绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 100
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 29512 条结果
[博士论文] 罗益滨
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:颈椎病是临床多发病和常见病之一,广义的颈椎病是由颈椎间盘退变及继发病理改变导致周围解耦的变化,出现神经肌肉相关症状的一类疾病总称,又叫颈椎综合征。据粗略统计,我国颈椎病发病率在8.1%-19.1%之间。根据颈椎病的临床表现,颈椎病有多种分型,其中,伴交感神经症状颈椎病是较为特殊的一种。所谓伴交感神经症状颈椎病,是由于各种颈椎病损(如不稳、退变、间盘突出、炎症等)刺激颈部交感神经节,引起眩晕、视物模糊、头痛、失眠、胸闷、潮热甚至腹胀等交感神经症状的颈椎病。对该类型颈椎病形成的命名、分型、形成机制、发病过程、诊断标准、治疗规范,目前还存在较大的争议,其中机制研究是伴交感神经症状颈椎病的热点和难点之一。据已经发表的文献,主要有颈椎椎间不稳学说、体液因子学说、后纵韧带交感神经学说、关节周围本体感受器刺激学说、颈部Ruffini小体受激学说等。迄今没有一种假说能完美解释这种特殊类型颈椎病的发病机制。近年来,较为热门的是颈椎后纵韧带上交感神经纤维刺激学说。现有实验表明,刺激后纵韧带上交感神经纤维可以引起颈部交感神经节电位变化,并诱发相应交感神经症状。基于此学说,临床上选择术中切断后纵韧带,以对颈段脊髓充分减压、阻断交感神经反射通路,部分患者得到症状的缓解。还有学者围绕椎动脉、心脏等效应器对颈部交感纤维与交感症状之间的对应关系做了探索。但这一学说还有不完善和不成熟的地方,本研究拟对这种机制展开进一步研究。
  目的:
  1、在前人研究的基础上,通过形态学研究,进一步明确交感神经在后纵韧带上的节段性分布形态学规律,为后续的实验和其他类型的研究提供必要的证据。
  2、进一步明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维受激惹引起的相应交感神经症状。通过选取呼吸和血压两个效应器,明确颈部交感神经节→后纵韧带上交感神经纤维→效应器的传导关系,理清伴交感神经症状颈椎病的发病机制。
  3、通过上述实验,巩固伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究的其中一种学说:即颈后纵韧带上交感神经纤维致病机制。
  4、通过研究伴交感神经症状颈椎病的发病机制研究,明确症状与病变部位的对应关系,为临床上精确定位和治疗伴交感神经症状颈椎病提供客观依据。
  方法:
  实验一:研究颈椎后纵韧带上交感神经纤维的分布情况。手术切取10只实验动物新西兰白兔的颈椎后纵韧带、交感神经节,通过不同染色方法进行形态学研究。将实验兔分为两组,每组5只,第一组进行颈椎交感神经节的切取,第二组进行颈椎后纵韧带的切取。将实验动物新西兰白兔进行耳缘静脉麻醉后,妥善安置于颈椎操作台,充分伸展颈椎,术区备皮消毒。切开皮肤,显露颈椎及周围附属结构,分别切取相应的组织。取出材料后,迅速放入中性甲醛溶液固定,进行HE、NPY以及S100的组织染色,并进行读片分析,以明确颈椎后纵韧带上交感神经纤维存在的证据以及神经组织的来源。
  实验二:研究电刺激不同部位颈交感神经节时,观察效应器官(以呼吸频率为参数)的变化情况。取实验动物新西兰白兔35只,实验组(颈上、中、下交感神经节组)分为3组,每组10只;对照组5只。麻醉后捆绑胸部呼吸换能器。显露颈椎及周围附属结构,对不同部位颈部交感神经节进行电刺激,测量刺激前后呼吸频率变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录呼吸频率变化。以明确不同部位颈交感神经节和呼吸频率之间的关系。
  实验三:研究电刺激不同部位颈交感神经节,观察血压变化情况以及与神经节对应关系。取实验动物新西兰白兔35只,实验组分为3组(颈上、中、下交感神经节组),每组10只;对照组5只。进行耳缘静脉麻醉后,显露颈椎及周围附属结构,游离颈动脉,进行动脉置管及换能器连接。对不同部位颈部交感神经节进行电刺激(50mV),记录血压变化。用麻醉药物阻滞神经节后再次刺激,记录血压变化。明确不同部位颈部交感神经节和血压之间的对应关系。统计学方法:实验中涉及的计量资料以均数±标准差(x±s)表示。应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析,组内采用配对t检验的方法。3个实验组(分别为颈部上、中、下交感神经节)与对照组(0mV电刺激组)刺激后的数据组间比较,采用Dunnett-t检验。设置检验水准a=0.05,当P<0.05认为差异有统计学意义。
  结果:
  实验一:通过形态学研究后纵韧带上交感神经纤维的分布及来源。结果发现,①通过观察染色后的切片,到颈椎后纵韧带表面神经染色呈阳性反应。②阳性反应的密度较低,提示交感神经纤维分布较少。③不是所有实验动物的后纵韧带都能检测出神经染色阳性反应,提示交感神经纤维在后纵韧带上分布不具有普遍性。④经过特异性NPY染色,观察到后纵韧带表面分布的神经纤维,和颈部交感神经节的来源相同。
  实验二:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察呼吸频率的相应改变。结果发现,颈上神经节刺激组于对照组刺激后相比,呼吸频率存在的统计学意义(P<0.05)。颈中、下神经节刺激后和对照组刺激后比,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,呼吸频率变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  实验三:通过电刺激不同节段的实验动物新西兰白兔颈部交感神经节,观察血压的相应改变。结果发现,颈上、中神经节刺激组可以观察到血压的改变,和对照组相比,变化存在统计学意义(P<0.05)。颈下神经节刺激后和对照组比较,血压不存在统计学意义(P>0.05)。各组神经节经过药物阻滞后再次刺激,血压变化不存在统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1、形态学研究证实了交感神经纤维存在于后纵韧带本研究从形态学上进一步证实了后纵韧带上分布的交感神经纤维。通过多项神经染色技术在光镜下仔细观察,确认交感神经纤维存在于颈椎后纵韧带表面。且交感神经纤维的来源与颈交感神经节同源,这是作为后纵韧带交感神经纤维致病机制的解剖学证据。
  2、通过效应器研究明确了不同部位交感神经节和症状对应关系实验证实,刺激不同节段颈交感神经节后,可引起相应交感神经症状(以呼吸频率和血压为对象)。通过药物阻滞后纵韧带上的神经纤维,不能再次触发相应症状。结合既往发现的颈交感神经节与后纵韧带表面交感神经纤维的对应关系,得出以下结论:颈椎病变刺激后纵韧带上不同节段的交感神经纤维,可以引起对应的不同症状。其中,颈4/5节段病变对应呼吸频率变化,颈5/6节段病变对应血压变化。证实了后纵韧带上交感神经纤维致病机制的合理性。
  3、本系列实验的结果对临床诊治具有一定的指导意义本实验发现了呼吸频率和血压与颈部交感神经节之间的对应关系。通过这一结果,可以由不同症状准确定位颈椎的病变节段。这一发现,为临床上对伴交感神经症状颈椎病的精准诊断和治疗带来了新的启发。
[博士论文] 刘伟聪
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景与目的:
  颈椎病的理想治疗目标包括彻底清除产生疼痛或者压迫的局部病灶、完全缓解疼痛及神经功能全面得到恢复、局部颈椎节段达到良好的稳定性重建、恢复并维持脊柱生理性的动力学状态四个方面。由于能保持手术节段活动度,作为不同于经前路颈椎间盘切除椎间植骨融合术的非融合手术方式,颈人工椎间盘置换术在临床中越来越广泛应用于颈椎退变性疾病。颈人工椎间盘置换术的近期临床疗效优于或者等同于经前路颈椎间盘切除椎间植骨融合术,而中长期疗效尚待进一步证实。随着临床资料的积累,关于颈椎间盘置换术后的异位骨化也陆续报道,多个随机对照研究报道认为非限制型假体术后在两年随访期间之内异位骨化的发生率超过50%。由于假体磨损、下沉等其他远期并发症目前发生率报道比较低,手术节段术后产生的异位骨化成为颈人工椎间盘置换当前面临的主要障碍。异位骨化的产生能导致置换节段活动度的下降甚至丧失,其病因学至今仍未明确。有分子生物学、活动度差异及力学变化等各种全身及局部机制等各种假说。尽管很多临床报道认为生物力学因素会刺激异位骨化产生,并且在压力情况或者载荷情况下同异位骨化形成相关,但其具体发生机制尚未明确。全面了解颈椎基本的生物力学变化,对防治颈椎伤病、改进颈椎病治疗方法和提高临床疗效有着非常重要的现实意义。相对于其他力学研究方法,有限元模型在研究颈椎内部的压应力及张力等生物力学方面有着独特的优势。它能为研究者提供机体在不同状态下的应力、载荷、结构形变及运动稳定性等脊柱各方面生物力学状况定量及定性分析,在对颈人工椎间盘置换术后颈椎各个方面的力学情况变化进行测试和评估方面应用广泛。但到目前为止,关于颈人工椎间盘的不同高度选择对于患者术后颈椎生理参数变化及临床疗效的影响尚未得到明确的研究,置换节段的椎间高度变化对于异位骨化形成、活动度的影响目前也尚未明确。
  本研究拟将生物力学分析及临床应用相结合的方法,通过建立的全颈椎三维有限元模型,测试不同高度的颈人工椎间盘置换对于术后颈椎局部活动度、骨终板界面的压力分布及后方关节突关节关节囊的应力变化的影响,结合力学实验结果观察颈人工椎间盘置换术后的临床应用疗效、颈椎活动度的维持情况及术后手术节段异位骨化的情况,探讨颈人工椎间盘术后异位骨化的发生机制及其影响因素,为改善颈椎病治疗的疗效,优化颈人工椎间盘置换手术方案提供理论依据。
  研究方法与结果:
  第一部分 生物力学测试部分(三维有限元研究)
  第1节 正常人体全颈椎三维有限元模型的建立及其有效性验证
  一、材料与方法
  选择1位正常健康成人志愿者作为本实验研究原始数据来源的对象,将通过CT薄层扫描获得的原始数据导入硬盘,使用软件将像素提取并编辑,实施逆向重建,通过模拟计算建立C0-T1全颈椎三维有限元模型,并对其进行验证。
  二、结果
  该模型在各个方向上的活动度及力学特性与既往文献资料相符,通过模型验证。
  第2节 不同高度人工椎间盘的模型建立及生物力学分析
  一、材料与方法
  通过在前期建立的全颈椎三维有限元模型基础上建立5mm、6mm、7mm三种不同高度的DiscoverTM颈人工椎间盘置换模型,在1.5Nm的扭矩载荷条件下,比较不同高度的颈人工椎间盘假体置换对颈椎活动度、骨终板界面的压力分布及后方关节突关节关节囊等力学变化的影响。
  二、结果
  三种高度的颈人工椎间盘假体都能较好地维持并在不同方向和程度上增加置换节段的活动度。随着假体高度的增加,假体-骨终板界面在各个方向上的压力增加显著。与5mm为标准假体骨终板界面压力进行比较,在后伸位时,6mm假体上下骨终板界面压力分别增加了52%和260%,7mm高度假体则增加了242%和720%;在前屈位时,6mm假体上下骨终板界面压力分别增加了66%和142%,7mm高度假体则增加了247%和407%;在左侧方屈曲时,6mm假体上下骨终板界面压力分别增加了153%和31%,7mm高度假体则增加了537%和179%,与右侧屈曲结果相似。不同高度假体应力在骨终板界面上分布不均。三种高度的假体均以在后伸状态下的上方骨终板界面压力为最高,关节突关节压力也随着假体规格的改变而变化明显。
  第二部分 相关临床研究部分
  一、资料与方法
  通过对长征医院2009.01-2014.01期间本手术组接受颈人工椎间盘置换的84例患者、共108个置换节段进行术前术后临床疗效及影像学两方面随访评估。观察比较颈人工椎间盘置换术后的临床应用疗效、椎间高度、颈椎活动度的变化情况及术后手术节段发生异位骨化的情况,并按照McAfee骨化分级法将患者分为对节段活动度无影响组(0-1级)和有影响组(2-4级),对不同高度假体等异位骨化相关因素进行比较分析。
  二、结果
  在术后3年左右中期随访时间内,使用DiscoverTM假体进行颈人工椎间盘置换治疗颈椎病临床疗效良好,术后手术节段椎间高度较术前增加明显,异位骨化总发生率为66.7%,其中有2个节段出现4级异位骨化,20个节段出现3级异位骨化。大高度的假体有增加异位骨化发生的倾向性,但无统计学意义。不同级别异位骨化患者之间的临床疗效无显著性差异,而节段活动度有显著性差异。多节段手术、置换节段活动度大是产生异位骨化的高危因素。
  三、结论
  1.根据正常健康成人的CT扫描数据构建的全颈椎三维有限元模型能较好地模拟真实的活动度及力学情况,可以作为进一步开展生物力学研究的基础模型;
  2.使用不同高度规格的DiscoverTM颈人工椎间盘假体都增加了该节段的活动度,不同高度假体应力在骨终板界面上的分布不均。随着假体高度的增加,节段活动度、假体-骨终板界面在各个方向上的压力、邻近节段椎间盘压力也明显增大,后方关节突关节压力则先降低,再升高,不同高度规格颈人工椎间盘假体对局部节段的压力有较大影响。
  3.在中期随访时,DiscoverTM颈人工椎间盘置换治疗颈椎病安全、有效,异位骨化的发生与否、严重程度对临床疗效无明显影响,不同高度规格的假体之间的异位骨化发生率无显著性差异,多节段手术、置换节段活动度大是产生异位骨化的高危因素。
[硕士论文] 徐铮
骨外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  髋部骨折是老年人最常见损伤之一,其预后效果差,老年髋部骨折患者预后不良与术后并发症发生率高有关,骨折后1年内致残率超过50%,死亡率高达36%。目前的治疗方案虽然强调早期手术固定以及功能康复锻炼,但致死率、致残率仍高居不下。近些年发现,老年髋部骨折后出现的高致残率、高死亡率与骨折后机体出现的免疫炎症紊乱有着密切的关系!因此,在外科治疗的同时,纠正老年髋部骨折患者机体内出现的免疫功能紊乱状态,将会是解决这一问题的关键。而骨髓间充质干细胞具有很强的抗炎作用、组织修复及免疫调节功能,在许多与免疫炎症相关疾病的治疗过程中已取得了很大成功,但是对老年患者创伤后免疫功能调节目前尚无相关报道。骨髓间充质干细胞是一类高度异质性的细胞群,而以往对异质性的细胞群体的认识都是停留在群体水平上面。因此,更加系统而全面韵认识和探索各亚群之间的构成,找到真正有意义的亚群/亚群比例(与免疫调节有关系)是十分必要的。近年来,单细胞转录组测序技术的发展为异质性细胞群体在单细胞水平方面的研究上奠定了重要基础。
  研究目的:
  通过单细胞转录组测序技术分析老年髋部骨折患者骨髓间充质干细胞的异质性,找出不同的亚群,并且分析各个群的功能;对于每个细胞亚群,将该亚群与其他所有亚群做差异分析比较,获得每个亚群差异高表达的基因,作为亚群的特征基因;在每群特异性表达的基因里通过数据库分析找到特异性表达的基因与哪些疾病相关;找到与免疫调节有关的亚群/亚群比例,为后期通过干细胞治疗降低老年髋部骨折患者术后并发症打下坚实的基础。
  研究方法:
  1、选取一例股骨粗隆间骨折需行手术治疗的患者,在术中扩髓过程中用注射器抽取约10ml骨髓,置于无菌袋中立即送入实验室。
  2、将骨髓间充质干细胞混合液进行分离、培养,待细胞生长至80%时进行融合,随后进行传代培养,获取第二代MSCs。
  3、采用流式细胞荧光分选技术对获得的第二代MSCs进行鉴定,并进行成骨、成软骨、成脂肪方向分化,确定为骨髓间充质干细胞。
  4、对第二代MSCs进行细胞消化,使细胞量达到1000个/ul,体积100ul,并溶于PBS中,置于无菌袋中送至北京博奥晶典生物技术有限公司进行单细胞基因测序及亚群分析。
  研究结果:
  扩髓过程中抽取的老年患者骨髓按照一定方法可培养出来骨髓间充质干细胞;培养出来的骨髓间充质干细胞在第二代时细胞形态、贴壁性最好;第三代时即出现增殖不明显,贴壁性不好;第四代时细胞已不再增殖;培养出来的骨髓间充质干细胞表达为CD90(+)、CD105(+)、CD29(+)、CD44(+),CD34(-)、CD45(-)、HLA-DR(-);培养出来的骨髓间充质干细胞混悬液可分为10个亚群,10个亚群之间的相关性较好,每个群的比例各不相同,功能不尽相同。
  研究结论:
  用单细胞测序技术对老年髋部骨折患者骨髓间充质干细胞进行亚群分析是可行的;不同细胞亚群决定细胞性质;每个群的特异性差异表达top20基因在功能上不尽相同,差异表达的top20基因与体内许多疾病相关。
[硕士论文] 罗盛昌
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:自从1996年脊柱外科领域权威杂志《SPINE》上发表关于腰痛作为人类世纪难题的文章,腰痛也越来越引起大家的重视,椎间盘变性引起的慢性背痛和颈肩痛是威胁人类健康的严重问题,目前没有有效的治疗方法。慢性腰背部疼痛是造成劳动力丧失的常见原因。对于严重的椎间盘退行性病变的患者,目前主要采用手术治疗为主的治疗方法:腰椎间融合,人工椎间盘置换术,微创髓核摘除术等。手术治疗可以一定程度的减轻患者的症状,但手术合并很多并发症,例如相邻节段椎间盘退变加重,椎间隙感染等,这常常需要进一步的外科手术。虽然手术可以减轻临床症状,但既不阻止变性的进展,也不能恢复椎间盘(Intervertebral disc,IVD)的天然功能状态。基于上述外科干扰的情况和限制,因此,在探寻椎间盘退变机制及寻求无创治疗的研究一直并未停止。
  椎间盘退变是复杂的多因素过程,虽然做了长期大量的研究工作,其确切机制并未完全了解。当前研究以炎症通路为主,大量研究表明退变的椎间盘细胞能产生炎性介质,包括:TNF-α,IL-1α/β,IL-6,IL-10和IFN-γ等等。这些因子导致炎症级联反应促进基质降解,趋化因子的产生和细胞表型的改变。由此导致了基质成分分解和合成之间出现严重不平衡最终导致椎间盘退变。炎症因子对椎间盘细胞的作用并不存在疾病特异性,具有的局限性,转化效益差等
  椎间盘是人体中最大的无血管组织。椎间盘由内层的富含水和胶原的髓核和外层富含纤维的纤维环两部分组成。椎间盘退变的特征在于细胞外基质中主要成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的含量明显较少,直接导致与水结合能力的降低,椎间盘含水量减少,髓核细胞数量减少,被成纤维细胞样表型的细胞的替换。椎间盘作为特殊的软骨组织,其退变过程可能与骨化相关基因有着密切的联系。
  课题组在前期研究中已经发现有报道关于骨化相关基因RUNX2能够引起椎间盘退变。TWIST作为骨化相关基因的重要一员,参与早期抑制RUNX2调控成骨细胞化。基于上述内容,我们推测在椎间盘退变中,TWIST基因也起着至关重要的作用。
  第一部分:TWIST基因在髓核组织中的表达
  目的:研究TWIST基因在人髓核组织中的表达情况。
  方法:(1)利用GEO数据库,生物信息学筛选椎间盘退变中骨化相关基因。(2)收集2016年3月-2017年6月因腰突症于我院行腰椎手术的患者的椎间盘标本,根据磁共振Pfirrmann分级系统,Ⅰ-Ⅱ级为轻度退变对照组,Ⅲ-Ⅴ级为重度退变退变组。共采集患者标本32例,其中对照组12例,退变组20例。对收集的椎间盘组织进行鉴定。(3)对椎间盘组织细胞针对筛选的骨化相关基因进行免疫组化。(4)椎间盘组织RNA提取及验证,通过实时定量PCR的检测方式明确骨化基因在椎间盘退变中的表达。
  结果:(1)骨化相关IBSP、ENPP、OPN等在椎间盘退变网路中存在,提示骨化相关基因在椎间盘退变中可能具有重要地位。(2)经组织学鉴定,椎间盘退变程度与Pfirrmann分级一致,分组合理。(3)组化显示成骨相关基因均呈不同程度的上调,而骨化抑制相关基因中TWIST1及TWIST2能够随着退变逐渐下调。(4)通过椎间盘髓核组织的RNA检测结果显示TWIST1及TWIST2确实如组化所示在退变中出现明显下调。
  结论:我们利用GEO数据库、椎间盘标本免疫组化、椎间盘组织RNA提取与验证对退变椎间盘中骨化基因进行检测,明确骨化相关基因在退变椎间盘中异常表达,TWIST1及TWIST2在退变椎间盘中明显下调。
  第二部分:TWIST基因在人髓核细胞退变过程中的作用
  目的:研究TWIST基因在人髓核细胞中的表达情况。
  方法:(1)收集2016年5月-2017年7月因脊柱外伤或脊柱侧弯等患者的Pfirrmann分级Ⅰ-Ⅱ级的椎间盘组织,进行原代人髓核细胞培养。(2)通过TWIST1及2基因全长PCR将TWIST表达CDS区纯化、克隆入表达载体,并于髓核细胞中利用转染试剂进行TWIST1及2基因的过表达,构建TWIST的过表达及干扰载体。(3)利用炎症因子IL-1β与TNF-α进行体外髓核细胞的炎性刺激,构建体外髓核细胞退变模型。(4)通过转染TWIST1/TWIST2过表达及干扰载体于髓核细胞中,培养24h后通过Real-time PCR检测处理后髓核细胞ECM降解相关MMP、ADAMTS的表达情况明确退变情况。(5)同上处理后通过Western Blot检测处理后髓核细胞ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。
  结果:(1)通过原代培养髓核组织,成功建立体外髓核细胞系6株。(2)检测细胞TWIST1及2的表达发现确实出现上调,提示过表达及干扰载体构建成功。(3)通过检测发现刺激后髓核细胞CHSY、ACAN、Ⅱ型胶原等基质相关基因表达减少,基质降解相关MMP、ADAMTS表达显著增加,体外模型构建成功。(4)过表达TWIST1及2基因,髓核细胞CHSY、ACAN、Ⅱ型胶原等基质相关基因表达较对照组显著增加,基质降解相关MMP、ADAMTS表达显著减少。
  结论:我们通过髓核细胞原代培养、构建TWIST过表达载体、构建体外退变模型、转染过表达载体等方法,明确TWIST基因在体外确实具有抑制椎间盘退变,保护椎间盘的作用。
  第三部分:TWIST基因保护椎间盘退变的机制研究
  目的:研究TWIST基因保护椎间盘退变的机制研究。
  方法:(1)构建RUNX2过表达及干扰载体。(2)于人髓核细胞中过表达RUNX2基因并检测ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。(3)利用共转染的方式将TWIST与RUNX2于退变髓核中共表达,检测ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。(4)构建RUNX2启动子双荧光报告载体,检测TWIST过表达后RUNX2启动子的活性情况。
  结果:(1)成功构建RUNX2过表达及干扰载体。(2)RUNX2过表达后髓核基质合成相关ACAN、COL2A1等基因出现显著下调,提示其具有促进退变发生的作用。(3)共转染TWIST与RUNX2于退变髓核后,RUNX2基因引起的促退变效应出现一定程度上的缓解。(4)利用双荧光素酶报告基因检测过表达TWIST后对RUNX2下游功能的影响,发现TWIST能够显著抑制RUNX2的活性。
  结论:我们通过构建RUNX2过表达及干扰载体、共转染TWIST与RUNX2、双荧光素酶报告基因检测等方法,进一步明确TWIST制椎间盘退变,保护椎间盘的作用主要是通过抑制RUNX2的活性来实现的。
[博士论文] 吴卉乔
外科学(骨外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 Nampt参与介导椎间盘退变过程
  背景:
  腰痛在临床上极为常见,超过80%的人一生某个时间中将受到下腰痛的困扰,是目前导致人类残疾的首要原因。椎间盘退变及其继发疾病的一系列相关疾病是导致腰痛最重要的病因。研究证实,椎间盘退变伴随炎症因子表达增加,炎症反应是介导椎间盘退变最重要的病理生理过程,炎症因子或介质不仅能诱导细胞外基质分解酶表达增加、降低细胞外基质合成基因表达、还能诱导神经血管长入,从而引发椎间盘退变及疼痛。
  烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又称内胀脂肪素(Visfatin)和前B细胞克隆增强因子(PBEF),在1994年被首次发现。Nampt在有机体内广泛存在,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的限速酶,研究表明,Nampt具有类炎症细胞因子样作用,参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,在免疫调节、炎症反应、代谢等相关疾病中均发挥重要作用。研究已证实Nampt可通过促炎作用介导细胞外基质降解,参与骨关节炎、类风湿关节炎等疾病的发生。但Nampt在椎间盘退变中的作用目前尚无文献报道,考虑椎间盘退变与骨关节炎、类风湿关节炎具有相似的病理生理机制,本研究拟对Nampt在椎间盘退变中的具体作用机制进行探讨。
  目的:
  1、探讨Nampt在椎间盘退变过程中的表达;
  2、探讨阻断Nampt对椎间盘细胞外基质代谢的影响。
  方法:
  1、获取因腰椎滑脱、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出症需手术治疗患者的椎间盘组织(50例),按Pfirrmann分级分组,退变等级Ⅱ级和Ⅲ级为轻度退变组,退变等级Ⅳ级和Ⅴ级为重度退变组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(WesternBlot)和免疫荧光法检测Nampt在不同退变等椎间盘标本中的表达。
  2、获取椎间盘标本后,采用酶消化法消化、培养髓核细胞,给予不同浓度IL-1β干预48小时或给予IL-1β(10ng/mL)干预不同时间后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,采用NAD活性检测试剂盒检测干预后髓核细胞NAD的活性。
  3、采用Nampt酶活性抑制剂APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  4、采用IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞后联合IL-1β(10ng/mL)共干预髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、以及MMP-3和MMP-13的表达差异;采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞合成相关基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  5、构建三种shRNA质粒敲除载体(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)转染髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。
  6、采用空质粒颗粒Src、shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#预先转染髓核细胞后,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,细胞免疫荧光检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况。
  结果:
  1、本研究纳入的50例标本中,轻度退变等级26例,重度退变等级24例;qRT-PCR检测结果显示重度退变组Nampt在mRNA表达水平显著高于轻度退变组;蛋白印迹法和免疫组化结果显示重度退变组Nampt在蛋白表达水平也显著高于轻度退变组。2、不同浓度IL-1β干预后检测发现Nampt在mRNA水平和蛋白水平表达均随着IL-1β干预浓度增加而增加,呈剂量依赖性;且IL-1β干预不同时间后也发现Nampt表达随着干预时间延长而逐步增加,呈时间依赖性。
  3、APO866干预细胞后,Nampt表达不变,且APO866并不影响IL-1β诱导Nampt表达上调的作用;但APO866可显著降低髓核细胞中NAD活性,且可显著抑制IL-1β上调NAD活性的作用。
  4、IL-1β干预可显著上调细胞外基质分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的表达,且显著下调细胞外基质合成基因蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;而APO866并不影响这些基因的表达,但可显著抑制IL-1β上调ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的作用,以及抑制IL-1β下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用。
  5、三种质粒载体均可显著敲除髓核细胞中Nampt基因表达,无论mRNA层面还是蛋白层面,且可显著抑制细胞NAD活性。
  6、Nampt敲除后并不影响ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用,但shRNA1#和shRNA3#转染后可显著逆转IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调作用,且显著逆转IL-1β对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分解的作用。
  结论:
  1、椎间盘退变过程中伴随Nampt表达增加,且Nampt表达水平与椎间盘退变严重程度呈正相关,说明Nampt参与介导椎间盘退变过程。
  2、IL-1β具有诱导Nampt表达上调的作用,且抑制Nampt酶活性或敲除Nampt均可显著抑制IL-1β对细胞外基质分解的作用,说明IL-1β可能通过诱导Nampt介导椎间盘细胞外基质分解,从而诱导椎间盘退变,且阻断Nampt具有逆转椎间盘退变的作用。该研究为为椎间盘退变及腰痛的治疗提供新思路和新策略。
  第二部分 APO866诱导细胞自噬延缓椎间盘退变的作用及机制
  背景:
  自噬是哺乳动物体内细胞的一种分解代谢方式,在细胞代谢增加或在缺氧、营养匮乏等应激条件下,细胞将通过自噬机制,将受损的细胞器或蛋白等物质转运至自噬溶酶体中进行降解。细胞自噬是细胞发育和存活的重要途径,自噬持续时间过久或程度过强,超出细胞自身调节能力,将导致细胞代谢紊乱甚至凋亡等变化,因此细胞自噬对于维持细胞稳态具有重要作用。目前研究已证实,自噬与多种疾病的发生发展均密切相关,如炎症及免疫性疾病、神经及心血管系统疾病、以及癌症等。椎间盘退变与细胞衰老、缺氧、营养匮乏等具有紧密联系,椎间盘细胞凋亡、衰老或功能减弱是导致椎间盘退变的主要原因。近年来,研究发现细胞自噬也参与椎间盘退变过程,且大多数情况下对椎间盘退变起到保护作用。
  Nampt参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,既往研究表明,APO866可诱导细胞自噬,在缓解急性肝损伤以及抑制肿瘤方面发挥重要作用。然而,APO866是否具有诱导髓核细胞自噬及其在椎间盘退变中的作用目前尚不明确。
  目的:
  1、探讨APO866诱导髓核细胞自噬的作用
  2、探讨APO866通过细胞自噬拮抗IL-1β对椎间盘细胞外基质降解的作用。
  方法:
  1、体外培养髓核细胞,采用不同浓度APO866(0、1、5、10、20、100nmol/L)干预48小时后、或采用APO866 (10nmol/L)干预不同时间(0、24、48、72、96h)后,CCK-8法检测细胞活性、单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  2、米用自噬抑制剂3-MA、或烟酰胺单核苷酸(NMN)、或人重组Nampt(rNampt)预处理髓核细胞,再辅助IL-1β干预与不干预,单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。
  3、髓核细胞单独给予IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866预干预2小时后给予IL-1β共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA(10mmol/L)和IL-1β(10ng/mL)共处理48小时,无干预髓核细胞作为对照。qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原降解情况;Tunel检测细胞凋亡情况。
  结果:
  1、APO866干预浓度达到20nmol/L以上时,髓核细胞活性显著下降。MDC染色发现髓核细胞自噬小体形成数量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。蛋白印迹检测发现LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表达随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性,且APO866干预48h时表达量达到峰值。细胞免疫荧光检测显示LC3蛋白阳性的自噬体膜含量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。
  2、自噬抑制剂3-MA可显著抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。NMN和rNampt干预同样可抑制由APO866诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。
  3、自噬抑制剂3-MA并不能影响IL-1β对Nampt的诱导作用;APO866抑制IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调的作用被3-MA显著逆转;APO866抑制IL-1β降解蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的作用被3-MA显著逆转;APO866具有拮抗IL-1β诱导髓核细胞凋亡的作用,而这一作用被3-MA所逆转。
  结论:
  Nampt酶活性抑制剂APO866具有诱导髓核细胞自噬的作用,且通过自噬作用可显著逆转由IL-1β介导的髓核细胞外基质分解作用。提示APO866有望成为治疗椎间盘退变新的分子靶点及药物。
[博士论文] 郭瑛
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  建立稳定、可重复性好、操作简便的山羊腰椎临界大小骨缺损模型,制备具有良好生物活性的自体富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP),观察其与自固化可注射型磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate bone cement,CPC)复合后的可注射性,以及PRP/CPC复合物填充椎体骨缺损后的材料降解、新骨形成与椎体力学强度等方面的变化,以研究PRP与CPC复合后能否改善CPC的成骨性能及机械性能,从而更好地用于椎体骨缺损的修复。
  方法:
  1.羊全腰椎椎体临界大小骨缺损模型的建立:选取健康成年黑山羊18只,雌雄不限,使用盐酸氯胺酮+丙泊酚+戊巴比妥钠复合静肌麻醉,麻醉状态下取侧卧位、经腹膜后入路到达椎体侧方,在每只羊全部6个腰椎椎体(L1-L6)上分别制备一个大小为6mm×10mm的圆柱状空洞,根据数字表法随机对两个椎体填充PRP/CPC复合物、CPC或不填充任何材料,并因此将实验分为三组,实验组(PRP/CPC)、对照组(CPC)和空白组。观察术中实验动物在麻醉各阶段生命体征及血氧饱和度变化;并在术后6个月时对骨缺损大小进行影像学评估;
  2.PRP制备及与CPC复合后的生物活性及可注射性:用装有1ml复方柠檬酸钠的注射器抽取羊颈静脉全血5ml,利用改良的Landeasberg法制备PRP。测定PRP及全血中血小板及生长因子的含量;通过CaCl2和凝血酶将PRP激活后按10%wt比例与可注射型CPC复合,观察复合物凝固时间、可注射率和抗溃散性,以及植入椎体后的弥散情况;
  3.骨缺损内材料降解及新骨形成:术后1、3、6个月将动物处死后采集腰椎标本进行脱钙组织切片HE染色及未脱钙组织切片Van Gison染色进行组织形态学观察成骨情况,并通过未脱钙未染色组织切片计算PRP/CPC、CPC两组材料降解率;
  4.椎体的生物力学研究:术后1、3、6个月进行CT检查观察椎体骨缺损中皮质骨与松质骨的生长愈合情况;比较三组椎体术后1、3、6个月的抗压强度及刚度以评估其机械性能;
  结果:
  1.所有动物造模手术均顺利完成,麻醉效果满意,优良率为100%。各麻醉阶段血氧饱和度、体温、呼吸等指标比较无差异(P>0.05)。手术结束后动物苏醒时无明显挣扎、躁动等表现,无胃胀、呕吐等不良反应,所有动物均长时间存活。术后各时间点CT检查示椎体未发生骨折,空白组骨缺损在术后6个月时新骨形成有限,缺损未自然愈合,达到临界大小骨缺损标准;
  2.通过改良的Landeasberg法成功制备PRP,进行血小板计数发现PRP中血小板浓度是全血的5倍余(P<0.05),同时激活后的PRP中血小板衍生生长因子-AB(Platelet derived growth factor-AB,PDGF-AB)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等生长因子的含量明显高于全血(P<0.05)。CPC、PRP/CPC复合物最终均自然凝结,PRP/CPC复合物的初始凝结时间以及最终凝结时间均比单纯CPC要长(P<0.05)。两组水泥在推注时表现出良好的粘滞性。PRP/CPC可注射率高于CPC(P<0.05),PRP/CPC的抗溃散性也优于CPC;
  3.脱钙HE染色组织切片光镜下观察有材料填充的两组均未发生炎症及其它免疫排斥反应。空白组在术后1个月仅观察到成软骨形成,未见明显的新生编织骨及胶原骨形成。术后3、6个月可见少量沿缺损边缘的新生骨组织及无钙盐成积的胶原骨。实验组及对照组在术后6个月内可见连续性的成骨表现,术后6个月对照组在骨水泥及新生骨之间存在因成片的新生骨形成产生的“转化带”,实验组更为明显。未脱钙组织切片Van Gison染色观察发现从术后1个月开始实验组、对照组骨水泥均有不同程度吸收,被吸收的空隙内有新生骨形成。成骨活动主要集中在骨水泥-宿主骨界面,但对照组新生骨量少于实验组,且实验组有往骨水泥内部生长的趋势。术后3、6个月两组骨水泥进一步降解并伴新骨继续形成,并且实验组比对照组更明显。PRP/CPC复合物在术后1、3、6个月的降解率均比单独CPC高(P<0.05);
  4.CT平扫示空白组骨缺损大小在术后6个月内无明显变化,6个月时骨缺损边缘皮质骨虽然有少许生长,但缺损内部仍清晰,仅边缘毛糙。实验组及对照组在术后1个月时缺损内骨水泥呈高密度影,材料充盈确实。从术后3个月开始,两组骨水泥均有不同程度显影密度降低,边界模糊不清,实验组更为明显。术后6个月,实验组部分椎体无清晰的骨缺损轮廓,仅可见未被吸收的骨水泥,椎体外侧皮质骨达到完全骨性连接。除术后1个月椎体刚度对照组与空白组无明显差异外(P>0.05),其它时间点两材料填充组的椎体强度与刚度均高于空白组,而实验组椎体的强度及刚度高于对照组(P<0.05),实验组和对照组椎体的机械性能随着时间延长而逐渐提高(P<0.05)。空白组椎体强度及刚度各时间点无明显变化(P>0.05)。
  结论:
  PRP/CPC生物相容性好,植入体内后不会引起机体发生免疫排斥和炎症反应。同时PRP/CPC的可注射性好,可注射型CPC复合PRP后能延长骨水泥凝结时间,术中有充足的时间便于操作,粘滞性好不易渗漏。富含多种生长因子的PRP与CPC复合后能促进骨水泥的降解吸收,同时诱导新骨形成并向骨水泥内长入,从而提高了椎体的机械性能,更适合用于椎体等承重骨缺损的修复。
[博士论文] 桑成林
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  第一部分:绝经后骨质疏松疾病中TNF-α通过JNK信号途径上调Semaphorin3D蛋白表达诱导破骨细胞分化
  一、目的:
  本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α诱导破骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α促进破骨细胞分化中的作用;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白促进破骨细胞分化的作用。本研究的完成对于探索绝经后骨质疏松的发生机制、寻找新的治疗靶点提供重要的理论依据。
  二、方法:
  1、培养正常小鼠来源的破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术对破骨细胞形成的标志性基因(TRAP、c-Fos和NFATc-1)表达检测等方法,明确TNF-α对破骨细胞分化的影响。
  2、在TNF-α促进RANKL诱导破骨细胞分化的过程中,通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E)表达量的变化,并进一步检测SemaⅢ家族蛋白受体(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表达量的改变。
  3、构建假手术组(Sham operation,Sham)小鼠、去卵巢组(Ovariectomized,OVX)小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+TNF-α中和性抗体(anti-TNF-α)小鼠模型,通过酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过微计算机断层扫描技术(micro computed tomography,micro-CT)技术确定模型构建是否成功。
  4、通过TRAP染色观察Sham组、OVX组、OVX+PBS组及OVX+anti-TNF-α组小鼠股骨干骺端的破骨细胞数量变化。
  三、结果:
  1、TNF-α能够增加TRAP阳性染色的破骨细胞数量,并且够促进破骨细胞中TRAP,NFATc1和c-Fos基因的表达,提示TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞形成。进一步研究发现,TNF-α通过作用于破骨细胞分化的早期阶段促进破骨细胞的形成。
  2、在TNF-α正向调控破骨细胞形成过程中SemaⅢ家族蛋白中的sema3D表达量增加最明显,并且TNF-α诱导的sema3D表达量的增加存在时间依赖性。此外,我们发现TNF-α在促进破骨细胞分化的过程中SemaⅢ家族蛋白受体NPR1的表达量明显减少,而Plx-A3的表达量轻微的减少。
  3、过表达Sema3D后能够明显的促进RANKL诱导破骨细胞分化,而阻断Sema3D后RANKL诱导的破骨细胞分化明显减少。此外,过表达Sema3D后能够明显的促进TNF-α正向调控RANKL诱导的破骨细胞分化,而阻断Sema3D后能够缓解TNF-α诱导的破骨细胞分化,提示Sema3D在TNF-α诱导破骨细胞分化的过程中具有重要功能。
  4、TNF-α能够明显的促进破骨细胞前体细胞的增殖,而基因沉默Sema3D后能够明显缓解TNF-α诱导的破骨细胞前体细胞增殖,这些结果证明Sema3D介导了TNF-α对破骨细胞前体细胞增殖的调控。过表达或基因沉默Sema3D后并未影响细胞的凋亡。
  四、结论:
  1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松中破骨细胞分化增加、骨吸收增强的重要因素。雌激素缺乏后导致TNF-α水平升高,过量的TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞分化,并且这种诱导作用发生在破骨细胞分化的早期阶段。
  2、在TNF-α促进RANKL诱导的破骨细胞分化过程中,Sema3D的表达量明显增加。Sema3D的增加一方面通过促进破骨细胞前体细胞的增殖增加破骨细胞的数量,另一方面通过促进RANKL诱导的破骨细胞分化影响破骨细胞的形成。
  3、TNF-α通过激活JNK途径上调了Sema3D的表达。体内抑制Sema3D能够有效缓解OVX诱导的小鼠骨质疏松。
  第二部分:绝经后骨质疏松中TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径下调Semaphorin3B表达抑制成骨细胞分化
  一、研究目的:
  本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化中的功能;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白抑制BMMSCs向成骨细胞分化的分子机制。本研究的完成有助于阐释PMOP的发病机制,尤其是TNF-α相关的骨形成减少的分子机制。
  二、研究方法:
  1、培养正常小鼠骨髓来源的MSCs(BMMSCs)细胞,在TNF-α抑制BMSCs向成骨细胞分化的不同时间点(0天、3天、7天、14天),通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白(Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E)表达量的变化,并通过Western blot技术进一步验证Sema3B在此过程中表达量的变化。
  2、构建Sham小鼠、OVX小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+anti-TNF-α小鼠模型,通过micro-CT技术确定模型构建是否成功,通过Elisa实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端TF-α表达量的变化。
  3、构建TNF-α中和抗体抑制OVX诱导骨质疏松的小鼠模型,免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端Sema3B表达量的变化,qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白受体(Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2)表达量的变化。
  4、分离各组模型小鼠的BMMSCs,qRT-PCR技术检测细胞中Sema3B表达量的变化。
  三、结果:
  1、TNF-α在抑制BMMSCs向成骨细胞分化的过程中sema3A,sema3C,sema3D和sema3E的表达量并没有发生明显的变化,而sema3B的表达量明显的减少且具有时间依赖性。
  2、OVX组小梁骨密度(BMD)和静态微观结构参数(Tb.Th、BV/TV和Tb.N)明显小于Sham组,OVX+anti-TNF-α组小鼠骨量相对于OVX组小鼠明显增加。OVX组小鼠相对于Sham组小鼠小梁骨变细、数量减少,TNF-α中和抗体能够缓解OVX引起的小鼠股骨干骺端小梁骨结构的变化。
  3、OVX组小鼠TNF-α水平明显高于Sham组小鼠,而应用TNF-α中和抗体能够有效地降低OVX组小鼠的TNF-α水平;OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端TNF-α的表达明显增加,而应用TNF-α中和抗体能够明显减少TNF-α表达。
  4、OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端Sema3B的表达明显减少,而OVX小鼠应用TNF-α中和抗体后能够明显增加Sema3B的表达;相对于Sham组小鼠,OVX组小鼠来源的BMMSCs(OVX-MSCs)中Sema3B的表达量明显减少,而TNF-α中和抗体的应用能够明显的增加OVX小鼠BMMSCs中Sema3B的表达。
  四、结论:
  1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松疾病中BMMSCs向成骨细胞分化抑制、骨形成减少的重要因素。在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化过程中,Sema3B的表达量明显减少。Sema3B表达量的降低一方面通过影响BMMSCs的增殖来减少成骨细胞形成的数量,另一方面通过抑制BMMSCs细胞向成骨细胞分化影响骨形成。
  2、TNF-α抑制MSCs细胞向成骨细胞分化的过程中,DKK-1,GSK-3β和β-catenin的蛋白表达量明显降低,提示TNF-α能够明显的抑制MSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径。而Wnt/β-catenin信号途径的激活能够明显的缓解TNF-α对MSCs细胞中Sema3B表达的抑制作用,提示TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径负向调控Sema3B的表达。
[硕士论文] 王超
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:腰椎后路椎间融合内固定手术在治疗腰椎退变性疾病中的应用日益增多,而术后邻近节段退变是该手术重要的远期并发症,其中,症状性邻近节段退变会严重影响手术效果,甚至需要再手术治疗。既往的文献报道初步研究了腰椎融合术后邻近节段退变的危险因素,包括长节段固定、相邻节段减压未固定和术前存在的邻近节段病变。与此同时,矢状面平衡对腰椎融合手术后效果的影响也受到越来越多的关注,但症状性邻近节段退变与脊柱-骨盆矢状面参数的相关性研究较为缺乏。
  研究目的:
  通过比较病例组与对照组初次术前与末次随访时的脊柱-骨盆矢状面参数的差异,探讨腰椎融合术后症状性邻近节段退变与脊柱-骨盆矢状面参数的相关性。
  研究方法:
  病例对照研究。回顾性分析自2013年1月至2017年10月上海长海医院骨科收治的腰椎融合术后症状性邻近节段退变(symptomatic adjacent segment degeneration,SASD)再手术的病例25例,其中男性11例,女性14例,初次手术时平均年龄55.8岁(28岁~76岁),平均BMI为26.9Kg/m2(21.6Kg/m2~37.1Kg/m2),8例为L4-L5固定例,17例为L4-S1固定,发生于头侧的症状性邻近节段退变16例,发生于尾侧5例,双侧4例,两次手术间隔时间为79.6个月(12个月~168个月);获取其初次术前及末次随访时的站立位全脊柱侧位片,测量其脊柱-骨盆矢状面参数,包括胸椎后凸角(thoracic kyphosis,TK)、总腰椎前凸角(total lumbar lordosis,TLL)、下腰椎前凸角(low lumbar lordosis,LLL)、骨盆入射角(pelvic incidence,PI)、骨盆倾斜角(pelvic tilt,PT)、骶骨倾斜角(sacral slope,SS)、矢状面垂直轴(sagittal vertical axis,SVA),并计算LLL占TLL的比例,记为RL。按照1∶2配对的方法获取另外50例腰椎融合术后未发生邻近节段退变患者,其中男性24例,女性26例,L4-L5固定18例,L4-S1固定32例,初次手术时平均年龄55.2岁(32岁~82岁),平均BMI为24.8Kg/m2(19.2Kg/m2~31.4Kg/m2),平均随访时间为78.8个月(12个月~160个月),同样获取其初次术前及末次随访时的站立位全脊柱侧位片,并测量其脊柱-骨盆矢状面参数。
  研究结果与结论:
  两组病例在年龄、性别、BMI、随访时间及初次手术方式均无显著差异(P>0.05),病例组中,LLL在末次随访时小于术前,且RL<60%的人数多于术前,差异有统计学意义;对照组中,术前及末次随访时的腰骶矢状面参数差异无统计学意义。术前脊柱-骨盆矢状面参数中,与对照组相比,病例组TLL明显较小(P<0.01)而PT明显较大(P<0.01),PT-TLL≥10°及SVA>50mm的人数病例组明显多于对照组。末次随访时,病例组TLL明显低于对照组(P<0.01),且RL<60%的人数也是病例组明显较多(P<0.01);与术前相似,PT-TLL≥10°的人数病例组明显多于对照组。经统计学分析,术前TLL降低、SVA>50mm是腰椎融合术后发生症状性邻近节段退变患者的危险因素;且术后RL<60%与SASD的发生有明显关联性,由此可见,手术节段前凸恢复不良导致邻近节段代偿性后凸可能是引起腰椎融合术后症状性邻近节段退变的原因之一。
[硕士论文] 刘德琳
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  全髋关节置换术发展至今已是骨科领域较为成熟的手术之一。但是考虑到髋关节周围神经血管等软组织丰富,手术创伤较大,造成大量的术中出血以及术后渗血。为了将术后渗血引出以降低血肿形成的风险,术后留置引流管一直以来都是围术期常见的处理方法。
  近年来,也有一些学者认为全髋关节置换术后留置引流的益处并不明显,还可能会增加术后出血。因此很多临床医生对于髋关节置换术后引流管理的问题一直有所争论。然而,很多学者忽视了术后的引流液其实是稀释性的,其红细胞压积相对较低。简单将术后引流量作为术后的显性失血量实际上高估了髋关节置换的显性失血而低估了其隐性失血。引流液的真实失血量应根据引流液的红细胞压积计算而得。究其根本,引流的益处是建立在引流装置可以真正有效地将术后早期渗血排出的前提之下。引流的效率则主要取决于引流装置的负压大小,但是目前关于不同负压大小的引流对髋关节置换临床疗效影响的研究较少。
  因此,本研究通过更为准确的计算方法,旨在前瞻性地对比临床中常用的高、低负压两种引流装置对全髋关节置换术围术期失血、术后早期康复及术后并发症等方面的区别。
  方法:
  将我院2017年03月至2017年12月行全髋关节置换术的患者随机分成高负压(最大负压约98kPa)引流组和低负压(最大负压约20kPa)引流组,其中高负压组53例,低负压组51例。检测患者术后引流液的红细胞压积,并计算出相应的引流液真实失血量及隐性失血量。对两组患者引流液红细胞压积、术后引流量、引流液真实失血量、显性失血量、总失血量、异体输血、隐性失血量、隐性失血占比、围术期血红蛋白变化、术后早期康复及术后并发症等方面进行统计学对比。计量资料采用两独立样本t检验,计数资料采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  高、低负压两组患者一般资料(性别、年龄、身高、体重、身体质量指数、术前Harris评分、麻醉方式及手术时间)的对比均无统计学差异(P>0.05)。两组患者术后引流液红细胞压积均较低,组间比较差异无统计学意义(19.25±4.89%VS20.29±4.23%,P>0.05)。两组患者术中出血量相似,差异无统计学意义(P>0.05)。高负压组术后12小时、24小时、48小时引流量均明显高于低负压组(P<0.001)。通过引流液红细胞压积计算后,高负压组患者引流液真实失血量、围术期显性失血量均明显高于低负压组(P<0.001)。两组患者在围术期总失血量、输血例数、输血量方面的对比无统计学差异(P>0.05)。但高负压组隐性失血量比低负压组更少(647.64±299.85ml VS783.53±292.56ml,P<0.05),隐性失血占比也明显低于低负压组,(53.84±9.55%VS67.58±6.80%,P<0.001)。两组患者围术期血红蛋白变化基本相似,仅在术后第一天时高负压组血红蛋百要低于低负压组(111.42±15.28g/L VS117.88±16.43g/L)。在术后早期康复方面,高负压组术后第3天VAS疼痛评分更低(3.30±0.59VS3.86±0.49,P<0.001),术后第3天肿胀程度更轻(103.42±2.17%VS104.62±1.76%,P<0.05)。两组患者术后第7天VAS评分、术后首次下床时间、术后6周Harris评分的比较均无统计学差异。术后并发症方面,两组患者均无伤口内血肿和深部感染发生。两组患者在术后早期发热、伤口延迟愈合、伤口表面感染、深静脉血栓形成方面的比较均无统计学差异(P>0.05)。高负压组出现2例伤口周围瘀斑形成的患者,而低负压组有9例,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:
  全髋关节置换术后使用高负压引流不会增加患者的总失血量,但是其隐性失血量更少,早期疼痛、肿胀程度更轻,伤口周围瘀斑发生风险更低,临床疗效值得肯定。
[博士论文] 胡博
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  下腰痛为困扰当代中老年人乃至年轻人的重要疾患,其每年给国家带来巨大的经济损失以及社会负担。目前认为下腰痛的主要病因为椎间盘退变,椎间盘退变在临床上很常见,其主要表现为椎间盘含水量降低,椎间高度降低;椎间盘含水量的决定分子为其基质成分内的硫酸软骨素,硫酸软骨素的合成由多种合成酶催化,但其在椎间盘退变中的作用鲜有研究。硫酸软骨素已被发现在椎间盘退变中表达降低,但其调控机制尚不清楚,目前大量研究提示炎症因子与椎间盘基质代谢密切相关,我们的预实验结果提示促炎因子白细胞介素-1β可直接下调硫酸软骨素的合成,而抗炎因子转化生长因子-β则促进硫酸软骨素合成,我们进一步假设该调节作用可能是通过其对硫酸软骨素合酶的调控实现,阐明该调控机制有助于在其中寻找相关治疗靶点,从而籍此提高椎间盘硫酸软骨素的合成水平,恢复退变椎间盘的含水量,从而延缓甚至逆转椎间盘退变的进程。
  研究方法:
  该项目在组织层面使用免疫组织化学法及quantitive real-time PCR(RT-PCR)法检测硫酸软骨素合酶的表达水平,使用免疫荧光法以及DMMB法检测硫酸软骨素的水平,使用高通量转录组测序法检测潜在microRNA靶点。细胞层面使用大鼠及人髓核细胞作为研究对象,使用RT-PCR法、Western-Blot法以及双荧光素酶报告基因法在不同维度检测硫酸软骨素合酶的表达水平,使用免疫荧光法检测髓核细胞硫酸软骨素合酶表达的位置及水平,使用搭载不同干扰shRNA的慢病毒载体转染髓核细胞,Western-Blot法以及双荧光素酶报告基因法检测其中不同信号通路蛋白的活化水平。
  研究结果:
  该研究发现抗炎因子TGF-β在上调大鼠髓核细胞CHSY-1以及CHPF的水平,TGF-β对CHSY-1的调控部分依赖经典的Smad信号通路,其主要通过AP1、SP1以及MAPK通路对CHSY-1起调控作用,使用慢病毒载体敲除大鼠髓核细胞CHSY-1可降低髓核细胞以及TGF-β诱导下的髓核细胞合成硫酸软骨素;TGF-β可通过经典Smad通路上调CHPF的表达,MAPK通路以及RhoA/ROCK1信号也参与了TGF-β诱导的CHPF表达。使用慢病毒载体敲除大鼠髓核细胞CHPF也可降低髓核细胞以及TGF-β诱导下的髓核细胞合成硫酸软骨素。以上结果提示CHSY-1以及CHPF对髓核细胞硫酸软骨素的合成起关键作用。但通过对人退变髓核组织CHSY-1、CHPF以及TGF-β的关系进行分析后,发现CHSY-1以及CHPF表达降低,同时伴随TGF-β高表达。提示在椎间盘退变过程中CHSY-1以及CHPF的调节还有其他机制参与。我们进一步关注了促炎因子IL-1β对硫酸软骨素合酶家族的调控,发现IL-1β可下调CHSY-1,2,3的表达,且IL-1β在退变髓核组织中高表达,该结果提示IL-1β在退变环境下对硫酸软骨素合酶的调控相较于TGF-β占主导地位,通过microRNA高通量转录组测序,发现IL-1β对CHSYs家族基因的调节以及髓核细胞硫酸软骨素的合成依赖microRNA-194以及microRNA-515,该研究结果提示microRNAs参与促炎因子对硫酸软骨素及其合酶的调控。
  研究结论:
  椎间盘退变中硫酸软骨素含量降低为髓核组织含水量降低的重要原因,硫酸软骨素合酶家族基因在椎间盘退变中表达显著降低可能为导致硫酸软骨素含量降低的重要原因。促炎因子IL-1β及抗炎因子TGF-β均参与对硫酸软骨素合酶家族基因的调控,促炎-抗炎平衡失调可能为硫酸软骨素家族基因在椎间盘退变中显著下调以及硫酸软骨素合成降低的重要原因。MAPK、Smad、RhoA/ROCK信号介导抗炎因子对硫酸软骨素合酶基因的调控,椎间盘退变中这些通路在促炎因子作用下的应答改变可能为TGF-β对硫酸软骨素合酶调控失偶联的重要原因。促炎因子IL-β可显著降低硫酸软骨素合酶基因的表达以及硫酸软骨素的合成,且该调节过程依赖于microRNA-194以及micro-RNA-515的参与,通过对以上调控机制的阐明,为未来寻找椎间盘退变生物治疗中的潜在治疗靶点提供了新的科学依据。
[博士论文] 宋方龙
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 机械拉力对腱骨愈合过程的影响以及对间充质干细胞和肌腱细胞共培养系统增殖与分化的调节作用
  目的:
  探讨周期性机械拉力对白兔自体半腱肌腱重建前交叉韧带术后腱骨愈合的影响以及在体外模型中对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)和肌腱细胞(tendon cells,TCs)共培养系统的增殖与分化的调节作用。
  方法:
  建立新西兰白兔自体半腱肌腱重建前交叉韧带模型,术后行膝关节持续被动活动(continuous passive motion,CPM)治疗,在术后6周及12周时取材行组织学观察与评分、测试肌腱-骨复合物的抗拔出强度以及RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)法检测腱骨愈合界面相关细胞基质的表达,通过与对照组比较,评价CPM治疗对腱骨愈合的效果。体外实验中,分别分离培养BMSCs和TCs,将两种细胞以1∶1比例直接接触共培养,并使用周期性机械拉力作用于此共培养系统,使用Alamar Blue法检测细胞增殖能力的变化以及RT-PCR法检测其相关基质的合成情况。
  结果:
  前交叉韧带重建术后CPM治疗可以显著促进腱骨愈合,与对照组相比,治疗组的腱骨界面早期出现较多的纤维软骨组织,肌腱-骨复合组织块具有更高的抗拔出强度,腱骨界面的组织中表达更多的CollagenⅠ,alkaline phosphatase,osteopontin,Tenascin C和tenomodulin。另外,与对照组相比,机械拉力可明显促进BMSC/TC共培养系统的细胞率以及增强CollagenⅠ,CollagenⅢ,alkaline phosphatase,osteopontin,Tenascin C和tenomodulin的表达。
  结论:
  机械应力可增强腱骨界面局部前体细胞如BMSCs和TCs的增殖和分化能力,从而促进腱骨愈合。
  第二部分 周期性机械压力对成骨细胞凋亡的调节作用及其机制
  目的:
  探讨周期性机械压力对大鼠成骨细胞凋亡的影响及其机制。
  方法:
  使用周期下落的液滴产生的周期性压力作用于单层贴壁培养的大鼠成骨细胞,通过TUNEL染色和测定Caspase-3的活性来观察不同大小及频率的机械应力对细胞凋亡的效应;选取代表性强度的机械应力刺激成骨细胞,Western blot法测定细胞中MAPKs和PI3K/Akt信号通路中各信号蛋白的活化情况;使用特异性的阻断剂对上述两条信号通路中部分信号蛋白进行阻断,使用流式细胞仪检测高强度机械应力对成骨细胞促凋亡作用的改变情况;使用高强度机械应力刺激成骨细胞,分别阻断JNK和PI3K/Akt信号通路,使用Western blot法测定细胞中Bax/Bcl-2/Caspase-3的活化水平变化情况。
  结果:
  机械刺激以强度依赖性方式调节成骨细胞凋亡,即较低强度的应力(0.15Hz×4cm,0.15Hz×8cm)可抑制细胞凋亡,较强的应力(0.6Hz×8cm)促进细胞的凋亡;应力可激活MAPKs和PI3K/Akt信号通路,随着应力强度的增加,ERK与Akt的磷酸化呈现先增强后减弱的趋势,而JNK与p38的磷酸化呈现不断增强的趋势;当使用较强的应力(0.6Hz×8cm)时,细胞凋亡明显增加(P<0.05),阻断PI3K/Akt通路则显著增加细胞凋亡(P<0.05),而阻断JNK通路可显著减少细胞凋亡(P<0.05);较强的应力(0.6Hz×8cm)可以通过调节Bax/Bcl-2/Caspase-3的活化增加细胞凋亡;当阻断JNK通路后较强的应力(0.6Hz×8cm)所导致的Bax/Bcl-2/Caspase-3通路的活化减少,凋亡减少,而阻断PI3K/Akt后其活化增加,凋亡增加。
  结论:
  低强度应力可抑制细胞凋亡,高强度应力促进细胞凋亡,而这个过程是通过对PI3K/Akt和JNK MAPK两条信号通路的活化程度不同实现的。即低强度应力更多地活化PI3K/Akt通路,发挥抑制凋亡作用,高强度应力更多地活化JNK MAPK信号通路,发挥促凋亡作用。
  第三部分 周期性机械压力对间充质干细胞成脂及成骨分化的调节作用及机制
  目的:
  探讨不同强度周期性机械压力对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂及成骨分化的调节作用及机制。
  方法:
  使用不同强度周期性机械压力作用于单层贴壁培养的大鼠BMSCs,并置于普通培养基或成脂培养基中培养。Western blot和组织学染色检测细胞成骨分化(Runx2和CollagenⅠ)和成脂分化(C/EBPα,PPARγ和脂滴)的效果;使用Western blot检测不同强度周期性机械压力对细胞内PI3 K/Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的活化水平;使用LiCl刺激BMSCs后置于成脂培养基中培养,观察BMSCs成脂及成骨分化的效果;使用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路,Western blot检测周期性机械压力对细胞内PI3K/Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的活化水平。
  结果:
  低强度压力作用后,与对照组相比,普通培养基中的BMSCs中Runx2和CollagenⅠ的表达显著升高,成脂培养基中的BMSCs中PPARγ和C/EBPα显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);而高强度压力作用后,此效应发生逆转。周期性机械压力可激活PI3 K/Akt信号通路,随着压力强度的增加,Akt磷酸化程度降低,而下游的GSK-3β发生上调,β-catenin表达减少。与对照组相比,使用LiCl刺激BMSCs可导致细胞内β-catenin的活化,出现Runx2和CollagenⅠ表达显著增加,而C/EBPα和PPARγ表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。LY294002后可部分降低周期性机械压力导致的Akt的磷酸化,发生β-catenin活化水平的降低。
  结论:
  周期性机械压力可通过或者部分通过PBK/Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路调节大鼠BMSCs的成骨和成脂分化过程。即低强度的压力可促进成骨、抑制成脂分化;而高强度压力抑制成骨、促进成脂分化。
[硕士论文] 周婷
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:骨质疏松是一种年龄退行性疾病,主要症状是骨量减少、骨微结构发生变化。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是成骨细胞的祖细胞,具有多向分化功能,但是老化的BMSCs细胞的成骨分化能力减弱,成脂分化能力增强,因此,老年人的骨质疏松治疗难度较大。抑制BMSCs老化,促进其成骨分化能力是提高老年人骨骼质量的一个突破途径。白藜芦醇具有抗氧化、抗炎等功能,那么白藜芦醇能否抑制BMSCs老化,促进其成骨分化,进而治疗老年入骨质疏松呢?本研究对来源不同月龄小鼠的BMSCs研究发现,随着月龄增加,老化的BMSCs占比增加,细胞增殖速率减慢。加入白藜芦醇后,BMSCs老化现象减少,且呈现浓度依赖性,同时,BMSCs的成骨分化能力显著增强。进一步研究发现,白藜芦醇逆转BMSCs老化的作用是通过激活AMPK信号通路,抑制细胞内活性氧的产生而实现的。这些结果的发现,揭示了白藜芦醇促进BMSCs成骨分化的机制,为老年人骨质疏松的治疗提供了新的方向。
[博士论文] 李乐翔
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分:脱细胞骨软骨基质支架的制备及相关研究
  目的:制备多种兔脱细胞骨软骨支架,并对这些支架进行脱细胞效果、成份、结构与生物力学测试等研究,为组织工程构造骨软骨复合物建立基础。
  方法:利用物理、化学、酶类联合脱细胞方法,对兔股骨滑车关节和肋骨软骨整体进行脱细胞处理,获得整体骨软骨支架,将兔股骨滑车关节和肋两个部位骨软骨按照透明软骨、钙化软骨层、软骨下骨三层结构进行分离粉碎,对三层微粒进行脱细胞处理,重新交联制备关节和肋来源的分层骨软骨支架。对整体骨软骨支架进行组织学染色,荧光比色法对整体支架各分层微粒进行残留DNA含量测定,验证脱细胞程度。利用氨基酸分析仪和荧光比色法对三层微粒中氨基酸和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)进行定量分析,XRD衍射仪对羟基磷灰石进行定量分析,并与天然骨软骨进行对比。检测三种支架密度、孔隙率、孔径、吸水率等物理参数,拉扭复合力学测试机检测三种支架在干燥、湿润状态下的弹性极限、强度极限、弹性模量、脆性等力学机械性能,并和天然骨软骨进行对比。
  结果:本方法脱细胞程度较为彻底。相比天然骨软骨组织,脱细胞过程损失了约20~30%的氨基酸,损失了30~40%的GAG,但无机物并无损失。相比整体支架,分层支架的密度较小,孔隙率、孔径、吸水率更大。相比天然骨软骨组织,无论干燥或湿润状态,两种支架机械性能均差,且分层支架差距更大。
  结论:本研究联合脱细胞效果较为彻底,但有机成分有所损失。脱细胞整体支架与分层支架相比天然组织,机械性能均有不同程度下降,提示结构(尤其超微结构)和成份的完整性对生物力学性能影响至关重要。
  第二部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC的相关体外研究
  目的:分离提取兔髌下脂肪垫间充质干细胞(IPFP-SC)并对之鉴定,检测骨软骨支架的生物相容性、细胞毒性,研究骨软骨基质成份、结构对IPFP-SC向成骨、成软骨分化的影响。初步探讨利用脱细胞基质进行生物3D打印。
  方法:利用胶原酶消化法和贴壁培养法分离提取出IPFP-SC,根据细胞表面分子流式细胞分析(FACS)、免疫荧光(IF)鉴定表型,检测其成骨、成软骨、成脂分化能力。制作兔膝OA模型,比较健康与OA兔IPFP-SC在增殖、迁移、成软骨方面的区别。利用直接接种法、直接植入法、浸提液培养法验证多种脱细胞骨软骨支架的生物相容性与细胞毒性。检测支架骨、软骨的仿生结构和骨、软骨组织成份对IPFP-SC向成骨、成软骨方向诱导的作用。利用Micro-CT扫描和天狼星染色连续切面图像数字化方式,获得兔天然骨软骨的结构数据,制作STL格式文件,对利用脱细胞基质生物3D打印进行初步探讨。
  结果:所提取细胞,FACS及IF验证表达CD73+、CD90+、CD105+、CD 44+、CD34-、CD45-、HLADR-,可向成骨、成软骨、成脂分化。OA个体IPFP-SC相比健康个体,在增殖方面无显著差别,迁移及成软骨能力较弱。三种脱细胞支架生物相容性良好,无细胞毒性。骨软骨的结构、成份均可促进IPFP-SC向成骨、成软骨方向分化。得到的骨软骨结构STL文件可以较好的模拟打印出天然组织。
  结论:所提取细胞证实为间充质干细胞,OA个体IPFP-SC迁移及成软骨能力较弱可能是影响软骨修复的原因。脱细胞支架的仿生结构和组成成份均影响着IPFP-SC向成骨、成软骨分化,这为IPFP-SC体内诱导为目的细胞打下了基础
  第三部分:脱细胞骨软骨支架负载兔IPFP-SC修复兔骨软骨缺损
  目的: 通过将负载IPFP-SC的三种脱细胞骨软骨支架复合体植入兔股骨滑车骨软骨缺损模型中,研究三种组织工程方法修复骨软骨缺损的效果。
  方法:制作42例标准兔股骨滑车关节骨软骨缺损模型。分别将脱细胞关节整体骨软骨支架、脱细胞关节分层骨软骨支架、脱细胞肋分层骨软骨支架三种支架分为3组,组内分为负载或不负载IPFP-SC的亚组,除空白组共6小组,随机分配植入骨缺损模型中。术后1个月、3个月、6个月处死实验兔取得标本,大体观察修复组织的软骨面及软骨下骨面,石蜡切片进行HE、天狼猩红、番红固绿、甲苯胺蓝染色,比较各种组织工程方法修复骨软骨损伤的效果。
  结果:总体修复效果,负载IPFP-SC组优于单纯支架组,空白组最差,软骨修复方面,分层支架组优于整体支架组,软骨下骨修复方面则相反。1月时,除空白组外,各组间差异不大,3月、6月时,包括空白组,各组差异最明显。
  结论:三种组织工程构造方式对骨软骨缺损均能起到一定的修复作用,其中分层支架修复软骨能力较强,整体支架修复软骨下骨能力较强。
[博士论文] 杨明园
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  几年来,脊柱矢状面的参数及其平衡越来越受到人们的关注,包括脊柱参数和骨盆参数,如骨盆入射角(PI)、骨盆倾斜角(PT)、骶骨倾斜角(SS)、腰椎前凸(LL)及胸椎后凸(TK)等。现已经证实,脊柱骨盆参数之间存在明显的关联性,且相互之间通过代偿和调节参与维持脊柱整体的矢状面平衡。此外,脊柱的矢状面参数与患者的生存质量存在明显的关系。因此,相比较冠状面而言,在脊柱畸形及其他骨科手术中,越来越多的外科医生更关注于术后矢状面的恢复和重建。但是,大量的脊柱-骨盆参数及其之间复杂的联系使得脊柱矢状面平衡的研究趋于复杂化。现已经公认的矢状面的平衡调节机制包括三个部分:邻近节段进行代偿(主要是LL和TK之间的代偿)、通过骨盆旋转进行代偿(PT和SS之间的代偿)以及通过下肢的调节(膝关节屈曲等),但是很难能够明确的判断哪些因素是维持脊柱矢状面平衡的主要原因,哪些因素在其中只是起代偿的作用。LL和TK是维持脊柱平衡及脊柱形态的的两个重要弯曲,所以推测LL和TK在脊柱矢状面的维持中起到重要作用。虽然评估脊柱矢状面的参数的数量之多,但是没有一个参数能直接反映矢状面的代偿,且也没有研究去证实脊柱区域性的矢状面参数(LL和TK)是否在脊柱整体的矢状面调节中具有重要的作用。
  目的:
  本课题主要通过临床数据的随访和分析提出脊柱区域性参数(LL、TK)在正常人及青少年特发性脊柱侧凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)患者的矢状面平衡调节代偿中的作用;探索LL和TK是否能用来预测脊柱的整体的矢状面平衡。最后以LL、TK为主要参数,建立术中矢状面重建的预测公式,为患者术前制定精准化治疗方案。
  方法:
  1.正常人维持矢状面平衡的参数研究
  2014.1至2015.8,来本院体检中心体检的健康人群。纳入的研究对象均为无脊柱疾患的健康志愿者,每位志愿者者需拍摄全脊柱正侧位X线,收集志愿者的一般资料和影像学参数。一般资料包括:性别和年龄。影像学资料包括:T1倾斜角(T1上终板和水平线的夹角)、maxLL(最大腰椎前凸角,测量腰椎最大前凸的上下终板之间的夹角)、maxTk(最大胸椎后凸角,测量胸椎最大后凸的上下终板之间的夹角)、骶骨倾斜角(SS,S1的上终板与水平线的夹角)、骨盆入射角(Pelvic Incidence,S1上终板中点的垂线与S1上终板中点和股骨头中点之间连线的夹角)、骨盆倾斜角(Pelvic Tilt,S1上终板中点与股骨头中点连线与铅垂线之间的夹角)和SVA(Sagittal Vertical Axis,C7中点铅垂线与S1后上角垂线之间的距离)。将志愿者分为两组:第一组311名病例,用于探索维持正常人矢状面平衡的主要参数,并建立正常人矢状面平衡的预测公式。第二组29名病例,用于公式效度的检验。
  2.LL和TK之间的匹配(LL-TK)在老年非特异性腰痛人群中的矢状面平衡预测研究
  2012.01至2014.01间,纳入我科门诊129名非特异性腰痛的老年患者,排除腰椎骨折、腰椎管狭窄、骨肿瘤或感染等引起的腰背部的疼痛。每位患者需拍摄全脊柱正侧位X线,收集患者的影像学参数。包括:maxLL、maxTK、SS、PI、PT、SVA、LL-TK和PI-LL(PI-maxLL的差值)。疼痛评分利用Numeric rating scales量表(0-10分)。
  统计分析:
  ①对SVA及年龄、疼痛指数及其他影像学参数做相关性分析;
  ②对LL-TK及年龄、疼痛指数及其他影像学参数做相关性分析;
  ③根据患者的SVA的绝对值是否大于5cm,将患者分为两组:A组(SVA>5cm)和B组(SVA≤5cm);比较两组之间各个一般参数及影像学参数之间是否存在差异;
  ④利用LL-TK和PI-LL制作ROC曲线,求出Cutoff值作为SVA平衡的指标;
  ⑤利用LL-TK和PI-LL的Cutoff值,计算该参考值下,矢状面平衡的阳性率及阴性率,以判断LL-TK是否能用来准确预测矢状面的平衡。
  3.腰椎前凸和胸椎后凸差值在青少年特发性脊柱侧弯(Adolescent Idiopathic Scoliosis)患者术前及术后矢状面中的代偿作用
  纳入2010.01至2013.01,我科接受手术治疗的LenkeⅠ型和LenkeⅡ型患者。收集患者的一般资料,包括姓名、年龄、性别及Risser征。每位患者需在术前及术后拍摄全脊柱正侧位X片。测量收集影像学参数,包括TK、LL、SS、PI、PT、SVA和LL-TK(LL和TK的差值)。通过统计学分析,比较术前术后LL、TK及LL-TK是否发生变化,探讨LL和TK在AIS患者矢状面平衡中的作用。
  4.术中恢复理想矢状面的预测公式研究
  收集2014.01-2015.08,来本院体检中心体检的健康人群。纳入的研究对象均为无脊柱疾患的志愿者共311名,每位志愿者签署临床研究知情同意书。其中220名进行预测公式的建立,其余91名志愿者进行预测公式的检验。每位志愿者者需拍摄全脊柱正侧位X线,收集志愿者的一般资料和影像学参数。一般资料包括:性别和年龄。影像学资料包括:maxLL、maxTK、SS、PI和PT。通过相关统计学分析,建立能够预测术中理想腰弯的公式并进行检验。
  结果:
  1.统计学研究显示:在正常人中,T1倾斜角与maxTK、maxLL与SS、SS与PI、PT与PI之间存在非常密切的相关性(Very good correlation);maxTK与maxLL、maxLL与PI之间存在中等的相关性(Moderate correlation);年龄与T1倾斜角、年龄与maxTK、年龄与SS、年龄与PT、年龄与SVA、T1倾斜角与SVA、SVA与PT、SVA与PI存在弱相关性(Weak correlation);T1倾斜角与maxLL、maxLL与PT、SVA与maxLL、PT与SS存在较弱相关性(Very weak correlation)。多元线性回归分析显示:年龄、T1倾斜角、maxLL、PI和PT为维持正常人矢状面平衡(SVA)的主要因素。预测公式为:SVA=0.294*age+1.367*T1倾斜角-1.149*maxLL-0.704*PT+1.378*PI-34.164。利用另一部分病例,发现该公式具有良好的效度(P=0.307)。
  2.在非特异性腰背痛的老年患者中,矢状面平衡SVA与NRS疼痛指数、年龄、maxLL、PT、LL-TK和PI-LL明显相关。LL-TK与年龄、maxTK、maxLL、SS、PT、PI、SVA、NRS疼痛指数明显相关。根据患者矢状面是否平衡(SVA是否大于5cm),将患者分为2组,统计学研究发现:年龄、maxLL、PT、LL-TK、PI-LL、SVA及NRS疼痛指数存在明显差异。ROC曲线显示:矢状面平衡的LL-TK、PI-LL的cutoff值分别为:0°和13°。利用LL-TK、PI-LL的cutoff值,发现当LL-TK≥0°、PI-LL≤13°时,89%的患者矢状面处于平衡状态;当LL-TK<0°、PI-LL>13°时,87%的患者矢状面处于失平衡状态。LL-TK可以有效地预测非特异性腰背痛的老年群体的矢状面的平衡。
  3.在LenkeⅠ型和Ⅱ型的AIS患者中,术前及术后TK和LL均有显著的减少;术前及术后TK与LL之间均存在显著的相关性;LL与TK的差值(LL-TK)在术前及术后无显著改变;且TK和LL的改变量之间存在明显的相关性。证实了,TK与LL可能是AIS术后维持矢状面平衡的一个重要代偿作用。
  结论:
  1.年龄、T1倾斜角、maxLL、PT和PI是维持正常人矢状面平衡的主要参数。正常人矢状面平衡可以根据预测公式进行预测:SVA=0.294*age+1.367*T1倾斜角-1.149*maxLL-0.704*PT+1.378*PI-34.164。
  2.LL-TK与PI-LL相结合,是预测老年非特异性腰背痛患者矢状面平衡的良好指标。
  3.AIS患者术前术后,LL与TK发生了相同的改变;LL-TK在术前与术后无明显变化。LL与TK之间的匹配可能参与AIS术后矢状面平衡的维持。
  4.术中恢复矢状面的平衡主要通过恢复LL,而LL的恢复主要可能通过TK来恢复。
  5.基于正常成人失状位脊柱骨盆参数的预测模型,可以准确地预测正常人群中矢状面的平衡状态。此外,还可以指导术中腰弯的恢复程度,以恢复矢状面的平衡。
  6.脊柱区域性参数(LL和TK)参与调节脊柱矢状面的平衡,并且恢复LL和TK可以重建恢复矢状面的平衡。
[硕士论文] 汪琳
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  衰老作为一个全身性的事件,不仅以孤立的方式影响着某个组织或器官,其对骨骼系统也产生不利的影响。骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨量减低,骨结构破坏导致骨脆性增加因而易发生骨折的全身性疾病。原发性骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、老年骨质疏松症和特发性骨质疏松症。和衰老相关的骨质疏松症主要指老年性骨质疏松症。抗衰老治疗能够增加小鼠骨小梁量及骨组织生物机械特性,因此,我们有理由相信,抗衰老是治疗老年性骨质疏松症的一种有效方法。
  长久以来,人们一直在研究延缓衰老以达到长生不老的方法。有研究报道:年轻个体的血液、血浆及他们的衍生物能够促进干细胞功能及组织的再生和修复,因此其能够对抗衰老过程。而通过联体共生/血浆注射实现两只动物的血液交换对于衰老/抗衰老的研究具有十分重要的作用。研究表明,异时联体共生/年轻血浆注射能够对抗衰老的不利影响,对于对抗老年性骨质疏松症具有积极的作用;反之,异时联体共生/老年血浆注射能够对年轻动物的组织产生不利的影响。
  因此,我们推测,在动物体内是否存在某种/某些关键的因子,其随着年龄的增长而改变,通过调节这种或这些因子能够影响骨质疏松症的发生发展进程。本课题旨在探讨老年血浆是否能够影响小鼠的骨骼“衰老”,进一步研究其中关键的分子及其对于骨质疏松症的意义。
  方法:
  本研究分三部分进行:
  第一部分 观察异时联体共生/老年血浆注射对年轻小鼠的骨量影响。联体共生实验共分为三个组,分别为年轻小鼠与年轻小鼠共生组,年轻小鼠与老年小鼠共生组,假共生组,在共生模型建立后4周,于一只小鼠尾静脉注射Evan染液,通过观察Evan染液向与其共生小鼠渗透情况,确认联体共生模型是否成功;共生后正常饲养3个月。血浆注射实验分为三个组,分别为注射年轻血浆组,注射老年血浆组,注射生理盐水组,提取18月老年雄性及3月年轻雄性C57小鼠血液、常规离心后收集血浆,将血浆对3月龄年轻C57小鼠进行尾静脉注射,每周2次,每次0.2ml,共注射8周,另外设置一组即对3月龄年轻C57小鼠尾静脉注射生理盐水,每周2次,每次0.2ml。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失及成骨和破骨情况。
  第二部分 筛选影响骨质丢失的关键分子。通过定制蛋白芯片分析联体共生/老年血浆注射两种模型,分别筛选各自的关键分子,交叉得到CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5四种关键分子。然后进行验证实验,实验分为五组:注射老年血浆组、注射老年血浆+CCL11抗体组、注射老年血浆+CXCL1抗体组、注射老年血浆+IL-13抗体组、注射老年血浆+CCL5抗体组,每周注射2次,每次0.2ml老年血浆,抗体注入时,每周1次,每次0.1ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色的方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失的情况。最后得出CCL11效果最强的初步结论。
  第三部分 探讨CCL11与年轻和老年小鼠骨量丢失的关系。本实验分为六组:年轻小鼠组、年轻小鼠注射CCL11组、年轻小鼠注射CCL11+CCL11抗体组、老年小鼠组、老年小鼠注射CCL11组、老年小鼠注射CCL11+CCL11抗体组,每周2次,每次0.1ml CCL11重构体,CCL11抗体注入时,每周2次,每次0.1ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法观察几组动物模型中小鼠的骨量丢失及成骨和破骨情况。
  结果:
  第一部分:在联体共生模型中,年轻与老年小鼠共生组年轻小鼠在BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.area上明显低于其余两组(年轻小鼠与年轻小鼠共生组,假共生组);N.ob/B.Pm及P1NP(骨形成指标)较其余两组减低;N.Oc/B.Pm及CTX(骨吸收指标)较其余两组增高。在血浆注射模型中我们观察到注射老年血浆的年轻小鼠在BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area上明显低于其余两组(注射年轻血浆的年轻小鼠,注射生理盐水的年轻小鼠),且N.ob/B.Pm及P1NP较其余两组减低,而N.Oc/B.Pm及CTX较其余两组增高。这些结果提示:老年血液和血浆确实可加速小鼠骨质和骨量的丢失。
  第二部分:我们发现,注射老年血浆+CCL11抗体的年轻小鼠BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area比注射老年血浆组明显增高;而注射老年血浆+CXCL1抗体组、注射老年血浆+IL-13抗体组、注射老年血浆+CCL5抗体组比注射老年血浆组在上述指标上无明显差异。
  结果提示:CCL11可能是老年血浆可以加速年轻小鼠骨质和骨量丢失的关键。
  第三部分:我们发现,对于年轻小鼠来说,CCL11注射组在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area较年轻小鼠组和年轻小鼠注射CCL11+CCL11抗体组两组均明显减低,N.ob/B.Pm、P1NP均明显减低,而N.Oc/B.Pm,CTX指标明显增高;同样对于老年小鼠,CCL11注射组较其余两组(老年小鼠组和老年小鼠注射CCL11+CCL11抗体组)在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area明显减低,在N.ob/B.Pm、P1NP明显减低,而在N.Oc/B.Pm和CTX上,三组间无明显差异。
  结果提示:CCL11确实可以加速年轻和老年小鼠的骨质和骨量的丢失,成骨细胞功能下降可能是关键原因之一。
  结论:
  1、在异时联体共生模型中,年轻小鼠和同种属老年小鼠共生后,导致年轻小鼠骨量丢失;在血浆注射模型中,对年轻小鼠注射老年血浆后促进年轻小鼠的骨量丢失。
  2、在联体共生模型和血浆注射模型中共同升高的因子为CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5;而其中CCL11为影响骨量丢失的关键因子。
  3、CCL11注射后能引起年轻小鼠和老年小鼠的骨量丢失,且CCL11被CCL11抗体抑制后这种加速骨量丢失的效应消失。
  总之,老年血浆能够加速年轻小鼠的骨量丢失,这种作用可能是通过血浆中高浓度的CCL11实现的。
[硕士论文] 李唐波
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:高位颈髓损伤患者,呼吸功能丧失,死亡率极高,为了降低此类患者的死亡率,重建其自主呼吸功能尤为重要。本课题组在国家自然基金的资助下,采用副神经移位膈神经的方法成功重建了高位颈髓损伤大鼠的呼吸功能,建立了动物模型。本研究旨在通过腺相关病毒、伪狂犬病毒逆行示踪及免疫组织化学染色的方法进一步揭示副神经移位膈神经重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能的中枢机制,为进一步将该方法学运用于临床提供更为殷实的理论依据。
  方法:本实验以成年雄性SD大鼠为实验动物。利用腺相关病毒AAV-Retro-GFP注射副神经、膈神经,进行跨单突触逆行追踪支配正常SD大鼠副神经和膈神经的运动神经元。利用伪狂犬病毒PRV-CMV-EGFP注射副神经、膈神经,进行跨多级突触逆行追踪支配正常SD大鼠副神经和膈神经的前运动神经元及其相关神经核团。利用免疫组织化学染色的方法,对病毒标记核团进行特异性双标,进一步确证病毒标记的神经核团。相同方法,利用腺相关病毒AAV-Retro-GFP、伪狂犬病毒PRV-CMV-EGFP注射吻合神经吻合处远端,进行逆行追踪副神经移位膈神经6个月后支配SD大鼠膈肌运动的运动神经元、前运动神经元及其相关神经核团。并利用特异性抗体对病毒标记核团进行双标,进一步确证病毒标记神经核团。最后,通过对比支配正常SD大鼠的膈神经、副神经及神经移位后SD大鼠的吻合神经的运动神经元、前运动神经元及其相关神经核团的变化,初步揭示神经移位重建高位颈髓损伤SD大鼠呼吸功能的中枢机制变化。
  结果:(1)正常SD大鼠:支配副神经斜方肌支的运动神经元主要集中在延髓网状核。支配副神经的前运动神经元主要集中在孤束核、延髓中缝、面神经核。支配膈神经的运动神经元主要集中在颈髓C4-C6的脊髓前角。支配膈神经的前运动神经元主要集中在腹侧呼吸群、延髓孤束核、延髓中缝、上橄榄核。(2)神经移位后SD大鼠:支配吻合神经的运动神经元主要集中在延髓网状核。支配吻合神经的前运动神经元主要集中在孤束核、延髓中缝、面神经核。
  结论:神经移位6个月后,SD大鼠的副神经核和(或)上级神经元发生了重塑,形成了与腹侧呼吸群神经元相同或相似的突触,从而建立了副神经核→副神经→膈神经→膈肌的神经支配通路。最终由副神经核神经元产生节律性电冲动,通过吻合后神经支配膈肌,重建高位颈髓损伤后大鼠的呼吸功能。
[硕士论文] 周文超
外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:颈椎后纵韧带骨化(Ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是指颈椎椎体后方因退变或应力刺激等原因,导致后纵韧带异位骨化,进而压迫椎管内颈髓,出现神经功能障碍的一种疾病,神经功能障碍可表现为四肢感觉、运动异常,伴或不伴随肌肉萎缩,严重者可因突发的外力而出现四肢瘫痪、大小便失禁,严重危害人类健康。OPLL发病具有种群、地域特异性,流行病学调查研究表明该疾病在日本、中国等国家发病率居高,最早由日本人报道,因此该病又称为“日本病”。文献报道该病与内分泌激素、机械应力刺激及遗传因素等多种机制相关,单一因素无法解释颈椎后纵韧带骨化症的发病机制。学者认为基因调控与后纵韧带骨化发生密切相关,因此探索OPLL特异性基因改变并探索其发病机制尤为重要。
  除此之外,颈椎后纵韧带骨化起病隐匿,无早期特异性症状,缺乏行之有效的早期筛查、诊断方法。OPLL诊断金标准为颈椎CT,该项检查具有预约时间长,辐射剂量大,价格昂贵等缺点。CT检查操作相对简单,扫描速度快,CT薄层扫描可以重建器官、病灶三维影像,方便临床诊断和治疗,大大提高患者生存率,预后改善明显。由于以上优势,自21世纪至今CT检查的普及率越来越高,尤其在我国基层医院使用频率逐年增加。当人们享受这一便利时,被检查者接受的辐射剂量也随之增多,增加了致癌的风险。因此如何进行早期、快速、精准、无创的诊断成为目前OPLL又一亟待解决的问题。
  目前较多文献报道后纵韧带异位骨化与成骨相关基因表达密切相关,其表达受到上游调控因子的调节,提示与OPLL的发生、发展有重要联系。在众多调节机制中,microRNA(miRNA)起到了至关重要的作用。miRNA是一类进化上高度保守的小分子非编码RNA,主要在转录后调控基因表达,长度在18-22nt之间,人体内miRNA调控超过三分之一以上的基因表达,调控多种生理病理过程,比如生长发育、免疫应答、肿瘤发生等。在肿瘤发生等领域,有大量实验分析肿瘤组织及该器官正常组织的miRNA,表明某些特异性miRNA表达的上调或下调与肿瘤发生密切相关。这一现象提示我们从该角度出发,探索OPLL的发病与miRNA的发病机制、临床诊断和治疗之间的关系。因此,我们设计了相关实验,筛选出OPLL的特异性miRNA,从而为无创、高效的诊断OPLL提供新方法、新途径。
  第一部分:疾病特异性miRNAs筛选
  本部分为前期结果,我们利用高通量测序技术筛选出了OPLL中差异表达的miRNAs,确定了5个显著上调的miRNAs(miR-10a-3p,miR-10a-5p,563,885-5p,和210-3p)和5个显著下调的miRNAs(miR-129-3p,199b-5p,212-3p,218-3p和196b-5p)。随后,利用real-time PCR进行了验证,发现了多种miRNAs与OPLL具有较强的相关性,提示差异表达的miRNAs可能和OPLL的发生、发展有关。为后续研究OPLL的特异性生物标志物提供了前期基础和研究OPLL发病机制的切入点。
  第二部分:外周血miRNA的验证及稳定性检测
  目的与方法:(1)根据影像学表现及临床症状选取5例健康志愿者,并分别采集外周血;(2)通过qPCR验证上述实验所获取的表达上调最显著的5种miRNA;(3)冻融实验验证血清、血浆中miRNA的稳定性。
  结果:(1)经外周静脉抽取5例健康志愿者早晨、空腹时外周血2管(一管为EDTA采血管,用于分离血浆;另一管为普通采血管,用于分离血清);(2)血清和血浆中均可以检测出表达上调最显著的5种miRNA(miR-10a-3p,miR-10a-5p,miR-563, miR-210-3p和miR-885-5p),并且血清和血浆中miRNA表达量无显著性差异;(3) miR-563,miR-10a-3p和内参U6经反复冻融之后表达无明显下降,说明其在外界环境中可稳定存在。
  结论:我们利用qPCR技术证明在正常人群外周血中同样存在多种差异表达的miRNA,它们在血清和血浆中广泛存在,均可用于后续实验;除此之外,冻融实验表明部分miRNA在外界环境可稳定存在,为miRNA成为诊断OPLL特异性生物标记物提供可能性。
  第三部分:外周血OPLL诊断性miRNA的检测
  目的与方法:(1)根据影像学表现及临床症状进行分组:OPLL组、颈椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IDD)组、正常对照组;(2)对所有入选人员采集外周血;(3) real-time PCR分析入选miRNAs表达量;(4)三组人群进行miRNAs差异表达统计学分析;(5)确定诊断OPLL的特异性miRNAs,并进行AUC曲线绘制,确定miRNAs诊断特异性。
  结果:(1)根据影像学表现及临床症状纳入OPLL患者68人、IDD患者45人;正常对照组53人,三组患者年龄、性别等一般参数无显著性差异;(2)经外周抽取三组患者早晨、空腹时外周血(采用EDTA采血管);(3)MiR-10a-3p、miR-196b-5p和miR-129-2-3p表达量在OPLL组和非OPLL组具有显著性差异,在IDD组和OPLL组无显著性差异;miR-218-1-3p表达量在OPLL组和IDD组具有显著性差异,在OPLL组和正常对照组无显著性差异;miR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p表达量在三组中均具有显著性差异。(4) MiR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p三种miRNAs联合的AUC为0.950。
  结论:MiR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p在三组患者中表达量均有显著性差异,三种miRNAs联合的AUC为0.950,说明三者联合可作为诊断OPLL的特异性生物标志物。
  后纵韧带骨化症是一种临床工作中常见的脊柱韧带骨化性疾病,为椎体后方后纵韧带骨化,压迫后方脊髓,从而产生较重的神经功能障碍。该病早期可无任何症状或症状较轻,无特异性;后期脊髓严重受压时则会出现行走障碍或大小便失禁等症状。诊断该病的金标准为高分辨率薄层CT,但CT检查具有辐射性。近几十年来,随着循环标志物检测技术的发展和应用,越来越多miRNAs种类得以证实,功能状态相关研究也越来越多。目前已经证实miRNAs异常和肿瘤发生、病毒感染等疾病密切相关,但是其与脊柱相关性疾病的关系尚不明确。针对上述问题,我们创新性的从microRNAs入手,寻找二者之间的联系。利用高通量技术的优势,从后纵韧带细胞中筛选出OPLL差异表达的miRNAs,并通过real-time PCR验证差异表达的miRNAs与高通量测序结果基本一致。随后,在OPLL患者外周血中进一步验证了血清和血浆中均可以检测出表达上调最显著的5种miRNAs(miR-10a-3p,miR-10a-5p,miR-563,miR-210-3p和miR-885-5p),说明miRNAs广泛存在于外周血中,结构稳定,并可被检测到,为miRNAs成为诊断OPLL特异性生物标记物提供可能性。最后,我们对已筛选的10种miRNAs在不同脊柱疾病中进行比较分析,从而界定出OPLL特异性生物标志物:miR-10a-5p,miR-563和miR-210-3p。三种miRNAs联合的ROC曲线分析表明其AUC为0.950,为诊断OPLL提供另一条途径,不仅为诊断OPLL提供了前期理论依据,而且为解释韧带骨化发生发展提供了方向。
[硕士论文] 姜里强
外科学(骨外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:椎弓根螺钉置入是目前常用的脊柱内固定技术,但由于椎弓根形态特殊,椎体旁血管及神经丰富,椎弓根穿刺及置钉过程中定位困难、风险较高,穿刺失败往往造成灾难性后果。椎弓根穿刺及置钉过程中的精准“定位”和“定向”问题是目前骨科手术导航研究的热点和难点。新型激光定位导航系统基于C臂机研发,手术路径指示直观,定位精准度高达1.0mm,其线性导航原理与传统的类GPS定位原理不同。本研究为新型激光定位导航辅助下实施椎弓根螺钉置入的应用研究,评价该新型激光导航下置钉的可行性、安全性及精确性等问题。
  方法:实验第一部分,以人体脊柱标本建立椎弓根穿刺点模型,C臂机沿脊椎长轴在-30°~30°以5°为间隔旋转并透视出椎体椎弓根影像,用激光对穿刺点的位置进行定位验证,志愿者对不同旋转角度的椎弓根及穿刺点成像进行判定,总结成像规律。实验第二部分,将正常人体脊椎CT数据三维重建后,计算机模拟确定穿刺的最佳位点、最佳角度及最佳深度,测算椎弓根穿刺及置钉过程中穿破内侧及外侧皮质的角度阈值;3D打印椎体,并在最佳穿刺点处置入钢珠,分析该3D打印椎体在C臂机上的成像,验证线性导航辅助下椎弓根穿刺及螺钉置入的可行性。实验第三部分,选择5具尸体标本,实验组及对照组分别对应同一椎体的两侧椎弓根,标本术前扫描CT,规划手术路径;实验组行激光导航辅助下经皮椎弓根螺钉置入术,对照组采用开放直视下椎弓根徒手置钉术,记录椎体及椎弓根定位时间、椎弓根置钉手术时间,术后对标本行X片及CT平扫,根据Gertzbein and Robbins评价体系判断置钉成功率;将术后椎弓根螺钉的实际进针点、实际置钉路径与最佳进针点、最佳置钉路径在CT影像上进行比对,对部分CT扫描时金属伪影较大的椎体切开,直视下判断椎弓根螺钉穿出皮质情况,评价置钉精确性。
  结果:(一)椎体椎弓根及其穿刺点在C臂机的成像随着椎体角度的变化而变化,将C臂机的透视角度调整至椎弓根轴位可结合激光线性导航。(二)椎弓根轴位透视时,最佳穿刺点(钢珠透视位点)处于椎弓根影中心处,此时C臂机的透视调整角度与计算机重建后模拟测算的椎弓根偏斜角度契合,椎弓根轴位透视位置为激光线性导航最佳穿刺引导位,此时导航设备偏斜角度可根据椎弓根偏斜角度测算,从该节段椎体“标准前后正位”至“椎弓根轴位”调整简单合理,具有可行性。当椎弓根穿刺路径为模拟的最佳穿刺路径时拥有最佳的置钉效果,其穿破皮质的角度阈值最大,手术具有最低的风险,术者的操作误差完全可以在其穿刺阈值范围之内,激光导航下椎弓根置钉具有可行性。(三)以Gertzbein and Robbins评价体系评价实验组及对照组的置钉精准度,录入SPSS19.0软件,实验组置钉成功率为94.29%(33/35),对照组对照组置钉成果率为91.42%(32/35),两组间无统计学差异(P值>0.05);进针点偏离值实验组平均为1.08±0.76mm,对照组平均为2.61±0.89mm,两组具有统计学差异(平均差1.53,95%CI=1.34~1.72,P<0.05);进针方向偏离值实验组平均为2.41±1.18°,对照组平均为4.52±0.99°,两组有统计学意义(平均差2.11,95%CI=1.59~2.52,P<0.05),实验组置钉精确性优于对照组;椎体及椎弓根定位时间,实验组平均为294.9±50.93s,对照组平均为433.3±60.78s,手术时间实验组平均506.2±63.7s,对照组平均633.7±114.9s,P值均小于0.05,两者具有统计学差异,导航下置钉可有效减少椎体椎弓根定位及置钉手术时间。
  结论:使用新型激光定位导航系统辅助椎弓根穿刺及螺钉置入术可行性强、安全性好、精准度高,为椎弓根穿刺及螺钉置入术提供了新的研究方向和理论依据,同时对于其他精准微创操作也具有借鉴意义。
[博士论文] 张鹏
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:自上世纪30年代第一例枕颈融合手术报道以来,枕颈融合手术已有了长足的发展,在恢复枕颈交界区稳定性、提高植骨融合率及维持复位等方面均取得了令人满意的效果。但近年来,部分患者枕颈融合术后出现下颈椎曲度异常,严重者出现后凸畸形或半脱位,有的甚至需要二次手术治疗,从而引起了临床医生的关注。目前关于枕颈融合术后出现下颈椎曲度异常的研究,主要集中于影像学对枕颈角(O-C2角)与下颈椎曲度(C2-C7角)的观察随访,而其生物力学机制尚未得以阐明。另外,在离体生物力学研究中,由于标本的离断,O-C2角的测量难以实现,而后枕颈角(POCA角)的使用却不受影响,但有文献指出POCA角的可靠性尚有待进一步验证。
  目的:
  1、通过多人重复测量及统计分析,验证POCA角的可靠性。
  2、通过人尸体颈椎标本的离体生物力学研究,分析不同的POCA角对下颈椎各节段的运动范围(ROM)和椎间压力(IDP)的影响,揭示枕颈融合术后下颈椎曲度变化的生物力学机制,为枕颈融合手术术中POCA角固定大小的选择提供重要的理论依据。
  3、通过临床随访研究,对枕颈融合手术前、后以及最后一次随访时的O-C2角和POCA角以及C2-C7角的关系进行评价,揭示POCA角的临床意义。
  方法:
  1、由3名资深骨科医生对30名健康志愿者以及30名罹患枕颈部疾患需行枕颈融合手术患者的中立位颈椎侧位X光片的O-C2角及POCA角进行测量、记录。间隔至少两周以后相同的3名医生再次测量、记录,两次记录分别用不同的文档,避免影响测量结果的真实性。通过计算组内相关系数(ICC),统计分析每名医生前后两次测量之间的复测信度(intra-observer ICC)及3名医生测量之间的观察者间信度(inter-observer ICC),并对健康组和疾病组的O-C2角及POCA角进行统计分析。
  2、选用8具新近死亡的青壮年颈椎标本作为实验材料,应用强生辛迪思(DePuy Synthes)公司的枕颈融合系统,以及生物力学试验机、OptiTrack(@)运动捕捉系统、060型微型压力传感器及与之适配的P3型应变测量仪和记录器等实验工具,使用混杂测试模式模拟颈椎三维运动。其中枕颈固定节段为枕骨(C0)、枢椎(C2)及第三颈椎(C3)。测试分为6种工况分别进行,其中第1种是未行内固定的正常组,其余5种是枕颈固定时将POCA角固定于不同角度的实验组,分别为:1、中立位组(POCA=111°),2、中立位-SD组(POCA=101°),3、中立位+SD组(POCA=121°),4、中立位-2SD组(POCA=91°),5、中立位+2SD组(POCA=131°)。实验中对各运动节段(C3/4、C4/5、C5/6、C6/7)在前屈、后伸、左旋及左侧弯等4个方向上的运动范围(ROM)以及椎间压力(IDP)进行监测记录。对正常组和各实验组在各个运动方向上的ROM以及IDP进行统计分析比较。
  3、对2005年1月到2016年12月之间在海军军医大学第二附属长征医院骨科脊柱病区收治的由同一名手术医生行枕颈融合手术治疗的30名患者进行回顾性研究。统计其术前、术后第二天以及最后一次随访时的中立位颈椎侧位X光片的O-C2角、POCA角、C2-C7角等三个参数。比较、分析O-C2角、POCA角、C2-C7角之间的相关性和变化趋势。
  结果:
  1、本研究中健康组的O-C2角为:19.72°±6.80°,POCA角为:111.13°±9.71°;疾病组O-C2角为:7.12°±11.70°,POCA角为:121.23°±14.64°;两组间有的统计学差异(P<0.001,P=0.003)。3名医师对健康组O-C2角测量的复测信度分别为:0.975、0.948和0.974,观察者间信度为:0.983;对POCA角测量的复测信度分别为:0.984、0.856和0.945,观察者间信度为:0.948。3名医师对疾病组的O-C2角测量的复测信度分别为:0.990、0.988和0.986,观察者间信度为:0.995;对POCA角测量的复测信度分别为:0.998、0.997和0.997,观察者间信度为:0.999。
  2、枕颈固定以后,C0到C3之间各个方向的ROM较正常组显著减小,而C3-C7各节段间在各个方向上的ROM较正常组均有显著增加。而POCA角的改变,四个方向的测试中,其对前屈和后伸的影响最为显著,且各节段ROM的变化趋势相似。其中,在前屈方向上,随着POCA角的增大,各节段的ROM随之减小;而后伸方向上,趋势相反,随着POCA角的增大,各节段的ROM随之增大。而POCA角固定于中立位时,虽然各节段前屈、后伸时的ROM虽然仍明显大于正常组,但未出现POCA角过小时前屈方向上和过大时后伸方向上的极度增大的活动度。虽然施加内固定以后,各实验组在左侧弯及左旋转方向上的ROM均显著增加,但POCA角的改变对这两个方向上的ROM均无显著影响。而IDP的测试结果仍可看出POCA角对前屈、后伸影响的趋势,随着POCA角的增大,各节段前屈时IDP呈现减小的趋势;同样各节段后伸时IDP也呈现减小的趋势。
  3、枕颈融合手术治疗以后患者症状均获得明显改善;术前O-C2角与POCA角、C2-C7角呈负相关,POCA角与C2-C7角呈正相关;术后、末次随访时的O-C2角、POCA角及C2-C7角均较术前获得改善;末次随访时的O-C2角、POCA角及C2-C7角和术后之间无明显差异,术后及末次随访时的O-C2角与POCA角、C2-C7角呈负相关,而POCA角与C2-C7角之间无显著相关;末次随访时O-C2角的变化值和末次随访时POCA角的变化值、末次随访时C2-C7角的变化值之间呈负相关,末次随访时的POCA角变化值与C2-C7角变化值之间呈正相关。
  结论:
  1、健康组和疾病组之间的O-C2角和POCA角均存在显著差异。这两种测量方法对健康人群及罹患枕颈部疾患的人群的枕颈序列的评估均有较高的复测信度和观察者间信度。POCA角是一种临床实用性强、可靠性高的枕颈序列观测指标,可用于临床及实验研究。
  2、枕颈固定以后,固定节段的ROM显著减小,而其余运动节段均出现代偿性活动增加。POCA角中立位固定时,相较于过曲和过伸位固定,其在前屈后伸时可避免出现极度增大的活动度,且各运动节段的椎间压力也近似正常。因此,枕颈固定时,POCA角固定在中立位的111.13°±9.71°左右可获得最佳的生物力学环境。
  3、枕颈融合手术可有效改善枕颈序列并维持复位。POCA角是全颈椎序列的一个重要参数,它的变化与O-C2角的变化呈负相关,与C2-C7角的变化呈正相关。为减少枕颈融合术后下颈椎序列异常的发生,术中不应只简单过度后伸复位,应对POCA角的选择持谨慎态度,应全面考量颈椎的整体序列。对于术前下颈椎曲度较小的患者,术中固定时不宜将POCA角较术前作较大幅度的减小。
[硕士论文] 张云
麻醉学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  颈椎病是临床常见的疾病。它有4种类型,分别是神经根型颈椎病、脊髓型颈椎病、椎动脉型颈椎病以及交感神经型颈椎病。神经根型颈椎病(cervical spondylotic radiculopathy,CSR)在各型颈椎病中最常见,约占颈椎病的60%~70%。特别是进入老年化时代,颈椎病老年患者发病率越来越高。目前CSR的治疗方法主要针对病因治疗,有物理治疗、手术治疗以及微创介入治疗。物理治疗包括手法按摩、颌枕吊带牵引等,以解除肌肉痉挛,增大椎间隙,减轻对神经根的压迫和刺激,老年CSR患者多采取保守治疗,往往易复发且效果不佳,老年患者手术疗法不但费用高,创伤大、术后恢复较差,且老年患者常合并其他系统疾病,手术风险较高。很多患者因颈椎病行手术治疗,术后疼痛仍无明显缓解甚至疼痛加重。因此针对老年CSR患者其治疗方法有限。随着射频(radio frequency,RF)等微创技术的逐日成熟,为老年CSR患者提供了一种更为可选的治疗方法。本研究将超声和CT引导颈椎间孔外侧入路行射频热凝联合消炎镇痛液注射治疗同单纯消炎镇痛液注射治疗老年CSR患者进行比较,观察两种不同治疗方法对老年CSR患者的临床疗效。
  研究方法:
  采用随机数字表法将50例老年CSR患者随机分为两组,试验组(T组)和对照组(C组)各25例。治疗均先用超声进行体表定位,试验组全程CT引导下进行穿刺定位。试验组(T组,n=25)行射频热凝(55℃60s,60℃120s,65℃60s)+消炎镇痛液(配方:0.25%利多卡因+地塞米松10mg+碘海醇共4ml)注射治疗。对照组(C组,n=25)单纯行消炎镇痛液(配方:0.25%利多卡因+地塞米松10mg+无菌生理盐水共4ml)注射治疗,对照组需行4个疗程的治疗,每周注射一次,4个疗程结束后进行随访。两组均在超声引导下行病变颈椎间孔外口靶点穿刺。治疗结果从安全性和有效性两方面进行评价。安全性主要是看术中有无血管、神经损伤;术后有无麻木、神经功能障碍的发生。有效性评价主要为治疗前、治疗结束后1个月以及治疗结束后6个月对患者采用疼痛视觉模拟评分法(VAS)进行评分,使用改良Macnab标准评价治疗结束后6个月临床疗效以及两组患者对治疗的满意度。
  研究结果:
  所有患者均成功进行治疗,其中观察组有5名老年CSR患者失访,对照组有2名患者失访,3名患者中途退出治疗。最终试验组20例患者纳入统计分析,对照组也是20例患者。治疗过程中及治疗后无一例患者出现血管、神经损伤;术后无一例患者出现麻木、神经功能障碍的发生。所有患者于治疗后1个月、6个月进行随访。与治疗前相比,治疗结束后1个月试验组和对照组疼痛VAS评分均较治疗前降低(试验组:3.00±1.22vs8.1±0.77;对照组:5.25±0.89vs7.95±0.80)、治疗结束后6个月试验组和对照组疼痛VAS评分也较治疗前降低(试验组:1.4±1.32vs8.1±0.77;对照组:4.05±1.20vs7.95±0.80),其中试验组治疗结束后1个月、6个月疼痛VAS评分降低更为明显(治疗结束后1个月:3.00±1.22vs5.25±0.89;治疗结束后6个月:1.4±1.32vs4.05±1.20),两组数据对比差异有统计学意义(P<0.05),试验组临床疗效优良率高达85%,对照组优良率仅45%,两组数据对比差异有统计学意义(P<0.05),所有老年CSR患者对本次治疗的满意度较高,试验组和对照组满意度均为100%。
  结论:
  本疼痛中心通过对40例老年CSR患者治疗发现,作为介于保守治疗和手术治疗之间,超声联合CT引导颈椎间孔外口行射频热凝联合激素治疗老年CSR患者为一种操作简便且安全有效的治疗方法,其相对于单纯注射治疗而言,疼痛缓解持续时间更长,临床疗效更优,是老年CSR患者比较理想的治疗方法,与手术相比治疗费用低,对老年患者创伤较小,值得在未来临床实践中继续深入推广和研究。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部