绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 139142 条结果
[硕士论文] 乔君
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中的作用。
  方法:1.分别在SHR大鼠及其野生型对照WKY大鼠4、6、10、30周龄测量体重和血压;并采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1浓度;采用RT-PCR法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA表达水平;采用组织免疫化学染色法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平;采用Masson染色法检测肾脏纤维化水平。2.将SHR大鼠随机分为IL-6单克隆抗体阻断组(SHR-B组)和0.01M PBS对照组(SHR-C组),IL-6单克隆抗体阻断组大鼠腹腔注射IL-6单克隆抗体10μg/d,对照组大鼠腹腔注射等体积0.01M PBS,持续14d。分别于4、6、30周龄动态检测上述各项指标变化。
  结果:1.SHR大鼠体重低于同期WKY大鼠,10、30周龄时两者差异存在显著性(P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠收缩压显著高于WKY大鼠(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1亦显著高于同期WKY大鼠,两者相比具有差异性(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORg、TGF-β1mRNA表达水平均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与WKY大鼠相比,SHR大鼠肾脏纤维化程度明显升高,在10、30周龄两者差异具有显著性(P<0.05)。2.与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠收缩压在30周龄时显著降低(P<0.05);在6、30周龄时,与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠血浆中IL-17和TGF-β1均显著降低(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA相对表达均显著低于SHR-C大鼠(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值亦显著低于同期SHR-C组(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与SHR-C组大鼠相比,SHR-B组大鼠肾脏纤维化程度有所降低,在30周龄时两者差异具有显著性(P<0.05)。
  结论:IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中发挥重要作用;高血压形成初期,通过阻断IL-6-IL-17-CD13信号调控轴可以减轻或延缓高血压及肾脏损害进程。
[硕士论文] 樊莹莹
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:隐孢子虫(Cryptosporidium)和贾第虫(Giardia)是两种重要的人畜共患肠道原虫,它们通常是经过粪-口途径直接进入人或动物的宿主体内,伴随着卵囊的摄取,最终引起人和动物的隐孢子虫病和贾第虫病,并伴随着宿主的腹泻;最近的流行病学研究表明,在隐孢子虫病和贾第虫病中,人畜共患之间的传播起着重要的作用;牛,尤其是乳牛,是作为隐孢子虫病和贾第虫病在人和动物之间传播的重要来源。然而,在一些地区,例如中国湖北省,关于人和犊牛的隐孢子虫和贾第虫的流行病学的数据(比如优势虫种和基因型)却仍是一片空白。为此,本文针对这些问题开展了如下的研究:
  在第1章中,对这两种原生寄生虫的背景知识、关键的物种、生活史、传播途径、病原体的发病机制、诊断及其防控进行详细的介绍;并总结了已有的物种和基因型。通过对分子流行病学调查的总结,提供了对隐孢子虫和贾第虫病防控的研究方向。
  在第2章中,对湖北省武汉市腹泻儿童的隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查进行了首次报道。在2016年6月至2016年8月,对武汉市儿童医院和武汉大学人民医院门诊部的腹泻儿童新鲜粪便样品共计500份进行了隐孢子虫、贾第虫和微孢子虫的分子流行病学调查,基于SSU基因,tpi基因和ITS基因位点采用Nested-PCR方法对所有样品进行扩增,序列比对结果经遗传进化分析,鉴定出隐孢子虫为C.meleagridis,贾第虫为assemblage A型,微孢子虫的基因型为D型。值得一提的是,在隐孢子虫中,发现了C.meleagridis是该地区的优势虫种,而该虫种主要的宿主是在鸟类中,该发现也为后续对该地区人和鸟之间病原的传播研究奠定了基础。
  在第3章中,进一步对湖北省犊牛进行了隐孢子虫和贾第虫的分子流行病学调查。在2016年9月至2016年12月,对湖北省北部、东部和西部地区的5个奶牛场和1个肉牛场的1-12周龄的断奶前和断奶后的犊牛进行了采样,旨在探索隐孢子虫和贾第虫的优势虫种和基因型。共鉴定出3种隐孢子虫,分别为C.bovis,C.andersoni和C.ryanae;在贾第虫中,确立了贾第虫的assemblage E型;在该研究中,并针对人畜共患之间的传播问题进行了讨论。
  在第4章中,对目前所取得的成果进行了综合性的讨论,并提供了对未来研究的视角和方向;本论文对隐孢子虫和贾第虫在中国湖北省的分子流行病学的调查提供了数据参考;获得的数据提示我们,仍需开展更多的流行病学调查和采集更多的样品进行遗传多样性分析,以便更好的了解这些病原体在中国的传播。
[博士论文] 刘莹
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:近年来,埃博拉病毒(EBOV)导致的疫情对全世界人类的安全带来巨大威胁。2014年西非爆发的埃博拉疫情造成了大量死亡,引起了全世界的关注。由于没有针对EBOV的特定药物和治疗,因此,疫苗被认为是控制该流行病最有希望和最有效的方法,开发有效且安全的埃博拉疫苗对于公共安全十分重要。EBOV的糖蛋白GP是病毒粒子上唯一的表面蛋白,负责调节与宿主细胞的吸附和融合,因此成为埃博拉疫苗研究的主要目标蛋白。GP的基因通过基因编辑,不仅编码结构蛋白GP,还编码分泌型糖蛋白(sGP),且占GP基因编码产物的70%。
  目前,疫苗的接种方式主要为肌肉注射(M),使用该种免疫方式的疫苗多为溶液,需要在冷藏或冷冻的条件下保存以保持疫苗的稳定性。最近的几十年,微针(MN)作为一种新的疫苗接种技术被广泛应用与皮内免疫研究中。皮肤是人体最大的免疫器官,其真皮层富含大量的树突状细胞、朗格汉斯细胞等多种免疫细胞,且丰富表达这两种抗原递呈细胞受体,可与包括单核细胞、巨噬细胞在内的其他免疫活性细胞结合,这使得皮肤成为免疫的理想部位。
  本研究针对EBOV GP进行亚单位疫苗的研究。在对GP及sGP进行三维结构的预测和比对后,发现sGP与GP氨基酸序列相同部分形成的空间结构高度相似,因此sGP或可作为GP的替代物。使用牛痘病毒真核表达系统成功表达EBOV GP与sGP,作为亚单位疫苗,分别使用MN与IM进行免疫,评价抗体水平。研究结果表明,MN免疫EBOV GP后刺激产生的抗体水平更高,约是IM免疫产生抗体水平的2倍,其中MN免疫产生抗体的中和抗体效价为900,而IM免疫产生的中和抗体效价为300;此外,MN免疫产生的抗体维持的时间更长,加强免疫后16周,MN免疫产生的抗体水平下降约30%,同抗原使用IM免疫,抗体水平下降约60%。使用sGP作为GP的替代抗原研究中,MN免疫较IM免疫仍然能够刺激产生更高水平的抗体,但产生的中和抗体效价无明显区别。
  为了进一步提高EBOV GP及sGP的免疫原性,我们首次在疫苗配方中加入佐剂Matrix-M并使用MN免疫。研究结果表明,Matrix-M可以显著提高MN和IM免疫GP或sGP亚单位疫苗所诱导的抗体反应,中和抗体效价显著增高,IgG水平约是无佐剂组的5倍,且可以诱导IgG2a的产生,多元化IgG亚型,平衡IgG1/IgG2a的比例。对免疫后小鼠进行致死性EBOV的攻毒试验,结果显示,无论抗原为GP或sGP,免疫方式为MN或IM,Matrix-M作为抗原成分的加入均可对小鼠提供100%的保护率,且小鼠无明显体重下降和临床症状。在无佐剂加入的攻毒试验中,使用MN免疫GP亚单位疫苗后,可对感染致死性EBOV的小鼠提供80%的保护,而IM免疫组的5只小鼠中只有1只存活。综上所述,使用MN免疫GP亚单位疫苗能够有效保护EBOV感染,佐剂Matrix-M的加入,使sGP成为GP有效的替代抗原成为可能。本研究为埃博拉疫苗的开发提供了新的实验及理论基础。
[硕士论文] 伍享
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病,主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失,还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白,然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚,探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制,能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外,我国结核病的状况十分严峻,传统的检测方法已经不能满足临床需求,此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
  1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6,MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点,3×Flag,mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2,经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B,利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系,然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1,后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
  2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因,发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性,且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测,得到阳性结果,且靶定三个基因(IS6110,CFP10,GryB)时,提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法,能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测,并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。
[硕士论文] 宋林栋
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
  本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。
  (1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
  将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
  (2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
  通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。
  (3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
  将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
  (4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
  使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
  本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
[博士论文] 张雅春
预防兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:狂犬病是一种古老的人畜共患传染病,每年在世界各地造成超过59,000人死亡。其致病病原体狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)编码五种结构蛋白:核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和病毒RNA聚合酶(L)。RABV进入机体后,沿外周神经系统迅速移动,最终到达中枢神经系统(Central nervous system,CNS)。一旦出现临床症状,狂犬病的死亡率接近100%。虽然狂犬病死亡率高,但是人类和动物可以通过接种疫苗来预防狂犬病,疫苗能够激活免疫系统,产生抗体以中和病毒。自1885年以来,疫苗接种已成为保护人类免于狂犬病危害的最有效途径。全球每年有数百万人接种狂犬疫苗,约有25万人因接种疫苗得到保护。
  我们之前的研究表明,树突状细胞(Dendritic cell,DC)的激活可以增强RABV的免疫原性。当重组RABV过表达与DC成熟相关的细胞因子或趋化因子时能够达到增强DC活化的目的。然而,这些细胞因子或趋化因子的过度表达可能会产生副作用。因此,需要进一步研究通过仅增加rRABV与DC的结合来增强RABV免疫原性。在本研究中,构建了融合表达DC靶向小肽(DCBp)或阴性对照肽(DCCp)的重组狂犬病病毒(Recombinant rabies virus,rRABV),并成功拯救获得重组病毒rLBNSE-DCBp和rLBNSE-DCCp。BSR和NA细胞上的多步生长曲线显示,DCBp或DCCp插入G蛋白后不影响病毒在体外复制,且Western印迹检测显示DCBp或DCCp的插入也不影响G蛋白表达。此外,颅内(i.c.)接种途径感染rRABV的后小鼠体重变化显示DCBp或DCCp的表达并不影响病毒致病性。
  关于免疫原性,rLBNSE-DCBp在体内和体外都促进了DC成熟。实验结果显示rLBNSE-DCBp免疫的小鼠与rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫小鼠相比,可在腹股沟淋巴结中检测到更多的滤泡性辅助T细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)和生发中心B细胞(Germinal center B cells,GC B cells)细胞。此外,在rLBNSE-DCBp免疫的小鼠中,中和抗体的滴度也显著高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp免疫的小鼠,所以,LBNSE-DCBp免疫的小鼠在攻毒实验中表现出更高的存活率。此外,灭活的rLBNSE-DCBp仍能产生高水平的中和抗体,对小鼠的免疫保护率也高于rLBNSE或rLBNSE-DCCp。
  总之,rLBNSE-DCBp可以通过增强抗原与DC的结合促进DC成熟,进而增加腹股沟淋巴结中Tfh细胞和GC B细胞的数量,从而诱导产生高水平的中和抗体,最终更好地保护小鼠免受致死性强毒的攻击,这表明rLBNSE-DCBp具有被开发为安全有效的狂犬病疫苗的潜力。
[博士论文] 刘永相
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:固有免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线,宿主的模式识别受体能够对病原相关分子模式进行识别,进而激活固有免疫系统,最终释放干扰素和炎症因子等一系列细胞因子通过抗病毒或参与炎症反应等发挥作用。Ⅰ型干扰素可以通过JAK/STAT通路激活数以百计的干扰素刺激基因(ISGs)转录表达,从而发挥抗病毒作用。而病毒也进化出了许多对抗宿主抗病毒反应的策略,尤其是对抗宿主的固有免疫系统。因此研究固有抗病毒免疫和病毒对固有免疫系统的抑制,对于基础研究和临床应用都有很大的意义。
  猫杯状病毒(FCV)是杯状病毒科,水疮性病毒属(Vesivirus)成员,感染猫后可引起上呼吸道疾病和急性口腔炎溃疡,病情严重的,可引起感染猫的死亡。同病毒科的人诺如病毒是引起急性胃肠炎和腹泻最重要的病原之一。目前还没有对抗人诺如病毒的有效药物和疫苗,主要原因是一直以来人诺如病毒的体外培养技术都不成熟。此外杯状病毒与宿主免疫系统的相互作用研究相对较少,FCV体外培养技术比较成熟,是目前研究人诺如病毒最好的模式病毒之一,研究FCV与固有免疫系统的关系对整个杯状病毒科的研究都有很重要的意义。
  本研究首先应用蛋白质组学技术筛选FCV感染CRFK细胞前后的差异表达蛋白,共筛选到差异蛋白429个,其中229个蛋白表达量升高,有200个蛋白表达量降低;与固有免疫相关的蛋白有IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等,且这些蛋白表达量都发生了不同程度的下调;其中IFNAR1为Ⅰ型干扰素受体组分,IRF1为Ⅰ型干扰素信号通路重要调控分子,该发现为FCV抑制Ⅰ型干扰素通路研究奠定基础。
  其次,通过IFN-α抗病毒试验,发现IFN-α不能够抑制FCV复制,Western blot和流式细胞术结果表明FCV感染后下调了IFNAR1在细胞表面的表达量,qRT-PCR、半定量PCR和Northern blot结果表明FCV感染后IFNAR1的mRNA表达量减少,最终发现FCV非结构蛋白PP和p30可以抑制共转染质粒的表达,且PP和p30转染后可以使IFNAR1的mRNA表达量降低。
  此外,克隆了猫源IRF1(Fe-IRF1),瞬时转染Fe-IRF1后可以显著抑制FCV的复制。双荧光素酶试验结果表明Fe-IRF1通过激活Ⅰ型干扰素通路发挥抗病毒作用;Western blot结果表明FCV感染可以下调IRF1蛋白表达量;qRT-PCR结果表明FCV感染可以下调IRF1的mRNA表达量。
  总之,本研究应用差异蛋白质组学方法,筛选到FCV感染后下调表达的固有免疫相关蛋白IFNAR1、IRF1、IRF9、IFI35、IFIT3、PKR和ISG15等;FCV感染后可以通过下调IFNAR1的mRNA表达,阻断Ⅰ型干扰素通路发挥作用,FCV感染后同时可以下调IRF1的mRNA水平,抑制Ⅰ型干扰素通路发挥作用。最终FCV可以通过两种方式抑制Ⅰ型干扰素信号通路的抗病毒作用。
[博士论文] 程艳洁
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20-23个核苷酸之间的、基因组编码的、进化保守的非蛋白编码RNA,通过靶向mRNA的3'UTR影响靶基因的表达,进而发挥重要的调控作用。近年来,大量的研究结果显示,miRNAs在肝脏的生理病理进程中均发挥重要作用。研究结果显示:PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性;miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。主要成果如下:
  1、PPARA诱导miR-181a2表达减轻自身过度激活引起的肝细胞毒性。
  某些增塑剂、降血脂药、农用化学品和环境污染物等化合物均是过氧化物酶体增殖物(peroxisome proliferators,PPs)。适当剂量的PPs引起过氧化物酶体的数量和大小适度增加。但是,高剂量的PPs则会导致不同程度的有害作用。长期向小鼠和大鼠施用PPs会导致其肝肿大,并最终导致肝癌的发生。核受体过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PARA)被证明在这个过程中发挥重要作用。但是,生物体降低过量PPs产生的危害的生物适应性机制尚不清楚。
  研究发现:(1)高剂量PPARA激动剂诱导miR-181a2表达;(2)进一步研究发现,Hsa-miR-181a2启动子区域含有预测的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator responsive element,PPRE),且PPARA直接结合于该元件上;(3)高剂量PPARA激动剂引起ROS、DNA断裂、凋亡等细胞毒性;(4)外源表达miR-181a-5p显著降低PARA过度激活引起的细胞毒性。
  结论:miR-181a2和PPARA之间的反馈环路调节在PPARA被过度激活的情况下促进了生物系统的平衡。这一平衡机制的发现有助于建立更有意义的人体风险评估,并为药物的合理设计提供理论基础。
  2、miR-126-5p靶向GSK3B调节肝星形细胞上皮-间质转化。
  各种慢性肝脏损伤,包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝炎均能引起肝脏纤维化,肝纤维化往往导致肝功能受损,并最终导致肝功能衰竭。肝纤维化的一个典型特征是肌成纤维细胞产生的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的堆积。尽管肝纤维化在慢性疾病中引起明显的发病率和死亡率,但是关于对介导肝纤维化的特定分子的认识并不充分,这在一定程度上妨碍了抗纤维化治疗的设计。据报道,在转基因小鼠肝纤维化过程中肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)占肌成纤维细胞群总量的90%。一直以来,HSCs的激活被认为是肝纤维化过程中的核心事件。作为对传统机制的补充,近年来的研究成果显示,肝星形细胞的EMT在肝纤维化过程中发挥重要作用。在大鼠中,上调肝细胞核因子4a(Hepatocyte nuclear factor4a,HNF4α)可通过抑制激活的星形细胞EMT减轻肝纤维化。有研究报道,HSCs激活后,miR-126的表达发生极显著变化。但其在HSCs中的具体功能及作用机制则未见报道。
  在此,以人源的肝脏星形细胞LX2、肝细胞LO2和大鼠肝脏星形细胞系HSC-T6为主要细胞模型,获得主要研究结果如下:(1)外源表达miR-126-5p诱导了肝脏星形细胞的激活和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT);(2)EMT相关转录因子ZEB1的mRNA水平和蛋白水平在外源表达miR-126-5p后均显著升高;(3)进一步的研究显示,miR-126-5p直接靶向糖原合酶激酶3B(Glycogen synthase kinase-3,GSK3B的3'UTR抑制GSK3B的蛋白水平,并通过Wnt/B-catenin信号通路调控ZEB1的表达;(4)外源表达miR-126-5p和GSK3B抵消了单独表达miR-126-5p对EMT的促进作用。
  结论:miR-126-5p直接参与到肝星形细胞的激活和上皮-间质转化过程,证明了miR-126-5p通过直接靶向GSK3B,进而打开Wnt/B-catenin信号通路,这在诱导肝脏星形细胞的上皮-间质转化中发挥重要作用,提示miR-126-5p可能在将来作为一个抗纤维化的分子靶标。
[硕士论文] 吴欣瞳
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:内脏脂肪素,简称内脂素(Visfatin),是近年来新发现的一种参与机体炎症和免疫应答反应的脂肪细胞因子,它的发现推动了脂肪组织和炎症之间关系的研究,而炎症又可以引起细胞凋亡和自噬,所以内脂素可能直接或间接影响细胞凋亡和自噬反应。急性肺损伤(ALI)是全身炎症反应综合征表现在肺部的呼吸系统性疾病,经常被用作一种炎症模型。研究发现,在急性肺损伤动物模型中,肺泡灌洗液的内脂素水平升高,推测内脂素作为炎性介质可能参与肺部炎症的发生和发展,从而影响细胞凋亡和自噬。因此,本试验以昆明小鼠为研究对象,利用LPS构建的急性肺损伤模型,通过HE染色、TUNEL、透射电镜、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR和Western blot等技术方法研究内脂素对急性肺损伤肺部细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路的作用,以探讨内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路调节凋亡和自噬参与炎症反应,阐明内脂素在LPS介导的炎症反应中与肺内细胞凋亡和自噬之间的关系及作用机制。研究结果如下:
  1.内脂素对急性肺损伤肺组织结构的影响
  利用LPS诱导构建的急性肺损伤模型,取肺组织制作石蜡切片并进行HE染色。显微镜下观察:生理盐水对照组小鼠肺组织的结构完整,肺泡壁较薄,无炎性细胞浸润,肺泡内无肺泡液渗出;急性肺损伤造模组(LPS组)的肺组织损伤明显,肺组织结构遭到破坏,肺泡壁明显增厚,肺间质及肺泡有红细胞渗出,可见大量炎性细胞尤其是中性粒细胞浸润;LPS+Visfatin组与LPS组比较,小鼠肺组织损伤程度减轻,肺泡隔变薄,肺泡轻微充血,肺间质及肺泡出现轻微渗出,有少量的炎性细胞浸润。通过免疫组化检测血管内皮生长因子(VEGF),结果显示:生理盐水对照组,小鼠肺泡上皮细胞中,VEGF的表达很少;急性肺损伤造模组(LPS组),肺组织中,VEGF的表达明显增强,主要在肺泡上皮细胞、呼吸性细支气管上皮细胞、炎性细胞以及单核细胞;与LPS组相比,LPS+Visfatin组肺组织中VEGF的表达明显减少。上述结果表明:内脂素能够减轻LPS诱导的急性肺损伤肺部组织结构的病理变化。
  2.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞凋亡的影响
  采用TUNEL技术以及IPP软件进行研究并统计分析了不同组肺内的凋亡细胞。结果显示:凋亡细胞在小鼠的肺泡上皮细胞中分布居多,生理盐水对照组肺组织中凋亡细胞的数目较少;与对照组相比,LPS组肺组织内的凋亡细胞数量极显著增多(P<0.01);LPS+Visfatin组肺组织内的凋亡细胞数量与LPS组相比显著减少(P<0.05)。结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞凋亡,而内脂素能够抑制急性肺损伤引起的细胞凋亡。
  3.内脂素对急性肺损伤肺组织凋亡因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测Bcl-2基因家族中的促进细胞凋亡基因Bax、Bik和抑制细胞凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl的mRNA表达。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中的促凋亡因子Bax和Bik的mRNA表达呈现出极显著的升高(P<0.01),抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xl的mRNA表达显著升高(P<0.05);促凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比显著降低(P<0.05),而抗凋亡因子在LPS+Visfatin组中的表达与LPS组相比极显著升高(P<0.01)。WesternBlot检测凋亡相关因子p53和MLKL的蛋白在肺组织中的表达,结果表明:与对照组相比,LPS组中P53和MLKL的蛋白表达均明显增多。与LPS组相比,LPS+Visfatin组P53和MLKL的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:内脂素可以抑制促凋亡基因的表达,促进抗凋亡基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
  4.内脂素对急性肺损伤肺组织细胞自噬的影响
  通过透射电镜观察发现:生理盐水对照组中的自噬小体很少;与生理盐水对照组相比,LPS组的自噬小体明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组的自噬小体明显减少。采用免疫组织化学法检测自噬标志物LC3和Beclin1的定位表达,并结合IPP软件进行统计学分析,结果显示:肺组织中可见棕色阳性产物,LC3主要在细胞质中表达,并且肺泡隔的上皮细胞中居多;Beclin1主要在肺泡上皮细胞以及肺泡管结节状膨大部细胞中表达。与生理盐水对照组相比较,LPS组中LC3和Beclin1的表达极显著升高(P<0.01);与LPS组相比LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的表极显著降低(P<0.01)。以上结果提示:LPS诱导的急性肺损伤能够促进小鼠肺组织发生细胞自噬,而内脂素能够减少急性肺损伤引起的细胞自噬。
  5.内脂素对急性肺损伤肺组织自噬因子表达的影响
  采用q-PCR技术检测自噬因子LC3和Beclin1的mRNA表达。结果显示,生理盐水对照组中自噬因子mRNA表达较低,说明机体在正常情况下时,自噬的表达量较少;与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的mRNA表达均升高;与LPS组相比,LPS+Visfatin组中LC3和Beclin1的mRNA表达均降低。Western Blot检测LC3和Beclin1蛋白表达的结果显示:与对照组相比,LPS组中LC3和Beclin1的蛋白表达均明显增多;与LPS组相比,LPS+Visfatin组LC3和Beclin1的蛋白表达均呈现出减少趋势。以上结果提示:在急性肺损伤中,细胞自噬的表达增强,协助细胞凋亡,而内脂素可以抑制细胞凋亡并使自噬的表达降低,从而减轻肺损伤的程度。
  6.内脂素对PI3K/AKT信号通路的影响
  利用Western Blot技术并结合ImageJ软件分别检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达,以验证内脂素是否通过PI3K/AKT信号通路参与急性肺损伤中细胞的凋亡和自噬。结果显示:与生理盐水对照组相比,LPS组中PI3K、AKT和p-AKT的表达均上调;与LPS组相比,LPS+Visfatin组PI3K和p-AKT的表达上调,AKT的表达下调。结果提示:内脂素能够激活PI3K/AKT信号通路,抑制肺细胞凋亡,降低自噬水平,产生肺的保护作用。
[博士论文] 代现良
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:高血压是一种多因素疾病,多种细胞或者细胞因子等都参与其发病进程。随着人口老龄化和生活方式的改变,高血压的发病率呈现增高的严峻态势,高血压已然成为全球性的重要公共卫生问题。由高血压带来的各种心脑血管疾病以及其相关的并发症则成为严重威胁世界人民群众身心健康,临床迫切需要解决的关键问题。既往研究已知炎症反应和免疫系统参与了高血压进程,而且已经得到的广泛认可。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种导致高血压和靶器官损害的主要介质和血管活性肽。另外,通过以往研究我们也已经明确,T淋巴细胞参与了炎症反应和免疫反应,并在高血压的病理进程中具有重要的调节作用。而胸腺作为一个十分重要的免疫器官,以及T细胞发育成熟的重要位点,虽然随着年龄增长,胸腺功能逐渐减退,但其依然具有一定的生理功能,可以继续促进新的T细胞的产生,尤其近来国内外很多研究揭示:通过调节相关转录因子FoxN1逆转胸腺衰老可奇迹般逆转小鼠的整体衰老,有牵一发而动全身的功效,这就激发了研究人员的无限遐想。
  既往有研究结果显示,高血压小鼠可能存在胸腺功能减退的情况。说明胸腺与高血压进展可能存在密切相关性,那么高血压本身的病理进程是否会导致胸腺功能减退加速衰老,以及其可能的相关的机制都不清楚,而通过逆转胸腺衰老则是否能够影响高血压进程亦尚不清楚。本研究通过血管紧张素Ⅱ诱导小鼠高血压模型,观察高血压小鼠胸腺功能的改变,随后通过胸腺移植等技术进行干预,观察上述操作对高血压进程及其靶器官的影响,并通过体外培养胸腺上皮细胞(TEC)探讨其中可能存在的机制,从而为临床治疗高血压提供新的诊疗方案和治疗靶点。
  方法:本研究动物实验共分为两个大部分,第一部分在体实验,将45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,随机分为正常对照组(Con组,n=15)、假手术组(Sham组,n=15)和AngⅡ诱导的高血压模型组(HTN组,n=15)。高血压模型组采用皮下植入装有AngⅡ溶液的微泵诱导而成,植入微泵后第三天开始每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续8周记录血压数据,处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、脾脏、心脏和肾脏等器官或组织。第二部分分为在体实验和体外实验,其中在体实验:45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,先被随机分为两组,正常对照组(Con组,n=15)和AngⅡ诱导的高血压模型组(n=30)。连续鼠尾无创测压4周后,明确建模成功后再将高血压模型组随机分为高血压组(HTN组,n=15)和移植组(HTN+Trans组,n=15)。分离出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺组织,将其切成小块移植至移植组小鼠另外一侧(与植入微泵相反一侧)的肾包膜下,移植后3天继续每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续5周记录血压数据,并应用心脏超声检测小鼠心脏功能,然后处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、心脏、脾脏和肾脏等器官或组织。流式细胞仪分析外周血和脾脏T细胞亚群的百分比,以及胸腺细胞皮质胸腺上皮细胞(cTEC)和髓质胸腺上皮细胞(mTEC)比值(cTEC/mTEC);实时定量PCR检测胸腺FoxN1、Aire、sjTREC和ATRAP表达水平;WesternBlot检测小鼠胸腺FoxN1、Aire和ATRAP的蛋白水平;以及对胸腺、脾脏、心脏和肾脏组织进行HE染色,并通过免疫组化方式检测胸腺FoxN1的水平;体外试验:将出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺在无菌条件下取出,然后进行胸腺上皮细胞(TEC)的培养,胸腺上皮细胞被分为空白对照组(即无刺激)、AngⅡ刺激48h组和AngⅡ刺激48h后与无刺激的TEC共培养组,然后取样以提取RNA和蛋白,检测FoxN1和ATRAP mRNA表达水平和蛋白水平。
  结果:
  1、HTN组收缩压(SBP)与舒张压(DBP)明显高于Con组和Sham组(p<0.05),Con组与Sham组血压没有差异,HTN+Trans组血压低于HTN组(p<0.05)略高于Con组(p>0.05)。在第一部分小鼠在体实验中,HTN组小鼠胸腺指数低于Con组和Sham组(p<0.05),Con组和Sham组无差异;在第二部分小鼠在体实验中,与Con组比较,HTN组小鼠胸腺指数明显下降(p<0.01),脾脏指数和肾脏指数升高(p<0.05),左室心脏比明显升高(p<0.01);与HTN组比较,HTN+Trans组小鼠胸腺指数明显升高(p<0.01),脾脏指数、肾脏指数和左室心脏比下降(p<0.05)i;HTN+Trans组小鼠左室心脏比高于Con组(p<0.05)。
  2、与Con组比较,HTN组LVEF、FS和SV均下降(p<0.05),ESV升高(p<0.05);HTN+Trans组LVEF、FS和SV高于HTN组,ESV低于HTN组(p<0.05),与Con组无差异。
  3、在第一部分中,与Con组小鼠相比较,HTN组小鼠胸腺衰老相关基因FoxN1和Aire的表达下调(P<0.05),HTN组小鼠sjTREC的含量亦下降(p<0.05),其余各组无明显统计学差异。在第二部分中,与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1、Aire、ATRAP和Thymosin beta4的表达下调(p<0.05),HTN组胸腺sjTREC的含量也减少(p<0.05),然而HTN组脾脏sjTREC的含量增加(p<0.05),余无统计学差异。
  4、流式分析结果显示,第一部分中HTN组小鼠外周血和脾脏TEM明显高于Con组和Sham组(p<0.05),HTN组小鼠脾脏na(i)ve T细胞低于Con组和Sham组(p<0.05),余无差异。第二部分中HTN组小鼠外周血和脾脏组织TEM明显高于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠外周血na(i)veT细胞低于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠cTEC/mTEC比值高于Con组,低于HTN+Trans组(p<0.05)。
  5、与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1和Aire,以及ATRAP的蛋白表达水平明显下调(p<0.01),其中与Con组比较,HTN+Trans组FoxN1的蛋白水平下降(p<0.05),余无差异。
  6、胸腺HE染色,结果显示,各组小鼠胸腺均出现不同程度的典型退化萎缩表现,其中高血压组小鼠出现胸腺上皮间室的典型退化萎缩最为严重,皮质和髓质区域之间的区别减少以及胸腺小岛数量减少,而高血压移植组,胸腺病理与正常对照组差异较小,胸腺退化程度较轻。肾脏HE染色,显示高血压组小鼠可见病变区域与正常组织区域界限明显,部分区域肾小管萎缩及间质发生纤维化,及以淋巴细胞及浆细胞为主的炎症细胞浸润;部分血管可见蛋白栓塞,个别肾小球萎缩,囊腔扩张,囊壁明显增厚。脾脏HE染色,显示Con组小鼠脾组织整体结构轻度异常,脾小结数量无轻度减少,个别脾小结萎缩,淋巴数量下降,小部分区域红髓白髓界限不清,但仍可见脾动脉,脾组织内可见大量中性粒细胞浸润;HTN组小鼠脾组织整体结构异常,组、织大部分区域结构紊乱,无正常脾小结结构,红髓白髓界限不清,可见多核巨噬细胞及中性粒细胞增多;HTN+Trans组小鼠脾组织整体结构异常,但与高血压组比较相对较轻,脾小结数量减少,且部分区域脾小结萎缩;部分区域红髓白髓界限不清,组织无明显炎症细胞浸润,淋巴数量减少。心脏HE染色,显示高血压组心肌肥厚,左室肥厚指数和左心室壁厚度增大以及纤维化增多等;HTN组主动脉壁增厚(p<0.05),Con组和HTN+Trans组之间无差异。
  7、免疫组化HTN组胸腺皮质和髓质区域之间的区别减少,FoxN1染色减少,HTN组小鼠胸腺FoxN1荧光累计光密度值明显下降(p<0.01),HTN+Trans组明显改善。
  8、体外实验结果显示,与无刺激的blank组、给予AngⅡ刺激和给予AngⅡ刺激后共培养组比较,给予1μmol/L的血管紧张素Ⅱ刺激后,FoxN1和ATRAP的mRNA表达水平以及其蛋白水平均下调(p<0.05),给予AngⅡ刺激后在共培养一段时间后的Co-culture组,与blank组无差异。
  结论:体外实验表明血管紧张素Ⅱ可以通过下调ATRAP的表达,进而下调胸腺FoxN1的表达,导致胸腺功能减退,共培养可改善其影响。在体实验结果显示AngⅡ诱导的高血压小鼠存在胸腺功能减退,包括FoxN1、Aire和ATRAP的mRNA表达的下调和蛋白水平的下降,以及反映胸腺近期输出功能减弱的sjTREC含量的下降,T细胞亚群百分比的失衡和胸腺素β4的下调,从而导致或者加重高血压进程。通过胸腺移植,提高胸腺FoxN1的表达,可明显改善小鼠心脏功能,恢复和抑制血压的升高。其可能存在的潜在机制为胸腺移植上调胸腺发育至关重要的转录因子FoxN1的表达,进而引起ATRAP的表达上调,从而反过来影响血管紧张素Ⅱ对胸腺功能的影响,以及引起胸腺素β4的升高和sjTREC含量的增加,并且能够恢复T细胞亚群的正常百分比,从而改善和抑制血压的升高。
[硕士论文] 陈凯
预防兽医学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可以感染几乎所有的温血动物,引起严重的弓形虫病症,造成新生儿流产、死胎等。弱毒活疫苗对控制弓形虫的传播有潜在价值,但报道甚少。MORN基因家族因参与速殖子细胞骨架的形成过程而发挥重要作用,是作为研制抗弓形虫弱毒活疫苗的理想候选基因。本研究的目的在于构建弓形虫MORN1与MORN2基因缺失株,阐明MORN基因家族成员的在弓形虫中的生物学功能,评价它们作为弱毒活疫苗的免疫保护力,探究其作为弱毒活疫苗的潜在价值。
  首先,为研究MORN2基因的生物学功能是否与弓形虫的毒力相关,我们利用CRISPR/Cas9技术,对弓形虫Ⅰ型RH虫株的MORN2基因进行了敲除。利用同源重组,在基因缺失处插入乙胺嘧啶药物抗性的片段DHFR。通过单克隆筛选以及PCR鉴定,成功获得MORN2基因缺失株。对该缺失株进行体外噬斑试验和体内毒力试验后,发现MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和对小鼠感染的毒力。因此我们认为MORN2基因的缺失不影响弓形虫RH虫株的毒力,其缺失株不具备成为弱毒疫苗的可能性。
  然后,为了研究△MORN1弱毒株作为弱毒疫苗的潜在可能性,我们又构建了△MORN1缺失株,评价了该缺失株对小鼠的毒力影响。进而以△MORN1缺失株腹腔接种昆明鼠,并在免疫后28d和70d检测相应的体液免疫和细胞免疫指标变化情况。在免疫70d后进行攻虫实验,对免疫的小鼠通过腹腔注射的方式,分别感染RH、PYS及TgC7三种不同虫株的速殖子103个(急性感染)或通过口服的万式感染PRU包囊20个(慢性感染),检测小鼠的存活时间和包囊减少率。结果表明,经△MORN1缺失株免疫的小鼠血清中抗体水平显著升高,脾细胞产生的细胞因子水平显著升高。在急性感染试验中,免疫鼠够较好地抵御RH、PYS及TgC7三种虫株的感染。在慢性感染试验中,对PRU包囊造成的慢性感染有较好的保护作用,能够有效减少小鼠脑中包囊数量。为了探究△MORN1缺失株对弓形虫垂直传播(先天性感染)的阻断效果,分别在母鼠怀孕第12天和第18天时,口服感染PRU虫株的包囊10个或者腹腔注射RH虫株速殖子200个,观察并记录仔鼠存活数和体重变化。结果显示经△MORN1缺失株免疫的母鼠能够明显地提高仔鼠的存活率及体重,同时减少仔鼠脑中包囊数量。△MORN1缺失株能够对小鼠的急性感染、慢性感染及先天性感染具有保护作用,因此有望成为防控弓形虫病的弱毒疫苗。
  综上所述,本研究通过构建弓形虫Ⅰ型RH虫株的△MORN1与△MORN2缺失株,阐明了MORN1与MORN2基因的生物学功能,进而研究了△MORN1作为弱毒疫苗的潜在价值,发现△MORN1缺失株是理想的弱毒疫苗,为弓形虫疫苗的研制与弓形虫防控奠定了基础。
[硕士论文] 张娴
急诊医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胃肠功能障碍对危重症患者的预后起着至关重要的作用。前期基础研究表明大黄,作为一种中药,能够有效保护胃肠道屏障功能,阻止肠道细菌移位,促进肠蠕动,但至今临床研究较少。本研究的目的在于探讨中药大黄对危重症患者胃肠功能障碍的疗效。
  方法:
  根据纳入及排除标准对2015年6月至2017年5月期间进入重症监护室(intensive care unit,ICU)的患者进行筛选,最终共有368位患者进入本次回顾性队列研究。再根据暴露因素(即胃肠功能障碍患者是否接受大黄治疗)将患者分为大黄组和常规治疗组。大黄组接受常规药物治疗+生大黄粉治疗,常规治疗组仅接受常规药物治疗。常规药物治疗方法包括促胃肠动力、抑制胃酸分泌、保护胃粘膜、抗感染、抗炎、保肝、维持循环稳定、维持水电解质平衡等。收集患者进入ICU24小时内及治疗7天后的临床资料,比较两组治疗效果。采用倾向性评分匹配法(propensity score matching,PSM)控制两组间的混杂偏倚。
  结果:
  根据是否使用大黄治疗,入选患者被分为大黄组(219例,59.51%)和常规治疗组(149例,40.49%)。
  基线特征:纳入时与常规治疗组相比,大黄组患者腹胀程度、急性胃肠损伤(Acute gastrointestinal injury,AGI)级别较高(重度腹胀:43.84%vs4.70%;AGIⅢ:43.84%vs4.70%,P<0.05),序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Assessment score,SOFA)评分、急性生理与慢性健康评分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)评分较低(SOFA评分:4.84±3.09vs6.44±3.45;APACHEⅡ评分:12.88±6.14vs14.98±5.77,P<0.05),甘油灌肠剂、米雅、促胃肠动力药使用比例较少(甘油灌肠剂:54.79%vs77.18%;米雅:35.16%vs48.32%;促胃肠动力药:17.35%vs32.21%,P<0.05),其余指标差异无统计学意义(P>0.05)。为控制两组间的混杂偏倚,采用倾向性评分匹配法,以大黄组为基准组进行匹配,最终68对匹配成功,共136例病例,匹配后两组患者基线特征无统计学差异。
  主要研究结果:匹配前大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为59.82%、39.60%,匹配后大黄组和常规治疗组喂养耐受率分别为77.94%、30.88%,大黄组喂养耐受率均较常规治疗组高,差异有统计学意义(P<0.05)。
  次要研究结果:匹配前后大黄组患者AGI分级改善率、肠鸣音改善率均较常规治疗组高(匹配前:AGI分级改善:75.34%vs29.53%,肠鸣音改善:90.41%vs72.48%;匹配后:AGI分级改善:76.47%vs33.82%,肠鸣音改善:91.18%vs64.71%,P<0.05),SOFA评分、APACHEⅡ评分、住ICU天数、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、内毒素均较常规治疗组低(匹配前:SOFA评分:4.23±3.57vs5.84±3.69,APACHEⅡ评分:11.92±6.55vs14.11±6.30,住ICU天数:12.00(9.00,18.00)vs14.00(9.50,21.00),CRP:23.21(9.00,52.97)vs47.08(24.00,92.86),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.11);匹配后:SOFA评分:4.54±3.61vs5.63±3.79,APACHEⅡ评分:12.56±6.03vs13.74±6.00,住ICU天数:12.00(9.00,18.50)vs13.00(9.50,20.50),CRP:25.39(12.03,67.71)vs53.48(28.19,100.25),内毒素:0.06(0.04,0.10)vs0.07(0.05,0.10),P<0.05),差异有统计学意义。28天死亡率在匹配前后两组患者间差异无统计学意义(匹配前:22.37%vs22.15%;匹配后:30.88%vs23.53%,P>0.05)。两组患者均未发现严重不良反应。
  结论:
  中药大黄能够有效提高危重症患者肠内营养耐受性,缓解胃肠功能障碍,且无严重不良反应,为临床实践中应用大黄治疗胃肠功能障碍提供了循证医学证据。
[博士论文] 刘淦
病理学与病理生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着物质生活水平的提高,代谢综合征如非酒精性脂肪肝、糖尿病、高脂血症、动脉粥样硬化等在人群中普遍流行。流行病学统计显示,在人群中非酒精性脂肪肝呈高发趋势,平均每100个人中就有20~30个人肝脏发生不同程度的脂肪变性。非酒精性脂肪肝不仅与肝纤维化、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的进展密切相关;临床研究指出,非酒精性脂肪肝的进展,与高血压、高脂血症、糖尿病、动脉粥样硬化等的发生、发展呈正相关。
  肝脏作为脂代谢的重要器官,参与全身脂质稳态的调控。考虑到非酒精性脂肪肝在人群中的流行度,以及其与代谢综合征间的相关性,对非酒精性脂肪肝发病机制的研究,迫切而有意义。研究发现,肝脏脂质从头合成速率增加会导致非酒精性脂肪肝。而转录因子ChREBP通过调控糖酵解、脂质从头合成相关代谢酶,调节肝脏脂质从头合成速率。近年来,ChREBP的功能研究逐渐成为热点,然而什么因子参与调控ChREBP活性及其调控ChREBP的分子机制,仍有待进一步明确。
  同时,肝脏通过脂质分泌、脂质摄取和血脂清除三个途径,参与血浆脂质稳态的维持。血浆脂质代谢异常导致的血脂紊乱,与一系列代谢综合征如动脉粥样硬化等密切相关。血浆脂质代谢是个多器官、多环节的复杂过程,其中“血浆脂质清除过程”作为中心代谢环节,受到广泛关注。而血浆载脂蛋白脂肪酶LPL作为血脂清除代谢的关键酶,被广泛地研究。对于LPL的结构、代谢模式以及LPL在其高表达组织如脂肪组织、心脏等的功能在过去几十年中已经相继被揭示,然而对于LPL在其低表达组织,如肝脏LPL的功能及代谢意义,相关的研究仍旧很少。
  我们实验室长期致力于锌指蛋白ZBTB20在发育、代谢中的功能研究。实验室前期对Alb-Cre介导的肝脏ZBTB20敲除(LZB20KO)小鼠的研究发现,敲除小鼠具有低肝脏甘油三酯、低血脂等表型;且肝脏脂质从头合成速率下降、肝脏脂质分泌能力减弱;相应的靶基因分析发现,肝脏ChREBP及下游脂质从头合成相关代谢基因低表达,高度提示ZBTB20可能通过ChREBP介导的信号通路参与脂代谢稳态的调控。本研究课题通过在LZB20KO小鼠中探究ZBTB20调控肝脏、血脂代谢的分子机制;并通过构建、分析Mx1-Cre介导的肝脏ZBTB20成年诱导敲除小鼠脂代谢表型,来验证ZBTB20在维持成年小鼠脂代谢稳态过程中所发挥的作用。我的研究主要包括以下三个部分:
  一、ZBTB20通过ChREBP调控肝脏脂质从头合成代谢:前期的研究结果提示,ZBTB20对机体脂代谢稳态的调控作用很可能与ChREBP相关。通过腺病毒介导的回补实验,发现在不存在ChREBP时,ZBTB20过表达不能上调脂质从头合成相关基因的表达;而不存在ZBTB20时,ChREBP的过表达能够上调DNL相关基因的表达;同时,ChREBP的过表达能够完全回补肝脏甘油三酯下降的表型,仅能部分回补血浆甘油三酯下降的表型;这些结果提示ZBTB20通过ChREBP介导的代谢通路调控肝脏甘油三酯代谢,存在非ChREBP信号通路来调控血脂代谢。同时,ChIP和Luciferase结果提示ZBTB20能够结合并激活ChREBP-α启动子的转录,再由ChREBP-α进一步激活下游DNL相关靶基因的表达。
  二、ZBTB20对血脂清除的调节作用:血浆脂质清除是血脂代谢的中心环节,而LPL是血脂清除代谢的关键酶。在前期研究的基础上,系统性地验证了LZB20KO小鼠血脂代谢表型,发现LZB20KO小鼠血脂含量降低,而血浆脂质清除能力增强,主要是肝脏LPL特异性过表达,血浆LPL活性升高造成的;同时,免疫荧光检测发现肝脏LPL蛋白过表达。为了明确肝脏LPL高表达在LZB20KO小鼠中的代谢作用,构建了肝脏ZBTB20、LPL双基因敲除(LDKO)小鼠。研究发现双敲小鼠血浆甘油三酯水平与野生型小鼠相同,提示在LZB20KO中肝脏LPL高表达主要参与血浆甘油三酯代谢。为了明确ZBTB20对LPL的调控机制,进行了经典的转录调控研究,ChIP和EMSA实验结果提示ZBTB20能够直接结合肝脏LPL启动子;而Luciferase实验结果提示ZBTB20能够抑制LPL启动子的转录,提示ZBTB20直接结合并抑制肝脏LPL表达来调控血浆甘油三酯水平。
  三、肝脏ZBTB20参与成年脂质稳态的调控:为了排除发育对代谢表型的影响,构建了Mx1-Cre介导的肝脏ZBTB20成年诱导敲除小鼠模型(Al-ZB20KO)。在成年小鼠肝脏诱导敲除ZBTB20后,表型分析发现,该小鼠肝脏甘油三酯含量、血浆脂质含量下降;靶基因分析发现,肝脏脂质从头合成相关基因ChREBP及其下游靶基因包括Pklr、Fasn、Elovl6、Scd1等表达下降,肝脏LPL基因表达升高。表型与靶基因结果与LZB20KO小鼠一致,提示ZBTB20的确参与脂代谢稳态的调控。
  综上,我们提出了如下学术观点:ZBTB20参与全身脂质代谢稳态的调控;ZBTB20通过激活肝脏ChREBP转录来调控肝脏脂质从头合成代谢,从而影响非酒精性脂肪肝的发生发展;同时,ZBTB20通过抑制肝脏LPL转录来调控血浆甘油三酯清除代谢,从而影响高脂血症的发生发展。对ZBTB20调控脂代谢机制的深入研究,丰富了脂代谢相关知识,为临床治疗非酒精性脂肪肝、高脂血症等代谢性综合征提供新思路;同时ZBTB20有望成为临床治疗非酒精性脂肪肝,高脂血症的药物靶标。
[硕士论文] 孟欣
化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:肝硬化是肝脏疾病引起死亡的主要病症,而肝纤维化是肝硬化的重要过程。此过程可逆,通过治疗肝纤维化成为预防和治疗肝硬化的重要手段。肝纤维化的重要特征为细胞外基质的增殖与沉淀,主要来源是肝星状细胞活化增值及上皮细胞间质转型等形成肌成纤维细胞。α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白为肝星状细胞活化增值及上皮细胞间质转型的主要生物指标,可以通过检测两者的表达水平来检验肝纤维化的发生。木犀草素(Lut)作为一种天然黄酮类化合物可以有效降低肝组织中的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA水平,抑制肝星状细胞的活化和胶原的合成,有效缓解肝纤维化程度。近期研究发现核糖体蛋白S5(RPS5)可以通过抑制肝星状细胞的活化,参与苦参碱及其衍生物治疗肝纤维化的过程,推测RPS5为治疗肝纤维化的靶蛋白。然而Lut治疗肝纤维化机制是否也与RPS5有关目前尚不清楚。本课题组前期研究发现,体外表达His6-Tag-RPS5与Lut有一定的结合,但是结合位点尚不明确。
  本论文主要研究了RPS5在Lut治疗肝纤维化过程中的作用,并通过体外表达纯化RPS5及其突变体、研究它们与Lut的结合来探索Lut-RPS5的结合区域及结合位点,从分子结构角度初步探讨RPS5参与Lut抗纤维化的作用机制。首先采用RPS5siRNA(small interference RNA)干扰肝星状细胞内RPS5mRNA表达水平,通过RNA抽提、反转录PCR与荧光实时定量PCR(Real-time PCR)等方法检测出干扰RPS5表达后,α-SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平明显增加,而加入Lut则可反转这一现象,表明RPS5参与了Lut治疗肝纤维化的过程;然后通过克隆RPS5片段与pET-28a载体连接,构建重组质粒pET-28a-RPS5,转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,并对表达条件进行探索和优化,使RPS在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达,通过离子交换层析柱分离、复性,凝胶过滤柱纯化,得到纯度高达95%的RPS5蛋白;再利用DS3.5分子模拟软件模拟RPS5与Lut的结合,分析可能的结合区域及结合位点,通过表达、纯化可能结合位点的蛋白突变体,用OCTET、Biacore检测Lut与RPS5、蛋白突变体的结合常数,初步确定区域Ⅰ(MET76~LYS85、ARG159)和区域Ⅱ(ARG60~GLN65、ARG145)为可能的结合区域,其中Lys63、Arg81、Lys85、Lys193及Arg145为可能的结合位点。
  通过上述研究,我们从分子生物学方面表明核糖体RPS5蛋白参与了Lut治疗肝纤维化过程;构建了RPS5原核表达体系,得到纯度的RPS5蛋白;通过计算机模拟,结合蛋白质定点突变和OCTET、Biacore技术,初步确定了RPS5与木犀草素的可能结合区域和可能结合位点,这为进一步阐明Lut抗肝纤维化的作用机制,对以RPS5为靶分子、以Lut为母体,设计新型抗肝纤维化药物具有重要意义。
[博士论文] 安朝
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胸主动脉夹层(Thoracic aortic dissection,TAD)是一种死亡率极高的主动脉急症。TAD发生时,主动脉内膜出现破口,破口处血液流入并导致主动脉中层撕裂成真假两腔,因假腔内血液无法及时有效排出,血液在假腔内不断累积并最终导致假腔破裂,病人急性死亡。若不给予积极干预,TAD起病后的48小时内约有50%的患者死亡。一些遗传性疾病如马凡氏综合征、Ehlers-Danlos综合征等可以引起TAD,但只有大约10%的TAD为遗传性疾病引起。目前非遗传性TAD的具体发病机制仍未能阐明,并且对于TAD尚无有效的预防及药物治疗手段。因此,对TAD发病机制的研究有利于在此基础上探寻TAD的早期预防和药物治疗方法。
  已知主动脉壁中层是主动脉的主要功能结构,主动脉中层的功能异常是TAD发生的重要病理生理基础。主动脉中层的主要细胞成分是血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs),其存在收缩型与合成型两种表型。与收缩型相比,合成型VSMCs表现为更强的增殖、迁移能力以及高表达骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、细胞外基质蛋白如基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase2,MMP2)及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase9,MMP9),而收缩型VSMCs标志物α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)与平滑肌蛋白22α(Smooth muscle22α,SM22α)的表达水平则显著下降。生理情况下主动脉内VSMCs主要以收缩型存在,维持主动脉的正常功能。多项研究已经表明VSMCs由收缩型向合成型的表型转化参与了TAD的发生,在TAD的病理生理过程中有重要作用。然而,目前对于TAD中VSMCs表型转化的具体机制仍然了解甚少。
  NANOG是一种在维持胚胎干细胞增殖及全能性方面有重要作用同源域蛋白。在胚胎干细胞中,NANOG的持续表达可以维持其自我更新潜能及去分化状态。相对的,NANOG的低表达可以引起胚胎干细胞分化。VSMCs由收缩型向合成型转化被认为是一种去分化过程,故NANOG在干细胞中的功能高度提示其可能与VSMCs的表型转化相关。但NANOG在TAD中VSMCs表型转化中的作用尚未见有报道。
  OPN蛋白高表达于TAD组织及合成型VSMCs。目前研究表明OPN直接促进了VSMCs由收缩型向合成型的转化,高表达的OPN能够增强VSMCs的增殖和迁移能力,上调VSMCs中合成型标志物MMP2的表达并下调收缩型标记物α-SMA的表达。同时,有研究报道在胚胎干细胞中OPN的表达受NANOG调控,这高度提示了NANOG可能通过调控OPN参与了TAD中VSMCs的表型转化。
  本研究的目的是通过组织学及分子生物学的方法探究NANOG对TAD中VSMCs表型转化的调控作用及其机制。
  方法:
  (一)TAD标本的收集与VSMCs的分离
  1.主动脉临床标本的收集:TAD组主动脉组织来自20例接受手术修复的TAD患者;正常对照组主动脉组织来自10例未患有主动脉及血管相关疾病的捐献者。2.VSMCs的分离与培养:原代VSMCs分离自TAD组以及对照组来源标本。标本离体经去除内外膜后剪切为约4mm2大小组织块,接种于24孔板,每孔加入200μl含有生长添加剂的M231培养基后经贴壁培养取得原代VSMCs。原代VSMCs生长至融合时进行传代,组织块则转移至新的孔板中继续分离细胞。
  (二)NANOG对VSMCs表型转化的调控作用及机制
  1.腺病毒转染:VSMCs生长至汇合率约70%时,取半量培养基根据MOI加入适量体积的腺病毒制成感染培养基,加入感染培养基37℃下孵育2小时后补足培养基,孵育过夜后更换至不含病毒培养基,24小时后荧光显微镜下观察转染效果。2.siRNA转染:根据Lipofectamine2000脂质体转染试剂的操作手册进行siRNA转染。3.免疫组织化学:主动脉组织经10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋后切片,组织切片经脱蜡、抗原修复、抑制内源性过氧化物酶、封闭、孵育一抗及二抗后采用DAB显色液显色。4.qRT-PCR与Western blot:qRT-PCR用于检测样本中目的基因mRNA表达水平,Western blot用于检测样本中目的蛋白表达水平。5.细胞增殖实验:采用CCK8法检测VSMCs增殖水平。6.划痕实验:划痕实验用于检测细胞的水平方向迁移能力。7.Transwell迁移实验:Transwell迁移实验用于检测细胞的垂直方向趋化迁移能力。8.AnnexinⅤ/PI双标记流式细胞凋亡实验:紫外线照射(10J/m2)被用于诱导VSMCs凋亡,细胞经AnnexinⅤ/PI双标记后通过流式细胞术定量分析凋亡细胞的比例。9.TUNEL细胞凋亡实验:VSMCs经4%多聚甲醛固定、透膜后加入生物素标记的dUTP与脱氧核糖核苷酸末端转移酶孵育,最后经荧光染色后荧光显微镜下检测凋亡细胞比例。10.免疫荧光:VSMCs经75%乙醇水溶液固定后,经透膜、封闭、一抗及二抗孵育、染核后荧光显微镜下观察。11.染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP):根据EpiQuik ChIP试剂盒中的操作手册所提供的步骤进行ChIP实验。
  (三)实验数据的统计分析
  数据采用非配对Student t检验。统计学分析均在SPSS中完成。数据以均数±标准差的形式呈现。P小于0.05认为在统计学上存在显著性差异。
  结果:
  (一)TAD来源的主动脉组织及VSMCs中高表达NANOG,同时伴随有VSMCs表型转化
  qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学的结果显示TAD主动脉组织中NANOG的mRNA及蛋白水平均显著上调,同时伴随着VSMCs合成型标志物OPN与MMP2的表达上调及收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达下调。进一步对VSMCs的检测在细胞水平上验证了上述发现,细胞免疫荧光结果显示TAD来源VSMCs中高表达的NANOG主要分布于细胞核,同时伴随着胞浆中OPN的表达升高与SM22α的表达降低。本部分的结果说明NANOG可能参与调控了TAD中VSMCs表型转化。
  (二)NANOG促进了VSMCs由收缩型向合成型的表型转化
  VSMCs中过表达NANOG上调了VSMCs合成型标志物OPN与MMP2的表达并下调了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达。同时,CCK8增殖实验结果显示过表达NANOG增强了VSMCs的增殖能力。划痕实验与Transwell迁移实验结果显示过表达NANOG增强了VSMCs在水平方向和垂直方向的迁移能力。流式细胞凋亡实验结果表明NANOG的过表达增强了VSMCs的抗凋亡能力。TUNEL实验的结果验证了流式细胞凋亡实验的结果,NANOG过表达组的VSMCs凋亡比例较对照组显著下降。进一步的研究结果显示在TAD来源的VSMCs中干扰敲低NANOG的表达上调了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达同时下调了合成型标志物OPN与MMP2的表达。本部分的结果说明高表达的NANOG可以调控VSMCs由收缩型向合成型转化,并且这一功能可能是通过OPN实现。
  (三)NANOG通过直接上调OPN的表达促进了VSMCs由收缩型向合成型转化
  ChIP实验结果显示NANOG可以直接结合至OPN基因的启动子区域。在进一步的拯救实验中,在过表达NANOG的VSMCs中敲低OPN引起了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达上调,同时合成型标志物MMP2的表达水平下调。CCK8增殖实验、划痕实验、Transwell迁移实验、流式凋亡实验及TUNEL实验的结果显示敲低OPN阻止了过表达NANOG引起的VSMCs增殖、迁移及抗凋亡能力增强。本部分的结果说明NANOG通过直接上调OPN的表达促进了TAD中VSMCs的表型转化。
  结论:
  我们的研究结果说明NANOG高表达于TAD患者的主动脉组织及VSMCs,高表达的NANOG通过直接上调OPN的表达促进了VSMCs由收缩型向合成型转化。
[硕士论文] 王灵
流行病与卫生统计学;流行病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:肾综合征出血热是一种自然疫源性疾病,其发病后的主要临床表现为发热、背部疼痛、头痛、低血压、凝血功能紊乱和急性肾损伤,该疾病由汉坦病毒感染引起。肾综合征出血热的具体临床过程可以分为五期,即发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期。在部分病情较重的患者临床表现中,不同的时期可以相互重叠,而在部分病情较轻的患者临床表现中,某些时期则不会表现出来。肾综合征出血热患病人群中以农民占据绝大多数。同时,肾综合征出血热的暴发与流行受到季节的影响,通常在深秋至次年春季时高发。
  中国是肾综合征出血热的高发国家,在中国,肾综合征出血热被归为乙类传染病,并被认为能够对公众卫生健康造成巨大的危害。青岛市是中国境内肾综合征出血热的高发地区,根据青岛市卫生监测数据,自1974年至2015年,青岛市共报道有肾综合征出血热患者14516人,因该病死亡的人数为700人。自2007年起,青岛市疾病预防控制中心便对青岛市内发生的肾综合征出血热疫情进行监控。在疫区,卫生工作者通过患者临床表现和快速诊断试剂诊断肾综合征出血热。自2009年五月起,青岛市给五个农村地区(胶南市、平度市、胶州市、即墨市和莱西市)中的16-60岁人群提供疫苗来控制疫情的发展。因此,针对青岛市当地的肾综合征出血热流行趋势进行研究可以帮助更好的了解当地肾综合征出血热的疾病流行特点,为该疾病的预防和治疗提供指导。
  目的:明确青岛市当地的肾综合征出血热的时间、空间和人群分布特征,了解当地汉坦病毒动物宿主的繁殖规律,评判当地汉坦病毒疫苗接种措施的有效程度,探索青岛市气象因素、动物宿主因素与肾综合征出血热发病之间的相关关系,寻找汉坦病毒传播的新媒介,了解当地汉坦病毒的病毒亚型分类。
  方法:收集2007-2015年青岛市肾综合征出血热发病和死亡资料、2009-2015年青岛市农村地区汉坦病毒疫苗接种资料以及2011-2015年青岛市农村地区动物宿主捕获资料。于2016年在青岛市当地进行流行病学现场调查,收集动物宿主样本和寄生虫样本。提取肾综合征出血热患者血清、动物宿主肺部组织和螨虫等寄生虫内的RNA,对其进行Sanger测序,并将所得序列使用MEGA5.05软件进行分析。
  结果:2007-2015年间青岛市肾综合征出血热共发病1846人,死亡41人,该病的平均发病率为2.45/105。肾综合征出血热发病人群的平均年龄为46.5岁,发病人群中男性占据绝大多数(74.65%),共1378人;在职业分布上,发病人群中大多数为农民(83.37%),共1539人。在地区分布上,青岛市农村地区发病人数最多,共1728人,其次为城乡结合部,共84人,城市地区发病最少,共34人。
  2011-2015年间,青岛市农村地区共捕获动物宿主4081只,动物宿主种类包括黑线姬鼠、褐家鼠、小家鼠、黑家鼠、鼩鼱、仓鼠和黑线仓鼠。在室外捕获的动物宿主主要为黑线姬鼠、褐家鼠和仓鼠,占全部室外捕获动物宿主的73.44%;在室内捕获得动物宿主主要为褐家鼠和小家鼠,占全部室内捕获动物宿主的88.14%。
  2009-2015年间,青岛市农村地区历年的疫苗接种率分别为3.68%、2.73%、1.43%、1.66%、0.02%、2.21%和0.83%。经Cochran-Armitage趋势检验来评估2009-2015年青岛市农村地区疫苗累积接种率和肾综合征出血热发病之间的关系,结果发现青岛市农村地区的疫苗接种情况并未能影响当地肾综合征出血热的发病率。
  通过构建广义相加模型来探索肾综合征出血热与气象因素之间的关系,发现滞后3个月的降雨量与肾综合征出血热的发病率呈正相关。如果滞后3个月的温度在6.0℃到23.7℃之间,温度对肾综合征出血热发病率呈负效应(即该温度区间会减低肾综合征出血热发病风险);如果滞后3个月的温度高于23.7℃或者低于6.0℃,温度对肾综合征出血热发病率呈正效应(即该温度区间会增加肾综合征出血热发病风险)。如果滞后3个月的相对湿度在67.5%到85.7%之间,相对湿度对肾综合征出血热的发病率呈负效应(即该相对湿度区间会减低肾综合征出血热发病风险);如果滞后3个月的相对湿度大于85.7%或者小于67.5%,相对湿度对肾综合征出血热发病率呈正效应(即该相对湿度区间会增加肾综合征出血热发病风险)。考虑到青岛市动物宿主密度和汉坦病毒阳性动物宿主密度与肾综合征出血热患者发病率之间有着密切的关系,因此青岛市当地气象因素对肾综合征出血热流行趋势的作用可能是通过影响当地动物宿主密度和汉坦病毒阳性动物宿主密度来发挥作用的。
  最后,从肾综合征出血热患者、动物宿主肺组织和螨虫体内提取到了汉坦病毒的RNA,通过进化树分析汉坦病毒L片段,发现从螨虫提取的汉坦病毒序列与部分动物宿主体内的汉坦病毒序列相一致。值得注意的是,在青岛市肾综合征出血热患者、动物宿主和寄生虫体内提取到的汉滩病毒在进化树上距离较近,能够独立成簇,而小家鼠和褐家鼠体内提取的汉城病毒也能够独立成簇。
  结论:肾综合征出血热在青岛市农村地区(胶南市、胶州市、平度市、莱西市和即墨市)流行,并且每年在第四季度发病率达到高峰。黑线姬鼠、褐家鼠和小家鼠等啮齿类动物是汉坦病毒在当地的主要动物宿主。通过构建的广义相加模型,可以根据青岛市气象因素来预测肾综合征出血热在当地的发病趋势,同时根据动物宿主与肾综合征出血热发病之间的密切关联,认为气象因素有可能通过影响动物宿主来改变当地肾综合征出血热的流行趋势。此外,本研究还发现革螨和恙螨在汉坦病毒的传播中能够发挥作用,可能是宿主动物-人群传播之间的媒介。
[硕士论文] 柴淑梅
兽医 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病,在我国日本血吸虫病流行区钉螺分布面积仍较大,部分流行区仍存在一定数量的血吸虫病传染源,血吸虫病流行与传播的客观因素以及疫情反复与回升的风险因素依然存在。目前唯一大规模使用的治疗药物吡喹酮不能解决重复感染的问题,新药和疫苗的研制仍是该病研究的重点。东方田鼠是迄今为止发现的唯一一种具有天然抗日本血吸虫病特性的哺乳动物,其抗病机制研究可为血吸虫防控技术研究提供新方向。
  本文应用胸主动脉灌注和组织培养法比较了东方田鼠和BALB/c鼠感染日本血吸虫尾蚴后1d,3d,8d,12d和15d的感染部位皮肤、肺脏和肝脏等处的童虫回收情况,结果两种宿主感染尾蚴后不同时间点虫体总回收率差异较大,东方田鼠为15.04%,7.05%,8.33%,0.48%,0.72%,均低于小鼠的39.24%,38.56%,46.17%,19.02%,43%。结果表明东方田鼠体内日本血吸虫童虫消亡主要发生感染后的皮肤期和肝期。表观病理观察表明,东方田鼠肝脏在感染后10d可见明显的白色异物性包囊,感染后14d该类包囊依然存在,至感染后21d异物性包囊消失,小鼠则始终未见该类异物性包囊出现。组织病理观察表明,东方田鼠感染后10-14d肝血管内可见寄生虫栓子,周围炎细胞浸润,形成嗜酸性脓肿,肝细胞多发灶性坏死,小鼠肝脏病变不明显。血常规分析结果表明,东方田鼠在感染后1-16d白细胞显著升高,白细胞5种分类结果显示主要是中性粒细胞升高。血清生化分析显示,血清白蛋白ALB、HDL-C在感染后升高。东方田鼠血清补体活性CH50为512U/mL,应用RT-PCR和ELISA检测了东方田鼠和BALB/c鼠的补体相关分子C3,C9,CD59和DAF的表达水平,结果小鼠各指标变化不明显,东方田鼠感染后8dC3,C9和CD59转录水平显著升高,DAF感染后12d转录水平显著升高。
  体外杀虫试验结果显示,东方田鼠正常血清和灭活补体血清孵育的日本血吸虫童虫死亡率分别为85.50%±7.15%和60.99%±8.61%,差异显著(p<0.001),扫描电镜观察到二者孵育的童虫体表完整性存在差异,表明东方田鼠补体对日本血吸虫童虫具有显著杀伤效果。利用C1qBP蛋白抑制东方田鼠C1q的血清孵育童虫死亡率显著低于正常血清(P<0.001),而用50℃热灭活东方田鼠血清补体B因子孵育的童虫死亡率没有显著变化,结果表明补体经典途径可能在东方田鼠对童虫杀伤中发挥了重要作用。在体内抑制试验中,注射CVF和PBS对照组的东方田鼠在感染后8d的虫体回收率分别为23.20%和8.54%,15d为1.18%和0.42%,结果表明利用CVF抑制补体后童虫回收率显著提高。
  筛选设计了3条东方田鼠C5基因特异的RNA干扰靶序列,构建了相应的重组RNA干扰慢病毒。LV2重组慢病毒在体外培养的东方田鼠腹腔巨噬细胞中诱导了C5基因转录下降25.76%,为进行东方田鼠RNA干扰活体试验提供了基础。
  综上所述,东方田鼠体内日本血吸虫童虫消亡主要发生感染后皮肤期和肝期,补体在抗感染中发挥了重要作用,经典途径是补体杀伤童虫的重要机制,研究结果为阐明东方田鼠补体抗日本血吸虫特性中的作用和机制提供数据。
[硕士论文] 洪萍
儿科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  了解目前国内先天性心脏病相关肺高压患儿的临床流行病学特征、治疗现状及预后转归。分析红细胞分布宽度、血尿酸在儿童先天性心脏病相关肺高压中的变化,探讨两者在病情评价中的作用。
  方法:
  采用回顾性分析,收集2009年1月至2016年12月收治本院的确诊先天性心脏病相关肺高压患者,收集临床基线资料、超声心动图数据、右心导管检查结果、实验室检查及住院治疗的相关资料,然后对先天性心脏病相关肺高压患者进行回顾分析。根据年龄分组,0-16岁归入儿童先天性心脏病相关肺高压组,并以同期收治的先天性心脏病无肺高压的患儿为对照组,对两组的临床资料进行比较,分析影响先天性心脏病患儿发生肺高压的危险因素及影响预后的因素。根据手术后肺动脉高压是否持续存在,分为术后肺高压组与术后无肺高压组,对两组资料进行多因素分析。分析红细胞分布宽度和血尿酸水平在先天性心脏病相关肺高压者中的变化,对红细胞分布宽度和血尿酸水平与肺动脉收缩压、肺动脉舒张压、肺动脉平均压进行相关性分析。
  结果:
  1、本研究共入选儿童CHD-PH70例。在儿童CHD-PH中,室间隔缺损为最常见类型(63%),其次为2种及以上的复合畸形类型(29%),依次为房间隔缺损(4%),动脉导管未闭(4%)。
  2、治疗措施中,本研究中外科手术治疗为主(72%),内科介入及靶向药物治疗所占比例低。
  3、CHD-PH组红细胞分布宽度、NYU PHFI评分、双向分流比例均高于对照组(P<0.05),肺高压组左心室射血分数明显低于对照组(P<0.05)。
  4、术后肺高压组手术年龄、肺动脉收缩压均高于对照组(P<0.05),多因素Logistic回归分析示,手术年龄为儿童CHD-PH患儿术后持续肺高压的危险因素(P<0.05)。
  5、先天性心脏病相关肺高压的死亡组患儿其红细胞分布宽度高于存活组(P<0.05)。红细胞分布宽度预测先天性心脏病相关肺高压儿童发生不良事件的结果显示ROC曲线下面积为0.729(95%CI:0.541-0.917),红细胞分布宽度以14.8%为截点获得较好的敏感度(0.67)与特异度(0.77)。
  6、儿童CHD-PH组尿酸值高于CHD组,但差异无统计学意义(P>0.05);在儿童CHD-PH中死亡组尿酸值高于存活组,但差异无统计学意义(P>0.05,血尿酸水平与肺动脉收缩压、肺动脉舒张压、肺动脉平均压均无相关(P>0.05)。
  结论:
  1、儿童先天性心脏病相关肺高压中最常见的心脏畸形为室间隔缺损,本研究中以外科手术为主要治疗手段,手术年龄是CHD-PH患儿术后持续肺高压的独立危险因素,早期手术治疗者肺动脉高压纠正机会更大,预后良好,建议对此类患者应早期诊断、及时纠正心脏畸形。
  2、红细胞分布宽度在肺高压组明显高于对照组,且在因肺高压死亡患儿组明显高于存活组,因此,红细胞分布宽度在一定程度可以提示先天性心脏病相关肺高压患儿不良预后。
  3、血尿酸与肺动脉压力无相关性,对儿童先天性心脏病相关性肺高压患儿病情无评价意义。
[博士论文] 徐庆国
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:乙型肝炎病毒感染(HBV)是全球范围内的主要公共健康问题之一,尤其是包括中国在内的发展中国家。虽然目前针对HBV的抗病毒治疗可以抑制HBV的复制,但仍不能彻底清除HBV。部分慢性乙型肝炎(CHB)患者发展成为进行性肝纤维化,并逐步导致了肝硬化,甚至是原发性肝细胞癌(简称肝癌)的发生。在中国,由于HBV感染的广泛性和抗病毒治疗的不规范性使得肝硬化和肝癌的发生比例较高。慢性HBV感染所导致的肝硬化和肝癌严重威胁着中国人民的生命健康,是中国十三五规划中需要着重解决的重大课题。
  HBVX基因(HBx)作为HBV四个开放阅读框之一,可以编码出分子量为17KD的HBx蛋白。大量的研究证实HBx蛋白在肝硬化和肝癌的发生发展过程中发挥了至关重要的作用,是尤为重要的病毒蛋白。由于HBV复制过程中不准确的逆转录和缺乏校对能力,HBx DNA存在多种变异。在前期研究中,通过测序技术在大队列的肝癌癌组织和癌旁组织中对HBx的基因型进行了调查,发现了一型携带多个位点共同变异的基因型,即HBx-EHBH2(HBx-E2)。预后分析表明携带HBx-E2的患者预后较好。此外,还初步研究了HBx-E2在肝癌细胞中的生物学功能。
  然而,HBx-E2在判断肝癌患者预后中的作用和在临床转化中的意义还需多中心的队列进行验证,而且HBx-E2在肝癌发生和发展中所发挥的功能,以及具体的分子机制仍需进一步探索。同时,HBx-E2与临床病理指标的相关性分析表明HBx-E2与肝硬化的缺失相关。所以,HBx-E2在肝硬化进程中是否也发挥了与其他基因型不同的作用,也需进一步研究。针对上述的科学问题,开展了本研究。
  第一部分HBx基因EHBH2基因型影响肝癌进程的分子机制
  研究目的:明确HBx-E2基因型在术前预测肝癌患者预后中的作用。确定HBx-E2在肝癌发生发展中的生物学功能及相关分子机制。
  研究方法:在不同地区的肝癌患者队列中检测HBx基因型,并对HBx-E2进行预后分析和临床病理指标相关性分析。构建多株表达多个HBx基因型的肝癌细胞系和肝细胞系,通过细胞计数试剂盒8(CCK8)、克隆形成、流式细胞术等实验明确HBx-E2对细胞增殖的影响。利用体外合成重组HBx蛋白和蛋白芯片筛选HBx-E2与野生型HBx蛋白结合蛋白的差异,并通过免疫共沉淀和激光共聚焦技术探索分子机制。
  研究结果:在不同地区的肝癌患者组织队列(n=171)的癌和癌旁中以及在血清队列(n=168)中,HBx-E2均与患者较好的预后相关。临床病理指标相关性分析表明HBx-E2与肝硬化缺失、肿瘤直径较小相关。按照HBx基因型分类和巴塞罗那肝癌临床(BCLC)分期在组织队列和血清队列分层进行预后分析,结果表明HBx-E2可以作为术前预测BCLC B期患者预后的分子标记物。体内外实验证明相对于其他基因型,HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力。蛋白芯片和免疫共沉淀等实验发现HBx-E2失去与JAK1结合的能力,而且不能激活STAT3和STAT5。JAK1的抑制剂Upadacitinib可以抑制除HBx-E2外其他基因型的增殖能力。
  研究结论:HBx-E2可以作为分子标记物术前预测BCLC B期患者预后。HBx-E2失去了促进肝癌细胞和肝细胞增殖的能力,不能激活JAK1/STATs通路。JAK1是HBV相关肝癌中某些HBx基因型患者的潜在治疗靶点。
[硕士论文] 邓捷文
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:树突状细胞(dendritic cells,DC)是由Steinman和Cohn在小鼠脾脏中所发现的一种具有树枝状突起的独特形态的细胞。DC是目前已知的最强的抗原提呈细胞,它是特异性免疫应答的触发者,因为它能够刺激初始型T细胞(na(i)ve T cell)活化和增殖,而M(Φ)、B细胞等只能触发已活化的T细胞或记忆性T细胞发生免疫应答。而且也有报道表明,活化的DC细胞能产生释放大量的炎症因子TNF-α和IL-6等。而大量炎性因子的释放促进全身炎症反应综合征的发生发展进一步诱导多器官功能衰竭。故对可调控DC功能的相关分子进行研究具有重要意义。
  同时,细胞凋亡与固有免疫的关系仍是目前研究的热点,凋亡相关分子对固有免疫的调节效应也逐渐被人们所关注。以往研究表明,作为TNFR和TNF家族重要成员的Fas和FasL分子是经典的凋亡诱导信号,但近年来的研究表明,Fas和FasL也可以分别传递信号,发挥不同于凋亡诱导的效应。FasL分子与Fas受体结合后,表达FasL分子的细胞其自身在FasL分子反向信号的作用下发生相应改变。相关的体内和体外实验也证明,FasL分子作为共刺激分子参与胸腺细胞成熟和成熟T细胞活化、增殖的过程,并且FasL分子,作为阳性选择的必需分子能够调节TCR与MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子的亲和力并提高胸腺细胞阳性选择的效能,但其发挥效应的具体机制尚不清楚。树突状细胞表面也表达FasL蛋白,但是FasL反向信号是否在DC中发挥效应仍有待进一步研究。
  之前的实验工作发现,活化性抗Fas抗体Jo-2不能有效诱导树突状细胞的凋亡,反而诱导DC表型和功能的成熟,并分泌释放细胞因子IL-1β和多种趋化因子。为了深入研究FasL反向信号在DC中的非凋亡效应,用Fas-Fc融合蛋白来模拟Fas分子的作用刺激野生型小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC),观察炎症因子的分泌、表型、吞噬能力以及抗原提呈能力的变化。初步实验表明BMDC在Fas-Fc的作用下IL-6和TNF-α分泌增加,且DC表面MHCⅡ和CD86的表达明显上调,CD80和CD40的表达轻微上调,且DC吞噬功能轻度减弱以及抗原提呈能力一定程度上有所提升。为进一步确认该现象,用FasLgld(FasL分子胞外段分子突变致胞外结合Fas功能缺失及胞内无法传递信号)小鼠进一步验证了FasL的反向信号对BMDC的效应,发现FasLgld小鼠来源的BMDC在Fas-Fc的作用下,TNF-α和IL-6的分泌减少,抗原提呈能力降低。为了进一步确认该现象,利用了FasLΔIntra小鼠(FasL分子胞外段能结合并触发Fas信号,但FasL分子胞内段突变不能有效激活下游信号通路),结果基本与FasLgld小鼠相一致。而且进一步研究发现,野生型小鼠来源的BMDC在某些MAPK通路抑制剂和Fas-Fc的共同作用下,TNF-α和IL-6的分泌减少,这说明FasL胞内信号促进DC分泌炎症因子,并且这一效应与MAPK通路相关,Western blot结果也进一步验证了这一现象。由于TNF-α和IL-6的分泌与多种疾病如自身免疫性疾病及感染性疾病相关,因此,研究FasL的反向信号对其分泌的影响及机制,将进一步加深人们对自身免疫疾病及炎症等疾病的发生发展的认识,为寻找这些疾病的治疗方案提供新思路。
  另一方面,知道FasL分子反向信号能诱导炎症因子的大量释放,而炎症因子的大量释放是系统性感染的重要特征。因此,想知道FasL反向信号在系统性感染过程中发挥怎样的效用。建立了真菌系统性感染模型,将一定量的白色念珠菌通过尾静脉分别注入WT、FasLgld、FasLΔIntra小鼠体内,结果发现FasLgld小鼠总体生存率提高,在感染48h后肝、肾真菌负荷量减少;同样地,FasLΔIntra小鼠对真菌感染也不敏感,其生存期明显延长,并且血清中的IL-6和TNF-α的释放显著降低,且感染48h后,FasLΔIntra小鼠肾脏的真菌负荷量显著减少。这一系列结果提示FasL反向信号的活化可能与真菌系统性感染导致的炎症损害及预后相关。已知重要的模式识别受体Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)和C型凝集素型受体(C-type lectin receptors,CLR)在识别细菌和真菌并诱导免疫反应的过程中发挥重要作用,而大量研究表明CLR能够结合大多数真菌细胞壁暴露的β-葡聚糖或甘露糖等配体分子,在抗真菌感染免疫中发挥主要作用。CLR,包括dectin-1,dectin-2,甘露糖受体,DC-SIGN和Mincle等在内能够识别结合真菌的多糖,诱导DC分泌TNFα、IL-1β、IL-6和IL-23以及趋化因子CCL2、CXCL1及CCL3。而之前的实验结果也表明FasL分子突变后的小鼠对于系统性真菌感染不敏感,炎症因子释放减少,这也提示FasL反向信号可能与CLR信号传导通路存在相互影响。为了验证DC的FasL效应在抗真菌感染反应中的作用,进一步研究DC中FasL与CLR的交互作用,通过体外培养WT、FasLΔIntra小鼠来源的BMDC,分别给予2μg/ml的zymd(dectin-1激活剂)、2μg/ml的mannan(dectin-2激活剂)刺激DC24h,结果发现FasLΔIntra来源的BMDCIL-6和TNF-α的分泌量显著降低;同样地,用Fas-Fc刺激WT和CLR缺陷小鼠(dectin-1-/-和dectin-2-/-小鼠)来源的BMDC,结果发现CLR缺陷小鼠IL-6、TNF-α因子分泌减少。这也进一步验证了FasL与CLR存在交互作用,但其分子机制有待进一步研究。
  综上所述,FasL分子反向信号通过多条经典的相关信号通路(如MAPK信号通路等)促进树突状细胞成熟活化并诱导炎症反应。而在急性系统性真菌感染过程中,FasL分子促进机体分泌大量炎症因子,在由败血症诱导的SIRS反应中发挥一定的效应。本研究进一步研究了FasL非凋亡效应及其机制,以期为真菌感染所致败血症的治疗提供新的理论基础。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部