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[硕士论文] 徐俊
外科学(普通外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究将探讨在脓毒症发生过程中Robo4基因表达对EPCs数量和功能的影响,及其诱导EPCs定向分化作用,为临床防治脓毒症探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。
  本研究共分为三个部分,首先通过基因敲除技术构建Robo4-/+、Robo4-/-小鼠,通过盲肠穿孔+腹腔注射内毒素(LPS)制造出创伤后基因敲除小鼠的脓毒症模型。然后动态观察创伤后脓毒症发展过程中EPCs内Robo4表达水平和内皮祖细胞数量变化。最后对三种不同基因表达小鼠骨髓来源的EPCs进行体外培养和功能鉴定。
  第一部分 多器官功能障碍小鼠模型的建立
  目的:建立基因敲除小鼠脓毒症模型,为研究Robo4影响内皮祖细胞增殖和分化提供实验基础。
  方法:将体重20-25g的Robo4-/+、Robo4-/-和WT三种基因类型的小鼠100只分为2组:实验组(M组)90只,施行腹腔内毒素注射+盲肠穿孔;对照组(C组),施行假手术。观察各组动物的症状、体征、生存率、脏器功能指标(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并观察主要脏器的大体及显微镜下病理改变。
  结果:实验组小鼠的症状、体征与功能指标均发生明显变化,肺、肝、心、肾及胃肠道等脏器病理改变严重。实验组和对照组MODS发生率为(82.2%,0),死亡率(75%,10%),显著高于对照组。
  结论:采用腹腔注射内毒素+盲肠穿孔的方法,可以成功地复制出小鼠脓毒症模型,且有较高的死亡率和可重复的稳定性,并可进一步发展成为MODS。
  第二部分 脓毒症进展过程中EPCs数量的变化及EPCs内Robo4表达水平变化
  目的:监测脓毒症各个阶段正常小鼠骨髓中内皮祖细胞的数量变化,检测EPCsRobo4的mRNA和蛋白水平变化,探讨Robo4表达水平与EPCs数量变化的相关性。
  方法:按照第一部分造模后,分别在正常状态下、注射内毒素2小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取骨髓,按照密度梯度离心法获得单个核细胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×105PMC/孔的密度种于铺有纤维连接蛋白(FN)的培养板中培养,培养48小时后收集未贴壁细胞,再按1×105PMC/孔的密度接种于FN包被的培养板中进行培养,培养72小时进行贴壁细胞的计数。取1×105细胞进行裂解,利用RealTime-PCR检测MODS各个阶段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平变化。
  结果:脓毒症发展过程中,Robo4表达水平逐渐升高,至T4达到峰值,随后逐渐下降;内皮祖细胞的数量先增加,在T5时达到峰值,随后出现明显下降。相关性分析表明,二者在脓毒症进展过程中的变化成正相关。
  结论:在LPS介导的小鼠脓毒症模型中,Robo4表达水平与骨髓中EPCs数量具有相关性,因此Robo4可能参与调控EPCs的增殖。
  第三部分 三种不同基因表型的小鼠骨髓来源EPCs培养鉴定和功能特征比较
  目的:对三种不同基因表表型小鼠骨髓来源的EPCs进行分离、培养、鉴定和功能比较。
  方法:从小鼠骨髓分离出单个核细胞,进行诱导分化培养,对培养至P6代的EPC进行细胞形态学特征、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管形成功能等方法进行鉴定,并对照分析。
  结果:三种不同基因表达的EPC鉴定如下:贴壁细胞均特异性摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,摄取率均超过80%。免疫组化:Robo4-/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4+/-组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式细胞仪技术鉴定:Robo4-/-组:CD133阳性率:17.25±6.43%;CD34阳性率:48.75±6.83%;CD31阳性率:72.53±12.38%;KDR阳性率:87.25±10.23%;Robo4+/-组:CD133阳性率:16.55±7.29%;CD34阳性率:46.65±7.23%;CD31阳性率:75.93±11.28%;KDR阳性率:89.25±11.33%;WT组:CD133阳性率:18.25±8.57%;CD34阳性率:47.15±5.72%;CD31阳性率:74.61±10.69%;KDR阳性率:88.25±11.35%。体外血管生成功能:Robo4-/+组:28.49±4.38个/HP;Robo4-/-组:25.82±3.62个/HP;WT组:42.32±3.92个/HP(P<0.05)。粘附功能:贴壁率(Robo4-/+组:42.7±3.1%;Robo4-/-组:39.5±1.7%;WT组:64.5±2.6%(P<0.05))。迁徙功能:迁徙率(Robo4-/+组:18.5±1.7%;Robo4-/-组:13.3±2.6%;WT组:27.5±1.8%(P<0.05))。增殖功能:Robo4-/+组:23.06±2.63×104;Robo4-/-组:19.24±2.65×104;WT组:40.33±3.65×104(P<0.05)。
  结论:Robo4+/-、Robo4-/-和WT三种基因来源的EPC的细胞形态和鉴定无明显差别。基因敲除小鼠EPCs的血管形成能力、迁徙功能、粘附功能和细胞增殖能力要劣于野生型组。
  小结:通过CLP+腹腔LPS注射建立复制小鼠脓毒症模型与临床脓毒症发生的常见诱因和实际过程相近。脓毒症发展过程中Robo4表达水平和内皮祖细胞数量呈上升趋势,而随着死亡的升高,二者逐渐下降。通过对三种基因表达小鼠诱导分离骨髓来源EPCs比较分析,发现Robo4基因敲除小鼠与野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鉴定、形态学特征、双吞噬功能基本一致。基因敲除小鼠在迁徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明显低于野生型小鼠。证实Robo4基因表型对EPCs的部分功能存在调控作用。
[硕士论文] 郭玉
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:脓毒症的定义为感染引发的宿主免疫系统失调导致的器官功能障碍,致死率高;脓毒性休克为脓毒症伴随严重的循环系统和细胞代谢功能障碍。脓毒症以高发病率和致命性受到广泛关注,根据最近的数据,美国的脓毒症病例数从1996年的3873301例上升到2011年的110万,预计2020年将达到200万,脓毒症导致的死亡率接近心脏病发作的死亡率,超过了中风死亡率;所以早期的干预治疗是非常必要的。尽管脓毒症治疗策略经过近二十多年的发展,液体复苏、抗生素治疗以及血液透析等技术已取得了巨大的进步,脓毒症预后改善仍不明显。
  中性粒细胞是数量最多的参与固有免疫应答的细胞。脓毒症早期即宿主受到病原体攻击时,骨髓内的中性粒细胞迅速动员,大量中性粒细胞在趋化因子的作用下迁移至病灶部位通过吞噬、脱颗粒作用以及形成胞外诱捕网发挥清除病原体作用。虽然中性粒细胞对病原体清除非常重要,但研究已证实中性粒细胞与器官功能损伤密切相关。脓毒症过程中中性粒细胞的凋亡延迟以及其激活后释放的大量炎症因子引发的级联反应可导致组织缺氧和器官功能障碍。
  程序性死亡蛋白-配体1(programmed cell death protein-ligand1,PD-L1)是免疫激活的标志,其与程序性死亡受体-1的相互作用可抑制抗原特异性免疫反应,导致T淋巴细胞功能障碍、活化的免疫细胞耗竭及免疫耐受。肿瘤或炎症环境可诱导PD-L1在抗原递呈细胞、肿瘤细胞上表达。有研究证实脓毒症时PD-L1也可表达于中性粒细胞上,并且PD-L1阳性的中性粒细胞可诱导淋巴细胞凋亡;同时有研究表明PD-L1与B7-1分子互为配体,可发挥抑制淋巴细胞增殖的作用。那么PD-L1作为传统的配体,是否可发挥类似于受体的胞内信号激活作用?此外利用丹麦科技大学(DTU)的NetPhos2.0Server程序做磷酸化位点分析发现PD-L1的蛋白序列分析具有类似YXXM结构域,而YXXM序列可与PI3K结合并活化p85亚基,PI3K/Akt信号通路在调控细胞凋亡中发挥着重要作用。那么PD-L1是否参与脓毒症时中性粒细胞凋亡延迟的调控?由此在本课题中着重探讨脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达与PI3K/Akt信号通路及自身凋亡的相关性。
  第一部分 脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的作用
  目的:
  探索脓毒症时中性粒细胞上PD-L1的表达水平与其凋亡的关系。
  方法:
  1、分离纯化健康志愿者静脉血的中性粒细胞,并将其分为3组:对照组(Con)、IFN-γ刺激组、IFN-γ+LPS共刺激组,刺激21小时后免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式细胞仪检测中性粒细胞的凋亡率。人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)具有诱导分化成类中性粒细胞的特性并且其表达PD-L1,将其分为对照组(Control)和维甲酸刺激组(RA组)进行刺激,21小时后流式检测免疫印迹法检测PD-L1的表达水平以及流式检测HL-60细胞的凋亡率。
  2、分离纯化脓毒症患者的中性粒细胞,流式技术检测培养24h后的凋亡率,同时收集细胞用免疫印迹法检测PD-L1的表达。
  3、siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21h后免疫印迹法检测siRNA的转染效率以及流式检测其凋亡率;利用IFN-γ和LPS刺激健康志愿者中性粒细胞PD-L1的表达,并利用siRNA干扰PD-L1的表达,21h后免疫蛋白印迹法检测PD-L1以及流式检测中性粒细胞的凋亡率。
  结果:
  1.共采集6例健康志愿者的中性粒细胞,经IFN-γ和IFN-γ+LPS刺激后,中性粒细胞PD-L1表达上调,且培养21小时后凋亡率明显降低(P<0.01);RA刺激HL-60细胞系分化成中性粒细胞,与对照组相比,RA刺激组PD-L1表达下调,且其凋亡率明显增加(P<0.01);
  2.共收集了14例脓毒症患者中性粒细胞,培养24小时后的其凋亡率与PD-L1的表达水平呈负性线性关系(R2=0.4417,P=0.01)。
  3.siRNA转染脓毒症中性粒细胞,其凋亡率明显升高(P<0.01);PD-L1siRNA转染IFNγ+LPS刺激后的正常中性粒细胞的凋亡率与单纯IFNγ+LPS处理组相比,其凋亡率明显升高(P<0.01)。
  结论:
  PD-L1在中性粒细胞上的表达增加,而中性粒细胞的凋亡率下降,说明脓毒症时中性粒细胞PD-L1参与自身凋亡作用的调控。
  第二部分 PD-L1调控中性粒细胞凋亡作用的机制
  目的:探讨脓毒症时PD-L1调控中性粒细胞凋亡的可能机制
  方法:
  1.腺癌人肺泡基底上皮细胞细胞系(A549)具有易转染特性,常作为转染宿主;PD-L1全长质粒(PD-L1FL/GFP)转染A549细胞系,免疫荧光法检测已转染的A549细胞系内PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光的结合情况。
  2.人胚肾细胞系293 (HEK293)极少表达细胞外配体所需的内生受体,且易转染;利用PD-L1全长序列(PD-L1FL/GFP)和胞内段敲除(PD-L1TD/GFP)质粒转染HEK293细胞,免疫共沉淀检测PD-L1与p85的存在相互作用。
  3.利用siRNA干扰HL-60细胞系PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT的蛋白水平。
  4.利用siRNA干扰分离纯化的脓毒症患者中性粒细胞PD-L1的表达,21小时后免疫印迹法检测pAKT和AKT蛋白水平。
  结果:
  1.携带GFP的PD-L1全长质粒和胞内段敲除质粒构建成功。免疫荧光双染法发现PD-L1的GFP荧光与p85亚基的FITC荧光可重合。
  2.PD-L1FL/GFP和PD-L1TD/GFP转染HEK294细胞系行免疫共沉淀后发现PD-L1可与P85相互作用,且与PD-L1胞内段无关。
  3.PD-L1 siRNA转染HL-60细胞后,其pAKT水平降低。
  4.PD-L1 siRNA干扰脓毒症患者中性粒细胞后,其pAK水平下调
  结论:
  脓毒症时PD-L1可调控中性粒细胞的凋亡作用,其调控机制可能与PI3K/AKT信号通路相关。
[硕士论文] 周利萍
护理学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨腔镜食管癌根治手术患者术中压疮预防的三时段护理干预方案。
  方法:
  本研究为类实验性研究。收集河南省某三甲肿瘤专科医院2017年2月至2017年9月在胸外科因食管癌行腔镜食管癌根治手术并符合纳入标准的患者132例,随机分组法将患者分为干预组和对照组,干预组在胸外一病区,对照组在胸外二病区。其中对照组66例,干预组66例。对照组使用常规预防术中压疮的方法,干预组在常规护理的基础上使用三时段护理干预,包括:①成立压疮防护小组,对压疮知识、NRS评分、手术床的使用、体位安置、手术流程等进行培训。②在术前、术中、术后三时段对患者进行皮肤评估及护理并填写《手术患者皮肤护理单》:术前对患者进行NRS评分,确定其营养状况;术中皮肤护理干预(规范手术操作和体位安置流程、使用充气式保温毯等);术后即刻评估压疮并及时采取护理措施;在术后6h、术后24h对产生压疮的患者进行随访。收集两组手术患者的一般资料、体位安置时间、手术总时间及出血量、术中低体温发生率、24h内压疮发生情况、护理配合满意度。资料收集整理后录入数据库,采用SPSS19.0软件进行统计,运用t检验和卡方检验等方法精细分析,从而评价手术室护士三时段的护理干预对于预防腔镜食管癌根治手术患者术中压疮的效果,得出预防腔镜食管癌根治术手术患者术中压疮的三时段护理干预方案。
  结果:
  1、术后24内压疮发生率采用卡方检验。对照组24内压疮发生率为25.76%,干预组24h内压疮发生率为10.61%,经过卡方检验,差异具有统计学意义(P=0.024);干预组和对照组发生的术中压疮分期经过卡方检验,差异不具有统计学意义,Ⅰ期压疮(P=0.118),Ⅱ期压疮(P=0.090)。
  2、术中体位安置时间和手术总时间和术中出血量采用t检验。干预组和对照组术中体位安置时间和手术总时间经过t检验,差异具有统计学意义,术中体位安置时间(P=0.034),手术总时间(P=0.021);对照组术中出血量为36.32±9.42(ml),干预组术中出血量为33.85±8.25(ml),经过t检验,差异不具有统计学意义(P=0.111)。
  3、使用充气式保温毯后患者术中体温的比较,采用t检验。两组患者在麻醉时和切开皮肤时的口咽温度进行了t检验,差异无统计学意义(P>0.05),可以进行比较;手术结束后对干预组和对照组的口咽温度进行了t检验,差异有统计学意义(P=0.000);干预组和对照组两组患者术中低体温发生情况进行卡方检验,差异具有统计学意义(P=0.032)。
  4、压疮预防小组护士专业能力的比较,手术室护理配合的满意度调查,采用t检验和卡方检验。对照组和干预组对预防压疮的专业知识和操作技能进行t检验、手术室护理配合满意度经卡方检验,差异均具有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1、手术室护士三时段护理干预方案可以降低腔镜食管癌根治手术患者术中压疮的发生率。
  2、成立压疮防护小组可以提高手术室护士的专业能力和手术室护理配合满意度,减少影响手术时间的不良因素,提高护理质量。
  3、术中使用充气式保温毯可以有效的改善患者的体温状况,减少术中低体温的发生。
  4、手术患者皮肤管理记录单将手术室护士对患者的术前、术中、术后进行的评估及操作措施以表格形式写出,可以进一步的提醒和监督护士做好预防术中压疮的工作,并方便病房护士了解术中患者皮肤情况。
[硕士论文] 张敏
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.探讨经皮氧分压(TcPO2)和经皮二氧化碳分压(TcPCO2)监测在急诊留观患者压疮早期预警中的应用价值。
  2.分析急诊留观患者压疮高危风险早期预警的相关因素,探讨胸骶经皮氧分压变异率(TcPO2 CV)这一新型指标预测压疮高危风险的可行性。
  方法:
  连续性纳入山东大学齐鲁医院急诊医学科自2017年3月1日至2017年6月30日的急诊留观患者。纳入标准:①年龄≥18岁;②进入急诊科留观且未发生压疮患者;③签署知情同意书。排除标准:①急、慢性皮肤病或烧伤患者;②留观2小时内发生压疮的患者。设计病例报告表,收集患者基线资料,包括年龄、BMI、性别、吸烟史、留观时间、Braden评分、Norton评分、Waterlow评分、体温(℃)、脉搏(次/分)、呼吸(次/分)、收缩压(mmHg)、舒张压(mmHg)、平均压(mmHg)、脉搏氧饱和度(%)、血糖(mmol/L)、pH值、血乳酸(mmol/L)、pCO2(mmHg)、pO2(mmHg)、血红蛋白(g/L)、血清白蛋白(g/L)、WBC(*109/L)、NEU(%)、LYM(%)、K+(mmol/L)、Na+(mmol/L)、Cl-(mmol/L)、ALT(IU/L)、AST(IU/L)、BUN(mmol/L)、Cr(μmol/L)。患者急诊留观后即刻使用经皮氧分压/二氧化碳分压监测仪(丹麦雷度公司TCM4)。操作前首先进行标准气体校正。严格按照操作规范,选择监测位点:前胸部肋间隙及骶尾部皮肤,安装经皮氧/二氧化碳分压监测传感器,待TcPO2和TcPCO2读数稳定后(10-15min)记为转入时数值。并于同一时刻进行患者的血常规、血生化、血气分析等检验,记录对应点患者生命体征、血氧饱和度及血流动力学等结果。设置监测电极温度为42-44℃。持续监测时4小时需更换监测部位,防止温度的变化引起皮肤的损伤。本研究经过山东大学齐鲁医院伦理委员会审查同意后实行。SPSS19.0软件进行数据处理,以均数±标准差表示计量资料,以频数表示计数资料,两组间计量资料的比较采用t检验,分类变量的比较采用x2检验。对两个变量间的直线关系采用线性相关分析进行分析。采用Logistic回归分析校正混杂因素,计算比值比(odds ratio,OR)及其95%置信区间(95% Confidence Interval,95% CI)。由受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,ROC曲线)计算曲线下面积(area and curve,AUC)以及约登指数(Youden's index),确定cut-off值,以p值小于0.05为差异具有统计学意义。
  结果:
  1.本研究共纳入186例急诊留观患者,其中男性101例(54.3%),女性85例(45.7%);留观时间24小时以内者157例(84.4%),24-72小时者22例(11.8%),超过72小时者7例(3.8%)。发生I期压疮者11例(5.91%)。通过单因素分析,我们发现,Braden评分(p=0.002)、Norton评分(p<0.001)以及waterlow评分(p=0.008)在两组中的差异具有统计学意义。
  2.Braden评分分别与Norton评分和waterlow评分具有线性相关关系;TcPO2及TcPCO2与动脉血气分析PO2和PCO2亦呈线性相关。
  3.将所有患者根据Braden评分中高危(<15分)与低危(≥15分)分为两组,单因素分析二组患者年龄(66.50±17.23 vs.58.07±18.63,p=0.014)、体温(37.02±0.80 vs.36.72±0.65,p=0.023)、收缩压(122.28±22.79 vs.131.09±22.90,p=0.039)、平均压(89.31±17.61 vs.95.51±16.01,p=0.042)、氧分压(106.58±43.67 vs.84.52±36.12,p=0.018)、血清白蛋白(43.09±16.20vs.51.13±16.76,p=0.023)、TcPO2胸(89.39±24.43 vs.71.32±19.68,p<0.001)、TcPO2骶尾(59.61±21.59 vs.75.26±21.61,p<0.001)、TcPO2 CV(34.08±14.74 vs.15.92±18.86,p<0.001)差异具有统计学意义。
  4.将TcPO2 CV、年龄、体温、收缩压、动脉血氧分压、血清白蛋白六个指标进入Logistic回归分析,可以发现TcPO2 CV(OR=64.073,95%CI=1.171~3505.881,p=0.042)及动脉血氧分压(OR=1.027,95%CI=1.008~1.048,p=0.006)分别是患者Braden评分高危的独立危险因素。
  5.采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC曲线),计算AUC=0.883,根据约登指数(Youden's index)最大值对应值确定TcPO2 CV的cut-off值为20%。
  结论:
  1.Braden评分、Norton评分与waterlow评分对于急诊患者留观期间发生Ⅰ期压疮具有较好的相关性,且Braden评分分别与Norton评分与waterlow评分具有良好的线性相关。
  2.胸骶经皮氧分压变异率(TcPO2 CV)是急诊留观患者压疮发生高风险的独立危险因素,TcPO2 CV≥20%者对于Braden评分高危预测性强,发生压疮潜在可能性大,应注意加强防压疮护理。
[博士论文] 尹梅
老年医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:本文分为以下两个部分进行探讨:
  论文Ⅰ 缺血修饰白蛋白对严重脓毒症患者短期预后的评估价值
  目的:
  已有研究证实,在脓毒症患者中,血清IMA水平可用于量化患者的缺血及氧化应激程度。由于脓毒症的缺血和氧化应激程度往往和患者的预后相关,因此,血清IMA水平也可能是严重脓毒症患者不良预后的生物标志物。然而,血清IMA水平是否对严重脓毒症患者的预后有指示的意义,尚不得而知。在我们的研究中,我们收集入住ICU病房的严重脓毒症患者的相关临床和实验室数据,并试图从以下几个方面探讨问题:
  1.研究血清IMA水平是否可以预测患者的短期(28天)病死率;
  2.探讨血清IMA水平预测严重脓毒症患者短期病死率的最佳截断值;
  3.比较IMA和白蛋白校正后的IMA水平对于短期病死率的诊断效能。
  方法:
  1、研究对象
  本研究为前瞻观察队列研究。本研究中,我们纳入山东大学齐鲁医院重症监护病房的严重脓毒症住院患者156例,纳入时间范围为2014年4月至2014年10月。严重脓毒症根据“拯救脓毒症运动”国际指南进行定义。患者的排除标准如下:(1)患者存在其他缺血性疾病,如急性冠状动脉综合征、急性缺血性脑血管疾病、急性肺栓塞或急性下肢动脉或静脉栓塞、主动脉夹层等;(2)患者此前存在恶性的心律失常,或者心脏骤停;(3)患者存在未经充分引流的外科感染;(4)患者年龄小于18岁、患有艾滋病或为妊娠状态;(5)患者血清白蛋白水平极低或极高(<20 g/L或>55 g/L)[31,32];(6)在24h内死亡,或者住院时间<72h,或者放弃进一步治疗的患者。所有患者均参照“拯救脓毒症运动”国际指南的建议接受适当的治疗。记录患者在严重脓毒症发生24h内的一般情况、严重脓毒症原发感染源、实验室结果和基础疾病等数据,对于多部位感染的患者,只记录1个最重要的原发感染源。根据采集的相关数据,计算急性生理与慢性健康状态Ⅱ(APACHEⅡ)评分和脓毒症相关性器官功能衰竭评分(SOFA)评分等两个危重病患者病情状态的评分。本研究主要的观察终点是病人在28天的病死率。
  2、检测指标
  在严重脓毒症发生的早期(24小时内),抽取外周静脉血约5mL。在1620g下离心15分钟,分离血清并且即刻应用IMA测定试剂盒检测患者血清中IMA水平。由于极低的血清白蛋白水平(<20g/L)时,血清IMA的测定水平可能会受到影响,而使用如下校正公式能够消除此影响,校正公式:校正IMA值=(个体血清白蛋白水平/群体的血清白蛋白水平中位数)×所测定IMA值。其中,每组人群中,血清白蛋白的中位数水平分别进行独立的统计。血清IMA水平的高低不影响临床医生的治疗决策或患者的治疗效果。
  结果:
  1、严重脓毒症患者一般情况及感染来源
  共计117例严重脓毒症患者纳入到该研究,61.5%患者为男性,平均年龄为57.7±18.4岁。患者在发生严重脓毒症后28天时死亡29例,病死率为24.8%。严重脓毒症的两大感染源分别为肺脏和腹/盆腔。
  2、严重脓毒症患者的血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平对28天病死率的预测价值
  我们通过ROC曲线,评估了血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平对严重脓毒症患者28天病死率的预测价值。血清IMA水平和白蛋白校正血清IMA水平都是28天病死率的有效预测因子,AUC分别为0.742(P<0.001)和0.627(P=0.040),95%CI分别为0.638-0.847和0.497-0.757。IMA预测严重脓毒症患者28天病死率的最佳截断值为110U/mL,对应的灵敏度和特异度分别为0.517和0.886。
  3、严重脓毒症患者出现死亡的单因素分析和死亡的多因素Logistic回归分析
  单因素分析发现,与存活组相比,死亡组患者的感染性休克和急性肾损伤发生率、使用有创机械通气和肾脏替代治疗的比例均明显升高(均P<0.01),IMA水平、血糖水平、格拉斯哥昏迷评分、APACHEⅡ评分和SOFA评分均明显升高(均P<0.05),白蛋白水平显著降低(P<0.05)。
  多因素分析发现,与严重脓毒症患者28天病死率相关的独立危险因素仅为血清IMA水平(OR,2.104;95%CI,1.032-4.288; P=0.041)和APACHEⅡ评分(OR,1.166;95%CI,1.078-1.261;P<0.001)。血清IMA水平和APACHEⅡ评分无统计学相关关系(r=0.064,P=0.495)。
  结论:
  1、严重脓毒症的患者血清中IMA水平升高。血清IMA水平能够预测严重脓毒症患者的短期(28天)病死率。通过ROC曲线和多因素Logistic回归分析,我们证实了血清IMA水平不仅是严重脓毒症患者28天病死率的有效预测因子,而且是患者28天死亡的独立危险因素;
  2、血清IMA水平预测严重脓毒症患者短期(28天)病死率的最佳截断值为110U/ml,通过Kaplan-Meier生存分析进一步证实,血清IMA水平高于110U/ml的患者累计生存率较低。对于血清IMA水平高于110U/ml的严重脓毒症患者,应及时采取积极干预措施,改善患者预后。
  3、白蛋白校正的IMA水平对于短期病死率的诊断效能并不优于IMA水平,因此,使用白蛋白水平来校正血清IMA水平并非必要。
  论文Ⅱ 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1抑制对脓毒症肝脏线粒体损伤的保护作用研究
  目的:
  1、探讨PARP-1抑制能否改善脓毒症肝脏线粒体损伤;
  2、研究脓毒症中PARP-1抑制对肝脏线粒体发挥有益作用的潜在分子机制,探讨线粒体生物合成、氧化应激和炎症反应等调控通路在上述机制中的作用。
  方法:
  1、动物实验:采用内毒素(LPS)腹腔注射法建立脓毒症模型。10周龄C57BL/6小鼠称重后,给予腹腔注射LPS10mg/kg(PBS稀释为2mg/ml浓度)诱导脓毒症动物模型,该组小鼠为脓毒症组(Sepsis,n=10)。对照组小鼠(Control,n=10)则接受腹腔注射同等剂量的PBS。为保证小鼠出现显著的PARP-1抑制及后续效应,PARP-1抑制组(Sepsis+P J34,n=10)小鼠在脓毒症造模前3h和造模后8h,各腹腔注射一次PARP-1抑制剂PJ34(10mg/kg,生理盐水稀释)。在相同的时间点,对照组以及脓毒症组的动物给予腹腔注射等剂量的生理盐水。脓毒症造模24h后,麻醉动物取材进行后续实验;
  2、小鼠麻醉后行心脏左心室穿刺取血,检测相关指标:血气分析仪检测血气分析和乳酸水平,商品化试剂盒测定血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平;
  3、即刻肝脏线粒体复合体呼吸容量测定:取新鲜肝脏组织提取肝脏线粒体后,使用能量代谢测定仪检测即刻线粒体电子传递链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的呼吸容量;
  结果:
  一、LPS诱导的脓毒症小鼠模型
  1、脓毒症组小鼠出现严重的代谢性酸中毒、高乳酸血症、电解质紊乱和肝功能损伤
  与对照组相比,脓毒症组小鼠出现明显的高乳酸血症、酸中毒、低HCO3-血症、高钾血症、低钙血症及血AST、ALT水平升高(均P<0.05),但血钠水平和血细胞比容等指标并无显著变化(均P>0.05)。对照组小鼠均存活(死亡率0%),脓毒症组小鼠有3只死亡(死亡率30%)。
  2、脓毒症组小鼠出现明显的肝脏线粒体呼吸容量降低、线粒体ATP水平下降和线粒体膜电位水平下降
  与对照组相比,脓毒症组的小鼠肝脏线粒体复合体Ⅰ、肝脏线粒体复合体Ⅱ及肝脏线粒体复合体Ⅳ的呼吸容量均显著降低,线粒体ATP水平下降,线粒体膜电位的水平明显降低(均P<0.05)。
  二、PARP-1抑制剂PJ-34对脓毒症组小鼠的有益作用
  1、PARP-1抑制显著减轻脓毒症导致的乳酸酸中毒、高钾血症、低HCO3-血症,并降低AST和ALT水平
  与脓毒症组相比,PARP-1抑制组小鼠的乳酸产量减少、酸中毒改善,低HCO3-血症及高钾血症显著改善,血AST和ALT水平均明显降低(均P<0.05)。PARP-1抑制组小鼠1只死亡(死亡率10%),较脓毒症组小鼠死亡率(30%)有所下降,但无统计学差异(P>0.05)。
  2、PARP-1抑制明显改善脓毒症导致的肝脏线粒体损伤
  与脓毒症组相比,PARP-1抑制组小鼠肝脏线粒体复合体Ⅰ、肝脏线粒体复合体Ⅱ及肝脏线粒体复合体Ⅳ的呼吸容量均显著升高,线粒体ATP水平和线粒体膜电位水平均明显升高(均P<0.05)。
  结论:
  1、LPS诱导的脓毒症小鼠出现明显的肝脏线粒体功能障碍和结构损伤。同时,脓毒症小鼠肝脏线粒体合成上游因子表达水平显著降低,并出现明显的氧化应激损伤和炎症反应。
  2、PARP-1抑制可以有效缓解脓毒症肝脏线粒体功能障碍和结构损伤,改善线粒体呼吸复合体的呼吸容量,提高线粒体ATP产量,增加线粒体膜电位水平,减少线粒体肿胀和线粒体自噬。
  3、PARP-1抑制可能通过对肝脏线粒体生物合成通路、氧化应激通路和炎症反应通路的正向调控作用而对线粒体发挥靶向调节作用,从而改善脓毒症继发的肝脏线粒体的损伤。
[博士论文] 陶小根
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  脓毒症是一种由严重感染引起的过度炎症反应的临床综合征。可引起多器官功能障碍综合征(MODS),最终可引起器官衰竭,临床预后差,死亡率高。在脓毒症过程中,肝脏对清除细菌的防御反应和产生炎症介质起着重要的作用。此外,脓毒症引起的多器官损伤和衰竭可能是由于线粒体功能恶化和细胞能量代谢衰竭引起的。线粒体通过提供能量,利用大约98%的全身氧来维持正常的细胞功能。因此,线粒体在维持正常的器官功能中起着重要的作用。另一方面,保持线粒体结构的完整性是正常的线粒体功能及能量代谢必不可少的。脓毒症状态下,主要表现为细胞病理性缺氧,氧利用障碍,导致能量产生下降,而线粒体功能降低是细胞氧利用障碍的根本原因。脓毒症时会出现线粒体结构损伤与功能障碍,线粒体损伤的同时会诱发促炎介质的释放,加重炎症反应,同时线粒体功能障碍导致组织细胞产生能量不足,引起严重的微循环障碍,直至多器官功能衰竭。可见线粒体功能障碍往往与失调的全身炎症反应引起的多器官功能衰竭相关;然而,线粒体功能障碍的确切机制尚不完全清楚。
  川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中药川芎的一种活性提取物,广泛应用于抗炎和治疗心血管疾病。TMP可抑制脂质过氧化,作为灭活活性氧、保护酶的抗氧化剂。TMP还具有抗炎和器官保护作用,并在细胞水平上改善线粒体功能。然而,这些影响作用的分子机制仍然不清。水通道蛋白8(Aquaporin-8,AQP8)位于肝细胞内线粒体膜,主要介导水和其他代谢底物的运输,对维持线粒体的正常结构十分必要。AQP8还通过诱导细胞快速肿胀,促进IL-1β释放而介导炎症。另一方面,线粒体敲除AQP8基因能导致氧化剂诱导的线粒体功能障碍和导致人肝肿瘤细胞坏死性死亡。在肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的脓毒症实验动物模型中,肝细胞AQP8的表达可能通过其转录后抑制的机制而被下调,导致AQP8介导的水向线粒体外的转运功能下降,线粒体体积的快速膨胀,线粒体破裂。这些证据表明AQP8可能在维持正常的线粒体功能中起重要的作用。以往的研究表明,川芎嗪可能通过增加AQP8表达保护脓毒症大鼠肝细胞线粒体的结构。然而,TMP能否通过改善线粒体功能保护肝脏免受炎症损害,在脓毒症大鼠模型中AQP8和炎症反应之间是否存在相互影响仍不清楚。在当前的研究中,试图进一步探讨TMP对线粒体功能的影响,阐明TMP在治疗脓毒症致急性肝损伤中对线粒体保护作用的潜在机制。
  方法:
  选用96只SD大鼠,随机分为正常对照组、脓毒症组、TMP治疗组和TMP预防组,每组24只。使用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法制备脓毒症实验动物模型,对照组实验动物仅接受假手术处理;脓毒症组进行CLP手术;治疗组在CLP手术完成后,立即从大鼠尾静脉注射盐酸川芎嗪注射液,剂量为60mg/kg;预防组在CLP手术处理前7天开始每天从大鼠尾静脉注射60mg/kg盐酸川芎嗪注射液。
  造模18小时后,在四组大鼠中随机抽取12只处死,留取肝脏和血清标本,部分肝脏组织固定、包埋后保存,余肝脏组织及血清保存在零下80℃冰箱中。每组剩余12只大鼠观察至出现明显脓毒症症状及至死亡的时间,并绘制生存曲线。
  生化分析仪直接检测大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平。双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平。提取部分肝脏组织标本,采用ATP检测试剂盒,测定组织中ATP含量。
  取包埋后的大鼠肝脏制备50nm厚度的电镜切片,使用4%的醋酸铀酰和0.5%的醋酸铅染色后,电镜下观察肝细胞线粒体的超微结构;按照Flameng分级方法对肝脏线粒体进行半定量分析。
  差速离心法提取肝细胞线粒体,JC-1对线粒体进行染色,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测荧光强度,通过绿色荧光/红色荧光的比值,间接反映线粒体膜电位变化。
  取肝细胞线粒体,采用分光光度法,测定线粒体膜Na+-K-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。
  裂解肝细胞线粒体,分离出线粒体内膜蛋白,采用Western blot法检测AQP8蛋白,采用实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测肝组织AQP8mRNA的表达。
  使用SPSS14.0统计学软件包进行统计学分析。各组大鼠实验结束至出现脓毒症症状的时间、大鼠存活时间,大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平,血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平,大鼠肝细胞ATP含量,肝细胞线粒体膜ATP酶活性,AQP8mRNA表达、AQP8蛋白表达使用均数±标准差((x)±s)表示,组间比较采用方差分析(ANOVA)进行处理;AQP8蛋白表达与血清ALT、AST、m-AST,肝细胞ATP含量,血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平的相关性分析使直线相关性检验。
  结果:
  1.大鼠手术结束至出现脓毒症症状的时间和存活时间
  脓毒症组大鼠手术结束至出现症状的时间较治疗组和预防组短(P<0.01);治疗组和预防组的大鼠存活时间较脓毒症组长(P<0.01);治疗组和预防组两组大鼠出现脓毒症症状的时间和存活时间均无显著差异(P>0.05)。
  2.肝脏组织中ATP含量及血清ALT、AST、m-AST的水平
  与正常对照组相比,脓毒症组大鼠肝脏组织中ATP含量明显减低(P<0.01);与脓毒症组比较,治疗组和预防组肝脏组织中ATP含量升高(P<0.01)。
  与正常对照组比较,脓毒症组血清ALT、AST、m-AST的水平明显升高(P<0.01);与脓毒症组相比,治疗组和预防组血清ALT、AST、m-AST的水平降低(P<0.01)。
  3.肝细胞线粒体结构的变化
  电镜观察大鼠肝细胞线粒体发现脓毒症组线粒体体积增大,嵴明显肿胀、并有空泡样变,外膜破裂,线粒体内出现脂肪变性。而在治疗组和预防组,大鼠肝细胞线粒体上述变化,如肿胀、空泡样改变等均较脓毒症组减轻。脓毒症组肝脏线粒体电镜半定量评分较对照组明显增加(P<0.01);TMP治疗组和预防组肝脏线粒体电镜半定量评分较脓毒症组明显降低(P<0.01)。
  4.肝脏细胞线粒体膜电位
  激光共聚焦及流式细胞仪检测肝脏线粒体膜电位结果表明:脓毒症组大鼠肝脏线粒体膜电位明显低于对照组(P<0.01),而治疗组和预防组大鼠肝细胞线粒体膜电位高于脓毒症组(P<0.01)。
  5.肝脏细胞线粒体ATP酶活性
  与对照组比较,脓毒症组肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性水平明显下降(P<0.01),与脓毒症组相比,治疗组和预防组肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显升高(P<0.01)。而治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。
  6.肝细胞线粒体AQP8mRNA的表达
  与对照组比较,脓毒症组大鼠肝细胞线粒体AQP8mRNA的表达降低(P<0.01);脓毒症组线粒体AQP8mRNA的表达低于治疗组和预防组的(P<0.01);而治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。
  7.肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达
  与对照组比较,肝细胞线粒体AQP8蛋白的相对表达量在脓毒症组明显减少(P<0.01);治疗组和预防组的AQP8蛋白相对表达量较脓毒症组升高(P<0.01),在治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。
  8.血清炎症因子水平
  与对照组比较,脓毒症组大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平显著增加(P<0.01),而TMP治疗组及预防组大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平低于脓毒症组(P<0.01)。
  9.相关性分析
  大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达与血清ALT、AST、m-AST的水平呈负相关(P<0.01),大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达量与肝细胞ATP含量、线粒体膜电位水平呈正相关(P<0.01)。大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达与血清NO、TNF-α水平负相关(P<0.01)。
  结论:
  1.川芎嗪可以延缓大鼠CLP手术后出现脓毒症症状的时间,延长脓毒症大鼠的生存时间。
  2.脓毒症大鼠血清炎症因子释放增加,肝细胞线粒体AQP8、AQP8mRNA表达下降、并出现肝细胞ATP含量下降、线粒体ATP酶活性下降、线粒体膜电位下降等线粒体功能障碍,同时线粒体结构变化,还出现肝功能损害。而线粒体AQP8蛋白的表达与肝脏酶学指标的呈负相关,与肝细胞ATP含量及线粒体膜电位呈正相关,与血清TNF-α、NO水平呈负相关。
  3.川芎嗪能改善脓毒症大鼠的肝功能,保护肝细胞线粒体功能,其机制可能包括:
  (1)川芎嗪可以通过上调线粒体AQP8蛋白的表达、保护线粒体ATP酶活性,稳定线粒体膜电位来发挥对脓毒症大鼠肝线粒体损伤的保护作用。
  (2)川芎嗪可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6、HGMB1、NO等多种炎症介质的过量释放,从而抑制脓毒症发生时失控的炎症反应。
[博士论文] 耿立霞
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:背景及目的:
  脓毒症(sepsis)是宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍,是由于感染引起的全身过度炎症反应、免疫失衡、内皮损伤等因素致使细胞和组织受损,而产生多脏器功能不全的危重症。其发病率高、住院费用高、死亡率高,是一种全球性疾病负担。
  在脓毒症的炎症反应、免疫失衡过程中巨噬细胞起关键作用,巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的根本环节。巨噬细胞可分化为具有不同生物学特征的M1型和M2型两类。其中M1型巨噬细胞由干扰素γ(IFN-γ)和或脂多糖(LPS)诱导,表现为低表达甚至不表达白介素(IL)-10,并且分泌大量的促炎因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及趋化因子配体2(CCL-2),参与急性促炎反应,清除入侵病原体和肿瘤细胞。M1表型巨噬细胞主要发挥针对病原微生物的炎症反应和发挥宿主的免疫防御功能,也会造成机体损伤。M2型巨噬细胞由IL-4或IL-13诱导,表现为IL-10高表达,并分泌大量的抑炎因子如精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体(CD206)、症区分子1(FIZZ-1)、几丁质酶3样分3(Ym1),参与杀伤细胞外病原体、碎片清除、组织修复和伤口愈合。M2型巨噬细胞表现出很强的抗炎活性,对于修复和重塑炎症后期由病原微生物造成的组织损伤以及重建组织稳态中作用重大。
  巨噬细胞的分化可以根据环境因素发生逆转。接受不同的刺激,不仅能使尚未分型的成熟巨噬细胞发生分型极化,而且能使已分化的M1型和M2型巨噬细胞之间可以相互转化,能使激活的M1型转化成M2型巨噬细胞,也能使M2型转化成M1型巨噬细胞,这取决于M1型和M2型标志蛋白表达量的可逆性转化。M1型巨噬绌胞标志蛋白包括表达CCL-2、IL-6和TNF-α等,而M2型巨噬细胞标志蛋白有CD206、Arg-1、IL-10、Ym-1、FIZZ-1等。M1型巨噬细胞主要参与炎症产生的起始和维持,M2型巨噬细胞主要参与炎症控制,M2型巨噬细胞数量的增加有利于炎症的消除。巨噬细胞向何种表型极化决定了炎症的最终转归。
  间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)具有免疫调节、抗炎作用和旁分泌特性,被广泛用于免疫调节失衡导致的炎症性相关疾病的治疗。并且大量的研究主要围绕在与T淋巴细胞的相互作用及免疫机制方面的探讨。近年来有研究表明MSCs可改善内毒素注射及盲肠结扎穿孔导致的脓毒症动物模型损伤。我们既往研究“骨髓间充质干细胞对盲肠结扎穿孔所致脓毒痘动物模型治疗作用的研究”中也同样发现脓毒症动物模型TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平增高,IL-10mRNA表达水平降低;血清中炎症因子TNF-α、IL-6和CCL-2水平增高,抗炎因子IL-10水平降低,肺组织水肿,肺间质血管扩张、充血,肺泡间隔内可见中性粒细胞,肺泡结构破坏,在小气管、细支气管周围可见大量淋巴细胞浸润,肺组织炎症损伤重。经MSCs治疗后TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平降低,IL-10mRNA表达水平增高,血清中TNF-α、IL-6和CCL-2水平下降,IL-10升高,肺组织结构尚可,肺泡结构无明显破坏,小气管、细支气管周围可见少量淋巴细胞浸润,肺组织的炎症损伤明显减轻,72h存活率明显提高。提示MSCs对脓毒症动物模型有保护作用,并且可能是通过影响巨噬细胞起作用。
  因此我们基于这些认识:1.脓毒症中巨噬细胞起关键作用。巨噬细胞可以分化为M1/M2型巨噬细胞,M1型巨噬细胞标志蛋白包括CCL-2、IL-6和TNF-α等,M2型巨噬细胞标志蛋白有CD206、Arg-1、IL-10等。发生脓毒症时M1型巨噬细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-6水平升高,M2巨噬细胞分泌的抑炎因子IL-10等水平下降。2.巨噬细胞具有可塑性,接受不同的刺激不仅能使尚未分型的成熟巨噬细胞发生分型极化,而且已分化的M1型和M2型巨噬细胞之间可以相互转化,能使激活的M1型巨噬细胞转化成M2型巨噬细胞,也能使M2型巨噬细胞转化成M1型巨噬细胞,这取决于M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞标志蛋白表达量的可逆性转化。3.MSCs对脓毒症动物模型有保护作用,可以降低全血中TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平,同时也可以降低血清中促炎因子TNF-α、IL-6蛋白表达水平,增加抗炎因子IL-10 mRNA表达水平,提高血清IL-10蛋白水平,此外,MSCs还可以减轻组织的炎症反应、保护脏器功能,从而提高动物存活率。因此我们推测MSCs可能对巨噬细胞极化有影响,通过影响巨噬细胞的极化而抑制炎症因子的表达水平、增加抗炎因子的表达水平,从而减轻组织的炎症反应,保护脏器功能。
  MSCs对巨噬细胞的作用的相关研究不多。有研究发现MSCs在体外与未极化巨噬细胞共培养后可使其具有M2型巨噬细胞的特点,M2型巨噬细胞比例上调,CD206表达上调,IL-10表达增加,TNF-α明显降低,提示MSCs调控巨噬细胞表型向M2型巨噬细胞转化,由组织促炎反应向抗炎反应调节,进而改善失控性炎症反应。然而MSCs对已经极化的巨噬细胞(M1/M2型巨噬细胞)是否有影响,是否可以促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,对M2型巨噬细胞是否有影响,这方面的相关研究尚未发现。骨髓间充质干细胞(BMSCs)相比其他类型的干细胞在培养中更容易获得并且能够迅速增殖。鉴于此,本研究利用TranswellTM培养体系,探讨BMSCs对M1/M2型巨噬细胞极化的影响。
  方法:
  第一部分 探索M1/M2型巨噬细胞极化体系:用不同剂量脂多糖(LPS)、干扰素γ(IFN-γ)刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M1型巨噬细胞;白细胞介素-4(IL-4)刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M2型巨噬细胞。
  第二部分
  1.提取SPF级C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、鉴定BMSCs表面标记物及成骨成脂诱导鉴定。
  2.将已经提取的BMSCs分别与M1/M2型巨噬细胞共培养24h后,收集巨噬细胞和上清液,用实时定量PCR和ELISA检测巨噬细胞白细胞介素6(1L-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、趋化因子配体2(CCL2)、CD86、精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体/CD206(MR/CD206)、IL-10、炎症区分子1(found in inflammatoryzone1,FIZZ1)、几丁质酶3样分子3(chitinase3-like3,Ym-1)的变化。
  结果:
  第一部分
  1.M1型巨噬细胞诱导极化的体系为100ng/mL LPS+30ng/mL IFN-γ,100ng/mL lL-4为M2型巨噬细胞诱导极化的最适体系。
  2.M1型巨噬细胞细胞表面标记为CD86,M2型巨噬细胞表面标记为CD206。
  3.M1型巨噬细胞表达的特异因子有IL-6、iNOS、TNF-α、CCL-2和CD86,M2型巨噬细胞特异表达的因子有Arg-1、CD206、FIZZ-1、Ym1和IL-10。
  4.经LPS和IFN-γ刺激诱导的M1型巨噬细胞形态为:巨噬细胞伸出伪足增多,呈树突状、梭状及放射状,表现为炎症性巨噬细胞形态;而经IL-4刺激诱导的M2型巨噬细胞形态为:大部分巨噬细胞细胞体积略变大呈椭圆形,细胞黏附性增强,呈聚集或集落样生长,且胞质丰富。
  第二部分
  1.第3代BMSCs贴壁生长,形态类似成纤维细胞,细胞表面标记物流式鉴定,结果为CD44、CD90阳性;CD45、CD34阴性,符合国际上对BMSCs的流式标记物认定标准。并且将第3代BMSCs成脂诱导3天后可见明显增多的脂滴,7天时出现大量脂滴,油红O染色成亮红色。将第3代BMSCs成骨诱导后细胞局部出现聚集现象,诱导第7天细胞呈铺路石状汇集现象,碱性磷酸酶染色呈阳性,诱导21天细胞周围有钙沉积,茜素红染色,可见红色钙结节。表明培养的BMSCs分化能力很强。
  2.BMSCs分别与M1/M2型巨噬细胞共培养后发现棒状、放射状以及树枝状形态的巨噬细胞明显减少,细胞变圆,细胞黏附性增强,胞内颗粒增多,且流式鉴定巨噬细胞表面标记CD86为阴性。
  3.BMSCs使M1型巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α、iNOS、CCL2、-CD86mRNA水平明显减少,Arg1、CD206、IL-10 mRNA水平明显增加,且上清液中IL-6和TNF-α含量明显减少,CD206明显增加。
  4.BMSCs使M2型巨噬细胞分泌的Arg1、CD206、FIZZ-1、Ym-1、IL-10mRNA水平明显增加,CD206明显增加。
  结论:
  BMSCs不仅抑制M1型巨噬细胞活性,还能诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,使M2型巨噬细胞功能进一步活化,抗炎因子生成增多,促炎因子生成减少,由组织促炎反应向抗炎反应调节,进而改善失控性炎症反应。
  意义:
  本实验证实了我们的设想:MSCs对巨噬细胞极化有影响,不仅对未极化巨噬细胞有影响,而且对已经极化的巨噬细胞(M1/M2型巨噬细胞)有影响,通过影响巨噬细胞的极化而抑制炎症因子的表达水平、增加抗炎因子的表达水平,从而减轻组织的炎症反应,保护脏器功能。本实验为研究BMSCs对脓毒症等炎症相关疾病的治疗在细胞水平上提供了理论支持。
[博士论文] 王大伟
急诊医学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:天然CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)对于维持适度的免疫耐受和免疫稳态至关重要。CD4+CD25+ Treg细胞结构性表达叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)-4。上述关键的免疫调节性分子缺陷时,小鼠表现为致死性淋巴细胞增殖表型。CD4+CD25+Treg表达Toll样受体4(TLR4),后者可以被脂多糖(LPS)激活,Treg细胞抑制活性随之增强。Treg细胞还可以分泌抑制性细胞因子,如转化生长因子(TGF)-β和白细胞介素(IL)-10,发挥免疫抑制效应,抑制效应T细胞。Treg细胞自身增殖活性低下,它在体外可以抑制IL-2的产生,进而抑制T细胞活化。Treg细胞还可以通过细胞表面的IL-2受体,消耗效应T细胞赖以生存的IL-2,进而导致效应T细胞凋亡。Treg细胞可以控制Th1和Th2细胞转录因子表达,进而控制Th1和Th2型免疫反应。Treg细胞对于控制脓毒症早期的炎症反应有利。但是Treg细胞增多可以导致淋巴细胞增殖受抑制,进而导致脓毒症免疫麻痹。
  IL-37(IL-1F7)在人类细胞表达,在小鼠中不表达。但是人重组IL-37对小鼠细胞的效应和人类细胞的效应相似,均表现为下调固有免疫和获得性免疫反应。体内研究显示,IL-37在多种炎症疾病中发挥抗炎效应。IL-37转基因小鼠研究显示,IL-37对内毒素血症、刀豆素A诱导的肝炎、葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎、缺血再灌注损伤均有抗炎保护效应。新近研究显示,IL-37在人Treg细胞表达,基因敲减IL-37可以减弱Treg细胞的抑制活性。
  研究目的:
  1.研究IL-37对正常小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影响;
  2.体外模拟脓毒症环境,研究IL-37对LPS环境中小鼠CD4+CD25+Treg免疫抑制活性的影响;
  3.研究IL-37对脓毒症小鼠的生存保护效应。
  研究方法:
  1.按照说明书要求,用美天妮磁性分离仪从C57BL/6J小鼠脾脏细胞中分选CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞。流式细胞术鉴定CD4+CD25+Treg纯度;
  2.用重组人IL-37(rhIL-37)(0~250ng/ml)刺激Treg细胞12~48h。收集细胞上清液,EHSA分析Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1变化;部分预处理的Treg细胞,进行免疫荧光染色,流式细胞术分析Treg细胞CTLA-4和Foxp3表达变化;部分预处理的Treg细胞用于抑制活性分析。IL-37预处理的Treg细胞与CFSE标记的CD4+CD25-T细胞共培养,96小时后收集上清液,ELISA检测CD4+CD25-T细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ浓度。同时收集细胞,上流式细胞仪检测CFSE稀释度,检测发生CFSE稀释的CD4+CD25-T细胞百分比,借此分析CD4+CD25-T淋巴细胞增殖程度。通过检测上述指标,分析IL-37刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的关系,
  3.LPS(5μg/ml)预处理Treg细胞3天,预处理结束前24h向培养基中加入不同浓度IL-37(0~250ng/ml)。预处理完毕后分析Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达,IL-10/TGF-β分泌;Treg/CD4+CD25-T共培养,收集细胞上流式细胞仪,检测Treg对效应T细胞增殖活性的抑制程度;收集共培养上清液,检测IL-2、IL-4和IFN-γ分泌。通过分析上述指标,明确LPS环境中,IL-37能否影响Treg细胞免疫抑制活性。
  4.建立小鼠盲肠结扎穿孔(CLP)模型,假手术组只分离盲肠,但不予结扎穿刺。给小鼠腹腔注射IL-37(1μg)。IL-37腹腔注射分三种方式:CLP术前2h注射、CLP术后立即注射和CLP术后2h注射。在三个相应时间点腹腔注射PBS(200μl)作为对照组处理方式。处理完毕后,观察CLP小鼠8天生存率。
  5.统计学分析:应用SPSS软件统计分析。连续性变量首先进行正态性检验和方差齐性检验。数据用均数±标准差(SD)表示。每个实验重复三次。多组比较应用单因素方差分析和Bonferroni检验。生存率应用Kaplan-Meier生存曲线分析和log rank检验。P<0.05认为有统计学差异。
  研究结果:
  1.IL-37对CD4+CD25+Treg抑制活性的影响:IL-37预处理增强了CD4+CD25+Treg细胞对效应T细胞的免疫抑制活性,100 ng/ml处理组和24h处理组效应最明显。LPS可以活化小鼠Treg细胞,加强Treg细胞免疫抑制活性。IL-37预处理,可以进一步上调LPS环境中的Treg细胞的免疫抑制活性。
  2.IL-37对Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达的影响:IL-37(40~250ng/ml)预处理Treg细胞24h,可以显著增强Foxp3表达;IL-37(100~250ng/ml)预处理Treg细胞24h,可以显著增强CTLA-4表达。100 ng/mlIL-37预处理Treg细胞不同时间,24h组Treg细胞的Foxp3/CTLA-4表达上调最明显。LPS刺激上调Foxp3表达,但是对CTLA-4表达无影响。IL-37联合LPS刺激,可以上调Treg细胞Foxp3/CTLA-4表达。
  3.IL-37对Treg细胞IL-10/TGF-β分泌的影响:IL-37促进Treg细胞分泌TGF-β1。LPS刺激也可以加强TGF-β1分泌。LPS环境中,IL-37刺激可以进一步促进Treg细胞分泌TGF-β。IL-37和LPS单独刺激,或IL-37/LPS联合刺激,对Treg细胞IL-10分泌均无影响。
  4.IL-37对共培养试验中CD4+CD25-T细胞分泌IL-2、IL-4和IFN-γ的影响:Treg细胞可以抑制IL-2,但是IL-37预处理不影响Treg对IL-2的抑制效应。LPS预处理加强Treg细胞对IL-2的抑制效应,LPS联合IL-37刺激,不能进一步上调Treg细胞对IL-2的抑制效应。Treg细胞有效诱导Th2细胞极化,共培养试验中上清液IL-4/IFN-γ比例增加,提示Th2细胞增多。IL-37刺激或IL-37联合LPS刺激,加强了Treg细胞极化Th2细胞的效应。
  5.IL-37对脓毒症动物生存率的影响:IL-37预处理或IL-37术后立即给药,均可以改善动物生存率。然而,IL-37术后2h给药对脓毒症动物没有生存保护效应。
  研究结论:
  rhIL-37增强CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制活性,这为脓毒症免疫调节治疗提供了新思路。
[硕士论文] 张玲玲
公共卫生 山东大学 2017(学位年度)
摘要:压疮,又称压力性损伤,是发生在皮肤和/或潜在皮下软组织的局限性损伤,通常发生在骨隆突处或与医疗或其他医疗设备有关的损伤。压疮是临床常见的护理并发症,美国每年有大约100万的患者发生压疮,每年用于治疗压疮的医疗费用高达16亿美金,美国近10年的调查研究显示压疮的患病率在综合性医院为10%-18%,一旦患者发生压疮,不但给患者带来了痛苦,而且增加了社会、家庭的经济负担,同时给护理和治疗带来了极大的困难。压疮多发于年老虚弱或者长期卧床的患者,各个医疗机构将患者压疮的现患率,特别是医院内获得性压疮的发生率作为评价护理质量的指标,为此美国、荷兰、澳大利亚等国家相继开展了全国的现患率调研。
  目的:
  获得综合性医院住院成人患者的压疮现患率和医院获得性压疮的发生率,为临床医护人员制定下一步的预防策略提供依据。
  方法:
  经培训合格后分配到各个科室进行调查的压疮联络员在统一的时间,采用相同的流程、方法及压疮分期判定标准,对样本医院的成人住院患者进行横断面调查,严格按照护理部制定的统一标准填写调查表及统计数据;①调研对象为年龄≥18岁的所有住院患者,性别、病种不限;②排除标准:血液动力学不稳定,无法现场检查皮肤的患者以及儿科、门诊的患者;拒绝参与调研者;③数据库建立:所有调查表经核对后,剔除有缺失值的调查表;④统计学处理:使用SPSS18.0中文版进行统计分析,现患率统计采用描述性分析,使用率、百分比、均数和标准差。
  结果:
  2016年4次调研共入组患者17066位,调研共筛选出327例压疮患者,其中医院获得性压疮的患者有13位,压疮患者的压疮总数共计587处,压疮患者人均患有1.79处压疮。①压疮现患率及医院获得性压疮发生率:样本医院的压疮现患率为1.92%,医院获得性压疮的发生率为0.07%;②不同年龄段压疮现患率为:18岁-40岁压疮现患率0.42%、41岁-60岁压疮现患率0.82%、61岁-80岁压疮现患率3.02%、>80岁压疮现患率为7.61%;③压疮分期分布为:Ⅰ期压疮占比36.80%,Ⅱ期压疮占比40.89%,ⅢⅡ期压疮占6.30%,Ⅳ期压疮占0.85%,可疑深部组织创伤占6.81%,不可分期占8.35%;④压疮的首发部位是骶尾部;⑤不同科室现患率:压疮现患率在监护室最高为18.13%,内科患者的现患率为2.38%,外科患者的现患率为1.40%,综合科患者的现患率为0.97%,综合科患者的现患率是最低的;⑥在327例压疮患者中,使用压疮敷料的患者占比70.03%;每2小时一次的翻身措施落实率为94.80%。⑦医院新发生压疮的患者为13例,所患有压疮的总数量为22处,新发生压疮的患者人均患有1.68处压疮。其中Ⅰ期压疮7处,Ⅱ期压疮15处;患有3处压疮的患者有2位,患有2处压疮的患者有5位,患有1处压疮的患者有6位;男性患者8位,女性患者5位。
  结论:
  ①2016年4次调研结果显示样本医院的压疮现患率为1.92%,医院获得性压疮的发生率为0.07%;压疮患者的现患率随着住院患者年龄的增大而逐步升高;最常见的压疮分期为Ⅱ期;骶尾部是压疮重点防护部位;监护室的压疮现患率最高;②2016年度的4次调研结果可以指导医院压疮预防措施的制订与实施,并且能够为其他相关研究提供初步的基线数据。
[硕士论文] 杨玉环
急诊医学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,是重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)主要收治病种之一,具有发病率高、病情严重程度高、病死率高等特点;急性肾损伤(Acute kidney Injury,AKI)是脓毒症患者常见及最严重并发症,尤其是在老年患者中,约超过50%的重症患者并发AKI。AKI诊断存在滞后性,诊断的延迟导致治疗的不及时,错失了脓毒症AKI在早期损伤可逆阶段的最佳治疗时机。本研究的目的在于评估血浆中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Plasma neutrophilgelatinase-associated lipocaliin,血NGAL)、尿中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocaliin,尿NGAL)、尿肾损伤分子-1(Kidney injury molecule-1,KIM-1)和尿金属蛋白酶抑制物-2(Tissue inhibitorof metalloproteinase-2,TIMP-2)对脓毒症AKI的早期诊断价值。
  方法:收集2015年6月至2016年1月期间入住江苏省苏北人民医院ICU的脓毒症患者,连续观察72小时,观察是否出现AKI,根据观察结果分组,即脓毒症AKI组及脓毒症非AKI组,收集各组患者的一般临床资料,并收集脓毒症患者入ICU时(0h)以及入ICU后6h、12h、24h、48h、72h时患者外周静脉血及尿液样本,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血肌酐、血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2的表达水平,比较各组患者各时刻血肌酐、血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2的表达水平,并用血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2并与血肌酐、SOFA(Sequential organ failureassessment SOFA)评分及APACHEⅡ(Acute physiology and chronic health evaluationⅡ)评分进行相关性分析。绘制受试者工作特征曲线(ROC),计算曲线下面积(AUC),评价血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2对脓毒症AKI的早期诊断价值。
  结果:研究期间共有522名患者入住我院ICU,最终纳入符合研究标准的脓毒症患者共90名,其中38例发生AKI,占脓毒症患者的42.22%。AKI组患者血NGAL、尿NGAL水平在T-18h时开始升高(P<0.05),在T-12h时明显升高,T0h时达到峰值,在T-18h、T-12h、T0h、T24h、T48h时血NGAL、尿NGAL浓度明显高于同时刻非AKI组患者(P<0.05)。AKI组患者尿KIM-1水平在T-18h时开始升高(P均<0.05),在T-12h时达到峰值,在T-18h、T-12h、T0h、T24h、T48h时尿KIM-1水平明显高于同时刻非AKI组患者(P均<0.05)。AKI组患者尿TIMP-2水平在T-18h时开始升高(P均<0.05),在T-12h时达到峰值,在T-18h、T12h、T0h、T24h、T48h时尿KIM-1水平明显高于同时刻非AKI组患者(P均<0.05)。整体样本的ROC曲线结果显示血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-2的ROC-AUC分别为0.861,0.858,0.787,0.771,其诊断截断值分别为119.30ng/L,120.36 ng/L,90.07 ng/L,3299.50 ng/L。各时间点绘制ROC曲线显示,在T-18h时,血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1及尿TIMP-2的ROC-AUC分别为0.84、0.95、0.76、0.87;在T-12h时,血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1及尿TIMP-2的ROC-AUC分别为1、1、0.95、0.92。血NGAL、尿NGAL在T-12h时的阳性预测值及阴性预测值分别为95.47%、100.00%;93.25%、100.00%。尿KIM-1和尿TIMP-2在T-12h时的阳性预测值及阴性预测值分别为95.84%、90.34%;90.84%、83.52%。尿TIMP-2与APACHEⅡ评分呈正相关性,其相关系数为r=0.547,P<0.01。
  结论:血NGAL、尿NGAL、尿KIM-1、尿TIMP-1可以早于临床诊断诊断脓毒症急性肾损伤。尿TIMP-2与APACHEⅡ评分呈正相关性,可能反映患者病情严重程度。
[硕士论文] 王文递
生理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1、通过建立大鼠代谢性内毒素血症及肝胰岛素抵抗模型,探讨代谢性内毒素血症对肝线粒体结构与能量代谢的影响;
  2、通过体外实验,探讨内毒素(LPS)对大鼠正常肝细胞线粒体结构及能量代谢的直接影响。
  方法:
  在体实验:30只雄性SD大鼠随机分三组(每组10只):正常对照组(NC组)、高果糖组(HFD组,10%果糖水喂养)、LPS组(皮下注射LPS300μg.kg-1.d-1)。每周检测并记录大鼠体重,8周末,禁食12 h以上,腹腔注射糖耐量实验结束后,经乙醚麻醉腹主动脉采血,4℃3500 r/min离心10 min,取血浆分装后置于-40℃保存。分离肝脏组织,部分置于4%多聚甲醛溶液中固定12~24 h,冲洗修整,经常规石蜡包埋切片,行苏木素伊红染色(H&E染色);剩余样本置液氮速冻后转-80℃保存。
  1、腹腔注射糖耐量实验(IPGTT)
  每周检测大鼠体重变化,8周末,空腹腹腔注射50%葡萄糖溶液(2 g/kg)。尾静脉采血,采用快速血糖仪(罗氏活力型)分别检测注射前(0 min)与注射后(15 min、30 min、120 min)血糖水平。
  2、血浆肝酶、LPS检测及肝胰岛素抵抗评估
  采用酶法测定血糖、血浆 AST及 ALT;鲎试剂法检测血浆 LPS水平;ELISA法检测胰岛素变化,计算胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR),公式为:HOMA-IR=空腹血糖(FPG, mmol/L)×空腹胰岛素(FINS, EU/ml)/22.5。
  3、氧化损伤产物及能量代谢指标检测
  采用酶法检测并计算血浆中 GSH-PX的水平;ELISA法检测血浆中氧化损伤产物(8-OhdG、MDA、4-HNE)及能量代谢指标(ADP、ATP)的表达。
  4、肝脏组织病理学检测
  于4%多聚甲醛固定液中取出肝脏组织,冲洗修整后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋切片,厚度5μm,行H&E染色,光镜下观察肝组织病理学变化。
  5、Western blot分析
  采用 Western blot检测肝组织胰岛素信号转导关键蛋白(p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K)及线粒体内膜受体蛋白(UCP2)表达。
  离体实验:采用改良胶原酶二步灌流法,体外分离培养大鼠肝细胞并随机分为四组:正常对照组(NC组,DMEM培养液培养)、高果糖组(HFD组,培养液+4.5 g/L果糖水)、LPS组(培养液+10 mg/L LPS)、果糖并LPS干预组(H+L组,培养液+4.5 g/L果糖水+10 mg/L LPS)。20 h后,吸取并分装细胞上清液,胰酶(含EDTA)消化,2000 r/min离心3 min后弃上清,收取肝细胞于-40℃冷冻保存。
  1、氧化损伤产物及能量代谢指标检测
  采用ELISA法检测细胞上清液中氧化损伤产物(8-OhdG、MDA、4-HNE)及能量代谢指标(ADP、ATP)的表达。
  2、Western blot分析
  采用Western blot检测肝细胞中胰岛素信号转导关键蛋白(p-IRS1Tyr632、IRS1、p-PI3KTyr458、PI3K)、线粒体内膜受体蛋白(UCP2)表达。
  结果:
  在体实验:
  1、体重变化及糖耐量结果
  实验期间,各组大鼠总体状态良好。与NC组相比,HFD组与LPS组大鼠体重在2~8周显著增高(P<0.01,P<0.05)。HFD组与LPS组各时间点血糖均显著高于NC组(P<0.01,P<0.05),表明HFD组与LPS组大鼠发生糖耐量异常。
  2、血浆肝酶、LPS检测及肝胰岛素抵抗评估结果
  HFD组与LPS组的肝酶、FINS、FPG、LPS水平及HOMA-IR显著高于NC组(P<0.01),HFD组与LPS组无统计学差异(P>0.05)。
  3、氧化损伤产物及能量代谢指标变化
  HFD组与LPS组8-OhdG、MDA、4-HNE及GSH-PX显著高于NC组(P<0.01), HFD组与LPS组差异无统计学意义。能量代谢指标,HFD组与 LPS组ADP、ATP与NC组相比显著降低(P<0.01),HFD组与LPS组差异无统计学意义(P>0.05)。
  4、肝组织病理学变化
  NC组肝脏呈暗红色,无油腻感,H&E染色后光镜下可见肝索呈放射状排列。HFD组与LPS组肝脏有明显油腻感;镜下可见肝细胞包浆内出现脂滴空泡并伴有气球样变。
  5、Western blot结果
  与NC组相比,HFD组与LPS组肝组织IRS1、PI3K表达、p-IRS1Tyr632/IRS1和 p-PI3KTyr458/PI3K比值则显著降低(P<0.01),UCP2表达显著升高(P<0.01), HFD组与LPS组相比无统计学意义(P>0.05)。
  离体实验:
  1、氧化损伤产物及能量代谢指标变化
  HFD组、LPS组及H+L组8-OhdG、MDA及4-HNE显著高于NC组(P<0.01, P<0.05),能量代谢指标与NC组比较,HFD组、LPS组及H+L组ADP、ATP显著降低(P<0.05)。HFD组、LPS组及HFD+LPS组差异无统计学意义(P>0.05)。
  2、Western blot结果
  与NC组相比, HFD组、LPS组及H+L组肝细胞IRS1、PI3K表达、p-IRS1Tyr632/IRS1和p-PI3KTyr458/PI3K比值则显著降低(P<0.01,P<0.05),UCP2表达显著升高(P<0.01),HFD组、LPS组及H+L组相比无统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1、高果糖饮食及皮下注射LPS可诱发大鼠胰岛素抵抗和代谢性内毒素血症,并伴有氧化应激和肝细胞线粒体功能障碍。
  2、LPS可诱导氧化中间产物生成增多,清除减少,致使肝脏处于氧化应激状态,进而破坏肝细胞线粒体结构,影响其能量代谢,加速胰岛素抵抗及代谢性疾病的发生发展。
[硕士论文] 舒畅
急诊医学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:感染性休克是临床常见的危重症,尽管治疗水平不断提高,但病死率仍居高不下。感染导致有效循环血量不足,组织器官灌注减少,是感染性休克的病理生理学机制,积极液体复苏改善组织灌注是感染性休克的主要治疗手段之一。右美托咪定是临床重症患者常用的镇痛镇静药物,近年有研究显示右美托咪定可改善感染性休克患者的组织灌注,本文对此进行了探讨。
  目的:
  探讨右美托咪定对早期感染性休克患者血流动力学和微循环的影响。
  方法:
  (1)研究设计:单中心、前瞻随机、对照、双盲研究;
  (2)研究对象:2016年2月~2017年3月期间东南大学附属中大医院重症医学科收治的进行液体复苏且平均动脉压(MAP≥65mmHg)的早期(≤24小时)感染性休克患者;
  (3)试验分组:患者纳入后根据随机数字表随机分为试验组和对照组,试验组给予右美托咪定0.7ug/kg/hr持续静脉泵入治疗,对照组给予生理盐水0.7ug/kg/hr持续静脉泵入治疗;
  (4)试验监测方法:纳入研究的患者采用脉搏指示连续心排出量(PiCCO)行血流动力学监测,采用血气分析仪进行氧代谢监测,通过旁流暗视野成像(SDFimaging)技术监测患者的微循环灌注水平;
  (5)试验观察和临床数据收集:分别于患者入组时,试验用药1小时后收集以下临床资料:
  ①血流动力学指标:一般指标,如心率(HR)等;压力指标,如平均动脉压(MAP)、中心静脉压(CVP)等;容积指标,如每搏输出量(SV)、每搏指数(SVI)、心输出量(CO)等;阻力指标,如体循环阻力(SVR)、体循环阻力指数(SVRI)等;
  ②氧代谢指标:动脉氧分压(PaO2)、动脉血氧饱和度(SvO2)、静脉血氧饱和度(PvO2)、静脉血氧饱和度(SvO2)、乳酸(Lac)等;
  ③微循环指标:总血管密度(Total Vascular Density,TVD)、灌注血管密度(Perfused Vessel Density,PVD)、灌注血管比例(Proportion of PerfusedVessels,PPV)、微血管流动指数(Microvascular Flow Index,MFI)等;
  (6)试验条件:试验过程中两组患者均处于镇痛状态,给予瑞芬太尼、吗啡等镇痛药物持续静脉泵入治疗,维持重症监护患者疼痛评估(Critical carePatient Observation Tool,CPOT)评分0~1分。研究期间输液速度、补液量处于相同水平,血管活性药物剂量随血压调整并维持平均动脉压(MAP)≥65mmHg。患者氧饱和度(SpO2)维持在95%以上。
  (7)盲法的实施与揭盲;研究用药按照随机数字表随机分组,保持外观和形状上一致性。保管者与使用者均不明确药物具体内容,全部病例数据收集完成后予以揭盲,完成试验。
  结果:
  (1)患者入组情况:2016年2月1日至2017年3月31日期间入住东南大学附属中大医院重症医学科的感染性休克患者共283例,依入排标准共排除235例:其中脑血管意外、痴呆37例;肝功能异常22例;入组时平均动脉压<65mmHg79例;未放置PiCCO导管56例;年龄因素41例。符合纳入标准48例。试验过程中2例患者使用药物后出现明显心率减慢,被迫终止研究;7例患者微循环图像质量不佳脱落,最终入组39例。其中对照组17例,试验组22例。
  (2)两组患者的基本资料比较:在纳入研究的39例患者中,试验组22例,对照组17例。对照组和试验组的平均年龄为(72.5±10.8) vs.(71±11.0)岁,P=0.850;男女性别比例为13/4 vs.17/5,P=0.623,两组相比无统计学差异。两组患者的疾病严重程度方面,患者APACHEⅡ评分(P=0.092)、SOFA评分(P=0.798),也无统计学差异。对照组和试验组主要的基础疾病为高血压(P=0.270),主要感染部位为肺部(P=0.074),同样无显著差异。
  两组患者入组时血流动力学参数比较,对照组和试验组患者心率(HR)、平均动脉压(MAP)、心输出量(CO)以及其他压力、阻力、容量指标P值均>0.05,无统计学差异。诸如静脉血氧饱和度(SvO2)、乳酸(Lac)等氧代谢指标也无统计学差异。同样两组患者基础微循环数据如灌注血管密度(PVD)(21.46±13.78 vs.14.40±13.86 mm/mm2)等指标,P值均>0.05,均无显著差异。
  (3)右美托咪定对感染性休克患者血流动力学的影响:试验用药以0.7ug/kg/hr速度持续静脉泵入1小时后,对照组和试验组患者心率(HR)无统计学差异(94.82 bpm vs.96.86 bpm,P=0.758),平均动脉压(MAP)、心输出量(CO)[(83.65 mmHg vs.81.08 mmHg, P=0.417);(6.18L/min vs.6.66L/min,P=0.480)]以及其他压力、阻力等血流动力学指标均无显著差异。针对Lac≥2mmol/L进行亚组分析,两亚组患者相应的血流动力学压力、阻力、容积指标同样无显著差异;
  (4)右美托咪定对感染性休克患者氧代谢的影响:试验用药以0.7ug/kg/hr速度持续静脉泵入1小时后,对照组和试验组患者中心静脉血氧饱和度(ScvO2)、乳酸(Lac)等氧代谢指标无明显统计学差异(79.52% vs.75.81%,P=0.229;2.26mmol/L vs.2.50 mmol/L,P=0.356)。针对Lac≥2mmol/L进行亚组分析,两亚组患者ScvO2、Lac指标(78.86% vs.76.46%,P=0.401;3.53 mmol/L vs.4.02 mmol/L,P=0.779)同样无显著差异;
  (5)右美托咪定对感染性休克患者微循环的影响:试验用药以0.7ug/kg/hr速度持续静脉泵入1小时后,对照组和试验组患者灌注血管密度(PVD)、微血管流动指数(MFI)指标(22.59 mm/mm2 vs.16.75 mm/mm2,P=0.586;2.49 vs.2.43,P=0.670)无统计学差异。针对Lac≥2mmol/L进行亚组分析,两亚组患者PVD、MFI指标(10.76 mm/mm2 vs.14.27 mm/mm2,P=0.401;2.39 vs.2.46,P=0.889)仍无统计学差异。
  结论:
  右美托咪定对感染性休克患者的血流动力学和微循环无显著影响。
[硕士论文] 赵群
内科学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究4EDB-1(青藤碱衍生物)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒症小鼠生存及肝、肾功能的影响,并探讨其相关的抗炎作用机制。
  方法:
  1.4EDB-1对小鼠生存及肝、肾功能影响的观察
  (1)观察并记录6天内不同药物浓度作用下,小鼠的存活状况。
  (2)应用生化仪检测不同药物浓度、给药次数下,小鼠肝、肾功能指标谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase, AST)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)及血肌酐值(Creatinine,CREA)的变化。
  2.4EDB-1对炎症因子变化及脾脏巨噬细胞表型的观察
  (1)应用酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunodeficient Assay,ELISA)检测小鼠血清及细胞上清液中细胞因子如白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平的变化。
  (2)流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞F4/80+CD206,评估巨噬细胞极化。
  结果:
  1.不治疗组(LPS+NS组)小鼠6天存活率为20%;4EDB-1实验组(5mg/kg、10mg/kg)小鼠存活率均为100%;SIN-HCL(盐酸青藤碱)实验组(10mg/kg、15mg/kg)存活率为80%,5mg/kg浓度治疗下,SIN-HCL实验组存活率仅为60%。2.与对照组及SIN-HCL组相比,不同浓度4EDB-1给药2次或4次后,小鼠相关肝、肾功能指标ALT、AST、CREA及BUN没有差异(均P>0.05)。
  3.体内实验表明,与不治疗组相比,4EDB-1实验组(5mg/kg)小鼠血清中炎症因子IL-6及TNF-α水平均下降(P<0.001),IL-10水平明显升高(P<0.001);体外实验表明,当4EDB-1浓度为1、2、5、10 umol/L时,细胞上清液中IL-6水平,较不治疗组,均明显下降(P<0.01,P<0.05),当4EDB-1浓度为2、5、10umol/L时,TNF-α水平明显下降(P<0.05,P<0.01),IL-10水平呈升高趋势(P<0.01)。4.4EDB-1(5mg/kg)作用脓毒症小鼠后,CD206的表达较不治疗组明显升高(P<0.01)。
  结论:
  1.与盐酸青藤碱(SIN-HCL)相比较,在相同治疗浓度下,4EDB-1对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠具有更好的治疗作用,更能提高其存活率。
  2.在肝、肾功能的相关试验中,发现青藤碱衍生物4EDB-1在短期内对小鼠肝、肾功能没有明显的毒性作用。
  3.4EDB-1可能通过促进巨噬细胞向M2型极化,抑制IL-6及TNF-α的释放,促进IL-10的释放,从而减轻炎症反应,发挥对小鼠的保护作用。
[硕士论文] 章晋辉
临床医学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过对脓毒症患者血清降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)指标的检测,可以为临床进行早期准确诊断,尽早进行有效合理治疗,取得良好的预后提供有利的指导依据。
  方法:
  随机选取2013年1月1日-2015年12月31日入住江苏大学附属医院ICU的重症患者302例纳入本研究,按照脓毒症诊断标准将302例患者分为三组:脓毒症组、脓毒性休克组与非脓毒症组。其中脓毒症组102例,男56例,女46例,年龄39-68岁;脓毒性休克组87例,男47例,女40例,年龄42-75岁;非脓毒症组113例为对照组,其中男50例,女63例,年龄40-74岁。全部患者的血清中PCT的检测用酶联荧光分析法测定,CRP采用荧光免疫定量法检测,最终检测指标在各组间进行对比,分析组间差别,并对 PCT、CRP指标绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线),比较各检测炎症指标对诊断脓毒症的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率等指标。采用统计专业软件对最终数据进行统计分析,P<0.05为有统计学意义。
  结果:
  1、比较脓毒性休克组、脓毒症组与对照组患者的年龄、性别、APACHEⅡ分、ICU住院时间(天)等指标上均无显著性差距(P>0.05),在ISS评分、住院死亡率[n(%)]上有明显差异(P<0.05)。
  2、脓毒症患者血清 PCT水平达(6.03±3.98 ug/L),高于对照组患者水平(1.68±0.93 ug/L),脓毒性休克组患者的PCT水平(14.03±9.61 ug/L)较脓毒症组高,均具有明显差异(P<0.05);脓毒症患者血清中CRP的水平达(34.91±15.71 mg/L),高于对照组患者水平(12.41±7.98 mg/L),脓毒性休克组患者的CRP水平(148.29±32.04 mg/L)较脓毒症组高,均具有明显差异(P<0.05)。
  3、脓毒性休克组、脓毒症组和对照组患者血清PCT检测阳性率分别为93.1%、80.4%、29.2%,3组比较差异有统计学意义(X2=104.335;P<0.05);脓毒性休克组、脓毒症组和对照组患者血清CRP检测阳性率分别为90.8%、79.4%、25.7%,3组比较差异有统计学意义(X2=107.702;P<0.05)。
  4、PCT、CRP联合检测诊断脓毒症的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率(84.7%、87.6%、92.0%、77.3%、85.8%)均明显高于PCT单独检
  测(75.7%、77.0%、84.7%、65.4%、76.2%),同样高于CRP单独检测(77.8%、74.3%、83.5%、66.7%、76.5%),具有明显差异(P<0.05)。PCT、CRP联合检测ROC曲线下面积为0.922,曲线下面积的95%置信区间为(0.872,0.971);PCT水平ROC曲线下面积为0.850,曲线下面积的95%置信区间为(0.777,0.923);CRP水平的检测水准描记出的ROC相应曲线下规模为0.814,曲线下具体取值的95%置信区间为(0.730,0.898)。
  结论:
  1、血清PCT、CRP水平可用来评估脓毒症患者的病情严重程度,其水平越高,病情越严重。
  2、血清PCT、CRP联合检测较PCT或CRP单独检测敏感度及特异度大大提高,提示通过对PCT、CRP水平的联合检测可提高脓毒症早期诊断的准确率。
[博士论文] 王旭
临床检验诊断学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:背景:脓毒症是指宿主对感染的反应失调,产生危及生命的器官功能障碍,是严重创伤、烧伤、休克后常见的并发症。近年来,尽管在严重脓毒症及脓毒性休克的抗感染、液体复苏、创面处理、器官支持治疗等方面已取得进展,但其病死率仍居高不下,是重症监护室(intensive care unit,ICU)病人的首要死亡原因。脓毒症患者免疫功能受到抑制,自身清除感染的能力降低,是患者感染难以控制的重要原因。抗生素的使用提高了脓毒症患者的救治成功率,但随着抗生素的长期应用,不敏感菌株大量繁殖,抗生素不能完全解决脓毒症时的感染问题。因此,如何改善脓毒症时患者自身的免疫功能从而有效地控制感染,是脓毒症防治的重要课题。脓毒症时,在多种细菌毒素及细胞因子的刺激下,中性粒细胞功能失调,趋化方向性受损,到达病原感染部位的中性粒细胞数量减少,不能有效抑制病原增殖,导致机体抵御感染的能力降低,影响重要脏器的功能,是脓毒症患者死亡的重要原因之一。进一步阐明脓毒症时中性粒细胞方向性受损的机制,寻找针对性的干预措施,使中性粒细胞向感染部位的趋化增强,可为脓毒症的抗感染治疗提供理论基础。
  内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁表面的主要组成成分,过量的LPS可导致天然免疫细胞的过度活化,释放过多的炎症介质,通过自分泌、旁分泌和体循环作用于全身组织器官,是引起脓毒症时全身炎症反应综合征的重要原因。ATP是细胞内重要的能量分子,近年来,Junger等人发现中性粒细胞也可通过自分泌ATP途径对自身的趋化产生影响。中性粒细胞趋化时前端片足分泌的ATP通过自分泌途径激活自身局部的P2Y2受体,增强了细胞的运动功能,但当细胞整体都接受ATP的刺激时,中性粒细胞的趋化功能反而受到抑制,这提示胞外ATP亦可能是中性粒细胞趋化的抑制分子,但其具体分子机制目前并不明确。P2X1受体是ATP门控阳离子通道受体,与ATP结合后能迅速诱导细胞的Ca+内流,是细胞重要的Ca2+内流通道。近年来的研究证实P2X1受体也表达于外周血中性粒细胞中,ATP可通过活化P2X1受体增强中性粒细胞的随机运动,但随机运动的中性粒细胞不具有方向性,损伤了其向趋化物的定向运动能力,减弱了中性粒细胞向感染部位的特异性趋化能力。Ca+是细胞内重要的信号分子,参与调控了中性粒细胞的多种生物学功能,但过度的Ca2+内流对中性粒细胞的趋化则具有抑制作用,但其是否与P2X1受体的活化有关目前尚不明确。
  方法:体内实验采用致死剂量和非致死剂量的大肠埃希菌腹腔注射,制作脓毒症感染小鼠模型和轻度局部感染小鼠模型,观察小鼠生存率,血细胞自动分析仪检测腹腔灌洗液、血液中性粒细胞数量,平板菌落计数法检测腹腔灌洗液、血液细菌含量。病理切片HE染色观察小鼠脓毒症后肝、肺损伤,ELISA试剂盒检测肝、肺IL-1β、IL-6细胞因子水平,MDA试剂盒检测肝、肺MDA含量,转录谱基因芯片检测中性粒细胞基因表达的差异。
  体外实验采用LPS刺激原代中性粒细胞模型,琼脂糖趋化实验检测中性粒细胞趋化距离,流式细胞仪检测中性粒细胞趋化分子受体表达及凋亡,高效液相色谱仪检测ATP释放,Western Blot检测Cx43蛋白磷酸化,激光共聚焦显微镜检测P2X1受体分布、Ca2+内流,原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化,激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白肌球蛋白轻链(myosin lightchain,MLC)磷酸化、极性化。
  采用CRISPR/Cas9慢病毒敲除HL-60早幼粒细胞株P2X1受体,1.3%二甲基亚砜处理HL-60细胞6d后分化成类中性粒细胞,原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化,激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白MLC磷酸化、极性化。
  结果:体内研究发现脓毒症时中性粒细胞趋化功能受到抑制、清除感染能力受损,肝、肺组织病理损伤明显、炎症反应增强,进一步的基因芯片检测发现脓毒症时中性粒细胞TLR信号通路活化,LPS通过TLR4对中性粒细胞多种的趋化分子受体的表达产生调控作用。
  体外研究发现在脓毒症时重要的炎症刺激分子中LPS对中性粒细胞趋化的抑制作用最为明显,LPS通过促进Cx43通道开放分泌ATP,ATP作用于自身P2X1受体后引起过量的Ca2+内流,使中性粒细胞钙调蛋白MLCK活化,导致MLC异常磷酸化及极性化,抑制了中性粒细胞的趋化。P2X1受体敲除后,LPS对中性粒细胞的抑制作用被削弱,MLC磷酸化、极性化恢复正常。
  结论:本研究通过体内、体外研究发现了LPS刺激后自分泌ATP/P2X1/Ca2+信号通路对中性粒细胞趋化的抑制作用,并揭示其对中性粒细胞骨架蛋白MLC异常极性化的作用及机制,这可能是脓毒症时中性粒细胞趋化受损的重要原因之一。
[硕士论文] 张艺森
外科学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:背景与目的:
  脓毒症(Sepsis)是指人体在外源性微生物感染时反应失调时全身多器官功能障碍,特别是在宿主重度创伤、休克、烧伤等危重疾病病人身上存在的一个严重性的问题,尽管现代医学的治疗能不断提升,脓毒症的致死率仍居高不下。近些年流行病学调查结果报告显示,在美国每年约有75万脓毒症患者,其中重症脓毒血症(severe sepsis)患者占9%,脓毒性休克(septic shock)患者占3%,这些患者中有超过21万无法从临床治疗中生还。目前脓毒症病人的死亡率仍居高不下,最主要的两大因素依然是多器官功能衰竭和感染。而由细菌感染引起的约占脓毒症总数的90%以上,其中60%是由革兰氏染色阴性杆菌感染侵袭所致,大肠埃希氏菌则是重要感染源。细菌内毒素脂多糖(LPS)是一种高度酰化的糖脂,主要死由核心多糖、脂类、抗原多糖组成,作为革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要组成成分,是其所致脓毒症时最重要的致病因素。脂多糖经中性粒细胞膜表面的模式识别与Toll4受体结合使细胞活化,活化后的中性粒细胞可以使释放大量炎症介子如IL-6、白细胞三烯B4、活性氧。脓毒症早期大量的中性粒细胞聚集在血供丰富的器官中,例如肝脏、脾脏中,在全身感染加重时细菌通过释放促炎因子,可以诱导中性粒细胞无法发挥正常功能,并且使中性粒细胞在诸如肝脏中大量聚集并活化,引起(SIRS)全身性炎症反应。在临床治疗中,大量或不合理的抗生素应用,使得很多致病菌产生强大的耐药性,使得抗生素种种弊端体现而出。因此在临床治疗上,新的抗菌抑菌药物或方法则急需发现与运用,脂多糖刺激的中性粒细胞后增强其吞噬功能,脂多糖对中性粒细胞刺激后吞噬功能增强的调控和机制尚无明确的报道。
  方法:
  招募健康成年志愿者采集静脉血,采用Ficoll梯度离心法分离健康成年人血液中的中性粒细胞,后采用随机数字表法随机分为正常对照组(CONTROL),脂多糖刺激10分钟组,脂多糖刺激20分钟组,脂多糖刺激30分钟组,抑制剂+脂多糖组。采用流式细胞术检测中性粒细胞吞噬功能,骨架蛋白F-actin表达。在透视电镜下观察中性粒细胞形态的改变。在荧光显微镜下观察中性粒细胞形态,骨架蛋白F-actin表达,以及对25922GFP的吞噬情况。采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测中性粒细胞胞内蛋白Pi3k、P-Pi3k、AKT、P-Akt。的表达。
  结果和结论:
  1.脂多糖刺激并激活中性粒细胞后,可见中性粒细胞呈不规则形,中性粒细胞内颗粒减少,胞膜褶皱,有大量伪足生成,中性粒细胞形态发生变化。
  2.脂多糖刺激中性粒细胞后,中性粒细胞对细菌吞噬功能得到加强,且呈时间依赖性。
  3.脂多糖刺激中性粒细胞后,中性粒细胞骨架蛋白F-actin大量增多并且发生极化。脂多糖刺激中性粒细胞后 F-actin的形成与极化增加与吞噬功能的增强有密切关系。
  4.脂多糖通过对中性粒细胞内pi3k/Akt信号通路的激活,促进中性粒细胞对ATCC25922GFP的吞噬能力增强。
  5.脂多糖刺激中性粒细胞后,细胞内关键蛋白pi3k、Akt的磷酸化水平均发生大程度的上升。实验表明脂多糖刺激中性粒细胞后,其吞噬功能的增强可能与pi3k/Akt信号通路有关。
[硕士论文] 徐晓涵
外科学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:背景与目的:
  脓毒症是宿主对微生物感染的反应失调导致了危及生命的器官功能障碍,是感染、烧/创伤、休克等急危重患者的严重并发症。随着当代医疗技术、危重病监护手段、治疗措施的进步,但其病死率依然居高不下。脓毒症时,宿主免疫功能严重失调,机体自身清除感染能力下降,是导致感染难以控制和多器官功能障碍的重要原因。中性粒细胞作为防御病原体的第一道防线,其依赖趋化功能来发挥杀灭细菌作用。脓毒症时,在多种细菌毒素及细胞因子的刺激下,中性粒细胞功能失调,其招募和趋化功能严重受损,吞噬能力下降,炎症介质释放增多, NETs形成增加,是脓毒症患者免疫功能紊乱的重要原因。因此,如何调控脓毒症患者自身的免疫功能,从而有效的发挥抗感染的作用,可能成为治疗脓毒症的一个重要手段之一。
  脂多糖(LPS)是一种高度酰化的糖脂,位于革兰氏阴性(G-)杆菌外膜的外层,是 G-杆菌感染所致的内毒素血症及脓毒症时最重要的致病成分。早期在体和体外研究均表明 LPS能够抑制中性粒细胞的趋化功能。腺苷(ADO)是腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的水解产物之一,半衰期很短,但具有强大的效应功能。ADO发挥其功能是通过4种G蛋白偶联受体:A1、 A2A、A2B和 A3受体。这4种ADO受体均在中性粒细胞表面表达, ADO可通过其不同的受体介导中性粒细胞多种功能包括调控中性粒细胞的趋化功能,而关于ADO介导的恢复LPS抑制的中性粒细胞趋化作用目前尚无报道。
  方法:
  1.采集健康成年志愿者肘部静脉血,通过 Ficoll密度梯度离心法分离健康成人外周血中性粒细胞;采用瑞士染色、台盼蓝染色及流式细胞术检测CD66b,鉴定中性粒细胞的活性及纯度。
  2.建立琼脂糖下趋化模型,使用趋化物IL-8和fMLP检测中性粒细胞的定向迁移距离,鉴定趋化模型及确立趋化物的使用方案。
  3.对中性粒细胞进行LPS刺激、ADO干预、ADO受体相关抑制剂和激动剂、cAMP类似物和抑制剂、AC激动剂、p38 MAPK抑制剂等干预,采用琼脂糖下趋化模型检测不同干预下中性粒细胞的定向迁移能力。
  4.采用流式细胞术和免疫印记(WB)检测中性粒细胞 ADO受体 A1的表达。
  5.采用蛋白芯片检测MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平;WB检测总p38 MAPK相对磷酸化水平。
  结果:
  1. Ficoll密度梯度离心法分离的细胞,瑞士染色发现细胞核染色为紫色,呈现马蹄形或分叶状,细胞胞质呈现浅红色,为中性粒细胞;台盼蓝染色及流式细胞术检测CD66b,分别显示细胞的活性和纯度均≥97%。
  2.琼脂糖下趋化实验显示IL-8和fMLP诱导中性粒细胞趋化的最适浓度分别为1μmol/L和0.1μmol/L。
  3. LPS刺激中性粒细胞后,可以明显抑制中性粒细胞定向迁移到 IL-8或fMLP,呈剂量依赖方式;ADO干预能够恢复LPS抑制的中性粒细胞的趋化,呈浓度依赖方式。
  4. ADO介导的恢复 LPS抑制的中性粒细胞趋化主要是通过中性粒细胞表面的ADO受体A1发挥作用。
  5. LPS刺激中性粒细胞后,其对A1受体(A1R)表达水平未见明显改变。
  6. A1R发挥恢复 LPS抑制的中性粒细胞趋化作用可能不依赖其经典的AC-cAMP-PKA信号通路,而是抑制p38 MAPK磷酸化水平。
[硕士论文] 李小超
临床检验诊断学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过对713例血流感染病原菌侵袭性及病原学感染特点进行分析,寻找血流感染病原菌的侵袭途径,查找播散源头,切断感染源,以减少血流感染发生率,降低患者死亡率。同时对血流感染病原菌的菌群分布,耐药特点,耐药表型进行分析,指导临床合理用药,减少耐药菌的产生,为临床对血流感染的防控及治疗提供依据。
  方法:每日及时收集华北理工大学附属医院2015年1月到2016年12月血培养阳性病原菌,用Phoenix100全自动细菌鉴定/药敏系统对其做出准确的分离鉴定及药敏试验。同时及时了解患者病情,查找病原菌侵袭性特点、临床耐药性特点、病原菌构成特点,并进一步分析病原菌及科室分布,结合相关实验室检查和病原菌侵袭特点,查找病原菌感染源头。同一时间段内感染灶培养菌株与血培养检出的菌株相同,且除外其他感染来源,认为该感染灶为血流感染的播散源头。
  结果:
  1.血流感染病原菌播散源头情况:两年间共检出713株血流感染病原菌,分离率位于前五的病原菌依次为大肠埃希菌(17.8%)、肺炎克雷伯菌(16.3%)、凝固酶阴性葡萄球菌(10.9%)、鲍曼不动杆菌(7.9%)和金黄色葡萄球菌(7.7%)。静脉导管来源的检出病原菌257株(36.0%),其中226株来自中心静脉导管,以凝固酶阴性葡萄球菌(72株)、鲍曼不动杆菌(55株)为主,主要分布科室为重症医学科和神经外科;泌尿系感染来源146株(20.5%),以大肠埃希菌(70株)为主,主要分布科室为重症医学科、泌尿外科和肾内科;腹腔感染来源114株(16.0%),以肠杆菌科细菌和链球菌为主,主要分布科室为重症医学科和普通外科;下呼吸道感染来源80株(11.2%),以肺炎链球菌(35株)为主,主要分布科室为呼吸内科;外伤感染来源61株(8.6%),以金黄色葡萄球菌(39株)为主,主要分布科室为骨科。其他不明途径55株(7.7%)。
  2.药物敏感情况:常见的革兰阴性菌中,肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对头孢类、喹诺酮类耐药率较高,对碳青霉烯类、氨基糖苷类、酶抑制剂类抗生素较敏感,同时肺炎克雷伯菌的耐药率高于大肠埃希菌,且差异有统计学意义(P<0.01)。鲍曼不动杆菌耐药形式严峻,对多种抗生素耐药率均在较高水平。洋葱伯克霍尔德氏菌对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、复方新诺明、头孢吡肟较敏感。铜绿假单胞菌对一、二代头孢、复方新诺明天然耐药,对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、氨基糖苷类等抗生素敏感。常见的革兰阳性菌中金黄葡萄球菌对青霉素耐药率高达96.5%,肠球菌属对青霉素、氨苄西林较敏感。四种常见阳性菌对利奈唑胺、万古霉素、替考拉宁等均敏感。713例血流感染病原菌中检出多重耐药菌97例,检出率为13.6%。其中产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌47株(48.5%),多重耐药的鲍曼不动杆菌37株(38.1%),耐甲氧西林金黄色葡萄球菌10株(10.3%),多重耐药的铜绿假单胞菌3株(3.1%)。检出科室主要是重症医学科、神经内科重症和神经外科。无论是革兰氏阳性球菌还是革兰氏阴性杆菌,尿中病原菌耐药率稍高于血中的,差异无统计学意义(P>0.05)。痰标本里的病原菌耐药率明显高于尿标本和血液标本的耐药率,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  1.血流感染病原菌检出率位于前五位的依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、凝固酶阴性葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌。
  2.病原菌的感染途径静脉导管来源的检出最多,检出菌以凝固酶阴性葡萄球菌、鲍曼不动杆菌占优势,主要分布科室为重症医学科和神经外科;泌尿系感染来源的以大肠埃希菌为主,主要分布科室为重症医学科、泌尿外科和肾内科;腹腔感染来源以肠杆菌科细菌和链球菌为主,主要分布科室为重症医学科和普通外科;下呼吸道感染来源以肺炎链球菌为主,主要分布科室为呼吸内科;外伤感染来源以金黄色葡萄球菌为主,主要分布科室为骨科。
  3.无论是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌,尿中病原菌耐药率稍高于血中的,差异无统计学意义;痰标本里的病原菌耐药率明显高于尿标本和血液标本的耐药率,差异有统计学意义。菌血症的控制应结合感染来源,注重查找播散源头,积极治疗感染灶,控制并减少血流感染的发生。
[硕士论文] 李菁
中医内科学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  观察脓毒症中医证型与乳酸(Lactic acid,LAC)值、SIRS分值的相关性,为脓毒症中医辨证分型提供临床依据,使中医辨证客观化,指导疾病的治疗,帮助判断预后。
  方法:
  本研究选择符合纳入标准的120例脓毒症患者,2位副高以上的中医师参照《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南(2014)》进行中医辨证分型,对采集的病例行LAC值、SIRS分值检测,制定统一的调查表,运用SPSS20.0软件进行统计学分析。
  结果:
  1.本研究收集了120例脓毒症患者,其中毒热证36例(占30.0%),血瘀证33例(占27.5%),腑气不通证26例(占21.7%),急性虚证25例(占20.8%)。
  2.本研究收集的120例患者中,中医各证型在性别、年龄方面均无统计学差异(P>0.05),脓毒症各分级在性别、年龄方面均无统计学差异(P>0.05)。
  3.在LAC值与脓毒症中医证型的研究中,发现急性虚证>毒热证>腑气不通证>血瘀证。除去毒热证与腑气不通证无统计学差异(P>0.05),其余各证型之间均有统计学差异(P<0.05),中医证型与LAC值之间存在相关性。
  4.在SIRS分值与脓毒症中医证型的研究中,发现毒热证>腑气不通证>急性虚证>血瘀证。除去毒热证与血瘀证、毒热证与腑气不通证、毒热证与急性虚证有统计学差异(P<0.05),其余各证型之间均无统计学差异(P>0.05),中医证型与SIRS分值之间存在相关性。
  5.在LAC值与脓毒症分级的研究中,发现严重脓毒症>脓毒症,两组之间具有统计学差异(P<0.05),脓毒症分级与LAC值之间存在相关性。
  6.在SIRS分值与脓毒症分级的研究中,发现严重脓毒症>脓毒症,两组之间具有统计学差异(P<0.05),脓毒症分级与SIRS分值之间存在相关性。
  7.在脓毒症中医证型与病情严重程度的等级资料多样本比较的秩和检验中,发现除去毒热证与腑气不通证无统计学差异(P>0.05),其余证型之间均具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  1.中医证型与LAC值之间存在相关性,脓毒症患者的LAC值随中医证型的变化而逐渐升高,血瘀证<毒热证或腑气不通证<急性虚证。
  2.研究脓毒症患者的SIRS分值与中医证型的相关性,结果为毒热证与其余三个证型之间均具有统计学差异(P<0.05),且毒热证的SIRS分值高于其余三个证型,中医证型与SIRS分值之间存在相关性。
  3.脓毒症分级与LAC值之间存在相关性,脓毒症患者的LAC值随着脓毒症分级的变化而逐渐升高,脓毒症<严重脓毒症。
  4.脓毒症分级与SIRS分值之间存在相关性,脓毒症患者的SIRS分值随着脓毒症分级的变化而逐渐升高,脓毒症<严重脓毒症。
  5.LAC值、SIRS分值可提示病情的严重程度,为脓毒症中医辨证分型提供参考价值。
[硕士论文] 周岩
护理学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨大鼠早期压疮缺血再灌注损伤的凋亡机制及曲美他嗪预处理的效果,为临床早期压疮的防治提供基础理论依据和新思路。
  方法:
  1.将16只Wistar大鼠随机分为2组,对照组(Sham组)和缺血/再灌注组(I/R组)。I/R组大鼠应用特制压力装置制备大鼠早期压疮缺血再灌注损伤模型。实验终点取受压局部肌肉组织,采用HE染色法观察大鼠受压肌肉组织的病理学变化;TUNEL法检测大鼠受压组织中肌细胞凋亡情况;免疫组织化学法检测受压肌肉组织中凋亡相关蛋白Bax与 Bcl-2的表达情况;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和 CHOP在受压组织中的表达水平。
  2.将40只Wistar大鼠随机分为5组,对照组(Sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、曲美他嗪低剂量组(TMZ低组)、曲美他嗪中剂量组(TMZ中组)、曲美他嗪高剂量组(TMZ高组)。应用特制压力装置制备大鼠压疮缺血再灌注损伤模型。I/R组大鼠只造模不给药,曲美他嗪预处理组大鼠造模前7天分别给予曲美他嗪低(5mg/kg)、中(10mg/kg)、高(15mg/kg)剂量灌胃预处理。实验终点取受压局部肌肉组织,采用HE染色法观察各组大鼠受压肌肉组织的病理学变化;TUNEL法检测各组大鼠受压组织中肌细胞凋亡情况;免疫组织化学法检测各组受压肌肉组织中凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2的表达情况;Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和CHOP在受压组织中的表达水平。
  结果:
  1.光镜观察受压组织发现,Sham组肌纤维排列紧密,形态正常,无炎性细胞浸润及病理改变,与Sham组相比I/R组肌纤维病理损伤严重;TUNEL法检测受压组织凋亡结果显示,Sham组中几乎很少见到凋亡细胞,I/R组凋亡细胞的表达显著增多(P<0.05);免疫组化检测Bax和Bcl-2蛋白结果与Western blot结果趋势一致,即Bax蛋白在Sham组中几乎不表达或有极少表达,与Sham组相比I/R组Bax蛋白表达显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白在Sham组中表达显著,在I/R组中的表达与Sham组相比显著降低(P<0.05);Western blot法检测受压组织中CHOP的表达结果显示,在Sham组中几乎不表达或仅有极少表达,与Sham组相比I/R组CHOP蛋白表达显著升高(P<0.05)。
  2.光镜观察受压组织发现,Sham组肌纤维排列紧密,形态正常,与Sham组相比I/R组肌纤维病理损伤严重,在曲美他嗪预处理组中随着给药剂量的增加病理损伤逐渐减轻。TUNEL法检测受压组织凋亡结果显示,Sham组中几乎很少见到凋亡细胞,I/R组凋亡细胞的表达显著增多(P<0.05),在曲美他嗪预处理组中随着给药剂量的增加凋亡细胞表达逐渐减少。免疫组化检测Bax和Bcl-2蛋白结果与Western blot结果趋势一致,即Bax蛋白在Sham组中几乎不表达或有极少表达,与Sham组相比I/R组Bax蛋白表达显著升高(P<0.05),在曲美他嗪预处理组中随着给药剂量的增加表达逐渐减少,Bcl-2蛋白在Sham组中表达显著,在I/R组中的表达与Sham组相比显著降低(P<0.05),在曲美他嗪预处理组中随着给药剂量的增加表达逐渐增多。Western blot法检测受压组织中CHOP的表达结果显示,在Sham组中几乎不表达或仅有极少表达,与Sham组相比I/R组CHOP蛋白表达显著升高(P<0.05),在曲美他嗪预处理组中随着给药剂量的增加表达逐渐减少。
  结论:
  1.细胞凋亡参与了大鼠早期压疮的形成,受压组织中Bcl-2蛋白表达减少,Bax和CHOP蛋白表达增多。
  2.曲美他嗪预处理对大鼠早期压疮缺血再灌注损伤具有保护作用,可以减轻受压肌肉组织的病理损伤程度,上调Bcl-2表达水平,下调Bax、CHOP表达水平抑制细胞凋亡,保护受压肌肉组织。曲美他嗪高剂量(15mg/kg)对大鼠早期压疮缺血再灌注损伤的保护效果较低剂量好。
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