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[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[硕士论文] 刘溪
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过研究PDLIM5在前列腺癌组织及细胞系中的表达水平,验证PDLIM5在前列腺癌中的异常高表达。筛选高表达PDLIM5细胞株进一步进行生物功能学实验,以探索PDLIM5介导肿瘤发生及转移的生物学功能及调控机制。
  方法:
  (一)PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证
  收集Oncomine、PROGGENE数据库中的前列腺癌样本中PDLIM5表达、转移及预后相关信息,验证PDLIM5在癌和正常腺体中的表达差异,明确高表达PDLIM5与PCa转移预后的相关性。进一步收集长征医院泌尿外科前列腺癌根治术后临床组织样本44例,运用免疫组织化学染色法检测癌和癌旁组织标本明确PDLIM5组织表达水平。
  (二)前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证
  在PCa常见细胞系中通过Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表达情况,选取高表达PDLIM5的转移性PCa细胞株DU145和PC-3作为后续实验对象,构建包含靶向干扰PDLIM5的质粒的慢病毒进行细胞感染。观察质粒上的报告基因荧光强度,并分别在mRNA及蛋白水平验证PDLIM5的敲减效率,确认沉默PDLIM5的细胞株构建成功。
  (三)检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响
  在稳定沉默PDLIM5的DU145和PC-3细胞中,通过MTT比色法、克隆形成试验来评估肿瘤细胞增殖能力的变化;通过细胞流式术检测细胞周期及凋亡水平变化以明确PDLIM5敲减后对肿瘤细胞的周期阻滞及诱导凋亡作用;通过划痕愈合实验及TRANSWELL实验来检测PDLIM5对肿瘤迁移侵袭的影响。
  (四)PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究
  根据细胞表型相关实验结果及数据库信息分析,PDLIM5对肿瘤细胞的转移侵袭能力具有显著影响。首先在PDLIM5沉默状态下通过Western Blot和qPCR对上皮细胞-间充质转化(EMT)相关分子进行了检测,随后通过构建过表达质粒,在同种细胞株中过表达PDLIM5,检测EMT相关分子表达回复情况,并分别在PDLIM5敲减及过表达两种情况下对前列腺骨转移相关分析因子进行检测。最后通过免疫共沉淀,确定PDLIM5与AMPK的相互作用并对敲减PDLIM5后AMPK磷酸化水平进行检测,探索PDLIM5-AMPK-EMT的调控机制。
  (五)动物实验研究PDLIM5在体内功能作用
  使用沉默PDLIM5的DU145细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,观察体内环境下PDLIM5敲减后对细胞成瘤及增殖能力的影响。随后将取瘤体组织进行裂解,通过Western Blot对PDLIM5蛋白表达水平进行检测,明确PDLIM5的沉默效率并检测AMPK、EMT相关信号通路分子表达变化,明确在动物实验中PDLIM5对细胞增殖转移的调控机制。
  结果:
  1.发现PDLIM5在PCa组织中异常高表达,并且与PCa生化复发与生存期相关。通过免疫组化及生物信息学分析方法,确认PDLIM5在PCa中较正常前列腺组织表达水平升高,且深入分析数据库芯片资料发现异常高表达的PDLIM5与预后不良因素如:转移、高Gleason评分及TMN分期相关。同时,通过多因素分析及生存分析发现高表达PDLIM5是PCa生化复发的独立危险因素并导致患者总生存率下降。
  2.成功建立稳定沉默PDLIM5的DU145及PC-3细胞株,通过相关细胞学实验发现沉默PDLIM5可导致前列癌细胞恶性增殖、克隆形成、侵袭转移能力受抑制,并可诱导G2/M阻滞和细胞凋亡的发生。
  3.检测PDLIM5敲减后上皮-间质转化(EMT)相关分子表达水平,通过Western Blot及qPCR发现人紧密连接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出现不同程度下调,而EMT关键分子E-cadherin表达量上升,证实EMT过程受到抑制。
  4.在DU145及PC-3细胞中过表达PDLIM5可以在一定程度上通过上调SNAIL的表达,从而使及关键分子E-cadherin表达量下降,证实PDLIM5对细胞侵袭和转移的影响与EMT密切相关。同时在细胞实验中检测已知促进前列腺癌骨转移的相关分子,如结缔组织生长因子(CTGF),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。qPCR结果显示,沉默PDLIM5后,PC-3细胞中这些促肿瘤转移因子的表达显着下调。当PDLIM5过表达时,这些分子的表达水平出现上调,且在DU145细胞中也观察到类似的结果,进一步证实PDLIM5在促进肿瘤转移中起作用
  5.免疫共沉淀确定PDLIM5可与AMPK相结合,敲减PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。随后通过放线菌素阻断上游蛋白质合成,在给药后不同时间点检测AMPK蛋白水平,结果发现PDLIM5沉默组AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通过维持AMPK的稳定性,使AMPK通路持续性激活,从而促进前列腺癌的恶性增殖及转移。
  6.裸鼠成瘤实验证明在体内条件下,沉默PDLIM5可抑制肿瘤细胞生长。通过组织蛋白水平检测,在动物实验中PDLIM5同样可通过AMPK-EMT相关通路对前列腺癌细胞增殖及转移进行调控。
  结论:
  本研究证实了PDLIM5表达水平在PCa组织中发生上调,表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通过生物信息学分析探索PDLIM5与PCa复发和转移的关系,表明高表达PDLIM5是前列腺癌预后不良的相关因素。此外,细胞和动物实验都表明,PDLIM5通过激活AMPK通路可以促进癌细胞的增殖并增强EMT介导的侵袭和转移。探索PDLIM5相关相关通路及作用靶点可能有助于丰富PCa的进展和转移机制,并为mCRPC患者带来新的治疗策略。
[博士论文] 汤雨潇
劳动卫生与环境卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过比较肝癌转移患者与未转移患者的肝癌组织铁含量,以及体内外实验明确缺铁与肝癌转移的关系和机制,为系统了解肝癌铁代谢特点及其在肝癌细胞转移中的作用,同时为今后肝癌转移防治措施的完善,尤其是铁螯合剂在肝癌治疗中的应用提供科学依据。
  方法:
  一、肝癌组织铁含量的检测
  1.磁共振成像检测铁含量
  采用GE Signa HDx1.5T MR扫描仪对肝癌患者进行术前扫描,按设定参数扫描后利用自带的工作站软件建立R2*图,随后在R2*图手动标出目标区域,通过软件分析得到R2*值。
  2.火焰原子吸收法检测组织铁含量
  剪下适量组织,烘干后称重,置于玻璃消化管中,加入1ml硝酸和高氯酸混合酸(硝酸/高氯酸=1/4)。放入高温消化炉消化至组织溶解,溶液澄清,随后定容至10ml,作为待测液。以铁标准贮备液(100μg/mL)为标准品配置标准曲线测定液,随后与待测样本同时进原子吸收分光光度计检测,根据标准曲线计算出溶液中铁含量,再比上各组织重量得到组织中铁含量(μg/g)。
  二、细胞实验
  1.细胞培养与处理
  Huh7细胞和HepG2细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养液中,SMMC-7721细胞和H22细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液中。DFO的使用浓度为100μM,Dp44mT的使用浓度为10μM,处理时间为24小时。HIF1α抑制剂PX478的使用浓度为20μM,SP1抑制剂Mithramycin A的使用浓度为100nM,在添加铁螯合剂的同时加入培养液中。
  2.原代肝细胞提取
  人原代肝细胞购于Sciencell公司并附鉴定报告。小鼠原代肝细胞提取:消化酶灌流后取出肝,重悬细胞过400目筛网过滤,随后通过Percoll分离液分离细胞,转移细胞至细胞培养瓶培养并洗去未贴壁细胞。
  3.细胞增殖检测
  采用ThermoFisher Click-iT(@)Plus EdU Alexa Fluor(@)488Flow Cytometry Assay Kit检测细胞增殖。
  4.细胞迁移侵袭实验
  采用transwell小室定性检测肝癌细胞迁移能力,采用Cell Biolabs迁移能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞迁移能力变化。侵袭能力定性检测采用预包被基质胶的transwell小室,采用Cell Biolabs侵袭能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞侵袭能力变化。
  5.细胞转染
  采用lipo3000进行siRNA转染,siRNA浓度为100μM,lipo3000用量及操作参照试剂说明书,隔天换液,转染48小时后进行后续操作。
  6.荧光素酶标记
  细胞荧光素酶标记使用荧光素酶标记试剂盒(上海中乔新舟,货号A1001-8),该试剂盒内含慢病毒介导的萤光素酶标记液及辅助感染的polybrene,通过CAG启动子过表达萤光素酶从而作为报告基因,感染后可在细胞中稳定表达。
  7.细胞TFRC基因敲降
  使用携带TFRC shRNA的慢病毒敲降Huh7细胞和H22细胞的转铁蛋白受体,将shRNA序列克隆进pLVX-shRNA1慢病毒载体后进行包装和生产,得到病毒感染液后感染细胞并筛选稳定细胞系进行后续成瘤实验。
  8.荧光淬灭法检测细胞内铁含量
  使用Phen GreenTM FL试剂(Thermo Fisher)检测细胞内铁含量。细胞内二价铁与荧光试剂结合使其荧光淬灭,通过荧光显微镜观察细胞内荧光强度定性检测细胞内铁含量的变化。
  9.转录因子活性芯片
  DFO干预Huh7细胞24h后提取核蛋白,与对照组核蛋白一起分别与TranSignalTM Protein/DNA Array试剂盒中345种特异性与转录因子结合的探针孵育结合,随后洗去未结合的探针,接着分离探针/核蛋白复合体得到探针,与transignal芯片杂交,检测每种探针产生的信号变化,以此反应各探针对应的转录因子结合活性的变化。
  10.染色质免疫共沉淀
  采用CST的酶解法染色质免疫共沉淀试剂盒检测三种转录因子HIF1α、SP1和YY1对SPNS2转录活性的变化
  。
  结果:
  一、肝癌转移患者癌组织铁含量显著低于未转移患者
  1.与正常组织或癌旁组织相比,肝癌组织铁含量下降
  10例肝癌患者肝癌组织的R2*值显著低于癌旁组织和远处正常肝组织的R2*值。由于R2*值与铁含量呈正相关,提示肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  火焰原子吸收法定量检测29位肝癌患者手术标本癌旁组织和癌组织,发现肝癌组织铁含量显著低于癌旁组织,与磁共振扫描的结果一致。
  与癌旁组织相比,肝癌组织铁稳态分子TFRC、HAMP、Ferritin的表达显著改变,符合肝癌组织缺铁的表现。上述结果表明,肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  2.发生转移肝癌患者的癌组织铁含量显著低于未发生转移肝癌患者
  收集术后5年内发生转移复发的肝癌患者15例,未发生转移复发患者15例,通过检测手术标本(5年前首次手术的标本)的铁含量及铁稳态分子表达,发现发生转移的肝癌患者其肝癌组织铁含量显著低于未发生转移的肝癌患者,提示铁含量下降在肝癌转移中可能发挥一定作用。
  二、体内外实验证实缺铁促进肝癌细胞转移
  1.缺铁抑制人肝癌细胞增殖,但促进人肝癌细胞迁移和侵袭
  通过添加DFO(100μM)和Dp44mT(10μM)两种铁螯合剂造成细胞缺铁模型。采用EdU标记方法观察缺铁对三种人肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721增殖的影响,结果发现缺铁时三种肝癌细胞增殖均受到显著抑制。
  但是,定性及定量检测结果显示,在两种铁螯合剂的作用下,Huh7、HepG2、SMMC-7721三种肝癌细胞均表现出显著的迁移侵袭增强。
  2.缺铁促进人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内转移
  2.1系统性缺铁模型
  在体内缺铁是否促进肝癌转移尚不清楚。首先通过给裸鼠喂食缺铁饲料造成裸鼠系统性缺铁模型,观察人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内的转移情况。通过检测肝组织、肺组织铁含量和血清铁含量、铁蛋白含量、转铁蛋白饱和度等指标以及免疫荧光检测肝组织、肺组织的铁蛋白表达,确认喂食缺铁饲料后裸鼠缺铁模型制作成功。
  为了更好地观察肝癌细胞在体内转移的情况,采用活体成像技术定期观察肝癌细胞在体内的生长、扩散。Huh7细胞进行荧光素酶标记(Huh7-fluc),扩增到足够数量后通过肝脏原位种瘤和尾静脉注射种瘤两种方式进行体内荷瘤实验。每10天进行一次活体成像拍照,并利用软件分析肝癌细胞在体内的增殖数量与转移面积。结果发现,与正常组相比,在两种荷瘤模型中缺铁组均表现出明显的肝癌细胞转移范围增大和肺部转移增强。提示缺铁会促进Huh7细胞的体内转移。
  2.2肝癌细胞(Huh7)缺铁模型
  为了更贴合人肝癌组织铁含量下降而整体并不缺铁的情况,通过敲降Huh7细胞转铁蛋白受体,限制其摄入铁的能力而造成细胞内缺铁。检测TFRC mRNA表达和TfR1蛋白表达显示,敲降Huh7-fluc细胞TfR1成功,同时细胞内铁含量低于未敲降组。
  Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞与Huh7-fluc细胞扩增足量后以同样细胞量通过原位种植和尾静脉注射两种方式进行裸鼠荷瘤实验,敲降组与未敲降组裸鼠喂食同样的正常饲料。相比于Huh7-fluc细胞,Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞在裸鼠体内转移显著增强,肺部转移显著。
  3.缺铁促进小鼠肝癌细胞H22在C57小鼠体内转移
  系统性缺铁模型
  为了排除免疫系统缺陷对肝癌细胞转移的影响,在C57小鼠体内种植小鼠肝癌细胞H22,观察缺铁对H22在体内转移的影响。通过检测铁相关指标,确认喂食缺铁饲料后C57小鼠系统性缺铁。
  同样,H22细胞标记荧光素酶(H22-fluc)后,以肝原位种瘤和尾静脉注射两种方式荷瘤。活体成像拍照分析结果显示缺铁组小鼠比正常组小鼠成瘤面积大,肺部转移肿瘤面积增大。
  结论:
  本研究通过检测肝癌转移患者和未转移患者癌组织铁含量,并在整体和细胞水平制作多种缺铁模型,观察缺铁对肝癌细胞转移的作用及其机制。从所取得的实验结果上得出以下结论:
  1.发生转移肝癌患者癌组织铁含量明显降低;
  2.在体内和体外,缺铁均促进肝癌细胞转移;
  2.SPNS2上调是缺铁促进肝癌细胞转移的关键环节;
  3.HIF1α和SP1在缺铁引起SPNS2上调中发挥重要作用。
[博士论文] 陈红芳
肿瘤学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  胃癌作为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,具有很高的致死率。中国是胃癌的高发地区。早期胃癌患者缺乏特异性的临床症状和影像学特征,常常被误诊。当出现明显症状时,大多处于进展期。尽管现在的诊疗技术进一步发展,进展期的胃癌病人预后仍然非常差。除了肿瘤本身的异常增殖,浸润和转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因。
  肿瘤的浸润及转移涉及多个步骤、多种因素,牵涉很多机制和基因。此过程包括肿瘤细胞与宿主细胞、肿瘤细胞与细胞外基质之间相互作用。最早的转移机制是由Liotta提出的,包括三个步骤:粘附、降解和移动。在肿瘤浸润转移过程中,上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)发挥重要的作用。EMT涉及多种标记物表达的变化。
  钙粘附蛋白是一类常见的粘附分子,它是一类依赖钙离子的跨膜糖蛋白。可以介导正常组织和肿瘤组织中细胞-细胞间的粘附及连接作用。钙粘附蛋白家族包括经典钙粘蛋白(classic cadherins)、桥粒钙粘蛋白(desmosomal cadherins)、Flamingo(CELSR)钙粘蛋白,FAT钙粘蛋白(fat-like cadherins)和原钙粘蛋白(protocadherins, PCDH)。
  原钙粘蛋白是最大的钙粘蛋白超家族,最早由Shintaro发现并命名。PCDH是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白,根据基因结构和功能可将其分为:非成簇原钙粘蛋白(Nonclustered PCDH)、成簇原钙粘蛋白(Clustered PCDH)。PCDH7属于非成簇PCDH家族,位于人染色体4p15。PCDH7首先是在胃癌细胞中被发现的,后来研究发现其主要在人类和鼠的脑和心脏中表达。PCDH7作为粘附分子也具有粘附能力,只不过作用要小一点。目前的研究主要表明,PCDH7可以影响神经系统发育,并且在多种肿瘤中存在异常表达,然而其在肿瘤中的异常表达和发挥作用的机制尚不清楚。本实验的主要目的,检测PCDH7在胃癌组织及胃粘膜组织中是否存在差异表达。并进一步分析PCDH7的表达和胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系,明确PCDH7对胃癌细胞增殖、浸润和迁移能力的影响,并探索PCDH7参与胃癌细胞浸润转移的相关调节机制。
  方法:
  收取山东大学齐鲁医院病理科47例胃腺癌和25例正常胃粘膜新鲜组织,并完善其临床资料。所有标本均经过病理确诊。提取标本的RNA,反转录,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测两组标本中PCDH7 mRNA的表达。回顾性分析2004年1月至2007年5月间保存的119例胃腺癌及75例胃粘膜石蜡标本,所有标本均有完善的临床病例资料。采用免疫组化方法,检测PCDH7蛋白在胃癌、上皮内瘤变及正常胃粘膜之间的差异。分析PCDH7蛋白与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤体积、分型、TNM分期、淋巴结转移以及远处转移等病理参数的关系,明确其对胃癌的影响。对119例胃癌病人均进行随访,确定患者的基本情况。根据相关数据,采用Kaplan-Meier生存法,分析PCDH7与总生存期(overall survival,OS)、无瘤生存期(disease-free survival,DFS)的关系,明确PCDH7对胃癌患者预后的影响。进一步采取了单因素和多因素方法分析,明确PCDH7是否为胃癌患者预后的独立因素。
  为进一步确定PCDH7对胃癌的影响,进行细胞功能学方面的实验。常规培养胃癌细胞株BGC823和MKN45。采用瞬时转染siPCDH7,抑制胃癌细胞内PCDH7的表达。提取RNA,反转录,RT-qPCR,检测转染效率。转染siPCDH7后,MTS法检测胃癌细胞株BGC823和MKN45增殖能力的变化。采用Transwell小室法,进行人工重组基底膜侵袭、迁移实验,检测PCDH7对胃癌细胞株BGC823和MKN45侵袭、迁移能力的影响。
  为研究PCDH7在胃癌中的作用机制,采取RT-qPCR检测EMT相关因子E-cadherin, N-cadherin,β-catenin, Vimentin, Twist, Snail, Zeb1和Zeb2等mRNA水平的变化。并进一步采用Western blot检测E-cadherin,β-catenin,Vimentin和Snail蛋白水平的表达变化。
  结果:
  1.胃癌组织中PCDH7表达降低
  首先,检测标本中PCDH7 mRNA的含量。显示,与正常胃粘膜相比,胃癌组织中PCDH7 mRNA明显降低,比起正常胃组织下调17.8倍。免疫组化结果,胃粘膜中PCDH7蛋白的阳性表达率为(20/20,100%),上皮内瘤变组织为63.6%(35/55),胃癌组织为32.8%(39/119)。总之,从正常胃粘膜、上皮内瘤变到胃癌组织,PCDH7蛋白表达水平呈现渐进式降低,组别间的差异均具有统计学意义(组间P<0.001)。此外,与没有淋巴结转移的胃癌相比,存在淋巴结转移者PCDH7的表达率明显降低(P<0.001)。结果提示,PCDH7在胃癌的淋巴结转移中可能起重要作用。
  我们应用ROC(receiver operator characteristic)曲线评价PCDH7在诊断胃癌与非癌组织中的价值。结果显示,ROC曲线能很好的区分两者,胃癌和非癌变组织之间,曲线下的面积(area under the curve,AUC)为0.938,表明PCDH7的表达可以用来区分两者。另外,ROC曲线表明,PCDH7的表达可以用来区别胃癌淋巴结转移与否(AUC=0.695,P=0.01)。
  2.PCDH7的表达与临床病理参数之间的关系
  胃癌标本PCDH7的低表达水平与Lauren's分型(P=0.0005)呈正相关,肠型胃癌(55.3%)显著高于弥漫型胃癌(26.2%);无淋巴结转移组(55.3%)显著高于淋巴结转移组(22.2%)(P=0.0002);与TNM分期(P=0.0221)呈正相关,Ⅰ期阳性率为50%(12/24),Ⅱ-Ⅳ期阳性率为28.4%(27/95)。而PCDH7蛋白的表达与肿瘤患者的年龄、性别、肿瘤体积以及是否存在远处器官转移等参数无明显相关性。这些数据显示PCDH7参与胃癌的发生、发展。
  3.PCDH7的表达与预后的关系
  Kaplan-Meier生存分析显示,PCDH7高表达患者的术后生存时间(P=0.0490)、无瘤生存时间(P=0.0380)明显高于PCDH7低表达的患者。
  单因素分析结果显示,PCDH7的表达、癌组织浸润深度、淋巴结转移、远处脏器转移和肿瘤分期是胃癌预后的因素。多因素分析显示,远处转移、肿瘤分期是独立的预后影响因素,而PCDH7并不是胃癌患者独立的预后因素。
  4.细胞学功能实验结果
  MTS法检测胃癌细胞的增殖能力。结果显示,抑制PCDH7的表达后,BGC823和MKN45细胞的增殖能力无明显变化。侵袭和迁移实验中,采用直接计数法,计数穿透小室的细胞数。PCDH7抑制后,穿透Transwell底部的膜,进入下层的BGC823及MKN45细胞数,均比对照组的多(P<0.05)。细胞功能学实验,更加明确PCDH7可以抑制胃癌细胞的迁移和浸润。
  5.干扰PCDH7的表达对EMT相关分子表达的影响
  RT-qPCR结果显示,干扰PCDH7的表达后,在两株胃癌细胞中EMT相关因子中只有E-cadherin的mRNA水平降低,而N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Twist、Snail、Zebl和Zeb2等分子无明显变化。Western blot结果表明,随着PCDH7表达降低,在两株胃癌细胞株中,E-cadherin蛋白表达水平均降低。PCDH7的表达E-cadherin呈正相关。其他EMT相关蛋白β-catenin、Vimentin和Snail等无显著变化,PCDH7的低表达与其无关。
  结论:
  1.PCDH7在胃癌组织中低表达,抑制胃癌的浸润转移,与胃癌的预后有关。
  2.PCDH7通过调节E-cadherin的表达抑制胃癌的浸润和转移。
  3.PCDH7可以作为胃癌诊断和预后判断的新的指标。
[硕士论文] 李林
外科学(骨肿瘤外科) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  癌症类型中,肺癌是发病率和死亡率最高的肿瘤之一,约有30%~40%的中晚期肺癌病人会发生骨转移,严重危害人类的健康和生活质量。黑色素瘤特异性抗原(Preferentially expressed antigen of melanoma,PRAME)是于众多黑色素瘤病人群体中筛查得出,它是一种表面抗原,细胞毒性T淋巴细胞可以识别PRAME,随即引发特异肿瘤的相关性溶解。目前,国内外研究已确定PRAME可以作为一个判断该肿瘤患者预后及复发情况的重要指标,PRAME在原发性骨肉瘤,皮肤鳞状细胞癌等肿瘤中的表达高低也预示着肿瘤的演出转移情况。为了阐明PRAME在肺癌骨转移及其对下游基因信号通路调控的作用机制,设计了本实验研究。
  研究方法:
  1.检测正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及骨转移肿瘤标本中PRAME表达水平获取正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及肺癌骨转移肿瘤组织,通过蛋白质免疫印记检测蛋白电泳及实时定量聚合酶链式反应等检测明确PRAME,E-cadherin在表达水平上的差异及意义。
  2.检测PRAME对肺癌细胞系迁移及侵袭能力的影响体外验证PRAME基因在肺癌骨转移中的影响,建立稳定敲除PRAME的肺癌骨转移亚克隆细胞系PC9及A549,利用MTT,侵袭实验等技术检测细胞迁移和增殖能力及PRAME对E-cadherin蛋白水平和RNA水平的影响。
  3.小鼠骨肿瘤模型中PRAME表达水平对肺癌骨转移的影响骨内局部注射法利用上述PC9细胞系建立小鼠胫骨肺癌骨转移模型,通过实时定量聚合酶链式反应,蛋白质免疫印记检测,免疫组化等方法检测PRAME基因的表达与E-cadherin蛋白水平的关系,通过X-Ray,荧光标记活体成像等方法对小鼠肿瘤模型进行评估。
  研究结果:
  1.检测正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及骨转移肿瘤标本中PRAME表达水平蛋白质免疫印记检测及实时定量聚合酶链式反应的结果证实正常人肺组织、肺癌原位肿瘤及肺癌骨转移肿瘤组织中PRAME及E-cadherin均有表达,其中正常人肺组织中的表达水平最高,骨转移组织最低。
  2.检测PRAME对肺癌细胞系迁移及侵袭能力的影响体外实验中,抑制PC9及A549的PRAME基因的表达,细胞迁移及增值活性上均明显低于对照组细胞系,同时E-cadherin蛋白表达水平与PRAME基因呈正相关。
  3.小鼠骨肿瘤模型中PRAME表达水平对肺癌骨转移的影响通过X-Ray照射发现抑制PRAME基因组的骨侵蚀的现象明显强于对照组,荧光标记活体成像结果也更加明显,取出肿瘤通过免疫组化染色等方法检测,发现抑制组PRAME基因表达明显降低,同时E-cadherin蛋白表达水平也明显降低。
  研究结论:
  肺癌骨转移肿瘤组织中PRAME的表达水平较正常肺组织及肺癌原位肿瘤组织低。下调PRAME表达水平可促进肿瘤细胞迁移和增值,E-cadherin蛋白在这一过程中起重要作用。
[博士论文] 李晓梅
肿瘤学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:乳腺癌(Breast cancer, BC)发病率和死亡率已跃居全球女性恶性肿瘤的首位。与欧美等发达国家相比,中国等发展中国家的乳腺癌发病表现出发病率较低、患者较年轻、激素受体阴性比例较高等特点。随着肿瘤筛查检测技术的普及和综合治疗水平的提高,乳腺癌患者的预后已取得了显著改善,但乳腺癌仍高居女性恶性肿瘤致死病因的首位,特别是在一些发达国家和地区,乳腺癌更是严重危害女性身心健康的疾病。因此,研究乳腺癌的发生发展,尤其是对侵袭和转移机制的深入研究,为寻找乳腺癌新的分子标记和治疗靶点提供重要的理论依据,具有重大意义。
  随着近代肿瘤学的发展,研究已证实肿瘤细胞的无限增殖,进而导致肿瘤细胞的侵袭转移,是肿瘤进展和患者死亡的根本原因。因此,通过研究癌细胞增殖、侵袭和转移,进行乳腺癌生物学行为预测,对肿瘤的预后预测研究具有重要意义。在恶性肿瘤的上皮-间质转化、侵袭、转移及信号传导过程中,Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TypeⅡ transmembrane serine protease,TTSPs)起着极其重要的作用。Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4(TypeⅡ transmembrane serine protease4,TMPRSS4)是TTSPs家族成员之一,多项国内外研究显示了TMPRSS4在多种恶性肿瘤中高表达,比如胃癌、胰腺癌、肝癌和结肠癌等,且与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。近期研究也表明TMPRSS4能够促进肿瘤细胞基底膜(Basement membrane,BM)和细胞外基质(Cell-extracellular matrix,ECM)的降解及组织的重建,通过诱导E-cadherin蛋白表达降低导致上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的发生来促进肿瘤的侵袭和转移。然而,TMPRSS4在乳腺癌中的表达及与临床生物学行为特征关系的相关性研究极少。本研究通过观察乳腺癌组织及正常乳腺组织中TMPRSS4蛋白的表达,探讨其与乳腺癌临床病理学特征及预后的关系;通过体外实验,检测乳腺癌细胞系中TMPRSS4 mRNA和蛋白水平的表达,观察TMPRSS4表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的调控,并初步探究其潜在的作用机制。本课题主要包括以下两个部分:
  第一部分 TMPRSS4在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的相关性研究
  目的:通过检测Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)蛋白在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达情况,探讨其与乳腺癌临床病理学特征及预后的关系。
  方法:采用免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)方法检测107例乳腺癌石蜡包埋组织及52例正常乳腺组织中TMPRSS4蛋白的表达,分析TMPRSS4表达与乳腺癌临床病理特征及患者总生存期(Overall survival,OS)及无病生存期(Disease free survival,DFS)的关系,探讨TMPRSS4对乳腺癌患者预后的影响。
  结果:(1)107例乳腺癌标本中TMPRSS4高表达者70例(70/107),表达率为65.4%,而在正常乳腺组织中TMPRSS4表达率为17.6%(9/52),两者比较有显著的统计学差异(P<0.05),且TMPRSS4的表达强度随着乳腺浸润性导管癌组织学分级的升高而升高。(2) TMPRSS4的高表达与肿瘤大小(P=0.044)、浸润性导管癌组织学分级(P=0.006)、淋巴结转移(P=0.002)、临床分期(P=0.015)有关,而与年龄、月经状态、乳腺癌组织学类型及ER、PR、HER-2的表达情况均无明显相关,差异无统计学意义(均P>0.05)。(3) KaPlan-Meier生存分析并经Log-rank检验,结果显示TMPRSS4蛋白高表达组生存率低于低表达组,差异具有显著统计学意义(OS,P=0.036; DFS,P=0.010)。(4)单因素分析显示肿瘤大小(OS,P=0.042; DFS,P=0.047)、淋巴结转移(OS,P=0.000; DFS,P=0.001)、浸润性导管癌组织学分级(OS,P=0.036; DFS,P=0.039)、临床分期(OS,P=0.009;DFS,P=0.012)和TMPRSS4的表达(OS,P=0.015; DFS,P=0.018)均与预后相关。多因素分析显示TMPRSS4的表达(OS,P=0.016; DFS,P=0.019)及淋巴转移(OS,P=0.001;DFS,P=0.002)和临床分期(OS,P=0.015;DFS,P=0.018)是影响乳腺癌预后的独立因素。
  结论:(1) TMPRSS4在乳腺癌组织中高表达。(2) TMPRSS4高表达与乳腺癌的肿瘤大小、浸润性导管癌组织学分级、淋巴结转移和临床分期密切相关,可能促进乳腺癌的发展。(3) TMPRSS4高表达的肿瘤患者生存时间更短,预后更差。TMPRSS4高表达是评估乳腺癌患者预后的独立风险因素。(4)总之,TMPRSS4可能成为治疗乳腺癌的新的治疗靶点。
  第二部分 TMPRSS4在乳腺癌细胞侵袭和转移中的调控作用及与上皮-间质转化的关系
  目的:通过检测乳腺癌细胞中TMPRSS4表达情况,分析其在乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭过程中的作用及其与上皮-间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)的关系,并探讨TMPRSS4表达在乳腺癌发生发展过程中的作用与意义。
  方法:(1)采用实时荧光定量PCR(Real time quantitive polymerase chainreaction,RT-qPCR)和Western blot法检测本课题组已有的5种乳腺癌细胞系(MCF-7、MCF-7/ADM、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468)中TMPRSS4mRNA和蛋白水平的表达情况。
  (2)提取pCMV-myc-TMPRSS4过表达质粒,将其转染至乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231,采用RT-qPCR方法检测转染效率,并通过MTS和EdU细胞增殖实验、Transwell和Matrigel细胞迁移和侵袭实验,研究TMPRSS4过表达调控乳腺癌增殖、迁移和侵袭的作用。
  (3)将TMPRSS4的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)瞬时转染至乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231,通过RT-qPCR评估其干扰效率,采用MTS和EdU细胞增殖实验、Transwell和Matrigel细胞迁移和侵袭实验,研究TMPRSS4表达抑制调控乳腺癌增殖、迁移和侵袭的作用。
  (4)采用RT-qPCR和Western blot法检测过表达和抑制TMPRSS4后细胞EMT相关基因E-cadherin、Vimentin、Claudin-1、Slug、ZEB1的表达变化。
  结果:(1) RT-qPCR和Western blot显示,TMPRSS4 mRNA和蛋白在5种乳腺癌细胞系中均有表达,以MDA-MB-468细胞系表达最高,MDA-MB-231细胞系表达次之。过表达质粒测序符合实验要求,检测过表达和干扰效率均符合实验要求。(2)MTS和EdU实验显示TMPRSS4过表达组乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖率明显增加(均P<0.05);反之,沉默TMPRSS4的表达乳腺癌细胞的增殖率显著下降(均P<0.05)。(3)Transwell小室和Matrigel实验显示,TMPRSS4过表达组中两种乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高;反之,降低TMPRSS4表达水平乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著下降(均P<0.05)。(4)过表达TMPRSS4后,EMT相关基因包括上皮性标记E-cadherin和Claudin-1的表达均显著下降,而间质标记Vimentin和Slug的表达均明显提高(P<0.05)。转染TMPRSS4 siRNA后,乳腺癌细胞E-cadherin和Claudin-1的表达均显著升高,而Vimentin和Slug的表达均明显降低(P<0.05)。
  结论:(1) TMPRSS4在乳腺癌MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞系中高表达。(2) TMPRSS4过表达能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而干扰TMPRSS4表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)上调或下调TMPRSS4的表达,能够调控乳腺癌细胞EMT相关基因的表达,TMPRSS4可能参与了乳腺癌EMT的发生过程。
[硕士论文] 娄嘉明
内科学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  恶性肿瘤是一种难治性疾病,严重威胁到人类的健康最。放射治疗是目前临床上治疗恶性肿瘤最常用的手段之一。然而,由于影像学在肿瘤类疾病的诊断及定位上的局限性,临床治疗时常出现放射治疗的剂量未达肿瘤组织的致死剂量、定位不够精确而对周围正常组织造成放疗损伤,从而引起放疗副反应;同时由于各类肿瘤组织自身存在着不同程度的放疗抗性,降低了肿瘤细胞对放射治疗的敏感性,从而进一步削弱了放疗的临床治疗效果。为了克服在肿瘤类疾病的诊疗过程中所出现的影像学诊断误差及病灶组织的放疗抵抗,本课题旨在利用水热聚醇法构建一种多功能的新型纳米颗粒—透明质酸功能化三氧化二铋纳米颗粒(HA-Bi2O3 NPs),用于肿瘤类疾病的靶向性CT造影成像引导下的放疗增敏。
  方法:
  利用透明质酸钠、六水氯化铋(BiCl3·6H2O)为前驱物通过水热聚醇法制备HA-Bi2O3 NPs;通过透射电子显微镜/高分辨透射电子显微镜(TEM/HR-TEM)、傅氏转换红外线光谱分析仪(FT-IR)、NanoDLS高敏度粒径分析仪、X射线光电子能谱学分析仪(XPS)和X射线衍射仪(XRD)揭示HA-Bi2O3的理化特性;通过流式细胞术、半定量PCR和细胞成像来研究HA介导的HA-Bi2O3 NPs细胞吞噬行为;利用细胞增值率检测、溶血实验、病理切片和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)来分析HA-Bi2O3 NPs的生物相容性;利用ICR小鼠皮下肿瘤模型CT平扫检测HA-Bi2O3 NPs的肿瘤靶向性CT成像;利用细胞增值率检测、克隆形成实验、活-死细胞染色、流式细胞术(凋亡与周期)、ICR小鼠皮下肿瘤模型体内实验检测HA-Bi2O3 NPs的放疗增敏作用。
  结果:
  1. HA-Bi2O3 NPs的制备及表征
  利用水热聚醇法成功制备HA-Bi2O3 NPs,NanoDLS高敏度粒径分析仪显示HA-Bi2O3 NPs粒径分布均匀,大小约为45nm,在PBS缓冲液中保存8天后HA-Bi2O3 NPs粒径大小无明显变化;TEM/HR-TEM提示HA-Bi2O3 NPs的水溶性、分散性好,粒径大小均一,晶格条纹明显,晶面间距为3.3±0.2?;XRD显示HA-Bi2O3 NPs的物相结构符合Bi2O3的特征,为多相异质结构。FT-IR提示HA-Bi2O3 NPs,表面具有羧基、羟基、羰基等亲水基团;XPS提示HA-Bi2O3 NPs主要是由铋、氧、碳等元素组成。
  2.透明质酸(HA)介导的HA-Bi2O3 NPs的细胞吞噬行为
  通过定量PCR提示CD44抗原的表达在人肝癌细胞株SMMC-7721中比在人乳腺癌细胞株MCF7细胞高,与相关文献的报道相一致;利用流式细胞术揭示HA-Bi2O3 NPs可被SMMC-7721细胞和MCF7细胞吞噬,但在CD44抗原高表达的SMMC-7721细胞中,HA-Bi2O3 NPs的吞噬效率较CD44抗原低表达的MCF7细胞高。
  3. HA-Bi2O3 NPs的生物相容性的表征
  检测细胞的增殖抑制率显示,不同浓度的HA-Bi2O3 NPs(0-400μg/mL)对SMMC-7721、VSMCs和MCF7的细胞活性均无明显影响(p>0.05);溶血实验提示,不同浓度的HA-Bi2O3 NPs(0-400μg/ml)均不引起明显的溶血反应;ICP-MS显示,ICR小鼠经尾静脉注射HA-Bi2O3 NPs后,心、肝、脾、肺、肾对HA-Bi2O3 NPs均有摄取,其中以肝脏(摄取量:27.80?g/g)和肾脏(摄取量:7.40?g/g)对HA-Bi2O3 NPs的摄取为主;组织切片提示HA-Bi2O3 NPs对小鼠重要脏器无明显毒性,未引起明显的病理变化。
  4. HA-Bi2O3 NPs在肿瘤CT靶向性成像的研究
  体外CT成像结果提示相较于已用于临床的CT造影剂碘海醇,HA-Bi2O3 NPs具有更加优秀的CT造影成像效果。皮下荷瘤小鼠经尾静脉注射HA-Bi2O3 NPs,10min后小鼠各脏器及皮下肿瘤的CT造影信号均有所增强,其中肾脏、膀胱及皮下肿瘤处的信号增强尤为明显;30min后,肾脏的信号强度开始下降而膀胱及皮下肿瘤的信号增强仍十分明显。
  5. HA-Bi2O3 NPs的放疗增敏效果的实验研究
  单纯 HA-Bi2O3 NPs对 SMMC-7721细胞的增殖率的无显著影响,而当HA-Bi2O3 NPs联合放射治疗时,则明显抑制了SMMC-7721细胞的增殖。随着提高HA-Bi2O3 NPs的浓度或加大放射治疗的强度,SMMC-7721细胞增殖率所受到的抑制越发明显,与剂量呈正相关性,尤其是在400μg/mL浓度的HA-Bi2O3 NPs联合9Gy的放疗剂量时,SMMC-7721细胞的增值率显著降低至23.5%(p<0.05);克隆形成实验提示,单纯HA-Bi2O3 NPs组与对照组的细胞增值率无明显差异,单纯放疗组在6Gy的放疗剂量下,细胞增值率为46.7%,而实验组在6Gy的放疗剂量及200μg/mL浓度的HA-Bi2O3 NPs下,细胞增值率显著降低至29.8%;活-死细胞染色实验中,相较于对照组、单纯HA-Bi2O3 NPs组和单纯放疗组, HA-Bi2O3 NPs联合放疗组中可被FDA染色(绿色)的存活细胞明显减少,并与HA-Bi2O3 NPs浓度成负相关,可被PI染色(红色)的凋亡细胞明显增多,并与HA-Bi2O3 NPs浓度成正相关;如流式细胞术(凋亡)所示,对照度及单纯HA-Bi2O3 NPs组中的早期凋亡率及晚期凋亡率无明显差异,单纯放疗组中,早期凋亡率升高至30.4%,晚期凋亡率升至5.89%,而实验组在6Gy的放疗剂量联合200μg/mL浓度的HA-Bi2O3 NPs下,早期和晚期凋亡率均明显升高,分别达到41.2%和14.1%;流式细胞术(周期)提示,相比于对照组与单纯HA-Bi2O3 NPs组,单纯放疗组(6Gy)引起G2/M期阻滞(19.87%),Sub-G1期峰值升高至2.34%,实验组在6Gy的放疗剂量下,随着HA-Bi2O3 NPs浓度的升高,G2/M期阻滞越发明显、Sub-G1期峰值逐渐升高,特别是HA-Bi2O3 NPs的浓度为200μg/mL时,G2/M期升高为33.00%,Sub-G1期峰值为21.59%;ICR小鼠体内实验提示,对照组和单纯HA-Bi2O3 NPs组荷瘤小鼠的皮下肿瘤体积在10d时增长至270%,生存曲线提示对照组和单纯HA-Bi2O3 NPs组小鼠的存活时间中位数分别为为17d和20d;单纯放疗组的肿瘤体积增长受到抑制,在10d时缩小了约14.6%,存活时间中位数为24d;HA-Bi2O3 NPs联合放射治疗则明显抑制了肿瘤生长,第10d时肿瘤体积缩小了33.9%,存活时间中位数为35d。
  结论:
  1.本研究以六水氯化铋作为铋源材料,利用透明质酸进行修饰,通过水热聚醇法成功构建了HA-Bi2O3 NPs。
  2. HA-Bi2O3 NPs的水溶性、分散性和稳定性良好,粒径大小均一;物相结构为多层异质性,晶格条纹明显,晶格间距为3.3±0.2?,符合Bi2O3的特征;HA-Bi2O3 NPs主要是由铋、氧、碳等元素组成,颗粒表面官能团主要为羧基、甲基、羰基等;生物相容性良好。
  3. HA-Bi2O3 NPs相较于已用于临床的CT造影剂碘海醇,具有更加优秀的CT造影成像效果,同时,纳米材料具有EPR效应和体内滞留时间长等特性,使得HA-Bi2O3 NPs可以用于肿瘤靶向性影像诊断。
  4. HA-Bi2O3 NPs可以增强放射射线对肿瘤的抑制和杀伤作用,具有成为临床放疗增敏剂的潜力。
[硕士论文] 杨非
控制工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:癌症的发病率、死亡率长期位居各种疾病之首,全球每年有超过1000万人死于癌症,癌症患者的5年生存率仅有15%~30%。为提高癌症病人的存活率,大量的研究人员开始对影响癌症生存时间的因素展开研究分析,通过收集癌症病人生存时间并采用统计建模方法挖掘潜在的生存规律。
  本论文在考虑传统的临床数据、基因表达数据基础上,通过融入DNA甲基化数据,采用COX回归方法探讨了11种癌症病人中影响其生存时间的关键因素,并对多种癌症的共性特征进行了深入分析。
  本文的主要研究内容如下:
  (1)针对目前癌症生存分析主要基于临床数据以及基因表达数据进行分析的特点,本文提出了融入DNA甲基化特征进行生存数据分析的策略。本工作基于惩罚函数的Lasso变量选择方法进行特征选择并进行在COX模型下的回归分析,对比了单因素作用下,以及是否融合DNA甲基化特征下的生存率回归准确性。结果表明,对分析的11种癌症,融入DNA甲基化特征后具有更高的回归准确率。
  (2)由于Lasso算法在处理高维小样本类型回归分析存在着所选特征不稳定且较少的不足,本文引入了基于K-split的Lasso回归分析方法。通过对高维特征的多次分割采样进行独立的特征选择,再在组合特征的基础上完成最终的核心特征选择。结果表明,基于K-split的Lasso回归方法能够获得更稳定的特征以及更高的预测准确度。
  (3)通过对11种癌症的独立分析,分别得到了影响不同癌症生存时间的重要特征;通过对11种癌症的组合分析,得到了对多种癌症的生存时间都有重要影响的特征。本研究为医学人员进一步认识与理解癌症的预后提供了重要依据,也为进一步的实验验证提供了潜在目标。
[硕士论文] 吴芳华
肿瘤学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨比较转移淋巴结数目(pN)、淋巴结转移率(rN)和阳性淋巴结对数比(LODDS)分期系统对评估进展期胃癌(AGC)患者的预后准确性,为合理的胃癌分期、预后评价及指导术后辅助治疗提供依据。
  方法:回顾性分析2010年1月至2014年6月于福建中医药大学附属人民医院行胃癌根治术并具有完整随访资料的175例AGC患者的临床病理资料。
  (1)采用Kaplan-Meier方法计算AGC患者术后生存率,绘制生存曲线;组间生存率的比较采用Log-rank检验;将单因素分析具有统计学意义的因素纳入Cox比例风险回归模型确定影响AGC患者术后预后的独立因素。
  (2)通过Log-rank检验分层分析相同pN分期与rN、LODDS分期各亚组患者间3年生存率(3-YSR)的差异。
  (3)采用似然比x2检验比较不同淋巴结分期系统的同质性,线性趋势x2检验比较不同淋巴结分期系统的判别力、分期和预后间的梯度单一性,采用Cox比例风险模型计算不同淋巴结分期系统对应的-2对数似然值(-2Log likelihood)的大小,进一步计算各淋巴结分期系统的AIC值,对预后评估的准确性进行比较。
  (4)通过绘制受试者工作特性曲线(ROC)和计算曲线下面积(AUC)比较不同淋巴结分期系统的预后评价能力。
  (5)所有统计学分析采用SPSS20.0和MedCalc15.2.2统计软件进行,P<0.05时具有统计学意义。
  结果:
  (1)全组AGC患者3年总体生存率为52.9%;其中,pN0、pN1、pN2和pN3的3-YSR分别为76.6%、70.4%、47.1%和29.2%,rN0、rN1、rN2和rN3的3-YSR分别为79.2%、64.0%、20.8%和0,LODDS1、LODDS2、LODDS3、LODDS4和LODDS5的3-YSR分别为92.3%、74.3%、60.1%、41.7%和7.8%。
  (2) Log-rank检验单因素分析结果显示,肿瘤大小、Borrmann分型、组织学类型、脉管癌栓、浸润程度、TNM分期、pN分期、rN分期和LODDS分期与AGC的预后有关(均P<0.05);进一步多因素Cox比例风险回归分析显示,病理类型(HR=1.998,P=0.025)、rN分期(HR=1.876,P=0.007)和LODDS分期(HR=1.694,P<0.001)是影响AGC患者预后的独立危险因素。
  (3)分层分析显示rN和LODDS分期系统在区别相同pN分期患者的预后风险方面具有更好的辨别力,然而,LODDS分期系统还可有效区分无淋巴结转移患者(pN0)的预后,而rN分期系统不能;相比之下,pN分期系统则不能进一步区分具有相同rN和LODDS分期AGC患者的预后差异。
  (4) rN分期系统的线性趋势x2检验值与似然比x2检验值(46.513与62.380)均高于pN(27.950与31.612)和LODDS分期系统(42.367与59.900),而AIC值(688.692)低于pN(719.460)和LODDS分期系统(693.172)。
  (5)以AGC患者术后3年死亡与否为金标准,pN分期系统的ROC曲线下面积(AUC)为0.726(95%CI:0.653~0.790),rN分期系统的AUC为0.774(95%CI:0.705~0.834),LODDS分期系统的AUC为0.781(95%CI:0.712~0.840),pN与rN分期系统的AUC比较具有统计学差异(P=0.033),而pN与LODDS分期系统、rN与LODDS分期系统之间的AUC差异比较均无统计学意义(P>0.05)。
  结论: rN和LODDS分期为AGC患者的独立预后危险因素,在对评价AGC患者预后准确性方面,rN分期系统较LODDS和pN分期系统更具优越性;临床工作中,可将rN分期系统作为独立指标纳入以综合评价AGC患者的预后。
[硕士论文] 陈新田
肿瘤学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:通过建立小鼠炎症性肠病乳腺癌肺转移模型,观察炎症性肠病是否可加速乳腺癌的肺部转移过程,探索其可能机制,以期为临床上防治乳腺癌合并炎症性肠病患者发生肿瘤远处转移提供新的干预策略。
  方法:1、依据实验室前期实验动物造模方法,以 Balb/c雌鼠为实验对象,建立2.5%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)模型,并在此模型基础上通过尾静脉接种小鼠乳腺癌细胞4T1100ul(1×106/ml)建立 IBD乳腺癌肺转移动物模型,动物实验结果重复2次,每次实验动物中每组动物至少10只(每组分别选取5只动物进行统计学分析)。2、通过结肠组织病理切片评价 IBD乳腺癌肺转移模型中的结肠炎症情况,通过肺组织病理切片观察 IBD乳腺癌肺转移模型中的肺转移情况。3、应用流式细胞术、血细胞计数仪检测小鼠外周血中中性粒细胞情况,应用免疫组织化学染色方法检测小鼠肺组织中中性粒细胞浸润情况。4、应用脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase-I)破坏中性粒细胞胞外捕获网结构(neutrophil extracellular trap,NET),肺组织病理切片观察小鼠肺转移情况。5、统计学方法:应用 SAS9.1统计软件包对数据进行统计分析,所有计量资料用(均数±标准差)来表示。两组样本之间差异的显著性分析采用 t检验,多组样本间差异的显著性分析采用 One-way ANOVA单因素方差分析,多组之间两两比较(事后检验)采用Bonferroni法。在炎性细胞浸润和组织破坏程度评估分析中,两组样本(多值有序变量的成组设计资料)之间采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05视为有统计学意义。
  结果:1、2.5%DSS可诱导 Balb/c雌鼠明显的结肠炎症反应,实验过程中观察可见经 DSS诱导的实验小鼠发生明显腹泻、血便,解剖见结肠组织明显充血,长度明显缩短(P<0.01),病理切片观察结肠组织可见大量的炎性细胞浸润及组织损伤。2、在DSS诱导的IBD乳腺癌肺转移模型中,肺组织病理切片可见经DSS诱导的小鼠,与正常饮水组相比,其乳腺癌肺转移明显增加(P<0.01)。3、血细胞计数、流式细胞术结果显示,DSS可诱导小鼠外周血中中性粒细胞的动员,其数量及比例均增加(P<0.05),免疫组织化学染色结果显示,转移部位肺组织中浸润的中性粒细胞也明显增加(P<0.01)。4、应用 DNase-I破坏中性粒细胞 NET结构,可逆转DSS诱导的IBD促进乳腺癌肺转移增加(P<0.05)。
  结论: DSS诱导的小鼠 IBD乳腺癌肺转移模型可见明显的乳腺癌肺转移,其机制可能为 DSS诱导小鼠外周血中中性粒细胞动员并浸润至肺组织,动员的中性粒细胞可通过形成NET结构促进乳腺癌肺转移,应用脱氧核糖核酸酶(DNase-I)破坏中性粒细胞NET结构,可逆转DSS诱导的小鼠乳腺癌肺转移增加。
[博士论文] 张小梅
生物医学工程 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:肿瘤转移引起的器官衰竭是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段和多基因参与的复杂过程。除了生化因素,肿瘤细胞本身的力学特性和力学微环境(如基质力学、流体剪切力等)也是影响肿瘤转移的重要方面。肿瘤细胞“失巢”后的悬浮力学状态是转移过程中真实存在的一种生物力学因素。已有研究表明悬浮力学状态可以通过调控细胞骨架结构和基因表达参与乳腺肿瘤细胞的再贴壁和抗凋亡过程。但是,目前关于悬浮力学状态对肿瘤转移影响的研究还不够全面,相关力学生物学机制也不甚清楚。因此,本研究拟从生物力学的角度出发,系统性地探索乳腺肿瘤细胞散播过程中悬浮状态对转移的影响并探索其可能的力学生物学机制,主要研究内容和结果如下:
  ①悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞再粘附的影响及其力学生物学机制
  以贴壁培养为对照,利用不黏附基底悬浮培养乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231和SK-BR-3。检测悬浮状态对乳腺肿瘤细胞粘附和再贴壁的影响,并探索其力学生物学机制。结果表明,悬浮状态改变肌动蛋白骨架的聚合和细胞收缩状态;快速且可逆地提高核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)的蛋白水平,促进再贴壁乳腺肿瘤细胞的粘附和铺展及其应力纤维丝和粘着斑的形成,降低细胞的运动性,同时提高细胞核的圆度和细胞刚度。裸鼠恶性胸腔积液中悬浮肿瘤细胞体外再贴壁实验证明体内悬浮状态也能促进肿瘤细胞的再贴壁。悬浮状态引起的Lamin A/C上调与细胞骨架扰乱有关。同时,悬浮状态也通过上调整合素β1(Integrinβ1)的表达促进乳腺肿瘤细胞的粘附能力。
  ②悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞存活、迁移、侵袭和体内转移的影响
  为了探究悬浮状态对乳腺肿瘤细胞转移能力的影响,首先在细胞水平上,检测悬浮状态下乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231和SK-BR-3的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力;检测乳腺肿瘤细胞再贴壁后的增殖和克隆能力,以及饥饿应激条件下细胞的生存能力。然后在动物水平上,考察悬浮状态对乳腺肿瘤细胞成瘤能力和转移能力的影响。细胞实验证明,悬浮状态下乳腺肿瘤细胞增殖活性低,并出现一定程度的凋亡,悬浮状态尽管会影响乳腺肿瘤细胞体外的克隆形成能力以及引起再贴壁后增殖滞后,但提高了乳腺肿瘤细胞在低营养应激条件下的存活,以及提高迁移和侵袭能力。动物实验证明,悬浮状态提高肿瘤细胞的休眠,抑制肿瘤的生长速度,但显著地促进了肺转移的形成。
  ③悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞基因表达的调控
  为了考察悬浮状态下肿瘤细胞基因表达谱的改变并深入探讨悬浮促进肿瘤转移的机制,提取悬浮培养或正常贴壁培养的MDA-MB-231细胞的总RNA,利用Illumina HiSeq2000测序平台进行高通量转录组测序并进行信息学分析,再用定量PCR和免疫印迹技术对肿瘤转移相关基因进行表达验证。与贴壁培养细胞相比,悬浮状态上调254个基因,下调190个基因(|log2 Fold change|>2, FDR<0.05);差异基因主要富集于免疫响应调节、细胞周期、细胞粘附、细胞外基质成分、细胞迁移、凋亡调节等生物过程。验证实验表明悬浮状态时间依赖性地上调促转移相关基因的表达,包括PTGS2、FN、LOX1、ABCC3、ICAM-1、MUC1、SELPLG、TGFBR2、TGFB1;再贴壁后这些基因表达逐渐降低并恢复至贴壁培养细胞水平。
  ④悬浮力学状态诱导环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)上调的力学生物学机制及其在乳腺肿瘤细胞转移过程的作用
  为了考察悬浮力学状态诱导COX-2上调的力学生物学机制及其在乳腺肿瘤细胞转移过程的作用,首先探讨了钙离子(calcium ion,Ca2+)/钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)/COX-2信号通路在悬浮状态引起的肿瘤细胞特性改变中的作用;利用骨架抑制剂处理悬浮和贴壁肿瘤细胞以及不同刚度聚丙烯酰胺凝胶基底培养肿瘤细胞,考察骨架应力状态对NFAT2核内转移和COX-2上调的作用。然后在动物水平上,考察敲低COX-2的表达对悬浮乳腺肿瘤细胞肺转移能力的影响。细胞水平的研究表明,悬浮状态提高乳腺肿瘤细胞内Ca2+含量,提高NFAT2核内转移促进COX-2的表达,促进肿瘤细胞的存活,迁移和侵袭能力。低基质刚度以及细胞松弛素D处理都有利于COX-2的表达,但细胞收缩抑制剂Y27632对COX-2表达无影响。动物实验表明,悬浮状态诱导COX-2通过提高肿瘤细胞在肺的截留和存活从而促进肿瘤转移。
  本文系统性地研究了悬浮力学状态对乳腺肿瘤细胞转移能力的调控,证明了悬浮力学状态在转录水平和转录后水平可逆地调节相关基因的表达,通过提高乳腺肿瘤细胞的再粘附、迁移、侵袭和存活能力而促进乳腺肿瘤的转移,并初步证实了悬浮引起的细胞骨架改变在其中的力学生物学作用。本文研究结果有助于深入认识悬浮力学状态在乳腺肿瘤细胞转移过程中的重要地位,为靶向Lamin A/C和COX-2的抗转移治疗策略提供理论支持。
[硕士论文] 侯添
生物医学工程 太原理工大学 2017(学位年度)
摘要:细胞外基质是一个复杂的大分子网络,具有独特的物理特性、生物化学特性和力学特性,这些性质能够直接或间接地影响细胞的生物学行为,成为正常组织发育必不可少的因素。当细胞外基质的代谢发生异常时,细胞外基质的组织结构和力学特性发生改变,同时伴随一些疾病的发生。例如组织的纤维化、癌细胞的增殖、迁移、上皮间质转换等。由此可见细胞所处的微环境刚度在癌症的产生、迁移和恶化过程中起重要作用,研究癌细胞如何感知周围组织刚度以及对硬度的响应规律,能够为应对癌症的产生机制提供有价值的参考,并协助改进治疗方案。
  本文主要研究不同刚度的基底对于细胞生物力学特性的影响。采用具有良好生物兼容性的水溶性聚合物——聚丙烯酰胺水凝胶,作为模拟细胞外环境的培养基底。通过调节丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例,制备不同刚度的弹性基底。把处于对数生长期的宫颈癌细胞接种到1KPa、10KPa、150KPa的聚丙烯酰胺水凝胶基底上,进行24-48小时的培养,对培养后的宫颈癌细胞进行以下实验,观测基底硬度对细胞生物力学行为特性的影响:
  (1)测量细胞骨架中分子马达蛋白——肌球蛋白Ⅱ的分布与运动速率。将宫颈癌细胞稳定转染荧光肌球蛋白Ⅱ,利用激光共聚焦显微镜测定三种刚度基底上生长的宫颈癌细胞荧光肌球蛋白Ⅱ沿细胞长轴的荧光分布;运用荧光漂白恢复技术,测定荧光肌球蛋白Ⅱ在细胞末端的恢复速率。
  (2)测量肌动蛋白纤维在整个细胞内的分布情况。使用Phalloidin-Tetramethylrhodamine B Isothiocyanate对宫颈癌细胞肌动蛋白纤维进行荧光染色,测定三种刚度上培养的宫颈癌细胞肌动蛋白纤维的分布。
  (3)采用微管吸吮技术,结合半无限体模型,测定单个宫颈癌细胞在铺展状态下的细胞弹性模量。
  结果显示,不同硬度基底上生长的宫颈癌细胞呈现出肌球蛋白Ⅱ和肌动蛋白纤维的分布差异。在软基底上生长的宫颈癌细胞,细胞边缘肌球蛋白Ⅱ和肌动蛋白纤维分布较少,肌球蛋白Ⅱ的运动速率较慢,细胞弹性模量降低;在较硬基底上生长的宫颈癌细胞,肌球蛋白Ⅱ和肌动蛋白蛋白纤维呈现出明显的细胞边缘聚集状态,细胞弹性模量也明显高于在较软两组基底上生长的细胞。实验表明,基底硬度会明显改变肌球蛋白Ⅱ、肌动蛋白等重要的细胞骨架蛋白区域性作用的效果,对细胞的弹性模量造成影响。影响癌细胞在不同微环境下的细胞状态。
[硕士论文] 宋应
控制科学与工程 电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:DNA甲基化是最重要的表观遗传机制之一,在基因表达调控、胚胎发育、X染色体失活、基因印记以及维持染色质结构等生物学过程中发挥着重要的作用,并且与许多疾病的致病过程相关。近年来的大量研究表明,差异甲基化位点与许多疾病有直接关系,特别是癌症。因此,识别差异甲基化位点是解剖疾病病因中最关键和最根本的问题之一。本文对多种癌症进行分析,找到每种癌症对应的差异甲基化位点,为癌症早期诊断提供依据,为此本文做了如下工作:
  1)针对现有统计假设检验方法只是选出在统计上有显著差异的位点,选出来的位点并不都具有类别区分特性,本文引入了基于机器学习的特征选择方法(Elastic Net正则化)。该方法有效解决了假设检验方法不能同时发现多个位点对癌症的组合作用。
  2)针对在优化差异甲基化识别算法过程中发现选择出的差异甲基化位点不稳定问题,本文提出了基于Elastic Net正则化的集成特征选择算法。本文选择了13种癌症数据来分析算法特征选择稳固性,结果发现在两种特征选择算法模型分类性能接近的情况下本文算法在特征选择稳固性评价指标(杰卡德指数)上优于Elastic Net正则化特征选择算法。
  3)在与现有统计假设检验方法的对比中,本文采用在独立测试集上测试本文算法选择出的差异甲基化位点与FastDMA、RnBeads两种假设检验方法得到的差异甲基化位点的类别区分性能。结果发现,本文算法在独立测试集上正确率高于 FastDMA与 RnBeads,由此可知本文算法选出的差异甲基化位点的类别区分性能优于两种假设检验方法。
  4)针对本文选出的差异甲基化位点是否有实际的生物意义,本文采用了对多种癌症做癌症共性分析。本文将癌症共有差异甲基化位点对应到基因上,得到38个共有差异基因,查阅文献发现有23个共有差异基因跟癌症有密切关系。本文进行 pathway分析时,发现共有代谢通路有11个,其中9个和癌症有直接关系。这说明本文找到的差异甲基化位点能为生物学家提供有效参考。
[硕士论文] 郑敏
肿瘤学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:本研究通过检测结直肠癌细胞系HCT116和HT29的miR-192的表达差异,观察高表达miR-192和封闭miR-192的功能对结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移、克隆形成和成球能力的影响;并初步探索 miR-192的生物靶标及其调控机制,进一步研究其靶基因在结直肠癌中的表达及其与结直肠癌临床特征的关系。
  方法:
  1.采用荧光实时定量PCR检测结肠癌组织、癌旁正常组织以及结直肠癌细胞系HCT116和HT29中miR-192及CXCL2mRNA表达水平。
  2.CCK-8和克隆形成实验检测细胞生长,观察miR-192对结直肠癌细胞增殖的影响。
  3.结直肠癌细胞穿孔实验观察miR-192对癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。
  4.结直肠癌细胞划痕实验观察miR-192对癌细胞的迁移能力的影响。
  5.成球实验观察miR-192对结直肠癌干细胞自我更新能力的影响。
  6.miRDB和TargetScan预测miR-192的候选靶基因。然后将CXCL2的3’-UTR区的野生型和突变型基因插入到双荧光素酶报告基因载体中构建报告基因质粒。HCT116细胞高表达miR-192后,将报告基因质粒转染到HCT116细胞中,用双荧光素酶报告实验和Western blot实验证实miR-192的靶基因。
  7.Western blot方法检测CXCL2在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达;ELISA方法检测CXCL2在结直肠癌、健康对照和非肿瘤患者对照血清中的表达,分析CXCL2的表达与结直肠癌临床特征的关系,同时采用电化学发光法测定血清中的CEA和CA19-9的表达。
  结果:
  1.结直肠癌组织中miR-192的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.01),CXCL2 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);且miR-192的表达与CXCL2 mRNA表达水平呈负相关。结直肠癌细胞HCT116中的miR-192表达水平明显低于HT29(P<0.01)。
  2.CCK-8法检测细胞生长实验结果显示,miR-192高表达组的HCT116细胞在450nm的吸光度值明显低于阴性对照组细胞(P<0.05);高表达zip-miR-192的HT29细胞在450nm的吸光度值明显高于阴性对照组细胞(P<0.05)。克隆形成实验结果显示miR-192高表达组的HCT116细胞克隆数明显低于对照组细胞(P<0.05),高表达zip-miR-192的HT29细胞克隆数明显高于对照组细胞(P<0.05)。
  3.细胞穿孔实验结果显示,高表达miR-192的HCT116细胞中发生侵袭和迁移的细胞数较对照细胞均明显减少,侵袭率明显下降(P<0.05);高表达zip-miR-192的HT29细胞中发生侵袭和迁移的细胞数较对照细胞均明显增多,侵袭率明显升高(P<0.05)。
  4.划痕实验结果显示,与对照质粒组比较,miR-192高表达组的HCT116细胞迁移能力明显降低,划痕愈合较慢;zip-miR-192高表达组的HT29细胞迁移能力明显提高,划痕愈合较快。
  5.成球实验结果显示,高表达miR-192的HCT116细胞中成球比例较对照细胞明显下降(P<0.05);高表达zip-miR-192的 HT29细胞中成球比例较对照细胞明显上升(P<0.05)。
  6.双荧光素酶报告实验和Western blot结果提示,CXCL2是miR-192的作用靶基因。
  7.Western blot结果显示,结直肠癌中的CXCL2蛋白表达明显高于癌旁正常组织;ELISA结果显示,结直肠癌患者血清中的CXCL2蛋白浓度明显高于健康对照组和非肿瘤患者对照组(P<0.01)。CXCL2蛋白表达水平与肿瘤TNM分期(P<0.01)及侵润深度(P<0.05)均呈正相关,与肿瘤分化程度、肿瘤栓塞、淋巴结转移、病理类型和性别无关。CXCL2检测结直肠癌的敏感度和特异度分别为56.1%(69/123)和95.31%(203/213)。将CXCL2、CEA和CA19-9阳性样本叠加后,诊断Ⅰ期结直肠癌的敏感度为22.2%(4/18),诊断Ⅱ期结直肠癌的敏感度为66.7%(26/39)。CXCL2的ROC曲线下面积(0.834)高于CEA(0.739)和CA19-9(0.676)。
  结论:
  1.结直肠癌组织中miR-192异常低表达,CXCL2高表达,二者呈负相关;侵袭能力较强的结直肠癌细胞HCT116中的miR-192表达明显低于侵袭能力较弱的结直肠癌细胞HT29;HCT116细胞中的CXCL2表达明显高于HT29细胞。
  2.miR-192通过作用于CXCL2的3’-UTR区负向调控其表达。
  3.miR-192表达上调可以有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成和成球能力。抑制miR-192的功能可以增强结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、克隆形成和成球能力。
  4.结直肠癌组织的CXCL2表达异常增高,表明其可能参与肿瘤的发生及发展过程;结直肠癌血清中的CXCL2蛋白浓度升高,显示CXCL2可能是一个有效的结直肠癌检测标志物。
[博士论文] 赵薇
病理学与病理生理学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  胃癌是世界五大常见肿瘤之一,其致死率位列第三[1-3]。在东亚地区,胃癌是发病率最高的癌症之一,每年约有70%的胃癌新发病例和死亡发生在东亚、东欧和南美,而中国就占到所有人数的42%[4-6]。中国是胃癌高发国家,胃癌在中国男性人群中的发病率仅次于肺癌,位列第二,在中国女性人群中居第四位[2]。近年来,随着人们卫生条件的提高和饮食习惯的改善,胃癌的发病率有下降的趋势,但是由于胃癌具有高转移和高复发率等特点,导致其生存预后情况差异很大,晚期胃癌的5年生存率仍低于20%。针对胃癌的传统治疗方法,如手术、放疗、化疗并未明显改善胃癌病人的预后,因此迫切需要创新肿瘤治疗手段。研究表明,一些基因可能对胃癌的侵袭转移具有调控作用[7],针对这些基因的靶向治疗取得了一些进步,但是由于肿瘤形成的异质性,多种基因间的相互作用,以及靶向药物载体的局限等原因,导致胃癌的靶向治疗效果不佳。因此,迫切需要寻找新的治疗靶点,为胃癌发生发展、侵袭转移机制的深入研究以及精准医疗提供可靠的理论依据。
  人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen2,TACSTD2/Trop2/M1S1/GA733-1),位于染色体1q32[8]。Trop2最早发现在人滋养层细胞表面[9,10],是单跨膜蛋白,约36kDa,分为膜外区、跨膜区、膜内区和一个磷酸化的胞质尾[11]。Trop2能够被肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)转化酶裂解为胞外域和胞内域,胞内域从跨膜区离开后直接进入胞浆或核内从而发挥生物学作用[12]。Trop2主要在上皮组织肿瘤中高表达,并能够促进肿瘤的恶性生物学行为[13]。本实验室自2009开始对Trop2基因进行研究,前期的实验表明,Trop2基因在乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌中高表达,但是关于Trop2基因对胃癌的影响尚未见报道。
  上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)现象是指上皮细胞在正常生理和特定病理条件下向间充质细胞转化的现象[14],在肿瘤转移过程中发挥关键作用[15],将肿瘤细胞重新编程,使其具有干细胞特性[16-18]。为了适应肿瘤微环境的变化,在肿瘤发生转移的早期,肿瘤细胞就会发生很多表型的改变[19]。而正常的上皮组织多层细胞结构不利于恶性肿瘤细胞的迁移与侵袭,肿瘤细胞为了获得运动能力就要通过发生EMT变化而失去上皮表型(细胞间粘附、基顶极性以及非移动性)和上皮细胞的表面标志物,如E-钙黏附蛋白(E-cadherin),并得到间质表型(可移动性、侵袭能力以及抗凋亡能力)和间质细胞的表面标志物,如纤维连接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)等[20-22]。因此,EMT现象在肿瘤转移的早期出现是非常重要和必不可少的。
  本课题首先应用免疫组化技术,通过830例临床胃癌组织芯片分析Trop2与临床病理因素、预后的相关性,评价Trop2作为胃癌靶向治疗分子靶点的可行性;在第二部分的研究中我们分别从体内和体外实验探讨Trop2对胃癌恶性生物学行为的影响,发现Trop2在胃癌上具有促进胃癌细胞增殖,抑制凋亡,并能促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力;最后我们通过临床标本和动物实验证实Trop2的表达和间质细胞表面标志物vimentin的表达相关联,进而利用体外实验阐明Trop2能够介导β-catenin促进vimentin的表达,从而诱导胃癌EMT现象及侵袭转移的分子机制。
  研究目的:
  1.从胃癌临床标本、细胞学实验和动物实验三个层次研究Trop2对胃癌恶性生物学行为的影响和Trop2作为胃癌新靶点的可行性。
  2.阐明Trop2可能通过调控β-catenin促进vimentin的表达,从而诱导胃癌EMT现象和侵袭转移的分子机制。
  研究方法:
  1.选择41对胃癌组织和癌旁组织新鲜标本,实时定量RT-PCR检测Trop2mRNA的表达水平;用免疫组化方法检测Trop2在830例胃癌组织芯片中的表达情况,并结合临床病理资料分析其临床意义,探讨Trop2的表达与胃癌临床病理分期、预后等的关系。
  2.选择Trop2高表达和低表达各两株胃癌细胞系,分别敲减和过表达Trop2,CCK8法和平板克隆实验检测胃癌细胞增殖,FACS检测细胞凋亡和细胞周期,Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力变化。分别选用shRNA-NC和shRNA-Trop2稳转胃癌细胞株,制备裸鼠皮下成瘤模型,通过测量瘤体积和瘤重,比较Trop2敲减后对胃癌的抑制作用。
  3.免疫组化检测EMT表面标志物vimentin和Trop2在248例人胃癌组织及86例癌旁组织中的表达情况,分析两个基因表达的关联,以及与胃癌转移、生存预后等的相关性。
  4.检测过表达或敲减Trop2后胃癌细胞上EMT表面标志物(E-cadherin,vimentin和fibronectin)及β-catenin、goocecoid、snail等EMT转录因子的表达变化;TGF-β1诱导胃癌细胞株EMT模型,检测EMT模型中Trop2和EMT转录因子的表达变化;免疫共沉淀实验检测Trop2和β-catenin间的相互作用;同时检测Trop2,β-catenin,vimentin在胃癌细胞株,EMT模型细胞株,敲除Trop2的EMT模型细胞株上表达情况;激光共聚焦显微镜观察β-catenin、vimentin在过表达/敲减Trop2胃癌细胞株、EMT模型细胞株上敲除Trop2后的表达变化情况,分析Trop2对胃癌侵袭转移的作用机制。
  5.分别选用shRNA-NC和shRNA-Trop2稳转胃癌细胞株,注射裸鼠尾静脉制备转移瘤模型,5周后处死裸鼠,分离出肺组织,比较组别间肺组织的重量和转移瘤的数量,IHC检测肺组织转移瘤的Trop2、ki67、vimentin表达情况,分析Trop2对胃癌细胞转移能力的影响。
  研究结果:
  1.实时定量RT-PCR检测41对人胃癌新鲜标本和癌旁组织,结果显示Trop2mRNA在胃癌组织中的表达比癌旁组织高2.32±1.44倍;免疫组化检测830例不同类型的人胃癌组织芯片,结果显示,Trop2在胃癌组织中阳性表达率高于癌旁组织、慢性胃炎组织、低级别瘤变和高级别瘤变;胃癌中Trop2的表达与胃癌分化程度、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、幽门螺旋杆菌感染等相关,Trop2高表达预示着胃癌病人的预后不良,提示Trop2可以作为一个新的胃癌分子靶点。
  2.细胞实验结果显示,Trop2能促进胃癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,并能减少胃癌细胞的凋亡数量;过表达Trop2后,胃癌细胞的迁移、侵袭能力增强,敲减Trop2能抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力;Trop2促进胃癌细胞周期中S期所占比例明显增多。动物实验结果发现,敲减Trop2在体内能明显抑制肿瘤的增殖能力,抑瘤率达到50.40%。免疫组化结果显示,和空载对照组的肿瘤组织相比,shRNA-Trop2组的肿瘤组织中Trop2表达量相对较低。结果提示Trop2对胃癌细胞的恶性生物学行为具有促进作用。
  3.免疫组化检测248例胃癌组织及86例癌旁组织中Trop2和vimentin的表达水平。结果显示,Trop2和vimentin的表达呈正相关,Trop2和vimentin在胃癌组织中阳性表达率高于癌旁组织;胃癌组织中Trop2+/vimentin+表达和分化、TNM分期、远处转移等相关,Trop2+/vimentin+预示着胃癌病人的预后不良,提示胃癌中Trop2的表达可能和胃癌EMT现象有关。
  4.细胞水平实验结果显示,western-blot和实时定量RT-PCR检测结果显示,Trop2可上调间质细胞表型vimentin和fibronectin,下调上皮细胞表型E-cadherin,同时上调EMT调控因子β-catenin; TGF-β1能诱导胃癌细胞系发生EMT现象,诱导7天后,细胞形态发生明显变化,免疫荧光和实时定量RT-PCR结果显示细胞E-cadherin表达量减少,vimentin和fibronectin表达量增加,证实EMT模型诱导成功;EMT模型组细胞Trop2表达明显增加,同时上调EMT调控因子β-catenin;免疫共沉淀实验推测Trop2和β-catenin可在胞内发生结合;Western-blot实验结果显示Trop2能通过上调β-catenin促进胃癌细胞发生EMT现象;激光共聚焦显微镜进一步观察到Trop2能通过促进β-catenin核内聚集,上调EMT表面标志物vimentin的表达。提示Trop2能通过上调p-catenin促进vimentin表达,进而诱导胃癌EMT和侵袭转移的分子机制。
  5.在体内转移模型中,敲减Trop2的胃癌细胞经裸鼠尾静脉注射后,肺部转移瘤形成数量少于空载对照组;肺部转移瘤组织的免疫组化结果显示,Trop2敲减组的Trop2、vimentin和Ki67的表达量明显少于空载对照组。
  研究结论:
  1.Trop2在胃癌组织高表达,其高表达与胃癌分化、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和幽门螺旋杆菌感染有关,并预示着胃癌病人的预后不良,提示Trop2可作为治疗胃癌的分子靶点。
  2.Trop2高表达可促进胃癌细胞的增殖,抑制凋亡,促进胃癌细胞的迁移、侵袭能力,以及细胞的有丝分裂能力。
  3.Trop2和vimentin在胃癌组织上共同高表达,并呈正相关;胃癌组织中Trop2+/vimentin+表达和分化、TNM分期、远处转移等相关,Trop2+/vimentin+预示着胃癌病人的预后不良,提示胃癌中Trop2的表达可能和胃癌EMT现象有关。
  4.Trop2能通过调控β-catenin促进vimentin表达,从而诱导胃癌EMT现象和胃癌侵袭转移。
[硕士论文] 李晓晓
生物医学工程 西安电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,分子影像技术带来医学影像领域的新革命,将对现代和未来的医学模式产生深远影响。纳米探针为分子影像技术的发展铺平了道路。而随着纳米技术的发展,其研究趋势已经从对单一纳米材料的合成和性质的研究转向对纳米材料组装体的性能与应用的研究。通过自组装技术,可以实现对这些纳米材料结构和尺寸的精确控制,并使之具有特殊功能,从而在生物医学、新型材料、光学以及电子工业等领域发挥重要作用。本文基于以上现状,选择金纳米簇作为荧光源,结合组装技术的优势,制备出荧光信号增强高达10.88倍的组装体,并赋予其靶向性,而后将其应用于肿瘤的诊疗一体化研究。
  本论文首先选用两种方法合成金纳米簇及其组装体,结果表明经过组装的AuNPs-GSH具有荧光信号显著增强、生物安全性和生物相容性较好改善的特性。因此,本文最终选取AuNCs-GSH用于后面的金纳米簇自组装研究。其次,本文研究了合成过程中五个重要的实验参数,如钙离子的来源、PAA分子量、IPA的加入量、AuNCs-GSH的加入量以及Ca(OH)2和(NH4)2HPO4的加入量对AuNPs-GSH性能的影响,得到最优化合成方案。然后进一步研究了金纳米簇自组装前后的生物成像及光动力治疗效果。结果表明经过自组装的金纳米簇不仅提高了生物相容性,而且在体内外荧光成像中均可以看到较好的增强效果,有利于生物医学成像。此外,本文还研究了另一种金纳米探针的合成及其生物成像应用—耦联RGD的金纳米棒探针(AuNRs-RGD)在体靶向肿瘤CT成像。
  在上述实验中,本文首先基于金纳米簇,将其与自组装的优势结合起来制备了具有荧光显著增强且生物相容性良好的金纳米簇组装体,并修饰叶酸(FA),使其具有靶向性,最后应用于生物成像及光动力治疗的相关研究。本文还研究了AuNRs-RGD作为新型造影剂在体靶向肿瘤CT成像。综上所述,制备的金纳米探针还存在深度成像受限的问题,但其在生物医学领域仍具有广阔的发展空间和应用价值。因此,在下一步研究中我们将着重调控其发射峰位置,使其处于近红外区,完善其性质进而扩展其医学应用。
[硕士论文] 赵洪焕
病原生物学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨miR-615-3p在胃癌组织和血清中的表达水平及对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及化疗耐药的影响,确定miR-615-3p的靶基因以及靶基因对胃癌细胞的作用。
  方法:
  1.qRT-PCR法检测miR-615-3p在临床胃癌组织(低分化和中高分化)及相应血清标本中的表达水平;对胃癌患者的临床病理资料汇总后分析胃癌组织中miR-615-3p水平与临床病理因素(性别、年龄、病理分化类型及TNM分期)的关系;通过SPSS软件分析胃癌患者和健康体检者血清中miR-615-3p值切点,绘制ROC曲线,分析miR-615-3p区分胃癌和健康人群的诊断临界点,敏感度及其特异度。
  2.胃癌细胞系MGC-803中分别过表达和封闭miR-615-3p,于24h后采用CCK-8实验、Transwell实验检测各组胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;应用免疫细胞化学法和western blot法检测各组细胞中上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平;24h后添加不同浓度奥沙利铂,48h后采用CCK-8实验检测细胞活性变化。
  3.采用qRT-PCR和western blot实验分别检测miR-615-3p的靶基因B4GALT1在胃癌组织与胃癌细胞系中的mRNA和蛋白水平;在MGC-803细胞中分别过表达和敲降B4GALT1,于24h后采用CCK-8实验、Transwell实验检测各组胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;应用免疫细胞化学法和western blot法检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平;24h后添加不同浓度奥沙利铂,48h后采用CCK-8实验检测细胞的活性变化。
  结果:
  1.miR-615-3p在低分化胃癌组中的表达水平显著高于良性病变组及中高分化胃癌组(P<0.01);而在中高分化胃癌组的表达水平与良性病变组比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-615-3p在胃癌组织中的表达水平与患者的性别、年龄无明显关系(P>0.05),与其病理分化类型和 TNM分期相关,其中低分化胃癌患者的表达水平明显高于中高分化者(P<0.01),III/IV期的相对表达水平明显高于I/II期(P<0.05);另一方面,miR-615-3p在低分化和中高分化胃癌血清组的表达水平均显著高于健康体检组(P<0.01),低分化胃癌血清组的表达水平显著高于中高分化胃癌血清组(P<0.01)。血清中miR-615-3p的 ROC曲线下面积为0.803[95% CI(0.707,0.906)],与A=0.5比较,差异有统计学意义。区分胃癌和健康人群的诊断临界点为35.32,敏感度为85.71%、特异度为68.57%。提示miR-615-3p可能作为辅助诊断胃癌的生物学指标具有可行性。
  2.与对照组相比,封闭miR-615-3p组的细胞增殖能力显著减弱(P<0.05,P<0.01),穿过基底膜(无基质胶及含基质胶)的细胞数均显著降低(P<0.01),封闭miR-615-3p组E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果证明,miR-615-3p可正向调控MGC-803细胞的增殖、迁移与侵袭能力。奥沙利铂处理封闭miR-615-3p的MGC-803细胞48h后,细胞的增殖能力显著弱于对照组(P<0.01)。提示miR-615-3p可负向调控胃癌细胞对奥沙利铂药物的敏感性。
  3.B4GALT1在低分化胃癌组织中的mRNA和蛋白表达水平显著高于良性病变组(P<0.01);B4GALT1在过表达miR-615-3p的MGC-803细胞组中mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05),蛋白表达水平也同样显著高于对照组(P<0.01);在封闭miR-615-3p的MGC-803细胞组中的mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.01),蛋白表达水平同样也显著低于对照组(P<0.01)。以上结果表明,miR-615-3p在胃癌中可正向调控B4GALT1的表达。与对照组相比,敲降B4GALT1组的细胞增殖能力明显减弱(P<0.05,P<0.01),穿过基底膜(无基质胶及含基质胶)的细胞数均显著降低(P<0.01);敲降B4GALT1组的E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果证明,B4GALT1可正向调控MGC-803细胞的增殖、迁移与侵袭能力;奥沙利铂处理B4GALT1敲降的MGC-803细胞48h后,细胞的增殖能力显著弱于对照组(P<0.05,P<0.01)。提示B4GALT1可负向调控细胞对奥沙利铂的药物敏感性。
  结论:
  1.miR-615-3p及其靶基因B4GALT1在胃癌组织中的表达水平显著高于良性病变组织,在胃癌中的表达水平与其病理分化类型和TNM分期呈正相关;
  2.miR-615-3p可能通过正向调控 B4GALT1促进胃癌细胞MGC-803的增殖、迁移和侵袭,增强细胞的化疗耐药性。
[硕士论文] 陆皓东
口腔临床医学 华北理工大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究旨在测定高迁移率族蛋白1(HMGB1)、肿瘤相关巨噬细胞特异性标记物CD68及淋巴管特异性标记物D2-40在甲状腺乳头状癌以及结节性甲状腺肿组织中的表达情况,探讨甲状腺乳头状癌中高迁移率族蛋白1、肿瘤相关巨噬细胞与淋巴管密度之间的相关性以及其与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的相关性,为临床诊断和治疗甲状腺乳头状癌以及对患者预后情况的预测提供宝贵的实验证据。
  方法:研究选取自2014年1月至2015年12月在河北省唐山工人医院头颈外科接受诊治的93例甲状腺肿瘤患者的石蜡包埋的肿瘤组织,其中31例为结节性甲状腺肿组织,62例为甲状腺乳头状癌组织。在62例甲状腺乳头状癌患者中,有31例伴有颈部淋巴结转移,31例未伴颈部淋巴结转移。对其采用免疫组织化学SP法检测甲状腺乳头状癌组织和结节性甲状腺肿组织中HMGB1、CD68及D2-40的表达水平。
  结果:
  1.HMGB1在甲状腺乳头状癌组中的阳性率为61.29%,明显高于其在结节性甲状腺肿组中的阳性率22.58%,二者差异有统计学意义(P<0.05);而在甲状腺乳头状癌组中,HMGB1在不同年龄以及不同性别分组之间的表达水平无明显差异(P>0.05),但是其在有颈部淋巴结转移组的阳性率80.65%明显高于在无颈部淋巴结转移组的阳性率41.94%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。
  2.CD68在甲状腺乳头状癌组中的阳性率为70.97%,明显高于其在结节性甲状腺肿组中的阳性率16.13%,二者差异有统计学意义(P<0.05);而在甲状腺乳头状癌组中,CD68在不同年龄以及不同性别分组之间的表达水平无明显差异(P>0.05),但是其在有颈部淋巴结转移组的阳性率87.10%明显高于在无颈部淋巴结转移组的阳性率54.84%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。
  3.D2-40在甲状腺乳头状癌组中的表达水平(LVD=12.45±6.29)远高于结节性甲状腺肿组中D2-40的表达水平(LVD=3.58±3.11),二者差异具有统计学意义(P<0.05);而在甲状腺乳头状癌组的不同年龄分组以及不同性别分组中,D2-40的表达水平并未显示出有统计学差异(P>0.05),但是其在有颈部淋巴结转移组的表达水平(LVD=14.95±7.05)明显高于在无颈部淋巴结转移组的表达水平(LVD=9.95±4.22),二者差异有统计学意义(P<0.05)。
  4.甲状腺乳头状癌组中HMGB1、CD68和D2-40表达水平的相关性:HMGB1与CD68在甲状腺乳头状癌中的表达水平呈正相关关系(r=0.384,P<0.05)。HMGB1与D2-40在甲状腺乳头状癌中的表达水平呈正相关关系(r=0.428, P<0.05)。CD68与D2-40在甲状腺乳头状癌中的表达水平呈正相关关系(r=0.479,P<0.05)。
  结论:
  1.HMGB1、CD68和D2-40在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平均明显高于在结节性甲状腺肿组织中的表达水平(P<0.05)。三者均在甲状腺乳头状癌的发生与发展当中起到了重要的作用。
  2.HMGB1、CD68和D2-40的表达水平与颈部淋巴结转移情况有明显关系(P<0.05)。可以认为三者参与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的过程,可以作为评估患者甲状腺乳头状癌颈部转移情况的参考指标。
  3.通过进行Spearman相关性分析可以发现,HMGB1、CD68和D2-40表达水平之间有着相关性,三者呈正相关关系(P<0.05)。这证实了三者之间存在着紧密的联系,HMGB1在甲状腺乳头状癌生长过程中,不仅激活TAMs,而且直接参与到淋巴管形成的过程中;TAMs在通过对癌细胞的增殖的促进参与到甲状腺乳头状癌的发生发展过程中,而且对于淋巴管的生成和增殖起到重要作用;而经过HMGB1和TAMs的共同作用后,肿瘤组织中淋巴管数量增多,直接参与并促进了甲状腺乳头状癌的颈部淋巴结转移。
[硕士论文] 常奇
电子与通信工程 大连海事大学 2017(学位年度)
摘要:目前癌症发病率越来越高,精准的预后预测不仅可以帮助患者了解他们的生存期望,而且还可以帮助研究者了解疾病的发展规律、指导临床治疗。
  本文提出了一种预测癌症患者生存期的方法,该方法利用数据挖掘技术,研究来自TCGA(The Cancer Genome Atlas)项目的多形性胶质母细胞瘤(GBM,Glioblastoma Multiforme)患者的分子数据和临床数据,得到了一个由特征选择算法和分类算法构成的联合预测模型。与已有研究成果相比,该模型能够以较高的精度预测GBM患者的生存期,判断其生存期是否超过12个月,以便医疗人员能够将患者分到不同的危险组别中,进行更为精准的治疗。本文的主要工作如下:
  (1)数据的收集和预处理。本文研究的癌症为GBM,所用的分子数据和临床数据均来源于TCGA数据库。并且对下载下来的数据进行了一定的预处理,过程包括:缺失值的定义和填补,去除缺失值过多的特征、样本,标准化处理。
  (2)针对GBM患者的分子数据和临床数据,利用基于L1正则化的逻辑回归算法进行特征选择。通过理论分析并且与其他三种常用的特征选择算法(基于树模型的特征选择算法,方差选择法,基于逻辑回归的递归特征消除法)相比较,建模对GBM患者生存期预测得到的AUC分数较高,程序运行时间较短。
  (3)针对GBM患者的分子数据和临床数据,利用支持向量机算法进行分类。通过理论分析并且与其他九种常用的机器学习分类算法相比较,建模对GBM患者生存期预测得到的AUC分数较高,程序运行时间较短。
  (4)将上述特征选择算法和分类算法相结合得到了一个联合预测模型。利用该模型对GBM患者的生存期进行预测,预测精度与使用类似数据结构的已有研究成果相比有所提高。
[硕士论文] 方文娟
材料学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:由于硅酞菁中硅的六配位属性,使其具有可以在轴向上引入配体的特性。因此通过引入功能化的基团不仅可以改善硅酞菁性能,还可以增加空间位阻改善聚集。胺类化合物在细胞的增殖和分化中扮演着重要的角色;双膦酸酯通过抗侵入性、抗血管生成、免疫调节等活动直接抑制肿瘤生长是常用的化疗药物。将第二代光敏剂与化疗抗癌药物一起作用能够产生协同效应,显著增强抗癌功效,减小副作用,解决耐药性等问题。
  在本论文中,我们首先合成了两种不同长度胺基链轴向取代的硅酞菁,发现长链胺基硅酞菁具有较好的性质,以此为前置配体,接上双膦酸酯,成功合成了双膦酸酯取代硅酞菁,测试了合成物的光物理化学及生物性质。论文的主要内容如下:
  1以二氯硅酞菁为原料,2-(2-胺基乙氧基)乙醇和乙醇胺作为配体分别轴向取代硅酞菁。通过核磁氢谱、碳谱,质谱,元素分析,红外等方法对合成的两种硅酞菁进行表征,确保与设计的分子结构一致。
  2紫外可见光谱显示除了在常规有机溶剂中,两种胺基硅酞菁在水溶液中也表现出了良好的溶解性。荧光光谱显示两种胺基硅酞菁的荧光强度均随着pH值的降低而有所增强。
  3用Hela细胞进行细胞吸收、体外细胞毒性和荧光成像实验。长链胺基硅酞菁的吸收和荧光强度均高于短链胺基硅酞菁,对细胞荧光成像的进一步研究中发现两种硅酞菁均在线粒体中显示较大的聚集。长链和短链硅酞菁均具有较高的光毒性和低暗毒性,符合理想光敏剂特点。
  4以合成的长链胺基硅酞菁作为配体,与设计合成的带有羧基的双膦酸酯室温反应,利用核磁氢谱、碳谱、磷谱,质谱,元素分析,红外等方法对合成的硅酞菁进行表征,确保与设计的分子结构一致。
  5光物理化学测试结果显示,与长链胺基硅酞菁相比,双膦酸酯的引入对酞菁本身的性质影响较小,其紫外可见光谱和荧光光谱未发生明显变化,单线态氧产率也很相近,但荧光量子产率有所提高。
  6用A549肺癌细胞和HELF正常肺细胞进行细胞吸收、体外细胞毒性和荧光成像实验。双膦酸酯硅酞菁在A549细胞中的吸收和荧光强度均高于HELF细胞。对细胞荧光成像的进一步研究中发现双膦酸酯硅酞菁在线粒体和溶酶体中均有聚集。在光照条件下,双膦酸酯硅酞菁在A549细胞中的光毒性高于HELF细胞,而且双膦酸酯硅酞菁比胺基硅酞菁表现出了更好的光毒性。在避光时,低浓度条件下胺基硅酞菁几乎没有表现出暗毒性,但是双膦酸酯硅酞菁仍有一定的暗毒性。这些结果表明双膦酸酯硅酞菁是潜在的具有光动力治疗和化疗协同作用的光敏剂。
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