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[硕士论文] 王曦
数学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:科学家研究发现,肿瘤的扩散和发展与细胞的扩散和聚集有着紧密的联系,这个过程主要与趋化机制和趋触机制有关.本文主要关注用趋化模型来研究肿瘤细胞的扩散和聚集,人们对经典趋化模型的研究已经获得了丰富的成果.近年来,随着研究的深入,人们发现在自然界中许多物质的移动并不符合经典的趋化模型规律,而用Lévy飞行来描述它们的扩散比用Brownian机制更为合理.为此,人们在经典模型的基础上引入了分数次扩散来描述Lévy飞行.具分数次扩散的问题是近年来偏微分方程领域的前沿问题之一,它引起了许多著名学者的关注,如沃尔夫奖获得者美国数学家Caffarelli,法国著名数学家Perthame以及意大利著名数学家Terracini等.关于这些模型的研究促进了偏微分方程理论的发展,其研究成果对肿瘤的预防和治疗又起到了指导性的作用.
  本文我们主要研究经典的趋化模型和具分数次扩散的趋化模型,并考虑其解的长时间性态问题.研究方法上的主要创新在于引入了一个能够同时体现解的能量估计及解的衰减性的函数空间作为基本迭代空间,运用压缩映射原理证明古典解的存在性,同时获得解的任意阶导数的衰减估计.本文的主要内容分为四个章节.
  第一章,介绍趋化模型的背景以及研究现状.
  第二章,研究经典的抛物-抛物趋化模型,证明该模型的古典解的存在性和解任意阶导数的衰减性.
  第三章,研究两个方程带相同分数次扩散的抛物-抛物趋化模型.首先我们证明了分数次线性发展方程的解关于时间t的衰减性,其次证明了该问题整体经典解的存在唯一性并获得解的任意阶导数关于时间的衰减估计.
  第四章,研究包含三个具分数次扩散的抛物方程的趋化模型,其中对于两种不同细胞的密度u和v的扩散具有不同的分数次指数,同时对于化学物质浓度ψ的扩散是由Brownian运动机制引起的.利用第三章中关于分数次线性发展方程关于时间的衰减估计,得到了该模型的整体古典解的存在唯一性和任意阶导数的衰减估计.
[硕士论文] 何欣
生物化学与分子生物学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:肿瘤转移抑制因子(Metastasis suppressor)是由转移抑制基因(Metastasis suppresor gene,Msgs)编码的一类在肿瘤转移过程中发挥负调作用的蛋白质。其作用特点是抑制肿瘤细胞在体内的扩散转移,但不影响原发瘤的形成及生长。为区别与抑癌基因,故定义为肿瘤转移抑制基因。自从1988第一个肿瘤移抑制基因,NM23基因被发现以来,已经发现了30多个肿瘤转移抑制基因。不同的转移抑制因子可在转移过程的不同环节阻断转移过程。一些转移抑制因子可促进细胞间的同源粘附,以阻断瘤细胞从原发瘤的脱落;一些转移抑制因子可抑制细胞外基质分子的降解及肿瘤细胞的迁移和侵袭。一些转移抑制因子调控肿瘤细胞在血液或继发部位的存活和生长,抑制转移瘤的形成。不同转移抑制因子之间的功能常互相交叉。一种转移抑制因子可在多个不同环节阻断肿瘤转移。转移抑制基因在转移的瘤细胞中常常表达下调或不表达。恢复其表达或功能可抑制肿瘤细胞在体外迁移运动和在体内的转移。因此,肿瘤转移抑制因子的相关研究是目前肿瘤转移领域的前沿课题,其研究热点正由对生物学功能及作用机制的研究,转向靶向转移抑制因子治疗策略的设计以及靶向或模拟转移抑制因子的抗转移新药的开发。
  恢复肿瘤转移抑制因子的功能,抑制肿瘤的侵袭和转移,将为临床控制肿瘤转移开辟一条新途径。过去的多年中,已有多种策略被用来恢复转移抑制基因的功能。这些策略可分为三类:诱导内源性不表达基因重新表达、通过脂质体或病毒介导的基因治疗技术转染外源基因,直接应用肿瘤转移抑制基因编码的重组蛋白产物,以及靶向转移抑制基因的下游通路。然而,到目前为止,因各种原因,如技术上的限制、疗效欠佳,或对正常生理的干扰,靶向肿瘤转移抑制基因控制肿瘤转移的治疗策略在临床的应用尚处于起步阶段,仍面临众多挑战。
  在众多肿瘤转移抑制因子中,KAI1(Kang Ai1,抗癌1号)/CD82是研究最为详细的肿瘤转移抑制因子之一。KAI1/CD82广泛表达于不同组织,在肿瘤组织中表达经常被下调或缺失。与其他大多数肿瘤转移抑制因子不同,KAI1/CD82可在多个环节阻断肿瘤的转移:KAI1/CD82可促进肿瘤细胞的同型粘着,抑制瘤细胞从原发瘤脱离。KAI1/CD82可抑制细胞外基质分子降解,抑制细胞-细胞外基质粘附;KAI1/CD82也可抑制细胞迁移运动、诱导肿瘤细胞衰老或休眠。KAI1/CD82属于四跨膜蛋白家族成员,包含四个跨膜结构域、两个细胞外环(EC1和EC2)、一个胞内小环、和胞内N端和C端。目前,KAI1/CD82各部分结构域所对应的功能基本弄清楚,但其胞外小环结构域(EC1)的功能研究欠缺,尚不清楚。既然EC1结构域在长期生物进化过程中一直存在于四跨膜蛋白家族的所有成员中,必定有其重要的功能。为验证这一假设,在前期研究中,我们合成了CD82-EC1结构的氨基酸序列模拟肽(CD82-EC1-mP),并发现CD82-EC1-mP可以抑制肿瘤细胞体外迁移运动。在本研究中,我们进一步研究了CD82-EC1-mP对肿瘤细胞转移行为的影响,并对其影响机制做了初步探讨。同时观察了CD82-EC1-mP体内抗肿瘤转移作用。
  一、体外培养细胞,采用划痕法,transwell法,观察CD82-EC1-mP肿瘤细胞粘附、贴壁,的迁移及生长的影响。
  结果:1.CD82-EC1-mP促进肿瘤细胞的粘连聚集
  2.CD82-EC1-mP抑制肿瘤细胞的贴壁生长
  3.CD82-EC1-mP抑制肿瘤细胞的迁移
  结论:CD82-EC1-mP抑制肿瘤细胞体外迁移,可能是其转移抑制作用的主要机制之一。
  二、采用Western Bloting、细胞免疫荧光化学等技术,对CD82-EC1-mP抑制细胞迁移机制进行初步研究。
  结果:1.CD82-EC1-mP可抑制Vimentin的表达,促进Vimentin的磷酸化。促进磷酸化的Vimentin向细胞表面分布。
  2.CD82-EC1-mP促进E-Cadherin的表达。
  3.CD82-EC1-mP抑制β-Catenin在细胞核分布,促进β-Catenin在细胞膜分布。
  4.CD82-EC1-mP抑制GSK3β磷酸化,激活GSK3β,促进β-Catenin磷酸化
  结论:CD82-EC1-mP下调Wnt信号通路,抑制GSK3β磷酸化从而激活GSK3β,GSK3β使β-Catenin磷酸化降解,减少β-Catenin由胞质进入细胞核,从而抑制Vimentin的表达。另外,CD82-EC1-mP促进β-Catenin向胞膜分布并加强与E-Cadherin复合体形成。
  三、经尾静脉注射,建立纯系小鼠和裸鼠模型,观察CD82-EC1-mP对体内肿瘤转移的影响。
  结果:1.CD82-EC1-mP抑制小鼠肺癌LLC细胞在ICR小鼠形成肺转移。
  2.CD82-EC1-mP抑制人肺癌H1299细胞裸鼠体内肺转移。
  3.CD82-EC1-mP抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠体内肺转移。
  4.CD82-EC1-mP抑制人结肠癌SW620细胞裸鼠体内肺转移。
[硕士论文] 董其燕
发育生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:恶性肿瘤现已成为我国居民的主要死亡原因。转移是恶性肿瘤难治、易复发的主要原因,其中肿瘤脑转移是恶性肿瘤转移的最严重后果之一,一旦发生脑转移,预后非常差,5年存活率极低。因此,研究肿瘤细胞脑转移机制对于我国癌症病人来说具有重要意义。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易发生脑转移的三种癌症。本课题旨在应用模式动物斑马鱼,建立用于肿瘤脑转移机制研究的活体模型,并进一步探索肿瘤脑转移的分子机制以及肿瘤细胞外泌体在肿瘤脑转移中的作用。研究结果总结如下:
  1.在血脑屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑马鱼胚胎心包腔部位注射带有红色荧光标记的鼠源性黑素瘤细胞tfRFP-B16-F10,对肿瘤细胞的转移进行检测和统计:胚胎存活率、注射部位含有肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。同时我们选取移植后的幼鱼进行活体成像实验,实时观察肿瘤细胞突破血脑屏障(Brain-Blood-Barrier,BBB)进入脑组织的过程,我们发现肿瘤细胞是通过不断地变形穿过脑内皮细胞间隙进入脑实质,在脑内皮细胞间紧密连接出现以后,肿瘤细胞的脑转移率大大降低,而紧密连接正是血脑屏障实现其功能的主要一部分,因此,我们得出结论:血脑屏障在抑制肿瘤细胞脑转移的过程中发挥了重要作用,另外,通过对发生脑转移2d后的斑马鱼幼鱼进行长时程转盘共聚焦拍摄,我们发现脑转移的肿瘤细胞沿着血管壁扩增延伸,细胞集群不断扩大,这与之前文献报道的脑转移生长情况相符,而且通过本部分实验,我们成功建立了研究肿瘤脑转移的斑马鱼模型。
  2.在血脑屏障开始形成后即3dpf的斑马鱼幼鱼心包腔部位注射3-D纤维软胶培养富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性细胞和普通培养的tfRFP-B16-F10肿瘤细胞,分别统计注射不同培养肿瘤细胞的胚胎存活率、注射部位肿瘤细胞团的数目和各个部位包括头部、躯干、尾部的转移灶数目,以及总体转移灶数目。数据统计结果表明3-D纤维软胶培养的高致瘤性细胞无论是总体转移率还是脑转移率都要高于普通培养瓶培养的肿瘤细胞。因此,高致瘤性细胞的转移潜能更强。另外,我们利用荧光显微镜连续观察同一条幼鱼体内转移的肿瘤细胞,可以很明显的观察肿瘤细胞在转移部位的生长。
  3.外泌体是30-100um的囊泡结构,在肿瘤细胞转移过程中起重要作用,然而对于其作用机制的了解还不全面,因此我们拟利用本课题所建立的肿瘤脑转移斑马鱼模型研究外泌体促进脑转移的分子机制。我们利用DiI荧光染料使体外提取的外泌体带上红色荧光,将DiI-exosomes注射进2dpf的斑马鱼胚胎心包腔部位,利用转盘共聚焦显微镜观察外泌体与血脑屏障脑内皮细胞间的相互作用,我们发现外泌体可以被绿色荧光标记的脑微血管内皮细胞吸收,并且红色荧光与脑内皮细胞的绿色荧光存在共定位长达4h甚至更长,结果说明外泌体与脑内皮细胞间存在相互作用,而这种相互作用很可能对肿瘤细胞穿过血脑屏障具有重要影响。我们先后尝试了5次tfRFP-B16-F10及其外泌体的共注射以及1次非小细胞肺癌细胞A549及其外泌体的共注射,监测脑转移,并进行统计分析,然而实验结果与预期有较大出入,我们需要探究新的建模方式来构建斑马鱼模型研究外泌体对肿瘤细胞脑转移的影响。
[硕士论文] 王东旭
临床医学(外科学) 济南大学 2018(学位年度)
摘要:结直肠癌是世界范围内最常见的肿瘤类型之一,肝转移是结直肠癌患者的主要致死因素。肿瘤的转移是一个多步骤的复杂过程,对肝转移的抑制是治疗结直肠癌有效的手段。
  大量研究表明髓系细胞广泛参与了肿瘤转移灶形成与进展,而在结直肠癌肝转移中,不同亚群的髓系细胞发挥着不同的作用。Tip-DC,分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的树突状细胞(TNF-α/iNOS producing dendritic cells,Tip-DCs),是一群表面分子表型为CD11b的特殊类型的髓系细胞。前期研究发现,在结直肠癌肝脏转移灶中,机体通过趋化因子CCL2结合其受体CCR2,募集大量的CD11b+髓系细胞浸润。而在动物实验中,选择性的去除该群CD11b+髓系细胞后肝转移灶的生长明显受到抑制,一些已形成的转移灶缩小甚至消失。
  因此,对该群髓系细胞参与结直肠癌肝转移的研究有利于更好地了解肝转移的分子机制,为临床工作提供新的方向。进一步研究发现肝转移灶中CD11b+髓系细胞则较多存在于肿瘤浸润组织的边缘以及瘤组织的基质中。因此探寻从手术取下的肝转移瘤组织中,对该CD11b+髓系细胞进行特异分离与提取。本研究联合机械-酶消化法与流式细胞仪分选出目标细胞,并对获取的细胞进行鉴定和评价,寻求建立一种结直肠癌肝转移瘤组织中获取特异性细胞的分选方法。
  目的:
  利用机械法联合化学酶消化法,从结直肠癌肝转移瘤组织中分选出高纯度CD11b+髓系细胞,并对该细胞的特异性进行验证;对细胞的形态和活性进行评价;从而建立稳定的可靠的从结直肠癌肝转移瘤组织中获得特异单细胞的方法。
  方法:
  采用术后离体的结直肠癌肝转移瘤标本,机械联合酶消化法将实体瘤组织制备成单细胞悬液;流式细胞检测仪对各组单细胞悬液的阳性细胞的比例进行检测;利用流式细胞分选仪分选出CD11b阳性的髓系细胞,并回测细胞纯度;免疫细胞化学技术对分选出细胞的特异性进行鉴定;吉姆萨以及台盼蓝染色对分选所获得细胞进行评价。采用配对样本的t检验,对10例样本的分选前阳性率以及分选后纯度进行比较,以P<0.01为差异有统计学意义;采用单样本均数的t检验,判断本研究的10例分选纯度是否不低于一般流式分选纯度,以标准95%为已知总体的分选纯度,P<0.05/2(单侧)为差异有统计学意义。
  结果:
  (1)流式细胞术能从机械联合酶消化法制备的单细胞悬液中分选出高纯度以及足够数量的CD11b阳性细胞;
  (2)直接细胞免疫化学荧光技术验证了分选细胞的特异性;
  (3)采用吉姆萨染色法对分选前后的细胞形态对比观察,分选前的细胞成团成块,形态各不相同,为各种细胞混合;分选后的细胞,不再成团块,形态类型一致;
  (4)统计分析10例样本分选前细胞阳性率与分选后细胞纯度。分选前阳性细胞率相比分选后细胞的纯度,P(0.003)<0.01,分选效果明显;分选后细胞纯度与一般流式分选纯度的差异比较,P(0.016)<0.05/2,可以认为该10例样本平均分选纯度不低于95%,从而表明所建立的方法具有良好的可重复性。
  结论:
  机械联合酶消化法制备的单细胞悬液,经过流式细胞仪分选,能够分选出高纯度,活性良好,形态完整的特异性细胞,操作方法稳定可重复,满足进一步研究的要求。
[博士论文] 周立志
流行病与卫生统计学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:在肿瘤研究中,疗效评价的硬终点为生存结局,如总生存时间(overall survival,OS)或无疾病进展生存时间(disease-free survival,DFS),但某些疾病通常需要较长时间观察到这两种生存结局,如乳腺癌等。反映治疗后肿瘤载荷降低的指标,如客观缓解/应答(objective response,OR),往往比DFS更快观察到,且肿瘤载荷能有效预测生存结局。因此,在Ⅱ期肿瘤临床试验中,肿瘤载荷降低常被用作疗效评价指标。
  在Ⅲ期肿瘤临床试验中,生存结局是评价疗效的金标准;但在分析生存结局时,通常未考虑短期结局的应答率。Thall(2008)认为在分析长期生存结局时,应考虑短期应答率;因为受试者出现应答,其相应的生存时间通常也会更长。忽略短期结局不仅丢失重要信息,而且忽略了各组的生存时间是出现应答及非应答的受试者生存时间的混合分布。Inoue(2002)以及Lai(2012)等在成组序贯设计中提出了结合短期结局估计生存结局的方法。Inoue(2002)基于Bayesian思想,假定生存时间服从指数分布,提出相应的参数模型;而实际中生存时间可能并非服从指数分布,且其参数难以确定,故其应用场合有限。Lai等(2012)基于Cox模型提出相应的半参数模型,但缺少对所提指标的全面评价。ICH目前正在对E9R1征求意见,该指南的主要议题是临床试验中如何考虑伴发事件对研究结果的影响,而短期结局事件对生存结局的影响恰恰类似于伴发事件,因此结合短期结局估计生存结局具有重要的临床应用价值,同时也对统计方法学提出了新的挑战。
  目的:
  本研究针对非成组序贯设计,旨在建立结合短期结局估计生存结局的统计推断方法,为临床研究中的疗效评价提供方法学手段,为Ⅱ/Ⅲ期无缝试验设计的目标人群确证和干预方案优化提供依据。
  方法:
  本研究应用Lai等(2012)等的思想,首先在非成组序贯设计中提出结合短期结局估计生存结局的指标。然后,基于似然理论,推导出相应的假设检验方法(包括似然比检验、Wald检验以及Score检验),进而对所提指标的统计性能进行全面评价。最后,基于所提出的方法,将其扩展到基于短期结局目标人群选择的Ⅱ/Ⅲ期无缝试验。
  根据Lai等(2012)的思想,提出以下结合短期结局估计生存结局的半参数模型:λ(t|Y,Z)=λ0(t)exp(αY+βZ)。当α趋近于1时,试验组与对照组的风险比可近似为1-R(π,ξ),其中π=(π0,π1),ξ=(a,b),a=eα,b=eβ以及R(π,ξ)={π0a+(1-π0)}-{π1ab+(1-π1)b}当R(π,ξ)>0时,说明试验组疗效优于对照组。
  采用偏似然估计方法估计α和R,基于似然理论构造检验假设H0∶R=0(对应于检验H0:1-R=1)的Wald检验、似然比检验以及Score检验。相应的检验统计量分别为
  Wald检验统计量:X2W=((R)-R)[IRR(α,R)]-1((R)-R);
  似然比检验(LRT)统计量:X2LR=2{LL((ā),R)-LL((ā)(R),R)};
  Score检验统计量:X2SC=U((ā)(R),R)[IRR((ā)(R),R)]-1U((ā)(R),R)
  上述三个检验统计量在原假设成立的条件下近似服从自由度为1的卡方分布。通过模拟研究评价R的参数估计准确性、检验统计量分布、Ⅰ类错误及检验效能,并进行实例分析。最后将其应用在包含目标人群选择的Ⅱ/Ⅲ期无缝设计情形。
  本研究通过模拟研究对所提指标进行全面评价,包括参数估计准确性、检验统计量分布、Ⅰ类错误及检验效能;最后基于实际数据进行实例分析。
  结果:
  (1)结合短期结局估计生存结局的统计方法
  模拟研究结果如下:
  参数估计准确性:1)偏差(bias):新指标(1-R)以及考虑短期结局的HR估计偏差均接近于0,且随着样本量增大,效应越强,其偏差越接近于0;但均略微高于0,也即趋于缩小干预效果,其结果略微偏保守。
  2)均方根误差(Mean Square Error,MSE):各指标的均方根误差均是随着样本量增大而减小,随着干预效果增大而减小。新指标(1-R)以及考虑短期结局的HR估计均方根误差均小于不考虑短期结局的HR估计。
  统计量分布:Wald检验,LRT以及Score检验的检验统计量基本呈现卡方分布的形式;从右侧尾部的拟合情况来看,LRT尾部拟合最好。
  Ⅰ类错误(检验水准0.05):三种检验及两种Cox模型的Ⅰ类错误都控制比较好。整体来看,Score检验的Ⅰ类错误高于其他方法,Wald检验其次,LRT与两种Cox模型基本一致。
  检验效能:当ppvT为0.7时,Score检验的检验效能高于LRT以及Cox_1(不包含短期结局),后两者基本一致;随着ppvT增大至超过0.8时,LRT与Cox_1检验效能逐渐增大,此时LRT效能高于Score检验,而Score检验的检验效能高于Cox_1。所有情况下均是Cox_2(包含短期结局)的检验效能最低。
  实例分析结果如下:
  基于非小细胞肺癌的实例数据显示,新指标(1-R)的点估计值介于包含及不包含短期结局的Cox模型之间;新指标的LRT与logrank检验及两个Cox模型结论一致,且其假设检验的P值更接近logrank检验和不包含短期结局的Cox模型。而新指标的Wald检验及Score检验均提示低△CT值组患者风险更低。其结论与模拟研究一致。
  (2)在Ⅱ/Ⅲ期无缝设计中的应用
  模拟研究结果如下:
  Ⅰ类错误(检验水准单侧0.025):Wald检验和Score检验均会放大Ⅰ类错误。LRT与Cox_1、Cox_2及log-rank检验基本一致,均略微低于设定的检验水准。
  检验效能:整体来看LRT效能与Cox_1相近。随着ppvT增大至超过0.8时,LRT效能高于Cox_1。LRT效能与logrank检验也基本一致,在一些参数组合下,LRT效能高于logrank检验。Cox_2的检验效能最低。
  实例分析结果如下:
  基于乳腺癌的实例分析显示,整体而言新指标LRT的效能略低于Cox_1(包含短期结局的Cox模型)的效能,后者普遍要高出1-2%;但要高于logrank检验(1-2%),尤其体现在对目标人群的确证方面(提高约15%)。
  结论:
  本研究首次针对非成组序贯设计,提出结合短期结局估计生存结局的指标及相应统计推断方法,为肿瘤试验中的疗效评价提供新的方法学手段。从目前研究结果来看,该指标的似然比检验(LRT)在整体上Ⅰ类错误控制均较好,检验效能较高;且实例分析显示LRT表现较优,故建议使用LRT进行统计推断。本研究所提指标统计性能较好,意义直观,便于应用。
[硕士论文] 张祥
应用统计学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:不同病理状态下的基因调控网络模式发生改变,表明其对应的基因连接关系已改变。本文尝试寻找那些连接关系改变的关键基因,以区分不同亚型的癌症。从研究历史文献发现,通常采用直接法和间接法来估计差异网络。当考虑到时间花度和预测精度时,我们一般选择直接估计法。由于样本数据较少,因而,这些差异网络估计法可能未能充分的利用其样本信息。基于此,文本提出采用Bagging算法集成直接估计法来估计差异网络,通过有放回的采样,增加了数据的多样性以及对数据的充分利用。在模拟数据上,将本文提出的模型与Dtrace模型进行对比分析,模拟实验结果显示本文提出的模型比Dtrace模型效果更优。在真实数据集分析,将我们的方法应用到不同亚型乳腺癌基因表达数据的分析上,采用稳定性选择算法选择调优参数,最后模型确定了5个关键基因。通过调查研究文献发现,本文找到的5个关键基因对区分不同亚型的乳腺癌有非常重要的作用。
[硕士论文] 覃宇禄
公共卫生 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:描述2010-2014年柳州市城区居民恶性肿瘤的发病和死亡状况;了解近年来柳州市城区居民恶性肿瘤疾病负担(DALYs)的变化趋势;分析比较不同年份、不同年龄组、不同性别恶性肿瘤疾病负担(DALYs)的差异;确定对柳州市城区居民造成主要疾病负担的恶性肿瘤,为相关部门的进一步决策提供依据。
  方法:收集2010-2014年柳州市恶性肿瘤发病和死亡的数据和柳州市公安局统计的人口数据资料,运用WHO提供的计算公式表,计算恶性肿瘤伤残调整寿命年及DALY率,估算恶性肿瘤的疾病负担。
  结果:2010-2014年肿瘤登记随访共覆盖城区人口5589637人,其中男性2836303人;女性2753334人。柳州市居民恶性肿瘤平均发病率为260.91/10万,发病率男性282.52/10万大于女性238.66/10万(X2=103.26,p<0.05)。标化发病率城中区(292.07/10万)最高,柳南区(238.15/10万)最低。柳州市恶性肿瘤发病率始终在较高水平维持着稳步增长(X2=109.147,p<0.05),男性和女性发病率趋势一致(男性:X2=25.330,p<0.05,女性:X2=101.617,p<0.05)。在30-34岁年龄组发病率开始明显上升,在55-59岁年龄组之后,男性发病率始终保持较高的增长速度,而女性发病率增速开始放缓,发病率峰值分别出现在80-84岁、75-79岁年龄组。恶性肿瘤发病率处于前五位的依次是气管、支气管与肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌,除乳腺癌外,主要恶性肿瘤的发病率男性均高于女性(X2分别为426.024、49.552、657.440、74.897,均为p<0.05)。性别不同,恶性肿瘤发病谱不同。男性发病率最高的是气管、支气管与肺癌(66.88/10万);结直肠癌、胃癌呈现逐年增长的趋势(X2分别为23.592、7.953,均为p<0.05)。女性发病率最高的是乳腺癌(54.12/10万);乳腺癌、子宫颈癌的发病率都出现上升趋势(X2分别为24.867、25.920,均为p<0.05)。
  柳州市居民恶性肿瘤平均死亡率为139.03/10万,男性179.74/10万大于女性97.08/10万(X2=687.57,p<0.05)。标化死亡率城中区(151.11/10万)最高;鱼峰区(129.54/10万)最低。柳州市恶性肿瘤死亡率一直维持着窄幅波动,男性死亡率的趋势同总死亡率一致,而女性死亡率在2011年之后一直-+*8*呈现上涨趋势(X2=6.290,p=0.012)。在30-34岁年龄组之后死亡率开始随着年龄增长而增加,在80-84岁年龄组出现峰值之后开始降低,其中女性死亡率与合计死亡率年龄别趋势大体一致,而男性死亡率始终随着年龄增长而升高。柳州市恶性肿瘤死亡率处于前五位的依次为气管、支气管与肺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌。除乳腺癌外,主要恶性肿瘤的死亡率男性均高于女性(X2分别为372.938、500.566、28.930、56.763,均为p<0.05)。性别不同,恶性肿瘤死亡谱不同。男性和女性死亡率最高的是气管、支气管与肺癌,分别为50.81/10万、19.98/10万。男性结直肠癌死亡率有增长趋势(X2=8.047,p=0.005)。女性前5位恶性肿瘤死亡率趋势不明显。
  2010-2014年柳州市恶性肿瘤DALY总共损失112289.26人年,其中男性损失70704.41人年,占62.97%;女性损失41584.85人年,占37.03%。恶性肿瘤损失的DALYs中,YLLs为110819.38人年,占98.69%;YLDs为1469.88人年,占1.31%。恶性肿瘤合计DALY率为20.09DALYs/千人,男性24.72DALYs/千人大于女性15.25DALYs/千人(WilcoxonW=15.00,P=0.008。各城区DALY率最大的是城中区21.66DALYs/千人,最小的是柳南区19.11DALYs/千人,各城区DALY率均为男性大于女性(Wilcoxon W=15.00,P=0.008)。不同年龄段恶性肿瘤的疾病负担不同。在30-59岁年龄组之后,疾病负担开始激增,在70+岁年龄组疾病负担达到顶峰,男性和女性变化趋势一致。柳州市恶性肿瘤疾病负担居于前五位的为气管、支气管与肺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌。性别不同,恶性肿瘤疾病负担顺位不同。男性气管、支气管与肺癌、肝癌、口和口咽部恶性肿瘤呈现缓慢下降趋势,2010-2014年分别降低了13.76%、23.61%、20.57%,结直肠癌和胃癌DALY率呈现缓慢上升趋势,2010-2014年分别上升了62.57%、14.20%。女性乳腺癌、结直肠癌呈现缓慢上升趋势,2010-2014年分别上升了39.05%、22.42%。在60-69岁年龄组之后,女性乳腺癌和男性肝癌、口和口咽部恶性肿瘤DALY率出现峰值后开始呈下降趋势。柳州市老年人(≥60岁)居民恶性肿瘤疾病负担是中青年人(<60岁)的5.53倍。气管、支气管与肺癌DALY率老年人(≥60岁)是中青年人(<60岁)的8.74倍。
  结论:柳州市恶性肿瘤疾病负担始终在一个范围内波动,平均疾病负担(20.09DALYs/千人)高于全国平均水平(18.10DALYs/千人)。恶性肿瘤疾病负担在30-59岁后开始激增,并随年龄增加而升高,老年人口的疾病负担显著大于中青年人群。疾病负担居于前五位恶性肿瘤为气管、支气管与肺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌。恶性肿瘤疾病负担男性大于女性,负担最重的都是气管、支气管与肺癌。需要进一步加强恶性肿瘤防治工作。
[硕士论文] 林慧霞
肿瘤学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是肝脏常见的恶性肿瘤。近年来,随着饮食习惯、生活方式的改变,中国肝癌发生率明显提高。调查显示,中国肝癌发病率位于肿瘤第三位,发病人数和死亡人数居世界首位,发病趋势逐年上升。乙型肝炎病毒感染是世界范围内的主要公共卫生问题,全球约20亿人曾感染过乙肝,每年死于乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌的约有100万人。乙肝是中国肝癌发生的主要危险因素之一。广西是乙肝高发区,乙肝感染者肝癌发生率为非乙肝者的25~37倍。肝癌高危人群队列研究追踪随访可明显提高早诊率。高危人群通过定期体检筛查早期发现肝癌,能获得早期治疗的机会,从而提高预后。高危人群队列研究在阐明肝癌发病危险因素、肝癌早诊早治、发现早诊标记物等方面发挥了重要作用。质量控制是肝癌高危人群队列研究的重要部分,是确保研究结论客观真实的关键。随着时代发展、社会需求及疾病谱的改变,大健康理念应运而生,全民普及健康知识,转变全民健康观念。肝癌高危人群队列研究正是契合了这一理念。
  目的:①在原有研究基础上,继续完善广西社区肝癌高危人群队列随访复查工作;②完善本现场队列研究的质量控制方法,为研究的可持续发展提供更加科学合理的参考依据;③完善队列标本库建设,为人类基因组多态性和肝癌遗传关联性研究提供血液标本和研究资料;④在随访中加强癌症早诊早治宣传,动员高危人群积极复查,增强居民健康知识水平。
  方法:本研究的主要方法是在肝癌高危人群队列前期筛查与随访研究的基础上,继续做好队列人群随访工作,以便在早期发现肝癌患者,并收集血液标本。结合当地居民的健康体检,队列人群每年进行一次体检随访,检测项目包括乙肝两对半、肝功能、甲胎蛋白(AFP)定性和肝脏B超等;若受检者AFP阳性而肝脏B超检查无明显异常,则建议其一周后行AFP定量复查;若受检者B超检查提示有实质性占位,建议其进一步行CT等检查排除诊断;若是发现肝癌确诊病例,立即进行癌症登记工作,做好后续追踪随访工作。研究对象采集静脉血,分离其血浆和血细胞后置于-20℃冰箱,作为队列的血样标本保存。
  结果:1、(1)2015年筛查出1232例高危人群,其平均年龄为37.47±11.11岁,中位年龄38岁;2016年筛查出1115例高危人群,其平均年龄38.02±10.75岁,中位年龄38岁。队列人群年龄段主要集中在20~49岁之间,2015年高危人群年龄构成与2016年相似,各年龄段构成比相对稳定。2016年随访中,肝癌高危人群主要集中在40~49年龄段,较初筛时年龄高峰出现后移趋势。(2)2015年筛查出肝癌高危人群1232例,男性988例,女性244例,阳性率8.80%。其中,AFP阳性者12例;ALT升高者213例,最高值909U/L;AST升高者29例,最高值415U/L;ALT与AST同时升高者165例,B超检查结果异常者308例。(3)2016年筛查出肝癌高危人群1115例,男性914例,女性201例,阳性率8.45%。2015年筛查出的高危人群1232人中,有905人参与本次复查,复查率73.46%。本次新增高危人群237例,目前队列人群增至2571例。2010年初筛的高危人群946人中有505人参与此次复查,复查率为53.38%,在这946人中,192人参与2011年~2016年所有复查,基础队列规范化参与随访的依从性为20.29%。(4)2016年筛查出1115例高危人群当中,AFP阳性者15例,ALT升高者249例,最高值841U/L;AST升高20例,ALT与AST同时升高者165例;B超检查结果异常者281例。(5)2015年、2016年筛查出的高危人群的乙肝两对半结果以HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)为主。
  2、2015年随访未检出新发肝癌患者;2016年检出1例确诊早期肝癌患者,该患者自2010年进入队列以来,每一次复查均有参加。截至2016年12月,队列共检出临床确诊肝癌患者10例,其中早期肝癌7例,晚期肝癌3例;7例出现异常肝脏B超检查结果。10例肝癌患者确诊当次的ALT、AST、TBIL水平较确诊前升高,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。
  3、自2010年~2014年本研究已收集血液标本6021份,相关资料完整。2015年收集血细胞1163份,血浆1163份,血清1132份。2016年收集血细胞1093份,血浆1092份,血清1299份。血样整体质量良好,能够满足实验室检测要求。
  4、本研究制定并执行完整的标准化质量控制文件,确保现场工作有序进行。
  结论:1.对比初筛,队列人群年龄出现后移趋势,人口构成基本保持稳定。2.基础队列人群在2015年、2016年的复查依从性较好。3.目前队列发现肝癌确诊患者10例,男性发病人数高于女性。肝功能检测与肝脏B超检查对早期肝癌筛查具有良好的辅助作用。肝功能检测与肝脏B超对早期肝癌诊断具有良好的辅助作用。2016年随访发现1例新发早期肝癌患者,按要求参与规范化随访,证明高危人群定期随访在肝癌早诊早治方面发挥了重要作用。4.通过对队列标本库的完善,充分利用本地医疗资源,为下一步研究提供坚实基础。5.质量控制标准有助于队列工作的顺利开展。
[硕士论文] 何鹏
凝聚态物理 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:生物分子间的相互作用及其规律的研究是现代分子生物学研究的一个重要领域。从分子生物实验出发,研究分子间相互作用机理的系统生物学,有助于人们认识许多复杂疾病、动植物的寿命、生命周期节律等重要生命现象的本质。系统生物学中关于基因调控网络重构和功能预测是具有挑战性的课题之一。
  MicroRNA(miRNA)作为真核生物中普遍存在的一类重要的非编码RNA,大量的生物学实验研究表明:miRNA转录后抑制靶基因表达功能,在生物发育、细胞衰老与凋亡、癌症发生及转移等方面都起到了重要的作用。因此,对具有miRNA调控的基因网络动力学进行研究,在实验和理论上都有重要意义。
  基于已有的关于细胞周期、肿瘤细胞EMT/MET过程中基因调控网络的研究,本文主要考虑miRNA的作用、生化噪声、相互作用时间延迟分别对这两个生物过程的影响,建立起了相应的非线性动力学。本文的主要研究结果如下:
  (1)考虑MiR-17-92对细胞周期中Rb-E2F基因调控网络的作用,改进了此网络构建起了由Rb-E2F-CycE基因回路、E2F基因自激活回路两个正反馈环、E2F-miR-17-92负反馈环、转录因子Myc直接上调miR-17-92的非一致前馈环,这四个功能环组成的Rb-E2F-miRNA调控网络,并建立起该网络基因相互作用非线性动力学。研究表明:miR-17-92的调控会很大程度的延缓细胞G1至S期进程,使得细胞处于静止期的时间更长。而且调节miR-17-92对E2F的抑制率导致的延时效果比调节Myc对miR-17-92的产生率更加明显。噪声情况下,发现miR-17-92的加入可以使细胞有更大的概率处在静止期,从而维持网络的鲁棒性。通过对不同调控途径的动力学分析,发现miRNA的加入不会改变系统的双稳性质。但调节miR-17-92对E2F的抑制率、Myc对miR-17-92的产生率会出现实验中的miRNA“靶标回避”现象,此现象与miRNA和E2F表达的关联性有关,这可能为miR-17-92抑癌和致癌的双重角色提供了新的理论解释。
  (2)针对细胞EMT过程的[miR-34/SNAIL]:[miR-200/ZEB]调控网络,提出了一个简化模型。研究表明:该简化模型可以很好地重现实验中发现的肿瘤细胞EMT和MET过程,并从动力学机制上解释了肿瘤细胞的E/M混合表型在转换中的不对称性,即E/M混合态只出现于EMT过程。噪声存在时的数值模拟结果表明:在三稳表型态下,噪声会导致肿瘤细胞从E表型转换到M表型,从而增加了肿瘤细胞的转移性和侵袭性,并且发现混合表型有一定的噪声抵抗能力。此外,通过噪声和时滞同时存在时的研究发现,噪声会导致ZEB的高表达,而时滞则会削弱这种影响,将ZEB维持在低表达水平,表明二者之间存在一种竞争效应。这些结论可能为肿瘤的临床治疗提供新的思路。
[硕士论文] 夏健雄
外科学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:背景及目的:
  胃癌(Gastric Cancer,GC)是最常见的恶性肿瘤之一。根据GLOB OCAN2012统计数据估计[1],2012年新发胃癌病例约951000例,位居世界第五大恶性肿瘤,其中约一半的病例发生在东亚,而中国则又属于主要的发病地区;死亡病例约723000例,在癌症所致死因中排列第三。目前胃癌的治疗方式,是基于外科手术的综合治疗。淋巴结转移常被作为评估胃癌患者预后的重要指标[2]。在第4版日本《胃癌治疗指南》中指出[3]:标准胃癌根治术应包括D2淋巴结清扫,目前此观点已被广泛接受。近年来研究发现[4],脾门淋巴结转移率约为9%~27.9%,那么脾门淋巴结(No.10淋巴结)作为胃中上部癌的第2站淋巴结在术中的清扫则显得至关重要,但脾脏位置深、质地脆,脾动脉与胰尾的关系复杂、解剖变异多,手术操作空间狭小,加之出入的血管、淋巴管、脂肪结缔组织的影响,在清扫过程中极易造成血管、脾脏损伤,甚至引起难以控制的大出血或脾梗死等并发症。此外,目前尚不推荐预防性脾切除以达到彻底清扫脾门淋巴结的目的,而保脾清扫难度较大,因此国内外学者开始研究脾门淋巴结转移的危险因素及其清扫是否存在必要性,力求在尽量降低手术创伤及并发症的基础上,使患者在远期生存中获益[5],[6]。据文献报道[7],脾门淋巴结的转移与肿瘤大小、部位、浸润深度、No.4sb淋巴结转移有关,建议依其规律对转移风险较高者,行彻底的脾门淋巴结清扫;另有学者在对82例标准D2胃癌根治术全胃切除的患者研究中发现,肿瘤横向部位、Borrmann分型、T分期、TNM分期是脾门淋巴结转移的高危因素,建议对大弯侧、Bormann分型Ⅲ~Ⅳ型、T3或T4期、Ⅲ或Ⅳ期的中上部胃癌常规行脾门淋巴结清扫[8];而Zhu等[4]研究发现pT分期、pN分期及远处淋巴结转移是脾门淋巴结转移的独立危险因素,但对于存在脾门淋巴结转移的患者而言,R0切除组与R1-R2切除组的生存时间无明显差异,考虑将其认为是不可治愈的因素,那么对脾门淋巴结清扫必要性则需进一步探究。总之,目前关于脾门淋巴结转移及清扫的相关研究尚无确切定论,通过检索近年来的相关文献发现,对脾门淋巴结转移危险因素的研究多以临床转移为判断标准,但考虑脾门淋巴结微转移也存在发展为临床转移的趋势,若忽视这种潜在可能性,则可能影响患者的远期生存。因此,本研究以微转移为判断标准,分析脾门淋巴结转移的相关危险因素,探讨脾门淋巴结的清扫指征。
  方法:
  收集西南医科大学附属医院胃肠外科2013年6月~2018年1月76例因胃中上部癌行标准D2胃癌根治术常规脾门淋巴结清扫患者的临床病理资料。对76例研究对象的脾门淋巴结行常规病理学检测确定是否存在临床转移,对临床转移阴性患者的脾门淋巴结采用免疫组化SP法,选取鼠抗人细胞角蛋白(CK19、CK20)单克隆抗体检测微转移。将存在脾门淋巴结临床转移和微转移者均纳入脾门淋巴结转移组,反之,则为阴性转移组,分析其相关危险因素,探讨脾门淋巴结清扫的手术指征。
  结果:
  1、单因素分析显示脾门淋巴结转移与肿瘤部位(包括横向及纵向部位)、Borrmann分型、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、脉管浸润、神经侵犯及No.1、No.3、No.4sa、No.7、No.11淋巴结的转移状态无关(P>0.05)。
  2、Logistic回归分析提示肿瘤纵向部位、浸润深度、NO.4sb淋巴结转移是影响脾门淋巴结转移的独立危险因素(P<0.05)。当肿瘤位于胃底贲门部、侵犯浆膜、No.4sb淋巴结转移时,提示脾门淋巴结转移风险较高。
  结论:
  1、肿瘤纵向部位、浸润深度及No.4sb淋巴结转移是脾门淋巴结转移的独立危险因素。
  2、建议对位于胃底贲门部、侵犯浆膜(T4期)、No.4sb淋巴结转移的胃中上部癌常规行脾门淋巴结清扫。
[硕士论文] 刘溪
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  通过研究PDLIM5在前列腺癌组织及细胞系中的表达水平,验证PDLIM5在前列腺癌中的异常高表达。筛选高表达PDLIM5细胞株进一步进行生物功能学实验,以探索PDLIM5介导肿瘤发生及转移的生物学功能及调控机制。
  方法:
  (一)PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证
  收集Oncomine、PROGGENE数据库中的前列腺癌样本中PDLIM5表达、转移及预后相关信息,验证PDLIM5在癌和正常腺体中的表达差异,明确高表达PDLIM5与PCa转移预后的相关性。进一步收集长征医院泌尿外科前列腺癌根治术后临床组织样本44例,运用免疫组织化学染色法检测癌和癌旁组织标本明确PDLIM5组织表达水平。
  (二)前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证
  在PCa常见细胞系中通过Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表达情况,选取高表达PDLIM5的转移性PCa细胞株DU145和PC-3作为后续实验对象,构建包含靶向干扰PDLIM5的质粒的慢病毒进行细胞感染。观察质粒上的报告基因荧光强度,并分别在mRNA及蛋白水平验证PDLIM5的敲减效率,确认沉默PDLIM5的细胞株构建成功。
  (三)检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响
  在稳定沉默PDLIM5的DU145和PC-3细胞中,通过MTT比色法、克隆形成试验来评估肿瘤细胞增殖能力的变化;通过细胞流式术检测细胞周期及凋亡水平变化以明确PDLIM5敲减后对肿瘤细胞的周期阻滞及诱导凋亡作用;通过划痕愈合实验及TRANSWELL实验来检测PDLIM5对肿瘤迁移侵袭的影响。
  (四)PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究
  根据细胞表型相关实验结果及数据库信息分析,PDLIM5对肿瘤细胞的转移侵袭能力具有显著影响。首先在PDLIM5沉默状态下通过Western Blot和qPCR对上皮细胞-间充质转化(EMT)相关分子进行了检测,随后通过构建过表达质粒,在同种细胞株中过表达PDLIM5,检测EMT相关分子表达回复情况,并分别在PDLIM5敲减及过表达两种情况下对前列腺骨转移相关分析因子进行检测。最后通过免疫共沉淀,确定PDLIM5与AMPK的相互作用并对敲减PDLIM5后AMPK磷酸化水平进行检测,探索PDLIM5-AMPK-EMT的调控机制。
  (五)动物实验研究PDLIM5在体内功能作用
  使用沉默PDLIM5的DU145细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,观察体内环境下PDLIM5敲减后对细胞成瘤及增殖能力的影响。随后将取瘤体组织进行裂解,通过Western Blot对PDLIM5蛋白表达水平进行检测,明确PDLIM5的沉默效率并检测AMPK、EMT相关信号通路分子表达变化,明确在动物实验中PDLIM5对细胞增殖转移的调控机制。
  结果:
  1.发现PDLIM5在PCa组织中异常高表达,并且与PCa生化复发与生存期相关。通过免疫组化及生物信息学分析方法,确认PDLIM5在PCa中较正常前列腺组织表达水平升高,且深入分析数据库芯片资料发现异常高表达的PDLIM5与预后不良因素如:转移、高Gleason评分及TMN分期相关。同时,通过多因素分析及生存分析发现高表达PDLIM5是PCa生化复发的独立危险因素并导致患者总生存率下降。
  2.成功建立稳定沉默PDLIM5的DU145及PC-3细胞株,通过相关细胞学实验发现沉默PDLIM5可导致前列癌细胞恶性增殖、克隆形成、侵袭转移能力受抑制,并可诱导G2/M阻滞和细胞凋亡的发生。
  3.检测PDLIM5敲减后上皮-间质转化(EMT)相关分子表达水平,通过Western Blot及qPCR发现人紧密连接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出现不同程度下调,而EMT关键分子E-cadherin表达量上升,证实EMT过程受到抑制。
  4.在DU145及PC-3细胞中过表达PDLIM5可以在一定程度上通过上调SNAIL的表达,从而使及关键分子E-cadherin表达量下降,证实PDLIM5对细胞侵袭和转移的影响与EMT密切相关。同时在细胞实验中检测已知促进前列腺癌骨转移的相关分子,如结缔组织生长因子(CTGF),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。qPCR结果显示,沉默PDLIM5后,PC-3细胞中这些促肿瘤转移因子的表达显着下调。当PDLIM5过表达时,这些分子的表达水平出现上调,且在DU145细胞中也观察到类似的结果,进一步证实PDLIM5在促进肿瘤转移中起作用
  5.免疫共沉淀确定PDLIM5可与AMPK相结合,敲减PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。随后通过放线菌素阻断上游蛋白质合成,在给药后不同时间点检测AMPK蛋白水平,结果发现PDLIM5沉默组AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通过维持AMPK的稳定性,使AMPK通路持续性激活,从而促进前列腺癌的恶性增殖及转移。
  6.裸鼠成瘤实验证明在体内条件下,沉默PDLIM5可抑制肿瘤细胞生长。通过组织蛋白水平检测,在动物实验中PDLIM5同样可通过AMPK-EMT相关通路对前列腺癌细胞增殖及转移进行调控。
  结论:
  本研究证实了PDLIM5表达水平在PCa组织中发生上调,表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通过生物信息学分析探索PDLIM5与PCa复发和转移的关系,表明高表达PDLIM5是前列腺癌预后不良的相关因素。此外,细胞和动物实验都表明,PDLIM5通过激活AMPK通路可以促进癌细胞的增殖并增强EMT介导的侵袭和转移。探索PDLIM5相关相关通路及作用靶点可能有助于丰富PCa的进展和转移机制,并为mCRPC患者带来新的治疗策略。
[硕士论文] 董梦莹
影像医学与核医学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  探讨ELAM-1(Endothelial leukocyte adhesion molecule-1)在裸鼠鼻咽癌移植瘤、转移灶,包括淋巴结转移灶及远处转移灶中的表达,并进一步确定ELAM-1是鼻咽癌转移的重要分子标志物。
  方法:
  1、细胞培养,将鼻咽癌细胞株SUNE1-亚株5-8F细胞用1640培养基、胎牛血清及青链霉素混合液配置成的完全培养液置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养,每天观察细胞生长状态,适时更换培养液及进行细胞传代,适时冻存多余细胞;用六孔板分别将细胞培养0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h,计数每个时间点的细胞个数,绘制细胞生长曲线。
  2、Balb/c雌性裸鼠共16只,移植癌细胞前分别称取每只裸鼠的体重,在裸鼠左侧后爪爪垫注射处于对数生长期的鼻咽癌细胞悬浮液20μL(瘤细胞约为2×106个),之后每日观察裸鼠生长情况,于接种后8周常规麻醉,处死全部裸鼠,详细解剖检查,测量肿瘤的大小,观察肿瘤以及转移情况,所有标本经福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片,做HE染色及免疫组化染色。
  3、用HE染色观察各病理组织并判断各组织中是否出现转移灶,实验分组:根据是否出现转移癌,将裸鼠分为转移组和非转移组。
  4、用方差分析比较转移组和非转移组裸鼠初始体重的差异。
  5、用免疫组织化学法检测ELAM-1在裸鼠鼻咽癌移植瘤、淋巴结转移灶及远处转移灶中的表达。用image J软件定量分析ELAM-1在各组间表达情况。
  结果:
  1、所培养的细胞均生长状态良好;16只裸鼠均种瘤成功,且裸鼠在荷瘤期间生命体征均正常,生长状态良好。
  2、解剖裸鼠,所有组织经福尔马林固定包埋及切片后,共得到27个蜡快,81片切片,HE染色后发现,共10只裸鼠发生转移,为转移组,成功建立了人鼻咽癌裸鼠移植瘤转移模型;其中7只仅淋巴结转移,1只仅腹盆腔转移,2只既发生淋巴结转移又出现腹盆腔转移灶。另6只未见转移灶,为非转移组。
  3、ELAM-1在所有裸鼠鼻咽癌移植瘤、淋巴结转移灶及远处转移灶中的表达均为阳性;其中,非转移组瘤组织均为弱阳性,转移组瘤组织中4例为强阳性、6例为阳性。HE染色显示鼻咽癌细胞的胞核为深蓝色,具有显著的异形性,胞浆及周围的纤维组织呈现深浅不一的红色。正常的淋巴结组织呈圆形或椭圆形,其周围为一层粉红色被膜,被膜下方的深蓝色部分为皮质,中央浅色部分为髓质;转移淋巴结的HE染色显示,在正常的淋巴组织中可见散在大小不等癌巢,部分转移灶中出现坏死。
  4、转移组与非转移组裸鼠初始体重差异无统计学意义(P>0.05)
  5、转移组ELAM-1的表达高于非转移组,且两组间表达的差异有统计学意义(P<0.05);
  结论:
  ELAM-1在鼻咽原发癌、转移癌中高表达,且与鼻咽癌的转移密切相关,是鼻咽癌转移的重要分子标志物。ELAM-1对鼻咽癌及转移灶的监测及临床治疗以及患者预后的评价等可提供参考,有望为以后研发出检测鼻咽癌早期转移的靶向造影剂、靶向药物等提供动物模型实验思路。
[博士论文] 汤雨潇
劳动卫生与环境卫生学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究通过比较肝癌转移患者与未转移患者的肝癌组织铁含量,以及体内外实验明确缺铁与肝癌转移的关系和机制,为系统了解肝癌铁代谢特点及其在肝癌细胞转移中的作用,同时为今后肝癌转移防治措施的完善,尤其是铁螯合剂在肝癌治疗中的应用提供科学依据。
  方法:
  一、肝癌组织铁含量的检测
  1.磁共振成像检测铁含量
  采用GE Signa HDx1.5T MR扫描仪对肝癌患者进行术前扫描,按设定参数扫描后利用自带的工作站软件建立R2*图,随后在R2*图手动标出目标区域,通过软件分析得到R2*值。
  2.火焰原子吸收法检测组织铁含量
  剪下适量组织,烘干后称重,置于玻璃消化管中,加入1ml硝酸和高氯酸混合酸(硝酸/高氯酸=1/4)。放入高温消化炉消化至组织溶解,溶液澄清,随后定容至10ml,作为待测液。以铁标准贮备液(100μg/mL)为标准品配置标准曲线测定液,随后与待测样本同时进原子吸收分光光度计检测,根据标准曲线计算出溶液中铁含量,再比上各组织重量得到组织中铁含量(μg/g)。
  二、细胞实验
  1.细胞培养与处理
  Huh7细胞和HepG2细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养液中,SMMC-7721细胞和H22细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液中。DFO的使用浓度为100μM,Dp44mT的使用浓度为10μM,处理时间为24小时。HIF1α抑制剂PX478的使用浓度为20μM,SP1抑制剂Mithramycin A的使用浓度为100nM,在添加铁螯合剂的同时加入培养液中。
  2.原代肝细胞提取
  人原代肝细胞购于Sciencell公司并附鉴定报告。小鼠原代肝细胞提取:消化酶灌流后取出肝,重悬细胞过400目筛网过滤,随后通过Percoll分离液分离细胞,转移细胞至细胞培养瓶培养并洗去未贴壁细胞。
  3.细胞增殖检测
  采用ThermoFisher Click-iT(@)Plus EdU Alexa Fluor(@)488Flow Cytometry Assay Kit检测细胞增殖。
  4.细胞迁移侵袭实验
  采用transwell小室定性检测肝癌细胞迁移能力,采用Cell Biolabs迁移能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞迁移能力变化。侵袭能力定性检测采用预包被基质胶的transwell小室,采用Cell Biolabs侵袭能力检测试剂盒定量分析缺铁作用下肝癌细胞侵袭能力变化。
  5.细胞转染
  采用lipo3000进行siRNA转染,siRNA浓度为100μM,lipo3000用量及操作参照试剂说明书,隔天换液,转染48小时后进行后续操作。
  6.荧光素酶标记
  细胞荧光素酶标记使用荧光素酶标记试剂盒(上海中乔新舟,货号A1001-8),该试剂盒内含慢病毒介导的萤光素酶标记液及辅助感染的polybrene,通过CAG启动子过表达萤光素酶从而作为报告基因,感染后可在细胞中稳定表达。
  7.细胞TFRC基因敲降
  使用携带TFRC shRNA的慢病毒敲降Huh7细胞和H22细胞的转铁蛋白受体,将shRNA序列克隆进pLVX-shRNA1慢病毒载体后进行包装和生产,得到病毒感染液后感染细胞并筛选稳定细胞系进行后续成瘤实验。
  8.荧光淬灭法检测细胞内铁含量
  使用Phen GreenTM FL试剂(Thermo Fisher)检测细胞内铁含量。细胞内二价铁与荧光试剂结合使其荧光淬灭,通过荧光显微镜观察细胞内荧光强度定性检测细胞内铁含量的变化。
  9.转录因子活性芯片
  DFO干预Huh7细胞24h后提取核蛋白,与对照组核蛋白一起分别与TranSignalTM Protein/DNA Array试剂盒中345种特异性与转录因子结合的探针孵育结合,随后洗去未结合的探针,接着分离探针/核蛋白复合体得到探针,与transignal芯片杂交,检测每种探针产生的信号变化,以此反应各探针对应的转录因子结合活性的变化。
  10.染色质免疫共沉淀
  采用CST的酶解法染色质免疫共沉淀试剂盒检测三种转录因子HIF1α、SP1和YY1对SPNS2转录活性的变化
  。
  结果:
  一、肝癌转移患者癌组织铁含量显著低于未转移患者
  1.与正常组织或癌旁组织相比,肝癌组织铁含量下降
  10例肝癌患者肝癌组织的R2*值显著低于癌旁组织和远处正常肝组织的R2*值。由于R2*值与铁含量呈正相关,提示肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  火焰原子吸收法定量检测29位肝癌患者手术标本癌旁组织和癌组织,发现肝癌组织铁含量显著低于癌旁组织,与磁共振扫描的结果一致。
  与癌旁组织相比,肝癌组织铁稳态分子TFRC、HAMP、Ferritin的表达显著改变,符合肝癌组织缺铁的表现。上述结果表明,肝癌组织铁含量低于癌旁组织及正常肝组织。
  2.发生转移肝癌患者的癌组织铁含量显著低于未发生转移肝癌患者
  收集术后5年内发生转移复发的肝癌患者15例,未发生转移复发患者15例,通过检测手术标本(5年前首次手术的标本)的铁含量及铁稳态分子表达,发现发生转移的肝癌患者其肝癌组织铁含量显著低于未发生转移的肝癌患者,提示铁含量下降在肝癌转移中可能发挥一定作用。
  二、体内外实验证实缺铁促进肝癌细胞转移
  1.缺铁抑制人肝癌细胞增殖,但促进人肝癌细胞迁移和侵袭
  通过添加DFO(100μM)和Dp44mT(10μM)两种铁螯合剂造成细胞缺铁模型。采用EdU标记方法观察缺铁对三种人肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721增殖的影响,结果发现缺铁时三种肝癌细胞增殖均受到显著抑制。
  但是,定性及定量检测结果显示,在两种铁螯合剂的作用下,Huh7、HepG2、SMMC-7721三种肝癌细胞均表现出显著的迁移侵袭增强。
  2.缺铁促进人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内转移
  2.1系统性缺铁模型
  在体内缺铁是否促进肝癌转移尚不清楚。首先通过给裸鼠喂食缺铁饲料造成裸鼠系统性缺铁模型,观察人肝癌细胞Huh7在裸鼠体内的转移情况。通过检测肝组织、肺组织铁含量和血清铁含量、铁蛋白含量、转铁蛋白饱和度等指标以及免疫荧光检测肝组织、肺组织的铁蛋白表达,确认喂食缺铁饲料后裸鼠缺铁模型制作成功。
  为了更好地观察肝癌细胞在体内转移的情况,采用活体成像技术定期观察肝癌细胞在体内的生长、扩散。Huh7细胞进行荧光素酶标记(Huh7-fluc),扩增到足够数量后通过肝脏原位种瘤和尾静脉注射种瘤两种方式进行体内荷瘤实验。每10天进行一次活体成像拍照,并利用软件分析肝癌细胞在体内的增殖数量与转移面积。结果发现,与正常组相比,在两种荷瘤模型中缺铁组均表现出明显的肝癌细胞转移范围增大和肺部转移增强。提示缺铁会促进Huh7细胞的体内转移。
  2.2肝癌细胞(Huh7)缺铁模型
  为了更贴合人肝癌组织铁含量下降而整体并不缺铁的情况,通过敲降Huh7细胞转铁蛋白受体,限制其摄入铁的能力而造成细胞内缺铁。检测TFRC mRNA表达和TfR1蛋白表达显示,敲降Huh7-fluc细胞TfR1成功,同时细胞内铁含量低于未敲降组。
  Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞与Huh7-fluc细胞扩增足量后以同样细胞量通过原位种植和尾静脉注射两种方式进行裸鼠荷瘤实验,敲降组与未敲降组裸鼠喂食同样的正常饲料。相比于Huh7-fluc细胞,Huh7-fluc-TFRCknockdown细胞在裸鼠体内转移显著增强,肺部转移显著。
  3.缺铁促进小鼠肝癌细胞H22在C57小鼠体内转移
  系统性缺铁模型
  为了排除免疫系统缺陷对肝癌细胞转移的影响,在C57小鼠体内种植小鼠肝癌细胞H22,观察缺铁对H22在体内转移的影响。通过检测铁相关指标,确认喂食缺铁饲料后C57小鼠系统性缺铁。
  同样,H22细胞标记荧光素酶(H22-fluc)后,以肝原位种瘤和尾静脉注射两种方式荷瘤。活体成像拍照分析结果显示缺铁组小鼠比正常组小鼠成瘤面积大,肺部转移肿瘤面积增大。
  结论:
  本研究通过检测肝癌转移患者和未转移患者癌组织铁含量,并在整体和细胞水平制作多种缺铁模型,观察缺铁对肝癌细胞转移的作用及其机制。从所取得的实验结果上得出以下结论:
  1.发生转移肝癌患者癌组织铁含量明显降低;
  2.在体内和体外,缺铁均促进肝癌细胞转移;
  2.SPNS2上调是缺铁促进肝癌细胞转移的关键环节;
  3.HIF1α和SP1在缺铁引起SPNS2上调中发挥重要作用。
[硕士论文] 房芳
口腔颌面外科学 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨从人新鲜口腔鳞癌组织中培养鳞癌细胞的方法以及应用免疫磁珠和流式细胞分离技术分离与鉴定口腔鳞癌干细胞的方法。
  方法:1.取自广西医科大学附属口腔医院2016-2017年行口腔鳞状细胞癌切除术的患者新鲜肿瘤标本6例,经抗污染处理,应用机械法获得原代口腔鳞癌细胞并用酶消化法传代。2.应用细胞形态学及免疫组化角蛋白抗体染色方法对原代鳞癌细胞进行鉴定。3.流式细胞仪检测原代鳞癌细胞中CD133、CD44的表达情况并用免疫磁珠法分选出相应CD133+、CD44+细胞,并鉴定其分选效果。4.流式细胞仪检测分选前后细胞的细胞周期测定。5.将口腔鳞癌细胞及其分选出的亚群细胞进行成骨、成脂细胞诱导分化。6.将原代培养的肿瘤细胞及分选出的CD133+、CD44+细胞亚群培养注射入裸鼠体内,进行体内成瘤实验,观察其成瘤情况。7.将移植瘤组织行HE染色,观察其组织病理改变。
  结果:1.成功培养出纯化的口腔鳞癌细胞,并能成功传代。2.通过细胞形态学能够体现口腔鳞癌细胞的生物学特点,角蛋白在OSCC胞浆中见棕色染色呈阳性。3.流式细胞检测鳞癌细胞中干细胞表面标志物CD133的平均表达率为0.41%、CD44的平均表达率为33.76%。4.通过免疫磁珠法分选出的CD44+细胞、CD133+细胞经流式细胞检测纯度均在94%以上,细胞周期检测处于G0/G1期。5.成功将口腔鳞癌细胞、CD44+细胞、CD133+细胞诱导分化成成骨细胞及成脂细胞。6.皮下注射后第3天可在裸鼠接种区域触及新生肿物,CD133+细胞组瘤体体积最大,CD44+细胞组次之,未分选口腔鳞癌细胞组最小,成瘤组织HE染色中,皆明显可见大量癌组织,其恶性程度由高到低依次为CD133+细胞组、CD44+细胞、未分选口腔鳞癌细胞。
  结论:从人新鲜口腔鳞癌标本中利用机械法可成功获得大量原代口腔鳞癌细胞并能顺利传代,口腔鳞癌细胞中干细胞表面标志物CD44表达偏高,CD133的表达量明显偏低。通过免疫磁珠法可以成功分选出高纯度的CD133+细胞、CD44+细胞,是一群长期处于细胞周期的G0/G1期,高成瘤性的细胞,口腔鳞癌细胞、CD44细胞、CD133细胞不仅具有分化成成骨、成脂细胞的能力,且CD133细胞分化能力强于CD44细胞强于口腔鳞癌细胞;CD133+细胞不仅成瘤性要强于CD44+细胞组,而且其移植瘤的恶性程度要高于CD44+细胞组,具有更强的干细胞特性。
[博士论文] 周琛斐
妇产科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本文的主要内容是着重探讨了TWIST2是否通过靶向调控miR-221-3p进而介导了宫颈癌的EMT,促进淋巴结转移。同时探讨了miR-221-3p进一步调控宫颈癌EMT的具体分子机制。这为理解宫颈癌发生EMT进而转移提供了一定的理论基础,也为寻找宫颈癌潜在的治疗靶基因提供了一定的帮助。
  内容与方法:
  1.TWIST2调控宫颈癌细胞发生EMT进而促进其淋巴结转移
  (1)设计并构建稳定过表达TWITS2慢病毒载体并进行宫颈癌细胞转染,运动荧光定量PCR和Western blot检测转染效率。选取稳定过表达TWIST2的宫颈癌细胞进行后续实验。
  (2)划痕实验和Transwell侵袭实验检测TWIST2对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。
  (3)腘淋巴结转移模型验证TWIST2对宫颈癌细胞淋巴结转移的影响。
  (4)荧光定量PCR和Western Blot检测TWIST2对宫颈癌细胞EMT相关蛋白表达的影响。
  2.TWIST2通过上调miR-221-3p转录进而促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭
  (1)miRNAs芯片检测稳定过表达TWIST2后的Siha细胞中表达变化的miRNAs,并用荧光定量PCR验证和寻找差异表达显著的miRNA-221-3p进行后续研究。
  (2)生物信息学分析TWIST2可以结合miR-221-3p的启动子区域,双荧光素酶报告基因检测TWIST2与miRNA-221-3p启动子的直接结合并能促进其转录。
  (3)设计并构建miR-221-3p稳定过表达慢病毒载体并运用荧光定量PCR进行验证。
  (4)划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-221-3p对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。
  (5)腘淋巴结转移模型验证miR-221-3p对宫颈癌细胞淋巴结转移的影响。
  (6)荧光定量PCR和Western Blot检测miR-221-3p对宫颈癌细胞EMT相关蛋白表达的影响。
  (7)划痕实验和Transwell侵袭实验验证TWIST2通过直接调控miR-221-3p进而影响宫颈癌细胞的体外功能。
  (8)荧光定量PCR和Western Blot检测TWIST2通过调控miR-221-3p进而影响EMT相关蛋白表达。
  3.miR-221-3p直接靶向调节THBS2进而影响宫颈癌细胞的功能
  (1)生物信息学预测THBS2可能为miR-221-3p的下游靶基因,双荧光素酶报告基因验证miR-221-3p可以直接结合THBS2的3'-UTR区域进而抑制其表达。并采用荧光定量PCR和Western blot验证过表达和沉默miR-221-3p后对THBS2表达的影响。
  (2)划痕实验和Transwell侵袭实验检测THBS2对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。
  (3)荧光定量PCR和Western Blot检测THBS2对宫颈癌细胞EMT相关蛋白表达的影响。
  (4)划痕实验和Transwell侵袭实验验证miR-221-3p通过直接调控THBS2进而影响宫颈癌细胞的体外功能。
  (5)荧光定量PCR和Western Blot检测miR-221-3p通过直接调控THBS2进而影响EMT相关蛋白表达。
  4.TWIST2-miR-221-3p-THBS2信号通路在临床组织标本中的表达和分析
  (1)荧光定量PCR和免疫组化检测TWIST2和THBS2在10例正常宫颈组织、23例不伴淋巴结转移的宫颈癌组织和22例伴淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达水平。
  (2)荧光定量PCR和原位杂交检测miR-221-3p在10例正常宫颈组织、23例不伴淋巴结转移的宫颈癌组织和22例伴淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达水平。
  (3)统计分析宫颈癌临床样本中TWIST2、miR-221-3p、THBS2之间的表达相关性。
  结果:
  1.TWIST2调控宫颈癌细胞发生EMT进而促进其淋巴结转移
  成功构建稳定过表达TWIST2的Siha(Siha-TW2)和Hela(Hela-TW2)细胞株。随后运用划痕实验和Transwell侵袭实验检测稳定过表达TWIST2后对宫颈癌细胞体外迁移和侵袭的作用。划痕实验结果表明,与对照组相比,Siha-TW2和Hela-TW2的迁移率明显增高(P=0.005;P=0.003);Transwell侵袭实验结果显示,与对照组相比,Siha-TW2和Hela-TW2的穿膜细胞数显著增多(P<0.001;P=0.003)。
  采用腘淋巴结转移实验检测稳定过表达TWIST2后对宫颈癌细胞体内淋巴结转移的作用。
  结果表明,与对照组相比,Siha-TW2和Hela-TW2的腘淋巴结转移率明显增高(33.3%vs.83.3%;16.7%vs.66.7%)。
  采用荧光定量PCR和Western blot检测稳定过表达TWIST2后宫颈癌细胞EMT相关蛋白的表达变化。
  结果显示,Siha-TW2和Hela-TW2的N-Cadherin和Vimentin表达上调,E-Cadherin表达下调,而沉默组的结果相反。
  2.TWIST2通过上调miR-221-3p转录进而促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭
  对Siha-TW2进行Agilent miRNAs芯片检测一共发现了36个差异表达miRNAs,选取其中表达差异最明显且上调的miR-221-3p采用荧光定量PCR验证。
  结果显示,过表达TWIST2后,miR-221-3p的表达显著下调(P<0.001;P<0.001)。进一步利用生物信息学预测,发现TWIST2和miR-221-3p上游启动子序列存在结合靶点,随后利用双荧光素酶报告基因对该结合位点进行验证。
  结果表明,过表达TWIST2后可以促进其与miR-221-3p启动子的结合,沉默TWIST2后可以抑制其与miR-221-3p启动子的结合(P均小于0.001)。
  构建稳定过表达miR-221-3p慢病毒载体并转染Siha(Siha-221)和Hela(Hela-221),荧光定量PCR验证表明miR-221-3p在Siha-221和Hela-221中上调超过200倍和120倍(P<0.001;P<0.001)。随后进行体内/外功能实验。体外迁移和Transwell侵袭实验结果表明,Siha-221和Hela-221的体外迁移(P=0.003;P=0.001)和侵袭能力(P=0.001;P=0.001)明显增强。体内行腘淋巴结转移实验结果表明,与对照组相比,Siha-221和Hela-221的淋巴结转移率明显增高(37.5%vs.87.5%;25%vs.75%)。
  采用荧光定量PCR和Western blot检测Siha-221和Hela-221中EMT相关蛋白的表达变化。
  结果显示,Siha-221和Hela-221的EMT相关蛋白N-Cadherin和Vimentin表达上调,E-Cadherin表达下调。
  进一步瞬时转染miR-221-3p inhibitor至Siha-TW2(Siha-TW2/221KN)和Hela-TW2(Hela-TW2/221KN)中,随后采用划痕和Transwell侵袭实验来检测细胞功能的变化。实验结果显示,与Siha-TW2和Hela-TW2相比,Siha-TW2/221KN和Hela-TW2/221KN的体外迁移(P=0.004;P=0.005)和侵袭能力(P<0.001;P=0.003)明显减弱。该结果提示,miR-221-3p对TWIST2促细胞迁移和侵袭的能力有协同作用。
  采用荧光定量PCR和Westem blot检测Siha-TW2、Siha-TW2/221KN、Hela-TW2和Hela-TW2/221KN EMT相关蛋白的表达变化。
  结果显示,与Siha-TW2和Hela-TW2相比,Siha-TW2/221KN和Hela-TW2/221KN的N-Cadherin和Vimentin表达下调,E-Cadherin表达上调。该结果提示,miR-221-3p对TWIST2促细胞EMT有协同作用。
  结论:
  TWIST2作为转录因子可以与miR-221-3p上游启动子区域的位点结合并上调其转录,从而促进miR-221-3p与THBS2的3'-UTR区域靶向结合,下调THBS2的表达,进一步通过上调N-Cadherin和Vimentin的表达,下调E-Cadherin的表达来促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭。此外,TWIST2和miR-221-3p在伴淋巴结转移的宫颈癌临床样本中高表达,而THBS2在伴淋巴结转移的宫颈癌临床样本中低表达。同时,TWIST2与miR-221-3p的表达呈正相关,而miR-221-3p与THBS2的表达呈负相关。
[硕士论文] 楼昭涵
物理海洋学 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:目的:人类进入海洋文明时代以来,沿海地区逐渐成为资本、人口、科学技术和其他先进生产力密集分布和高效组合的区域。我国,尤其是东南沿海地区,在经济高速发展的同时,对生态环境造成了巨大的破坏,使居民暴露在高健康风险之下。此外,城市化改变了人们的生活饮食习惯,提高了人们的健康意识,为人们提供了更为便利的医疗服务条件,使得慢性疾病(如癌症、心脑血管疾病)的发生和检出率大大增加。乳腺癌作为威胁女性健康最常见的恶性肿瘤,在我国东南沿海地区具有普遍高发的现象,亟需采取有效的方法研究其时空分布特性,为人群的健康风险管理和公共卫生资源的配置提供参考。传统的时空统计分析方法(如时空克里格)能够通过研究时空数据的分布特征与内在结构,预测产生发病率的时空分布图,为风险评估和健康管理提供有价值的信息。然而,时空克里格在复合时空距离构建、理论模型选择与参数调试上仍存在一些理论和技术上的难关。如何构建有效的技术手段探索乳腺癌发病的时空分布规律,是我们亟需解决的问题。
  方法:本研究选取中国东南沿海城市杭州市为研究区,以杭州市2008年至2012年间所有新发的乳腺癌(International Classification of Disease10th edition(ICD-10)code:C50)为研究对象。首先,结合2010年杭州市乡镇街道的人口数据,计算各乡镇街道各年间乳腺癌发病率,构建杭州市乳腺癌发病率时空数据库,并通过卡方检验分析乳腺癌发病率在不同年份、不同地区之间的发病差异,了解乳腺癌发病的基本情况。其次,在时空随机场和贝叶斯最大熵理论框架下,采用时空投影转换模型(spatiotemporal projection,STP)对乳腺癌发病率进行时空预测,并将其与时空克里格的预测结果加以比较,评估时空投影转换模型的预测能力。最后,利用时空投影转换模型预测产生的乳腺癌发病率,采用全局自相关分析、热点分析、局部聚集性和异常值探测以及时空扫描统计,探索乳腺癌发病的时空格局,评估时空投影转换模型的适用性。
  结果:2008-2012年间,杭州市乳腺癌在年际间相对稳定,在地区间差异较大,街道地区的发病率显著高于乡镇地区,约为乡村地区的3.2倍,小城镇地区的1.6倍。与时空克里格法预测的结果相比,时空投影转换模型通过分析空间属性、时间属性、发病率和投影转移速度矢量之间内在的相互关系,将复杂的三维时空数据转换为二维空间数据,有效的避开了三维时空数据分析时复合时空距离构建、模型选择与调试等问题,具有更高的预测精度和计算效率:(1)投影转换后,空间数据的协方差模型具有更高的空间相关性;(2)预测结果具有更低的平均误差,平均绝对误差和均方根误差;(3)预测获得的发病率分布图和5年平均发病率更加稳定准确。时空格局分析结果显示,乳腺癌发病率在时间上分布稳定,在空间上呈显著的聚集分布,东北近海城市地区为乳腺癌高发病率的风险聚集区,而西南地区为乳腺癌低发病率的风险聚集区,发病率呈现从西南低发病率地区到东北高发病率地区逐渐增长的趋势。
  结论:与传统的时空统计方法相比,基于时空随机场和贝叶斯最大熵的时空投影转换模型通过更深入地挖掘空间属性、时间属性、时空变量以及投影转移速度矢量之间的内在联系,在“转换(Transform)-求解(Solve)-回变(Backtransform)”的基本思路下,将复杂的多维时空数据进行降维处理:在时空维度转换阶段临时将数据集的时间信息加以“压缩”,在低维空间域中完成对数据集的探索与评估,最后在“回变”阶段释放“压缩”的时间数据信息,从而能够在更低的计算成本下,获得更准确的发病率预测结果,更有利于后续的时空格局探索,能够为人群的健康风险评估和管理提供理论依据。
[博士论文] 李玲玲
统计学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:癌症一直以来都是威胁人类生命健康的一类疾病,研究癌症的发病机理对于癌症治疗是非常有帮助的。随着科学技术的快速发展,关于癌症的研究也变得日益丰富,广泛被接受的癌症病因是由于基因的累积突变导致的。早在二十世纪八十年代,流行病学家就提出了导致癌症发病的许多重要因素,如环境因素、遗传因素,并给出了关于癌症形成的数学模型。在过去几十年里,细胞学和分子生物学的迅速发展为癌症流行病学的研究提供了方法和机会。最近的研究表明,癌症的形成主要是由于驱动基因突变(driver gene mutation)导致的,一般的癌症需要二到八个驱动基因突变(driver gene mutations)。然而在过去的研究中主要考虑的是两次基因突变模型,因此扩展这些模型对于癌症的研究是非常有必要的。在本文中,我们主要探究了乳腺癌和肺癌形成所需要的基因突变数量,并讨论了辐射对肺癌的发病机理的影响以及基因不稳定性在肺癌形成过程中的作用,通过这些研究可以加深我们对癌症的理解,为癌症的预防、诊断和治疗提供依据。
  本文由六章组成,在第一章中,我们介绍了癌症的研究背景与研究现状,并给出一些预备知识。
  肺癌是世界上死亡率最高的一类癌症,对于肺癌的研究主要集中在两阶段模型,并且,很少有工作详细讨论肺癌患病的性别差异。为了解决这些问题,第二章讨论了不同性别肺癌形成所需要的基因突变次数,同时讨论了细胞突变率变化和细胞克隆扩张变化对肺癌发病概率的影响。我们构建了具有细胞克隆扩张的多阶段模型,通过模型对在美国人口普查或人口监测、流行病学和最终结果注册表(SEER)中肺癌发病率数据的拟合,可以得到所有能够拟合数据的模型,然后根据统计检验得出最优模型,最后根据男性最优模型对模型中参数进行分析给出癌症治疗的有效方案。其研究结果表明:肺组织中正常干细胞需要经历二到八次驱动基因突变才能转化为恶性肿瘤细胞,其中三次驱动基因突变是最有可能发生的。此外,有趣的结果是,肺癌的形成存在着显著的性别差异,对于男性病人,最优的模型是四阶段模型,而对于女性病人,最优的模型是三阶段模型。通过参数分析表明,减少细胞的突变率比减少细胞的净繁殖率能更有效地抑制肺癌的发病概率。
  环境是引起肺癌发生的主要因素,其中吸烟和辐射是引起肺癌发病的两大环境因素,研究环境与肺癌的关系对于肺癌的预防是非常有意义的。虽然关于这方面研究有着大量的工作,但是他们主要集中讨论环境对肺癌患病风险的影响,并没有探讨环境是怎么影响肺癌的形成的。为了解决这个问题,第三章研究了离子辐射对肺癌发病机理的影响,通过建立具有细胞克隆扩张的三阶段模型,我们讨论了辐射对细胞突变率以及细胞净繁殖率的影响。模型对日本广岛和长崎原子弹爆炸后幸存者肺癌发病数据和日本大阪肺癌发病数据的拟合结果表明,辐射主要影响肺癌形成过程中基因突变率,其中,对于男性病人,辐射主要影响正常细胞的突变和恶性肿瘤细胞的转化率,而对于女性病人,辐射主要影响模型中前两次细胞的突变率。我们所得到的这些结果可以为预测肺癌的发病率提供理论依据。
  基因组不稳定性在癌症中扮演着重要的角色,尽管对于基因组不稳定性有着大量的临床和理论研究,但是对于基因组不稳定到底是出现在癌基因和抑癌基因变异之前还是之后仍然是一个备受争论的问题。在第四章中,我们考虑了具有基因组不稳定性模型,通过拟合日本广岛和长崎原子弹爆炸后幸存者中肺癌发病数据表明,对于肺癌的形成,基因组不稳定性对细胞的克隆扩展没有显著的影响,并且,在肺癌形成过程中,基因组不稳定性的机制存在着性别差异。对男性病人,基因组不稳定性在肺癌发展中是一个早期事件,然而对于女性病人,并没有证据表明在肺癌的形成过程中基因组不稳定一定会发生,即使对于女性肺癌的形成存在着基因组不稳定性,它也是;个晚期的事件。
  对乳腺癌和直肠癌的基因突变数据的统计分析表明,在肿瘤中大部分基因突变是无害的,其中只有不到15个基因突变是会引起肿瘤的启动和发展。在第五章中,为了研究乳腺癌的基因突变机制,我们建立了任意多阶段克隆扩张模型,在这个模型中考虑了每一类变异细胞的克隆扩张,通过拟合在美国人口普查或人口监测、流行病学和最终结果注册表(SEER)中1990-1999年期间女性乳腺癌发病率数据,我们发现,在乳腺组织中正常的干细胞转变为;个恶性肿瘤细胞需要2-14次基因突变,其中三次基因突变是最可能出现的。此外,我们的结果表明,在女性乳腺癌的形成过程中存在着突变表型。
  最后,我们在第六章中总结了全文,并对癌症的相关研究作了研究展望。
[硕士论文] 蔡凯
外科学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:前列腺癌是威胁男性健康的恶性肿瘤之一,其发病率在欧美发达国家位于男性恶性肿瘤的首位,死亡率位居第三位。前列腺癌早期不易诊断,晚期易出现远处转移,且以骨转移最多见,目前诊断骨转移最常用的检查是骨扫描。NCCN,EAU及AJCC指南多次修改骨扫描指征,以减少不必要的骨扫描检查,但骨扫描指征的制定均是基于欧美人群的研究,是否适合所有人群,特别是中国人群,仍不确定。因此,本研究通过分析本院初诊前列腺癌患者的临床资料,探讨前列腺癌骨转移的特点及其预测因素,为临床提供参考。
  方法:回顾性分析2010年1月至2017年12月在大连医科大学附属第二医院确诊的340例前列腺癌患者的临床资料。所有患者入院后均进行全身骨扫描检查,评估年龄、前列腺特异性抗原(PSA)、Gleason评分、前列腺特异性抗原密度(PSAD)、碱性磷酸酶(ALP)、中性粒细胞淋巴细胞比(neutrophil-lymphocyte ratio,NLR)、临床T分期在骨转移组和非骨转移组之间的差异,单因素相关性分析比较这些参数与骨转移的相关性,多因素Logistic回归分析确定这些参数中的独立预测因素。运用受试者工作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲线,分析独立预测因素对骨转移的预测作用。
  结果:340例前列腺癌患者的平均年龄为73岁(73±9岁),中位PSA为41.92ng/ml(16.96-110.83ng/ml),Gleason评分≤6,7,≥8分分别为38例(11.2%),154例(45.3%),148例(43.5%),中位PSAD为0.98ng/(ml·cm3)[(0.38-2.39)ng/(ml·cm3)],中位NLR为2.27(1.61-3.00),中位ALP为76.0U/L(61.0-105.0U/L),临床T分期T1期42例(12.4%)、T2期190例(55.8%)、T3期59例(17.4%)、T4期49例(14.4%)。340例前列腺癌患者中依据骨扫描结果发现骨转移患者139例(40.9%),201例(59.1%)患者未出现骨转移。其中出现脊柱转移110例(79.1%),骨盆转移93例(66.9%),肋骨转移79例(56.8%),四肢骨转移54例(38.9%),胸骨转移39例(28.1%),颅骨转移30例(21.6%),肩胛骨转移25例(18.0%),颌面骨和锁骨转移分别为10例(7.2%)、7例(5.0%)。在骨转移患者中,37例(26.6%)累及1个区域,35例(25.2%)累及2个区域,21例(15.1%)累及3个区域,5例(3.6%)累及4个区域,10例(7.2%)累及5个区域,14例(10.1%)累及6个区域,13例(9.3%)累及7个区域,3例(2.2%)累及8个区域,1例(0.7%)累及9个区域。PSA、Gleason评分、PSAD、ALP、临床T分期在两组之间的差异具有统计学意义(P<0.001);单因素分析显示PSA、Gleason评分、PSAD、临床T分期、ALP与骨转移均有相关性(P<0.001);多因素Logistic回归分析显示,PSA、Gleason评分、临床T分期及ALP是骨转移的独立预测因素(P<0.05)。ROC曲线显示PSA、ALP的曲线下面积(AUC)分别为0.827、0.768,cutoff值分别是48.3ng/mL、92.0U/L,敏感性分别是81.3%、75.6%,特异性分别是61.2%、88.6%。PSA≤10ng/ml、Gleason评分≤6及或临床分期为T1期的前列腺癌患者发生骨转移的概率极低。
  结论:1、前列腺癌易出现骨转移,且以脊柱转移最为多见;
  2、PSA、Gleason评分、临床T分期及ALP是前列腺癌骨转移的独立预测因素;
  3、PSA≤10ng/ml、Gleason评分≤6且临床分期为T1期的前列腺癌可不进行骨扫描。
[硕士论文] 王世平
外科学 大连医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨合并2型糖尿病对甲状腺乳头状癌患者淋巴结转移的影响。
  方法:回顾性分析大连医科大学附属第二医院甲状腺外科2015年06月至2017年06月收治的300例甲状腺乳头状癌患者临床资料,分析合并2型糖尿病的甲状腺乳头状癌患者的淋巴结转移情况。术者对所有患者施行病变侧甲状腺腺叶全切除对侧腺叶次全切除患侧中央组淋巴结清扫术,并且一起切除甲状腺峡部;双侧甲状腺癌则行甲状腺全切除术双侧中央组淋巴结清扫术,如合并侧方淋巴结转移则加行单侧(或双侧)功能性颈淋巴结清扫术。并根据患者是否有2型糖尿病、年龄大小、男性女性、原发肿瘤直径、是否有包膜侵犯、术前血清TSH浓度和肿瘤多灶性对两组患者及总体样本进行比较。
  结果:2型糖尿病组与对照组的淋巴结转移率存在差异,2型糖尿病组的淋巴结转移率大于对照组的淋巴结转移率,P<0.05。肿瘤直径>1cm与≤1cm的淋巴结转移率存在差异,肿瘤直径>1cm的淋巴结转移率大于肿瘤直径≤1cm的淋巴结转移率,P<0.05。45岁以下与45岁及以上之间的淋巴结转移率存在差异,45岁以下的淋巴结转移率大于45岁及以上的淋巴结转移率,P<0.05。多灶性的淋巴结转移率与非多灶性的淋巴结转移率之间存在差异,多灶性的淋巴结转移率大于非多灶性的淋巴结转移率,P<0.05。TSH浓度小于等于2.5miu/l与大于2.5miu/l之间的淋巴结转移率不存在差异,P>0.05。甲状腺包膜受到侵犯与甲状腺包膜没有受到侵犯之间的淋巴结转移率存在差异,甲状腺包膜侵犯的淋巴结转移率大于甲状腺包膜没有受侵犯的淋巴结转移率,P<0.05。男女之间的淋巴结转移率存在差异,男性的淋巴结转移率大于女性的淋巴结转移率,P<0.05。最后对2型糖尿病、性别、血清TSH浓度、肿瘤多灶性、年龄、肿瘤直径以及包膜侵犯进行logistic回归分析,结果显示糖尿病是甲状腺乳头状癌淋巴结转移的危险因素。
  结论:2型糖尿病是甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的危险因素。
[博士论文] 陈红芳
肿瘤学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  胃癌作为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,具有很高的致死率。中国是胃癌的高发地区。早期胃癌患者缺乏特异性的临床症状和影像学特征,常常被误诊。当出现明显症状时,大多处于进展期。尽管现在的诊疗技术进一步发展,进展期的胃癌病人预后仍然非常差。除了肿瘤本身的异常增殖,浸润和转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因。
  肿瘤的浸润及转移涉及多个步骤、多种因素,牵涉很多机制和基因。此过程包括肿瘤细胞与宿主细胞、肿瘤细胞与细胞外基质之间相互作用。最早的转移机制是由Liotta提出的,包括三个步骤:粘附、降解和移动。在肿瘤浸润转移过程中,上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)发挥重要的作用。EMT涉及多种标记物表达的变化。
  钙粘附蛋白是一类常见的粘附分子,它是一类依赖钙离子的跨膜糖蛋白。可以介导正常组织和肿瘤组织中细胞-细胞间的粘附及连接作用。钙粘附蛋白家族包括经典钙粘蛋白(classic cadherins)、桥粒钙粘蛋白(desmosomal cadherins)、Flamingo(CELSR)钙粘蛋白,FAT钙粘蛋白(fat-like cadherins)和原钙粘蛋白(protocadherins, PCDH)。
  原钙粘蛋白是最大的钙粘蛋白超家族,最早由Shintaro发现并命名。PCDH是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白,根据基因结构和功能可将其分为:非成簇原钙粘蛋白(Nonclustered PCDH)、成簇原钙粘蛋白(Clustered PCDH)。PCDH7属于非成簇PCDH家族,位于人染色体4p15。PCDH7首先是在胃癌细胞中被发现的,后来研究发现其主要在人类和鼠的脑和心脏中表达。PCDH7作为粘附分子也具有粘附能力,只不过作用要小一点。目前的研究主要表明,PCDH7可以影响神经系统发育,并且在多种肿瘤中存在异常表达,然而其在肿瘤中的异常表达和发挥作用的机制尚不清楚。本实验的主要目的,检测PCDH7在胃癌组织及胃粘膜组织中是否存在差异表达。并进一步分析PCDH7的表达和胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系,明确PCDH7对胃癌细胞增殖、浸润和迁移能力的影响,并探索PCDH7参与胃癌细胞浸润转移的相关调节机制。
  方法:
  收取山东大学齐鲁医院病理科47例胃腺癌和25例正常胃粘膜新鲜组织,并完善其临床资料。所有标本均经过病理确诊。提取标本的RNA,反转录,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测两组标本中PCDH7 mRNA的表达。回顾性分析2004年1月至2007年5月间保存的119例胃腺癌及75例胃粘膜石蜡标本,所有标本均有完善的临床病例资料。采用免疫组化方法,检测PCDH7蛋白在胃癌、上皮内瘤变及正常胃粘膜之间的差异。分析PCDH7蛋白与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤体积、分型、TNM分期、淋巴结转移以及远处转移等病理参数的关系,明确其对胃癌的影响。对119例胃癌病人均进行随访,确定患者的基本情况。根据相关数据,采用Kaplan-Meier生存法,分析PCDH7与总生存期(overall survival,OS)、无瘤生存期(disease-free survival,DFS)的关系,明确PCDH7对胃癌患者预后的影响。进一步采取了单因素和多因素方法分析,明确PCDH7是否为胃癌患者预后的独立因素。
  为进一步确定PCDH7对胃癌的影响,进行细胞功能学方面的实验。常规培养胃癌细胞株BGC823和MKN45。采用瞬时转染siPCDH7,抑制胃癌细胞内PCDH7的表达。提取RNA,反转录,RT-qPCR,检测转染效率。转染siPCDH7后,MTS法检测胃癌细胞株BGC823和MKN45增殖能力的变化。采用Transwell小室法,进行人工重组基底膜侵袭、迁移实验,检测PCDH7对胃癌细胞株BGC823和MKN45侵袭、迁移能力的影响。
  为研究PCDH7在胃癌中的作用机制,采取RT-qPCR检测EMT相关因子E-cadherin, N-cadherin,β-catenin, Vimentin, Twist, Snail, Zeb1和Zeb2等mRNA水平的变化。并进一步采用Western blot检测E-cadherin,β-catenin,Vimentin和Snail蛋白水平的表达变化。
  结果:
  1.胃癌组织中PCDH7表达降低
  首先,检测标本中PCDH7 mRNA的含量。显示,与正常胃粘膜相比,胃癌组织中PCDH7 mRNA明显降低,比起正常胃组织下调17.8倍。免疫组化结果,胃粘膜中PCDH7蛋白的阳性表达率为(20/20,100%),上皮内瘤变组织为63.6%(35/55),胃癌组织为32.8%(39/119)。总之,从正常胃粘膜、上皮内瘤变到胃癌组织,PCDH7蛋白表达水平呈现渐进式降低,组别间的差异均具有统计学意义(组间P<0.001)。此外,与没有淋巴结转移的胃癌相比,存在淋巴结转移者PCDH7的表达率明显降低(P<0.001)。结果提示,PCDH7在胃癌的淋巴结转移中可能起重要作用。
  我们应用ROC(receiver operator characteristic)曲线评价PCDH7在诊断胃癌与非癌组织中的价值。结果显示,ROC曲线能很好的区分两者,胃癌和非癌变组织之间,曲线下的面积(area under the curve,AUC)为0.938,表明PCDH7的表达可以用来区分两者。另外,ROC曲线表明,PCDH7的表达可以用来区别胃癌淋巴结转移与否(AUC=0.695,P=0.01)。
  2.PCDH7的表达与临床病理参数之间的关系
  胃癌标本PCDH7的低表达水平与Lauren's分型(P=0.0005)呈正相关,肠型胃癌(55.3%)显著高于弥漫型胃癌(26.2%);无淋巴结转移组(55.3%)显著高于淋巴结转移组(22.2%)(P=0.0002);与TNM分期(P=0.0221)呈正相关,Ⅰ期阳性率为50%(12/24),Ⅱ-Ⅳ期阳性率为28.4%(27/95)。而PCDH7蛋白的表达与肿瘤患者的年龄、性别、肿瘤体积以及是否存在远处器官转移等参数无明显相关性。这些数据显示PCDH7参与胃癌的发生、发展。
  3.PCDH7的表达与预后的关系
  Kaplan-Meier生存分析显示,PCDH7高表达患者的术后生存时间(P=0.0490)、无瘤生存时间(P=0.0380)明显高于PCDH7低表达的患者。
  单因素分析结果显示,PCDH7的表达、癌组织浸润深度、淋巴结转移、远处脏器转移和肿瘤分期是胃癌预后的因素。多因素分析显示,远处转移、肿瘤分期是独立的预后影响因素,而PCDH7并不是胃癌患者独立的预后因素。
  4.细胞学功能实验结果
  MTS法检测胃癌细胞的增殖能力。结果显示,抑制PCDH7的表达后,BGC823和MKN45细胞的增殖能力无明显变化。侵袭和迁移实验中,采用直接计数法,计数穿透小室的细胞数。PCDH7抑制后,穿透Transwell底部的膜,进入下层的BGC823及MKN45细胞数,均比对照组的多(P<0.05)。细胞功能学实验,更加明确PCDH7可以抑制胃癌细胞的迁移和浸润。
  5.干扰PCDH7的表达对EMT相关分子表达的影响
  RT-qPCR结果显示,干扰PCDH7的表达后,在两株胃癌细胞中EMT相关因子中只有E-cadherin的mRNA水平降低,而N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Twist、Snail、Zebl和Zeb2等分子无明显变化。Western blot结果表明,随着PCDH7表达降低,在两株胃癌细胞株中,E-cadherin蛋白表达水平均降低。PCDH7的表达E-cadherin呈正相关。其他EMT相关蛋白β-catenin、Vimentin和Snail等无显著变化,PCDH7的低表达与其无关。
  结论:
  1.PCDH7在胃癌组织中低表达,抑制胃癌的浸润转移,与胃癌的预后有关。
  2.PCDH7通过调节E-cadherin的表达抑制胃癌的浸润和转移。
  3.PCDH7可以作为胃癌诊断和预后判断的新的指标。
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