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[博士论文] 常继伟
生物信息学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:如何从大量数据中挖掘出有意义的信息,如何把复杂的研究对象用精确而简明的模型描述出来一直是数据处理工作中的中心课题。针对这个问题有两种截然不同的方法:数据挖掘和复杂网络理论。复杂网络和数据挖掘方法不仅有着相似的研究目的,而且其分析对象在多数情况下也相同。但在实验数据分析中将两者协同应用解决同一问题的情况比较少,主要原因是两者在分析对象上有较多重叠,在多数情况下仅用一种方式就可以解决问题。但实际上,将数据挖掘和复杂网络很好的结合起来解决问题会给数据分析提供新的思路。本研究将复杂网络和数据挖掘相结合,同时用于分析癌症相关基因/蛋白,结果表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。
  对癌症的研究积累了大量而且类型丰富的数据,利用这些数据发现癌细胞中关键的基因及其作用途径一直是重要的研究方向。得益于丰富的数据,癌症领域的数据分析方法也层出不穷,其中结合蛋白质相互作用网络分析基因及蛋白功能的方法是一个重要的类别。在癌症相关的信号传导,细胞定位和表达调控等过程中蛋白质相互作用扮演重要的角色,因此以蛋白质相互作用为基础整合其它组学数据的生物信息方法对分析参与这些过程的关键基因及蛋白至为重要。本研究不仅以人类蛋白质相互作用网络为基础,结合基因表达、基因重要性及基因突变数据优选并分析了癌症相关基因/蛋白和蛋白组合,还利用新的模型将生物网络与组学数据有效的结合起来,为后续分析提供帮助。本文的工作主要包含以下两个方面:
  (1)结合蛋白质相互作用网络和蛋白质、基因的表达数据预测新的癌症相关基因和蛋白质组合。蛋白质相互作用网络是典型的复杂网络,网络中每条边表示一对蛋白质的相互作用关系。表达数据包含基因或蛋白质在癌症组织、癌症细胞系和正常组织的样本中的表达量的信息,比较两类样本可以得到与癌症关联密切的基因或蛋白质。本研究将蛋白质相互作用网络用于构建稀疏的自动编码机,而后用癌症细胞系和正常组织的差异表达数据作为训练数据,训练后的自动编码机同时包含相互作用信息和差异表达信息。将训练得到的自动编码机用于构建一个深层模型,来模拟每个蛋白质/基因敲降对其它蛋白质/基表达的影响,最后将这种影响关系表示为有向网络的形式。蛋白间相互影响的有向网络可以用于鉴定新的癌症相关蛋白。在本研究优选的TOP500个高可信度的癌症相关蛋白中有211个为已知的癌症药物靶点,其余蛋白质的功能与癌症也密切相关。与其它方法相比较该方法有较高的AUC值(>0.8)。蛋白间相互影响的网络也可以用于预测蛋白组合。本文中提到的蛋白组合可以是合成致死组合,也可以是药物靶标的组合。这两类蛋白组合在蛋白相互影响网络中都与特定的蛋白存在密切联系。本研究利用已知的蛋白组合将这组蛋白质识别出来,并用于识别新的蛋白组合。交叉验证表明该策略有较高的准确度(>0.85),可以用于鉴别新的蛋白组合。进一步将该模型用于前列腺癌的单细胞测序数据集,单细胞测序可以检测病患体内癌细胞群体的演化,对临床治疗有重要意义。文中利用前列腺癌的数据集训练模型且计算了相应的蛋白影响网络,然后利用该网络识别了前列腺癌蛋白,其中包含已知的前列腺癌基因。这表明该模型适用于单细胞测序数据和小样本数据,具有良好的应用前景。
  (2)结合蛋白质相互作用网络和基因重要性数据寻找复杂的基因关联关系。在本研究中蛋白质相互作用网络依然表示两个蛋白质间的相互作用关系。基因重要性数据是通过CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)试验方法随机突变细胞系基因组得到,简单来讲基因重要程度越高,可以承受的突变越少。通过比较初始CRISPR随机突变的细胞系和经过一段时间的培养的细胞系间基因组的差异可以得到基因重要性数据。本研究将基因的重要性数据通过新方法转换为蛋白质相互作用的重要性。相互作用的重要性可以用于筛选重要的互作,计算相互作用间的相关性以及重新评估基因的重要性。本研究利用蛋白相互作用的相关性发现了以细胞因子信号通路相关的蛋白互作为核心的网络,为理解细胞因子对其它生物学途径的调控提供了方向。另外用高重要性相互作用构建的子网络包含了关键蛋白质行使功能时的互作信息,为优选关键相互作用提供了新的工具。最后本文利用该方法发现了差异表达基因与高频突变基因之间的关联。
  本研究通过以上的实验表明复杂网络和数据挖掘技术的协同应用可以为生物学数据的分析提供新的切入点。两个方法都是以相互作用为基础,在模型构建时同时利用组学数据进行训练,因而可以将两种数据有机的结合在一起。对癌症相关基因/蛋白的分析表明这种结合对分析生物学数据是有帮助的。
[硕士论文] 朱妍静
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  环状RNA(circular RNA,circRNAs)是一类不同于线性RNA分子的内源性非编码RNA,没有5'末端帽结构和3'末端poly(A)尾,是以共价键形成的闭合环状结构,其广泛存在于真核细胞中。研究表明大部分circRNAs分子在不同物种间是保守的,同时由于其具有组织及时空表达特异性、不易受RNA酶降解以及在疾病发生分子机理和疾病诊断中的重要潜在价值越来越受到大家的重视,近年来已成为继微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之后,RNA研究领域的又一全新热点。
  原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界第五大常见恶性肿瘤、第三大肿瘤常见死因。根据组织学类型,可将其分为肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma,ICC)和混合型肝癌。其中,HCC是原发性肝癌的主要组织学类型。中国是肝癌大国,其每年诊断率、新发病例数以及相关致死率都居高不下。肝癌发病隐匿,大部分患者出现临床症状时已处于晚期。肝癌的发生发展以及复发转移是涉及许多调控因素的复杂过程。近年来,非编码RNA(miRNA及LncRNA)在肝癌生物学功能调控以及肝癌诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。而circRNAs在肝癌中的相关研究甚少,其与肿瘤干性之间的相关研究更是空白,仍需对此进行深入研究。
  课题组前期与中科院计算生物所杨力教授实验室合作完成了10例肝癌配对样本mRNA和环状RNA的二代测序分析,构建了肝细胞癌差异表达circRNAs谱,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定肝癌干性相关差异circRNAs。而这些circRNAs在在肿瘤干性中的具体作用及分子机制如何,并不清楚。因此,本课题希望依托团队前期已建立的肝癌环状RNA数据,以肝癌干性相关差异circRNAs为切入点,构建环状RNA-靶基因-信号通路-细胞表型的分子调控网络,阐明肝癌干性关键环状RNA及分子机理,以期寻找肝癌的最新预警分子和干预靶点。
  方法:
  1、构建肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱:运用高通量测序技术(High-throughput sequencing)、Poly-A序列提取及接头序列分析等技术,检测circRNAs在临床肝癌样本中的表达情况,建立肝癌差异表达circRNAs谱,确定肝组织特征circRNAs;
  2、肝癌干性相关差异circRNAs鉴定:结合临床样本及聚类分析(Cluster Analysis)干性标志物,筛选出肝癌差异表达circRNAs谱中与肝癌干性相关的circRNAs;
  3、研究目标circRNA的生物学特性:应用RNA核浆分离、RnaseR处理、荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)实验研究目标circRNA的基本生物学特性;
  4、研究目标circRNA调控肝癌细胞干性过程中的生物学功能:应用慢病毒系统分别构建目标circRNA的肝癌干扰细胞系、过表达细胞系及其相应的对照细胞系;运用CCK8增殖及克隆形成实验研究目标circRNA对肝癌细胞增殖的影响;应用体外细胞成球实验、有限稀释、体内小鼠皮下荷瘤实验研究目标circRNA对肝癌细胞成瘤能力的影响;
  5、机制探索:应用荧光定量PCR实验、流式细胞术、免疫组织化学染色方法(Immunohistochemistry,IHC)、免疫磁珠细胞分选(MACS MicroBeads)、原代肝癌细胞分选等实验研究目标circRNA对肝癌细胞干性标志物表达的影响;应用RNA结合蛋白免疫共沉淀(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验研究目标circRNA与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)之间的RNA-蛋白质相互作用;
  6、临床印证:应用一系列的免疫组化实验以及原位杂交(In situ hybridization,ISH)实验,检测本研究中相关干性基因在临床样本以及小鼠皮下荷瘤样本中的表达情况,结合临床随访数据进行生存分析,研究目标circRNA对肝细胞癌患者预后判断的价值。
  结果:
  1、高通量测序技术发现circRNAs在肝癌和癌旁存在表达差异,通过构建肝癌干性相关circRNAs表达谱,并挑选其中circZKSCAN1进行研究;
  2、circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中;
  3、体内外实验证实circZKSCAN1能够抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型;
  4、circZKSCAN1可以抑制EpCAM等肝癌细胞干性基因的表达;
  5、circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达,从而抑制肝癌细胞干性表型。
  6、circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平在临床肝细胞癌样本中呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。
  结论:
  本研究首次运用高通量测序技术构建了肝癌组织circRNAs和mRNA表达谱,明确了circRNAs的表达特征,结合临床样本及聚类基因分析筛选鉴定出肝癌干性相关差异circRNAs,并从中挑选出了circRNA-ZKSCAN1进行研究。circZKSCAN1通过使用其上下游的Alu重复序列来实现自身环化,表达稳定不易被RNA酶降解,且主要定位于细胞浆中。进一步,在细胞和动物水平证实:circZKSCAN1通过竞争性结合RNA结合蛋白FMRP,阻断其与其他RNA结合,抑制靶基因表达;并抑制EpCAM等多种肝癌细胞干性基因的表达,从而抑制肝癌细胞干性及恶性生物学表型。临床肝细胞癌样本中,circZKSCAN1表达水平与EpCAM水平呈现负相关,可以有效地预测HCC患者的预后情况。本研究首次整合mRNA表达数据、系统性鉴定肝癌干性差异circRNAs,同时以RNA结合蛋白为新的切入点研究circRNAs-靶基因-生物学表型调控网络,相关结果对于深入了解circRNAs的多样化调控机制将具有非常重要的意义。
[硕士论文] 司秀花
计算机科学与技术 黑龙江大学 2018(学位年度)
摘要:前mRNA剪接是一种复杂且无处不在的核过程,它是基因表达中引起致癌错误的天然来源。此外,过去20年来的许多研究报道了在没有基因组突变的情况下癌症特异性的选择性剪接。受影响的蛋白质包括转录因子,细胞信号转导子和细胞外基质的组分。针对癌细胞上可选剪接产物的抗体目前正在进行临床试验,跨越选择性剪接区域的竞争性逆转录PCR被用作简单的诊断测试。除了与癌症相关之外,替代基因产物的性质通常与癌症中的积极作用一致;因此,可变剪接过程本身就是基因治疗的潜在目标。因此本文的主要工作如下:
  (1)随着大量DNA序列的快速增长,基因预测已成为生物信息学的一个难题。剪接位点预测在基因鉴定中起关键作用。因此,开发提高剪接点预测精度的新方法具有重要意义。通过将RF与三种最新的编码方法(MM1,MM2和MCM)相结合,我们证明了所提出的方法与基于SVM的方法执行大致相同并且通常更好。此外,所提出的方法简单,快速,易于使用并且可以应用于大规模人类基因组数据以鉴定剪接位点。作为未来的研究,这些方法也可用于鉴定其他调控区域,如翻译起始位点和启动子。
  (2)尽管已知的可变剪接事件的目录从此一直在增长,但在疾病情况下或在大量人群中工作时,通常会观察到新的异构体。鉴于完整同种型的鉴定在技术上是具有挑战性或昂贵的,将重点放在单剪接事件上作为转录组特性的替代物对于广泛的分析是富有成效的。我们提供SplAdder,一种基于RNA-Seq数据的大规模分析选择性剪接事件的新方法。SplAdder已成功应用于各种生物体的拼接分析,与其他各种先进方法相比,显示出高度的整体准确性,并可轻松应用于数千个样本的数据集。我们正在努力进一步改进SplAdder,以便本机处理高性能计算集群并生成更多交互式可视化。
  (3)我们已经鉴定出许多在正常和癌性组织之间差异剪接的基因。大多数实验验证的组织特异性选择性剪接事件发生在涉及细胞骨架结构,细胞外基质或细胞-细胞相互作用的基因中。这些事件中的一些报道了以组织特异性方式发生的剪接变体,并且可能由于结肠上皮和平滑肌细胞去分化而代表组织功能的丧失而不是帮助转化或转移。确定这些剪接事件的作用需要更详细的研究,但在大多数情况下,这些基因以前与肿瘤进展中的活性作用有牵连。
[硕士论文] 李高峰
外科学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本文目的是研究肝脏肿瘤细胞调控氧化应激的机制及肿瘤干细胞在抗氧化应激过程中的作用,探寻参与调节肿瘤干性特征与抗氧化应激过程的相交叉的分子靶点,并人为干预后,进一步对比肝脏肿瘤细胞抗氧化应激能力及干性特征的变化。从而从肿瘤干细胞具有较强抗氧化应激能力的生物学特性角度为肿瘤的临床治疗、基础研究及新药研发提供新的策略与思路。
  方法:
  1.对比肝细胞癌(HCC)细胞系Huh7与SMMC-7721对外源性ROS(H2O2)抵抗能力及两组细胞系中参与ROS调控的相关分子表达差异,探究肝癌细胞对ROS抵抗的初步机制;2.进一步分离Huh7细胞中抗ROS的亚群,并与普通Huh7细胞比较抗ROS能力及调控ROS代谢的相关分子表达的差异,筛选出调节通路中的关键分子(β-catenin);3.使用β-catenin阻滞剂XAV939阻断Wnt/β-catenin信号通路,观察Huh7细胞抗ROS能力的变化;4.通过慢病毒干扰Huh7细胞系内ROS产生基因Nox1,人为减少细胞内ROS的产生,来比较Nox1基因干扰组与GFP(绿色荧光)对照组细胞抗ROS能力、干性特征及相关分子表达的变化,进而探究ROS调控能力与肿瘤干性特征之间的关系。
  结果:
  1.经H2O2作用后,相对于SMMC-7721细胞,Huh7细胞凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低,同时相对高表达干性分子CD133、bmi-1,DNA修复基因Rad51、ROS清除酶基因SOD2。2.肝癌细胞Huh7内存在具有较强抗ROS能力的亚群(Huh7-ROS),该亚群细胞相对于普通的Huh7细胞高表达bmi-1、CD133、Bcl-2、SOD1,并且在经H2O2作用后,凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低。3.相对于未用XAV939处理的Huh7细胞,经XAV939处理的Huh7-XAV939组细胞在H2O2作用后,细胞凋亡坏死数目更多,活性更低,细胞内ROS水平更高,而在不使用H2O2情况下即H2O2浓度为0umol/ml时,Huh7细胞的凋亡和坏死及细胞活性都没有差异。4.干扰Huh7细胞内ROS产生基因Nox1的实验组细胞(Huh7-siNox1),相对于普通的对照组绿色荧光细胞(Huh7-GFP),不但在H2O2作用后细胞活性更高,而且还有更强体内致瘤能力、集落形成能力。
  结论:
  1.肝癌细胞拥有较强的抗ROS的能力有赖于肿瘤干性分子、DNA修复基因及清除酶基因的共同作用。2.肝癌细胞内存在抗ROS的亚群细胞,这一亚群也同时高表达肿瘤干性分子、ROS清除酶基因、DNA修复基因以及肿瘤干细胞信号通路分子β-catenin基因。3.β-catenin基因调控肿瘤细胞的自我更新等干性细胞学特性,在肿瘤细胞抗ROS过程中同样发挥作用。XAV939作为β-catenin基因的特异性阻滞剂,可以在不会诱导细胞凋亡和坏死的浓度水平抑制肝脏肿瘤细胞调控ROS抵抗的能力,进而可增加化疗药杀伤肿瘤细胞的效应,其有可能成为化疗“增敏剂”,进而在化疗过程中起到辅助作用。4.通过干扰Nox1基因降低内源性ROS的产生可以增强Huh7细胞抗ROS的能力并激活肿瘤细胞的干性特征,Nox1分子表达的高低及肿瘤细胞中ROS的水平可能作为为患者预后评判的标准和相关治疗的分子靶点来研究。
[博士论文] 秦文昊
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景与目的:
  胆固醇对于维持细胞正常的生理功能有着重要的意义。随着人类生活方式及饮食结构的改变,高胆固醇血症患者急剧增多。大量研究表明,高胆固醇血症是许多严重疾病的危险因素,包括动脉粥样硬化,冠心病及脑卒中等。但是,胆固醇与恶性肿瘤之间的关系一直备受争议。在一些流行病学研究中,血液总胆固醇水平与肝癌、食管癌、肺癌、胃癌等的发病呈明显的负相关,而与膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌等的发病呈正相关,而且相关关系会受性别和人种等差异的影响。这些结果表明胆固醇在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,且在不同类型的肿瘤中具有不同的作用模式,但其分子机制一直未被阐述清楚。因此,深入研究高胆固醇血症对肿瘤的影响并明确相关分子机制,对于肿瘤的预防和治疗均具有重要意义。
  方法及步骤:
  1.利用循证医学方法研究血胆固醇水平与多种肿瘤发生风险的关系
  检索收集已发表文献,提取数据进行循证医学统计和分析,明确胆固醇代谢异常对总肿瘤、肝癌、肺癌发病率的影响,为本项目的研究题目提供可靠的现实依据。
  2.构建饮食诱导及基因型诱导小鼠高胆固醇血症模型
  高胆固醇饮食诱导:给予6-8周龄野生型C57小鼠高胆固醇饮食4周,诱导小鼠产生高胆固醇血症。
  ApoE基因缺失小鼠:C57遗传背景下的ApoE-/-小鼠会自发产生高胆固醇血症。被广泛用于动脉粥样硬化相关研究,本研究采用6-8周龄ApoE-/-小鼠进行后续实验。
  3.在高胆固醇血症小鼠模型基础上,构建小鼠荷瘤、诱癌以及肿瘤转移模型
  荷瘤模型:采用皮下荷瘤的方法,观察黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌细胞在高胆固醇血症小鼠模型中的生长情况。
  诱癌模型:通过给予出生15天小鼠腹腔DEN注射(25mg/kg)诱发肝癌形成,观察高胆固醇血症小鼠的肝癌发生发展情况。通过支气管灌注Cre病毒的方法,诱发KrasG12D小鼠肺部特异性的Kras突变激活,诱发小鼠肺癌,观察小鼠高胆固醇血症对肺癌发生发展的影响。
  黑色素瘤肺转移模型:经小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞,构建小鼠黑色素瘤肺转移模型,观察小鼠高胆固醇血症对黑色素瘤肺转移的影响。
  4.通过转录组测序等方法探寻高胆固醇影响肿瘤发生发展的途径
  收集对照组及高胆固醇组的小鼠荷瘤组织,进行转录组测序分析,并对差异基因进行KEGG及GSEA分析,探索相关的基因及信号通路改变。
  5.检测高胆固醇对免疫细胞的影响,明确发挥作用的关键免疫细胞亚群
  利用PCR及流式检测方法检测荷瘤组织中免疫细胞的相对比例,观察自然杀伤细胞(NK)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NKT细胞及DC细胞的相对比例和绝对数变化。
  利用相应清除性抗体清除各类免疫细胞,观察对照小鼠及高胆固醇小鼠的肿瘤生长差异,明确发挥作用的免疫细胞亚群。
  6.检测高胆固醇对于关键免疫细胞功能以及杀伤能力的影响
  利用PCR及流式检测方法,分析高胆固醇组免疫细胞的活性,并通过细胞毒性实验、脱颗粒实验及细胞过继实验,证明高胆固醇组来源的免疫细胞在体内外,均具有较强的杀伤肿瘤细胞的能力。
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞胆固醇含量的变化,并通过体外人为调节免疫细胞胆固醇水平,调节其杀伤肿瘤细胞的能力。
  7.探索高胆固醇影响关键免疫细胞功能的分子机制
  检测对照组及高胆固醇组免疫细胞中免疫受体数量、定位的变化,相关通路的活化情况,明确高胆固醇调控免疫细胞功能的关键通路与分子事件。
  8.探索通过调节胆固醇代谢改善免疫细胞抗肿瘤活性的方式方法
  利用慢病毒过表达低密度脂蛋白受体(LDLR)或PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,检测这些方法对免疫细胞内胆固醇含量及其肿瘤杀伤能力的影响。
  结果:
  首先,我们通过荟萃分析(Meta),发现人群恶性肿瘤总体发病率,以及肝癌、肺癌的发生率与血总胆固醇水平呈明显的负相关。在高胆固醇组小鼠体内,多种肿瘤的发生、生长及转移受到抑制。转录组测序分析证明,对照组与高胆固醇组的差异基因在免疫系统及免疫细胞活化相关通路有着明显富集。同时,高胆固醇血症对肿瘤的抑制现象在NSG小鼠中不复存在,这表明此抑制作用可能和免疫系统密切相关。随后,我们发现在高胆固醇小鼠的肿瘤组织中NK细胞比例明显上调,而其他免疫细胞的比例则没有显著变化。NK细胞清除性抗体或清除剂可以消除高胆固醇对肿瘤生长的抑制作用,这表明高胆固醇主要通过NK细胞发挥抗肿瘤作用。
  随后,我们检测发现高胆固醇组小鼠体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力明显增强,细胞内总胆固醇含量及膜胆固醇含量明显上升。在体外,以胆固醇处理正常NK细胞可增强其细胞毒性,而用环糊精降低细胞胆固醇含量可下调高胆固醇组NK细胞肿瘤杀伤能力。在机制方面,我们发现细胞内胆固醇蓄积会增加细胞表面的脂筏数量,使NK细胞的激活性受体NCR1及NKG2D在脂筏定位增多,下游的信号通路激活,从而上调了NK细胞的活化能力。
  最后,我们证实过表达LDLR,或通过PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,均可以增加NK细胞的胆固醇含量,进而增强其抗肿瘤活性。
  结论:
  血液中的胆固醇水平对免疫细胞的抗肿瘤作用具有重大影响。NK细胞内胆固醇蓄积可增加细胞膜表面的脂筏数量,促进激活性受体向脂筏的移位,进而激活下游信号通路,增强其肿瘤杀伤能力。目前,肿瘤的免疫治疗正在快速发展。我们的研究表明升高免疫细胞内胆固醇水平,可增强其杀伤功能,改善其抗肿瘤作用,为肿瘤的免疫治疗提供了新思路与新策略。
[博士论文] 马重
外科学(泌尿外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:膀胱癌是世界范围内发病率和致死率都很高的一种恶性疾病,是我国泌尿系统中发病率第一的肿瘤。根据膀胱癌细胞侵袭下层组织的深度,可以分为非肌层浸润和肌层浸润性。这两种类型的膀胱癌生物学表型不同、预后不同,临床对应的治疗方法也不同。非肌层浸润性膀胱癌,约占所有膀胱肿瘤的75%,若能早期诊断和治疗,预后较好,但是容易复发。非肌层浸润性膀胱癌,治疗上以经尿道膀胱肿瘤切除术为标准,术后可辅助丝裂霉素等化疗药物或卡介苗膀胱灌注来预防复发和进展。肌层浸润性膀胱癌,对局部组织侵袭严重,转移风险高,预后不良。膀胱癌一旦确诊浸润肌层,在尚未转移时,应当采用更积极的根治性全膀胱癌切除+尿流改道术治疗;根据术中切缘情况,以及术后局部复发、远处转移情况,进行放疗或全身化疗。膀胱癌侵袭深度和临床预后的异质性,反映了膀胱癌细胞在基因、蛋白质水平的差异。研究不同类型膀胱癌的基因差异,探讨高恶性程度膀胱癌的进展机制,是实现膀胱癌早期诊断、精准治疗的前提。
  现有的膀胱癌诊断技术以尿脱落细胞检查和膀胱镜检查为主。尿脱落细胞检查是一项无创性诊断技术,特异性高,但总体敏感性低,诊断低级别膀胱癌的敏感性不到20%。膀胱镜检查是将膀胱内窥镜经过尿道插入被检者膀胱,通过医生肉眼观察,发现形态可疑的新生物后,用活检钳夹取组织样本,进行病理学检查。膀胱镜检查是一项有创性操作,镜检过程会造成尿道、膀胱粘膜的破损,引起出血;检查后尿路感染风险很高。不仅如此,膀胱镜检会造成被检者疼痛和心理不适,患者依从性不够高。鉴于现有膀胱癌诊断技术的不足,发现基于尿液的无创性诊断标志物,具有较高的临床应用价值。新一代测序技术的发展、生物信息学平台的完善,为寻找膀胱癌诊断和分子分型的标志物提供了丰富的资源。也为了解膀胱癌发生、进展机制,提供了强大的工具和线索。
  研究目的:
  为了解国人膀胱癌测序结果,寻找潜在的膀胱癌诊断标志物,探索膀胱癌进展中的分子机制,课题组收集了一系列不同恶性程度的膀胱癌组织样本和患者尿液样本,利用高通量测序技术、体外及活体的细胞分子实验技术,对膀胱癌诊断标志物和分子机制进行研究。
  研究方法:
  1.利用转录组测序技术和生物信息学分析,对膀胱癌组织样本和自身配对的正常尿路上皮样本进行测序和分析,发现差异化表达基因,筛选具有潜在膀胱癌诊断价值、可能调控膀胱癌进展的关键分子。
  2.扩大样本量,抽取组织RNA,通过定量PCR方法,对发现的差异化表达基因Endocan进行验证。
  3.检索生物信息学平台Oncomine,分析Endocan在其他膀胱癌研究中的结果。
  4.构建尿液中Endocan蛋白的检测体系。收集膀胱癌患者和对照人群的尿液,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Endocan浓度,用尿肌酐浓度对检测结果进行标化、分析。
  5.制作含有不同恶性程度膀胱癌及正常尿路上皮的组织芯片。用免疫组织化学技术研究Endocan在组织芯片中的表达量。
  6.在膀胱癌细胞中用siRNA干扰Endocan表达,研究Endocan对增殖、迁移、侵袭等膀胱癌生物学表型的影响。
  7.利用慢病毒建立稳转的Endocan敲减膀胱癌细胞系,在裸鼠实验中,探索Endocan在膀胱癌发生、进展中的作用。
  8.通过流式细胞术,研究Endocan对膀胱癌细胞周期、凋亡的影响。
  9.用蛋白免疫印迹(Western-Blotting)研究Endocan与膀胱癌细胞自噬的关系,分析可能的分子机制。
  研究结果:
  1.在10对膀胱癌组织与自身配对的正常粘膜组织的转录组测序中,发现Endocan在膀胱癌组织中显著过表达。
  2.在扩大的组织样本中验证,Endocan在膀胱癌中的表达显著高于正常尿路上皮样本,并且Endocan表达量与膀胱癌恶性程度有关。
  3.在Oncomine数据库中,证实其他研究中Endocan在膀胱癌中也呈现过表达。
  4.在92例膀胱癌患者中检测经肌酐标化的Endocan含量为6.08±0.75,而37例对照人群的尿液中经肌酐标化的Endocan含量为0.75±0.18,差异显著。并且尿液中经肌酐标化的Endocan与膀胱癌恶性程度相关。
  5.在组织芯片研究中,Endocan在膀胱癌中总体表达高于正常尿路上皮,并且Endocan在肌层浸润性膀胱癌表达显著高于非肌层浸润膀胱癌。
  6.用siRNA干扰Endocan,可以显著降低T24、T921膀胱癌细胞系的增殖、迁移、侵袭等生物学表型。
  7.在裸鼠实验中,Endocan稳定敲减T24细胞系与对照细胞相比,成瘤率降低,瘤体增长速度受到抑制。
  8.用siRNA干扰Endocan,可抑制T24、T921膀胱癌细胞的早期凋亡,对膀胱癌细胞周期无显著影响。
  9.Endocan敲减可以上调膀胱癌细胞自噬。这一作用可能是通过mTOR介导的。
  研究结论:
  Endocan基因及编码蛋白膀胱癌组织中过表达,且表达水平与膀胱癌恶性程度相关。膀胱癌患者尿液中标化Endocan的浓度显著高于对照人群,Endocan具有潜在的膀胱癌无创性诊断标志物价值。Endocan参与膀胱癌发生、进展,干扰Endocan可以显著降低膀胱癌细胞的增殖、侵袭能力,并抑制细胞凋亡,这种作用可能是通过上调mTOR介导的细胞自噬引起的。
[硕士论文] 刘笑
急诊医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肿瘤是全球面临的最主要的健康问题之一,目前许多肿瘤尚无切实有效的治疗方法。当前,手术治疗、放疗和化疗是临床上抗肿瘤的三大传统治疗手段。传统治疗方法因副作用、疗效不一和并发症等因素受到诸多限制。随着肿瘤分子分型的发展,靶向药物正逐步代替传统化疗药物成为肿瘤学研究中的热点。相比传统化疗药物,靶向药物具有靶向性强、副作用小、有效改善患者生存质量等优势。肿瘤药物靶点筛选和靶向药物寻找逐步成为肿瘤学研究中的热门领域。
  上世纪七十年代,两届诺贝尔获奖者Linus Pauling就曾根据实验提出维生素C(VitminC,VC)对肿瘤具有治疗作用,但随后的大规模临床实验结果并没能支持该论点。近年来,国内外研究表明VC对多种肿瘤均具有抑制或者辅助治疗作用。Yun J等人[1,2]研究发现,KRAS或者BRAF突变的结直肠癌细胞高表达葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT1),进一步的研究发现GLUT1对氧化型维生素C(dehydroascorbate,DHA)具有转运作用,可将胞外的DHA转运至胞内;进入胞内的大量DHA容易分解,形成VC的同时导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的升高,消耗大量还原物质谷胱甘肽(glutathione,GSH)和还原型磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH),从而消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+),使甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性受到抑制,糖酵解途径受阻,耗尽ATP,最终导致细胞死亡。Yun J等人[1]继续用含有相同KRAS或者BRAF突变基因的结直肠癌细胞株进一步实验:在未加入还原剂的情况下,VC在细胞培养基中被氧化为DHA;在两组细胞株内分别加入还原剂GSH或GLUT1抑制剂STF,结果表明两组实验细胞株内的VC摄入明显减少;第三组细胞株中的GLUT1去除后加入VC,发现VC的摄入同样明显降低。考虑到GLUT1在突变基因细胞中的增强表达,将对照组普通细胞株中的GLUT1增加到与突变组等量的情况下观察,VC的摄入并没有明显的增加。因此,他们得出在KRAS或者BRAF突变基因的结直肠癌细胞株中GLUT1能使VC转运到细胞内,而且VC需要氧化成DHA才能被GLUT1转运,只有在突变基因株中VC的摄入会增高。既往研究口服VC无法在体内实现抗肿瘤的目的,静脉输注VC可以突破口服时血药浓度的限制,使得血液VC水平高于口服摄入的100-500倍,可能正是这种超高浓度的VC成了攻击癌细胞能力的关键。如果VC可以成为一个全新的肿瘤靶向药物,那将是肿瘤患者的福音。
  根据以上研究,我们进一步探讨①各肿瘤细胞中GLUT1的表达情况以及在其它肿瘤细胞中GLUT1能否使VC转运到细胞内?②如果GLUT1高表达或DHA浓度增加,DHA的摄入是否会增加?③利用HBO增加肿瘤微环境中的氧化应激,是否会通过增加DHA,进而增强抗肿瘤的效果?据此,我们在体外细胞实验的基础上,通过构建裸鼠模型,对VC联合HBO抗肿瘤的有效性做一初探,为临床VC联合HBO治疗肿瘤提供理论依据。
  方法:
  (一)维生素C对细胞增殖作用的检测
  1、利用qRT-PCR技术对13种33株不同肿瘤细胞系GLUT1相关编码基因进行初步检测,根据筛选结果选择GLUT1高表达以及GLUT1低表达肿瘤细胞用于后续对照实验。
  2、选择GLUT1高表达肿瘤细胞,分别加入不同浓度的还原型VC、DHA,利用MTT法检测12、24、48h后细胞增殖活性,筛选合理的VC浓度及作用时间用于后续实验。
  3、用筛选得到的合理浓度的还原型VC及DHA分别对GLUT1高表达、GLUT1低表达肿瘤细胞进行处理,设置只用PBS处理的对照组,利用MTT法检测细胞增殖活性。
  4、倒置显微镜下观察肿瘤细胞形态学改变,并观察细胞膜、细胞质及细胞核的变化。
  5、用GLUT1慢病毒转染GLUT1高表达肿瘤细胞下调GLUT1mRNA的表达,再次分为对照组、还原型VC组、DHA组进一步验证,MTT法检测细胞增殖活性。
  (二)裸鼠肿瘤模型的建立
  构建裸鼠皮下移植瘤用PBS调整细胞浓度为1×107ml-1,在裸鼠背部接种GLUT1高表达肿瘤细胞悬液0.2ml/只。接种裸鼠25只,长出移植瘤后随机分组,每组5只:对照组(control组,n=5)、高压氧组(HBO组,n=5)、大剂量还原型VC组(VC组,n=5)、HBO联合大剂量还原型VC组(HBO+VC组,n=5)。记录每天观察小鼠食欲、活动度及成瘤的情况;分别于1、2、3、4周测量小鼠肿瘤长短直径(a,b),根据公式ab2/2计算肿瘤体积变化情况;4周后以断颈处死小鼠,完整剥离肿瘤组织,称瘤重。应用统计学分析(P<0.05)为差异有统计学意义。
  结果:
  1、13种33株不同肿瘤细胞系均可检测到GLUT1表达,但是表达水平差异明显。我们选择GLUT1高表达的肺癌A549细胞以及GLUT1低表达的肺癌H1299细胞作为研究对象。
  2、采用MTT法对肺癌A549细胞增殖活性检测,结果显示还原型VC、DHA对A549细胞增殖均有抑制作用,总体在一定范围内随着VC剂量的增加细胞增殖抑制率也明显增加。同一浓度,同一时间内,与对照组相比,DHA对肺癌A549细胞具有明显的抑制作用(P=0.04);DHA组与还原型VC相比,对A549细胞增殖显著抑制(P=0.03);同一浓度,同一时间内,与列照组相比,DHA、还原型VC对H1299细胞增殖均无明显抑制(P>0.05),与还原型VC相比,DHA组对H1299细胞增殖无明显抑制(P>0.05)。
  3、利用GLUT1慢病毒感染肺癌A549细胞后,利用qRT-PCR检测siR-GLUT1A549,GLUT1mRNA表达下调80%。再次用同样的处理方式(对照组PBS及相同浓度还原型VC、DHA)处理后,结果显示与对照组相比,DHA与还原型VC组对siR-Glut1A549细胞增殖无明显抑制;与还原型VC相比,DHA对siR-Glut1A549肿瘤细胞增殖抑制作用无明显差异。
  4、体内实验显示,从给还原型VC后第1周开始,小鼠肿瘤体积较前增长,对照组、HBO组肿瘤体积明显增大;大剂量还原型VC组的肿瘤体积、大剂量还原型VC联合HBO组的肿瘤体积较前稍有增加,比前两组增长少。VC联合HBO组与对照组体积、瘤重差异有统计学意义(P<0.05);VC联合HBO组与还原型VC瘤重、体积相比有协同趋势,但无统计学意义(P>0.05)。
  结论:
  1、各肿瘤细胞均表达GLUT1,但是表达水平差异明显;我们成功筛选出了GLUT1高表达的肺癌A549及GLUT1低表达的肺癌H1299肿瘤细胞。
  2、在肺癌A549细胞中,GLUT1转运DHA进入细胞;GLUT1高表达或DHA量增加,则DHA摄入增加。
  3、与单独还原型VC相比,还原型VC联合HBO具有协同抗肿瘤的趋势,但无统计学意义。
[硕士论文] 韦荣强
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1、归纳En-bloc胰十二指肠切除术的手术策略和具体操作步骤,指导临床实践;
  2、探究En-bloc胰十二指肠切除术的可行性、安全性以及疗效。
  方法:
  1、结合胰十二指肠切除术主刀医师的指导、手术录像资料及相关文献回顾,对En-bloc手术策略和具体操作步骤进行归纳。
  2、回顾性分析2013年1月~2016年6月海军军医大学附属长海医院和长征医院胰腺外科邵成浩团队收治的139例行胰十二指肠切除并且术后病理证实为胰腺导管腺癌的病人的临床资料,其中2013年1月至2014年6月共70例病例行传统胰十二指肠切除术(Traditional Pancreatoduodenectomy,TPD),2014年7月至2016年6月共69例病例行En-bloc胰十二指肠切除术(En-bloc Pancreatoduodenectomy,En-PD),分别设为TPD组和En-PD组。观察指标包括:1)手术时间、术中出血量、肿瘤最大直径、切缘状态、TNM分期等;2)术后主要并发症发生率(胰瘘、术后出血、乳糜漏、腹腔感染、胃排空延迟等)、围手术期死亡率、术后平均住院时间、局部复发转移率、中位生存时间、总生存时间等。
  3、本研究拟对En-PD切除病例资料进行回顾性分析,观察临床疗效与预后,并与传统胰十二指肠切除术(TPD)病例资料相比较,探讨En-bloc手术策略的安全性、可行性及临床应用价值。
  结果:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除,其手术时间、术中出血量均高于TPD组(P值分别为0.017,0.016);En-PD组和TPD组术后平均住院时间、术后并发症发生率及死亡率差异无统计学意义(P值分别为0.592,0.810,1.000)。
  2、En-PD组和TPD组中,可能切除病例数分别是16例(23.2%)和14例(20.0%),均行联合PV/SMV整块切除重建术,差异无统计学意义(P=0.648)。两组术后R0切除率分别是91.3%和94.3%,淋巴结阳性率分别是44.9%和41.4%,差异均无统计学意义(P=0.532,P=0.677);但En-PD组平均淋巴结切除数目(13.58±11.19枚)多于TPD组(5.79±3.12枚),统计学差异明显(P<0.001)。
  3、En-PD组和TPD组术后局部复发转移率分别为29.0%、45.7%,有统计学差异(P=0.042)。En-PD组术后中位生存期为19.8个月,1年生存率和2年生存率分别为75.5%和21.7%;而TPD组术后中位生存期为20.9个月,1年生存率和2年生存率分别为72.9%和24.3%。两组生存期差异无统计学意义(P=0.061)。
  结论:
  1、En-bloc手术切除策略应用于胰十二指肠切除术在临床实践中安全、可行,但是建议在经验丰富的胰腺外科中心开展,尤其是对可能切除胰腺癌需行联合血管整块切除重建的病例。
  2、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术术后局部复发转移率低。
  3、与传统胰十二指肠切除术相比,En-bloc切除策略胰十二指肠切除术具有更高的淋巴结切除数目,有利于对转移淋巴结的清扫。
  4、En-bloc切除策略胰十二指肠切除术后总体短期疗效满意。
[博士论文] 黄海
外科学(泌尿外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  肿瘤内异质性是促进肿瘤进化、疾病进展,以及导致治疗失败和患者不良预后的重要原因。肿瘤干细胞样细胞,作为肿瘤细胞群体遗传构成的一个亚群,是肿瘤异质性的重要来源。在不同肿瘤中发现,肿瘤干细胞样细胞具备自我更新能力、化疗药耐药、扩增成为肿瘤细胞并具有转移潜能等特性,是肿瘤进展和耐药的重要因素。因此,揭示肿瘤干细胞样细胞内在的分子机制,有助于发现针对进展期肿瘤的新疗法,为临床实践提供理论基础。
  前列腺癌,是世界范围内威胁男性健康的最主要原因之一,且具有高度异质性。雄激素剥夺治疗作为目前广泛应用的一线疗法,尽管对于进展期或是复发性前列腺癌有短时间的缓解效果,但是,最终由于不可逆的耐药,而导致不良预后。
  越来越多的证据提示,雄激素剥夺治疗在诱导耐药的过程中,对前列腺癌细胞进行重编程,导致一部分前列腺癌细胞发展出肿瘤干细胞样细胞特性。并且,在复杂的肿瘤微环境中,多种成分发挥与前列腺癌细胞相互塑造、相互促进的作用,因此,揭示前列腺癌干细胞样细胞与肿瘤微环境细胞相互作用的分子机制,并联合阻断相关通路,将有助于提高雄激素剥夺治疗的有效性。
  内容及结果:
  (一)OV6作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标
  为了了解OV6在前列腺癌组织中的表达情况和患者预后相关性,我们分别在正常前列腺组织、局限性前列腺癌组织、局部性进展前列腺癌组织、激素抵抗性前列腺癌、神经内分泌分化前列腺癌组织中,同时在同一前列腺癌组织内部、不同Gleason评分区域、晚期前列腺癌雄激素剥夺治疗前后组织、原位前列腺癌雄激素剥夺治疗的动物模型、前列腺癌细胞转移的动物模型中,利用免疫组化检测OV6的表达水平,结果发现,OV6与前列腺癌的恶性程度呈正相关,并且在同一肿瘤组织内部高Gleason评分区域相对高表达,并且在前列腺癌雄激素剥夺治疗后组织和转移组织中相对高表达,说明OV6可作为肿瘤异质性和前列腺癌患者预后的指标。
  (二)OV6阳性前列腺癌细胞通过启动自噬维持肿瘤干细胞样细胞特征
  为了了解OV6阳性前列腺癌细胞是否具有肿瘤干细胞样细胞特征以及发挥维持干细胞特性的分子机制。我们通过定量PCR检测OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞基因表达;通过梯度稀释体外成球实验和体内成瘤实验检测OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力;通过增殖和凋亡实验检测OV6阳性前列腺癌细胞对于化疗和雄激素剥夺治疗药物的药物抗性,从而评估OV6阳性前列腺癌细胞的干细胞特性。并通过RNA全转录组测序和一系列分子生物实验如Co-IP、Duolink、ChIP等,探索OV6阳性前列腺癌细胞维持干细胞特性的分子机制,发现,OV6阳性前列腺癌细胞可以通过启动自噬过表达ATG7,维持细胞质内β-catenin的稳定性,并促进后者入核启动OCT4的转录激活,从而维持干细胞特性。
  (三)OV6阳性前列腺癌干细胞样细胞通过和单核细胞相互塑造发挥促进雄激素剥夺治疗耐药的作用。
  我们在上部分研究中发现,单独抑制OV6阳性前列腺癌细胞内部相关通路并不能有效提高原位前列腺癌异种移植模型中雄激素剥夺药物恩杂鲁胺的治疗效果,提示肿瘤微环境细胞可能参与耐药过程。我们通过OV6阳性前列腺癌细胞与单核细胞共培养,抗体芯片和ELISA检测细胞上清中细胞因子的表达变化,发现IL6是OV6阳性前列腺癌细胞和单核细胞相互作用的关键分子。两者的相互作用,一方面,增强OV6阳性前列腺癌细胞的自我更新能力,另一方面,招募并促进单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合抑制ATG7和IL6R可以有效提高前列腺癌细胞在原位前列腺癌异种移植瘤模型中对于恩杂鲁胺治疗的有效性。
  结论:
  在本项研究中,我们发现OV6阳性前列腺癌细胞具有干细胞特性,并且可以招募和促进肿瘤微环境中的单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化。联合靶向OV6阳性前列腺癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞之间的网络信号传导可以有效改善原位前列腺癌模型中前列腺癌细胞对于雄激素剥夺治疗的抗性,这为改善前列腺癌雄激素剥夺药物的耐药性和提高疗效,最终改善患者预后提供临床前研究的理论基础。
[博士论文] 沈頔
外科学(整形外科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:婴幼儿血管瘤是一种婴幼儿期较为常见的内皮细胞良性肿瘤。该肿瘤通常具有增殖期、消退期和消退完成期的临床病理特征。患者在出生后3-6个月发病并迅速进入增殖期。该病一般在患者3-7岁可自发出现消退。在增殖期,由于血管瘤内血流量迅速增加,瘤体快速增殖,可使肿瘤体积明显增大,从而对周围组织器官造成压迫症状。多发者可伴随其它相关病理表现。在消退期,肿瘤瘤体停止生长,并自发消退。多数患儿可不残留明显皮肤改变。但部分婴幼儿血管瘤因其深在,或者并发其他疾病,可导致严重的并发症。某些病例中最终残留的病变可影响患儿正常生活。目前对于婴幼儿血管瘤的治疗方法已逐渐统一,但是还没有一种治疗方法是完全有效和没有副作用的。这主要是因为对于其发病机制还没有完全研究清楚。目前普遍认为,相对于增殖期,消退期的婴幼儿血管瘤中内皮细胞的凋亡是一个重要的促进因素。
  miRNA又称为微小RNA,是一类自然界中普遍存在的小分子RNA。该类RNA对于维持机体内环境稳定,调控细胞和组织分化有重要意义。该类RNA并不通过编码蛋白质发挥作用,而是通过识别特定靶目标的mRNA,降解mRNA或部分抑制mRNA的表达,从而抑制靶目标蛋白的形成和发挥作用。目前有诸多文献均认为,在肿瘤中miRNA与细胞凋亡有着重要的关系。在前列腺癌中[1],miRNA-34可以下调Bcl-2蛋白表达,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。在恶性胶质瘤中[2],miRNA-153可以通过下调Bcl-2蛋白表达,促进细胞凋亡。在直肠癌中[3]存在着低表达的miRNA-195。通过在直肠癌细胞内高表达miRNA-195,可以促进直肠癌细胞的凋亡。我们之前对增殖期及消退期的婴幼儿血管瘤组织进行差异microRNA芯片检测和筛选,发现miR-29a-3p在不同期的组织中差异明显,且在消退期的婴幼儿血管瘤组织中明显高表达。同时,在诸多文献中,均发现miR-29家族成员可以通过作用于凋亡相关因素而抑制肿瘤的发展。通过实验[4]发现,在恶性肝细胞癌细胞株中,miR-29a可调控抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2,从而导致肝癌细胞的凋亡。在慢性淋巴细胞白血病、肺癌、乳腺癌中,miR-29a均表达下调。上调miR-29a表达可以激活P53的表达,并抑制CDC42、Tcl-1等多种增殖相关基因的表达,促进肿瘤细胞的凋亡。
  通过本研究,我们试图探讨miR-29a对婴幼儿血管瘤生物活性的影响,以及在婴幼儿血管瘤消退中的作用及其机制。以期对进一步了解婴幼儿血管瘤自发消退的机制有所裨益。
  第一部分:婴幼儿血管瘤内皮细胞的培养及鉴定
  实验目的:
  通过原代细胞培养的方法,获得可用于实验的增殖期婴幼儿血管瘤内皮细胞。
  实验方法:
  1、无菌条件下收集手术中新鲜的增殖期婴幼儿血管瘤标本,于6小时内转入实验室超净台中。以组织块贴壁培养法处理并培养血管瘤组织。培养数周后,获取其周围爬出的细胞,通过酶消化法收集。经过传代再培养。传至3-4代,细胞量足够时,收集并以CD31免疫磁珠分选,获得CD31阳性细胞。将细胞进行CD31-FITC的流式细胞学检验,以保证阳性细胞率达90%以上。
  2、将获得的高纯度的CD31阳性细胞进行培养,在倒置相差显微镜下观察其生长形态,并绘制生长曲线,行Matrigel基质胶成管实验,以确定该细胞的生长特性。
  3、通过CD31、vWF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,以明确该细胞为可用于下一步实验的婴幼儿血管瘤内皮细胞。
  实验结果:
  1、通过对增殖期婴幼儿血管瘤新鲜标本组织块的培养,细胞的收集、扩增、传代、并经CD31免疫磁珠分选,获得了足够量的细胞。通过CD31-FITC的流式细胞学检验,所获得CD31阳性细胞率为96%左右。
  2、获得的细胞通过培养,在倒置相差显微镜下观察,可见其形态为梭形,生长较为杂乱。生长曲线显示其具有较为旺盛的增殖活性。Matrigel基质胶成管实验显示其具有早期成管能力。
  3、通过CD31、vWF、Glut-1、VEGFA的细胞表面标志物免疫荧光检测,可见该细胞上述表面标志物表达均为较强阳性。
  实验结论:
  我们通过收集增殖期婴幼儿血管瘤标本,并经体外扩增培养并获得细胞。经形态学及免疫荧光抗体检测,其特征均符合文献的一般描述,证实为所需婴幼儿血管瘤内皮细胞。经流式细胞仪检测,该细胞纯度较高,活力较强,可用于下一步实验。
  第二部分:上调miR-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响
  实验方法:
  1、体外构建能够转染并可在细胞内稳定表达miR-29a的慢病毒颗粒Lv-hsa-miR-29a及阴性对照病毒Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin。
  2、以自身细胞作为阴性对照组,以Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin转染的细胞作为阴性病毒转染组,以Lv-hsa-miR-29a转染的细胞作为慢病毒转染组。通过荧光显微镜观察其荧光表达情况。通过qRT-PCR检测细胞在转染前后miR-29a表达的变化,从而确定其转染效率。
  3、在婴幼儿血管瘤细胞内过表达miR-29a后,采用MTT法检测其增殖能力的改变。流式细胞仪检测其周期及凋亡水平的改变,Transwell侵袭法检测其侵袭能力的改变,以研究过表达miR-29a对婴幼儿血管瘤内皮细胞生物活性的影响。
  实验结果:
  荧光显微镜下观察,FITC荧光表达显示miR-29a转染效果良好,转染效率约为95%左右。qRT-PCR结果显示miR-29a在婴幼儿血管瘤内皮细胞中的表达丰度为中等,转染慢病毒颗粒后,miR-29a基因的表达丰度是阴性对照组的2.643倍。转染病毒后72h,过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,其早期凋亡率约为10.82%,较阴性对照组及阴性病毒转染组有显著性差异。其晚期凋亡率约为1.72%,较阴性对照组有显著性差异。而细胞周期、侵袭及增殖实验结果均无显著性差异。
  实验结论:
  通过转染慢病毒颗粒Lv-hsa-miR-29a,可以构建稳定高表达miR-29a的细胞模型。过表达miR-29a后,婴幼儿血管瘤内皮细胞的凋亡率有显著性变化。而对于细胞周期、增殖及侵袭均无显著性影响。
  第三部分:miR-29a在婴幼儿血管瘤中作用机制的研究
  实验方法:
  1、以miR-29a过表达后的婴幼儿血管瘤细胞作为目标样本,以自身细胞作为阴性对照,采用miRNA基因表达谱芯片筛选的方法,获得两者之间有较大表达差异的mRNA表达谱。通过与TargetScan数据库进行比对,结合之前细胞功能学研究结果,参考相关文献,选取可能为miR-29a下游的靶基因作验证。
  2、通过双荧光素酶检测显示,miR-29a的下游作用分子可能为Mcl-1分子。
  3、通过Western-blot检测的方法,进一步验证在过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平是否有显著性变化。
  4、通过查阅文献及相关数据库,我们选取Stat3及Akt3这两个可能同时是Mcl-1上游及miR-29a下游靶蛋白的分子加以验证,进一步研究miR-29a是否通过调控Mcl-1上游分子表达以调控Mcl-1表达的可能。
  实验结果:
  参考miRNA芯片筛选、数据库分析结果及相关文献,我们获取相关分子作为miR-29a可能的下游靶蛋白并进行验证。通过双荧光素酶检测确定Mcl-1具有与miR-29a结合的相关位点,其为miR-29a可能的下游分子。通过Western-blot检测,证实了Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平均有显著性变化。同时,通过Western-blot检测,证实了Stat3及Akt3蛋白水平无显著性变化。
  实验结论:
  双荧光素酶检测发现,miR-29a与Mcl-1是直接相互作用并且可以找出相互作用的结合位点。通过Western-blot检测,在过表达miR-29a的婴幼儿血管瘤血管瘤内皮细胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白表达明显下调。而miR-29a与Mcl-1的上游分子Stat3和Ark3没有表达相关性,miR-29a并不能抑制或者激活Stat3和Ark3的表达。
[博士论文] 塔娜
病理学与病理生理学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  胰腺癌是一种较为常见的高度恶性的消化系统肿瘤,其五年生存率不足5%,中位生存期小于6个月。胰腺癌最常见的组织学类型为胰腺导管腺癌(PDAC),约占所有胰腺癌病例的85%-90%。患者死亡率高、预后差的主要原因是该疾病早期缺乏特异性临床症状和诊断及预后相关的分子标志物,大部分患者在诊断时肿瘤已发生转移,从而失去了手术机会,而且该肿瘤对放、化疗反应性差,极易复发转移。近年来,随着医学的发展,人类大多数恶性肿瘤患者的生存期有了显著增加,但胰腺癌患者的生存期并无明显改善,因此胰腺癌早期诊断及治疗成为亟待解决的问题。研究显示,胰腺上皮内瘤变(PanIN),尤其是高级别上皮内瘤变(PanIN-3),是胰腺导管腺癌最常见的非侵袭性癌前病变。早期诊断和手术切除可将胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6%提高到Ⅰ期的50%左右。若能找到胰腺癌特异性的分子标志物并在癌前病变阶段对该疾病进行诊断或有针对性的对胰腺癌高危人群进行筛查,胰腺癌患者的生存状况将会得到大大改善。此外,胰腺癌的发生发展涉及多种癌基因、抑癌基因以及表观遗传学等改变,探索胰腺癌的发病机制,将为胰腺癌诊断治疗提供新的思路。
  MicroRNA(miRNA)是一组内源性的非编码的单链小RNA分子,长度为19-24个核苷酸,主要通过与其靶标mRNA的3'UTR区域互补结合,导致mRNA的降解或翻译的抑制,在转录后水平调节30%的蛋白质编码基因的表达而发挥作用。一个miRNA可能对应多个靶点,同时,多个miRNA也可能作用于同一个靶点。miRNA的异常表达与多种肿瘤发生发展的重要过程息息相关,例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。目前研究表明,miR-21,miR-155,miR-196a和miR-210在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用,或可作为胰腺癌潜在的分子标记物。然而多种研究中特异性miRNAs的一致性较差,应用中其敏感性和特异性仍有待提高。因此,本研究主要致力于发现更有优势的胰腺癌尤其是PanIN-3特异性的miRNAs并探索其作用机制,为胰腺癌的诊断、治疗和预后判断提供新的切入点。
  目的:
  筛查PanIN-3及胰腺癌组织中异常表达的miRNAs,并在胰腺癌组织和外周血浆中进行验证,研究其对胰腺癌生物学特性的影响,并分析其相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性,再通过生物信息学方法寻找并鉴定其下游作用的靶基因,进一步探寻其作用机制。
  方法:
  1.利用miRNA芯片技术筛查PanIN-3及胰腺癌组织中较胰腺正常导管及低级别上皮内瘤变组织中显著差异表达的miRNAs。
  2.利用原位杂交和实时荧光定量PCR技术,在胰腺癌患者石蜡包埋组织和外周血浆中进一步验证上述miRNAs的表达情况,获得可能作为诊断标志物的候选miRNAs,并分析其诊断效能。
  3.结合胰腺癌患者临床病理资料,分析候选miR-1290的相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性。
  4.通过细胞学实验:观察miR-1290对胰腺癌细胞株生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性的影响。
  5.通过动物实验:研究miR-1290对胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生物学特性的影响。
  6.利用生物信息学(MiRDB,Targetscan,MiRanda)分析技术,预测miR-1290可能的下游靶基因,并利用双荧光素酶报告基因系统分析其与miR-1290的关系,并进一步验证其对胰腺癌生物学行为的影响。
  7.利用实时荧光定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学技术,分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌旁正常组织中的表达情况,探讨其临床意义。
  结果:
  1.miRNA芯片结果显示:与正常胰腺导管上皮和低级别上皮内瘤变相比,PanIN-3和胰腺癌中表达明显上调或者下调(超过5倍)的miRNAs有30余种,结合文献,筛选出其中的19条作为候选miRNAs。其中上调的主要有miR-31-5p,miR-29a-5p,miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,miR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p,miR-29a-3p,miR-34a-3p,miR-155;下调的主要有miR-105-3p,miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。
  2.原位杂交结果显示:以“PanIN-3和癌组织中表达明显高于正常导管上皮和低级别上皮内瘤变(PanIN-1和PanIN-2)”作为判定标准,筛选出高表达的miRNAs共计6条,包括miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p以及miR-155。
  3.血浆实时荧光定量PCR验证结果显示:胰腺癌患者外周血浆中,miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表达均明显增高,差异具有统计学意义。绘制ROC曲线比较其诊断效能,miR-31-5p和miR-1290具有相对较好的诊断效能,AUC分别为0.848和0.829。
  4.组织实时荧光定量PCR验证结果显示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺导管腺癌组织中高表达,癌旁正常组织低表达,与外周血浆结果相一致,提示miR-31及miR-1290可能是参与高级别上皮内瘤变向胰腺癌转变这一过程的早期分子,具有成为胰腺癌早期诊断分子标志物的潜能。结合患者的临床病理资料进一步发现miR-1290高表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移密切相关(p<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。提示miR-1290可能参与肿瘤的侵袭转移。
  5.miR-1290对胰腺癌细胞株生物学特性的影响:(1)检测五株胰腺癌细胞株中miR-1290的表达量,发现其在AsPC-1中表达最低,在PANC-1中表达最高,选取这两株细胞分别进行过表达和抑制实验。(2)验证转染效果:转染miR-1290Agomir的细胞系中,miR-1290被成功过表达,转染miR-1290Antagomir的细胞系中,miR-1290被成功抑制。(3)平板克隆实验结果显示,过表达miR-1290可显著促进细胞增殖和集落形成(p<0.05)。(4)细胞增殖活性实验结果显示,miR-1290过表达,细胞增殖速度加快,24小时活细胞数量明显高于对照组(p<0.05);miR-1290抑制后,细胞增殖速度减慢,24小时活细胞数量明显少于对照组(p<0.05)。(5)细胞迁移及侵袭实验结果显示,过表达miR-1290可促进胰腺癌细胞迁移和侵袭(p<0.05);抑制miR-1290,细胞迁移和侵袭能力显著下降(p<0.05)。与细胞划痕实验趋势一致。(6)凋亡实验结果显示,过表达或抑制miR-1290对细胞凋亡无明显影响(p>0.05)。
  6.裸鼠皮下荷瘤实验结果显示:过表达miR-1290可增加胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积更大(p<0.05);抑制miR-1290可减弱胰腺癌细胞成瘤能力,形成的肿瘤体积减小(p<0.05)。
  7.生物信息学结果显示,IKKα可能为miR-1290的靶基因之一。
  9.IKKα对胰腺癌细胞功能学实验结果显示:(1)抑制IKKα在胰腺癌细胞系中的表达,可促进其增殖、迁移和侵袭;(2)过表达IKKα,可逆转miR-1290对胰腺癌细胞系促增殖、迁移和侵袭的作用;(3)改变胰腺癌细胞系中miR-1290及IKKα的表达量,NF-κB信号通路相关的蛋白IKBα、P65和P50表达无明显变化。
  结论:
  1.通过miRNA芯片、原位杂交以及组织和血浆中差异性表达miRNAs的筛查,6条miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表达升高。
  2.胰腺癌组织中差异性表达的miRNAs与胰腺癌患者血浆中差异性表达的miRNAs具有一致性,提示血浆中miRNAs有望成为胰腺癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。
  3.miR-1290在胰腺癌组织及胰腺癌患者外周血浆中表达均显著升高,且其表达水平与胰腺癌患者肿瘤分化程度及淋巴结转移相关,提示miR-1290可能成为胰腺癌诊断及预后判断的分子标志物。
  4.miR-1290可通过促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及成瘤能力,参与胰腺癌生物学行为的调控,其在胰腺癌发生发展中可能起着癌基因的作用。
  5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一,其可直接被miR-1290抑制(结合位点为3'端843-849处),促进胰腺癌的增殖、迁移和侵袭,提示miR-1290及其靶基因IKKα可能成为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。
  6.IKKα作为miR-1290靶基因之一参与胰腺癌发生发展,可能通过非NF-κB依赖的信号通路发挥作用。
[博士论文] 鲍蕾蕾
基础医学;免疫学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,基因组测序技术的快速发展,加深了人们对肿瘤异质性的认识,含有大量肿瘤临床样本多组学数据库的TCGA及Oncomine分析平台为肿瘤个体差异的基因分型、治疗与生存期的整合研究提供了大样本数据库,受到国内外学者的广泛关注,并越来越多地运用到肿瘤的个体化精准治疗的研究中来。
  肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一,现已成为中国第二世界第三位的癌症死亡原因。中国为肝癌高发病率国家,手术切除被认为是可能治愈初诊HCC患者的疗法,但只有约10%~20%的患者肿瘤可切除,且手术病人面临肿瘤复发的可能,最近的统计发现2000年至2014年间中国肝癌患者5年生存率仅为14.1%。
  近年来针对肝癌靶向治疗药物的研发逐渐成为热点,但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突变参与了肝细胞癌的发生发展,而其精确的分子机制尚不完全清楚,导致靶向制剂对肿瘤患者个体的治疗效果差异大,药物靶向性较低。目前,作为首个美国FDA批准上市,用于晚期HCC靶向治疗的多激酶抑制剂索拉菲尼,其有效率也仅为25%。
  1995年Lever在The Lancet杂志发表一项大型开创性回顾研究,发现服用血管紧张素酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEIs)和血管紧张素受体抑制剂(angotensin recepter blockers,ARBs)的病人比未服用该类药物的病人患乳腺癌和肺癌的风险更低。随后另一部分的学者进行相关研究却未得到类似结果。这个不同的研究结果引起众多学者的关注,在这些研究中除了入选患者种族、人群及服药周期等不同因素外,由于受到基因测序技术的限制,大部分的患者未做个体基因表达谱测定,导致患者个体基因差异未做考虑。在后续的研究中发现,在肾素血管紧张素系统中一个关键受体AT1R(type-1angiotensinⅡ)其编码的基因AGTR1在多个肿瘤中发生异质性表达,并且高表达该基因会引起多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良预后,但是AGTR1基因在肝细胞癌中的表达及对肝癌的影响却少有报道。对TCGA数据库中全部3个肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据的AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用的基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。
  第一部分 AGTR1差异表达对肝细胞癌发展的影响
  选用Oncomine数据库中全部3个肝细胞癌的临床347例RNA芯片数据,发现AGTR1基因在这3个数据集中均位于过表达基因前5%,并在部分肝细胞癌患者中出现高表达。同时在TCGA数据库中对全部374例的肝细胞癌临床样本进行差异分析,发现AGTR1表达前80位和后80位的样本AGTR1的相对表达具有显著差异,进一步结合数据库中肝细胞癌样本预后数据,采用Kaplan-Meier生存分析,发现低表达组患者的生存期较高表达组显著延长。以上结果说明,AGTR1在部分肝细胞癌患者中呈高表达,且这种高表达与患者的生存期相关,由此初步推断AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用。为了证明AGTR1基因在肝细胞癌发生、发展及转移中的作用,筛选低表达AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404细胞,对它们进行过表达AGTR1的改造,同时选择高表达AGTR1的MHCC-97H细胞进行干扰表达的改造,体内外研究AGTR1对肝细胞癌的作用。结果发现AGTR1在体外实验中具有促进肿瘤细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移的作用,而在体内试验中能加速裸鼠皮下成瘤试验的肿瘤形成及生长。此外,采用含有luciferine片段的载体构建sh-AGTR1和sh-nc,稳筛低表达AGTR1的MHCC-97H细胞,采用小动物活体成像系统,在体观察不同AGTR1表达量的MHCC-97H细胞在脾脏肝转移模型中的转移情况,发现抑制AGTR1可以降低MHCC-97H肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。
  第二部分 AGTR1差异表达影响肝细胞癌生长的作用机制研究
  为了探讨AGTR1促进HCC细胞生长、转移作用机制,采用Westen Blot方法检测过表达和干扰表达AGTR1对HCC细胞信号通路的影响,发现过表达HCC细胞中的AGTR1可以促进JAK2、STAT3、ERK的磷酸化,抑制AGTR1则可以降低相应分子的磷酸化。且JAK2特异性抑制剂AG490可以抑制AGTR1介导的HCC细胞的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力。此外,先用TCGA数据库中374例肝细胞癌患者的mRNA芯片数据,对VEGF与AGTR1进行相关性分析,发现随着AGTR1的表达量的上升,VEGF与AGTR1表达相关性也随之上升。对低表达AGTR1的SMMC-7721,BEL-7404细胞过表达AGTR1,两个细胞内VEGF的表达也随着AGTR1的表达上升而上升。对高表达AGTR1的MHCC-97H细胞干扰表达AGTR1,VEGF的表达也随之下降,且因AGTR1的高表达或过表达引起的VEGFA的上调表达可以被AG490抑制。由此可以推断,AGTR1的高表达可能会促进细胞内JKA2的磷酸化,进而激活细胞质内STAT3、ERK等分子的磷酸化,这些磷酸化的分子可进入细胞核,启动VEGF等分子的转录、翻译、合成,促进细胞分泌VEGF等细胞因子,大量新分泌的VEGF与细胞表面的受体结合可能会进一步激活细胞内STAT3、MAPK等信号通路,促进肿瘤内新生血管的生成及细胞的增殖、迁移等生物学过程。
  第三部分 AGTR1抑制剂对HCC细胞体内外抗肿瘤作用效果研究
  本部分研究中选择临床应用时间最长、应用病例最多的洛沙坦作为靶向AGTR1的抑制剂考察其作用效果。在体外实验中,发现当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高表达的MHCC-97H细胞和AGTR1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,但对AGTR1低表达的SMMC-7721细胞和AGTR1干扰表达的MHCC-97H细胞则无上述作用。体内实验中,选用高表达AGTR1的MHCC-97H细胞,在裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药,相比空白对照组,20mg·Kg-1~80mg·Kg-1给药剂量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。免疫组化分析发现随着给药剂量的增加,瘤内AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表达水平显著下降,血清VEGFA量也随着洛沙坦的给药剂量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在体内外水平对AGTR1高表达HCC细胞生长及肿瘤血管形成的抑制作用。
  综上所述,本课题通过TCGA数据库中全部肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据,对AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用,在此基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。对6种不同的肝细胞癌细胞系(HepG2、BEL-7402、BEL-7404、SMMC-7721、MHCC97H、HLF)与正常肝细胞系(QSG-7701)进行AGTR1的mRNA及蛋白的表达检测,证实相比正常肝细胞系(QSG-7701),肝细胞癌细胞系MHCC97H、HLF中AGTR1mRNA和蛋白水平均有显著的上调表达,而在BEL-7404、SMMC-7721中AGTR1mRNA和蛋白水平的表达显著低于正常肝细胞的表达水平。通过验证临床肝癌样本中AGTR1的表达情况,显示33例肝细胞癌样本中有20例临床样本AGTR1呈上调表达或高表达。进一步通过体内外实验,发现过表达AGTR1后可促进HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,加速裸鼠皮下肿瘤形成及生长;而抑制AGTR1的表达可降低HCC细胞体外增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移能力,并降低HCC肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。通过对AGTR1相关通路的分析,揭示AGTR1高/过表达HCC细胞主要通过JAK2/STAT3通路介导其生长、增殖、迁移及侵袭过程,同时验证了AGTR1靶向抑制剂的作用。在药效实验中,探讨以AGTR1靶向抑制剂洛沙坦对HCC细胞的作用效果,结果发现在体外试验中,当洛沙坦浓度为1~100μM时,能够不同程度的抑制AGTR1高/过表达HCC细胞的体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。在体内实验的裸鼠皮下成瘤模型中,经过4周给药(20mg·Kg-1~80mg·Kg-1),洛沙坦能显著抑制AGTR1高表达HCC细胞裸鼠皮下肿瘤的生长,降低肿瘤组织中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表达。由此证明了洛沙坦在体内外水平具有抑制AGTR1高表达HCC细胞生长的作用。研究结果明确了AGTR1在肝癌发生发展中的作用,探讨了AGTR1促进肝细胞癌细胞异常生长的可能机制,为AGTR1高表达肝细胞癌靶向治疗药物的发现及应用提供了实验数据。
[硕士论文] 陈海虎
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 探究分段读出平面回波和单次激发平面回波成像序列对膀胱癌成像图像质量的影响
  目的:探究分段读出平面回波成像(RS-EPI)和单次激发平面回波成像(SS-EPI)序列对膀胱癌磁共振扩散加权成像(DWI)图像质量的影响。
  方法:前瞻性收集膀胱镜活检证实为膀胱癌的35例患者,均行膀胱3.0T磁共振RS-EPI和SS-EPI序列扫描。2名放射科诊断医师分别在两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检测性、运动伪影和图像模糊程度四个方面进行评分。由1名放射科诊断医师测量并计算两种DWI图像的信噪比(SNR)、对比度噪声比(CNR)、信号强度比(SIR)和表观扩散系数(ADC)值。采用Kappa检验评价2名医师评分的一致性,分别采用配对样本t检验和配对Wilcoxon秩和检验比较两种序列定性评分和定量评价指标的差异。
  结果:2名医师在RS-EPI和SS-EPI两种序列上对膀胱癌图像的磁敏感伪影、病灶检出性、运动伪影和模糊程度的评分一致性较好,Kappa值分别为0.878、0.860、0.748、0.842。RS-EPI和SS-EPI的图像比较,磁敏感伪影、病灶检测性和图像模糊程度的评分差异具有统计学意义(P均<0.05),运动伪影评分无统计学差异(P>0.05),RS-EPI的图像质量明显优于SS-EPI。SS-EPI与RS-EPI序列上膀胱病变的SNR分别为96.65±51.59和85.79±43.41,CNR分别为3.54±1.26和3.91±1.21,SIR分别为5.03±1.26和5.51±1.35,ADC值分别为1239.09±253.73×10-6mm2/s和1230.16±239.60×10-6mm2/s,两者SNR和ADC值的差异无统计学意义,P值分别为0.085和0.627。两者CNR和SIR的差异具有统计学意义,P值分别为0.024和0.015。
  结论:3.0T磁共振中RS-EPI序列较SS-EPI序列明显提高了膀胱癌的DWI图像质量,且SS-EPI和RS-EPI图像中病灶ADC值无显著差异,RS-EPI序列可替代SS-EPI序列在膀胱癌的术前分期及分级中的应用并提供更高质量的诊断图像。
  第二部分 磁共振高分辨率T2WI联合分段读出平面回波成像鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的临床价值
  目的:评估磁共振高分辨率T2加权成像(HR-T2WI)、分段读出平面回波成像(RS-EPI)及两者联合鉴别非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)的临床价值。
  方法:本研究采用前瞻性研究方法,连续纳入95例膀胱镜活检证实为膀胱癌、最终行手术治疗并有明确手术病理分期的患者,均行3.0 T磁共振HR-T2WI和RS-EPI序列成像。2名放射科诊断医师分别在HR-T2WI、RS-EPI及HR-T2WI+RS-EPI上独立分析膀胱癌是否浸润肌层,以病理结果为金标准,绘制受试工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度、准确度和AUC,并采用DeLong检验比较三种方法诊断效能的差异。
  结果:三种诊断方法在鉴别NMIBC和MIBC的诊断中,HR-T2WI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为95.5%、83.4%、88.5%和0.889; RS-EPI的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.1%、94.1%、89.5%和0.891;HR-T2WI+RS-EPI的灵敏度、特异度为、准确度和AUC分别为93.1%、100%、96.8%和0.966。HR-T2WI联合RS-EPI的诊断效能明显优于两者单独诊断的效能。
  结论:HR-T2WI+RS-EPI可作为术前无创、精确鉴别肌层和非肌层浸润性膀胱癌的检查方法。
[硕士论文] 彭立嗣
内科学(消化系病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)不仅有细胞保护作用,而且参与抗癌药物耐药性的产生。但是,GST同工酶在胰腺癌化疗耐药中的作用仍不清楚。本研究将检测GSTM2基因在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达。并通过siRNA及shRNA沉默GSTM2基因,分别转染胰腺癌细胞及注入裸鼠胰腺构建原位移植瘤模型后用吉西他滨处理,从体外、体内实验两个层面观察在胰腺癌中沉默GSTM2对吉西他滨敏感性的影响。最后分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  结果表明吉西他滨处理可以增加胰腺癌细胞株及胰腺癌组织中GSTM2的表达。沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞的凋亡增加、活力降低,体内实验进一步表明在裸鼠胰腺原位移植瘤模型中利用shRNA诱导GSTM2沉默,能增强吉西他滨化疗的药物敏感性。研究还发现,GSTM2在胰腺癌组织中的表达低于正常胰腺组织,而GSTM2的高表达则与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  综上所述,GSTM2能使接受吉西他滨处理的胰腺癌细胞产生耐药性并存活,故吉西他滨也能增加胰腺癌细胞株中GSTM2的表达,GSTM2在胰腺癌中的沉默有益于增强吉西他滨的化疗效果,胰腺癌患者中GSTM2的高表达与总体生存期显著相关。因此,GSTM2有潜力成为优化胰腺癌化疗方案选择和预测胰腺癌预后的生物标志物。
  一、GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株及接受新辅助化疗的胰腺癌患者癌组织中的表达
  目的:分析吉西他滨处理胰腺癌细胞及癌组织对GSTM2表达的影响。
  材料和方法:利用qRT-PCR和western blot检测吉西他滨处理前后GSTM2在胰腺癌细胞株中的表达情况。收集接受吉西他滨新辅助化疗后手术和仅接受外科手术的胰腺癌患者的癌组织标本,进行免疫组化染色,比较两组中GSTM2表达水平的差异。
  结果:GSTM2在经吉西他滨处理的胰腺癌细胞株中的表达水平明显高于未经吉西他滨处理的对照组;在接受吉西他滨化疗的胰腺癌患者组织中的表达水平明显高于仅接受外科手术的患者。
  结论:吉西他滨能使胰腺癌细胞和胰腺癌组织中的GSTM2表达水平上升,初步证实GSTM2参与胰腺癌吉西他滨化疗耐药性产生。
  二、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体外实验研究
  目的:检测siGSTM2对吉西他滨处理胰腺癌细胞株的化疗敏感性的影响。
  材料和方法:运用siRNA技术沉默BXPC-3、Panc-1、L3.6pl和MPanc96四种胰腺癌细胞株中的GSTM2基因,利用qRT-PCR和western blot检测沉默效果。再用吉西他滨处理上述细胞株,通过流式细胞仪检测癌细胞的凋亡水平,应用MTT分析法检测细胞活力。
  结果:qRT-PCR和western blot检测结果示siRNA转染4种胰腺癌细胞株成功,沉默GSTM2效率高,均在60%以上。经吉西他滨处理后,siGSTM2组与siControl组相比癌细胞凋亡率明显更高、活力显著降低。
  结论:siGSTM2能在胰腺癌细胞株中高效沉默GSTM2基因。沉默GSTM2能增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。
  三、沉默GSTM2对胰腺癌化疗敏感性影响的体内实验研究
  目的:检测shGSTM2对裸鼠胰腺原位移植瘤行吉西他滨化疗敏感性的影响。
  材料和方法:用shGSTM2对胰腺癌细胞株Mpanc96进行转染,行qRT-PCR和western blot检测评估沉默效果。将证实已被shRNA成功转染的Mpanc96细胞株原位注入裸鼠胰腺,构建裸鼠胰腺原位转移瘤模型。用IVIS成像系统予以生物荧光成像明确成瘤效果。用吉西他滨处理胰腺癌原位瘤后,用Living Image软件程序进行定量分析瘤体体积变化。
  结果:shRNA转染Mpanc96成功且沉默GSTM2效果佳。生物荧光成像可见裸鼠胰腺位置有荧光信号,移植瘤成瘤,建模成功。shGSTM2+吉西他滨组裸鼠瘤体体积最小。
  结论:沉默GSTM2能在体内增强胰腺癌吉西他滨化疗的敏感性。
  四、GSTM2在胰腺癌患者中的表达与临床预后相关性的研究
  目的:分析GSTM2在胰腺癌患者中的表达及与临床预后的相关性。
  材料和方法:收集于我院确诊胰腺癌的50例手术患者的癌组织标本,以癌旁组织及正常人的胰腺组织样本作为对照,检测GSTM2的mRNA表达水平的差异。根据GSTM2的平均蛋白表达量将胰腺癌样本分为GSTM2低表达组和GSTM2高表达组,分析两组生存期的差异。
  结果:GSTM2在胰腺癌患者胰腺组织样本中的表达显著低于癌旁组织及正常人的胰腺组织样本。GSTM2低表达组的胰腺癌患者较高表达组患者的总体生存率低,预后差。
  结论:GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  总结上述研究,可得出结论如下:
  1、吉西他滨可以增加胰腺癌中GSTM2的表达。
  2、沉默GSTM2可使经吉西他滨处理的胰腺癌细胞凋亡增加、活力降低。
  3、沉默GSTM2能使接受吉西他滨化疗的裸鼠胰腺原位移植瘤体积缩小,在体内增强吉西他滨化疗的敏感性。
  4、GSTM2在正常人中的表达高于胰腺癌患者,且GSTM2高表达与胰腺癌患者生存率高、预后好呈显著相关。
  5、GSTM2有潜力作为生物标志物筛选对吉西他滨高敏感的胰腺癌患病人群行精准治疗,同时预测胰腺癌的预后。
[硕士论文] 孙戈
外科学(普通外科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  1、低位直肠癌实行经括约肌间切除术之后有着较多的排便失禁情况,本研究从与齿状线不同距离的粘膜下神经纤维密度和括约肌间隙内外侧神经纤维密度以及直径分布特点的角度,解释其失禁现象的原因。
  2、比较直肠癌适形切除术与低位前切除术及腹会阴联合切除术的排便功能和肿瘤学预后。
  方法:
  1、收集2016年11月至2017年4月在海军军医大学第一附属医院肛肠外科行腹会阴联合切除术(APR)治疗的16例患者,其中4例行术前放化疗,12例未行术前放化疗。对包含内外括约肌的大切片进行H-E、VB染色及S-100免疫组织化学染色,研究直肠肛管的精细结构并识别其分布的神经特点。
  2、2011年至2016年某一手术组共收治低位直肠癌病人175例,按照所行手术方式分为适形切除术组(第1组,52例),低位前切除术组(第2组,54例)和腹会阴联合切除术组(第3组,69例)。并回顾性分析其人口统计学,临床病理学和随访的肿瘤学和排便功能预后数据。
  结果:
  1、直肠粘膜下神经纤维的密度在齿状线以下5mm处最高。在齿线水平以下,相对于粘膜下层、内括约肌及外括约肌,括约肌间隙具有最高的神经纤维密度和最大的神经纤维直径,此外括约肌间隙可见Pacinian小体和大量的弹力纤维。
  2、与LAR组相比,CSPO组的肿瘤位置较低[3(3-4)vs.5(4-5)cm,P<0.001],远切缘较短[0.5(0.3-1)vs.1.5(1-2)cm,P<0.001],肿瘤直径较小[3(2-3.7)vs.3.5(2.75-4.5)cm,P=0.003],T分期及N分期更早。在Wexner评分,患者在排便满意率,随访时间,局部复发率,远处转移率,总生存率和无进展生存率方面,CSPO组与LAR组间差异无统计学意义。与APR组相比,CSPO组肿瘤部位相似,肿瘤直径较小,T分期较早,N分期较早,远处转移率较低(P=0.03),无进展生存期较长(P=0.03),总生存期较长(P=0.02)。
  结论:
  1、低位直肠癌术中应尽可能多的保留肛门内括约肌、齿线和肛管组织,以更多的保留齿状线周围丰富的粘膜下神经组织,同时应该避免括约肌间隙从上向下过多的分离,从而减少破坏括约肌间隙内的神经纤维,Pacinian小体以及弹力纤维。
  2、与LAR组相比,CSPO组肿瘤位置明显更低,分期更早,术后肿瘤学预后和控便能力相当。与APR组比较,CSPO组肿瘤位置相似,分期更早,远处转移率更低,无进展生存期和总生存期更长。因此,适形切除术可作为早期超低位直肠癌病人不适用于低位前切除术,而可能需要行腹会阴联合切除术情况时,一种替代性保肛手术。
[博士论文] 王扬
内科学(血液病学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本研究第一部分应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人存在显著差异表达的lncRNA CUST37778。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。第二部分观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性。第三部分阐明了lncRNA CUST37778可增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  第一部分 急性B淋巴细胞白血病中差异表达的lncRNA的筛选
  目的:应用新型基因表达谱芯片筛选出在急性B淋巴细胞白血病中存在显著差异表达的lncRNA。
  方法:应用新型基因表达谱芯片检测lncRNA,筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人表达存在显著差异的lncRNA。采用定量PCR技术在新的独立样本中验证前期的筛选结果。利用核质分离实验确定lncRNA CUST37778的亚细胞分布。
  结果:1.采用新型表达谱芯片检测了6对初发急性B淋巴细胞白血病患者单个核细胞和正常人单个核细胞,获得lncRNAs差异表达谱,发现lncRNA CUST37778在初发或复发急性B淋巴细胞白血病中的表达水平明显高于急性B淋巴细胞缓解组与正常对照组。
  2.扩大临床样本量,利用定量PCR对差异表达的lncRNA CUST37778进行验证,27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病骨髓单个核样本,32例急性B淋巴细胞白血病完全缓解骨髓单个核样本及48例健康人骨髓单个核样本,检测发现lncRNA CUST37778在初发及复发样本中的表达显著高于完全缓解组及对照组。
  3.lncRNA CUST37778同时存在于急性B淋巴细胞白血病细胞的胞质和胞核,胞核中含量约占总量的60%。
  结论:应用新型基因表达谱芯片筛选出急性B淋巴细胞白血病初发及复发患者相对于急性B淋巴细胞白血病缓解患者及健康正常人显著高表达的lncRNA CUST37778,且lncRNA CUST37778同时存在于细胞胞质和胞核。
  第二部分 lncRNA CUST37778表达水平与初发及复发ALL患者临床参数相关性分析
  目的:观察分析lncRNA CUST37778表达水平与急性B淋巴细胞白血病临床参数及预后的相关性
  方法:收集自2015年8月至2016年10月在我院血液科诊疗的27例初发及复发急性B淋巴细胞白血病患者的临床资料,观察指标为基本临床特征及诊断信息即性别、年龄、初诊外周血白细胞计数、初诊骨髓原始细胞比例(%)、细胞遗传学及分子生物学异常、预后分层评估、首次诱导治疗后是否达完全缓解(CR1)、生存情况(包括复发或死亡)。利用ROC曲线分析界定lncRNA CUST37778的表达量界值,将27例初发及复发B-ALL患者分为高、低表达两组,统计分析在lncRNA CUST37778高、低表达组中所收集的B-ALL患者的临床参数是否存在统计学差异。两组间比较采用卡方检验,生存资料分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用log-rank检验,生存分析采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析,所有多变量回归分析均列出OR或HR以及95%的置信区间用于风险评估。
  结果:1.利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,将27例初发及复发B-ALL患者分为高表达、低表达两组。外周血血小板计数<100×109(p=0.0370*)、骨髓原始细胞比例≥42%(p=0.0130*)在lncRNA CUST37778高表达组中的发生率显著高于lncRNA CUST37778低表达组中。而高表达组和低表达组在性别(p=0.125)、年龄(p=0.8947)、外周血白细胞计数(p=0.2059)、外周血血红蛋白水平(p=0.8857)、是否Ph染色体阳性(p=0.3261)、危险分层(p=0.4113)方面均无显著统计学差异。
  2.27例B-ALL患者接受一个疗程诱导化疗后,共14例达缓解,首次诱导缓解率为51.85%,lncRNA CUST37778高表达组与低表达组在首次诱导完全缓解率上未发现存在统计学差异(P=0.7448)。
  3.1ncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势,与低表达组相比OS(p=0.0436)和DFS(p=0.0471)存在显著统计学差异。
  结论:利用ROC曲线分析界定27例初发及复发B-ALL患者中lncRNA CUST37778的表达量界值为0.2135,在lncRNA CUST37778高表达组中的患者更易出现较低的外周血血小板水平和较高的骨髓原始细胞比例。lncRNA CUST37778的表达水平对患者对化疗敏感性并无明显影响。lncRNA CUST37778高表达患者存在较差的预后趋势。
  第三部分 lncRNA CUST37778增强急性B淋巴细胞白血病的增殖活性和浸润能力
  目的:明确lncRNA CUST37778在B-ALL发生发展中的作用机制。
  方法:利用Real-time PCR方法检测B-ALL和Nalm-6细胞中lncRNA CUST37778的表达水平。筛选出干扰效率最佳的siRNA,应用其对于lncRNA CUST37778在B-ALL和Nalm-6细胞中的表达水平进行干扰,Real-time PCR鉴定干扰效率;干扰B-ALL和Nalm-6细胞后,CCK-8检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,Q-PCR和Western blot检测细胞凋亡与细胞增殖关键因子Bcl-2、Bax、PCNA、P21、P27的表达水平;Western blot检测MAPK通路关键因子ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、P38、p-P38的表达和PI3K-AKT信号通路关键分子AKT、p-AKT、NF-kB、p-NF-kB、STAT3、p-STAT3、β-catenin和Notch1的表达。构建过表达lncRNA CUST37778的稳转Nalm-6细胞,Real-time PCR验证过表达效率,对上述干扰实验所得结果应用受影响的关键分子的相应抑制剂进行进一步验证。
  结果:1.利用Real-time PCR方法确认lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,与非B-ALL细胞系K562细胞、Molt4细胞存在显著统计学差异。
  2.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进B-ALL肿瘤细胞凋亡,抑制B-ALL肿瘤细胞增殖,使得G1期延长、G2期缩短。
  3.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA的表达,从而促进B-ALL肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖。
  4.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制MAPK通路关键因子ERK1/2磷酸化水平,故选择ERK1/2抑制剂PD98059进行进一步挽救实验。
  5.干扰lncRNA CUST37778的表达水平可显著抑制PI3K-AKT信号通路p-AKT和p-NF-kB的表达,故选择AKT抑制剂LY294002进行进一步挽救实验。
  6.过表达lncRNA CUST37778可促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。
  7.过表达lncRNA CUST37778可促进p-ERK1/2激活,ERK1/2抑制剂PD98059可以阻断此作用;还可促进p-AKT激活,AKT抑制剂LY294002可以阻断此作用。
  8.过表达lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长,干扰其则可抑制皮下肿瘤生长。
  9.lncRNA CUST37778过表达接种组和Nalm-6空载接种组的裸鼠肝脏存在Nalm-6细胞来源的白血病浸润灶。
  结论:lncRNA CUST37778在BALL-1细胞、Nalm-6细胞中高表达,干扰lncRNA CUST37778的表达水平可抑制B-ALL细胞增殖活性,促进细胞凋亡,使G1期延长、G2期缩短,促进促凋亡因子Bax、P21和P27的表达,抑制癌基因Bcl-2和核蛋白PCNA表达,并可显著抑制PI3K-AKT信号通路中p-AKT和p-NF-kB的表达水平、抑制MAPK信号通路中p-ERK1/2的表达水平。过表达lncRNA CUST37778促进细胞增殖和缩短G1期,抑制细胞凋亡,促进Bcl-2和PCNA表达,并促进p-ERK1/2和p-AKT激活,ERK1/2抑制剂PD98059和AKT抑制剂LY294002可以阻断lncRNA过表达的作用。体内实验证实lncRNA CUST37778可促进裸鼠皮下肿瘤生长及浸润能力。
[博士论文] 姚云峰
肿瘤学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  肺癌是致死率高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌(NSCLC)大约占肺癌类型的80%。2004年,人们发现在NSCLC中存在表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶结构域的突变,且大多数突变阳性的患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)如吉非替尼及厄洛替尼等敏感。接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变阳性的NSCLC患者中位生存期较化疗明显提高。然而,即使存在EGFR敏感突变,其中仍有20-30%的患者对EGFR-TKI原发性耐药,且治疗有效的患者不可避免的会产生获得性耐药。目前,有关EGFR-TKI获得性耐药的机制研究较多,如EGFR看守基因的二次突变(T790M)(约占50%)、MET扩增(约20-25%)、肝细胞生长因子(HGF)高表达及向小细胞肺癌转化等。但有关原发性耐药机制研究相对滞后。
  Bim基因是Bcl-2家族促凋亡成员之一。有研究发现,Bim基因的表达状态可能与EGFR突变阳性患者对EGFR-TKI的疗效存在相关性,但Bim基因的表达调控机制不明。人抗原R(HuR)是胚胎致死视觉异常(ELAV)家族的RNA结合蛋白,它可调节多种分子mRNA的稳定性,如cyclin A、cyclin B、TNF-α、IL-6和IL-8等。HuR都是通过与靶基因的3'UTR端ARE元件结合,调控靶基因mRNA稳定性及蛋白的表达。我们分析Bim基因的mRNA序列后发现,其3'UTR端含有多个AU元件,具备与RNA结合蛋白相互作用的分子基础。因此,我们推测作为RNA结合蛋白之一的HuR可能会调控Bim表达。
  目的:
  研究HuR与Bim在NSCLC中的表达与EGFR-TKI药物敏感性的关系,对HuR通过调控Bim表达影响EGFR突变阳性的肺腺癌细胞株对EGFR-TKI原发耐药进行深入的研究,以期为临床判断EGFR-TKI药物治疗效果及克服耐药提供理论依据。
  方法:
  1、免疫组织化学法检测HuR和Bim蛋白在EGFR突变阳性NSCLC组织中的表达(54例临床评价敏感和27例临床评价原发耐药),并分析肿瘤HuR与Bim表达、临床病理特征间的关系,进一步亚组分析EGFR-TKI敏感患者中HuR、Bim表达与PFS之间的关系。
  2、以H1650、HCC827及PC-9肺癌细胞为主要体外模型,给予吉非替尼药物处理后,用CCK-8法检测三种细胞的增殖情况。
  3、应用Western blotting、定量RT-PCR方法检测三种细胞HuR、Bim mRNA和蛋白水平的表达。
  4、在HCC827细胞中用siRNA干扰HuR表达,用吉非替尼药物处理后,用CCK-8、AnnexinⅤ/PI双染色法检测干扰组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC50值。
  5、Western blotting和定量RT-PCR分别检测HCC827细胞干扰组及对照未干扰组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,以明确干扰HuR对Bim的影响。
  6、构建过表达HuR的慢病毒载体,包装病毒,随后感染H1650细胞;用CCK-8、AnnexinⅤ/PI双染色法检测感染组与对照组细胞增殖和凋亡情况,并计算其IC50值。
  7、Western blotting和定量RT-PCR分别检测H1650细胞感染组及对照组HuR及Bim在mRNA和蛋白水平变化,体外分析高HuR水平对H1650细胞Bim表达的影响。
  8、用Balb/c小鼠,建立高表达HuR的H1650细胞皮下移植瘤模型,并观察吉非替尼药物处理后移植瘤生长情况,分析高HuR水平对EGFR-TKI药物敏感性的影响。
  9、RT-PCR及Western blotting检测移植瘤HuR、Bim mRNA和蛋白表达情况。
  10、免疫组化染色检测H1650移植瘤、对照组移植瘤中HuR及Bim表达情况。
  结果:
  1、临床评价敏感组及原发耐药组NSCLC患者在性别方面存在显著差别(p=0.01),耐药组女性患者占18.5%,敏感组女性患者占57.4%。敏感组及耐药组在年龄、PS评分、突变类型、pTNM分期、是否有既往手术史、化疗史及是否存在脑转移等方面未见明显差别。
  2、在原发耐药组患者中,胞浆HuR阴性表达占81.5%;在敏感组患者中,阴性表达占20.4%;两组间表达率存在显著差异(p<0.001),耐药组患者HuR阴性表达率显著高于敏感组患者。同样,在原发性耐药的NSCLC患者中,Bim阴性表达占70.4%;在敏感组患者,阴性表达占7.4%;两组间表达率存在差异(p<0.001),耐药组患者Bim阴性表达率显著高于敏感组患者。
  3、在耐药组的患者中,胞浆HuR阴性表达与Bim阴性表达呈正相关(p<0.01);Bim表达与患者年龄、性别及突变类型不相关。
  4、在敏感组患者中,Bim阳性表达患者PFS为12.8个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,Bim阳性组PFS显著高于阴性组(p<0.01)。
  5、在敏感组患者中,HuR阳性表达患者PFS为16.5个月,阴性表达组PFS为9.7月。Kaplan-Meier生存曲线显示,HuR阳性组中位PFS显著高于阴性组。
  6、PC-9、HCC827及H1650细胞株对吉非替尼药物的细胞毒性实验结果发现:三种细胞的IC50值分别为0.05μml/L、0.004μml/L及21.28μml/L,三者比较前两种细胞对吉非替尼高度敏感,H1650细胞则对吉非替尼表现为耐药(p<0.01)。
  7、RT-PCR分析发现在三种肺癌细胞株中,HuR及Bim表达量存在差异,其中在H1650细胞株中HuR、BimmRNA表达显著低于另外两株细胞(p<0.01);Western blotting结果显示,在H1650细胞株中HuR及Bim蛋白表达显著低于另外两株细胞株。
  8、我们利用小于扰RNA对高表达HuR的HCC827细胞进行瞬时转染,转染后行吉非替尼药物毒性试验,结果发现HCC827未干扰组其IC50值为0.004μM,干扰组为8.142μM,干扰组细胞表现出对吉非替尼耐药。两组细胞给予吉非替尼药物处理后行细胞凋亡检测发现,HCC827细胞干扰组调亡率较对照未干扰组降低(p<0.05)。
  9、RT-PCR检测结果提示HCC827干扰组细胞HuR mRNA表达量低于未干扰组(p<0.01);Western blotting结果显示干扰组HuR蛋白表达显著低于未干扰组。我们对HCC827细胞Bim mRNA及蛋白进行检测,RT-PCR结果发现干扰组Bim mRNA表达明显低于未干扰组(p<0.01),Western blotting结果显示蛋白表达干扰组低于未干扰组。
  10、我们构建了过表达HuR慢病毒表达载体(GV365-HuR),转染H1650细胞后获得稳定过表达HuR的H1650细胞株。
  11、过表达HuR的H1650细胞株及对照组细胞分别给予吉非替尼处理,CCK-8法测定结果发现IC50值分别为0.875μM、21.28μM(p<0.01),提示过表达HuR增加了NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性。细胞凋亡结果提示,过表达HuR的H1650细胞凋亡率较对照组显著升高(p<0.01)。
  12、RT-PCR结果提示,过表达HuR的H1650细胞HuR及Bim mRNA表达量显著高于对照组(p<0.01);Western Blotting结果显示HuR及Bim蛋白表达水平也显著高于对照组。
  13、动物实验结果显示,过表达HuR的移植瘤经吉非替尼处理后,与对照组比较肿瘤生长明显受到抑制。处死小鼠后发现,过表达HuR的移植瘤体积及重量显著低于对照组。
  14、免疫组化结果显示,过表达HuR移植瘤肿瘤胞浆HuR阳性、Bim阳性均高于对照组。
  15、RT-PCR及Western blotting结果显示过表达HuR移植瘤HuR和Bim表达水平显著高于对照组。
  结论:
  证实Bim基因表达下调是引起EGFR突变型NSCLC对EGFR-TKI天然耐药的重要因素,同时确定HuR通过调节Bim表达,导致耐药。
[硕士论文] 涂文婷
影像医学与核医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 传统CT形态学特征对NSCLC患者EGFR基因突变状态的预测价值
  目的:
  探讨传统CT形态学特征预测非小细胞肺癌(NSCLC)患者EGFR基因突变状态的诊断价值,并联合临床特征构建EGFR基因突变预测模型。
  方法:
  回顾性分析病理证实为NSCLC并行EGFR基因检测的243例患者的影像学资料,其中突变型有112例,突变率为46.1%,野生型有131例。比较分析两组患者的5个临床特征(性别、年龄、临床分期、CEA水平及吸烟情况)和17个传统CT形态学特征(最大直径、密度、形状、分叶、胸膜凹陷征等)。将EGFR基因突变状态作为因变量、有差异的特征作为自变量进行多因素Logistic回归分析,并对回归预测概率和各单独特征进行ROC曲线分析。
  结果:
  单因素分析显示,性别、临床分期、最大直径、密度、纵隔或肺门淋巴结肿大、位置、空泡征及CT支气管征在两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,性别、密度和病灶位置是EGFR突变型的独立预测因素,对回归预测概率进行ROC曲线分析后,AUC为0.693(P<0.05)。对各单独特征进行ROC曲线分析后,性别、密度和病灶位置的AUC分别为0.608、0.631和0.579。
  结论:
  在NSCLC患者中,性别、病灶密度和病灶位置与EGFR基因突变密切相关,女性患者、亚实性密度以及周围型肺癌可提示EGFR基因突变阳性。
  第二部分 放射组学标签对NSCLC患者EGFR基因突变状态的预测价值
  目的:
  建立并验证基于放射组学标签的EGFR基因突变预测模型,并与形态学联合预测模型进行对比。
  方法:
  回顾性收集2012年4月至2016年2月的243例非小细胞肺癌(NSCLC)作为训练集,另外收集2015年5月至2016年10月的161例NSCLC作为独立验证集。采用组内相关系数(ICC)检验放射组学特征的一致性,采用无监督一致性聚类分析在训练集中进行放射组学标签的建立。使用Mann-Whitney U检验、卡方检验对所有特征及放射组学标签进行单因素分析,多因素Logistic回归分析用于构建EGFR基因突变预测模型。ROC曲线分析用于评价单个特征及模型的预测效能,并采用Delong检验比较两个模型之间的效能差异是否有统计学意义。
  结果:
  在485个放射组学特征中,筛选出可重复性高的313个放射组学特征,聚类分析构建了5个放射组学标签。放射组学联合预测模型由最大直径、RS1和RS2组成,在训练集和验证集中,该模型的预测效能(AUC=0.789、0.797)均高于形态学联合预测模型(AUC=0.693、0.616),Delong检验表明这两者的AUC具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  Ⅰ型RS1、Ⅰ型RS2及较小的最大直径可提示EGFR基因突变阳性,放射组学联合预测模型具有较高的预测效能,可辅助临床靶向治疗。
  第三部分 放射组学标签预测Ⅰ期NSCLC患者远处转移情况的初步研究
  目的:
  探索影响Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的术后远处转移情况的相关因素,评估放射组学标签用于预测Ⅰ期NSCLC患者预后的可行性。
  方法:
  回顾性收集2012年4月至2016年10月的404例NSCLC患者,其中243例作为训练集用于构建放射组学标签,其余161例作为验证集用于检验放射组学标签的可靠性。根据纳入标准和排除标准筛选出194例Ⅰ期NSCLC患者,并对其远处转移情况进行随访。计算7个临床特征、16个传统CT形态学特征及5个放射组学标签的风险比(HR)。采用log-rank检验进行单因素生存分析,在此基础上进行COX模型多因素分析,筛选独立预后因素。
  结果:
  随访时间为3~63个月(中位数为21个月),25例(12.9%)患者发生远处转移,其无转移生存期(DMFS)为3~54个月(中位数为15个月)。单因素分析显示,除年龄、吸烟情况、形状、分叶征、尖角征、空泡征、胸膜增厚及RS4之外,其余20个特征均与Ⅰ期NSCLC患者的远处转移相关(P<0.05)。多因素分析显示组织学亚型、胸膜凹陷征及RS1具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  在Ⅰ期NSCLC患者中,组织学亚型、胸膜凹陷征及RS1是影响其远处转移情况的独立预后因素,表现为非腺癌、Ⅱ型RS1及伴有胸膜凹陷征的患者趋向于发生术后远处转移。
[硕士论文] 许洋
放射医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  原花青素是目前已知的抗氧化能力最强的天然提取物,远高于日常使用的维生素C及维生素E。其具有来源广泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的优势。此外,原花青素的生物体内的半数致死剂量超过5000mg/kg,远远大于治疗剂量。原花青素对肺组织相关炎症及疾病具有较好的治疗作用:原花青素可以有效减轻角夹胶诱导的肺组织急性炎症反应,减轻小鼠哮喘模型的急性气道炎症反应,抑制肺水肿的形成,且对博来霉素诱导的肺炎具有很好的治疗作用。本实验室前期研究成果发现,原花青素可以显著减轻辐照后早期放射性肺炎的炎症渗出和晚期放射性肺纤维化的发生,降低辐射所导致的肺组织上皮间质转化程度,减轻炎症因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改变程度。另外,与其他抗氧化剂不同的是,原花青素是一种缓释抗氧化剂,他可以在血液和组织中存留7-10天,发挥持续的抗氧化作用,这对于病情进行性进展的放射性肺损伤的防治具有独到的优势。此外,原花青素还具有抗肿瘤作用。过去的十年体外细胞实验和动物实验均已经证明原花青素对皮肤癌,乳腺癌,前列腺癌,头颈部肿瘤和肺癌等肿瘤细胞增殖具有明确抑制作用。研究者还在体外实验中证实原花青素对正常细胞的生长和活力没有明显影响,而只对肿瘤细胞表现出杀伤作用。综合以上的特点,推测,原花青素有希望在肺癌放疗过程中,防护放射野内正常的肺组织的同时,对肺癌细胞又起到抑制增殖的作用。本课题将重点研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用及其分子机制。
  研究目的:
  (一)小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。
  通过原位肺内注射法建立原位肺癌模型。特点:以左肺上叶作为肺癌细胞的生长环境,通过基质胶固定细胞位置。
  (二)原花青素在肺癌放疗中的双向作用。
  1、原花青素在细胞作用中的研究。
  (1)通过CCK8检测原花青素在小鼠正常肺上皮细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的毒性;
  (2)通过流式检测及克隆形成率实验检测原花青素对肺正常细胞的辐射防护作用及对肺肿瘤细胞的辐射增敏作用。
  2、原花青素在肺癌模型中的作用。
  (1)原花青素能够抑制小鼠肿瘤的生长及转移
  ①原花青素抑制小鼠皮下肿瘤的生长;
  ②原花青素抑制小鼠肿瘤的转移。
  (2)原花青素影响荷瘤小鼠局照后的生存状况;
  (3)原花青素对荷瘤小鼠局照后肿瘤大小及肺叶重量的影响;
  (4)原花青素减少荷瘤小鼠局照后正常肺组织的炎性渗出;
  (5)原花青素能够减少小鼠肺正常组织照射后的凋亡,而促进照射后肿瘤组织的凋亡,同时抑制其增值;
  (6)原花青素能够调节Th1/Th2相关细胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的机制研究。
  1、原花青素可以明显降低辐照后A549及BEAS-2B细胞中活性氧的产生;
  2、原花青素对肺正常细胞及肿瘤细胞内的p-ERK、p-JNK及p-P38表达情况的影响具有差异;
  3、原花青素可以激活肺正常细胞及肿瘤细胞Sirt6蛋白的表达;
  4、研究肺正常细胞及肿瘤细胞过表达Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表达情况;
  5、通过抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况,判断Sirt6蛋白在原花青素中的作用。
  研究方法:
  (一)建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。
  1、用胰岛素注射器将肿瘤细胞与基质胶的混悬液注射入小鼠左上肺叶,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;
  2、使用本实验室设计的固定小鼠模具,采取铅块遮挡的方式建立肺部局照放射模型;
  3、照射方式:采用25Gy60Coγ射线单次照射,剂量率为1Gy/min。
  (二)研究原花青素在肺癌放疗中的双向作用
  1、选取小鼠肺上皮细胞MLE-12、肺癌细胞LLC及人正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺腺癌细胞A549进行试验;
  (1)细胞分组:对照组、原花青素处理组、照射组、照射组加原花青素处理组,每种细胞分组相同,照射剂量为8Gy;
  (2)细胞照射及原花青素处理后对正常细胞及肿瘤细胞增殖能力的影响:流式细胞仪检测及克隆形成率;
  2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基础上检测原花青素的双向作用
  (1)小鼠分为:假手术对照组、假手术肺部照射组、肺部荷瘤对照组、肺部荷瘤原花青素处理组、肺部荷瘤照射组及肺部荷瘤原花青素加照射组,共6组,每组选用雄性8周C57BL/6小鼠3只;
  (2)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠的生存影响:检测荷瘤小鼠生存期及体重;
  (3)原花青素及照射对原位荷瘤小鼠肿瘤的影响:检测肿瘤大小,H&E染色及小鼠左上肺叶重量;
  (4)免疫荧光检测正常肺组织及肿瘤组织的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;
  (5)检测原花青素对小鼠免疫细胞因子的影响:用ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-6和IFN-γ。
  (三)原花青素在肺癌放疗中双向作用的分子机制
  1、检测原花青素对照射后细胞内活性氧的清除:ROS检测试剂盒;
  2、检测原花青素对照射后细胞内相关蛋白变化的影响:Western blot;
  3、检测原花青素对照射后原位荷瘤小鼠正常肺组织及肿瘤组织蛋白的影响:Western blot;
  4、通过改变细胞内Sirt6的表达检测p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达:Sirt6过表达质粒的转染、Western blot;
  5、通过选取抑制剂S1805、SP600125及SB203580分别抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表达,观察Sirt6的表达情况:Western blot。
  研究结果:
  (一)成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型
  1、成功建立小鼠左上肺叶原位肺癌荷瘤模型,肿瘤生长符合实验要求;
  2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。
  (二)原花青素在肺正常细胞及肿瘤细胞放疗中的双向作用
  1、对小鼠肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少小鼠肺上皮细胞MLE-12照射后的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对小鼠肺上皮细胞MLE-12具有辐射防护作用,对小鼠肺癌细胞LLC具有辐射增敏作用;
  2、对人肺正常及肿瘤细胞的双向研究:通过流式细胞仪检测,发现原花青素能够减少人正常肺上皮细胞BEAS-2B凋亡且促进人肺腺癌细胞A549的凋亡;通过克隆形成率实验,原花青素对人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞具有辐射防护作用,且能够抑制人肺腺癌细胞A549的生长,具有辐射增敏作用;
  (三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放疗中的双向作用研究
  1、通过观察并记录原位肺癌荷瘤小鼠的生存情况,发现:原花青素处理加照射组相比于照射组,其存活时间更长;
  2、通过对小鼠肺内肿瘤的测量,发现:原花青素处理加照射抑制小鼠左上肺叶内肿瘤的生长,相比较于单纯照射组,效果更加明显;
  3、通过荧光免疫分别标记增殖相关蛋白Ki67及凋亡相关蛋白p53,发现:在小鼠正常肺组织内,原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显降低;在肿瘤组织内,单纯处理组的Ki67的表达量相比于对照组明显降低,而原花青素加照射组与单纯照射组相比,p53表达量明显升高;
  4、通过ELISA检测荷瘤小鼠血清细胞因子的表达量,发现:原花青素加照射组相比于单纯照射组,能够明显抑制IL-6、提高IFN-γ的表达,促进对肿瘤的抑制,降低炎性损伤。
  (四)原花青素在肺癌放疗中的可能作用机制
  1、原花青素能够显著清除人肺癌细胞A549及正常肺上皮细胞BEAS-2B照射后所产生的自由基;
  2、在人肺癌细胞A549中,原花青素明显提高照射后p-JNK蛋白的表达;在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可以明显抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而这与其能够清除活性氧自由基有关。
  3、在人肺癌细胞A549中,原花青素通过增加Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用
  研究结论:
  在细胞层面上发现,原花青素对小鼠肺癌细胞LLC及人肺癌细胞A549具有辐射增敏作用,对小鼠肺正常细胞MLE-12及人正常肺上皮细胞BEAS-2B具有辐射防护作用。在人肺癌细胞A549中,原花青素可以通过提高Sirt6蛋白的表达进而改变p-JNK、p-P38蛋白的变化,促进辐射增敏作用。在人正常肺上皮细胞BEAS-2B中,原花青素可能通过清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎症作用。通过建立小鼠原位肺癌的放疗模型,发现原花青素能提高小鼠的生存期,可以改变血清细胞因子的表达,能够减少小鼠肺正常组织的辐射损伤,同时对肿瘤具有放疗增敏的作用。
[硕士论文] 张宪文
外科学(普外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着医学的发展,诊断肿瘤方法除原有的影像学、肿瘤标志物等,更有了新的基因检测技术。基于血液标本的循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是研究的热点,而作为血检“明星”的ctDNA越来越引起研究者重视。ctDNA是指肿瘤细胞脱落或凋亡后释放进入循环系统的DNA,是一种特征性的肿瘤生物标记物。通过ctDNA检测,能够检出血液中的肿瘤踪迹。相比于其他传统的肿瘤标记物,ctDNA具有半衰期短、假阳性率低、实时反映肿瘤本身等特点。但是ctDNA本身含量少,提取检测难度大。随着定量检测技术发展,DNA检测灵敏度逐渐提升,人们在多种肿瘤类型患者中的研究发现与证明了ctDNA在肿瘤诊断和治疗中的价值。尽管如此,目前对ctDNA在结直肠癌患者外周和门静脉血中分布情况及其在追踪微小残留病中的价值仍不清楚。考虑到胃肠肿瘤存在共性的门静脉回流系统,故本研究通过搜集结直肠癌、胃癌患者术中外周血及门静脉血,通过Accu-Act技术行61个基因pannel的深度二代测序,比较分析ctDNA在含量、基因的突变图谱、片段长度及丰度上的区别。此外,在动物体内注射携带突变位点K-ras基因的片段,考察ctDNA在动物体内的代谢动力学情况。最后,建立结直肠癌患者随访时间点,结合肿瘤复发、转移和死亡数据,考察ctDNA在追踪结直肠癌患者血液微小残留病中的价值。研究结果发现,相比较外周静脉血,门静脉血中的ctDNA(含有突变位点的cfDNA)在含量、肿瘤突变图谱以及片段长度无明显差异(P>0.05)。但是,体细胞突变的最小等位基因频率(MAF)在门静脉血中更高(P<0.05)。此外,与全长的cfDNA相比,ctDNA的平均长度更短(P<0.05)。更进一步,计算外周静脉血中的ctDNA半衰期为30秒-45分钟不等,进一步探索携带突变位点的K-ras基因片段在动物体内的代谢情况,发现ctDNA在动物体内的平均半衰期约为2.22分钟,这与临床结直肠癌患者静脉血中ctDNA估算的代谢时间不同。结直肠癌患者中术后检测到ctDNA能较好地预测2年内肿瘤复发,ctDNA在可切除的结直肠癌患者术后微小残留病评估中能起到至关重要的作用,是NCCN指南很好的补充。
  第一部分:ctDNA在胃肠癌患者外周和门静脉血中的对比研究
  目的:考虑到胃肠肿瘤存在共同的门静脉回流系统,且同时可将胃癌和结直肠癌作对比,故搜集结直肠癌、胃癌患者术中外周血及门静脉血,比较分析ctDNA在含量、基因的突变图谱、片段长度及丰度上的区别,并进一步考察片段ctDNA在动物体内的代谢动力学情况。
  方法:由于胃癌、结直肠癌存在共同的门静脉回流系统,搜集外周静脉血和门静脉血,通过Accu-Act技术行64个基因pannel的NGS二代测序,比较分析两者之间ctDNA在含量、体细胞突变率、长度、MAF的不同,并估算其代谢的半衰期。在动物体内注射携带突变位点K-ras基因的片段,将浓度为51.27ng/uL的CL-187酶切产物,予以生理盐水稀释后于狗下肢左侧股静脉注入,在右侧股静脉分别于1分钟、2.5分钟、5分钟、10分钟、30分钟取血3-5ml,予以血浆分离、Trans磁珠抽提ctDNA、ddPCR,计算出各个时间点ctDNA突变频率,从而计算其半衰期。
  结果:外周静脉血和门静脉血来源的ctDNA(含有突变位点的cfDNA)比较,两者在含量上没有差异(P=0.566)。检测外周血和门静脉血来源的ctDNA的突变图谱无差异。ctDNA的突变率(血中的突变数目/肿瘤组织中的突变数目)在外周静脉血和门静脉血中分别为42%和47%,两者比较无统计学差异(P=0.35)。检测到6例患者(C4,C8,C9,C10,C11和S5)肿瘤匹配的静脉血ctDNA片段长度与在相同染色体区域不含突变的cfDNA相比,明显短,差异具有统计学意义(P<0.001)。比较肿瘤匹配的外周静脉血和门静脉中ctDNA的MAF,用二元线性回归模型分析,门静脉血中的MAF明显高于外周静脉血(P=0.000679)。评估cfDNA的降解率依赖于肿瘤MAF的突变估算,而因为肿瘤的异质性、拷贝数目的变化和非整倍性,MAF很难完整获得。然而,通过多个基因组位点可以预估最大和最小降解率,进而计算指数式衰减。在5例结直肠癌和1例胃癌患者中通过估算9个基因组位置来分析降解率,每个基因组的位置有6个或者更多的UC读本,我们的结果显示,患者血中的cfDNA半衰期为30秒-45分钟不等,平均为1.98分钟。动物实验狗1各个时间点突变频率分别为3/986、1.4/1274、1.4/1254、0/610、0/1166;狗2各个时间点突变频率分别为11.2/430、4.8/466、2.6/352、1.4/502、0/848;狗3各个时间点突变频率分别为24/800、9.8/538、1.6/588、0/658、0/928。通过R软件编程计算每只狗体内ctDNA的半衰期,分别为2.479011分钟、2.794444分钟、1.38862分钟,平均为2.220692分钟。
  结论:ctDNA在外周血与门静脉血中的含量、肿瘤突变谱、片段大小无明显差异,但门静脉血中ctDNA基因突变频率比外周血高,经过计算,ctDNA在人体血液中代谢半衰期平均为1.98分钟,而在动物体内半衰期平均为2.2分钟。外周静脉血ctDNA有很好的循环系统代表性,且半衰期短,能实时监测肿瘤。
  第二部分:ctDNA在追踪结直肠癌患者微小残留病中的价值
  目的:建立结直肠癌患者随访时间点,结合肿瘤复发、转移和死亡数据,考察ctDNA在追踪结直肠癌患血液微小残留病中的价值。
  方法:前期搜集517例结直肠癌患者的术前血/术后血/临床肿瘤标本,排除不匹配标本,排除随访<12月,排除Ⅳ期肿瘤,最后纳入85例具备完整术前血、术后血和临床肿瘤标本病例,同时留取具有完整匹配临床标本的22例Ⅳ期转移性结直肠癌患者做对照研究。选取的85例患者均行R0根治性手术,术后规律随访。
  结果:通过Accu-Act技术行NGS二代测序,研究结果发现,在结直肠癌肿瘤组织、术前外周静脉血和术后静脉血中检测到的高频突变前五位基因为:TP53、KRAS、APC、BRAF和PIK3CA,与WES肿瘤gDNA(The Cancer Genome Atlas Network,Nature2012)报道的在多种肿瘤中的检测到的高度突变的基因类似。进一步,选取TP53、KRAS、APC和BRAF,发现来自结直肠癌组织的gDNA、血浆中的ctDNA突变图谱与全外显子测序(TCGA)的基因突变频率相似。因此捕获的Panel也是合理的,能cover约90%的结直肠癌患者(1-2突变)。病人群体与已报道的人群没有明显差异,ctDNA检测是精准的,与组织DNA检测结果符合。这说明采取Accu-Act技术行NGS二代测序的可行性及准确性。一共纳入85例结直肠癌患者,其中男性52例(61.2%),女性33例(38.8%),平均年龄62.87岁。左半结肠癌占28.23%,右半结肠占29.41%,直肠癌占42.36%。85例患者中仅有8例(9.4%)术后血检测到ctDNA,其中4例患者出现了复发或转移;77例患者术后血未检测到ctDNA,仅6例患者出现复发或转移。为了比较ctDNA含量、MAF在不同分期的结直肠癌患者中的分布规律,及术前ctDNA对术后ctDNA的检出预测情况,纳入Ⅳ期结直肠癌患者信息联合分析,不管是术前的ctDNA还是术后ctDNA的检出都与结直肠癌分期无关(P>0.05),术前cfDNA含量的高低,不会影响到术后ctDNA检出与否(P>0.05)。因此ctDNA含量和cfDNA总量没有太大关系,而是与微转移相关。术前的ctDNA的MAF与分期成正相关(P<0.05),而术前ctDNA的MAF也不能简单预测术后的ctDNA检出(P>0.05)。无论是术前的cfDNA还是术后cfDNA含量都不能预测2年内肿瘤复发的情况,术前ctDNA和肿瘤组织中的MAF均不能预测2年内肿瘤复发的情况,但术后ctDNA中的MAF可预测2年内肿瘤复发的情况(HR:1.33;P=0.0256)。发现,术前CEA、术后CEA、肿瘤大小,淋巴结检出和癌栓等因子,都不能有效的预测肿瘤2年内是否复发。只有术后ctDNA检出与否能有效预测2年内肿瘤复发。进一步行亚组分析,发现对于术后没有使用辅助化疗的结直肠癌Ⅱ期患者,术后无ctDNA检出的病人有明显生存优势,可见ctDNA是很好的MRD预后评估的生物标记物。结直肠癌Ⅲ期术后ctDNA阴性的患者,辅助化疗对无进展生存期没有明显影响,这可能与Ⅲ期ctDNA阴性未化疗的病人总数太少、随访时间短有一定的关系,因此结论的可靠性有待进一步证实。最后,使用TP53、KRAS、APC和BRAF4基因的小Panel,验证其检测MRD的可能性,证实小Panel的术后ctDNA检测也能很好的预测复发风险。
  结论:结直肠癌患者中术后检测到ctDNA能有效预测2年内肿瘤复发,ctDNA在可切除的结直肠癌患者术后微小残留病评估中能起到至关重要的作用,是NCCN指南好的补充。
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