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[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[硕士论文] 余今菁
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究结直肠腺癌与腺瘤性息肉患者肠道微生物群落构成变化,探索肠道菌群和结直肠腺癌发生发展间的内在关系。
  方法:选取湖北地区于武汉天佑医院和十堰太和医院消化内科就诊的结直肠腺癌、腺瘤性息肉患者及健康对照人群的粪便样本,应用Illumina Miseq高通量测序平台进行16S rRNA基因V4区测序,采用生物信息学方法分析肠道微生物群落结构、丰度与多样性的变化,筛选与结直肠腺癌发病有显著相关的微生物种属。
  结果:1、本研究最终纳入结直肠腺癌51例,腺瘤性息肉54例,健康对照组42例,组间在年龄、性别上无差异(P>0.05);
  2、测序数据质控后进行OTU分析,共得到1416个OTU,采用稀释曲线、observed species指数、chao指数、shannon指数及simpson指数等Alpha多样性指数进行分析,证实测序量足够覆盖肠道菌群种属,各组样本的丰富度和均匀度良好,随健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化,组内物种多样性呈下降趋势;
  3、在门水平上,三组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门与变形菌门,且样本均表现出明显的个体差异,属水平上三组共包含168个菌属,其中菌群多样性最高的菌属属于厚壁菌门,丰度最高的菌属均来自拟杆菌门;
  4、PCA分析和PCoA分析发现,在结直肠腺癌与健康对照组、腺瘤性息肉与健康对照组间均展现出组间聚类,表明疾病组与对照组间肠道菌群物种多样性存在差异;结直肠腺癌组与腺瘤性息肉组在PCA分析中未表现明显差异,两组菌群构成较为相似;
  5、样品组间菌群构成显著性差异分析发现,门水平上,变形菌门、梭杆菌门相对丰度随健康-腺瘤-腺癌的疾病发展呈升高趋势,厚壁菌门的相对丰度随疾病发展呈降低趋势,厚壁菌门/拟杆菌门比值在CRA组与CRC组中降低;在属水平上,乳杆菌属、消化链球菌属、微单胞菌属、梭菌属、弯曲菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、副球菌属、Morganella菌属、Aggregatibacter菌属、海杆菌属、拟杆菌属、紫单胞菌属、二氧化碳噬纤维菌属、梭杆菌属、纤毛菌属、Scardovia菌属、奇异菌属、Bulleidia菌属和密螺旋体属的相对丰度在健康、腺瘤、腺癌样本中逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);而罗氏菌属、粪球菌属、Faecalibacterium菌属、Blautia菌属、Anaerostipes菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度在健康-腺瘤性息肉-腺癌的变化过程中显著降低(P<0.01)。
  结论:肠道菌群与结直肠腺癌及其癌前病变的发生发展存在密切关系,Faecalibacterium菌属、罗氏菌属等丁酸盐产生菌在腺癌及腺瘤性息肉中低表达,弯曲菌属、假单胞菌属、梭形菌属等细菌的丰度变化与癌变过程呈正相关。
[硕士论文] 程小玲
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:目前长链非编码RNA H19对于宫颈癌Hela细胞生物学功能的作用及其作用机制尚缺乏相关研究。本文主要探讨了LncRNA H19在宫颈癌Hela细胞中的生物学功能研究。
  方法:本研究选择在3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)和正常上皮细胞株(H8)中来检测LncRNA H19的表达。构建含H19基因的重组真核表达载体pCDNA3.1-GFP-H19,经双酶切及基因测序等鉴定构建成功,并合成siRNA的LncRNA H19干扰序列,同时设置空白对照组、pCDNA3.1-GFP组及si-NC组。各组细胞转染48h后采用RT-qPCR法检测LncRNA H19mRNA相对表达水平;采用CCK-8法检测在转染后24h、48h、72h及96h细胞的增殖率;采用流式细胞仪分别检测各组24h和48h细胞凋亡率;采用细胞划痕实验检测各组细胞转染后的迁移数,评估细胞迁移能力;采用Transwell细胞体外侵袭实验检测各组细胞转染后的侵袭能力;采用Western blotting的方法检测LncRNAH19对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达。
  结果:3种宫颈癌细胞株(HeLa,C33A,CaSKi)中LncRNA H19的表达明显高于正常上皮细胞株(H8)中LncRNA H19的表达。首先,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外增殖和抑制其凋亡,沉默LncRNA H19可以显著抑制Hela细胞体外增殖和促进其凋亡。其次,过表达LncRNA H19可以显著促进Hela细胞体外迁移、侵袭,沉默LncRNA H19可以抑制Hela细胞体外迁移、侵袭,该效应直接与EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达相关。
  结论:上调LncRNA H19可以显著促进宫颈癌细胞增殖和抑制宫颈癌细胞凋亡,下调LncRNA H19表达则反之;上调LncRNA H19促进宫颈癌细胞迁移、侵袭,下调LncRNA H19表达则反之,同时可以引起EMT上皮标志物E-cadherin,间质标记物Vimentin及其MMPs家族中的MMP-9的蛋白表达发生改变。LncRNAH19在宫颈癌的发生、发展及预后中充当了重要角色,有可能作为一个发现及判断其预后的潜在生物标记物。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[硕士论文] 彭立嗣
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)不仅有细胞保护作用,而且参与抗癌药物耐药性的产生。但是,GST同工酶在胰腺癌化疗耐药中的作用仍不清楚。本研究将检测GSTM2基因在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达。并通过siRNA及shRNA沉默GSTM2基因,分别转染胰腺癌细胞及注入裸鼠胰腺构建原位移植瘤模型后用吉西他滨处理,从体外、体内实验两个层面观察在胰腺癌中沉默GSTM2对吉西他滨敏感性的影响。最后分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  结果表明吉西他滨处理可以增加胰腺癌细胞株及胰腺癌组织中GSTM2的表达。沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞的凋亡增加、活力降低,体内实验进一步表明在裸鼠胰腺原位移植瘤模型中利用shRNA诱导GSTM2沉默,能增强吉西他滨化疗的药物敏感性。研究还发现,GSTM2在胰腺癌组织中的表达低于正常胰腺组织,而GSTM2的高表达则与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  综上所述,GSTM2能使接受吉西他滨处理的胰腺癌细胞产生耐药性并存活,故吉西他滨也能增加胰腺癌细胞株中GSTM2的表达,GSTM2在胰腺癌中的沉默有益于增强吉西他滨的化疗效果,胰腺癌患者中GSTM2的高表达与总体生存期显著相关。因此,GSTM2有潜力成为优化胰腺癌化疗方案选择和预测胰腺癌预后的生物标志物。
  一、GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达
  目的:分析吉西他滨处理胰腺癌细胞及癌组织对GSTM2表达的影响。
  材料和方法:利用qRT-PCR和western blot检测吉西他滨处理前后GSTM2在胰腺癌细胞株中的表达情况。收集接受吉西他滨新辅助化疗后手术和仅接受外科手术的胰腺癌患者的癌组织标本,进行免疫组化染色,比较两组中GSTM2表达水平的差异。
  结果:GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株中的表达水平明显高于未经吉西他滨处理的对照组;在接受吉西他滨化疗的胰腺癌患者组织中的表达水平明显高于仅接受外科手术的患者。
  结论:吉西他滨能使胰腺癌细胞和胰腺癌组织中的GSTM2表达水平上升,初步证实GSTM2参与胰腺癌吉西他滨化疗耐药性产生。
  二、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体外实验研究
  目的:检测siGSTM2对吉西他滨处理胰腺癌细胞株的化疗敏感性的影响。
  材料和方法:运用siRNA技术沉默BXPC-3、Panc-1、L3.6pl和MPanc96四种胰腺癌细胞株中的GSTM2基因,利用qRT-PCR和western blot检测沉默效果。再用吉西他滨处理上述细胞株,通过流式细胞仪检测癌细胞的凋亡水平,应用MTT分析法检测细胞活力。
  结果:qRT-PCR和western blot检测结果示siRNA转染4种胰腺癌细胞株成功,沉默GSTM2效率高,均在60%以上。经吉西他滨处理后,siGSTM2组与siControl组相比癌细胞凋亡率明显更高、活力显著降低。
  结论:siGSTM2能在胰腺癌细胞株中高效沉默GSTM2基因。沉默GSTM2能增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。
  三、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体内实验研究
  目的:检测shGSTM2对裸鼠胰腺原位移植瘤行吉西他滨化疗敏感性的影响。
  材料和方法:用shGSTM2对胰腺癌细胞株Mpanc96进行转染,行qRT-PCR和western blot检测评估沉默效果。将证实已被shRNA成功转染的Mpanc96细胞株原位注入裸鼠胰腺,构建裸鼠胰腺原位转移瘤模型。用IVIS成像系统予以生物荧光成像明确成瘤效果。用吉西他滨处理胰腺癌原位瘤后,用Living Image软件程序进行定量分析瘤体体积变化。
  结果:shRNA转染Mpanc96成功且沉默GSTM2效果佳。生物荧光成像可见裸鼠胰腺位置有荧光信号,移植瘤成瘤,建模成功。shGSTM2+吉西他滨组裸鼠瘤体体积最小。
  结论:沉默GSTM2能在体内增强胰腺癌吉西他滨化疗的敏感性。
  四、GSTM2在胰腺癌患者中的表达与临床预后相关性的研究
  目的:分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  材料和方法:收集于我院确诊胰腺癌的50例手术患者的癌组织标本,以癌旁组织及正常人的胰腺组织样本作为对照,检测GSTM2的mRNA表达水平的差异。根据GSTM2的平均蛋白表达量将胰腺癌样本分为GSTM2低表达组和GSTM2高表达组,分析两组生存期的差异。
  结果:GSTM2在胰腺癌患者胰腺组织样本中的表达显著低于癌旁组织及正常人的胰腺组织样本。GSTM2低表达组的胰腺癌患者较高表达组患者的总体生存率低,预后差。
  结论:GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  总结上述研究,可得出结论如下:
  1、吉西他滨可以增加胰腺癌中GSTM2的表达。
  2、沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞凋亡增加、活力降低。
  3、沉默GSTM2能使接受吉西他滨化疗的裸鼠胰腺原位移植瘤体积缩小,在体内增强吉西他滨化疗的敏感性。
  4、GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  5、GSTM2有潜力作为生物标志物筛选对吉西他滨高敏感的胰腺癌患病人群行精准治疗,同时预测胰腺癌的预后。
[博士论文] 程利鹏
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景和目的:
  结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是世界第三大恶性肿瘤,也是导致癌症相关死亡的第四大原因。肿瘤复发及远处转移是CRC患者死亡的主要原因,而肝脏是其远处转移最常见的靶器官。大量研究证实,结直肠癌肝转移(Colorectal Liver Metastasis,CRLM)在伴有慢性肝病的患者中发病率较低。对于病理性肝病影响CRLM确切分子机制仍有争议。
  微小RNA(miRNA),作为一种内源性非编码RNA,在转录后水平调节人类近60%基因(尤其是癌基因)的表达。miRNA let-7超家族由12个成员组成,它作为一种肿瘤抑制因子,在多种恶性肿瘤中(包括CRC)发挥重要作用。前期研究已表明,IFN-γ刺激CRC细胞系HT29能下调let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p(let-7a簇)表达,增强其对Fas介导凋亡的敏感性。
  本文旨在进一步探讨肝炎微环境中IRF-1介导IFN-γ下调CRC细胞let-7a簇表达并降低其肝转移能力的相关分子机制。
  方法:
  采用4-6周雄性BALB/c小鼠,以40%四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)灌胃法构建慢性肝炎模型,经脾静脉注入鼠源性结直肠癌细胞系CT26.WT构建CRLM模型。活体成像和肝组织H&E染色确立成模时间。
  ELISA法检测炎症模型肝组织和血清中IFN-γ,TNF-α和IL-1β等炎症因子的表达水平。慢病毒稳转,构建IFN-γ受体1(IFNGR1)敲低细胞系(shRNA-IRFGR1-CT26),并在肝炎模型的基础上构建转移瘤模型,明确IFN-γ在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。IFN-γ刺激CRC细胞HT29和CT26.WT,体外模拟炎症微坏境,qRT-PCR、Western blot和IHC检测炎症状态下CRC细胞和小鼠肝组织中干扰素调节因子(IRF-1/IRF-2)及let-7a簇表达变化。检索UCSC网站,确立IRF-1/2与let-7a簇表达调控的相关性。Rescue实验、ChIP和双荧光素酶报告基因等实验,阐明IRF-1调控let-7a簇表达可能的相关机制。
  慢病毒构建let-7a-1-5p敲低(shRNA-let-7a-1-5p-CT26)和高表达(LV-let-7a-1-5p-CT26)细胞株,在正常和炎症小鼠模型基础上构建转移瘤模型,研究let-7a簇对结直肠癌肝转移的影响,同时探索其在炎症抵抗CRLM过程中的重要作用。
  用qRT-PCR、Western blot和IHC法检测CRC在体内外炎症微环境及let-7a-1-5p低表达情况下EMT相关marker(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表达情况,探索上皮-间质转化在炎症抵抗肿瘤转移过程中的作用。
  结果:
  1、肝炎微环境影响结直肠癌肝转移
  CCl4灌胃法和脾静脉注射法构建肝炎模型和CRLM模型。苏木精-伊红(H&E)染色后发现,当40%的CCl4灌胃(6ml/kg小鼠体重,每周2次)5周后肝炎模型构建成功。灌胃7周,肝硬化模型构建成功。CRLM造模6天后小鼠即可出现CRLM(1/6),而当建模12天后,超过80%(5/6)的小鼠肝脏出现了转移瘤。
  在肝炎的基础上构建CRLM模型。结果表明,炎症组肝转移率低于正常组(2/6vs.5/6),且活体成像总荧光强度、肝转移瘤最大直径和转移瘤个数等转移瘤负荷显著低于正常组(P值均小于0.05)。
  2、IFN-γ可能影响肝炎微环境中CRLM的发生过程
  ELISA法检测炎症小鼠血清及肝组织中IFN-γ,TNF-α和IL-1β的表达变化。结果发现,三者在炎症肝组织中表达无差异。而在炎症小鼠的血清中,表达均显著上调,尤其是IFN-γ,表达上调最为显著(倍数=6.55)。
  用shRNA-IRFGR1-CT26细胞在炎症模型基础上构建CRLM模型,IRFNG1敲低组肝转移率较高(8/10vs.3/10),转移瘤负荷也显著增高(P值均小于0.05)。
  3、肝脏炎症环境中let-7a簇与IRF-1表达呈负相关
  检索UCSC网站发现,let-7a簇转录起始位点上游存在多个IRF-1/2结合位点。qRT-PCR和Western blot检测发现,IFN-γ的刺激均能显著上调HT29和CT26.WT细胞IRF-1的表达,而IRF-2的表达无显著差异。IHC检测伴有肝炎的转移瘤肝组织进一步验证了上述结论。同时,研究还发现,IFN-γ刺激CRC细胞显著下调let-7a簇表达,但是,let-7a-1-5p,let-7d-5p和let-7f-1-5p表达下调无明显差异。
  4、IRF-1参与IFN-γ下调let-7a簇的表达
  Rescue实验结果显示,在HT29细胞中,干扰IRF-1的表达能显著削弱IFN-γ下调let-7a簇表达的趋势(P<0.01)。IFN-γ处理HT29,能同时显著下调let-7a-1-5p及其前体的表达水平(P<0.05),但二者下调趋势无差异(P>0.05)。
  染色质免疫共沉淀实验(ChIP)结果显示,引物4(chr9:96,931,077-96,931,229)扩增效率显著增高,提示该位点可能存在IRF-1的结合位点。本研究将879bp目的基因(包含chr9:96,931,077-96,931,229)构入报告质粒(let-7a-Report-WT)中,并在718-721(AATC)处构建缺失突变(let-7a-Report-MT)。双荧光素酶报告基因实验发现,IRF-1能结合在位点(718-721)上。
  5、结直肠癌细胞的let-7a-1-5p表达水平与其肝转移能力相关
  用shRNA-let-7a-1-5p-CT26和LV-let-7a-1-5p-CT26细胞株建立转移瘤模型。结果显示,与对照组相比,let-7a-1-5p敲低组CRLM发生率降低(1/6vs.4/6),荧光强度强度较弱(P=0.05),转移灶数目少(P<0.05),转移瘤最大直径较小(P=0.05)。而let-7a-1-5p高表达组CRLM发生率稍高(6/6vs.5/6),转移瘤负荷显著增高(P<0.05)。此外,在肝炎小鼠中,let-7a-1-5p敲低同样降低CRLM发生(1/10vs.5/10),且肿瘤负荷均显著低于高表达组(均P<0.05)。
  6、抑制let-7a簇的表达维持CRC细胞的间质表型
  在构建shRNA-let-7a-1-5p-HT29细胞系的过程中,HT29的细胞形态由上皮细胞型态转变成间质样细胞型态。我们用qRT-PCR和Western blot检测EMT相关marker后发现,IFN-γ刺激HT29后,E-cadherin表达显著增加,而N-cadherin和Vimentin的表达未见显著差异。敲低HT29细胞let-7a-1-5p表达也得到了相同的结论。再用IHC检测肝转移瘤组织中的N-cadherin,结果发现,肝脏炎症组和let-7a-1-5p低表达组的转移瘤组织中N-cadherin阳性率显著增加。
  结论:
  1.CCl4诱导的肝脏炎症微环境能降低结直肠癌肝转移的发生,IFN-γ在调控中起重要作用;
  2.IRF-1通过结合let-7a簇转录本上游区域,介导IFN-γ下调let-7a簇的表达,降低CRC细胞肝转移潜能;
  3.在炎症微环境中let-7a-1-5p低表达能减少CRLM的发生;
  4.Let-7a簇通过上调结直肠癌细胞的N-cadherin表达,促进了上皮-间质转化,从而降低了肿瘤细胞在肝脏中的定值能力。
[硕士论文] 张瑞瑞
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:肺癌是当前世界对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一,其高发病率及难治愈率均位于恶性肿瘤之首。癌症的主要特征是细胞迁移和侵袭,其迁移过程涉及到各种蛋白分子之间的相互协调、细胞骨架在迁移中的相互作用机制以及改变的肌动蛋白动力学。WDR1(WD-重复结构域1)是肌动蛋白解聚因子ADF/cofilin的主要辅助因子,能够强烈加速ADF/cofilin介导的肌动蛋白分解。目前,WDR1在非小细胞肺癌(NSCLC)进展中的作用尚无报道。我们通过RT-PCR实验检测发现在人类非小细胞肺癌组织中WDR1的表达水平与相邻的非肿瘤组织相比异常增加,并且高表达WDR1与非小细胞肺癌患者的不良预后相关。鉴于此,本文对WDR1在非小细胞肺癌中的生物学功能进行较为系统的研究及分析。我们利用shRNA干扰技术和过表达技术,在A549及H1299细胞中下调和高表达WDR1。结果发现在非小细胞肺癌细胞中WDR1的敲低显著抑制了细胞增殖、迁移和侵袭以及EMT进程,过表达WDR1则促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移。通过构建裸鼠模型,小鼠体内原位成瘤实验的结果与体外细胞实验结果相吻合。通过进一步的机制研究,我们发现WDR1通过促进ADF/cofilin介导的actin解聚,调控肿瘤细胞的运动能力和细胞连接,进而促进非小细胞肺癌的转移。我们的研究结果提示ADF/cofilin-WDR1-actin的特异性抑制剂有望成为治疗肿瘤转移的新靶点。
[硕士论文] 唐渊
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:胃癌是中国最常见的消化道恶性肿瘤,中国新发生的胃癌,其中90%以上患者是进展期胃癌。目前胃癌主要治疗方式是手术加上化疗,部分进展期的胃癌通常不能直接进行手术,需要进行术前的新辅助化疗。目前临床胃癌新辅助化疗,存在化疗耐药问题。课题组前期研究发现,胃癌新辅助化疗能够诱导肿瘤细胞衰老。衰老的细胞会分泌大量的炎性因子,趋化因子,蛋白酶体等,这种表型是细胞衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),能够通过多种方式,导致化疗耐药。进一步研究发现胃癌新辅助化疗标本耐药的患者存在SASP相关因子升高。课题组前期对胃癌新辅助化疗组织标本进行回顾性研究发现:胃癌新辅助化疗的效果与tristetraprolin(TTP)的表达有着密切相关,TTP高表达的患者胃癌新辅助化疗敏感性好,TTP低表达的患者新辅助化疗敏感性差。TTP作为一个RNA结合蛋白,能够与大量细胞因子mRNA的3'UTR区的AU富集区(AU-rich element,ARE)结合,进而降解目标因子的mRNA,也是一个重要的抑炎和抑癌蛋白。TTP调控的靶因子的mRNA与SASP相关分泌因子的mRNA有大量重叠。由此推测:TTP可能通过调控胃癌新辅助化疗引起的SASP,进而增加胃癌新辅助化疗敏感性。TTP其有可能成为候选的胃癌新辅助化疗敏感性的生物标志物。本研究拟在此研究基础上,通过在体外胃癌细胞衰老模型下,研究TTP通过调控SASP相关因子表达,提高新辅助化疗敏感性具体作用及其分子调控机制。为进一步探讨如何通过TTP改善胃癌新辅助化疗敏感性,以及胃癌患者治疗个体化治疗方案,也为TTP作为胃癌新辅助化疗有效的生物标志物提供基础理论支持,具有重要的临床意义。
  方法:第一部分:根据课题前期相关实验结果,选取胃癌BGC-823细胞系。分别在0、25nM、35nM、45nM浓度下紫杉醇诱导处理BGC-823细胞24h、48h、72h。衰老相关的β-gal半乳糖苷酶染色,分析构建稳定体外的胃癌细胞衰老模型。
  第二部分:基于胃癌BGC-823细胞系构建TTP过表达和TTP干扰细胞株,嘌呤霉素筛选稳定表达和稳定干扰的细胞株。实验分为三组:TTP过表达组,TTP干扰组,空白对照组。在紫杉醇35nM浓度下,诱导胃癌BGC-823细胞72h,分别通过qPCR和ELISA检测SASP部分相关因子的mRNA水平和蛋白分泌水平。
  第三部分,在体外紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞衰老模型上,通过Western blot方法检测p65在TTP过表达,TTP干扰的细胞核内外表达水平变化。进一步通过细胞免疫荧光,确定核内外p65表达水平,使用Image pro plus软件进行核内外p65荧光强度半定量分析。
  结果:第一部分:成功构建胃癌BGC-823细胞衰老模型构建:在35nM浓度下,紫杉醇诱导BGC-823细胞72h,β-gal染色,染色阳性,说明成功构建体外的胃癌细胞BGC-823衰老模型,其中胃癌BGC-823细胞衰老染色在紫杉醇诱导72h细胞衰老的比例达到60%以上
  第二部分:构建胃癌BGC-823细胞的TTP过表达和TTP干扰的细胞株,通过RT-qPCR验证TTP过表达和TTP干扰细胞株构建成功。通过嘌呤霉素在2μg/ml浓度作用下,筛选得到TTP稳定过表达和TTP稳定干扰的胃癌BGC-823细胞株。在35nM浓度紫杉醇诱导胃癌BGC-823细胞72h,通过qPCR和ELISA分别检测SASP部分相关因子的mRNA和蛋白变化。结果显示:TTP过表达时,能够下调SASP部分相关因子的表达,TTP干扰时,上调SASP部分相关因子表达,相比空白对照组差异具有统计学意义。
  第三部分:为了进一步研究TTP对SASP调控分子机制,在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型上,Western blot结果显示p65核内外的表达,TTP过表达组相比空白对照组显著减少,TTP干扰组核内p65相比空白对照也是显著增多。为了进一步验证TTP过表达和TTP干扰是否对p65入核影响,细胞免疫荧光,TTP过表达,TTP干扰组,空白对照组在紫杉醇诱导的胃癌BGC-823细胞72h条件下,细胞免疫荧光分析结果显示:在TTP过表达,核内的p65的荧光相比空白对照组和TTP干扰组有差异具有统计学意义。
  结论:成功构建紫杉醇体外诱导的胃癌BGC-823细胞衰老模型,在胃癌细胞衰老模型上,发现TTP能够调控胃癌BGC-823细胞的衰老相关分泌表型。TTP通过ARE结合途径直接降解SASP相关因子表达,还可以通过减少p65入核,抑制NF-κB信号通路激活,进而调控胃癌细胞衰老相关分泌表型。这也揭示:TTP可能通过调控SASP相关因子的表达,增加胃癌新辅助化疗敏感性。
[硕士论文] 许洋
放射医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  原花青素是目前已知的抗氧化能力最强的天然提取物,远高于日常使用的维生素C及维生素E。其具有来源广泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的优势。此外,原花青素的生物体内的半数致死剂量超过5000mg/kg,远远大于治疗剂量。原花青素对肺组织相关炎症及疾病具有较好的治疗作用:原花青素可以有效减轻角夹胶诱导的肺组织急性炎症反应,减轻小鼠哮喘模型的急性气道炎症反应,抑制肺水肿的形成,且对博来霉素诱导的肺炎具有很好的治疗作用。本实验室前期研究成果发现,原花青素可以显著减轻辐照后早期放射性肺炎的炎症渗出和晚期放射性肺纤维化的发生,降低辐射所导致的肺组织上皮间质转化程度,减轻炎症因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改变程度。另外,与其他抗氧化剂不同的是,原花青素是一种缓释抗氧化剂,他可以在血液和组织中存留7-10天,发挥持续的抗氧化作用,这对于病情进行性进展的放射性肺损伤的防治具有独到的优势。此外,原花青素还具有抗肿瘤作用。过去的十年体外细胞实验和动物实验均已经证明原花青素对皮肤癌,乳腺癌,前列腺癌,头颈部肿瘤和肺癌等肿瘤细胞增殖具有明确抑制作用。研究者还在体外实验中证实原花青素对正常细胞的生长和活力没有明显影响,而只对肿瘤细胞表现出杀伤作用。综合以上的特点,推测,原花青素有希望在肺癌放疗过程中,防护放射野内正常的肺组织的同时,对肺癌细胞又起到抑制增殖的作用。本课题将重点研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用及其分子机制。
  研究目的:
  (一)小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。
  通过原位肺内注射法建立原位肺癌模型。特点:以左肺上叶作为肺癌细胞的生长环境,通过基质胶固定细胞位置。
  (二)原花青素在肺癌放疗中的双向作用。
  1、原花青素在细胞作用中的研究。
  (1)通过CCK8检测原花青素在小鼠正常肺上皮细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的毒性;
  (2)通过流式检测及克隆形成率实验检测原花青素对肺正常细胞的辐射防护作用及对肺肿瘤细胞的辐射增敏作用。
  2、原花青素在肺癌模型中的作用。
  (1)原花青素能够抑制小鼠肿瘤的生长及转移
  ①原花青素抑制小鼠皮下肿瘤的生长;
  ②原花青素抑制小鼠肿瘤的转移。
  (2)原花青素影响荷瘤小鼠局照后的生存状况;
  (3)原花青素对荷瘤小鼠局照后肿瘤大小及肺叶重量的影响;
  (4)原花青素减少荷瘤小鼠局照后正常肺组织的炎性渗出;
  (5)原花青素能够减少小鼠肺正常组织照射后的凋亡,而促进照射后肿瘤组织的凋亡,同时抑制其增值;
  (6)原花青素能够调节Th1/Th2相关细胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的机制研究。
  1、原花青素可以明显降低辐照后A549及BEAS-2B细胞中活性氧的产生;
  2、原花青素对肺正常细胞及肿瘤细胞内的p-ERK、p-JNK及p-P38表达情况的影响具有差异;
  3、原花青素可以激活肺正常细胞及肿瘤细胞Sirt6蛋白的表达;
  4、研究肺正常细胞及肿瘤细胞过表达Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表达情况;
  5、通过抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况,判断Sirt6蛋白在原花青素中的作用。
  研究方法:
  (一)建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。
  1、用胰岛素注射器将肿瘤细胞与基质胶的混悬液注射入小鼠左上肺叶,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;
  2、使用本实验室设计的固定小鼠模具,采取铅块遮挡的方式建立肺部局照放射模型;
  3、照射方式:采用25Gy60Coγ射线单次照射,剂量率为1Gy/min。
  (二)研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用
  1、选取小鼠肺上皮细胞MLE-12、肺癌细胞LLC及人正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺腺癌细胞A549进行试验;
  (1)细胞分组:对照组、原花青素处理组、照射组、照射组加原花青素处理组,每种细胞分组相同,照射剂量为8Gy;
  (2)细胞照射及原花青素处理后对正常细胞及肿瘤细胞增殖能力的影响:流式细胞仪检测及克隆形成率;
  2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基础上检测原花青素的双向作用
  (1)小鼠分为:假手术对照组、假手术肺部照射组、肺部荷瘤对照组、肺部荷瘤原花青素处理组、肺部荷瘤照射组及肺部荷瘤原花青素加照射组,共6组,每组选用雄性8周C57BL/6小鼠3只;
  (2)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠的生存影响:检测荷瘤小鼠生存期及体重;
  (3)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠肿瘤的影响:检测肿瘤大小,H&E染色及小鼠左上肺叶重量;
  (4)免疫荧光检测正常肺组织及肿瘤组织的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;
  (5)检测原花青素对小鼠免疫细胞因子的影响:用ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-6和IFN-γ。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的分子机制
  1、检测原花青素对照射后细胞内活性氧的清除:ROS检测试剂盒;
  2、检测原花青素对照射后细胞内相关蛋白变化的影响:Western blot;
  3、检测原花青素对照射后原位荷瘤小鼠正常肺组织及肿瘤组织蛋白的影响:Western blot;
  4、通过改变细胞内Sirt6的表达检测p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达:Sirt6过表达质粒的转染、Western blot;
  5、通过选取抑制剂S1805、SP600125及SB203580分别抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况:Western blot。
  研究结果:
  (一)成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型
  1、成功建立小鼠左上肺叶原位肺癌荷瘤模型,肿瘤生长符合实验要求;
  2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。
  (二)原花青素在肺正常细胞及肿瘤细胞放疗中的双向作用
  1、对小鼠肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少小鼠肺上皮细胞MLE-12照射后的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对小鼠肺上皮细胞MLE-12具有辐射防护作用,对小鼠肺癌细胞LLC具有辐射增敏作用;
  2、对人肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少人正常肺上皮细胞BEAS-2B凋亡且促进人肺腺癌细胞A549的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞具有辐射防护作用,且能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,具有辐射增敏作用;
  (三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放疗中的双向作用研究
  1、通过观察并记录原位肺癌荷瘤小鼠的生存情况,发现:原花青素处理加照射组相比于照射组,其存活时间更长;
  2、通过对小鼠肺内肿瘤的测量,发现:原花青素处理加照射抑制小鼠左上肺叶内肿瘤的生长,相比较于单纯照射组,效果更加明显;
  3、通过荧光免疫分别标记增殖相关蛋白Ki67及凋亡相关蛋白p53,发现:在小鼠正常肺组织内,原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显降低;在肿瘤组织内,单纯处理组的Ki67的表达量相比于对照组明显降低,而原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显升高;
  4、通过ELISA检测荷瘤小鼠血清细胞因子的表达量,发现:原花青素加照射组相比于单纯照射组,能够明显抑制IL-6、提高IFN-γ的表达,促进对肿瘤的抑制,降低炎性损伤。
  (四)原花青素在肺癌放疗中的可能作用机制
  1、原花青素能够显著清除人肺癌细胞A549及正常肺上皮细胞BEAS-2B照射后所产生的自由基;
  2、在人肺癌细胞A549中,原花青素明显提高照射后p-JNK蛋白的表达;在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可以明显抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而这与其能够清除活性氧自由基有关。
  3、在人肺癌细胞A549中,原花青素通过增加Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用
  研究结论:
  在细胞层面上发现,原花青素对小鼠肺癌细胞LLC及人肺癌细胞A549具有辐射增敏作用,对小鼠肺正常细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B具有辐射防护作用。在人肺癌细胞A549中,原花青素可以通过提高Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用。在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可能通过清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎症作用。通过建立小鼠原位肺癌的放疗模型,发现原花青素能提高小鼠的生存期,可以改变血清细胞因子的表达,能够减少小鼠肺正常组织的辐射损伤,同时对肿瘤具有放疗增敏的作用。
[博士论文] 黄海
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肿瘤内异质性是促进肿瘤进化、疾病进展,以及导致治疗失败和患者不良预后的重要原因。肿瘤干细胞样细胞,作为肿瘤细胞群体遗传构成的一个亚群,是肿瘤异质性的重要来源。在不同肿瘤中发现,肿瘤干细胞样细胞具备自我更新能力、化疗药耐药、扩增成为肿瘤细胞并具有转移潜能等特性,是肿瘤进展和耐药的重要因素。因此,揭示肿瘤干细胞样细胞内在的分子机制,有助于发现针对进展期肿瘤的新疗法,为临床实践提供理论基础。
  前列腺癌,是世界范围内威胁男性健康的最主要原因之一,且具有高度异质性。雄激素剥夺治疗作为目前广泛应用的一线疗法,尽管对于进展期或是复发性前列腺癌有短时间的缓解效果,但是,最终由于不可逆的耐药,而导致不良预后。
  越来越多的证据提示,雄激素剥夺治疗在诱导耐药的过程中,对前列腺癌细胞进行重编程,导致一部分前列腺癌细胞发展出肿瘤干细胞样细胞特性。并且,在复杂的肿瘤微环境中,多种成分发挥与前列腺癌细胞相互塑造、相互促进的作用,因此,揭示前列腺癌干细胞样细胞与肿瘤微环境细胞相互作用的分子机制,并联合阻断相关通路,将有助于提高雄激素剥夺治疗的有效性。
  内容及结果:
  (一)OV6作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标
  为了了解OV6在前列腺癌组织中的表达情况和患者预后相关性,我们分别在正常前列腺组织、局限性前列腺癌组织、局部性进展前列腺癌组织、激素抵抗性前列腺癌、神经内分泌分化前列腺癌组织中,同时在同一前列腺癌组织内部、不同Gleason评分区域、晚期前列腺癌雄激素剥夺治疗前后组织、原位前列腺癌雄激素剥夺治疗的动物模型、前列腺癌细胞转移的动物模型中,利用免疫组化检测OV6的表达水平,结果发现,OV6与前列腺癌的恶性程度呈正相关,并且在同一肿瘤组织内部高Gleason评分区域相对高表达,并且在前列腺癌雄激素剥夺治疗后组织和转移组织中相对高表达,说明OV6可作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标。
  (二)OV6阳性前列腺癌细胞通过启动自噬维持肿瘤干细胞样细胞特征
  为了了解OV6阳性前列腺癌细胞是否具有肿瘤干细胞样细胞特征以及发挥维持干细胞特性的分子机制。我们通过定量PCR检测OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞基因表达;通过梯度稀释体外成球实验和体内成瘤实验检测OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力;通过增殖和凋亡实验检测OV6阳性前列腺癌细胞对于化疗和雄激素剥夺治疗药物的药物抗性,从而评估OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞特性。并通过RNA全转录组测序和一系列分子生物实验如Co-IP、Duolink、ChIP等,探索OV6阳性前列腺癌细胞维持干细胞特性的分子机制,发现,OV6阳性前列腺癌细胞可以通过启动自噬过表达ATG7,维持细胞质内β-catenin的稳定性,并促进后者入核启动OCT4的转录激活,从而维持干细胞特性。
  (三)OV6阳性前列腺癌干细胞样细胞通过和单核细胞相互塑造发挥促进雄激素剥夺治疗耐药的作用。
  我们在上部分研究中发现,单独抑制OV6阳性前列腺癌细胞内部相关通路并不能有效提高原位前列腺癌异种移植模型中雄激素剥夺药物恩杂鲁胺的治疗效果,提示肿瘤微环境细胞可能参与耐药过程。我们通过OV6阳性前列腺癌细胞与单核细胞共培养,抗体芯片和ELISA检测细胞上清中细胞因子的表达变化,发现IL6是OV6阳性前列腺癌细胞和单核细胞相互作用的关键分子。两者的相互作用,一方面,增强OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力,另一方面,招募并促进单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合抑制ATG7和IL6R可以有效提高前列腺癌细胞在原位前列腺癌异种移植瘤模型中对于恩杂鲁胺治疗的有效性。
  结论:
  在本项研究中,我们发现OV6阳性前列腺癌细胞具有干细胞特性,并且可以招募和促进肿瘤微环境中的单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合靶向OV6阳性前列腺癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间的网络信号传导可以有效改善原位前列腺癌模型中前列腺癌细胞对于雄激素剥夺治疗的抗性,这为改善前列腺癌雄激素剥夺药物的耐药性和提高疗效,最终改善患者预后提供临床前研究的理论基础。
[硕士论文] 李高峰
外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本文目的是研究肝脏肿瘤细胞调控氧化应激的机制及肿瘤干细胞在抗氧化应激过程中的作用,探寻参与调节肿瘤干性特征与抗氧化应激过程的相交叉的分子靶点,并人为干预后,进一步对比肝脏肿瘤细胞抗氧化应激能力及干性特征的变化。从而从肿瘤干细胞具有较强抗氧化应激能力的生物学特性角度为肿瘤的临床治疗、基础研究及新药研发提供新的策略与思路。
  方法:
  1.对比肝细胞癌(HCC)细胞系Huh7与SMMC-7721对外源性ROS(H2O2)抵抗能力及两组细胞系中参与ROS调控的相关分子表达差异,探究肝癌细胞对ROS抵抗的初步机制;2.进一步分离Huh7细胞中抗ROS的亚群,并与普通Huh7细胞比较抗ROS能力及调控ROS代谢的相关分子表达的差异,筛选出调节通路中的关键分子(β-catenin);3.使用β-catenin阻滞剂XAV939阻断Wnt/β-catenin信号通路,观察Huh7细胞抗ROS能力的变化;4.通过慢病毒干扰Huh7细胞系内ROS产生基因Nox1,人为减少细胞内ROS的产生,来比较Nox1基因干扰组与GFP(绿色荧光)对照组细胞抗ROS能力、干性特征及相关分子表达的变化,进而探究ROS调控能力与肿瘤干性特征之间的关系。
  结果:
  1.经H2O2作用后,相对于SMMC-7721细胞,Huh7细胞凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低,同时相对高表达干性分子CD133、bmi-1,DNA修复基因Rad51、ROS清除酶基因SOD2。2.肝癌细胞Huh7内存在具有较强抗ROS能力的亚群(Huh7-ROS),该亚群细胞相对于普通的Huh7细胞高表达bmi-1、CD133、Bcl-2、SOD1,并且在经H2O2作用后,凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低。3.相对于未用XAV939处理的Huh7细胞,经XAV939处理的Huh7-XAV939组细胞在H2O2作用后,细胞凋亡坏死数目更多,活性更低,细胞内ROS水平更高,而在不使用H2O2情况下即H2O2浓度为0umol/ml时,Huh7细胞的凋亡和坏死及细胞活性都没有差异。4.干扰Huh7细胞内ROS产生基因Nox1的实验组细胞(Huh7-siNox1),相对于普通的对照组绿色荧光细胞(Huh7-GFP),不但在H2O2作用后细胞活性更高,而且还有更强体内致瘤能力、集落形成能力。
  结论:
  1.肝癌细胞拥有较强的抗ROS的能力有赖于肿瘤干性分子、DNA修复基因及清除酶基因的共同作用。2.肝癌细胞内存在抗ROS的亚群细胞,这一亚群也同时高表达肿瘤干性分子、ROS清除酶基因、DNA修复基因以及肿瘤干细胞信号通路分子β-catenin基因。3.β-catenin基因调控肿瘤细胞的自我更新等干性细胞学特性,在肿瘤细胞抗ROS过程中同样发挥作用。XAV939作为β-catenin基因的特异性阻滞剂,可以在不会诱导细胞凋亡和坏死的浓度水平抑制肝脏肿瘤细胞调控ROS抵抗的能力,进而可增加化疗药杀伤肿瘤细胞的效应,其有可能成为化疗“增敏剂”,进而在化疗过程中起到辅助作用。4.通过干扰Nox1基因降低内源性ROS的产生可以增强Huh7细胞抗ROS的能力并激活肿瘤细胞的干性特征,Nox1分子表达的高低及肿瘤细胞中ROS的水平可能作为为患者预后评判的标准和相关治疗的分子靶点来研究。
[硕士论文] 韦荣强
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1、归纳En-bloc胰十二指肠切除术的手术策略和具体操作步骤,指导临床实践;
  2、探究En-bloc胰十二指肠切除术的可行性、安全性以及疗效。
  方法:
  1、结合胰十二指肠切除术主刀医师的指导、手术录像资料及相关文献回顾,对En-bloc手术策略和具体操作步骤进行归纳。
  2、回顾性分析2013年1月~2016年6月海军军医大学附属长海医院和长征医院胰腺外科邵成浩团队收治的139例行胰十二指肠切除并且术后病理证实为胰腺导管腺癌的病人的临床资料,其中2013年1月至2014年6月共70例病例行传统胰十二指肠切除术(Traditional Pancreatoduodenectomy,TPD),2014年7月至2016年6月共69例病例行En-bloc胰十二指肠切除术(En-bloc Pancreatoduodenectomy,En-PD),分别设为TPD组和En-PD组。观察指标包括:1)手术时间、术中出血量、肿瘤最大直径、切缘状态、TNM分期等;2)术后主要并发症发生率(胰瘘、术后出血、乳糜漏、腹腔感染、胃排空延迟等)、围手术期死亡率、术后平均住院时间、局部复发转移率、中位生存时间、总生存时间等。
  3、本研究拟对En-PD切除病例资料进行回顾性分析,观察临床疗效与预后,并与传统胰十二指肠切除术(TPD)病例资料相比较,探讨En-bloc手术策略的安全性、可行性及临床应用价值。
  结果:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除,其手术时间、术中出血量均高于TPD组(P值分别为0.017,0.016);En-PD组和TPD组术后平均住院时间、术后并发症发生率及死亡率差异无统计学意义(P值分别为0.592,0.810,1.000)。
  2、En-PD组和TPD组中,可能切除病例数分别是16例(23.2%)和14例(20.0%),均行联合PV/SMV整块切除重建术,差异无统计学意义(P=0.648)。两组术后R0切除率分别是91.3%和94.3%,淋巴结阳性率分别是44.9%和41.4%,差异均无统计学意义(P=0.532,P=0.677);但En-PD组平均淋巴结切除数目(13.58±11.19枚)多于TPD组(5.79±3.12枚),统计学差异明显(P<0.001)。
  3、En-PD组和TPD组术后局部复发转移率分别为29.0%、45.7%,有统计学差异(P=0.042)。En-PD组术后中位生存期为19.8个月,1年生存率和2年生存率分别为75.5%和21.7%;而TPD组术后中位生存期为20.9个月,1年生存率和2年生存率分别为72.9%和24.3%。两组生存期差异无统计学意义(P=0.061)。
  结论:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除术在临床实践中安全、可行,但是建议在经验丰富的胰腺外科中心开展,尤其是对可能切除胰腺癌需行联合血管整块切除重建的病例。
  2、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术术后局部复发转移率低。
  3、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术具有更高的淋巴结切除数目,有利于对转移淋巴结的清扫。
  4、En-bloc切除策略胰十二指肠切除术后总体短期疗效满意。
[硕士论文] 蒋亚波
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:
  信号转导与转录激活因子5(Signal Transducer and Activator Of Transcription5,STAT5)在人体内有着广泛的生理病理功能。STAT5能被多种细胞因子(cytokines)如催乳激素(prolactin,Prl)、红细胞生长素(erythropoietin)、生长激素(growth hormone,GH)和上皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等激活并能反馈的调控多种细胞因子。在肝脏中,有研究发现GH-STAT5信号通路在控制脂代谢途径上发挥着重要的作用:肝脏特异性敲除STAT5后,增加了CD36和PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)的表达,导致实验小鼠出现明显的脂肪肝、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗和肝脏再生能力受损。此外STAT5在肝脏的缺失,还会引起TGF-β和STAT3的表达增加,加速了肝脏的纤维化和肿瘤的形成。另外,肝特异性的敲除STAT5A后,调控了NOX4(reactive oxygen species(ROS)-generating enzyme NOX4)的表达,导致凋亡蛋白PUMA和BIM的表达下降,从而促进了肝癌细胞增殖。
  STAT5包含了STAT5A和STAT5B两个亚型,二个亚型均由人类17号染色体上衔接的连锁基因所编码,并在DNA结构上有95%的相似性,但是由于蛋白结构上的反式激活区域存在着一定的差异,STAT5A和STAT5B在生理病理过程中都有着特异的生物学功能。本课题旨在探究STAT5A亚型在肝癌进展中的作用,尤其是对肝癌糖代谢的影响。同时,希望能从抑制糖代谢的角度寻找新的潜在的治疗靶点。
  研究方法:
  首先,利用病人组织芯片,分析并明确STATSA在肝癌病人肿瘤组织中的表达情况。Kaplan-Meier方法分析STAT5A的表达与预后的关系以及进行多因素的生存分析。在生物学功能方面,首先构建STAT5A过表达的稳转Huh7肝癌细胞系,利用CCK8、流式分析及裸鼠皮下荷瘤实验探索STAT5A对于肝癌细胞增殖和细胞周期的影响。然后,利用Kit检测STAT5A的表达对于细胞葡萄糖消耗,乳酸代谢的影响。更进一步凭借GC-MS技术,具体的分析糖酵解和TCA循环上各代谢产物的变化。在机制方面,利用q-PCR技术和Wectern blot技术分析验证STAT5A可能的作用通路以及作用的糖代谢靶点。
  研究结果:
  (一)STAT5A的表达与患者预后的关系
  1.根据148例病人的组织芯片结果分析发现,与配对癌旁组织相比,STAT5A在肝癌肿瘤组织中的表达明显降低。用Kaplan-Meier生存分析方法分析发现,肿瘤中STAT5A低表达组OS较高表达组明显降低。多因素生存分析也有类似的结果:STAT5A的表达与是否有包膜、AFP的表达和肿瘤大小可以作为影响RFS和OS的独立风险因素。
  (二)STAT5A在体内外对肝癌细胞增殖能力、细胞周期的影响
  1.检测STAT5A在常用肝癌细胞系中的表达,挑选Huh7构建了稳转的过表达细胞系,而敲除STAT5A的细胞系则用相对应的siRNA,并用WB对STAT5A的表达进行验证。
  2.CCK8增殖实验发现,过表达STAT5A后肝癌细胞的增殖明显被抑制,而敲除STATSA之后细胞的增殖能力明显增强。裸鼠皮下荷瘤实验也证实了STAT5A能抑制肝癌细胞的增殖。流式技术分析还发现,STAT5A过表达可以抑制肝癌细胞的周期进展,使肝癌细胞更多的停滞在G0/G1期,减少了细胞的有丝分裂。
  3.关于糖代谢方面,首先利用相关kit检测培养基葡萄糖和乳酸,发现STAT5A过表达可以明显的减少肝癌细胞葡萄糖的消耗和乳酸的产生。进一步的针对具体代谢产物的分析提示,STAT5A过表达可以降低糖酵解和TCA循环上的主要产物。
  (三)STAT5A机制探究
  1.在通路方面,发现STAT5A可以明显的调控AKT的磷酸化,而反过来抑制AKT之后STAT5A的磷酸化也会增加。配对病人的组织芯片结果也证实,STAT5A的表达与p-AKT的表达呈负性相关。
  2.利用knock-down和过表达的细胞进行qPCR检测发现STAT5A在转录水平能影响多种基因的表达,在病人组织的RNA水平上也有类似的结果。进一步的WB实验发现,STAT5A会明显的影响HK2的蛋白水平的表达。加入AKT抑制剂之后能逆转HK1的蛋白表达证实,AKT通路在STAT5A-HK2的调控过程中有着重要的作用。
  3.发现了miRNA-23a可以负调控STAT5A的表达。
  4.此外,还证实了,STAT5A对另一个重要的转录因子HNF4α有着明显的正调控,并且,HNF4α可以直接作用于PI3K。
  研究结论:
  本课题首先明确了STAT5A在肝癌患者肿瘤组织中低表达,并且低表达组预后较差。接着在细胞学以及动物水平上验证了STAT5A能明显抑制细胞的增殖和细胞周期的进展,发挥着重要的抑癌作用。关于糖代谢方面,发现STAT5A的过表达可以明显的抑制糖酵解过程和TCA循环,从能量的角度抑制肿瘤的进展。在机制方面,验证了STAT5A与p-AKT的关系,并且确定了下游糖代谢的关键基因HK2。此外,还发现了可以调控STAT5A的miRNA-23a以及STATSA-HNF4α-PI3K-AKT信号通路,但具体的机制尚不清楚,仍需进一步研究。
[博士论文] 塔娜
病理学与病理生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  胰腺癌是一种较为常见的高度恶性的消化系统肿瘤,其五年生存率不足5%,中位生存期小于6个月。胰腺癌最常见的组织学类型为胰腺导管腺癌(PDAC),约占所有胰腺癌病例的85%-90%。患者死亡率高、预后差的主要原因是该疾病早期缺乏特异性临床症状和诊断及预后相关的分子标志物,大部分患者在诊断时肿瘤已发生转移,从而失去了手术机会,而且该肿瘤对放、化疗反应性差,极易复发转移。近年来,随着医学的发展,人类大多数恶性肿瘤患者的生存期有了显著增加,但胰腺癌患者的生存期并无明显改善,因此胰腺癌早期诊断及治疗成为亟待解决的问题。研究显示,胰腺上皮内瘤变(PanIN),尤其是高级别上皮内瘤变(PanIN-3),是胰腺导管腺癌最常见的非侵袭性癌前病变。早期诊断和手术切除可将胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6%提高到Ⅰ期的50%左右。若能找到胰腺癌特异性的分子标志物并在癌前病变阶段对该疾病进行诊断或有针对性的对胰腺癌高危人群进行筛查,胰腺癌患者的生存状况将会得到大大改善。此外,胰腺癌的发生发展涉及多种癌基因、抑癌基因以及表观遗传学等改变,探索胰腺癌的发病机制,将为胰腺癌诊断治疗提供新的思路。
  MicroRNA(miRNA)是一组内源性的非编码的单链小RNA分子,长度为19-24个核苷酸,主要通过与其靶标mRNA的3'UTR区域互补结合,导致mRNA的降解或翻译的抑制,在转录后水平调节30%的蛋白质编码基因的表达而发挥作用。一个miRNA可能对应多个靶点,同时,多个miRNA也可能作用于同一个靶点。miRNA的异常表达与多种肿瘤发生发展的重要过程息息相关,例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。目前研究表明,miR-21,miR-155,miR-196a和miR-210在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用,或可作为胰腺癌潜在的分子标记物。然而多种研究中特异性miRNAs的一致性较差,应用中其敏感性和特异性仍有待提高。因此,本研究主要致力于发现更有优势的胰腺癌尤其是PanIN-3特异性的miRNAs并探索其作用机制,为胰腺癌的诊断、治疗和预后判断提供新的切入点。
  目的:
  筛查PanIN-3及胰腺癌组织中异常表达的miRNAs,并在胰腺癌组织和外周血浆中进行验证,研究其对胰腺癌生物学特性的影响,并分析其相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性,再通过生物信息学方法寻找并鉴定其下游作用的靶基因,进一步探寻其作用机制。
  方法:
  1.利用miRNA芯片技术筛查PanIN-3及胰腺癌组织中较胰腺正常导管及低级别上皮内瘤变组织中显著差异表达的miRNAs。
  2.利用原位杂交和实时荧光定量PCR技术,在胰腺癌患者石蜡包埋组织和外周血浆中进一步验证上述miRNAs的表达情况,获得可能作为诊断标志物的候选miRNAs,并分析其诊断效能。
  3.结合胰腺癌患者临床病理资料,分析候选miR-1290的相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性。
  4.通过细胞学实验:观察miR-1290对胰腺癌细胞株生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性的影响。
  5.通过动物实验:研究miR-1290对胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生物学特性的影响。
  6.利用生物信息学(MiRDB,Targetscan,MiRanda)分析技术,预测miR-1290可能的下游靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统分析其与miR-1290的关系,并进一步验证其对胰腺癌生物学行为的影响。
  7.利用实时荧光定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学技术,分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌旁正常组织中的表达情况,探讨其临床意义。
  结果:
  1.miRNA芯片结果显示:与正常胰腺导管上皮和低级别上皮内瘤变相比,PanIN-3和胰腺癌中表达明显上调或者下调(超过5倍)的miRNAs有30余种,结合文献,筛选出其中的19条作为候选miRNAs。其中上调的主要有miR-31-5p,miR-29a-5p,miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,miR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p,miR-29a-3p,miR-34a-3p,miR-155;下调的主要有miR-105-3p,miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。
  2.原位杂交结果显示:以“PanIN-3和癌组织中表达明显高于正常导管上皮和低级别上皮内瘤变(PanIN-1和PanIN-2)”作为判定标准,筛选出高表达的miRNAs共计6条,包括miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p以及miR-155。
  3.血浆实时荧光定量PCR验证结果显示:胰腺癌患者外周血浆中,miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表达均明显增高,差异具有统计学意义。绘制ROC曲线比较其诊断效能,miR-31-5p和miR-1290具有相对较好的诊断效能,AUC分别为0.848和0.829。
  4.组织实时荧光定量PCR验证结果显示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺导管腺癌组织中高表达,癌旁正常组织低表达,与外周血浆结果相一致,提示miR-31及miR-1290可能是参与高级别上皮内瘤变向胰腺癌转变这一过程的早期分子,具有成为胰腺癌早期诊断分子标志物的潜能。结合患者的临床病理资料进一步发现miR-1290高表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移密切相关(p<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。提示miR-1290可能参与肿瘤的侵袭转移。
  5.miR-1290对胰腺癌细胞株生物学特性的影响:(1)检测五株胰腺癌细胞株中miR-1290的表达量,发现其在AsPC-1中表达最低,在PANC-1中表达最高,选取这两株细胞分别进行过表达和抑制实验。(2)验证转染效果:转染miR-1290Agomir的细胞系中,miR-1290被成功过表达,转染miR-1290Antagomir的细胞系中,miR-1290被成功抑制。(3)平板克隆实验结果显示,过表达miR-1290可显著促进细胞增殖和集落形成(p<0.05)。(4)细胞增殖活性实验结果显示,miR-1290过表达,细胞增殖速度加快,24小时活细胞数量明显高于对照组(p<0.05);miR-1290抑制后,细胞增殖速度减慢,24小时活细胞数量明显少于对照组(p<0.05)。(5)细胞迁移及侵袭实验结果显示,过表达miR-1290可促进胰腺癌细胞迁移和侵袭(p<0.05);抑制miR-1290,细胞迁移和侵袭能力显著下降(p<0.05)。与细胞划痕实验趋势一致。(6)凋亡实验结果显示,过表达或抑制miR-1290对细胞凋亡无明显影响(p>0.05)。
  6.裸鼠皮下荷瘤实验结果显示:过表达miR-1290可增加胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积更大(p<0.05);抑制miR-1290可减弱胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积减小(p<0.05)。
  7.生物信息学结果显示,IKKα可能为miR-1290的靶基因之一。
  9.IKKα对胰腺癌细胞功能学实验结果显示:(1)抑制IKKα在胰腺癌细胞系中的表达,可促进其增殖、迁移和侵袭;(2)过表达IKKα,可逆转miR-1290对胰腺癌细胞系促增殖、迁移和侵袭的作用;(3)改变胰腺癌细胞系中miR-1290及IKKα的表达量,NF-κB信号通路相关的蛋白IKBα、P65和P50表达无明显变化。
  结论:
  1.通过miRNA芯片、原位杂交以及组织和血浆中差异性表达miRNAs的筛查,6条miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表达升高。
  2.胰腺癌组织中差异性表达的miRNAs与胰腺癌患者血浆中差异性表达的miRNAs具有一致性,提示血浆中miRNAs有望成为胰腺癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。
  3.miR-1290在胰腺癌组织及胰腺癌患者外周血浆中表达均显著升高,且其表达水平与胰腺癌患者肿瘤分化程度及淋巴结转移相关,提示miR-1290可能成为胰腺癌诊断及预后判断的分子标志物。
  4.miR-1290可通过促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及成瘤能力,参与胰腺癌生物学行为的调控,其在胰腺癌发生发展中可能起着癌基因的作用。
  5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一,其可直接被miR-1290抑制(结合位点为3'端843-849处),促进胰腺癌的增殖、迁移和侵袭,提示miR-1290及其靶基因IKKα可能成为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。
  6.IKKα作为miR-1290靶基因之一参与胰腺癌发生发展,可能通过非NF-κB依赖的信号通路发挥作用。
[硕士论文] 陈泉
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分:不同强度的有氧运动对DEN诱导的小鼠肝癌形成的影响
  目的:以有氧运动作为干预方式,设定12米/分钟和18米/分钟的速度对DEN诱导小鼠进行干预,观察小鼠一般状态,检测肝肾功能等相关指标以及肝癌成瘤率和小鼠死亡率,明确有氧运动对于DEN诱导小鼠的死亡率及肝癌成瘤率的影响,为有氧运动抑制肝癌形成提供实验依据。
  方法:通过DEN灌胃诱导小鼠肝癌模型,并对各组小鼠实施不同强度的运动干预,观察小鼠肝功能、肾功能、死亡率、肝癌发生率的不同变化。
  结果:1.相较于空白组,DEN组ALT、AST均升高,差异具有统计学意义(ALT:40.40±5.63VS110.70±7.08;AST:140.90±21.89VS677.00±77.47;P<0.01);相较于DEN组,DEN+中速组、DEN+高速组小鼠ALT、AST显著降低,且差异具有统计学意义(ALT:110.70±7.08VS64.11±7.27;110.70±7.08VS61.13±6.62;AST:677.00±77.47VS208.50±43.45;677.00±77.47VS198.9±45.69;P<0.01)。2.相较于空白组,DEN组的BUN、UA显著增高,差异均有统计学意义(BUN:3.055±0.798VS9.875±1.089;UA:114.40±29.54VS317.30±43.26;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠UA均降低,且差异具有统计学意义(317.30±43.26VS192.0±38.59;317.30±43.26VS199.9±40.39;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠BUN无明显差异(P>0.05)。3.空白组、DEN组、DEN+中速组、DEN+高速组小鼠,死亡率均无统计学差异。4.与空白组相比,DEN组小鼠肝癌发生率显著增高,差异具有统计学差异(0%VS94.73%;P<0.05);与DEN组相比,DEN+中速组和DEN+高速组小鼠肝癌发生率显著降低,且差异具有统计学意义(94.73%VS66.67%;94.73%VS56.25%;P<0.05)。
  结论:有氧运动对于DEN诱导肝癌小鼠的一般状态有明显改善作用,有氧运动能够降低DEN诱导小鼠的肝癌发生率。
  第二部分:有氧运动对DEN诱导的模型小鼠铁代谢的影响
  目的:通过观察各组小鼠铁代谢相关指标的差别,证明有氧运动、铁代谢及肝癌形成三者之间的相关性,以观察有氧运动是否是通过影响铁代谢从而抑制DEN诱导的模型小鼠肝癌的发生。
  方法:在第一部分实验基础上,分别检测各组小鼠血清、肌肉组织和肝脏组织中铁、Ferritin和Hepcidin,并观察肌细胞膜上TfR1、TfR2和FPN1的表达差异,以证实有氧运动是否是通过促进铁代谢从而抑制DEN模型小鼠肝癌的发生。
  结果:1、与空白组相比,DEN组小鼠血清Fe含量明显升高差异有统计学意义(23.71±9.895VS54.86±5.383;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠血清Fe含量显著降低,且差异具有统计学意义(54.86±5.383VS29.31±9.997)。与空白组相比,DEN组小鼠血清Ferritin含量明显升高,差异具有统计学意义(1944±439.6VS3799±685.5;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠血清Ferritin含量显著降低,且差异有统计学意义(3799±685.5VS2318±555.4;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠血清Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(239.2±16.90VS318.1±28.80;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组血清Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(318.1±28.80VS512.7±26.35;P<0.01)。2、与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织铁含量明显降低,差异有统计学意义(3.117±0.325VS2.876±0.232;P<0.05);与DEN组比DEN+中速组小鼠肌肉组织铁含量显著提高,且差异有统计学意义(2.876±0.232VS4.199±0.313;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织Ferritin含量显著增高(13.32±0.909VS17.34±1.416;P<0.01);与DEN组相比,DEN+中速组肌肉组织Ferritin含量显著降低,差异有统计学意义(17.34±1.416VS11.01±1.330;P<0.01)。与空白组相比,DEN组小鼠肌肉组织Hepcidin含量无显著改变;与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肌肉组织Hepcidin含量显著升高,且差异有统计学意义(48.83±3.409VS81.67±7.090;P<0.01)。3、与空白组相比,DEN组小鼠肝脏组织Fe含量显著升高,且差异具有统计学意义(5.007±0.738VS8.118±0.865;P<0.01)。与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肝脏组织Fe显著降低,差异有统计学意义(8.118±0.865VS4.997±0.589;P<0.01)。与空白组相比DEN组小鼠肝脏组织Ferritin含量显著增高(28.79±4.093VS41.89±3.069;P<0.01);与DEN组相比DEN+中速组肝脏组织Ferritin含量显著降低,差异有统计学意义(41.89±3.069VS26.71±4.567;P<0.01);与空白组相比,DEN组肝脏组织Hepcidin含量无明显差异;与DEN组相比,DEN+中速组小鼠肝脏组织Hepcidin含量显著增高,差异有统计学意义(4.492±0.776VS10.290±0.867;P<0.01)。
  结论:有氧运动通过增加运动过程中肌肉组织对铁的摄入,升高体内Hepcidin的水平,降低血清Fe和体内Ferritin的水平,这可能与运动抑制小鼠肝癌的发生存在相关性。
[硕士论文] 辛成德
临床检验诊断学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种血液系统恶性疾病,其特征是骨髓中浆细胞恶性增生,分泌出大量的单克隆免疫球蛋白或其片段,导致患者出现血钙增高、肾功能损害、贫血、骨病等临床表现。MM好发于老年人,主要发病人群的年龄在50-70岁之间,发病率约为1/10万,占全部恶性肿瘤的1%,居血液系统恶性肿瘤的第二位。
  MM病因至今尚不明确,遗传、环境因素、化学物质等都可能与MM的发病有关。蛋白酶体抑制剂等靶向药物在临床上的广泛运用使MM患者的预后明显改善,但只有少数患者能够长期控制骨髓瘤,治疗药物耐药的产生在其中发挥着重要作用。因此,寻找一种能够在诊断、预后判断和整个疾病过程中表征疾病进程及药物敏感性的靶标显得十分必要。
  醛酮还原酶(Aldo-keto reductases,AKR)是一种NADP(H)依赖性的氧化还原酶,参与体内醛酮类化合物清除代谢。AKR1家族主要存在与哺乳动物中,有AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4四个亚型。目前发现,AKR1家族与恶性肿瘤密切相关,能在前列腺癌、乳腺癌中引起特异性的耐药,并通过作为E3-连接酶-泛醌系统中的共激活因子,调节细胞对药物的敏感性并能影响细胞凋亡及远处转移。近来,在GCBI等数据库中检索还发现,AKR1C1主要表达于乳腺癌、肺癌、结肠癌等实体肿瘤中,在非霍奇金淋巴瘤、B细胞性淋巴瘤等血液系统肿瘤中亦见报道。
  基于以上介绍,提出以下疑问:AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞株及MM患者外周血中是否也有异常表达?异常表达的AKR1C1与MM的诊断及预后有无关联呢?它们在MM的发病机制中又起着怎样的作用?为了解决这些问题,本课题运用大量数据统计分析、实时荧光定量PCR、基因转染、流式细胞学等技术进行了以下三部分的研究:1)AKR1C1及其他亚型在多发性骨髓瘤细胞株及患者中的表达情况;2)AKR1C1与多发性骨髓瘤患者临床及预后指标相关性;3)AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞中的生物学作用。
  第一部分:AKR1C1及其他亚型在多发性骨髓瘤细胞株及患者中的表达情况
  AKR1家族作为一种肿瘤相关基因,在实体肿瘤中存在异常表达已被证实。相关研究发现AKR1家族除与前列腺癌、乳腺癌密切相关外,在其他多种肿瘤如非小细胞肺癌、胆管癌、胃癌中表达水平明显异常,并有参与到治疗药物耐药机制的产生中,但AKR1家族在血液系统肿瘤特别是多发性骨髓瘤中表达情况尚未见报导。
  本部分实验主要目的是研究AKR1C1及其他亚型:AKR1C1-AKR1C4在各种多发性骨髓瘤细胞株及部分初诊MM患者外周血中的表达情况。首先,采用荧光定量PCR技术检测多发性骨髓瘤细胞株U266、H929、8226、KM3、LP-1等五个细胞株及正常骨髓CD138+浆细胞中AKR1C1-AKR1C4的表达情况,结果发现,各种多发性骨髓瘤细胞株中AKR1C1-AKR1C4表达水平不尽相同:AKR1C1在MM细胞株H929及U266细胞中的表达水平明显升高,AKR1C2在MM细胞株U266、H929、LP-1中表达水平均升高,AKR1C3在MM细胞株H929、LP-1中表达水平升高,AKR1C4在MM细胞株H929及U266中表达水平升高;而且AKR1C1-AKR1C4均在MM细胞株H929中的表达升高最为显著。接下来,进一步检测分析AKR1C1-AKR1C4在H929细胞中的表达水平,发现在H929细胞中,AKR1C1的表达水平要明显高于AKR1C2、AKR1C3及AKR1C4,且AKR1C4的表达水平最低。其次,为明确AKR1C1及其他亚型在初诊MM患者中的表达情况,收集了21例临床初发MM患者和20例健康对照者的外周血PBMC,利用实时荧光定量PCR技术检测其AKR1C1-AKR1C4的表达水平。结果发现,与健康对照者相比,AKR1C1-AKR1C4在初发MM患者外周血PBMC中的表达量不尽相同:AKR1C1的表达水平异常升高,而AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4则在初发MM患者外周血PBMC中未见异常表达。
  上述结果说明,AKR1C1及其他亚型在不同多发性骨髓瘤细胞株中的表达存在明显差异,而且AKR1C1在MM细胞株H929及初发MM患者外周血PBMC中均异常高表达。
  第二部分:AKR1C1与多发性骨髓瘤患者临床及预后指标相关性
  多发性骨髓瘤仍然是一种几乎无法治愈的浆细胞恶性肿瘤,新兴药物如蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、抗CD38单克隆抗体等在临床上广泛运用,MM患者的预后明显改善,但仍只有少数患者能够长期控制骨髓瘤。药物的耐药性在其中发挥着重要作用。因此,寻找一种能够在诊断、预后判断和整个疾病过程中表征疾病进程及药物敏感性的分子显得十分必要。第一部分的实验结果表明,AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞株及初发MM患者PBMC中均显著高表达,但其与多发性骨髓瘤患者病情程度、预后及临床指标间的相关性还需要进一步的探讨。
  本部分实验主要目的是探讨AKR1C1作为多发性骨髓瘤的诊断、预后判断、疗效监测新指标的可能性。首先,分别检测了AKR1C1在不同疾病阶段的MM患者外周血PBMC中的表达水平,发现,与健康对照组相比,初发组、复发组与缓解组MM患者的外周血PBMC中AKR1C1的表达水平均显著升高;而且与缓解组相比,初发组、复发组MM患者的外周血AKR1C1的表达水平有明显升高;但初发组与复发组之间,外周血AKR1C1的表达水平则无明显差异。其次,再分析检测不同预后分期的MM患者中外周血PBMC中AKR1C1的表达水平,发现ISS-Ⅰ期、ISS-Ⅱ期MM患者分别与ISS-Ⅲ期MM患者相比,外周血中AKR1C1表达水平差异明显;而且与其余两组相比,ISS-Ⅲ期MM患者的外周血AKR1C1表达水平最高;但ISS-Ⅰ期与ISS-Ⅱ期之间,外周血AKR1C1的表达水平则无明显差异。最后,又把AKR1C1在MM患者外周血PBMC中的表达水平与MM诊断、分期及预后相关的各种临床参数,包括血κ轻链、κ/λ比值、β2微球蛋白、血清白蛋白、乳酸脱氢酶、血红蛋白、血肌酐、血钙等进行大量的统计学分析。结果发现,AKR1C1在MM患者的外周血表达水平与血清κ轻链的含量呈正相关性、并与κ/λ的比值也显著正相关;还与血清β2微球蛋白含量显著正相关,也与LDH的含量呈正相关性;但是,AKR1C1在MM患者的外周血表达水平与血清白蛋白、血红蛋白、肌酐、血钙均无明显相关性。因此,上述结果提示,AKR1C1在MM中的表达水平与MM疾病的严重程度以及疾病的预后密切相关。
  第三部分:AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞中的生物学作用
  在多发性骨髓瘤患者的临床药物治疗中,部分病人会出现Bcl-2家族蛋白调控失控导致凋亡途径异常,从而出现对治疗药物的耐药。如能让MM患者骨髓瘤细胞恢复正常的凋亡机制,将能够明显提高临床药物的治疗效果。此外,调控细胞自噬也是其多发性骨髓瘤治疗的研究方向之一。通过前两部分的研究,发现AKR1C1在多发性骨髓瘤MM患者外周血PBMC中显著高表达,且异常表达的AKR1C1与MM的病情程度、预后密切相关;但其在MM的发病机制间的相关性还需要进一步的探讨。
  因此,在本部分实验中,首先通过CCK-8方法检测骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对细胞增殖的影响,发现与对照组相比,H929细胞转染siRNA-AKR1C1后细胞增殖率均明显降低;两组的细胞增殖率在12-72h间的各时间点均相差明显;且随着时间的延长,两组间差异逐渐增大,在48h时两组间差异最为明显。其次,为明确AKR1C1对目前治疗MM的主流化疗药物:硼替佐米(Bortezomib,BTZ)的药物敏感性,先研究了转染siRNA-AKR1C1并联用BTZ后对H929细胞增殖的影响。结果发现,对照组与转染siRNA-AKR1C1组的H929细胞增殖均明显受抑制;且与对照组相比,siRNA-AKR1C1组的细胞增殖受抑更为明显;在硼替佐米浓度为20ng/ml时,siRNA-AKR1C1组与对照组间的差异最为明显。然后,又采用流式细胞术检测骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对细胞凋亡的影响;发现与对照组相比,转染siRNA-AKR1C1组的细胞凋亡率明显增加,而且,加入硼替佐米后,转染siRNA-AKR1C1组的细胞凋亡率更要显著高于对照组。接下来,还探讨了骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对凋亡相关分子:Bcl-2、Caspase-3、以及自噬相关分子:p62、LC3表达的影响,结果发现,与对照组相比,转染siRNA-AKR1C1组的Bcl-2的表达减少、Caspase-3的表达则明显增加,且p62的表达明显减少、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换则明显增加。上述结果说明,在骨髓瘤H929细胞中沉默AKR1C1的基因表达后,能够明显抑制细胞增殖、增加细胞凋亡以及H929细胞对硼替佐米的药物敏感性,也能下调Bcl-2的表达、上调Caspase-3的表达,还可以诱导细胞自噬。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
[博士论文] 韩萍
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究分为以下四部分:1.蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的筛选;2.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响;3.酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究;4.酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制研究。
  第一章 蟾皮抑制卵巢癌细胞增殖有效成分的的筛选
  方法:
  5种蟾皮活性成分酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍噻咛配置浓度梯度0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500μM作用于卵巢癌SKOV3细胞72小时,用In cell2000 analyzer统计存活细胞数目,计算细胞存活率。筛选出抑制作用较强的2种成分,进一步作用于人胸水来源的卵巢癌原代细胞72小时,计算细胞存活率。
  结果:
  5种蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞活性作用,在浓度高于20μM时,有明显的量-效关系;72小时测定并计算酯蟾毒配基IC50=48.62μM,蟾毒它灵IC50=86.86μM;其余脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基和水溶性成分蟾蜍噻咛抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖活性作用较弱。酯蟾毒配基和蟾毒它灵在浓度高于20μM时,对人胸水来源的卵巢癌原代细胞抑制率均高于50%,能明显抑制人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖。
  结论:
  蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它灵有较好的抑制卵巢癌SKOV3细胞和人胸水来源的卵巢癌原代细胞增殖,为5种蟾皮有效成分中抑制卵巢癌细胞增殖活性的优势成分。
  第二章 酯蟾毒配基对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响
  方法:
  酯蟾毒配基配置浓度梯度20、100、500μM单独或与顺铂5μM联合作用于卵巢癌SKOV3细胞24、48、72小时,用MTS方法检测细胞增殖情况。流式细胞术和Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡。
  结果:
  1、各浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性降低。酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用,随着酯蟾毒配基浓度增加、作用时间的延长而增强。
  2、当不同浓度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于空白对照组,酯蟾毒配基组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)及死亡细胞(UL)比例均明显增加,并且这种变化呈现出了剂量依赖性。
  3、酯蟾毒配基给药处理后,随着酯蟾毒配基浓度(20μM、100μM、500μM)的增加,凋亡小体增多。
  4、在不同浓度(20μM、100μM、500μM)酯蟾毒配基和5μM顺铂联合作用72小时后,卵巢癌SKOV3细胞增殖活性发生不同的变化趋势。20μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基20μM组(P<0.001),高于顺铂组(P<0.05);100μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性低于酯蟾毒配基100μM组(P<0.001),低于顺铂组(P<0.01);500μM酯蟾毒配基与5μM顺铂联用组的细胞增殖活性与酯蟾毒配基500μM组比较,无显著性差异(P>0.05),低于顺铂组(P<0.001)。
  5、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,相对于顺铂组,酯蟾毒配基20μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)比例明显减少,晚期凋亡(UR)比例变化不明显。酯蟾毒配基100μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)变化不明显,晚期凋亡(UR)比例有所增加。酯蟾毒配基500μM与顺铂联用组的早期凋亡细胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)比例均明显增加。
  6、当不同浓度酯蟾毒配基联合顺铂作用卵巢癌SKOV3细胞72小时后,Hoechst荧光染色法检测到的凋亡变化情况同流式检测结果一致。
  结论:
  酯蟾毒配基能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,具有明显的浓度、时间依赖性。并能促进卵巢癌SKOV3细胞的凋亡。
  酯蟾毒配基20μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性的效果不及单用顺铂;酯蟾毒配基100μM联用顺铂,抑制卵巢癌细胞增殖活性效果优于单用顺铂和单用酯蟾毒配基。不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用可产生增强或减弱的影响。
  第三章 酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长作用研究
  方法:
  卵巢癌细胞SKOV3注射于裸鼠皮下进行移植瘤造模,造模成功后随机分为8组,分别给予低、中、高浓度酯蟾毒配基,低、中、高浓度酯蟾毒配基与顺铂合用进行干预,设置空白对照组和顺铂组,腹腔注射给药,酯蟾毒配基隔日1次,顺铂每周1次,比较各组裸鼠移植瘤体积、瘤重。
  结果:
  各组给药后裸鼠皮下移植瘤的生长均受到抑制。酯蟾毒配基低、中、高剂量组各组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为酯蟾毒配基低剂量组(L)<酯蟾毒配基中剂量组(M)<酯蟾毒配基高剂量组(H),顺铂组(PT)、酯蟾毒配基低、中、高剂量和顺铂合用组四组间抑瘤率差异有统计学意义(P<0.05),抑瘤率由低到高依次为L+PT< PT< M+PT< H+PT。
  结论:
  酯蟾毒配基能抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长,低剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有拮抗减效作用,中、高剂量酯蟾毒配基对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长有协同增效作用。
  第四章 机制研究
  方法:
  选择AffymetrixPrimeViewTMHuman Gene Expression Array表达谱芯片,用基因芯片筛查技术分析卵巢癌细胞SKOV3在接受酯蟾毒配基作用、酯蟾毒配基与顺铂联合作用处理后基因表达的变化,利用生物信息学分析差异基因,通过表达模式聚类分析、GO富集分析、KEGG富集分析,寻找有显著差异变化信号通路及关键分子,通过PCR、Western Blot方法检测关键基因的蛋白表达进行结果验证。
  结果:
  1、酯蟾毒配基可能通过调节PI3K/AKT/CREB通路,促进凋亡,抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,是酯蟾毒配基影响顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用的关键所在。
  2、PCR结果显示酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,AKT1不表达;与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中CREB1水平无明显差异(P>0.05),酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中CREB1水平明显增加(P<0.05)。
  3、Western Blot结果显示,酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3细胞后,与空白对照组比较,酯蟾毒配基20μM组、酯蟾毒配基100μM组中AKT水平均降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平均增高。与顺铂5μM组比较,酯蟾毒配基20μM+顺铂5μM组中AKT水平增高、Caspase3水平降低,磷酸化CREB水平降低;酯蟾毒配基100μM+顺铂5μM组中AKT水平降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平增高。
  结论:
  1、酯蟾毒配基通过PI3K/AKT/CREB通路,上调Caspase3水平,促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡,可能是酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的机制。
  2、CREB可能是卵巢癌SKOV3细胞的抑癌转录因子。
  3、不同浓度的酯蟾毒配基和顺铂联用后,可能通过PI3K/AKT/CREB通路,调节Caspase3水平,通过凋亡途径对顺铂抑制卵巢癌SKOV3细胞的作用产生协同或拮抗影响。
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