不建议术中对其进行探查。
  6.8重建感觉腓肠皮瓣术中吻合神经选择顺序(吻合阶梯):LSCN→PCB→隐神经,疗效从优到差。
[博士论文] 宋玲
口腔临床医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本课题组在前期研究中已发现,作为外源性CO的供源,CORM-3应用于炎症因子诱导的人牙龈成纤维(HGF)细胞时能够抑制其黏附分子的表达,抑制免疫活性细胞向牙周组织黏附、浸润和深部迁移,从而减轻宿主的炎性病理反应。前期研究结果提示我们CORM-3的应用可为牙周病的治疗提供了一种极具潜力的方法。基于以上研究背景,我们以人牙周膜成纤维细胞作为体外实验模型,以LPS和尼古丁共同刺激来模拟吸烟的牙周炎患者的牙周组织局部微环境,研究CORM-3对人牙周膜成纤维细胞的毒性、增殖和凋亡的影响,以及在炎性环境中对牙周膜成纤维细胞炎性因子和破骨细胞因子表达的调控作用,同时探讨HO-1通路是否参与CORM-3对上述因子表达的调控。
  方法:
  第一部分 CORM-3对人牙周膜成纤维细胞的毒性、增殖和炎症环境下抑制细胞凋亡的影响
  取新鲜拔除的恒牙,用组织块法分离并培养原代人牙周膜成纤维细胞,鉴定细胞来源,取状态良好的第4~6代细胞用于各项试验。采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)测定不同浓度(0、100、200、400、800μM)CORM-3对HPDLF细胞的毒性作用;以浓度为0、100、200、400μM的CORM-3刺激细胞,分别于0,24,48,72,96小时用CCK-8法检测细胞活性,评价CORM-3对HPDLF细胞增值的影响。
  建立LPS和尼古丁刺激下HPDLF细胞炎症模型,采用Annexin V-FITC/PⅠ双染法、应用流式细胞术检测工作浓度的CORM-3是否抑制炎症环境下HPDLF细胞凋亡。
  第二部分 CORM-3抑制LPS和尼古丁诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子及破骨细胞因子表达的作用及其机制
  (一)CORM-3对LPS和尼古丁诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子和破骨分化因子的影响
  取新鲜拔除的恒牙,分离并培养原代人牙周膜成纤维细胞,鉴定细胞来源后取状态良好的第4~6代细胞用于实验。常规培养细胞并以浓度为400μMCORM-3预处理细胞6h,然后以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激24h,用常规Trizol的方法提取细胞总RNA,应用实时定量PCR的方法从基因水平检测炎症环境下人牙周膜成纤维细胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的mRNA表达以及CORM-3的调控作用;同样在CORM-3预处理6h,然后以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁炎症诱导24h后,收集HPDLF细胞提取总蛋白,用蛋白印记实验方法在蛋白水平检测炎症环境下人牙周膜成纤维细胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表达以及CORM-3的调控作用。用完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞后再以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁诱导致炎,观察CORM-3对COX-2、PGE2、OPG和RANKL表达的调控作用是否还存在,以确定CORM-3的抑炎作用是否由其活性成分CO介导。
  (二)CORM-3对人牙周膜成纤维细胞HO-1表达的影响
  取新鲜拔除的恒牙,分离并培养原代牙周膜成纤维细胞,鉴定细胞来源后取状态良好的第4~6代细胞用于实验。以浓度为400μM CORM-3预处理细胞6小时后,分别提取细胞总RNA和总蛋白,以实时定量PCR和蛋白印迹实验的方法,从mRNA和蛋白水平检测HO-1的表达。用完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞6小时,分别提取细胞总RNA和总蛋白,以实时定量PCR和蛋白印迹实验的方法,从mRNA和蛋白水平检测HO-1的表达。探讨该作用是否由CORM-3的活性成分CO介导。
  常规培养细胞并以400μM的CORM-3预处理细胞6小时,以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁诱导致炎,24小时后分别提取细胞总RNA和总蛋白,以实时定量PCR和蛋白印迹实验的方法,从mRNA和蛋白水平检测HO-1的表达。用完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞6小时,以浓度为1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁诱导致炎,24小时后用上述方法检测HO-1的表达,以确定CORM增强HO-1表达作用是否由CO介导。
  (三)CORM-3抑制LPS和尼古丁诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子及破骨细胞因子表达的机制
  取新鲜拔除的恒牙,分离并培养原代牙周膜成纤维细胞,鉴定细胞来源后取状态良好的第4~6代细胞用于实验。研究CORM-3的抑炎作用是否由机体细胞保护机制HO-1通路介导。采用LIP03000用瞬时转染的方法将HO-1基因沉默,以浓度为400μM的CORM-3预处理人牙周膜成纤维细胞6小时,以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞24小时,分别提取RNA和总蛋白,以实时定量PCR和蛋白印迹法从基因和蛋白产物两方面检测HO-1、COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表达,研究在缺失HO-1通路的介导作用后,CORM-3对炎症细胞因子和破骨分化相关因子的调控作用是否存在。
  结果:
  第一部分 CORM-3对人牙周膜成纤维细胞的毒性、增殖的影响以及抑制炎症环境下细胞凋亡的作用
  成功分离培养原代人牙周膜成纤维细胞,鉴定为中胚层来源。CCK-8检测结果浓度为0~400μM的CORM-3刺激人牙周膜成纤维细胞24小时后,细胞的数量以及形态与正常对照组比较无明显差异,检测细胞活性示与对照组无明显差异,提示该浓度范围的CORM-3对人牙周膜成纤维细胞无明显毒性,而800μM的CORM-3对人HPDLF细胞则有明显毒性。以0、100、200、400μM的CORM-3刺激HPDLF细胞,分别于0,24,48,72,96小时用CCK-8法检测细胞活性,结果显示浓度为400μM的CORM-3对HPDLF细胞有较明显的促增殖作用。1μg/ml的LPS和5mM尼古丁可促进HPDLF细胞的凋亡,以工作浓度400μM的CORM-3预处理后,则可抑制炎症刺激引起的细胞凋亡。
  第二部分 CORM-3对人牙周膜成纤维细胞炎性因子及破骨细胞因子表达的影响及其作用机制
  (一)CORM-3对LPS和尼古丁诱导下的人牙周膜成纤维细胞炎症反应的调控作用
  以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞,炎性细胞因子COX-2、PGE2、RANKL的表达量较对照组均显著升高(P<0.05),且骨保护素OPG的表达受到明显抑制。以400μM CORM-3预处理细胞6小时,再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激细胞,其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表达较致炎组均显著降低(P<0.05),而OPG则有明显提高(P<0.05)。而完全释放掉CO的失活的CORM-3则无明显抑炎作用。证明CORM-3有抑制LPS和尼古丁诱导的HPDLF细胞炎症的作用而且该作用是由CORM-3溶于液体后释放出的CO介导而不是由其底物。
  (二)CORM-3对人牙周膜成纤维细胞HO-1表达的影响
  单独以浓度为400μM CORM-3预处理细胞6小时后,HO-1的mRNA和蛋白表达较对照组比较有显著提高(P<0.01);而完全释放掉CO的失活的CORM-3则无提高HO-1表达的作用,表明CORM-3有促进HPDLF细胞HO-1高表达的作用,而且该作用由CORM-3的活性成分CO介导的。
  以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞,HO-1的表达较对照组有所升高(P<0.05);以浓度为400μM的CORM-3预处理细胞6小时后,再以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激细胞,则HO-1的表达较对照组和致炎组均有显著升高(P<0.01);而完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理细胞则无提高HO-1表达的作用。提示1μg/ml LPS+5mM尼古丁的伤害性刺激能提高HO-1的表达量,而以400μM CORM-3预刺激后再致炎,则有更显著的促进HO-1高表达的作用。
  (三)CORM-3对LPS和尼古丁诱导下的人牙周膜成纤维细胞的抑炎作用的机制
  采用瞬时转染的方法将HO-1基因沉默后,以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激细胞,其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表达较对照组均显著升高(P<0.05),但骨保护素OPG的表达无明显改变;HO-1基因沉默后,以400μM CORM-3预处理细胞6小时,再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激细胞,其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表达较对照组显著升高(P<0.05),而且与致炎组比较无明显变化,虽OPG的表达无明显改变,但OPG/RANKL比值显著降低(P<0.05)。结果显示在HO-1通路缺失的情况下,CORM-3抑制炎性因子及破骨细胞因子表达的作用消失,提示我们CORM-3对LPS和尼古丁诱导下的HPDLF细胞的抑炎作用是通过HO-1通路介导的。
  结论:
  1.400μM CORM-3对人牙周膜成纤维细胞无明显毒性,且有促进增殖作用,400μM CORM-3抑制IPS和尼古丁诱导的HPDLF细胞凋亡。
  2.400μM CORM-3抑制脂多糖和尼古丁刺激下人牙周膜成纤维细胞炎性因子及破骨细胞因子表达。
  3.400μM CORM-3能显著增强人牙周膜成纤维细胞HO-1的表达。
  4.CORM-3抑制脂多糖和尼古丁刺激下人牙周膜成纤维细胞炎性因子及破骨细胞因子的表达是通过HO-1通路介导的。
[博士论文] 王频
生物化学与分子生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 MEF2D对DYRK1A的转录调控
  研究目的:
  研究DYRK1A不同异构体在神经胶质瘤细胞系中的特异性表达情况,以及MEF2D对DYRK1A不同异构体的转录调控,明确其分子调控机制,并进一步探索MEF2D对DYRK1A的调控作用与神经发育之间的关系。
  研究方法:
  1.在人脑胶质瘤T98G细胞系中研究转录因子MEF2D对DYRK1A基因不同异构体的转录调控。应用LipofectamineTM2000分别将MEF2D表达质粒pCMV6-entry-MEF2D及空白对照质粒转染入T98G细胞,48小时后将细胞收集起来,应用TRIzol法提取细胞中的RNA,并使用Takara PrimeScriptTM逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA,进一步通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内源性DYRK1A mRNA不同异构体的表达变化;应用SYBR Green法实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)法再次检测DYRK1A不同异构体的表达情况并进行分析。
  2.MEF2D对DYRK1A启动子活性调控。
  2.1 DYRK1A启动子质粒的构建:利用PCR技术从提取的人类基因组中扩增DYRK1A的启动子序列,并将其克隆到无启动子活性的pGL3-Basic载体中,或者启动子质粒pDYluc-long;
  2.2 MEF2D高表达及敲除siRNA效果检测。应用LipofectamineTM2000将MEF2D表达质粒及敲除siRNA分别与空白对照转染入T98G细胞,转染后48小时收集细胞并裂解,蛋白定量后应用Western Blot检测MEF2D以及DYRK1A的表达变化,β-ACTIN作为内参;
  2.3 应用LipofectamineTM2000将pCMV6-entry-MEF2D及空白对照质粒、MEF2D敲除siRNA及空白对照分别与pDYluc-long及pGL3-Basic质粒转染入HEK293细胞,48小时后裂解细胞并应用Luciferase Assay技术检测启动子活性。
  3.寻找并确认DYRK1A启动子功能性DY-MRE(MEF2D responsiveelement)位点。
  3.1 MEF2D结合位点预测:http://jaspar.genereg.net/网站中输入DYRK1A启动子区序列,预测MEF2D的可能结合位点;
  3.2 分别构建含有DYRK1A启动子不同区域截短体的荧光素酶载体,应用LipofectamineTM2000将pCMV6-entry-MEF2D及空白对照质粒分别与不同截短体载体及pGL3-Basic质粒共转染HEK293细胞,48小时候收集细胞并裂解,应用Luciferase Assay分析不同截短体在MEF2D作用下的启动子活性变化;
  3.3 构建包含预测DY-MRE的载体及对应的突变载体,转染HEK293细胞并通过Luciferase Assay再次确认MRE的活性。
  4.在动物模型中研究MEF2D与DYRK1A之间的关系。分别取胚胎期为13.5天(E13.5)、18天(E18)及出生后1、7、14天(P0,P7,P14)的多只小鼠的大脑皮层,应用TRIzol法提取组织中的RNA,进一步应用TakaraPrimeScriptTM反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,结合SYBR Green法实时荧光定量检测样本中MEF2D及总DYRK1A的mRNA表达情况。
  研究结果:
  1.MEF2D可以特异性上调DYRK1A的mRNA总量DYRK1A isoform5的表达量,对DYRK1A isoform2,3的mRNA表达量并无影响。T98G以及HEK293细胞中可以检测到DYRK1A isoform1和5以及MEF2D的蛋白表达。
  2.MEF2D通过增强DYRK1A isoform5的启动子活性上调DYRK1A mRNA的表达。
  2.1 MEF2D高表达后显著上调DYRK1A启动子活性;
  2.2 MEF2D被敲减后,DYRK1A启动子活性与对照相比显著降低。
  3.DYRK1A基因启动子上MEF2D功能性位点DY-MRE的确定。
  3.1 通过Jaspar网站对DYRK1A启动子区域序列进行分析,获得可能的MEF2D结合位点;
  3.2 双荧光素酶报告基因检测方法检测DYRK1A启动子不同区截短体质粒在MEF2D高表达时启动子活性的变化。结果发现包含-442~-254 bp位点的启动子活性可以被MEF2D上调,通过Jaspar序列分析发现,该区域包含一个可能的功能性MEF2D结合位点,位于-268~-254 bp;
  3.3 分别构建包含-268~-254 bp及对应突变的启动子载体,结合双荧光素酶报告基因检测方法证实该段区域启动子活性可被MEF2D特异性上调,关键碱基突变后,MEF2D对启动子活性的上调作用消失。
  4.DYRK1A与MEF2D在正常小鼠大脑神经发育过程中mRNA表达呈正相关性。当MEF2D表达较高时,DYRK1A表达水平也相应较高,而当MEF2D表达量较低时,DYRK1A的表达量随之降低,通过斯皮尔曼相关系数计算证实p=0.0478,r=0.6182。结果提示MEF2D与DYRK1A在大脑的神经发育过程中可能存在协同作用。
  研究结论:
  1.MEF2D可以特异性上调人DYRK1A isoform5的转录。
  2.人DYRK1A基因启动子活性可被MEF2D上调,-268~-254 bp处的DYMRE位点可与MEF2D特异性结合,激活DYRK1A的启动子活性。
  3.MEF2D与DYRK1A在正常小鼠的大脑皮层神经发育过程中,mRNA的表达量呈正相关性。
  4.在神经胶质瘤细胞系中,MEF2D通过特异性上调DYRK1A的表达降低NFATc2的蛋白表达量。
  第二部分 DYRK1A对MEF2D的磷酸化修饰及功能影响
  研究目的:
  研究双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶A(DYRK1A)对转录因子MEF2D的磷酸化修饰,探寻修饰位点及作用机制,明确MEF2D磷酸化修饰对其功能的影响。
  研究方法:
  1.在人胚肾HEK293细胞研究DYRK1A对MEF2D的磷酸化作用。应用LipofectamineTM2000将pCMV6-entry-MEF2D表达质粒分别与pCMV6-entry-DYRK1A表达质粒及空白对照质粒共转染入HEK293细胞,转染后48小时收集并裂解细胞,应用Western Blot检测MEF2D的表达情况。
  2.通过质谱检测,寻找并分析MEF2D蛋白被DYRK1A磷酸化的位点。
  2.1 构建MEF2D的原核表达载体。MEF2D表达序列全长521个氨基酸,将其克隆入pET32a(+)载体中,得到pET32a-MEF2D质粒,测序验证其正确表达;
  2.2 将构建好的pET32a-MEF2D转化入感受态BL21细胞中进行原核扩增,并应用适当浓度的IPTG过夜诱导,收集菌体并进行过Ni-NTA柱纯化;
  2.3 对纯化后的蛋白进行BCA法蛋白定量,并应用Western Blotting进行检测,验证其原核表达的正确性。
  3.DYRK1A对MEF2D蛋白转录活性的影响。
  3.1 将MEF2D特异性识别位点的多拷贝序列(MRE)插入pGL3-Basic载体中,构建p3×MRE载体;
  3.2 应用LipofectamineTM2000将DYRK1A表达载体、DYRK1A激酶失活载体DYRK1A(K188R)及空白对照分别与pGL3-Basic和p3×MRE载体转染入HEK293细胞中;
  3.3 转染48小时后收集样品进行Luciferase Assay检测,并分析检测结果。
  研究结果:
  1.DYRK1A过量表达可以显著升高外源MEF2D的表达水平,并使蛋白分子量发生改变,提示存在化学修饰。
  2.纯化MEF2D重组蛋白后进行体外磷酸化反应结合质谱分析结果显示,与空白对照相比,被DYRK1A处理过的MEF2D蛋白样品,位于251位的丝氨酸存在磷酸化修饰。
  3.Luciferase Assay结果显示,与pGL3-Basic相比,MEF2D可以显著性升高p3×MRE载体的活性,但DYRK1A会使p3×MRE的活性降低,而失去激酶活性的DYRK1A不会使p3×MRE的活性降低。
  4.被DYRK1A磷酸化的MEF2D,在NH4Cl的作用下,降解速率显著降低。
  研究结论:
  1.DYRK1A升高MEF2D的表达水平,并对MEF2D进行化学修饰。
  2.质谱检测结果提示DYRK1A可以使MEF2D被磷酸化,位点为251位丝氨酸。
  3.DYRK1A对MEF2D的磷酸化修饰使MEF2D的转录活性降低。
  4.DYRK1A对MEF2D的磷酸化修饰降低了MEF2D的降解速率。
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