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[硕士论文] 乔君
免疫学 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中的作用。
  方法:1.分别在SHR大鼠及其野生型对照WKY大鼠4、6、10、30周龄测量体重和血压;并采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1浓度;采用RT-PCR法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA表达水平;采用组织免疫化学染色法检测肾脏中IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ表达水平;采用Masson染色法检测肾脏纤维化水平。2.将SHR大鼠随机分为IL-6单克隆抗体阻断组(SHR-B组)和0.01M PBS对照组(SHR-C组),IL-6单克隆抗体阻断组大鼠腹腔注射IL-6单克隆抗体10μg/d,对照组大鼠腹腔注射等体积0.01M PBS,持续14d。分别于4、6、30周龄动态检测上述各项指标变化。
  结果:1.SHR大鼠体重低于同期WKY大鼠,10、30周龄时两者差异存在显著性(P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠收缩压显著高于WKY大鼠(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠血浆中IL-6、IL-17和TGF-β1亦显著高于同期WKY大鼠,两者相比具有差异性(皆P<0.05);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、CD4、RORg、TGF-β1mRNA表达水平均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);6、10、30周龄的SHR大鼠肾脏IL-6、IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值均显著高于同期WKY大鼠(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与WKY大鼠相比,SHR大鼠肾脏纤维化程度明显升高,在10、30周龄两者差异具有显著性(P<0.05)。2.与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠收缩压在30周龄时显著降低(P<0.05);在6、30周龄时,与SHR-C组相比,SHR-B组大鼠血浆中IL-17和TGF-β1均显著降低(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、CD4、RORγt、TGF-β1mRNA相对表达均显著低于SHR-C大鼠(P<0.05);在30周龄时,SHR-B组大鼠肾脏IL-17、CD13、TGF-β1、α-SMA和Collagen-Ⅰ免疫组化光密度平均值亦显著低于同期SHR-C组(P<0.05或P<0.01);Masson染色结果显示,与SHR-C组大鼠相比,SHR-B组大鼠肾脏纤维化程度有所降低,在30周龄时两者差异具有显著性(P<0.05)。
  结论:IL-6-IL-17-CD13信号调控轴在原发性高血压肾损害中发挥重要作用;高血压形成初期,通过阻断IL-6-IL-17-CD13信号调控轴可以减轻或延缓高血压及肾脏损害进程。
[博士论文] 代现良
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:高血压是一种多因素疾病,多种细胞或者细胞因子等都参与其发病进程。随着人口老龄化和生活方式的改变,高血压的发病率呈现增高的严峻态势,高血压已然成为全球性的重要公共卫生问题。由高血压带来的各种心脑血管疾病以及其相关的并发症则成为严重威胁世界人民群众身心健康,临床迫切需要解决的关键问题。既往研究已知炎症反应和免疫系统参与了高血压进程,而且已经得到的广泛认可。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种导致高血压和靶器官损害的主要介质和血管活性肽。另外,通过以往研究我们也已经明确,T淋巴细胞参与了炎症反应和免疫反应,并在高血压的病理进程中具有重要的调节作用。而胸腺作为一个十分重要的免疫器官,以及T细胞发育成熟的重要位点,虽然随着年龄增长,胸腺功能逐渐减退,但其依然具有一定的生理功能,可以继续促进新的T细胞的产生,尤其近来国内外很多研究揭示:通过调节相关转录因子FoxN1逆转胸腺衰老可奇迹般逆转小鼠的整体衰老,有牵一发而动全身的功效,这就激发了研究人员的无限遐想。
  既往有研究结果显示,高血压小鼠可能存在胸腺功能减退的情况。说明胸腺与高血压进展可能存在密切相关性,那么高血压本身的病理进程是否会导致胸腺功能减退加速衰老,以及其可能的相关的机制都不清楚,而通过逆转胸腺衰老则是否能够影响高血压进程亦尚不清楚。本研究通过血管紧张素Ⅱ诱导小鼠高血压模型,观察高血压小鼠胸腺功能的改变,随后通过胸腺移植等技术进行干预,观察上述操作对高血压进程及其靶器官的影响,并通过体外培养胸腺上皮细胞(TEC)探讨其中可能存在的机制,从而为临床治疗高血压提供新的诊疗方案和治疗靶点。
  方法:本研究动物实验共分为两个大部分,第一部分在体实验,将45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,随机分为正常对照组(Con组,n=15)、假手术组(Sham组,n=15)和AngⅡ诱导的高血压模型组(HTN组,n=15)。高血压模型组采用皮下植入装有AngⅡ溶液的微泵诱导而成,植入微泵后第三天开始每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续8周记录血压数据,处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、脾脏、心脏和肾脏等器官或组织。第二部分分为在体实验和体外实验,其中在体实验:45只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠,先被随机分为两组,正常对照组(Con组,n=15)和AngⅡ诱导的高血压模型组(n=30)。连续鼠尾无创测压4周后,明确建模成功后再将高血压模型组随机分为高血压组(HTN组,n=15)和移植组(HTN+Trans组,n=15)。分离出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺组织,将其切成小块移植至移植组小鼠另外一侧(与植入微泵相反一侧)的肾包膜下,移植后3天继续每天早上8:00-9:00之间不间断的进行鼠尾无创测压,持续5周记录血压数据,并应用心脏超声检测小鼠心脏功能,然后处死小鼠,并留取小鼠血样、胸腺、心脏、脾脏和肾脏等器官或组织。流式细胞仪分析外周血和脾脏T细胞亚群的百分比,以及胸腺细胞皮质胸腺上皮细胞(cTEC)和髓质胸腺上皮细胞(mTEC)比值(cTEC/mTEC);实时定量PCR检测胸腺FoxN1、Aire、sjTREC和ATRAP表达水平;WesternBlot检测小鼠胸腺FoxN1、Aire和ATRAP的蛋白水平;以及对胸腺、脾脏、心脏和肾脏组织进行HE染色,并通过免疫组化方式检测胸腺FoxN1的水平;体外试验:将出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺在无菌条件下取出,然后进行胸腺上皮细胞(TEC)的培养,胸腺上皮细胞被分为空白对照组(即无刺激)、AngⅡ刺激48h组和AngⅡ刺激48h后与无刺激的TEC共培养组,然后取样以提取RNA和蛋白,检测FoxN1和ATRAP mRNA表达水平和蛋白水平。
  结果:
  1、HTN组收缩压(SBP)与舒张压(DBP)明显高于Con组和Sham组(p<0.05),Con组与Sham组血压没有差异,HTN+Trans组血压低于HTN组(p<0.05)略高于Con组(p>0.05)。在第一部分小鼠在体实验中,HTN组小鼠胸腺指数低于Con组和Sham组(p<0.05),Con组和Sham组无差异;在第二部分小鼠在体实验中,与Con组比较,HTN组小鼠胸腺指数明显下降(p<0.01),脾脏指数和肾脏指数升高(p<0.05),左室心脏比明显升高(p<0.01);与HTN组比较,HTN+Trans组小鼠胸腺指数明显升高(p<0.01),脾脏指数、肾脏指数和左室心脏比下降(p<0.05)i;HTN+Trans组小鼠左室心脏比高于Con组(p<0.05)。
  2、与Con组比较,HTN组LVEF、FS和SV均下降(p<0.05),ESV升高(p<0.05);HTN+Trans组LVEF、FS和SV高于HTN组,ESV低于HTN组(p<0.05),与Con组无差异。
  3、在第一部分中,与Con组小鼠相比较,HTN组小鼠胸腺衰老相关基因FoxN1和Aire的表达下调(P<0.05),HTN组小鼠sjTREC的含量亦下降(p<0.05),其余各组无明显统计学差异。在第二部分中,与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1、Aire、ATRAP和Thymosin beta4的表达下调(p<0.05),HTN组胸腺sjTREC的含量也减少(p<0.05),然而HTN组脾脏sjTREC的含量增加(p<0.05),余无统计学差异。
  4、流式分析结果显示,第一部分中HTN组小鼠外周血和脾脏TEM明显高于Con组和Sham组(p<0.05),HTN组小鼠脾脏na(i)ve T细胞低于Con组和Sham组(p<0.05),余无差异。第二部分中HTN组小鼠外周血和脾脏组织TEM明显高于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠外周血na(i)veT细胞低于Con组和HTN+Trans组(p<0.05),HTN组小鼠cTEC/mTEC比值高于Con组,低于HTN+Trans组(p<0.05)。
  5、与Con组和HTN+Trans组比较,HTN组胸腺FoxN1和Aire,以及ATRAP的蛋白表达水平明显下调(p<0.01),其中与Con组比较,HTN+Trans组FoxN1的蛋白水平下降(p<0.05),余无差异。
  6、胸腺HE染色,结果显示,各组小鼠胸腺均出现不同程度的典型退化萎缩表现,其中高血压组小鼠出现胸腺上皮间室的典型退化萎缩最为严重,皮质和髓质区域之间的区别减少以及胸腺小岛数量减少,而高血压移植组,胸腺病理与正常对照组差异较小,胸腺退化程度较轻。肾脏HE染色,显示高血压组小鼠可见病变区域与正常组织区域界限明显,部分区域肾小管萎缩及间质发生纤维化,及以淋巴细胞及浆细胞为主的炎症细胞浸润;部分血管可见蛋白栓塞,个别肾小球萎缩,囊腔扩张,囊壁明显增厚。脾脏HE染色,显示Con组小鼠脾组织整体结构轻度异常,脾小结数量无轻度减少,个别脾小结萎缩,淋巴数量下降,小部分区域红髓白髓界限不清,但仍可见脾动脉,脾组织内可见大量中性粒细胞浸润;HTN组小鼠脾组织整体结构异常,组、织大部分区域结构紊乱,无正常脾小结结构,红髓白髓界限不清,可见多核巨噬细胞及中性粒细胞增多;HTN+Trans组小鼠脾组织整体结构异常,但与高血压组比较相对较轻,脾小结数量减少,且部分区域脾小结萎缩;部分区域红髓白髓界限不清,组织无明显炎症细胞浸润,淋巴数量减少。心脏HE染色,显示高血压组心肌肥厚,左室肥厚指数和左心室壁厚度增大以及纤维化增多等;HTN组主动脉壁增厚(p<0.05),Con组和HTN+Trans组之间无差异。
  7、免疫组化HTN组胸腺皮质和髓质区域之间的区别减少,FoxN1染色减少,HTN组小鼠胸腺FoxN1荧光累计光密度值明显下降(p<0.01),HTN+Trans组明显改善。
  8、体外实验结果显示,与无刺激的blank组、给予AngⅡ刺激和给予AngⅡ刺激后共培养组比较,给予1μmol/L的血管紧张素Ⅱ刺激后,FoxN1和ATRAP的mRNA表达水平以及其蛋白水平均下调(p<0.05),给予AngⅡ刺激后在共培养一段时间后的Co-culture组,与blank组无差异。
  结论:体外实验表明血管紧张素Ⅱ可以通过下调ATRAP的表达,进而下调胸腺FoxN1的表达,导致胸腺功能减退,共培养可改善其影响。在体实验结果显示AngⅡ诱导的高血压小鼠存在胸腺功能减退,包括FoxN1、Aire和ATRAP的mRNA表达的下调和蛋白水平的下降,以及反映胸腺近期输出功能减弱的sjTREC含量的下降,T细胞亚群百分比的失衡和胸腺素β4的下调,从而导致或者加重高血压进程。通过胸腺移植,提高胸腺FoxN1的表达,可明显改善小鼠心脏功能,恢复和抑制血压的升高。其可能存在的潜在机制为胸腺移植上调胸腺发育至关重要的转录因子FoxN1的表达,进而引起ATRAP的表达上调,从而反过来影响血管紧张素Ⅱ对胸腺功能的影响,以及引起胸腺素β4的升高和sjTREC含量的增加,并且能够恢复T细胞亚群的正常百分比,从而改善和抑制血压的升高。
[硕士论文] 高阳
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  心房颤动(Atrial fibrillation,AF)是最严重的心房电活动紊乱,也是临床上最常见的心律失常。关于AF的具体发生机制尚未完全明确,这严重制约着临床上AF治疗的有效性及安全性。大量研究表明,心房肌细胞内钙稳态异常,特别是钙泄漏是AF发生、发展的重要机制之一。而钙稳态主要受到心肌细胞肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)上雷尼丁受体(Ryanodine receptor2,RyR2)的调控。RYR2作为最主要的钙释放通道,在心肌的舒张期应保持理想的关闭状态。如舒张期RyR2异常开放,会引起肌浆网的钙泄漏(Ca2+leak)增多,Ca+通过胞膜上的钠钙交换体(NCX)外排,产生异常的净内向阳离子移动,进而导致心肌细胞延迟后除极(Delayed afterdepolarization,DAD)。一旦达到心肌细胞兴奋的阈值,即可诱发自发性的动作电位(action potential,AP);如多处心肌细胞同步出现自发AP等异位电触发活动,在业已存在心房扩大或纤维化等心房重构基质的基础上,则可引发AF。晚近研究发现,RyR2的稳定性受到亲联蛋白(Junctophilin,JPH)-2(JPH2)的调控,JPH2可通过和RyR2结合对影响RyR2的稳定性。近来研究发现,快速心房搏动导致心肌细胞内钙浓度增加,可激活Calpain-Ⅰ,而且其激活程度随AF持续时间的延长而逐渐增高,因此推测,高频率心房搏动可导致心房肌细胞内Ca+超载,进而可能激活Calpain-Ⅰ,降解JPH2蛋白,导致钙泄漏增多,最终引发AF的发生。本研究拟通过临床及动物研究明确在AF发生中Calpain-Ⅰ与JPH2蛋白水平的相关关系。
  研究目的:
  1、明确Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生的相关性;
  2、明确快速心房起搏通过诱导Calpain-Ⅰ/JPH2表达变化,影响钙稳态,导致房颤的发生。
  研究方法:
  (一)房颤患者左心房Calpain-Ⅰ与JPH2的表达变化研究
  1、研究对象
  选取在海军军医大学附属长征医院心脏外科行瓣膜手术的患者64例,所有患者签署手术知情同意书及剩余标本使用知情同意书。
  2、研究分组
  根据患者病史及术前心电图将患者分为两组:房颤组(AF组,n=32)和窦性心律组(SR组,n=32)。
  3、标本及临床资料采集
  收集手术中切除的左心房(LAA)及所有入院患者的一般临床资料。
  4、分子生物学指标检测
  (1)采用组织块酶消化及荧光染色的方法,评价心房肌细胞胞内钙离子浓度;
  (2)利用试剂盒检测不同分组心房肌组织Calpain-Ⅰ酶活;
  (3)性采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2mRNA表达水平:
  (4)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;
  (二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究
  1、兔AF模型的建立与鉴定
  (1)研究对象:成年新西兰大白兔,体重约2.0-2.5kg;
  (2)模型制备及实验分组:开胸将刺激电极缝合与左心耳表面,用阈上刺激连续刺激,观察刺激有效后关胸。手术组依据实验要求分为RAP组和RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组,RAP组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时予以腹腔注射二甲基亚砜制剂(DMSO,MDL28170的溶剂),连续给药4w。RAP+Calpain-Ⅰ抑制剂组在术后1w后开始RAP连续起搏4w,同时腹腔注射带有MDL28170(Calpain-Ⅰ特异性抑制剂)的溶液,连续给药4w。假手术组仅进行开关胸操作,在术后1w后开始腹腔注射DMSO,连续给药4w;
  (3)模型鉴定:利用遥测系统记录兔AF发生情况及持续时程(>5min为持续性AF,<5min并且能够自行终止者为非持续性AF或阵发性AF)。
  2、标本采集
  术后5周处死实验动物,部分用于分离心肌细胞,部分用于分子生物学指标检测。
  3、分子生物学研究
  (1)利用试剂盒检测不同分组Calpain-Ⅰ酶活性;
  (2)采用Q-PCR方法检测不同分组JPH2mRNA表达水平;
  (3)采用Western blot方法检测不同分组JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表达水平;
  (4)采用Langendorff灌流及荧光染色法,评价心房肌细胞内钙离子浓度:
  (三)统计学方法
  所有数据采用SPSS21.0进行统计分析,P<0.05表示差异存在统计学意义。
  研究结果:
  (一)房颤患者左心房Calpain-Ⅰ与JPH2的表达变化研究
  1、AF组与SR组患者一般临床资料无明显差异(P>0.05);但AF患者LAD明显大于SR组患者(53.97±8.37vs41.81±8.18,尸<0.05)。
  2、AF组心肌细胞内钙离子相关的荧光强度明显高于SR组,且AF组细胞内平均荧光强度明显高于SR组(20.56±1.98vs8.92±1.26,P<0.01)。
  3、以SR的OD值为基准,AF组Calpain-Ⅰ酶活性明显高于SR组(P<0.05)。
  4、以SR组的mRNA表达量为基准,AF组患者左心房肌组织中JPH2mRNA的表达水平与SR组差异无统计学意义(P>0.05)。
  5、AF组JPH2蛋白表达较SR组明显下调(0.53±0.14vs0.82±0.27,P<0.01);但AF组Calpain-Ⅰ蛋白表达较SR组显著上调(0.89±0.09vs0.46±0.09,P=0.015)。
  6、AF组左心房肌Calpain-Ⅰ与JPH2蛋白水平呈现明显负相关(P<0.01)。
  (二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相关性及其与房颤发生的动物实验研究
  1、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的房颤发生率(P<0.01)。
  2、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的酶活性增加(P<0.01)。
  3、Calpain-Ⅰ抑制剂对JPH2mRNA表达水平无影响(P>0.05)。
  4、Calpain-Ⅰ抑制剂可抑制RAP导致的JPH2蛋白降解(P<0.05)。
  5、房颤兔心房肌中JPH2与Calpain-Ⅰ蛋白水平呈现负相关(P<0.01)。
  6、Calpain-Ⅰ抑制剂可降低RAP导致的心肌细胞内钙离子浓度增加(P<0.01)。
  研究结论:
  (一)Calpain-Ⅰ/JPH2与人房颤发生密切相关;
  (二)Calpain-Ⅰ可通过降解JPH2蛋白,影响心房肌细胞内钙稳态,诱发房颤的发生。
[硕士论文] 周桑
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:通常认为哺乳动物缺乏心脏再生能力,因心梗等原因导致心肌损伤时可出现心力衰竭及一系列并发症,甚至发展至难治性心衰。对于难治性心衰患者,仅有心脏移植治疗可得到较好的预后,心脏供体的来源稀少及经济负担的沉重限制了心脏移植的应用,急性失代偿期心衰患者的1年内死亡率高达30%。2009年Bergmann依据大气层C14浓度的变化,证明了人的心肌细胞存在一定程度的再生能力,但再生的速率极低,成人心肌细胞的年再生速率约为0.5-1%,无法在心肌细胞大量损伤(如心肌梗死)后补充足够的心肌细胞。
  如何促进人体内心脏再生速率,找到心脏再生的关键调控点成为了心脏再生领域研究热点。而microRNAs及其靶基因在心脏再生信号通路及信号网络中的广泛参与使其成为了较好的切入点和潜在的药物作用靶点。Beauchemin报道miR-101a通过靶基因cfos调节心脏再生过程,Yin等人通过微阵列分析发现miR-133在斑马鱼心脏再生期间表达下降,而抑制miR-133的表达可通过上调细胞连接蛋白cx43促进心脏再生。另外Hosoda等发现miR-499可通过缝隙连接在细胞间传输,调节心脏祖细胞向成熟心肌细胞的分化。研究者报道miR-1受MyoD和Mef2的直接调控,既可降低Notch蛋白的表达,又可抑制靶基因Hand的表达,而Notch信号和Hand均是心脏再生重要的参与者,而Notch信号的调控者除了miR-1外,还有miR-34、miR-124、miR-19a、MicroRNA-21-5p、miR-100、miR-126等。另外有研究者发现心脏部分切除引起的心肌细胞缺氧状态是心脏再生的启动信号,而非心脏部分切除本身,而缺氧的直接效应分子缺氧诱导因子HIFs可作用于JAK-STAT通路,JAK阻断剂可使microRNA(miR-1、miR-133、miR-208、miR-499)介导的小鼠成纤维细胞向心肌样细胞转化的效率大大提高。但是目前心脏再生领域的研究仍未成功逆转心衰,寻找心脏再生的关键靶点需要更多的研究。
  本研究意在通过观察斑马鱼和出生7天之内的乳鼠和心脏再生时microRNA表达谱的变化,通过初步的筛选和验证,选出斑马鱼心脏再生和出生7天内乳鼠心脏再生过程中的变化明显的microRNA及其关键靶基因并研究该microRNA及其靶基因在心脏再生中的作用。
  第一部分 斑马鱼心脏再生模型的建立
  目的:建立稳定、可靠的斑马鱼心脏再生研究平台,探讨斑马鱼麻醉过程中三卡因浓度对其心脏手术后生存率的影响。
  方法:以经典实验方法中的三卡因(MS-222)浓度150mg/L为对照,分别用浓度为20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、200mg/L的MS-222麻醉液麻醉,将麻醉好的鱼体倒置在斑马鱼固定海绵内,显微镜下使用维纳斯剪分离胸部组织暴露斑马鱼心脏,在心尖切除其心室的20%左右,观察斑马鱼术后行为及术后生存率的差异。
  结果:斑马鱼心脏切除面积的大小和斑马鱼术前麻醉深浅等影响着斑马鱼心脏部分切除术后生存率的高低,实验中首先根据术前麻醉时斑马鱼的入麻行为及术后行为定义了斑马鱼的麻醉分级。随着MS-222浓度的提高,斑马鱼表现为入麻时间的逐渐减少、苏醒时间的逐渐增加。MS-222麻醉斑马鱼成鱼的有效浓度为40~160mg/L,在此浓度范围内,鱼体能够在3min内达到可施行手术操作的麻醉状态(Ⅱ或Ⅲ期),10min内可苏醒恢复;在有效浓度范围内,随着浓度的增大,斑马鱼的术后存活率逐渐下降;在经典麻醉浓度下,斑马鱼术后存活率为68.33%,当MS-222浓度为40mg/L时斑马鱼的术后存活率最高(98.3%),MS-222浓度为200mg/L时斑马鱼的术后存活率最低(63.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:成功构建斑马鱼心脏再生模型,并对切除面积,斑马鱼鱼龄等参数进行了优化,当MS-222浓度为40mg/L,心室切除面积为20%时,斑马鱼入麻及苏醒较为平稳,术后斑马鱼复苏时间较短,且保持了较高的术后生存率。在实验操作或者生产应用时推荐MS-222麻醉药液最佳麻醉浓度为40mg/L,所对应的麻醉时间约为15分钟左右。
  第二部分 MicroRNA在斑马鱼心脏再生中的表达谱分析及验证
  目的:筛选并验证在斑马鱼心脏再生中表达差异明显的microRNA。
  方法:将斑马鱼分为手术组与假手术组,分别进行心脏部分切除术和假手术(仅打开胸腔),术后第10d提取RNA进行microRNA的高通量测序,包含心脏假手术组和心脏部分切除后10d组各-3本(每个样本6鱼)。根据高通量测序结果,分别针对变化明显的microRNA对斑马鱼心脏部分切除后第3、7、10、15、60d心脏RNA进行定量PCR检测。选择变化最为明显的microRNA并通过生物信息学检索和文献分析,预测该microRNA的靶基因,建立乳鼠原代心肌细胞的培养方法,利用缺氧诱导心肌细胞增殖,通过RT-PCR验证高通量测序结果及靶基因预测结果。选择变化明显的靶基因,通过荧光素酶报告基因实验验证microRNA与预测靶基因的相关关系。
  结果:完成斑马鱼心脏再生模型中microRNA表达谱的高通量测序,对比心脏再生组与对照组之间,明显上调的microRNA有:microRNA-21-5p,microRNA-2188-5p,microRNA-19-5p,microRNA-199-3p,microRNA-731-5p,microRNA-222b-3p。明显下调的microRNA有:microRNA-301c-5p,microRNA-100-2-3p,microRNA-92b-3p。RT-PCR验证结果提示microRNA-301c-5p下调最为明显(0.29倍,第3d)和microRNA-21-5p上调最为明显(8.57倍,第7d)。同时通过生信分析,利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNA四个数据库的重合结果及文献检索,选择了Dnm11、Arhgap24、Cacybp、Alx1、per2、pitx2、Pja2等为mo-microRNA-21-5p的预测靶基因。建立乳鼠心肌细胞的原代培养方法,通过低氧诱导心肌细胞增殖,重新验证高通量测序结果及靶基因预测结果,发现MicroRNA-21-5p水平的上调与Alx1和pja2的下调具有时间相关性。通过双荧光素酶报告基因实验证实microRNA-21-5p在离体体系中能够调控Alx1和Pja2的表达。
  结论:在斑马鱼心脏再生中及低氧诱导乳鼠原代心肌细胞再生过程中microRNA-21-5p上调明显,同时microRNA-21-5p水平的上调与其预测靶基因Alx1和Pja2的下调具有时间相关性。双荧光素酶报告基因实验证实microRNA-21-5p在离体体系中能够调控Alx1和Pja2的表达。
  第三部分 microRNA-21-5p及Pja2在乳鼠心脏再生中的作用和机制
  目的:建立稳定的乳鼠原代心肌细胞培养体系,探讨过表达及敲低microRNA-21-5p和Pja2对于乳鼠心脏再生过程的影响。
  方法:设计并合成microRNA-21-5p的mimic和inhibitor、Pja2和Alx1的siRNA,转染乳鼠原代心肌细胞并验证其过表达和沉默效率,以EDU作为心肌细胞增殖指标,通过免疫荧光实验检测乳鼠心肌细胞增殖水平的变化。根据实验结果,合成microRNA-21-5p敲低腺病毒及Pja2过表达腺病毒进一步验证。
  结果:乳鼠原代心肌细胞转染mir21-5p inhibitor后,mir21-5p表达水平降低同时Pja2表达水平升高,;转染mir21-5p mimic后,mir21-5p表达水平升高同时Pja2表达水平降低;转染Pja2siRNA后,Pja2表达水平明显降低,但mir21-5p表达水平无明显差异。免疫荧光显示microRNA-21-5p mimic过表达microRNA-21-5p使心肌细胞增殖率增加了45.3%(P<0.05);microRNA-21-5p inhibitor使心肌细胞增殖率降低了44.5%(P<0.05);siRNA沉默Pja2使心肌细胞增殖率增加了64.73%(P<0.05);siRNA沉默Alx1对心肌细胞增殖率没有显著影响,microRNA-21-5p敲低腺病毒感染心肌细胞使心肌细胞增殖率降低了53.2%(P<0.05),Pja2过表达腺病毒感染心肌细胞使心肌细胞增殖率下降了76.5%(P<0.05)。MicroRNA-21-5p对心肌再生的促进作用可能是通过抑制Pja2表达实现的,而Alx1虽受microRNA-21-5p的调控,但并不参与心脏再生过程。
  结论:在乳鼠心肌细胞增殖过程中,microRNA21-5p可调控Pja2的表达,并促进心肌细胞增殖水平;而直接敲低Pja2对心肌细胞再生也有明显促进作用,但对microRNA21-5p的表达没有明显影响。下调microRNA-21-5p可使乳鼠心肌细胞增殖水平明显降低,microRNA-21-5p对乳鼠心脏再生的调节作用可能是通过抑制Pja2的表达实现的。抑制Pja2表达对心脏再生明显的促进作用提示Pja2可成为新的药物作用靶点。
[博士论文] 安朝
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  胸主动脉夹层(Thoracic aortic dissection,TAD)是一种死亡率极高的主动脉急症。TAD发生时,主动脉内膜出现破口,破口处血液流入并导致主动脉中层撕裂成真假两腔,因假腔内血液无法及时有效排出,血液在假腔内不断累积并最终导致假腔破裂,病人急性死亡。若不给予积极干预,TAD起病后的48小时内约有50%的患者死亡。一些遗传性疾病如马凡氏综合征、Ehlers-Danlos综合征等可以引起TAD,但只有大约10%的TAD为遗传性疾病引起。目前非遗传性TAD的具体发病机制仍未能阐明,并且对于TAD尚无有效的预防及药物治疗手段。因此,对TAD发病机制的研究有利于在此基础上探寻TAD的早期预防和药物治疗方法。
  已知主动脉壁中层是主动脉的主要功能结构,主动脉中层的功能异常是TAD发生的重要病理生理基础。主动脉中层的主要细胞成分是血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs),其存在收缩型与合成型两种表型。与收缩型相比,合成型VSMCs表现为更强的增殖、迁移能力以及高表达骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、细胞外基质蛋白如基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase2,MMP2)及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase9,MMP9),而收缩型VSMCs标志物α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)与平滑肌蛋白22α(Smooth muscle22α,SM22α)的表达水平则显著下降。生理情况下主动脉内VSMCs主要以收缩型存在,维持主动脉的正常功能。多项研究已经表明VSMCs由收缩型向合成型的表型转化参与了TAD的发生,在TAD的病理生理过程中有重要作用。然而,目前对于TAD中VSMCs表型转化的具体机制仍然了解甚少。
  NANOG是一种在维持胚胎干细胞增殖及全能性方面有重要作用同源域蛋白。在胚胎干细胞中,NANOG的持续表达可以维持其自我更新潜能及去分化状态。相对的,NANOG的低表达可以引起胚胎干细胞分化。VSMCs由收缩型向合成型转化被认为是一种去分化过程,故NANOG在干细胞中的功能高度提示其可能与VSMCs的表型转化相关。但NANOG在TAD中VSMCs表型转化中的作用尚未见有报道。
  OPN蛋白高表达于TAD组织及合成型VSMCs。目前研究表明OPN直接促进了VSMCs由收缩型向合成型的转化,高表达的OPN能够增强VSMCs的增殖和迁移能力,上调VSMCs中合成型标志物MMP2的表达并下调收缩型标记物α-SMA的表达。同时,有研究报道在胚胎干细胞中OPN的表达受NANOG调控,这高度提示了NANOG可能通过调控OPN参与了TAD中VSMCs的表型转化。
  本研究的目的是通过组织学及分子生物学的方法探究NANOG对TAD中VSMCs表型转化的调控作用及其机制。
  方法:
  (一)TAD标本的收集与VSMCs的分离
  1.主动脉临床标本的收集:TAD组主动脉组织来自20例接受手术修复的TAD患者;正常对照组主动脉组织来自10例未患有主动脉及血管相关疾病的捐献者。2.VSMCs的分离与培养:原代VSMCs分离自TAD组以及对照组来源标本。标本离体经去除内外膜后剪切为约4mm2大小组织块,接种于24孔板,每孔加入200μl含有生长添加剂的M231培养基后经贴壁培养取得原代VSMCs。原代VSMCs生长至融合时进行传代,组织块则转移至新的孔板中继续分离细胞。
  (二)NANOG对VSMCs表型转化的调控作用及机制
  1.腺病毒转染:VSMCs生长至汇合率约70%时,取半量培养基根据MOI加入适量体积的腺病毒制成感染培养基,加入感染培养基37℃下孵育2小时后补足培养基,孵育过夜后更换至不含病毒培养基,24小时后荧光显微镜下观察转染效果。2.siRNA转染:根据Lipofectamine2000脂质体转染试剂的操作手册进行siRNA转染。3.免疫组织化学:主动脉组织经10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋后切片,组织切片经脱蜡、抗原修复、抑制内源性过氧化物酶、封闭、孵育一抗及二抗后采用DAB显色液显色。4.qRT-PCR与Western blot:qRT-PCR用于检测样本中目的基因mRNA表达水平,Western blot用于检测样本中目的蛋白表达水平。5.细胞增殖实验:采用CCK8法检测VSMCs增殖水平。6.划痕实验:划痕实验用于检测细胞的水平方向迁移能力。7.Transwell迁移实验:Transwell迁移实验用于检测细胞的垂直方向趋化迁移能力。8.AnnexinⅤ/PI双标记流式细胞凋亡实验:紫外线照射(10J/m2)被用于诱导VSMCs凋亡,细胞经AnnexinⅤ/PI双标记后通过流式细胞术定量分析凋亡细胞的比例。9.TUNEL细胞凋亡实验:VSMCs经4%多聚甲醛固定、透膜后加入生物素标记的dUTP与脱氧核糖核苷酸末端转移酶孵育,最后经荧光染色后荧光显微镜下检测凋亡细胞比例。10.免疫荧光:VSMCs经75%乙醇水溶液固定后,经透膜、封闭、一抗及二抗孵育、染核后荧光显微镜下观察。11.染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP):根据EpiQuik ChIP试剂盒中的操作手册所提供的步骤进行ChIP实验。
  (三)实验数据的统计分析
  数据采用非配对Student t检验。统计学分析均在SPSS中完成。数据以均数±标准差的形式呈现。P小于0.05认为在统计学上存在显著性差异。
  结果:
  (一)TAD来源的主动脉组织及VSMCs中高表达NANOG,同时伴随有VSMCs表型转化
  qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学的结果显示TAD主动脉组织中NANOG的mRNA及蛋白水平均显著上调,同时伴随着VSMCs合成型标志物OPN与MMP2的表达上调及收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达下调。进一步对VSMCs的检测在细胞水平上验证了上述发现,细胞免疫荧光结果显示TAD来源VSMCs中高表达的NANOG主要分布于细胞核,同时伴随着胞浆中OPN的表达升高与SM22α的表达降低。本部分的结果说明NANOG可能参与调控了TAD中VSMCs表型转化。
  (二)NANOG促进了VSMCs由收缩型向合成型的表型转化
  VSMCs中过表达NANOG上调了VSMCs合成型标志物OPN与MMP2的表达并下调了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达。同时,CCK8增殖实验结果显示过表达NANOG增强了VSMCs的增殖能力。划痕实验与Transwell迁移实验结果显示过表达NANOG增强了VSMCs在水平方向和垂直方向的迁移能力。流式细胞凋亡实验结果表明NANOG的过表达增强了VSMCs的抗凋亡能力。TUNEL实验的结果验证了流式细胞凋亡实验的结果,NANOG过表达组的VSMCs凋亡比例较对照组显著下降。进一步的研究结果显示在TAD来源的VSMCs中干扰敲低NANOG的表达上调了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达同时下调了合成型标志物OPN与MMP2的表达。本部分的结果说明高表达的NANOG可以调控VSMCs由收缩型向合成型转化,并且这一功能可能是通过OPN实现。
  (三)NANOG通过直接上调OPN的表达促进了VSMCs由收缩型向合成型转化
  ChIP实验结果显示NANOG可以直接结合至OPN基因的启动子区域。在进一步的拯救实验中,在过表达NANOG的VSMCs中敲低OPN引起了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达上调,同时合成型标志物MMP2的表达水平下调。CCK8增殖实验、划痕实验、Transwell迁移实验、流式凋亡实验及TUNEL实验的结果显示敲低OPN阻止了过表达NANOG引起的VSMCs增殖、迁移及抗凋亡能力增强。本部分的结果说明NANOG通过直接上调OPN的表达促进了TAD中VSMCs的表型转化。
  结论:
  我们的研究结果说明NANOG高表达于TAD患者的主动脉组织及VSMCs,高表达的NANOG通过直接上调OPN的表达促进了VSMCs由收缩型向合成型转化。
[硕士论文] 高斌
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:动脉粥样硬化相关的心血管疾病是目前全球各地区的第一死因,在西方国家,约有(10%)的人死于动脉粥样硬化相关疾病及其引起的并发症,而在多数医疗水平低下的国家,目前已经超越了感染性疾病的危害。动脉粥样硬化可导致多种临床表现,包括短暂性脑缺血发作(Transient cerebral ischemic attacks,TIA)、主髂动脉闭塞及冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)等。虽然其临床症状多样,但病变本身具有普遍共性,即它们都表现为动脉管壁大量胆固醇酯的沉积及复杂的进展型斑块的形成,最终导致动脉相应供血区缺血性改变。颈动脉狭窄(carotid stenosis)因影响大脑血供而备受关注,其中90%由颈动脉粥样硬化引起,它能够引起颅内缺血并产生相应的临床症状,如黑蒙、视物模糊、偏瘫失语等,致残与致死率很高,患者一般无法自理,因而带来巨大的社会及经济负担。颈动脉狭窄通常起病隐匿,往往出现脑缺血症状后才被发现。目前普遍认为,导致脑缺血症状出现的原因主要有两个:一是动脉粥样硬化斑块不稳定,斑块破裂或表面继发的血栓脱落导致急性脑栓塞;二是动脉狭窄造成远端脑组织血流低罐注。近年来研究表明,斑块成分脱落是引起缺血性脑卒中最主要的原因,而颅内动脉低灌注导致卒中的较少。因此,研究颈动脉斑块稳定性,探索早期预测不稳定斑块的生物标记物及其作用机制具有重要意义,能够有效降低脑卒中等不良事件的发生。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度在200nt以上,不具备编码蛋白质功能的RNA。许多研究结果证实,多种lncRNA在血管疾病中发挥重要作用,在动脉粥样硬化性疾病的发生及进展中,lncRNA通过调节血管壁功能、激活巨噬细胞、调节脂质代谢及免疫炎症反应等多个环节调控疾病的发生与进展。但目前尚无明确报道hncRNA在颈动脉斑块稳定性中的作用及机制。
  目的:
  我中心前期应用基因芯片的方法,得到了稳定及不稳定颈动脉斑块中差异表达的lncRNA及mRNA,其中lncASAP2-7∶1差异表达倍数高,我们选择lncASAP2-7∶1作为深入研究的靶标,下一步将验证lncASAP2-7∶1在不同稳定性颈动脉斑块中的差异性表达,并检测斑块中lncASAP2-7∶1含量与纤维帽厚度及脂质核心区等斑块主要成分的相关性。利用基因芯片结果进行生物信息学分析,预测lncASAP2-7∶1的生物学功能,进一步通过细胞实验验证lncASAP2-7∶1在调控血管平滑肌细胞功能中的作用及可能的作用机制,进而说明lncASAP2-7∶1在斑块稳定性中发挥的调控作用。
  方法:
  (1)临床样本研究:收集2015年8月至2016年12月年于海军军医大学附属长海医院住院行颈动脉内膜切除术(carotid endanerectomy,CEA)患者的颈动脉斑块标本。将收集到的颈动脉斑块标本切成小段分开保存,一部分标本液氮冻存用于提取斑块中RNA,通过realtime PCR验证基因芯片中lncASAP2-7∶1差异性;一部分存放于福尔马林溶液中,然后石蜡包埋切片行HE染色,电镜扫描判断斑块稳定性、测量纤维帽厚度及脂质核心区面积等。最后,统计分析斑块中lncASAP2-7∶1相对表达量与斑块成分之间的相关性。利用基因芯片结果进行生物信息学分析,预测lncASAP2-7∶1可能的生物学功能。医院伦理审查委员会评审并批准了此项研究,所有患者均知情同意。
  (2)细胞实验研究:包装lncASAP2-7∶1过表达及干扰的慢病毒,通过慢病毒转染人主动脉平滑肌细胞,实验分组为lncASAP2-7∶1上调组、上调对照组、下调组、下调对照组及正常空白对照组。采用细胞划痕实验检测lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞的迁移功能,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定Ⅰ型胶原蛋白含量,进而反映lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞合成分泌蛋白的功能,采用流式凋亡检测lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞凋亡功能,CCK8(Cell Counting Kit-8)及流式细胞周期检测lncASAP2-7∶1调控血管平滑肌细胞增殖功能。
  结果:
  1.临床样本研究:收集2015年8月至2016年12月于长海医院血管外科行颈动脉内膜切除术的颈动脉斑块标本22例,其中不稳定斑块11例,稳定斑块11例。不稳定斑块lncASAP2-7∶1相对表达量为6.679±5.883,稳定斑块lncASAP2-7∶1相对表达量为1.192±0.583,Real-time PCR结果提示lncASAP2-7∶1在不稳定斑块中的相对表达量明显高于稳定斑块(p<0.0001)。不稳定斑块纤维帽厚度为120.80±31.29μm,稳定斑块纤维帽厚度为163.51±34.34μm,不稳定斑块脂核所占比例为33.45%±9.76%,稳定斑块脂核所占比例为27.84%±7.38%。稳定斑块纤维帽厚度明显高于不稳定斑块(p<0.01),两组斑块脂核所占比例无明显统计学意义。颈动脉斑块中lncASAP2-7∶1相对表达量与纤维帽厚度存在负相关(r=-0.667,p<0.01),与脂核所占比例无明显相关性(r=0.340,p>0.05)。生物信息学预测结果提示,lncASAP2-7∶1可能参与了细胞迁移、分泌及细胞内蛋白质转运等生物学过程。
  2.细胞实验研究:利用包装lncASAP2-7∶1过表达及干扰的慢病毒干预人主动脉平滑肌细胞,分别验证了血管平滑肌细胞的迁移、分泌、增殖、凋亡功能,发现lncASAP2-7∶1高表达可以明显抑制血管平滑肌的迁移及Ⅰ型胶原蛋白的合成,在细胞增殖及凋亡中无明显作用。
  结论:
  lncASAP2-7∶1在不稳定斑块中表达量明显高于稳定斑块且与斑块中纤维帽厚度呈负相关,细胞实验证实lncASAP2-7∶1高表达抑制了血管平滑肌细胞的迁移及分泌Ⅰ型胶原蛋白的功能,影响了纤维帽的厚度,导致斑块不稳定,继发脑卒中等不良事件。
[硕士论文] 洪萍
儿科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  了解目前国内先天性心脏病相关肺高压患儿的临床流行病学特征、治疗现状及预后转归。分析红细胞分布宽度、血尿酸在儿童先天性心脏病相关肺高压中的变化,探讨两者在病情评价中的作用。
  方法:
  采用回顾性分析,收集2009年1月至2016年12月收治本院的确诊先天性心脏病相关肺高压患者,收集临床基线资料、超声心动图数据、右心导管检查结果、实验室检查及住院治疗的相关资料,然后对先天性心脏病相关肺高压患者进行回顾分析。根据年龄分组,0-16岁归入儿童先天性心脏病相关肺高压组,并以同期收治的先天性心脏病无肺高压的患儿为对照组,对两组的临床资料进行比较,分析影响先天性心脏病患儿发生肺高压的危险因素及影响预后的因素。根据手术后肺动脉高压是否持续存在,分为术后肺高压组与术后无肺高压组,对两组资料进行多因素分析。分析红细胞分布宽度和血尿酸水平在先天性心脏病相关肺高压者中的变化,对红细胞分布宽度和血尿酸水平与肺动脉收缩压、肺动脉舒张压、肺动脉平均压进行相关性分析。
  结果:
  1、本研究共入选儿童CHD-PH70例。在儿童CHD-PH中,室间隔缺损为最常见类型(63%),其次为2种及以上的复合畸形类型(29%),依次为房间隔缺损(4%),动脉导管未闭(4%)。
  2、治疗措施中,本研究中外科手术治疗为主(72%),内科介入及靶向药物治疗所占比例低。
  3、CHD-PH组红细胞分布宽度、NYU PHFI评分、双向分流比例均高于对照组(P<0.05),肺高压组左心室射血分数明显低于对照组(P<0.05)。
  4、术后肺高压组手术年龄、肺动脉收缩压均高于对照组(P<0.05),多因素Logistic回归分析示,手术年龄为儿童CHD-PH患儿术后持续肺高压的危险因素(P<0.05)。
  5、先天性心脏病相关肺高压的死亡组患儿其红细胞分布宽度高于存活组(P<0.05)。红细胞分布宽度预测先天性心脏病相关肺高压儿童发生不良事件的结果显示ROC曲线下面积为0.729(95%CI:0.541-0.917),红细胞分布宽度以14.8%为截点获得较好的敏感度(0.67)与特异度(0.77)。
  6、儿童CHD-PH组尿酸值高于CHD组,但差异无统计学意义(P>0.05);在儿童CHD-PH中死亡组尿酸值高于存活组,但差异无统计学意义(P>0.05,血尿酸水平与肺动脉收缩压、肺动脉舒张压、肺动脉平均压均无相关(P>0.05)。
  结论:
  1、儿童先天性心脏病相关肺高压中最常见的心脏畸形为室间隔缺损,本研究中以外科手术为主要治疗手段,手术年龄是CHD-PH患儿术后持续肺高压的独立危险因素,早期手术治疗者肺动脉高压纠正机会更大,预后良好,建议对此类患者应早期诊断、及时纠正心脏畸形。
  2、红细胞分布宽度在肺高压组明显高于对照组,且在因肺高压死亡患儿组明显高于存活组,因此,红细胞分布宽度在一定程度可以提示先天性心脏病相关肺高压患儿不良预后。
  3、血尿酸与肺动脉压力无相关性,对儿童先天性心脏病相关性肺高压患儿病情无评价意义。
[硕士论文] 焦培磊
生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  原发性高血压是一种人类常见的慢性疾病,约占高血压患者总数的90-95%。尽管目前绝大部分高血压患者经过药物治疗可以将血压控制在正常水平,但高血压的严重并发症如脑卒中和心力衰竭等疾病的发病率仍旧居高不下,因此对高血压的发病机理进行深入研究仍然具有重要意义。除了体液调节,在高血压的形成过程中神经调控扮演了重要的角色,交感神经活动亢进是高血压病的主要特征和病理基础,并且与脑卒中和心力衰竭等疾病的发展预后密切相关。头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是调控交感神经活动的关键区域,有研究证实RVLM中的前交感神经元兴奋性增强是高血压状态下交感神经活动亢进的主要原因,因此,探究高血压病理状态下RVLM内前交感神经元兴奋性增强的作用机制并寻求有效降低其兴奋性的方法对探索高血压的预防和治疗具有重要作用和深远意义。
  氧化应激(oxidative stress)是指由于体内氧化和抗氧化系统的平衡被打破,更倾向于氧化,产生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。有研究报道,与正常血压Wistar-Kyoto(WKY)大鼠相比自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)RVLM的氧化应激明显增强;在SHR的RVLM内过表达超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)基因可以使血压和心率下降,表明高血压状态下的交感神经亢进与氧化应激密切相关。近年来研究发现核转录因子Nrf2(nuclear factor-erythroid-2-related factor2)在体内的抗氧化应激防御以及维持氧化还原稳态中发挥了重要的作用。研究证实与WKY相比,自发性高血压脑卒中大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rat,SHRSP)的血管平滑肌细胞中Nrf2的活化程度下降,而Nrf2激动剂莱菔硫烷(L-sulforaphane)可以改善SHRSP的血管功能紊乱。但目前关于高血压交感神经活动亢进下氧化应激水平增强的具体机制尚不明确。
  β-arrestin1是一种G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)的重要调节蛋白,它是最初在提纯β-肾上腺素受体激酶的过程中被发现的,它可以通过调节受体的脱敏、内吞和介导细胞信号转导等作用来发挥其负性调控G蛋白偶联受体的作用。近年来研究发现,在心脏β1AR中,β-arrestin可以通过反式激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)发挥心血管保护效应;在脑缺血模型中,β-arrestin1可以通过调节Beclin-1介导的自噬产生神经保护效应,由此可见,β-arrestin1在外周心血管系统和中枢神经系统中均可发挥生物学效应。然而目前RVLM内β-arrestin1在心血管生理和病理调控中的作用特点与意义尚不清楚。
  在外周心血管的研究,提示β-arrestin1与氧化应激关系紧密,但二者之间的关系在心血管调控中枢的作用与意义尚不明确,而且中枢β-arrestin1与Nrf2是否存在某些联系尚需验证。本课题的主要研究目的是明确中枢β-arrestin1在改善高血压心血管功能中的作用与机制,并探究其作用途径是否通过Nrf2途径改善高血压中枢的氧化应激水平,从而为β-arrestin1的作用机制提出了新的内容并且为高血压状态下中枢抗氧化应激提供了新的思路。
  方法:
  实验动物均为16周龄,体重在250-350g之间的雄性正常血压大鼠WKY和自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)。首先,利用免疫荧光确定RVLM内前交感神经元上存在β-arrestin1的表达,接着用Western blot的方法检测RVLM内β-arrestin1的蛋白表达含量。为了探究中枢β-arrestin1对高血压心血管功能的作用,我们向大鼠RVLM分别转染AAV-GFP(对照组)和AAV-Arrb1(β-arrestin1过表达组),并持续监测实验动物的血压。利用DHE检测RVLM内ROS含量,Western blot检测RVLM内Nrf2,p-Nrf2,Keap1(胞质中与Nrf2稳定结合),HO-1和NQO-1(Nrf2下游蛋白分子)的表达含量并用免疫荧光观察p-Nrf2进入细胞核的情况。
  为了进一步明确中枢β-arrestin1的作用机制,我们分别向SHR的RVLM分别转染AAV-GFP和AAV-Arrb1,转染病毒2周后,分别向RVLM注射Negative Control(NC)和Nrf2siRNA。在麻醉状态下监测大鼠的血压、心率和肾交感神经活动,并用DHE荧光探针检测RVLM内ROS含量,Western blot检测RVLM内Nrf2,p-Nrf2,Keap1,HO-1和NQO-1的表达含量。
  结果:
  一、中枢β-arrestin1对自发性高血压大鼠心血管功能的调节作用
  1.β-arrestin1在自发性高血压大鼠RVLM内的表达情况
  免疫荧光证实自发性高血压大鼠RVLM内前交感神经元上存在β-arrestin1的表达。Western blot结果显示,与WKY组相比,SHR组的RVLM内β-arrestin1表达含量明显降低(P<0.05,n=4)。
  2.RVLM过表达β-arrestin1明显降低SHR的血压水平
  清醒状态下监测血压结果显示:与SHR-GFP组相比,SHR-Arrb1组血压逐渐降低并在病毒转染2周后稳定于低水平(SHR-GFP组:165.4±2.0mmHg;SHR-Arrb1组:142.8±1.5mmHg;p<0.05,n=5),而WKY两组血压无明显差异。
  二、中枢β-arrestin1降低自发性高血压大鼠RVLM的氧化应激水平
  DHE荧光探针结果显示:与WKY-GFP组相比,SHR-GFP组RVLM内ROS含量明显增加;SHR-Arrb1组RVLM内ROS含量明显低于SHR-GFP组(p<0.05,n=5),结果提示:SHR的RVLM氧化应激水平明显高于WKY,过表达β-arrestin1明显降低SHR的RVLM氧化应激水平。
  三、中枢β-arrestin1通过促进Nrf2活化发挥抗氧化应激效应
  1.过表达β-arrestin1促进RVLM内Nrf2的活化
  Western blot结果显示:与WKY组相比,SHR组RVLM内p-Nrf2表达含量显著降低,同时,其下游HO-1和NQO-1表达含量显著降低(P<0.05,n=5)。RVLM过表达β-arrestin1后,与SHR-GFP组相比,SHR-Arrb1组RVLM内p-Nrf2表达含量显著增加,下游HO-1和NQO-1表达含量显著增加(P<0.05,n=5)。免疫荧光结果显示:p-Nrf2(红色荧光)在细胞核内分布增多,与蓝色细胞核混合呈淡紫色。
  2.干扰Nrf2可以逆转中枢β-arrestin1的抗氧化应激效应
  与SHR-Arrb1-NC组相比,SHR-Arrb1-Nrf2siRNA组血压和肾交感神经活动显著升高(P<0.05,n=4),而SHR-GFP两组则无明显变化。DHE荧光探针结果显示:与SHR-Arrb1-NC组相比,SHR-Arrb1-Nrf2siRNA组RVLM内ROS含量明显增加,而其与SHR-GFP-NC组相比无明显差异。Western blot结果显示:与SHR-Arrb1-NC组相比,SHR-Arrb1-Nrf2siRNA组RVLM内Nrf2和p-Nrf2表达含量均显著降低,同时,其下游HO-1和NQO-1表达含量显著降低(P<0.05,n=5)。
  结论:
  中枢β-arrestin1通过降低RVLM氧化应激水平改善SHR心血管功能异常,RVLM过表达β-arrestin1促进Nrf2活化,同时RVLM特异性干扰Nrf2逆转中枢β-arrestin1的抗氧化应激效应。本研究证实中枢β-arrestin1通过促进Nrf2活化发挥交感中枢抗氧化应激效应,从而改善高血压心血管功能。
[硕士论文] 蒋海波
影像医学与核医学(超声) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  运用三维斑点追踪技术定量评价单纯动脉导管未闭(Patent ductus arteriosus,PDA)及PDA合并肺动脉高压患者封堵前后左室三维整体应变,探讨其定量评价该类患者封堵前后左室收缩功能变化的价值。
  方法:
  随机选取2015年10月-2017年09月本院心内科介入封堵成功的动脉导管未闭患者60例(病例组)。根据(肺动脉压=收缩压-跨导管压差)法计算肺动脉压,并定义肺动脉压≥40mmHg为肺动脉压增高,最终入选的PDA合并肺动脉高压亚组25例(A组),单纯PDA亚组35例(B组)。同时选取性别、年龄相匹配的健康体检者35名作为对照组(C组)。病例组分别于术前、术后2天、术后1个月、术后3个月、术后6个月和对照组均接受常规超声心动图和三维斑点追踪(Three Dimension-Speckle Tracking Imaging,3D-STI)检查。所有研究对象均于胸骨旁左室长轴切面乳头肌水平获取左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVDS),肺动脉长轴获取肺动脉内径(pulmonary artery diameter,PAD),Simpson双平面法获取左室心尖四腔左室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume,LVEDV)、左室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume,LVESV)、并计算左室射血分数(left ventricular ejectionfraction,LVEF),及3D-STI技术获取的左室整体纵向峰值应变(global peak longitudinal strain,GPLS)、整体圆周峰值应变(global peak circumferential strain,GPCS)、整体径向峰值应变(global peak radial strain,GPRS)、整体面积峰值应变(global peak area strain,GPAS)等指标,并行统计分析。
  结果:
  ①A组LVDD、LVEDV、LVESV封堵前后各时间节点两两比较,差异有统计学意义(P均<0.05),且呈逐渐下降趋势;PAD除了术后3个月较术后1个月、6个月差异无统计学意义,其余时间节点两两比较差异有统计学意义(P均<0.05);LVDS除了术后3个月与6个月比较,差异无统计学意义,其余时间节点两两比较差异有统计学意义(P均<0.05);②B组患者封堵前后PAD各时间节点比较,差异有统计学意义(P均<0.05);LVDD、LVDS、LVEDV、LVESV除了术后3个月与6个月比较差异无统计学意义,其余时间节点两两比较,差异有统计学意义(P<0.05),并呈逐渐下降趋势;③A组和B组封堵前后各时间节点LVEF差异无统计学意义(P均>0.05);④A组GPLS、GPCS、GPAS术后2天较术前下降,但差异不显著(P均>0.05),术后1个月逐渐上升,差异有统计学意义(P均<0.05);GPRS于术后2天及1个月均出现下降,术后3个月开始逐渐增加,各时间节点比较差异显著(P均<0.05);⑤B组GPLS、GPCS、GPRS、GPAS封堵前后各时间节点两两比较,差异均有统计学意义(P均<0.05),呈现为术后2天、1个月先下降,术后3个月开始增加的趋势;⑥术前A组和B组除了LVEF外,PAD、LVDD、LVDS、LVEDV、LVESV均大于C组,差异显著(P均<0.05);A组除了LVDD和LVEF外,其余指标均大于B组,差异有统计学意义(P均<0.05)⑦术前A组GPCS和GPAS较C组减低,差异显著(P<0.05),GPLS和GPRS较C组差异无统计学意义(P>0.05);B组上述指标均较A组和C组明显增加,差异显著(P均<0.05);⑧随访至术后6个月,
  A组除了GPRS变化幅度低于B组外,GPLS、GPCS、GPAS的变化幅度均大于B组其中GPLS和GPCS差异显著(P<0.05),GPAS差异不明显(P>0.05);⑨A组和B组封堵后6个月与对照组比较,LVDS、LVEDV、LVESV恢复至正常范围,差异均无统计学意义(P均>0.05),仅LVDD仍大于C组,差异有统计学意义(P<0.05);B组LVEF大于A组和C组,差异有统计学意义(P<0.05);⑩封堵后6个月,A组和B组的GPLS大于C组,差异有统计学意义(P<0.05);B组GPCS大于A组和C组,差异有统计学意义(P<0.05);3组研究对象GPRS、GPAS差异均无统计学意义(P均>0.05)。
  结论:
  常规超声心动图测量单纯PDA及PDA合并肺动脉高压患者封堵前后各时间节点LVEF未发生改变时,3D-STI技术可以全面、准确的定量评价该类患者封堵前后左心室整体应变改变,且呈先下降后增强的趋势,较常规超声心动图能客观、有效的反映该类患者术后左室收缩功能变化。
[博士论文] 刘兵
血管病学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  原发性高血压病是一种人类常见的慢性病,它是以血压升高为主要特征,并伴有血管、心脏等重要脏器并发症的一种严重威胁人类健康的疾病,发病率长期居高不下。有调查显示,中国有23.3%的成年人约2.45亿患有高血压病,而根据2017年美国心脏病协会/美国心脏协会新修订的高血压标准(收缩压≥130mmHg,舒张压≥80mmHg),中国高血压的患病率高达46.4%,而中国高血压的控制率为17%。因此,对高血压发病机理的研究和寻找更高效的的治疗策略,仍是当前生物医学界研究的热点。高血压病除外周心血管系统的一系列特征表现外,中枢神经系统交感输出亢进是高血压病发生和发展的重要机制之一。在中枢神经系统的众多核团中,头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是调控交感输出和基础血压的关键中枢,RVLM神经元功能异常与高血压和交感兴奋性增高密切相关。
  研究证实中枢肾素血管紧张系统(Renin-angiotensin system,RAS)过度激活是高血压病中枢交感输出的重要机制之一,增多的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)可以降低中枢压力敏感反射,增强中枢交感缩血管紧张性,导致血压的异常增高。血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme2,ACE2)是肾素血管紧张系统家族中的新成员,ACE2将血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)和AngⅡ转化成血管紧张素-(1-7)[Angiotensin(1-7),Ang-(1-7)],并拮抗AngⅡ的升压效果而发挥作用,而RAS和ACE2相关轴之间的平衡对维持正常血压和自主神经功能的中枢调节非常重要。已有研究证实,原发性高血压状态下大鼠RVLM内ACE2的表达显著下降,而在该区域过表达ACE2可使血压和肾交感活性显著下降。因此,ACE2在中枢调控心血管功能中的作用十分显著,也是当前寻求新的高血压防治策略的研究靶点之一,但目前高血压中枢ACE2功能降低的机制尚不清楚。
  细胞中ACE2是Ⅰ型跨膜蛋白,由细胞外的N端结构域、跨膜结构和一个短的胞内C末端组成,细胞外液中可溶性ACE2的形式为缺乏其胞内和跨膜结构域的胞外部分。ACE2的作用功能目前研究较为广泛,而上游对其调控的机理目前尚不清晰,研究较少。有研究显示镶嵌在细胞膜表面的解聚素和金属蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteases17,ADAM17)可以调节细胞ACE2活性,ADAM17可以剪切细胞表面的多种蛋白质,从而发挥其多样的生理功能。它在机体内很多个器官都有表达,参与了一些生理和病理进程。ADAM17在细胞膜表面可以通过蛋白水解作用,剪切细胞膜上的ACE2,使得ACE2胞外部分脱落,进入细胞外液,降低细胞膜上ACE2的活性功能,导致细胞外液的可溶性ACE2片段增多。在一型糖尿病秋田(Akita)小鼠肾小管中,ADAM17表达增加,它通过剪切细胞膜上ACE2使得尿液中的游离ACE2片段(70KDa)增加,给予胰岛素可逆转这一状况。有研究证实AngⅡ灌注下,心脏ADAM17活性增加,ACE2表达减少且活性下降,最终引起心脏肥大和纤维化。组织基质金属蛋白酶抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP3)是ADAM17的内源性抑制剂,它可以抑制了ADAM17介导的底物胞外域脱落。有研究报道,AngⅡ诱导可以增加心肌TIMP3表达增加,而AngⅡ的灌流两周不能使TIMP3-/-小鼠的心脏肥大,可见TIMP3参与AngⅡ诱导心肌肥大的病理过程。研究证实中枢脑组织中存在ADAM17的表达,其是杏参与中枢特别是交感中枢RVLM内ACE2的调节,仍不清楚。有研究报道,白藜芦醇(resveratrol,RSV)在外周可以增加TIMP3表达,而果糖诱导的高血压大鼠口服RSV的1周后血压下降,那么RSV是否通过TIMP3/ADAM17作用,增加了中枢内ACE2的功能从而参与血压的调控呢,仍不清楚。
  RSV是一类多酚类化合物,具有多种的心血管调节保护功能。RSV在很多病理和生理条件下可以增加ACE2的表达和活性,改善疾病状态。如RSV通过上调腹主动脉和肾上主动脉的ACE2的表达和活性来抑制ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤的生长。此外,摄入RSV可以增加高脂饮食小鼠脂肪组织中ACE2的表达,而降低ACE的表达。此前,本课题组发现高血压大鼠中枢第四脑室灌流RSV产生抗高血压效应,且高血压大鼠RVLM内ACE2的变化直接影响血压和交感输出,而ACE2的活性受到ADAM17的调控,同时ACE2和ADAM17也受到AngⅡ的调节,那么RSV在中枢的抗高血压效应是否通过ADAM17蛋白介导调节RVLM内的ACE2活性来参与的呢?中枢RVLM内RAS系统异常是否通过ADAM17介导调节ACE2的活性并参与高血压的形成呢?
  因此,根据以上背景确立本课题的研究目标是(1)高血压大鼠中枢ACE2活性下降是否与TIMP3/ADAM17的异常相关,正常血压大鼠WKY中枢灌流AngⅡ能否在RVLM内通过TIMP3/ADAM17来降低ACE2活性;(2)RSV在交感中枢RVLM是能否来调节ACE2的表达和活性,能否对TIMP3/ADAM17通路产生调节作用;(3)在PC-12细胞中干扰TIMP3的表达,能否拮抗RSV对ADAM17和ACE2调节作用。
  方法:
  实验动物为雄性正常血压Wistar Kyoto(WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR),动物体重在250-330g之间,细胞模型为PC-12细胞系。通过第四脑室灌流RSV对大鼠中枢施行持续定量给药,使用无创尾动脉法动态监测实验大鼠血压,使用脑定位微透析法对RVLM的细胞外液进行收集,采用WKY第四脑室灌流AngⅡ来确定其对RVLM内ADAM17和ACE2的影响,使用免疫荧光共聚焦法检测RVLM神经元ADAM17的表达,使用淬灭荧光底物检测脑组织及脑脊液中的ACE2活性。
  结果:
  一、高血压大鼠RVLM前交感神经元ADAM17表达增加
  免疫荧光检测显示大鼠RVLM前交感神经元存在ADAM17的表达;通过Western Blot检测大鼠ADAM17蛋白表达显示:SHR组的RVLM内ADAM17表达显著高于对照组WKY组(P<0.05,n=5)。
  二、AngⅡ通过TIMP3/ADAM17途径下调RVLM内ACE2的功能
  (一)AngⅡ减弱RVLM细胞上ACE2功能而增强RVLM细胞外液ACE2活性。WKY第四脑室分别灌流人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)和AngⅡ一周。相比灌流aCSF,灌流AngⅡ一周后平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)显著增高[MAP:113±4vs.151±4mmHg;HR:360±5vs.395±6beats/min(BPM),P<0.05,n=5],使用试剂盒检测实验标本ACE2活性发现:灌流AngⅡ的WKY组(WKY+AngⅡ)RVLM组织内ACE2活性低于对照组(WKY+aCSF)的活性(454±44.7vs.180±73.2AFU/μg/min,P<0.05,n=5),而RVLM的细胞外液(脑脊液)ACE2活性显著高于对照组(1370+470vs.0AFU/ml/min,P<0.05,n=5)。
  (二)AngⅡ减少RVLM组织内TIMP3表达并增加ADAM17表达。Western Blot检测显示:灌流AngⅡ的WKY-RVLM内ADAM17表达水平高于对照组(WKY+aCSF),而TIMP3的表达水平则低于对照组。
  三、中枢白藜芦醇(RSV)通过TIMP3/ADAM17通路上调高血压大鼠RVLM内ACE2功能
  第四脑室灌流实验分成四组WKY+aCSF、WKY+RSV、SHR+aCSF和SHR+RSV。
  (一)中枢RSV降低高血压大鼠的血压。SHR第四脑室灌流RSV(SHR+RSV)后,第5天血压开始下降,约在第7天下降至最低值后趋于平缓稳定,与对照组SHR+aCSF相比,SHR+RSV组血压显著下降(161±2vs.143±2mmHg,P<0.05,n=5)。而WKY的血压与灌药前相比无明显变化(P>0.05,n=5)。
  (二)RSV增加高血压大鼠RVLM组织ACE2活性,并减少RVLM细胞外液ACE2活性。使用试剂盒分别检测脑组织和透析液中的ACE2活性显示:SHR+aCSF组RVLM内细胞外液(脑脊液)的ACE2活性显著高于WKY+aCSF(1455+287vs.0AFU/ml/min,P<0.05,n=8)而RVLM组织内的活性则显著低于WKY+aCSF组(291±13.2vs.464.0±48.5AFU/μg/min,P<0.05,n=8)。
  结论:
  高血压大鼠RVLM内ACE2表达与活性的下降与增多的中枢AngⅡ诱导的ADAM17功能增强相关,而中枢RSV通过TIMP3/ADAM17增加SHR-RVLM内ACE2的表达和活性,改善心血管功能,本研究揭示高血压中枢ACE2调节的新机理,为高血压的防治策略提供了新的思路。
[硕士论文] 褚恒
外科学(胸心外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  高血压作为心血管系统最常见病症之一,影响全球患者多达10亿。尽管医疗水平不断提高,但目前中国高血压疾病发病率较高,病情知晓率、疾病治疗率及血压控制率仍较低。血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)作为血压升高后最直接影响的被膜细胞,其功能异常会导致炎症介质和促凝因子释放,迁移能力下降,引起血管舒张功能障碍,最终导致心脏、脑、肾脏、眼以及大小血管等不同部位严重的并发症。目前ECs、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem,RAAS)等因素均被认为与高血压发病机制相关。其中血管紧张素2(AngiotensionⅡ,AngⅡ)作为RAAS中最重要的血管活性物质。不仅可引起机体血流动力学改变,导致高血压的发生,而且对血管内皮功能起着非常重要的作用。因此对高血压造成内皮细胞损伤的机制研究就显得尤为重要。
  微小RNA(MicroRNA,miRNA)作为一种内源性的非编码RNA,能够与靶向mRNA的3'非翻译区(3'untranslation region,3'UTR)结合,使其翻译过程阻断或引起靶mRNA的降解。近年来已有大量文献报道了miRNA可通过影响细胞的凋亡、增殖、代谢、分化等生物学过程,参与调节心血管疾病的发生发展。已有研究发现miR-31在心肌纤维化,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转化,以及心肌缺血/再灌注损伤具有调节作用。然而miR-31在高血压疾病中内皮功能障碍的作用和机制尚未阐明。
  本研究旨在探究miR-31在高血压发病过程中对内皮细胞功能的影响及机制。
  方法:
  1.通过酶消化法获得人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs);通过AngⅡ(1μmol/L)诱导HUVECs建立内皮细胞损伤模型,对内皮细胞生物学功能进行检测,包括流式细胞仪检测细胞凋亡、western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平,CCK8法检测细胞生长活力;通过实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miRNA的表达。
  2.利用miR-31模拟物/抑制物分别转染HUVECs,并通过qRT-PCR鉴定转染效率;CCK-8法检测生长活力变化;流式细胞仪检测细胞凋亡变化;平板划痕实验检测细胞迁移能力变化。
  3.生物信息学预测软件检索miR-31的潜在靶基因,分析miR-31与潜在靶基因3'UTR的结合位点;在293T细胞中共转染已构建的萤火虫荧光素酶表达载体,通过荧光素酶报告基因实验和western blot验证miR-31与靶基因的调控关系;通过拯救实验,明确miR-31与靶基因在AngⅡ诱导的HUVECs损伤中的机制。
  结果:
  1.AngⅡ刺激HUVECs后,CCK8结果显示内皮细胞生长活力明显降低(P<0.01);流式细胞术结果确定细胞凋亡率明显增加(P<0.01);western blot结果显示凋亡相关蛋白Caspase-3表达上调,Bcl-2表达下调。qRT-PCR结果显示AngⅡ刺激后,miR-126、miR-200和miR-221无明显变化(P>0.05);miR-155表达明显上调(P<0.01);miR-31、miR-384和miR-590表达明显下调(P<0.01)。其中miR-31在AngⅡ刺激不同时间(12h、24h、36h和48h)后均表达降低(P<0.01),其中24h变化最明显。
  2.转染后,CCK-8检测结果表明过表达miR-31的细胞生长活力明显增加(P<0.01),而敲低miR-31的细胞生长活力明显减弱(P<0.01);流式细胞术结果显示过表达miR-31的细胞凋亡率减少(P<0.01),而敲低miR-31的细胞凋亡率增加(P<0.01);细胞划痕实验结果显示过表达miR-31的细胞迁移能力增强,而敲低miR-31的细胞迁移能力减弱。
  3.生物信息学软件分析结果显示RASA1基因的3'UTR上存在miR-31的潜在结合位点;双荧光素酶报告基因系统检测发现过表达miR-31显著降低含RASA1基因3'UTR序列的荧光素酶活性(P<0.01);western blot结果发现过表达miR-31能够显著抑制RASA1的蛋白表达(P<0.01);拯救实验结果证实过表达miR-31对AngⅡ诱导HUVECs凋亡的保护是通过抑制RASA1表达实现的。
  结论:
  1.内皮细胞miR-31在AngⅡ刺激后表达明显下调,提示其参与AngⅡ诱导的内皮细胞损伤的调节。
  2.过表达miR-31抑制AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡,并促进内皮细胞的迁移能力。
  3.miR-31对AngⅡ诱导的细胞凋亡的保护作用是通过抑制RASA1表达而实现的。
[硕士论文] 张莹
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:动脉压力感受性反射(Arterial baroreflex,ABR)是稳定动脉血压最重要的负反馈调节系统。动脉压力感受性反射功能可以用压力感受性反射敏感性(Baroreflex sensitivity,BRS)来表示。近年来研究发现,BRS低下与高血压、心律失常、脑卒中、心肌梗死及心力衰竭等心脑血管疾病密切相关,但现有研究无法完全阐明BRS低下是心血管疾病的重要致病因素。BRS低下病人很多合并有交感功能亢进,并且大量的研究结果也表明交感神经的过度激活,将会诱发许多心血管疾病,包括心衰、高血压、心梗、房颤、室颤等等。因此需要更多的实验数据证实单纯的BRS低下与心脑血管疾病发生发展的关系。
  本教研室着手进行了自发性反射功能缺陷模型大鼠的培育工作,将BRS<0.6ms/mmHg的大鼠定义为动脉压力感受性反射功能缺陷大鼠(Arterial baroreflex-deficient rats,ABR-DRs),而BRS>0.8ms/mmHg的大鼠则定义为动脉压力感受性反射正常大鼠(Arterial baroreflex-normal rats,ABR-NRs),采用先近亲繁殖后筛选的方法,开展了ABR-NRs和ABR-DRs模型大鼠的培育工作。在培育过程中,两株动物的BRS逐步出现了明显差异。表型方面,较ABR-NRs动物,ABR-DRs动物呈现出现轻度高血压症状。但在其他心血管疾病方面,如心肌肥厚、心力衰竭、心律失常等,尚缺乏相关的实验数据。
  在BRS低下机制研究方面,我们教研室前期研究工作对此也进行了初步探索。已经确定ABR-DRs大鼠的动脉压力感受性反射功能缺陷主要表现在迷走功能方面,而交感功能正常,因此ABR-DRs是一株单纯的BRS低下动物模型;利用离体膜片钳技术测定ABR-DRs动物的疑核(Nucleus ambiguous,NA)自发性电活动显著减弱。进一步的实验证实谷氨酸的AMPA受体与疑核自发电活动降低密切相关。但AMPA受体在BRS低下的关键作用仍需要进一步的数据支持。同时AMPA受体有很多亚型,哪个亚型在其中发挥作用仍需研究。
  我在前期工作基础上,进一步鉴定、筛选和培育ABR-DRs以及对照ABR-NRs;进一步的表型测定显示,与ABR-NRs动物比较,ABR-DRs体重增加,血脂、血糖水平显著升高,结合血压数据猜测,ABR-DRs表现出显著的代谢综合征。同时,与ABR-NRs相比,ABR-DRs动物并未表现出心肌肥厚、心功能异常以及心律失常的易感性。关于BRS低下的机制研究。AMPA受体主要有4个亚基,其中GluR2亚基与AMPA功能和表达关系最为密切。后续的研究主要围绕GluR2开展。利用GluR2过表达慢病毒转染等技术手段,明确疑核的GluR2可能是BRS低下的关键蛋白。过表达GluR2可显著改善反射功能,降低血压,改善代谢综合征。
  具体实验和结果如下:
  实验一:第26代至第29代模型大鼠的鉴定、筛选和培育
  采用清醒测压技术测定每代ABR-NRs和ABR-DRs动物的BRS、血压和心率,淘汰各组BRS不符合或血压不正常的动物及其子代,保留并近亲交配符合标准的动物子代。到第29代,ABR-DRs的BRS合格率已稳步提高至90%,ABR-NRs的BRS合格率达到了80%。虽然筛选中严格控制父代血压,ABR-DRs血压却明显高于ABR-NRs(约10mm Hg)。更为重要的是,两组动物高血压发生率差异也越发显著,ABR-NRs高血压发生率为0(n=15),而ABR-DRs高达62.5%(n=15)。
  实验二:ABR-DRs出现代谢综合征表现
  对第29代两株大鼠的体重、随机血糖、空腹血糖、血脂四项和肝肾功能相关代谢指标进行测定,结果发现,与ABR-NRs比较,ABR-DRs动物的体重明显增加,空腹血糖、糖化血清蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及血清白蛋白均显著升高。糖耐量实验,与ABR-NRs相比,在0、15、30、60、120min各个时间点,ABR-DRs的血糖水平均显著升高,血糖的曲线下面积显著增加。这些指标的异常符合临床上的代谢综合征表现。
  实验三:ABR-DRs未表现出心律失常的易感性、心肌肥厚和心功能异常
  使用乌头碱静脉微量注射诱导两株大鼠发生致死性心律失常,采用乌头碱导致心律失常的临界剂量和体重比值来评价动物心律失常的敏感性。
  结果:发现,导致两株大鼠心室早搏、心室纤维颤动和心脏停搏的乌头碱计量指数均无明显差异。心功能测定:8月龄ABR-DRs与ABR-NRs,使用小动物B超机测定每搏输出量、射血分数、室短轴缩短几率,心输出量等,均无显著差异。麻醉处死动物,取心脏、主动脉进行形态学测定。与ABR-NRs相比,除主动脉重量表现出一定差异(11.6±1.4mg/cm in ABR-NRs vs13.8±1.5mg/cm in ABR-DRs,P=0.027)以外,ABR-DRs的左心室、右心室等脏器指数均无显著差异,未表现出心肌肥厚症状。
  实验四:ABR-DRs疑核AMPA受体功能异常
  向两株大鼠疑核微量注射L-谷氨酸激活AMPA受体,或CNQX抑制AMPA受体。疑核微量注射L-谷氨酸(1nM,50nL)进行定位,若心率下降表明定位准确。每个实验结束后,向疑核注射100nL2%的滂胺天蓝溶液进行定位标记。首先向疑核微量注射L-谷氨酸(1nM,50nL),ABR-NRs的BRS增加约51%,ABR-DRs的BRS增加约29%(P<0.01)。再而向疑核微量注射CNQX(0.5nM,50nL),削弱或反转L-谷氨酸引发的BRS升高,结果显示,ABR-NRs的BRS显著下降(P<0.01),ABR-DRs的BRS下降幅度无显著差异。以上数据表明AMPA受体参与了疑核功能异常和反射功能低下。
  实验五:ABR-DRs疑核GluR2表达降低
  AMPA受体是脑内引起兴奋性突触后电位的主要受体。是由GluR1、GluR2、GluR3、GluR4构成的同四聚体或异四聚体。其中GluR2亚基决定了AMPA受体对Ca2+的通透性,与AMPA功能和表达关系最为密切。因此本课题重点研究疑核的GluR2亚型。
  向大鼠结状神经节注射逆向荧光示踪剂,借此标记疑核,1周后取延髓作冰冻切片,利用组织免疫荧光技术,激光共聚焦测定疑核的GluR2。同ABR-NRs相比,ABR-DRs动物疑核的GluR2数目(Amount)和平均光密度值(AOD)均显著低下(Amount,12%±1.6%in ABR-DRs vs22%±1.1%in ABR-NRs;AOD,9.5±0.2inABR-DRs vs13.4±0.6in ABR-NRs,P<0.01,n=5)。
  实验六:慢病毒过表达疑核GluR2增加ABR-DRs的BRS、血压,改善代谢综合征
  ABR-DRs脑立体定位疑核注射GluR2过表达慢病毒、对照和假手术,3周后取延髓冰冻切片,通过组织免疫荧光确定转染效率。病毒过表达后NA的GluR2表达数目上调约10%。成功感染慢病毒,继续常规饲养1月后,采用清醒测压技术检测BRS和血压。测定发现,与假手术和对照组相比,过表达组的BRS数值明显增加(假手术组0.33±0.067ms/mmHg vs过表达组0.59±0.20ms/mmHg,P<0.01),血压有降低趋势。
  过表达组、对照组和假手术组动物术后常规饲养4个月,测定空腹状态下的体重、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖、瘦素、谷丙转氨酶、尿素氮、尿酸、肌酐。
  结果:显示,较对照组和假手术组,过表达组的血脂、血糖水平均有显著降低,代谢综合征减轻。
  结论:
  (一)ABR-DRs主要表现为代谢综合征,出现超重、高血压、高血糖、高血脂等心血管危险因素的汇集状态。但未表现出心肌肥厚、心律失常和心功能异常。
  (二)ABR-DRs动物疑核的AMPA受体功能异常。其亚型GluR2缺陷可能是BRS低下关键分子机制。
  (三)过表达疑核的GluR2可改善ABR-DRs动物的动脉压力感受性反射功能,降低血压、血脂、血糖等,改善代谢综合征。
[硕士论文] 邵壮
内科学(风湿病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 风湿免疫性疾病所致动脉瘤的回顾性临床研究
  研究目的:
  本研究旨在通过回顾性分析探究风湿免疫性疾病所致动脉瘤的发病情况及临床特点,以期在今后的临床工作中更准确、合理地进行诊治。
  研究方法:
  选择2001年1月1日至2017年12月31日在海军军医大学(原第二军医大学)附属长海医院诊断动脉瘤的住院患者的病历资料作为总体研究对象,根据患者的既往病史、临床症状、体征、实验室结果、影像学及病理学结果筛选出风湿免疫性疾病所致动脉瘤,分析其病因构成、性别年龄差异、动脉瘤分布情况和影像学特点,并与其它非风湿免疫原因所致动脉瘤在年龄、病程、全身/局部症状、各系统受累情况、实验室指标等方面进行分析比较,使用SPSS19.0软件对结果进行统计学分析。
  研究结果:
  1、本次研究共纳入动脉瘤患者9174例,其中165例为风湿免疫性疾病所导致,在整体病因构成中约占1.80%,其中男性76例,女性89例,发病比例女性患者>男性(2.68%和1.30%,x2=22.707,P<0.001),出现多发性动脉瘤比例高于非风湿性疾病组(33.33%和18.09%,x2=25.101,P<0.001)。起病年龄与发生动脉瘤年龄(34.76±14.16岁;40.35±15.96岁)分别高于先天性动脉发育异常组(29.44±14.14岁,t=4.189;36.16±14.45岁,t=3.145;P<0.001),分别低于高血压/高脂血症/动脉粥样硬化组(53.42±10.22岁,t'=-16.832;61.08±12.44岁,t'=-16.576;P<0.001)、外伤/医源性损伤组(48.26±16.98岁,t'=-8.994;48.94圭16.91岁,t=-5.274;P<0.001)和致病微生物感染组(53.87±17.00岁,t=-8.069;54.44±17.05岁,t=-5.461;P<0.001);病程长于外伤/医源性损伤组(3.0和0.5年,U=8257.5,P<0.001)以及致病微生物感染组(3.0和0.5年,U=1400.5,P<0.001),短于高血压/高脂血症/动脉粥样硬化组(3.0和5.0年,U=507263.5,P<0.001)。
  2、风湿免疫疾病组患者中出现全身症状(包括疲劳乏力、发热、贫血和体重下降)的比例较高(46.67%和12.61%,x2=163.797,P<0.001),其中以疲劳乏力(43例,26.06%)最为常见;在局部症状和其它各系统受累方面,出现血管杂音、皮肤黏膜和关节肌肉病变的比例分别高于非风湿性疾病组患者(33.94%和14.22%,x2=50.613;13.33%和0.07%,x2=937.256;3.64%和0.08%,x2=145.013;P<0.001);在实验室检验方面,其血红蛋白(Hemoglobin,Hb)水平低于非风湿性疾病组患者(117.14±22.19和124.46±20.00g/L,t=-4.651,P<0.001),C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和红细胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)水平高于非风湿性疾病组患者(15.20和7.31mg/L,U=41492.5;28和15mm/H,U=40556.0;P<0.001)。
  3、风湿免疫性疾病所致动脉瘤的病因以大动脉炎(Takayasu arteritis,TA)(96例,58.18%)最为常见。不同性别间在病因构成方面存在差异(x2=50.937,P<0.001),其中男性多见于TA(31例,40.79%)、白塞病(Behcet's disease,BD)(16例,21.05%)和慢性主动脉周围炎(Chronic periaortitis,CP)(15例,19.74%),女性多见于TA(65例,73.03%)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)(13例,14.61%)和巨细胞动脉炎(Giant cell arteritis,GCA)(4例,4.49%)。病变血管以腹主动脉最常受累(80处,29.30%),不同疾病在其它受累动脉的分布上也存在一定差异。
  4、病理学及影像学检查对于临床诊断和鉴别诊断具有重要意义,但仍需要根据患者病情、临床症状、体征及实验室检验结果等综合判断。
  5、糖皮质激素(Glucocorticoids,GC)和免疫抑制剂仍然是治疗风湿免疫性疾病所致动脉瘤的经典药物。除动脉瘤体积过大或破裂等紧急情况外,建议在动脉炎症反应控制后进行外科干预,或者在外科治疗的同时使用药物治疗,必要时多学科协同诊治。
  研究结论:
  风湿免疫性疾病所致动脉瘤患者的发病比例女性高于男性,与其它病因动脉瘤患者相比,在起病年龄、发生动脉瘤年龄、病程时间方面存在差异。临床上出现多发性动脉瘤、全身症状、局部血管杂音、皮肤黏膜和关节肌肉受累的比例较高。实验室检验结果中Hb平均水平较低,CRP和ESR平均水平较高。TA是最常见的病因,不同性别间在病因构成方面存在差异,病变血管以腹主动脉最常受累。病理学及影像学检查对于临床诊断具有重要意义,GC和免疫抑制剂仍然是经典治疗药物,临床上需要根据患者病情、临床症状、体征及各种辅助检查结果多学科协同判断诊治。
  第二部分 96例大动脉炎动脉瘤的回顾性临床研究
  研究目的:
  通过前一部分研究发现,TA是风湿免疫性动脉瘤中最常见的病因。因此本部分研究旨在回顾性分析TA动脉瘤的发病规律、临床特征、疾病活动性和血管造影分型等方面情况。
  研究方法:
  选择2001年1月1日至2017年12月31日在海军军医大学(原第二军医大学)附属长海医院诊断TA的住院患者的病历资料作为总体研究对象,根据有无动脉瘤形成分为动脉瘤组和非动脉瘤组。回顾性分析患者的一般资料、临床症状和体征、动脉瘤特征、各系统受累情况、实验室及影像学检查结果,根据1996年Numano学组制定的标准进行分型,并应用印度大动脉炎临床活动性评分(Indian Takayasu Clinical Activity Score,ITAS2010)评估患者的疾病活动性,使用SPSS19.0软件对结果进行统计学分析。
  研究结果:
  1、本研究中TA患者共397例,其中并发动脉瘤患者96例,总体发生率约24.18%。患者出现动脉瘤的平均年龄为34.06±12.47岁,起病至出现动脉瘤的平均中位时间为2.0(1.0,3.0)年。TA动脉瘤组患者男女比例为1∶2.1,而男性作为TA动脉瘤的危险因素(OR=0.258,95%CI0.147-0.452,P<0.001),其发生动脉瘤比例明显高于女性(48.44%和19.52%,x2=24.486,P<0.001)。
  2、TA动脉瘤的发生部位以腹主动脉(39处,25.00%)最为常见,其后依次为颈动脉(24处,15.38%)、升主动脉(23处,14.74%)、胸降主动脉(22处,14.10%)和肾动脉(12处,7.69%)。与非动脉瘤组患者相比,TA动脉瘤组患者出现疼痛和血管杂音的比例较高(63.54%和36.88%,x2=21.076;51.04%和36.88%,x2=6.070;P<0.05),而脉搏减弱或消失发生比例较低(59.38%和76.08%,x2=10.084,P<0.05);出现心脏并发症、消化系统症状的比例较高(31.25%和15.95%,x2=10.797;15.63%和5.32%,x2=10.746;P<0.05),而神经系统症状发生比例较低(59.38%和73.09%,x2=6.491,P<0.05);在实验室检验方面,C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的平均水平较高(13.30和7.55mg/L,U=5582.5,P<0.05)。
  3、总体TA患者的血管造影分型以Ⅰ型(155例,39.04%)最为常见,动脉瘤组患者中则以Ⅴ型(30例,31.25%)最为常见。与非动脉瘤组患者相比,两组间在血管造影分型方面存在差异(x2=22.813,P<0.05),其中TA动脉瘤组患者出现Ⅰ型病变的比例较低(20.83%和44.85%,x2=17.641,P<0.05),而Ⅱa型病变的比例较高(11.46%和4.32%,x2=6.532,P<0.05)。
  4、糖皮质激素(Gluco corticoids,GC)仍然是治疗TA动脉瘤的一线药物,临床疾病活动性评估与实际疾病活动情况之间存在非一致性。药物治疗的目标是使病情得到有效控制,有必要在围手术期使用GC和/或其它免疫抑制药物治疗。
  研究结论:
  本次研究中TA动脉瘤的总体发生率约24.18%,男性作为TA动脉瘤的危险因素,其发生动脉瘤的比例明显高于女性,发生部位以腹主动脉最为常见。与非动脉瘤组患者相比,TA动脉瘤组患者出现疼痛、血管杂音、心脏并发症和消化系统症状的比例较高,而脉搏减弱或消失、神经系统症状发生比例较低;实验室检验结果中CRP的平均水平较高;血管造影分型以Ⅴ型最为常见,出现Ⅰ型病变的比例较低,而Ⅱa型病变的比例较高。GC仍然是一线治疗药物,临床疾病活动性评估与实际疾病活动情况之间存在非一致性,有必要在围手术期使用GC和/或其它免疫抑制药物使病情得到有效控制。
[博士论文] 鲍礼智
临床医学(内科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:慢性心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段,其中常见的原因是冠心病,特别是心肌梗死。慢性心衰预后较差,有统计表明整体生存率比恶性肿瘤更低。患者的生存质量逐年下降、医疗成本逐渐升高,引起社会的广泛关注。水潴留是心衰的重要病理生理机制,针对水潴留的利尿是心衰规范化治疗的基石。临床上最常用的袢利尿剂能选择性地阻断分布在髓袢升支管腔侧质膜上的Na+-K+-2CI-共转运子,抑制机体对氯化钠的重吸收,产生强大的利尿作用,但其应用也有一定的局限性。利钠治疗继发的低钠血症是影响心衰远期预后的危险因素,部分患者出现的利尿剂抵抗是临床常见的难题。因此,新的水代谢调控靶点和高效安全、特异性强的利尿药物研究一直是学术界关注的热点。
  水通道蛋白2(Aquaporin2,AQP2)分布于肾脏集合管主细胞的管腔顶质膜和胞浆的囊泡内,是调控集合管水通透性的关键通道蛋白,主要承担集合管腔水的重吸收和原尿浓缩的功能。AQP2在管腔顶质膜的分布及合成上调,进而增加水重吸收,是心力衰竭水潴留的最重要病理生理机制之一。针对调控AQP2蛋白开发的新型利尿剂显示出众多优越性,具有广阔的临床应用前景。
  肥胖抑制素obestatin是2005年由斯坦福大学张键博士等人发现的一种由23个氨基酸构成的多肽,经酰胺化修饰成为生物活性形式,在调节消化系统功能、体重变化、糖脂代谢、血管内皮功能等方面有广泛作用。中枢侧脑室给予obestatin可直接影响口渴中枢,减少机体的水摄入,同时通过抑制下丘脑的精氨酸加压素(AVP)的合成和释放,下调肾脏对水的重吸收。心力衰竭时外周循环obestatin水平升高,由于循环中obestatin不能通过血脑屏障进入中枢,那么外周循环obestatin对肾脏水重吸收是否有调节作用值得进一步研究。
  目的:目前在慢性心力衰竭机制研究中,关于obestatin和AQP2的作用鲜有报道。本课题旨在通过在体和体外实验,观察obestatin对水代谢和肾脏内髓AQP2的长时调控作用,通过基因芯片筛选差异表达基因以及基因沉默技术来分析其可能的调控机制。
  方法:利用临床常用器材,设计自制经口气管插管的定位防逆流装置和尾静脉穿刺用途的四联固定器,并在预实验中进行测试评估。采用开胸结扎前降支的方法构建大鼠急性心肌梗死模型,6周后通过心脏超声来筛选EF值≤45%的大鼠作为心力衰竭模型,随机纳入造模空白组、dDAVP组、V2受体拮抗剂组、obestatin高剂量组、obestatin低剂量组、NA-obestatin组、obestatin抗血清组等7组,加上假手术组共8组。分别尾静脉注射生理盐水、dDAVP、OPC31260、obestatin(200ug/kg)、obestatin(100ug/kg)、NA-obestatin、obestatin抗血清,连续注射14天。第15天(造模后第8周末)为实验终点并取大鼠肾脏内髓。实验全程定期测量尿量、体重,干预前后分别行心脏彩超检查及留取血尿样本。使用ELISA方法检测血BNP和血AVP水平,使用荧光定量PCR检测Aqp2基因表达,免疫组化和western blotting相对定量AQP2蛋白在肾脏内髓的表达情况。体外培养mIMCD3细胞,待细胞长至70%融合状态,无血清培养基空白12h后,分别给予不同时间节点(6h、12h、24h、36h、48h,10-7mmol/L的obestain)和不同干预措施(PBS、10-7mmol/L的obestatin、0.5×10-7mmol/L的obestatin、NA-obestatin、dDAVP、OPC31260、obestatin抗血清)的刺激,24h后分别提取RNA和蛋白,通过定量PCR和western blotting来检测AQP2基因和蛋白的表达水平。通过基因芯片对obestatin和PBS分别干预后的mIMCD3细胞mRNA进行差异表达基因筛查,通过生物信息学分析推测可能的调控机制并选取73个感兴趣的基因进行real-time qPCR验证。从验证后的基因中选取与水代谢密切相关的Pparg、V2r、Gpr39三个靶基因进行特异性敲减,观察obestatin调控AQP2表达的变化。
  结果:成功构建大鼠心梗后慢性心衰模型,成模率为51.16%。造模后8周,心衰模型各组间LVIDd、LVIDs、LVVold、LVVols、EF%、FS%等心功能指标以及血尿电解质组间比较无明显差异。Obestatin高剂量组与干预前相比24h尿量明显增加(75.18±8.51vs.40.77±5.49mL/kg,P<0.001)。Obestatin高剂量组与造模空白组相比,血浆BNP浓度明显下降(1152.61±99.31vs.1504.54±85.62pg/mL,P<0.001),血浆AVP无明显变化(12.13±0.74vs.12.41±1.04pg/mL,P>0.05)。Real-time qPCR及免疫组化、western blotting显示肾内髓AQP2基因和蛋白表达与造模空白组比较均下降。体外培养的IMCD3细胞经obestatin在不同时间点刺激后,AQP2基因和蛋白的表达量水平波动基本一致,与对照组(0h)相比,6h、12h、24h、36h和48h时间点AQP2的表达量显著降低(P<0.05),在6h-24h区间内,随着刺激时间的延长,其下降趋势越明显;但是36h后,其下降趋势呈现回升现象。体外培养的mIMCD3细胞分别给予不同措施刺激24h后,与假手术组相比,obestatin高剂量组、obestatin低剂量组以及OPC组AQP2基因和蛋白的表达量显著降低(P<0.05),与obestatin高剂量组相比,抗血清组AQP2基因和蛋白的表达量显著升高。在obestatin刺激后的mIMCD3细胞中表达差异有统计学意义的基因主要有Pparg、Aqp2、V2r、Fgf23、Myo1f、Slc8a1,可能参与长时调控的信号通路有FGF信号通路。敲减Pparg、V2r基因能使mIMCD3细胞的AQP2表达下调,同时给予obestatin刺激24h后,下调幅度更为显著。敲减Gpr39基因对mIMCD3细胞的AQP2表达无明显影响,但同时给予obestatin刺激后,能显著削弱obestatin对V2R、PPARG、AQP2的下调效应。
  结论:在体实验和体外实验证实了obestatin能下调肾脏内髓AQP2表达,在体实验还观察到利尿作用及心衰的生化指标好转。基因芯片筛查结果的生物信息学分析及定量PCR验证发现obestatin通过V2R与PPARG两条信号通路来下调IMCD3细胞的Aqp2基因表达,Myo1f、Slc8a1基因可能参与钙调蛋白结合和细胞骨架蛋白结合等分子生物学功能的调控。利用shRNA技术特异性敲减Pparg、V2r、Gpr39三个靶基因,在基因及蛋白水平证实了obestatin通过与GPR39受体相互作用来下调V2R、PPARG和AQP2的表达。
[博士论文] 邵柏棕
药理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:现今,炎症相关疾病的发病率逐年增加,严重危害人类的健康,其中,动脉粥样硬化和多发性硬化尤为显著。动脉粥样硬化已成为现代社会危害人类健康的杀手之一,可以继发心肌缺血、心肌梗死、血栓形成,甚至由于血栓脱落引起急性心血管事件的发生。动脉粥样硬化在病理上大体可分为四期,分别为脂质条纹期、纤维斑块期、粥样斑块期及晚期继发改变期,泡沫细胞的形成是粥样斑块形成的病理基础。现在普遍认为,泡沫细胞主要来源于聚集于动脉内膜下的巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞,其中更多的泡沫细胞来源于巨噬细胞,其形成过程主要为血液中的单核细胞聚集于内膜受损动脉的内膜下转变为巨噬细胞,巨噬细胞吞噬异常聚集于血管壁内膜下层的氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoproteins,oxLDL)及其它修饰的脂蛋白,进而转变成为泡沫细胞。多发性硬化是一种炎症相关的神经退行性变,多发生在青少年,是致畸致残的主要疾病。目前认为,多发性硬化的主要病因是中枢神经系统的慢性炎症,其中,小胶质细胞作为中枢神经系统中的巨噬细胞发挥着重要的作用。因此,抑制小胶质细胞介导的炎症免疫反应在多发性硬化的防治工作中尤为关键。尽管已有很多研究探讨动脉粥样硬化和多发性硬化的防治,然而,两者发生发展的机制尚未阐明,有效的疾病防治手段仍需探索。β-arrestin-1蛋白属于β-arrestins蛋白家族,是一种多功能的胞浆调节蛋白。传统认为,其主要功能是参与G蛋白偶联受体的调节作用,主要使G蛋白偶联受体发生内吞或脱敏;然而,近年来的研究表明,β-arrestin-1可以作为支架蛋白参与多种G蛋白偶联受体依赖或非依赖的信号通路。已有报道指出,β-arrestin-1在多种疾病中发挥重要作用。在动脉粥样硬化中,已有研究表明,血管平滑肌中的β-arrestin-1可以通过抑制内皮下平滑肌的增殖、迁移进而降低斑块的新生内膜增生,从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而,巨噬细胞中的β-arrestin-1在动脉粥样硬化中的作用及其机制尚无文献报道。此外,在多发性硬化中,敲除β-arrestin-1的小鼠其发生多发性硬化(EAE)的疾病严重程度显著降低,说明了β-arrestin-1在多发性硬化中的作用,然而,巨噬细胞(小胶质细胞)中的β-arrestin-1作用及其具体机制尚未明确。本课题对巨噬细胞中的β-arrestin-1在动脉粥样硬化和多发性硬化中的作用及其机制进行研究,主要分为三个部分:第一部分实验中,探究了巨噬细胞β-arrestin-1在动脉粥样硬化中的保护作用,这种保护作用的实现有自噬过程的参与;第二部分实验中,发现巨噬细胞β-arrestin-1参与了α7nAChR介导的抗动脉粥样硬化作用;第三部分实验中,探讨巨噬细胞β-arrestin-1参与调控了α7nAChR的抗多发性硬化作用。
  (一)巨噬细胞β-arrestin-1通过自噬发挥抗动脉粥样硬化作用
  自噬是机体重要的代谢机制,主要降解细胞内的长程蛋白、折叠错误的蛋白和受损细胞器,其功能的实现依赖于溶酶体。已有报道,自噬在多种疾病的发生发展中发挥重要的作用。在动脉粥样硬化中,诱导自噬有利于缓解粥样斑块巨噬细胞的炎症及免疫反应,并通过抗凋亡、增加胆固醇流出发挥抗动脉粥样硬化的作用。对于β-arrestin-1与自噬的关系,教研室的前期研究表明,神经元中β-arrestin-1可以诱导自噬水平的增加,从而保护神经元。然而,在动脉粥样硬化中尚无相关报道。在这一部分中,旨在探讨巨噬细胞β-arrestin-1抗动脉粥样硬化的自噬机制。该部分实验的具体结果简述如下:
  (1)检测发生动脉粥样硬化时斑块巨噬细胞β-arrestin-1的表达
  通过Western blot检测正常小鼠与动脉粥样硬化疾病模型小鼠主动脉中的β-arrestins表达,发现与正常小鼠相比,疾病模型小鼠主动脉中的β-arrestin-1水平显著增高。进一步通过组织免疫荧光技术检测发现斑块巨噬细胞中有β-arrestin-1蛋白的高表达。
  (2)构建髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除的动脉粥样硬化小鼠模型
  通过Cre-LoxP系统构建髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠,并通过骨髓移植的方法构建ApoE-/-背景下的髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠,继以喂以高脂饮食4个月造成动脉粥样硬化小鼠模型。
  (3)巨噬细胞β-arrestin-1的抗动脉粥样硬化作用
  通过油红O染色、免疫组织化学染色、Masson染色及天狼星红染色检测发现,发生动脉粥样硬化时,与野生型小鼠相比,髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的主动脉斑块面积显著增加,主动脉斑块的稳定性下降,进一步检测血脂水平,发现髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的总胆固醇及低密度脂蛋白水平增加,高密度脂蛋白水平下降。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1通过自噬机制的参与发挥抗动脉粥样硬化的作用。
  (二)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用
  α7n型乙酰胆碱能受体(α7nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)是一种n型乙酰胆碱能受体亚型。近年来研究表明,α7nAChR通过胆碱能抗炎通路发挥抗炎作用。α7nAChR在多种疾病中发挥作用,其中在动脉粥样硬化中,广泛认为,激动α7nAChR具有抗动脉粥样硬化的作用,然而,其具体分子机制仍不明确。在这一部分实验中,旨在探讨巨噬细胞β-arrestin-1是否参与介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用。取得的具体结果简述如下:
  (1)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗动脉粥样硬化作用
  通过油红O染色、免疫组织化学染色、Masson染色及天狼星红染色检测发现,发生动脉粥样硬化时,激动α7nAChR可以显著降低小鼠的主动脉斑块面积,增加主动脉斑块的稳定性,而髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除很大程度上降低这种效果;进一步检测血脂水平,发现激动α7nAChR可以显著降低总胆固醇及低密度脂蛋白水平,而巨噬细胞特异性β-arrestin-1敲除很大程度上抑制这一效果。
  (2)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抗泡沫细胞形成作用
  在小鼠巨噬细胞上通过油红O染色及细胞水平胆固醇检测,发现激动α7nAChR可以显著降低泡沫细胞的形成比例,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。进一步通过Real-time PCR检测发现,激动α7nAChR可以显著提高与胆固醇流出呈正相关的ABCA1及ABCG1载体的表达水平,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。
  (3)巨噬细胞β-arrestin-1介导α7nAChR的抑制巨噬细胞迁移作用
  通过Transwell细胞迁移实验检测巨噬细胞的迁移水平,发现激动α7nAChR显著降低巨噬细胞的迁移水平,而敲除β-arrestin-1极大地缓解这一作用。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1通过介导α7nAChR的保护作用发挥抗动脉粥样硬化的作用。
  (三)巨噬细胞β-arrestin-1调控α7nAChR的抗多发性硬化作用
  激动α7nAChR在多发性硬化中发挥重要的抑制作用,主要是通过其介导的胆碱能抗炎通路抑制中枢神经系统中小胶质细胞引起的炎症反应。然而,其具体分子机制仍不明确。在这一部分实验中,旨在探讨巨噬细胞(小胶质细胞)β-arrestin-1是否参与调控α7nAChR的抗多发性硬化作用。取得的具体结果简述如下:
  (1)检测发生多发性硬化时脊髓中小胶质细胞β-arrestin-1的表达变化
  通过Real-time PCR技术、Western blot技术和免疫组织荧光技术检测发现,发生EAE时,脊髓和脊髓小胶质细胞中β-arrestin-1蛋白水平显著提高。
  (2)LPS/ATP刺激的BV2细胞中β-arrestin-1蛋白调节激动α7nAChR的抗炎作用
  通过Western blot技术检测发现,在LPS/ATP刺激下的BV2细胞中,应用PNU282987激动α7nAChR显著抑制了NLRP3炎性小体的激活,而过表达β-arrestin-1蛋白极大地抑制了激动α7nAChR的这一作用。
  (3)LPS/ATP刺激的BV2细胞中激动α7nAChR抑制β-arrestin-1蛋白与NLRP3蛋白的结合
  通过细胞免疫荧光技术和免疫共沉淀技术检测发现,在BV2细胞中,LPS/ATP刺激显著增加了β-arrestin-1和NLRP3蛋白的结合,而应用PNU282987激动α7nAChR显著降低了β-arrestin-1和NLRP3蛋白的结合水平。
  结论:巨噬细胞β-arrestin-1负向调控α7nAChR介导的抗多发性硬化作用。
[硕士论文] 张艳达
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在急性心肌梗死患者中,其冠脉微血管系统常由于缺血再灌而发生不可逆损伤,最终导致缺血心肌血流供应再度减少,加重损害。相对于大血管,微循环约占机体脉管系统的20%,其在心肌组织中与心肌细胞的比例接近1∶1,但其作用尤其在冠脉血管疾病中的作用长久以来一直被人们所忽视。随着研究的深入,临床医生越来越认识到冠脉微循环障碍的重要性。由于相关的机制不清,当前尚缺乏有效手段来直接干预冠脉微循环障碍。因此,探究冠脉微循环障碍的发病机制及探寻行之有效的治疗举措便显得尤为重要。麝香通心滴丸已在临床上被证实具有明确的改善冠脉慢血流患者症状的作用,但是其是否通过直接作用于微循环,以及具体的作用的机制尚不清楚。本课题将探究麝香通心滴丸对模型小鼠的外周微循环障碍的改善作用及其可能作用的机制?
  目的:
  明确麝香通心滴丸溶液对急性心肌梗死联合腹腔脂多糖注射诱导的小鼠外周微循环障碍的改善作用并探讨其相关机制。
  方法:
  1、诱导小鼠外周微循环障碍模型:选用6周至8周C57雄性小鼠(20±2g)50只,随机分为假手术对照组(Control组)、微循环障碍模型组(急性心梗联合脂多糖诱导(MI+LPS)组)、模型联合麝香通心滴丸干预(SXTXDW)组、模型联合麝香通心滴丸及炔丙基甘氨酸干预(SXTXDW+PAG)组、模型联合硫氢化钠干预(NaHS)组。假手术对照组小鼠在异氟烷麻醉下行开胸但冠状动脉不结扎处理,而后四组小鼠在气麻下行冠脉前降支结扎手术,以标准Ⅱ导心电图ST段抬高作为判定标准。心梗手术1周后予以假手术对照组小鼠腹腔注射200ul生理盐水,而MI+LPS组、SXTXDW组、SXTXDW+PAG组和NaHS组小鼠腹腔注射脂多糖溶液(2mg/kg)。采用Evan Blue合并TTC染色、小动物心电图评估小鼠心肌梗死情况,小动物超声评估小鼠心功能。
  2、麝香通心滴丸改善模型小鼠外周微循环的作用:腹腔注射LPS24小时后给予不同组的小鼠相对应的干预措施。采集图像并分析提睾肌微循环血流速度和白细胞粘附数。运用激光多普勒测定小鼠肠管血流灌注情况。通过流式细胞仪检测小鼠白细胞表面CD11b和CD62L表达改变。实验终点,处死小鼠,留取提睾肌、心肌、白细胞和主动脉标本,检测以上标本CSE相对表达量。
  3、麝香通心滴丸改善模型小鼠外周微循环的可能分子机制:通过DAPI染色评估不同干预组小鼠白细胞体外粘附水平,并对可能参与调解的FOXO1相对表达量及其线粒体DNA相对拷贝数进行分析。
  结果:
  1、与Control组相比,MI+LPS组小鼠心功能、提睾肌微血管血流速度和肠管血流灌注量明显降低(p<0.05)。提示:急性心梗手术合并腹腔注射脂多糖可诱导小鼠外周微循环障碍。
  2、与Control组相比,MI+LPS组小鼠及SXTXDW+PAG组小鼠微循环血流速度和肠管血流灌注显著降低,同时伴有微循环中白细胞粘附数目增加,白细胞表面CD11b表达异常增高,CD62L表达下调。无论是SXTXDW还是NaHS都可显著提高小鼠提睾肌微循环血流速度和肠管血流灌注,降低白细胞粘附,以及白细胞表面CD11b的表达,上调CD62L的表达(p<0.05)。与Control组相比,MI+LPS组小鼠提睾肌、心肌和白细胞CSE表达减弱,而SXTXDW干预则可上调提睾肌、心肌和白细胞CSE的表达(p<0.05)。提示:麝香通心滴丸可显著改善小鼠外周微循环障碍,其机制可能涉及硫化氢相关通路。
  3、与Control组相比,MI+LPS组小鼠白细胞体外粘附数目增多,白细胞FOXO1表达增强,白细胞线粒体DNA相对拷贝数显著减少(p<0.05)。而SXTXDW干预则可降低白细胞体外粘附数目减少,下调白细胞FOXO1表达,提高白细胞线粒体DNA相对拷贝数(p<0.05)。提示:麝香通心滴丸可以显著降低体外白细胞粘附数,并可提高线粒体活力。
  结论:
  麝香通心滴丸通过促进内源性硫化氢合成,下调白细胞FOXO1表达,从而改善白细胞CD11b表达以及白细胞线粒体活力,进而发挥改善微循环的作用。
[硕士论文] 牛文豪
内科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:青年心肌梗死发生率在全球范围内呈上升趋势,尤其是在中国这样的人口大国。然而,目前国内外对该人群临床特点及危险因素研究尚不足。
  方法:自2015-01-01至2016-12-31本研究从上海4家三级甲等医院共收集380例病例(其中青年心梗143例、老年心梗237例),并对两组人群临床特点、危险因素、冠脉病变严重程度、心脏超声特点、发病时间的节律特点及预后进行多中心回顾性研究及统计分析。同时收集24例青老年心梗患者(青年心梗患者12例,老年心梗患者12例)分析其CLOCK和TM-1基因表达。
  结果:青年心肌梗死患者与老年心肌梗死患者相比,男性(95.80%VS74.26%)、吸烟(68.53%VS26.16%)高于老年组(P<0.01)。而老年心肌梗死患者的高血压病史(71.31%VS36.36%)、糖尿病病史(38.82%VS12.59%)明显高于青年组(P<0.01)。青年患者的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白水平均明显高于老年组(P<0.01),而老年患者BNP明显高于青年患者(P<0.01)。至于心脏彩超方面,青年患者左室舒张末期内径(LVEDd)较老年患者高(P<0.01),但两组射血分数无统计学差异。冠状动脉造影显示,青年患者单支病变者高于老年患者(P<0.01),而老年患者多支病变多于青年患者(P<0.01),青年患者与老年患者相比,左前降支(LAD)病变无统计学差异,但左主干(LM)、左回旋支(LCX)及右冠状动脉(RCA)病变更多见于老年组(P<0.05、P<0.01、P<0.01),青年患者比老年患者Gensini评分低,且有统计学意义(P<0.01)。两组患者预后方面,老年患者平均住院日及住院死亡率均高于青年患者(P<0.01;P<0.05)。相比较老年患者,青年患者以06:00-12:00发病率较高(P<0.01),对两组患者上午10:00CLOCK与TM-1基因分析发现,青年患者CLOCK表达较老年高,而TM-1表达比老年患者低(p<0.05)。
  结论:青年心肌梗死发病的危险因素主要有男性、吸烟史、高总胆固醇、高甘油三酯、高低密度脂蛋白胆固醇等,而且常见于清晨发病,青年患者上午CLOCK表达较高,TM-1表达较低,可能是其清晨高发的机制。针对这些青年心肌梗死人群应根据其独特的临床特点做到早预防、早发现、早治疗,以便降低其死亡率、改善预后。
[硕士论文] 李天
生物医学工程 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:构建具有心脏特异性表达的重组腺相关病毒(rAAV9-AR185-EGFP和rAAV9-AR117-EGFP),并制备rAAV9-AR185-EGFP和rAAV9-AR117-EGFP两种病毒制剂,检测在大鼠体内的转染效果。
  建立大鼠心力衰竭模型,通过腺相关病毒载体携带的胞内抗体改变大鼠心脏中RyR2蛋白的磷酸化水平,研究AR185抗体对大鼠心脏功能和结构的影响,探讨使用胞内抗体治疗心衰的可能性。
  研究AR185抗体对大鼠单个心肌细胞的钙稳态和收缩功能的保护作用,进一步探讨RyR2蛋白过度磷酸化在心衰病理过程中的作用和影响机制。
  方法:以课题组前期筛选获得的AR185抗体为目的基因,以重组9型腺相关病毒(rAAV9)为载体,构建相应的rAAV9-AR185-EGFP穿梭质粒。体外转染293T细胞制备病毒制剂,通过尾静脉注射的方式在大鼠体内转染AAV9-AR185-EGFP并检测其体内转染效果。
  建立动物模型,进行实验分组,将大鼠分成4组。分别是Sham组(n=7),开胸后缝合,尾静脉注射生理盐水;HF组(n=7),进行心梗手术(结扎大鼠心脏冠脉左前降支),尾静脉注射生理盐水;AAV-AR117组(治疗对照组,n=8),心梗手术,尾静脉注射rAAV-AR117-EGFP;AAV-AR185组(治疗组,n=8),心梗手术,尾静脉注射rAAV-AR185-EGFP。
  手术8周后,使用小动物超声系统检测大鼠心脏功能;检测各组大鼠心重体重比;取大鼠心脏于4%PFA固定液中固定,包埋后切片进行HE染色、Massion染色,比较各组间大鼠心脏显微变化;取大鼠心肌组织左心室部分,完成常规组织样品的制作,使用透射电镜观察并拍摄电镜图像,比较各组间大鼠心肌超微结构变化。
  使用酶解法急性分离获得独立的大鼠心肌细胞,Fluo5N-AM胞内荧光钙离子探针孵育部分心肌细胞,使用激光扫描共聚焦荧光显微镜系统(laser scanning confocal microscopy,LSCM)检测心肌细胞肌浆网内的荧光强度;Fluo4-AM胞内荧光钙离子探针孵育部分心肌细胞,使用LSCM系统检测咖啡因诱导的钙瞬变幅度和心肌细胞静息期钙泄漏发生频率;使用IonOptix单细胞收缩检测系统检测电刺激下各组大鼠心肌细胞收缩能力。
  结果:成功制备AAV9-AR185-EGFP和AAV9-AR117-EGFP病毒制剂。尾静脉注射AAV9-AR185-EGFP病毒制剂四周后,在大鼠心脏组织中观察到明显的绿色荧光蛋白表达,其他器官组织中未检测到明显荧光信号。
  对各组大鼠心功能指标进行分析,与Sham组(n=7)相比,HF组(n=7)大鼠EF%及FS%均明显降低(EF%:32.49±6.46VS80.49±6.40,P<0.01;FS%:16.88±4.25VS47.65±4.30,P<0.01);LVEDV和LVESV都明显增大(LVEDV:498.74±62.97VS227.10±33.94,P<0.01;LVESV:343.75±43.05VS55.97±9.75,P<0.01)。同时,与AAV-AR117组(n=8)相比,AAV-AR185组(n=8)大鼠各项超声指标都有所改善,EF%和FS%明显变高(EF%:60.57±7.60VS31.30±6.22,P<0.01;FS%:37.72±3.31VS16.66±4.60,P<0.01);LVEDV和LVESV结果变小(LVEDV:432.62±37.02VS515.56±59.00,P<0.01;LVESV:187.22±44.06VS341.63±44.70,P<0.01)。
  对各组大鼠心肌组织显微及超微结构进行研究可以发现,与Sham组结果相比,HF组大鼠心室腔扩增,前间隔运动幅度减小,手术处心肌组织纤维化现象明显;肌丝排列疏松杂乱,线粒体出现大量损伤。与AAV-AR117组结果相比,AAV-AR185组大鼠心肌组织中肌丝排列基本正常,线粒体状态较好,恶性的心肌重构现象得到明显遏制。
  对各组大鼠心肌细胞肌浆网钙容量、钙瞬变、钙泄漏以及心肌细胞收缩能力进行分析,HF组大鼠心肌细胞(n=30)肌浆网钙容量较Sham组(n=30)显著降低(Fluo5N-AM:26.7±1.4VS49.3±3.1,P<0.01);钙瞬变幅度降低(Fluo4-AM:16.7±1.4VS34.5±2.5,P<0.01),同时舒张期钙释放发生频率增加(75.5±7.6VS3.7±1.6,P<0.01)。此外缩短分数,收缩舒张速度等细胞收缩评价指标的结果都显示来自衰竭心脏的心肌细胞在受到电刺激时收缩能力明显受到损害。与AAV-AR117组(n=30)结果相比,AR185抗体的表达(n=30)可以增加心衰大鼠心肌细胞肌浆网内的钙容量(Fluo5N-AM:42.1±2.2VS26.5±1.6,P<0.01);钙瞬变幅度增强(Fluo4-AM:28.6±2.7VS16.8±1.2,P<0.01),舒张期钙释放发生频率显著降低(6.8±1.6VS73.5±7.3,P<0.01),电刺激时的细胞收缩功能各项指标都有所改善。
  结论:本实验中构建和制备的rAAV9-AR185及rAAV9-AR117在体内转染效果良好具有心脏特异性,符合开展后续动物实验研究的要求。
  心衰时RyR2蛋白磷酸化水平明显升高,RyR2蛋白过度磷酸化在心衰的病理过程扮演着重要角色,在心脏整体水平上,AR185抗体改善衰竭心脏的收缩功能,保护心脏结构,减轻不良重构的影响。在细胞水平上,AR185抗体可以一定程度上减少心衰大鼠心肌细胞的钙泄漏现象,维持肌浆网中的钙容量,恢复钙稳态,保护心肌细胞的收缩能力。
  RyR2蛋白在心衰治疗中是非常有潜力的靶点,胞内抗体技术是一种很有前景的基因治疗方法。
[博士论文] 李卓东
外科学(胸心外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题通过建立主动脉夹层外科治疗数据库并以其为基础完成本中心2014年1月1日至2016年5月31日期间主动脉夹层患者临床数据的登记工作,通过筛选其中急性A型主动脉夹层患者的临床资料对疾病的发病特点、术前夹层破裂死亡、手术死亡的围术期危险因素做回顾性分析,讨论目前治疗过程中可能存在的问题并探讨进一步提高治疗水平的方法。
  方法:
  一、单中心主动脉夹层治疗数据库的建立
  参考国内首次多中心主动脉夹层治疗登记的资料并通过科室讨论、专家咨询,制定出患者临床资料的登记表格,收集本中心2014年1月1日至2016年5月31日期间收治的主动脉夹层患者资料,与第二军医大学计算机网络中心合作,完成数据库及网络信息平台的软件开发及调试工作,将收集的患者资料录入、核对及上传,完成患者资料的电子化。
  二、急性A型主动脉夹层临床分析
  1、筛选急性A型主动脉夹层患者的临床资料,分析其性别构成、年龄分布、发病季节、地区分布等流行病学特点。
  2、分析患者发病后的临床表现、既往疾病史、入院后检查及检验结果等情况。
  3、分析患者治疗及预后情况。
  三、急性A型主动脉夹层术前破裂死亡危险因素分析
  1、筛选急性A型主动脉夹层患者的临床资料,分为破裂组和非破裂组,分析两组患者性别、年龄、发病时间、入院时间、破裂死亡时间、手术时间、发病后临床表现、既往史、入院检查及血检验情况。
  2、根据两组患者对比分析结果,选择两组间差异有统计学意义的因素进行单因素分析,确定潜在危险因子。
  3、进行多因素二分类Logistic分析,确定夹层破裂死亡的独立危险因素。
  四、急性A型主动脉夹层手术死亡危险因素分析
  1、筛选手术治疗的急性A型主动脉夹层患者的临床资料,分为死亡组和存活组,对比分析两组患者性别、年龄、发病时间、入院时间、手术时间、发病后临床表现、既往史、入院检查及血检验情况、手术内容及术后并发症的发生情况。
  2、根据两组患者对比分析结果,选择两组间差异有统计学意义的因素进行单因素分析,确定潜在危险因子。
  3、进行多因素二分类Logistic分析,确定手术死亡的独立危险因素。
  结果:
  一、单中心主动脉夹层治疗数据库的建立
  1、根据科室出入院登记、ICU出入室记录、体外循环手术记录等多数据核实,收集主动脉夹层患者456例并完成资料登记。
  2、通过电子表单完成患者资料的录入及保存,通过网络信息平台完成数据上传,实现患者资料电子化,建成可持续扩充的主动脉夹层患者数据库。
  二、急性A型主动脉夹层临床分析:
  1、全组共329例患者,其中96.0%的患者为DebakeyⅠ型。发病人数从11月至第二年3月期间明显增多,本组患者发病的高峰年龄在41-60岁,男女比为3.9∶1(262∶67),女性患者平均年龄高于男性患者(54.5±12.8岁VS50.2±13.1岁,P=0.017);66.0%的患者有高血压,其中仅31.8%的患者血压控制在正常范围;32例为马凡综合征患者、主动脉瓣二叶瓣畸形患者4例。
  2、大部分患者主动脉破口位于升主动脉(31.9%)及主动脉弓部(37.1%),少数患者内膜破口位于主动脉根部(8.8%);62.0%的患者发病后白细胞高于正常值,其与患者年龄、发病时间、氧饱和度有一定相关性;87.2%的患者发病后D-二聚体快速升高,6-8小时达到峰值,发病后14天内仍高于正常值。
  3、本组急性A型主动脉夹层患者住院死亡率20.1%(66/329),手术率75.1%(247/329),手术死亡率9.3%(23/247),非手术死亡52.4%(43/82),破裂死亡占所有死亡患者总数的47.0%(31/66)。
  三、急性A型主动脉夹层术前破裂死亡危险因素分析
  1、本组329例ATAAD患者中,术前破裂死亡31例,经多因素二分类Logistic分析发现:ATAAD患者发病合并休克(OR:19.11,P<0.001)、疼痛症状需要药物控制或药物控制不良(OR:10.88,P<0.001)、入院后肌钙蛋白检测值>0.7ng/ml(OR:6.24,P=0.002)、D-二聚体检测值≥10μg/ml(OR:25.88,P<0.001)是住院夹层破裂死亡的独立危险因素。
  2、本组ATAAD患者中,男性患者是女性患者的3.9倍,而破裂组男性患者是女性患者2.9倍(23∶8),但性别并非夹层破裂死亡的危险因素(P=0.135);本组患者年龄是夹层破裂的影响因素,但年龄≥60岁(P<0.001)对夹层破裂的影响需进一步考证。
  3、ATAAD患者发病后合并昏迷(P<0.001)、肢体脉搏减弱或消失(P=0.002)、PaO2<80mmHg(P=0.027)、尿素氮>8mmol/L(P=0.037)、ALT≥130U/L(P<0.001)、乳酸≥3mmol/L(P=0.007)等是夹层破裂的影响因素,但不是独立危险因素。
  四、急性A型主动脉夹层手术死亡危险因素分析
  1、本组247例ATAAD手术患者,术后30天内死亡23例,经多因素分析,手术死亡有统计学意义的独立危险因素有:年龄≥68岁(OR:14.78,P=0.005),合并休克(OR:13.50,P=0.034),肌钙蛋白>0.67ng//ml(OR:34.95,P<0.001),D-二聚体>13.1μg/ml(OR:11.79,P=0.002),术后呼吸功能不全(OR:4.58,P=0.032),术后肝功能不全(OR:32.47,P<0.001)。
  2、本研究未能得性别(P=0.416)、体重指数(P=0.434)、既往疾病史等流行病学因素对急性A型主动脉夹层手术的危险性存在影响的结论,而入院收缩压<105mmHg(P=0.004)、术前肝功能不全(P=0.001)、术前肾功能不全或衰竭(P=0.006)、主动脉脉瓣关闭不全(P=0.031)、二尖瓣关闭不全(P=0.024)、三尖瓣关闭不全(P=0.004)及EF<50%(P=0.006)等在单因素分析中显示对手术死亡有影响,本组手术因素对患者不良预后无明显影响。
  结论:
  1、通过制定主动脉夹层数据登记表收集患者信息、以电子表单进行数据录入、上传至网络信息平台进行数据存储管理等方式成功构建了单中心主动脉夹层数据库。
  2、与既往文献报道结果相一致,急性A型主动脉夹层的发病在冬季明显增多,男性多于女性,高血压控制不良为主要发病原因,大部分患者发病后血D-二聚体快速升高,6-8小时达到峰值,发病后14天内仍高于正常值;该病发病后死亡率极高,夹层破裂死亡是主要的死亡原因,目前手术死亡率远低于住院死亡率;本组患者手术率仍偏低,进一步提高手术率能降低住院死亡率,改善患者预后。
  3、发病合并休克、疼痛症状需要药物控制或药物控制不良、入院后肌钙蛋白检测值>0.7ng/ml、D-二聚体检测值≥10μg/ml是急性A型夹层破裂死亡的独立危险因素;患者年龄、发病后合并晕厥、昏迷、偏瘫、呼吸功能不全、肢体脉搏减弱或消失、入院时乳酸≥3mmol/L等是夹层破裂的影响因素,但不是独立危险因素。
  4、年龄≥68岁、合并休克、肌钙蛋白>0.67ng//ml、D-二聚体>13.1μg/ml、术后呼吸功能不全、术后肝功能不全,是急性A型主动脉夹层手术死亡的独立危险因素;入院血压、术前肝/肾功能不全、心脏瓣膜及心肌功能等是影响手术预后因素。
  5、本研究的结论与既往文献报道相比具有共同性及相异性,其原因主要与本课题研究对象的来源特点、病情特点等原因密切相关。
[硕士论文] 胡思颖
全科医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:静脉血栓栓塞症是目前恶性肿瘤的一种常见并发症,而肺癌作为我国发病率最高的恶性肿瘤受到人们高度关注和重视。国内外的多项研究提示静脉血栓栓塞症与肺癌的治疗和预后密切相关。合并VTE的肺癌患者预后差,死亡率更高,而规范的预防性抗凝治疗可降低VTE的发生率。由此可见,认识肺癌合并VTE的高危因素及高发时段,并做到早期预防、早期诊断及早期治疗有着十分重要的临床意义。
  研究目的:
  分析合并静脉血栓栓塞症肺癌患者的临床特征,探寻肺癌患者发生VTE的高危因素,提高对高风险患者的预防及诊断意识。观察预防性抗凝在我院肺癌病人中的应用情况,并对比预防性抗凝治疗前后患者实验室指标的变化情况,了解预防性抗凝治疗的必要性和相关风险。
  研究方法:
  回顾性分析海军军医大学附属长海医院2012年6月至2016年6月共收治的2325例肺癌患者,选取其中有完整病历资料的50例合并静脉血栓栓塞症的患者为研究组(VTE组),分析VTE的临床特征(发生时间、发生部位、临床表现、治疗方式及临床转归)。随机选取同期入院但未合并静脉血栓栓塞症的100例肺癌患者作为对照组(非VTE组)。记录和分析两组患者的一般情况(包括年龄、性别、合并基础疾病、吸烟史),肿瘤相关情况(包括肺癌病理类型、TNM分期及肿瘤治疗方式),是否预防性抗凝治疗,实验室检查(包括凝血功能,白细胞计数,血红蛋白及血脂等)。并选取上述150例患者中预防性抗凝的47例患者作为研究对象(干预组),未预防性抗凝的103例患者为未干预组,记录干预组患者当次及下一次入院时凝血功能指标、白细胞计数及血红蛋白,对比两者是否有统计学差异。所有数据均应用SPSS21.0统计软件对结果进行统计处理和分析,检验水准α=0.05,以P<0.05差异具有统计学意义。
  研究结果:
  静脉血栓栓塞症在肺癌确诊后的6个月内发生率高达78.0%,以下肢深静脉血栓和肺血栓栓塞症最为多见。合并静脉血栓栓塞症组和未合并静脉血栓栓塞症组单因素分析结果显示,VTE组血浆D-二聚体、自细胞计数、凝血酶原时间高于非VTE组(P<0.05),肺腺癌、晚期肺癌患者(Ⅲb-Ⅳ期)、放疗、化疗的患者VTE发生率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。预防性抗凝治疗的患者静脉血栓栓塞症发生率明显低于未预防抗凝的患者(12.8%VS47.7%),P<0.001。多因素回归分析显示腺癌、化疗及凝血功能异常D-二聚体水平升高是肺癌患者合并静脉血栓栓塞症栓塞的独立危险因素(P<0.05),预防性抗凝治疗可以降低肺癌患者VTE的发生率,12.8%VS47.7%,(P<0.001)。预防性抗凝的肺癌患者血浆D-二聚体较前有明显下降,统计学有明显差异(P<0.05),凝血酶原时间、部分凝血酶原时间、纤维蛋白原、白细胞计数、血红蛋白等指标均未存在统计学差异性。
  研究结论:
  肺腺癌、化疗、D-二聚体升高是肺癌合并VTE的独立危险因素;静脉血栓栓塞症多发生在肺癌确诊后的6个月内。预防性抗凝治疗可以明显降低肺癌患者血浆D-二聚体水平,有效降低VTE的发生率。而对其他凝血功能指标及白细胞,血红蛋白等均无明显影响。预防性抗凝患者出血风险并未增加。临床上应对具有以上高危因素及处于高发时段的肺癌患者提高警惕,积极检查,早期诊断,并给予及时预防性抗凝治疗干预,降低VTE的发生率。
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