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[硕士论文] 刘永刚
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)属于起源于间充质的一种恶性骨肿瘤,是儿童与青少年罹患原发性恶性骨肿瘤疾病谱中最常见的。骨肉瘤患者的年龄分布呈现双峰状态,分别为青春期人群与老年人群。青春期高峰集中在大约15岁。0~24岁组的骨肉瘤发病率为4.4/百万。第二个峰值集中在75岁左右,主要由与佩吉特病或其他骨性病变相关的继发性骨肉瘤组成。男性与女性的发病率之比为1.22∶1。转移仍然是骨肉瘤最重要的致命性并发症,约有80%的骨肉瘤患者在确诊时发现已存在转移性或微小转移性病灶。由于治疗原则和化学疗法的进展,患者的5年生存率从不到30%提高到70%以上。尽管有了上述进展,但骨肉瘤发生发展的生物学机制研究仍任重而道远,如何从根源上治愈骨肉瘤是当今医学界面临的难题之一。
  整合素连接激酶相关磷酸酶(integrin-linked kinase-associated phosphatase,ILKAP)是一种丝氨酸/苏氨酸(S/T)磷酸化酶,与细胞的生存和凋亡有关。ILKAP同时也是一种具有调控肿瘤发生发展功能的抑癌基因表达产物。ILKAP广泛表达于人体组织中,主要在肾脏、骨骼肌、肝脏等脏器中表达水平较高。介导细胞凋亡是ILKAP的主要生理功能。ILKAP与肿瘤细胞的发生、发展息息相关。
  低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是肿瘤微环境与肿瘤病因学研究中的重点。作为一种转录因子,HIF-1有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等一系列作用。HIF-1的含量一旦失调,细胞将具备多种恶性能力并演变成肿瘤。早期研究认为,细胞在正常微环境下,HIF-1主要受羟化酶的调节而进入泛素降解途径,而仅当细胞处于低氧条件时HIF-1不能被降解,进而发挥功能。近年来随着对HIF-1调节方式的深入研究,人们发现羟化反应并不是HIF-1转录活性调节的唯一途径,磷酸化调节也是调控HIF-1的一种重要方式,尤其是在非低氧条件下。
  研究目的:
  证实低氧可导致细胞发生凋亡;研究低氧条件下ILKAP通过与HIF-1α相互作用,对骨肉瘤细胞凋亡产生的相关影响。
  研究方法:
  1、细胞低氧模型的构建与监测:使用Billups Rothenberg公司生产的二氧化碳培养箱将骨肉瘤细胞进行培养。连续从0h至96h将气罐中充入了混合的O2(1%)与N2(94%)和CO2(5%)。调节二氧化碳培养箱的温度(37℃)、湿度(95%)。每24h更换细胞培养液。通过YSI模型55溶氧测定仪来监测培养箱内溶氧量,从而监测低氧环境。
  2、骨肉瘤细胞活力测定:台盼蓝染色试验测定细胞存活率。将单细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合混匀。每0.1mL单细胞悬液中加入一滴台盼蓝染液,室温下染色3~5min,记录活细胞和死细胞数。将处理过的骨肿瘤细胞材料在高倍镜下观察。分别计数1000个细胞内的活细胞和死细胞数,统计未染色细胞,用公式计算细胞存活率。
  3、骨肉瘤细胞凋亡检测:本实验采用激光共聚焦显微镜技术通过观察骨肉瘤细胞内DAPI与TUNEL的共定位,判断骨肉瘤细胞是否经历凋亡。
  4、检测HIF-1α、细胞凋亡标记物:采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)—底物化学发光ECL法。
  5、研究ILKAP在导细胞凋亡过程中的作用:采用ILKAP shRNA腺病毒转染与Ad-ILKAP过表达的研究方法。
  6、研究HIF-1α、ILKAP、p53之间的相互作用:对细胞进行了72h低氧处理,而后进行免疫共沉淀实验。
  研究结果:
  1、细胞活力随着时间延长而下降,细胞凋亡增加(P<0.05)。HIF-1α随低氧处理时间延长逐步被诱导,磷酸化HIF-1α逐渐减少。通过400U ILKAP处理HIF-1α,PBS作为阴性对照,400Uλ磷酸酶作为阳性对照,发现ILKAP和λ磷酸酶对于HIF-1α的作用相似,可使去磷酸化HIF-1α逐渐增多。
  2、低氧条件下细胞存活由ILKAP shRNA维持。低氧条件下细胞凋亡与ILKAP有关。相同低氧时间下,ILKAP shRNA组的细胞凋亡数明显少于对照组(P<0.05)。Western blot条带显示HIF-1α在ILKAP shRNA组与对照组比较,大部分没有转为去磷酸化形式。
  3、通过免疫共沉淀实验发现,磷酸化形式的HIF-1α优先与抗ILKAP抗体免疫沉淀,去磷酸化形式的HIF-1α优先与p53抗体免疫共沉淀,ILKAP与p53之间没有相互作用。
  4、相比于对照组,Ad-ILKAP组的细胞存活率显著减少,呈时间依赖性(P<0.05)。细胞凋亡标记物和TUNEL法在Ad-ILKAP组相比于对照组,反映出显著增加的细胞凋亡现象。常氧条件无法诱导HIF-1α表达,但在Ad-ILKAP组可检测。
  研究结论:
  1、细胞凋亡数量会随着低氧处理时间延长而显著增加。ILKAP可以起到类似于λ磷酸酶的去磷酸化作用。HIF-1α磷酸化状态在持续的低氧诱导细胞凋亡过程中发生改变,ILKAP可使HIF-1α从磷酸化状态转为去磷酸化状态。
  2、长时间低氧诱导情况下,下调细胞内ILKAP表达,则细胞凋亡减少。由此可见,ILKAP在长时间低氧诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用。
  3、ILKAP结合磷酸化形式的HIF-1α使其去磷酸化,然后与去磷酸化形式的HIF-1α分离,去磷酸化的HIF-1α则与p53结合。ILKAP不与p53直接作用。
  4、常氧无法诱导HIF-1α表达。在常氧情况下,上调细胞内ILKAP表达可诱导细胞凋亡,并且使HIF-1α去磷酸化。
  综上所述,ILKAP直接使HIF-1α去磷酸化,并且对后续p53依赖的细胞凋亡发挥重要作用。考虑到其与p53及p53本身的复杂作用,现阶段的实验结果为进一步研究不同HIF-1α类型在多种疾病中的作用基因奠定了基础。
[博士论文] 乔苏迟
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是骨骼系统最常见的的原发恶性肿瘤,年发病率约(1-3)/1000,000,可于任何年龄发病,但高级别骨肉瘤(High-grade osteosarcoma,HGOS)主要发生于10-20岁的青少年和儿童。OS多累及长骨末端,尤其是生长快速的骨骼,如股骨远端、胫骨近端、肱骨近端等。
  得益于新辅助化疗的发展、假体以及材料学技术的进步,目前OS的保肢率和生存率都得到了较大的提升。但复发及远处转移的患者预后仍然较差,新型药物的研发也迟滞不前,OS的治疗已经进入到瓶颈。阐明OS发生发展的分子机制,研发新型药物是目前迫切需要解决的问题。
  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)的是一类重要的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。已有大量研究报道,LncRNA出现异常表达或是突变,与恶性肿瘤增殖、侵袭、转移、耐药等机制密切相关。而在OS中,LncRNA的相关研究尚处于起步阶段,是否可以利用下调或上调异常表达的LncRNA方式治疗OS,或是逆转OS耐药,有待深入探索。此外,LncRNA能否作为OS患者临床诊断的重要参考,以及判断化疗敏感性和预后的分子标志物,有待临床实践检验。
  LINC00511是一个较为全新的LncRNA,在非小细胞肺癌、舌鳞癌以及胰腺导管腺癌中,已证实LINC00511呈现高表达,并在其中作为癌基因发挥作用,促进相应恶性肿瘤增殖、迁移,与患者预后不良密切相关。
  通过芯片筛选等前期预实验,发现,相对于癌旁正常组织,LINC00511在OS组织中呈现低表达。本研究旨在进一步探索LINC00511在OS中的表达情况,并分析其表达与患者临床特征及预后的相关性,此外,分别从体外和体内层面对LINC00511的功能展开研究并初步揭示LINC00511在OS中的调控机制。
  第一部分:LINC00511在骨肉瘤组织、细胞株中的表达及其意义
  第一部分研究中,通过定量PCR检测LINC00511在OS组织标本和癌旁正常组织标本的表达情况,并结合临床资料分析LINC00511的表达水平与OS患者年龄、性别、肿瘤分期、化疗敏感性、预后等临床特征之间的相关性。此外,同时采用定量PCR检测LINC00511在不同OS细胞株及正常成骨细胞细胞株中的表达水平差异。结果显示,LINC00511在OS组织及细胞株中呈现低表达;LINC00511的表达与患者肿瘤坏死率显著相关,高表达患者呈现出更好的化疗敏感性;LINC00511的表达与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分期、肿瘤体积变化、手术方式等无关;LINC00511表达水平与骨肉瘤患者预后明显相关,高表达患者三年生存率更高,预后更好。上述结果提示,LINC00511可能是骨肉瘤疾病发生发展中的重要抑癌基因,其表达升高预示更好的化疗敏感性及预后,有望成为骨肉瘤诊断以及预后判断中的重要分子标志物。
  第二部分:LINC00511对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其作用
  第二部分研究中,构建了OS细胞株MG-63及Saos-2的LINC00511的过表达稳定株,并检测比较肿瘤生物学行为的变化。在体外细胞层面上,LINC00511表达上调后,进行CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞划痕实验、细胞transwell实验等观察LINC00511对OS细胞增殖、凋亡以及迁移的影响。在体内层面上,通过裸鼠成瘤实验,进一步验证LINC00511对OS发生发展的作用。结果显示,MG-63及Saos-2中过表达LINC00511能够显著抑制OS细胞增殖、迁移,但不影响细胞凋亡;裸鼠成瘤实验中LINC00511过表达的裸鼠肿瘤生长更慢,相同时间内肿瘤体积更小,肿瘤质量更轻。上述结果提示,LINC00511在OS中能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移,是其发病机制中重要的抑癌基因。
  第三部分:LINC00511对骨肉瘤疾病进展的调控机制的初步研究
  第三部分研究中,对LINC00511调控OS的分子机制进行初步的研究。从OS上皮间质转化及PI3K/Akt信号通路的调控两方面进行观察。在Saos-2各组细胞中,利用Western Blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimemin和α-SMA的表达,以及PI3K/Akt信号通路中PI3K和p-Akt的蛋白表达量,初步探讨LINC00511抑制OS增殖、迁移的分子调控机制。结果显示,Saos-2中过表达LINC00511后OS中的E-cadherin蛋白表达显著升高,而Vimentin和α-SMA蛋白表达显著降低,OS的EMT受到显著抑制。此外,PI3K和p-Akt(308)蛋白表达显著降低,而p-Akt(473)蛋白表达并无明显变化,PI3K/Akt信号通路受到明显抑制。上述结果提示,LINC00511可能通过抑制OS的EMT以及PI3K/Akt信号通路,对OS细胞增殖、迁移产生调控作用,其中,PI3K/Akt信号通路产生作用的Akt的磷酸化位点是苏氨酸308(Thr308)。
[硕士论文] 彭东宇
外科学(骨科) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:尤文肉瘤(Ewing's sarcoma,ES)是儿童和青少年中第二大常见骨肿瘤,是一种侵袭性骨和软组织肉瘤,其年发病率是2.93/1000000,常发生于骨骼,特别是下肢(41%),骨盆(26%),胸壁(16%),椎骨(6%)和颅骨(2%)。约四分之一的尤因肉瘤出现在软组织中而不是骨,大约四分之一的患者有诊断时可检测到转移。肺是最常见的转移部位(50%),其次是骨(25%)和骨髓(20%)。临床早期症状不明显,故极易漏诊。尤文肉瘤患者对放疗极为敏感,通过小剂量照射后,肿瘤可迅速减小,局部的疼痛感显著减轻。但值得注意的是,放疗对起源于椎体的尤文肉瘤同时容易造成脊髓及神经的损伤甚至导致神经功能不可逆性损害而致患者瘫痪。而且尤文肉瘤又容易早期转移,单纯放疗对于此类病人远期疗效差。但其具体的发病机制尚不明确。
  蛋白酶体系统是最重要的系统之一,蛋白质降解系统在真核生物中具有调节细胞过程如细胞周期,转录,细胞信号传导,细胞死亡和免疫反应的能力。REGγ(也被称为PA28γ、11Sγ或Proteasome activator complex subunit3,PSME3)蛋白是20S蛋白酶体激活因子家族中的一员,主要定位在细胞核中,可以形成同源七聚体,作为细胞内一种重要的蛋白酶体激活因子,参与到许多与疾病相关的通路调节中。以非泛素和非ATP依赖的方式促进一些靶蛋白的降解,如SRC-3、P21、P53、P16、CK-1δ、SirT1等。已有研究证实REGγ在许多癌症组织中高表达及恶性生物学行为中发挥着重要作用,如结肠癌、肺癌、胃癌、脊索瘤等。但它在尤文肉瘤中的作用尚未有报道,此研究REGγ在尤文肉瘤中的功能,为了解和阐明尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究目的:通过检测REGγ在尤文肉瘤组织中的表达水平及预后相关性,初步探究REGγ在尤文肉瘤发生发展中的作用及相互关系。为深入探索尤文肉瘤的发病机制及新的药物靶点提供了更多的思路。
  研究方法:1.通过免疫组化染色评估REGγ在尤文肉瘤组织中的表达情况,并结合临床随访资料行相关性分析;2.在尤文肉瘤细胞系中干扰REGγ的表达,肿瘤细胞生物学行为的改变;3.在尤文肉瘤细胞系中过表达REGγ基因,检测肿瘤细胞生物学行为的改变。
  研究结果:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,瘤旁正常组织中REGγ表达水平相对较低;2.REGγ在尤文肉瘤组织中的高表达与患者的不良预后存在显著的相关性;3.在尤文肉瘤细胞系中,REGγ敲减干扰后均出现凋亡敏感性的增加而使其增殖能力、侵袭能力、迁移能力均明显下降的肿瘤细胞生物学行为的改变;4.在尤文肉瘤细胞系中,过表达REGγ基因,尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强。
  研究结论:1.在尤文肉瘤中REGγ表达明显高于瘤旁正常组织,这表明REGy可能有促进肿瘤细胞生长的作用;2.REGγ的表达与尤文肉瘤患者的无瘤生存时间呈负相关;3.在尤文肉瘤中,蛋白酶体REGγ敲减干扰后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显下降,而其凋亡增加。REGγ过表达后的尤文肉瘤细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显增强,而其凋亡敏感性降低。提示REGγ与尤文肉瘤的发生及预后密切相关,这将为提高尤文肉瘤的治愈率提供非常重要的思路。
[硕士论文] 王文剑
外科学(骨科学) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于间叶细胞恶性增殖产生骨样和骨基质所构成的原发恶性骨肿瘤,是最常见的原发性骨恶性肿瘤,多发生于骨骼快速生长发育的青少年或者儿童。由于骨肉瘤起病隐匿、恶性程度高、发展较快,给临床早期诊断与及时治疗带来困难。40年前,其生存率不足20%,近年来,随着新辅助化疗的出现,骨肉瘤患者的5年总生存率逐步提高。近20年来,中国新辅助化疗及辅助化疗应用日渐广泛,但骨肉瘤生存率未见继续提高,术后复发及转移率亦未下降。由于缺乏更为有效的化疗药物,多学科协作亦未形成标准,骨肉瘤综合治疗疗效未见提升。为了解中国骨肉瘤近年来发病情况,2017年本人前往国内7家骨肿瘤治疗中心,收集整理了1593例行手术治疗的骨肉瘤患者资料。试图从患者性别、发病年龄及发病部位、新辅助化疗和辅助化疗、化疗后肿瘤坏死情况、手术方式等相关问题等诸多指标揭示中国近年骨肉瘤发病情况及治疗现状。并在国内外数据库中检索有关骨肉瘤的大样本文献,与本组资料进行比较,对比流行病学特征及治疗情况,调查其特征是否有区别,并分析产生区别的原因。
  目的:
  了解中国目前骨肉瘤的临床流行病学特点,分析国内骨肉瘤的发病情况及临床治疗现状,并在国内外数据库中检索有关骨肉瘤的大样本文献,与本组资料进行比较,对比流行病学特征及治疗情况。
  方法:
  1、收集原始资料:
  前往国内七家骨肿瘤治疗中心的病案室调阅病历资料,所有病例均查阅原始病历,5家医院为2000年1月至2017年2月资料,2家医院为2008年1月至2017年2月资料,骨肉瘤患者共1593例。
  2、提取相关数据:
  整理1593例骨肉瘤患者的一般情况(性别、发病年龄、首发部位、初诊时肺转移),诊断方式(术前穿刺活检、术前切开活检、未活检),及治疗情况(手术方式、术前化疗、化疗后肿瘤坏死率、术后化疗)。
  3、各数据库中检索文献:
  在Pubmed数据库、Embase数据库、SpringerLink全文数据库、Elseviver Science Direct全文数据库、John Wiley Interscience全文数据库、ProQuestHealth&Medical Complete全文数据库、EBSCO MEDLINE Complete全文数据库检索上检索“osteosarcoma”,在重庆维普科技期刊数据库、同方期刊全文数据库、中华医学会&中国医师协会全文期刊库检索“骨肉瘤”,纳入骨肉瘤病例数大于100的有相关数据对比的回顾性研究。最终共检索英文文献22篇,中文文献18篇,骨肉瘤共18534例,用作与本组病例发病及治疗情况的对比。
  4、统计学分析:
  采用SPSS13.0统计软件包(SPSS公司,美国)进行统计学分析。对比各组间流行病学特征及治疗情况进行比较,检验水准α值取0.05。
  结果:
  1、本组数据结果:一般情况:本组1593例患者中,男984例,女609例;男女比:1.62∶1。平均年龄:23.2岁(范围3-80岁)。发病高峰11-20岁(52.4%);高龄(>40岁)患者217例(13.6%)。病变发生于四肢骨1524例,中轴骨69例。发病部位最常见为股骨远端(706例)、胫骨近端(375例)、肱骨远端(117例),其他395例。膝关节周围1154例(71.0%);中轴骨包括脊柱18例,骨盆49例,肋骨2例。初诊时伴有转移的病例79例,占5.0%。诊断方式:术前穿刺活检1111例,切开活检280例。术前可以明确诊断1345例(占所有病人的比例84.4%,占活检病人的比例96.7%)。治疗方式:术前化疗1185例(74.4%)。术前化疗以DIA方案(271例)、DIA+MTX方案(251例)、AP方案(149例)为主;描述术后肿瘤细胞坏死率的220例,依据Huvos分级,Ⅰ级78例,Ⅱ级105例,Ⅲ35例,Ⅳ级2例;术后化疗1299例(81.5%);1306例患者行保肢手术(82.0%),具体术式以人工假体置换术最为常见(911例,69.8%);术后化疗以DIA+MTX方案(471例)、DIA方案(266例)、AP方案(98例)为主;手术前后化疗方案相同379例,更改化疗方案666例。
  2、国内外大样本文献检索结果及对比情况:国内共检索出18篇大样本文献5684例病例,男女比、年龄范围、发病高峰、发病部位与本研究相似,平均年龄低1-2岁,初诊转移率较高,术前术后化疗与与保肢率较低,化疗后肿瘤坏死率较好。国外共检索22篇大样本文献12850例病例,其男女比较低,平均年龄高1-2岁;膝关节周围比例较低,初诊转移率较高,术前术后化疗率与本研究类似,化疗后肿瘤坏死率较好。
  结论:
  此次调查骨肉瘤发病一般情况(性别、年龄、发病部位)与之前国内外报道均无明显差别;治疗方面术前、术后化疗率及保肢手术率较以往有明显提高,化疗方案上从各种方案并存逐渐向以DIA+MTX与DIA方案为主流方案。
[博士论文] 李博
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要从以下几个部分展开论述:
  第一部分 二甲双胍抑制骨肉瘤生长的分子机制研究
  目的:
  骨肉瘤是最为常见的原发恶性骨肿瘤,虽然手术和化疗等治疗手段在过去的30年中进步明显,但该病的总体生存率未见明显提高。二甲双胍作为治疗2型糖尿病的一线药物,目前很多证据表明其可以抑制多种恶性肿瘤的进展,但详细分子机制仍未研究透彻。本研究主要目的是探索二甲双胍在骨肉瘤中的抗肿瘤效应以及寻找潜在的信号通路,为进一步探索二甲双胍的抗肿瘤作用机制和寻找骨肉瘤的潜在治疗靶点提供新思路。
  方法:
  在本研究中,首先通过CCK-8细胞计数实验、平板克隆实验和流式分析技术探索不同浓度和作用时间条件下的二甲双胍对骨肉瘤增殖能力的影响,确定最适合的干预条件;然后通过流式分析技术、线粒体膜JC-1标记、WB等实验探索二甲双胍在骨肉瘤细胞凋亡方面的作用。随后对骨肉瘤细胞进行GFP-LC3慢病毒感染,并通过透射电镜技术和WB实验探索二甲双胍是否可以引起骨肉瘤细胞发生自噬现象;进一步通过免疫荧光、流式细胞标记和WB等实验技术对下游信号通路进行分析;最后,通过构建裸鼠骨肉瘤胫骨平台荷瘤模型,在动物实验水平探讨二甲双胍对骨肉瘤的影响。
  结果:
  证明二甲双胍通过诱导细胞周期G2/M时相阻滞进而抑制骨肉瘤细胞的生长,并且可以促进骨肉瘤细胞发生凋亡和自噬现象。通过进一步分析,发现抑制二甲双胍诱导的自噬现象可以促进骨肉瘤的凋亡。二甲双胍引起骨肉瘤细胞的线粒体膜电位发生变化,产生过量的ROS,进而激活下游的JNK/c-Jun信号通路进而诱导骨肉瘤细胞产生凋亡和自噬现象。最后,在动物体内水平证明安全剂量的二甲双胍可以显著抑制骨肉瘤的增殖。
  结论:
  在本项研究中,首次从体外和体内水平证明二甲双胍可以通过ROS依赖的JNK/c-Jun信号途径诱导骨肉瘤发生细胞周期障碍、凋亡和自噬现象。该研究为进一步探索二甲双胍在肿瘤领域的作用机制和寻找骨肉瘤的潜在治疗靶点奠定了基础。
  第二部分 唑来膦酸抑制骨肉瘤生长的代谢组学研究
  目的:
  唑来膦酸作为双膦酸盐家族中最有代表性的一员,近年来越来越多的证据表明其可以对多种肿瘤具有直接的抗增殖和促凋亡作用。本研究主要通过运用代谢组学技术探讨唑来膦酸抑制骨肿瘤生长的作用机制。
  方法:
  在本研究中,我们首先通过CCK-8细胞计数毒性实验和流式细胞周期检测技术探索不同浓度和作用时间下唑来膦酸对骨肉瘤增殖能力的影响,确定最适合的作用条件。之后采用液相质谱技术分析唑来膦酸干预骨肉瘤细胞后细胞内部代谢产物的差异性变化,随后通过对发生显著变化的代谢物进行聚类分析和KEGG通路的富集分析。
  结果:
  首先CCK-8的结果显示唑来膦酸对骨肉瘤细胞的增殖生长有抑制的作用,并且这种作用存在时间和浓度的依赖性,流式细胞周期检测提示该药物可以诱导骨肉瘤细胞周期发生G1时相停滞。随后通过液相质谱分析在正离子模式下分别发现15种显著差异代谢物和8种差异代谢物,而在负离子模式下发现了21种显著差异代谢物和11种差异代谢物。上述代谢物主要参与体内核酸代谢,氨基酸代谢和TCA循环等重要的生物过程。最后将得到的显著差异代谢产物进行聚类分析和KEGG通路富集分析后发现,上述代谢物涉及在细胞内部包括central carbon metabolism in cancer,pyrimidine metabolism和ABC transporters等多条重要的代谢通路。
  结论:
  在该项研究中,我们首次运用液相质谱分析唑来膦酸在骨肉瘤中的代谢组学水平的变化,为进一步探索唑来膦酸在肿瘤领域的作用机制和寻找骨肉瘤的潜在治疗靶点提供新的思路。
[博士论文] 王猛
影像医学与核医学 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:软组织肿瘤是起源于纤维组织、脂肪、滑膜、平滑肌、横纹肌、间皮、血管、黏液和淋巴管等结缔组织及神经外胚层等的一类肿瘤。[1]恶性软组织肿瘤发病率大约在1.28/10万-1.72/10万,在成人恶性肿瘤中,占全部恶性肿瘤的0.73%-0.81%,在<15岁儿童恶性肿瘤中,所占比例为6.5%。该肿瘤可发生于人体多个部位与器官,常发生于四肢、腹膜后、盆腔、胸腹壁或背部,毗邻神经、胃肠道、输尿管、膀胱、关节等脏器;其中有50%-60%发生于四肢,20%-25%发生于腹膜后和腹腔,15%-20%发生于躯干(胸腹壁和背部),5%发生于头颈部。[1]WHO软组织肿瘤分类中共19个组织类型,50多种亚型,常见病理类型有未分化多形性肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、恶性神经鞘瘤。[2]但不同类型有其共同特点,即大部分肿瘤不发生区域性淋巴结转移,以局部浸润生长为主,但如血管肉瘤、透明细胞肉瘤、横纹肌肉瘤发生区域淋巴结转移率较高,常见的远处转移部位有肺、骨、肝、脑、腹膜后等。[3]
  目前,恶性肿瘤的治疗均遵循多学科治疗模式,对于恶性软组织肿瘤的治疗,同样需要外科、肿瘤内科、放疗科、影像学科(包括CT、MRI、核医学、影像介入科)、病理科的参与。诸多研究证实,对绝大多数恶性软组织肿瘤,手术切除是唯一可能根治的治疗方法。[4]位于四肢的恶性软组织肉瘤,常用手术方法包括间室切除、广泛切除和截肢手术;位于躯干的恶性软组织肉瘤,外科切除率要远低于四肢,且局部控制率低于四肢;位于腹腔、盆腔的恶性软组织肿瘤,由于肿瘤常常广泛累及周围重要的脏器、血管、神经,所以手术难度较大,往往只是姑息的减瘤手术。虽然外科手术是治疗恶性软组织肿瘤的首选,但仍然面临诸多问题。第一,仅有约70%患者手术成功,有近30%的患者无法手术或手术失败;第二,术后复发及转移率高达40%-50%,远处转移率超过50%。[5]术后复发或转移后再切除仍是重要的治疗手段。但很多患者在复发后,由于体质差、花费高、手术切除创伤大等难以耐受或拒绝再手术;还有部分患者由于肿瘤恶性程度高,再手术后复发率高,失去了再手术的意义。[5]对于有3处以下或单个器官有限转移的患者,有效的局部治疗能提高局部控制率。因此,局部效果好、创伤小的治疗手段越来越多的用于术后复发的患者治疗中。
  除术后复发患者外,有超过10%的患者在确诊时已发生了远处转移;还有部分患者在确诊时肿瘤广泛累及周围重要的脏器、血管、神经、关节等,因无法完整切除肿瘤而拒绝外科手术。那么对于这部分失去外科根治性手术机会患者,由于恶性软组织肿瘤对放疗、化疗等传统治疗并不敏感,因此,如何在综合治疗的基础上增加局部控制率、提高生活质量、延长生存期,是摆在广大肿瘤工作者面前的一大难题。虽然已有众多研究证实RFA、CA等消融手段是除手术、化疗、放疗外等传统治疗外,是治疗恶性软组织肿瘤的有效治疗手段,但对如何选择优势人群并无过多探讨。本研究应用CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤,评价其疗效及安全性,分析影响疗效、安全性的因素,指导我们更好的从恶性软组织肿瘤患者中筛选出适合CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗的患者,使更多的患者通过该治疗受益。
  本研究主要创新点如下:
  1.在研究对象上,选择术后局部复发或有限转移的患者,所有病变均可行CT引导下氩氦刀冷冻消融
  2.在治疗高危部位的恶性软组织肿瘤中,应用氩氦刀冷冻消融联合放性125I粒子植入,并应用注射生理盐水、空气或球囊分离技术等增加靶病变与危险脏器的距离
  3.通过多种统计方法分析了影响氩氦刀冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤的疗效及并发症发生率的因素
  4.总结了术后复发的恶性软组织肿瘤行氩氦刀冷冻消融术的优势人群
  第一部分 CT引导氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤安全性研究
  目的:
  探讨CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤安全性,统计常见并发症发生率,分析影响并发症发生率的危险因素。
  材料与方法:
  收集我院2012年1月至2017年1月共93例恶性软组织肿瘤患者,根据纳入标准和排除标准,共纳入60例患者。统计早期常见并发症发生率及风险因素评估。根据美国介入放射学会制定的相关并发症标准,评定并发症严重程度。
  结果:
  所有患者均顺利完成手术,无因术中疼痛等其他原因终止手术情况发生。氩氦刀冷冻消融术后共有26例患者出现不同程度并发症,总并发症发生率为43.3%,不良反应和轻微并发症19例,严重并发症7例,无手术相关死亡病例发生。常见并发症有发热(19例),术后即刻疼痛加重7例,周围脏器组织损伤15例(皮肤冻7例、神经损伤6例、结肠膀胱损伤1例、膀胱损伤1例)、胸腔积液(4例)、肌红蛋白尿2例、血小板减少2例。肿瘤最大径>5cm出现术后发热概率高于最大径≤5cm,p=0.05;距离危险脏器距离<1cm发生临近脏器组织损伤的概率高于距离危险脏器距离>1cm,P=022;位于表浅的肿瘤术后即刻出现疼痛的概率高于位于深部肿瘤,P<0.001。
  结论:
  1、CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤患者耐受性良好。
  2、CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性恶性软组织肿瘤常见并发症有发热、周围脏器损伤、术后短期疼痛加剧、胸腔积液、肌红蛋白尿、血小板减少。
  3、发热多发生于较大肿瘤、周围脏器损伤多发生于距离危险脏器距离较近的肿瘤、浅表肿瘤术后易出现短暂的疼痛加剧。
  4、CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性恶性软组织肿瘤具有较高的安全性。
  第二部分 CT引导氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤的近期疗效评价
  目的:
  评估CT引导下经皮氩氦刀冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤的近期疗效。探讨常见CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤近期疗效的影响因素。
  材料与方法:
  研究对象同第一部分患者,在该组患者中有29例患者合并有不同程度疼痛。术后即刻应用CT监测冰球范围,术后1个月、术后3个月及术后半年行增强CT、MRI或PET-CT进行疗效评估。根据术后即刻冰球覆盖范围及mRECIST标准评价近期局部疗效。应用VAS评分及KPS评分记录患者术前、术后疼痛程度和术前、术后体力功能状态评分。
  结果:
  术后即刻根治性冷冻消融率60%,有效减瘤冷冻40%。术后1个月、3个月、6个月CR分别为51.7%,51.7%,43.3%,PR分别为43.3%,30%,26.7%,ORR分别为95%、81.7%、70%。通过单因素及多因素分析,肿瘤大小、部位、与危险脏器距离是影响术中冰球覆盖率的因素,P值分别为0.002,、0.023、0.000。肿瘤大小是影响近期有效率的因素。VAS疼痛评分术前平均(6.30±1.38)分,术后24h(2.78±2.23)分,术后1周的(1.52±2.10)分,术后1个月1.96±2.66,术后3个月的1.59±2.56,术后6个月的2.19±3.05,t值分别为11.96、13.29、9.993、10.946、8.059,P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000。术后24h、术后1周、术后1月、术后3月、6个月疼痛缓解率分别为86.2%、89.7%、89.7%、86.2%、75.9%。KPS功能状态评分由术前71.6±10.76增加到术后3个月的79.17±10.46, t=5.90,P<0.001。
  结论:
  1.氩氦刀冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤近期疗效确切,肿瘤直径大小是影响近期疗效的因素。
  2.CT引导下经皮氩氦刀冷冻消融术可有效缓解局部疼痛症状,提高KPS评分。
  3.肿瘤大小、部位、与危险脏器距离是影响CT引导下氩氦刀冷冻消融术后即刻消融率的因素。
  第三部分 CT引导氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤远期疗效评价
  目的:
  评估CT引导下经皮氩氦刀冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤的远期疗效,探讨影响CT引导下氩氦刀适形冷冻消融治疗恶性软组织肿瘤PFS、OS的影响因素。
  材料与方法:
  研究对象同第一部分患者,以氩氦刀冷冻消融术为起点,以患者失访或死亡为终点,随访截止到2017年6月,统计PFS、1年生存率、2年生存率、3年生存率。利用Kaplan-Meier分析对患者PFS和生存率进行统计学分析,并利用Log-rank检验对结果进行验证。应用cox风险模型分析影响PFS和OS的因素。
  结果:
  随访时间为3-47个月,中位随访时间17.5个月。平均LPFS(8.76±9.09)个月,平均RPFS(12.19±8.98)个月,平均PFS(10.53±9.12)个月,氩氦刀冷冻消融术后1年、2年、3年生存率分别为75.6%、33.3%、9.52%,平均OS为(20.4±10.52)个月。单因素、多因素分析显示肿瘤大小、肿瘤与危险脏器距离是影响PFS和OS的危险因素。
  结论:
  1.CT引导下氩氦刀冷冻消融术后远期疗效确切。
  2.肿瘤大小、肿瘤距离危险脏器的距离是影响CT引导下氩氦刀冷冻消融术OS和PFS的因素。
[博士论文] 李亮
细胞生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 细胞因子对调节性T细胞的发育调节研究
  揭示诱导机体免疫耐受打破的因素对于理解自身免疫性疾病的发生发展有重要作用。Treg细胞是控制机体过度免疫应答阻止自身免疫性疾病发生的负调性细胞,越来越多的研究也表明Treg还参与到细菌及病毒感染、肿瘤、器官移植耐受、组织修复等多种疾病过程。因此,对Treg发育调节的研究有利于进一步认识Treg的功能,从而将其作为多种疾病的治疗靶点。
  Treg细胞可由胸腺发育及外周诱导两种途径产生,其发育分化受到细胞因子的调节。在CD4启动子下表达显性失活TGF-βⅡ型受体的dnTGF-βRⅡ小鼠会出现T细胞过度活化而导致的肝脏和肠道炎性细胞浸润,其Treg细胞的抑制功能降低。Il2ra-/-小鼠由于Treg功能失调,出现多克隆T细胞和B细胞的扩增而导致多脏器自身免疫性疾病。在本研究中,利用Il2ra-/-Tg小鼠,探究TGF-β与IL-2信号在Treg发育过程中的共同调节作用。
  l2ra-/-Tg小鼠出现类似于Treg缺陷的scurfy小鼠症状,多个脏器出现淋巴细胞浸润与病理损伤。Il2ra-/-Tg小鼠淋巴结肿大,其中T细胞明显增加,而且活化状态增强,分泌炎性细胞因子IFN-γ的能力也增强。进一步探究2ra-/-Tg小鼠淋巴结肿大的原因时发现,该小鼠Tfh细胞的比例和数量明显增加,同时生发中心B细胞也明显增多,淋巴结中浆细胞明显增多,而且非淋巴组织中和出现了浆细胞的浸润。发现其外周Treg比例降低而胸腺Treg比例升高。Il2ra-/-Tg小鼠Treg细胞处于活化状态,表达更高水平的Treg功能分子和活化性分子。同时,胸腺Treg体外抑制功能降低而外周Treg抑制功能正常。Il2ra-/-Tg小鼠Treg细胞高表达Th1型趋化因子受体CXCR3和转录因子Eomes,同时具有更强的IFN-γ分泌能力,TSDR区域的去甲基化水平也升高。Il2ra-/-Tg小鼠胸腺及外周Treg上Nrp-1和PD-1的表达明显降低,伴随着的是Tfr细胞的消失。利用骨髓嵌合实验补充正常的Tfr细胞能抑制Il2ra-/-Tg小鼠Tfh细胞的增加及生发中心反应的增强,说明Tfr的缺陷是小鼠淋巴结肿大及生发中心反应增强的主要原因。
  综上所述,笔者发现了TGF-β和IL-2信号共同作用调节了Nrp-1+Treg细胞以及Tfr细胞的发育,为生发中心依赖的自身抗体介导的自身免疫性疾病的治疗提供了新靶点。
  第二部分 自身免疫性骨髓纤维化的发病机制研究
  骨髓纤维化是一种髓系细胞增生性肿瘤,其特征包括干细胞来源的髓系细胞克隆增殖、骨髓成纤维细胞增多和网状纤维分布导致的骨髓纤维化、贫血、脾肿大、髓外造血等。通常情况下,骨髓纤维化并不被认为是一种自身免疫性疾病。但是在一些情况下,骨髓纤维化可能伴随自身免疫病出现,尤其是系统性红斑狼疮(SLE),称之为自身免疫性骨髓纤维化。自身免疫性骨髓纤维化可伴随原发性胆汁性胆管炎(PBC),但其发生机制并不清楚。前期发现p40-/-IL-2Rα-/-模型小鼠是很好的PBC模型小鼠,并会自发出现肝脏的纤维化。而进一步发现,模型小鼠会出现脾脏肿大、贫血等现象,与临床骨髓纤维化症状相似。因此探究了p40-/-IL-2Rα-/-模型小鼠作为自身免疫性骨髓纤维化的模型的可能性,并进一步探究及其发病机制。
  不同于对照小鼠,p40-/-IL-2Rα-/-鼠脾脏出现类似CFU-S实验的结节,有大量巨核细胞,并且肝脏出现血岛。在小鼠的外周血、肝脏、脾脏中均出现了造血干细胞(LSK)样的细胞,说明髓外造血的存在。这些升高的LSK细胞与小鼠脾脏重量及肝脏的炎症程度成正相关。与对照鼠小鼠相比,血液中红细胞计数、血红蛋白、血球容积、白细胞计数均明显降低,说明出现了贫血的情况。H&E染色发现p40-/-IL-2Rα-/-鼠骨髓会出现成纤维细胞的增多,银染发现骨髓会有大量网状纤维,说明小鼠出现了骨髓纤维化。骨髓中LSK样细胞增多,且造血能力降低。p40-/-IL-2Rα-/-鼠骨髓浸润大量活化状态的CD4+和CD8+T细胞,这些T细胞有更强的IFN-γ分泌能力且与LSK细胞比例呈正相关。利用转基因小鼠发现,敲除CD4并不会减轻小鼠的骨髓纤维化,但是敲除CD8a或者敲除IFN-γ都可以阻止骨髓纤维化的发生,表现为髓外造血消失,骨髓造血干细胞恢复正常,骨髓成纤维细胞消失以及无网状纤维分布。关键的是,在小鼠发病之后利用抗CD8α抗体清除CD8+T细胞,能显著减轻小鼠自身免疫性骨髓纤维化的发生。
  总之,CD8+T细胞及其产生的细胞因子IFN-γ是导致小鼠自身免疫性骨髓纤维化的关键因素。利用抗体清除CD8+T细胞能对自身免疫性骨髓纤维化进行治疗,为临床上治疗提供新的思路。
[博士论文] 郑凯
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:骨巨细胞瘤(Giant cell tumor,GCT)是临床常见的骨肿瘤之一,是具有易复发性和潜在恶性的原发性骨肿瘤,占骨与软组织肿瘤的3%~8%。GCT多侵犯长骨末端,以膝关节周围最为常见,骨盆GCT临床较为少见,约占所有GCT的1.5%-6.1%。GCT同时具有良性肿瘤细胞学特征和恶性肿瘤生物学行为,存在较高的术后复发率及可能的远处转移,当临床医生将GCT作为良性肿瘤对待时,往往存在肿瘤切除不彻底,GCT局部复发及远处转移,当临床医生将GCT作为恶性肿瘤对待时,往往存在肿瘤切除范围大,损伤重要组织器官,牺牲了肢体功能。因此,正确认识GCT,选择恰当的治疗方式,在切除肿瘤的同时保留肢体功能是临床医生追求的治疗目标。骨盆GCT在具有肢体GCT特征的同时,因骨盆解剖结构复杂,在治疗过程中,需要考虑神经、血管、骨盆环及髋关节等系列问题,且骨盆肿瘤往往发生部位深在,就诊时间较晚,存在临床症状时,肿瘤巨大,切除困难,这一系列的原因导致骨盆GCT的治疗具有挑战。另一方面,由于骨盆GCT临床发病率较低,文献报道的骨盆GCT治疗结果数据较少,导致临床治疗决策中可以参考的资料较少,且在对肿瘤病灶进行术前评估时缺少必要的评价系统这就使得GCT的临床治疗多依赖医生个人经验,临床治疗方法的选择存在较多争议,各种治疗方式治疗后临床效果报道各异。
  本研究的目的是:1.回顾性分析多中心骨盆GCT临床病例,探讨骨盆GCT临床治疗策略;2.创建骨盆GCT临床评分系统,回顾性分析多中心骨盆GCT患者的治疗方式及预后情况以对评分系统进行初步临床验证;3.探寻骨盆GCT肿瘤组织生物标志物,探索建立骨盆GCT血清蛋白诊断模型。
  回顾性分析骨盆GCT临床病例,收集中国骨巨细胞瘤协作组(Giant cell tumor team of China,GTOC)临床病例,时间从2001年到2013年,涉及全国五家骨肿瘤治疗中心,包括济南军区总医院、天津医院、第四军医大学西京医院、南京军区总医院、浙江大学附属第二医院,共收集经过手术治疗、临床资料及随访资料完善的骨盆GCT病例29例,对29例患者依据肿瘤部分进行分组,比较各组间患者一般性资料、肿瘤控制情况、肢体功能情况等参数。采用专家咨询法和层次分析法,从影响骨盆GCT治疗决策和预后判断的众多因素中筛选出相对重要的一级指标及二级指标,并对二级指标进行分值计算,创建骨盆GCT临床评分系统。筛选2000年1月至2013年12月六家骨肿瘤治疗中心收治且临床治疗及随访资料完整的骨盆骨巨细胞瘤患者38例,依据评分系统对病例进行评分,分析评分与手术方案、术后功能、临床预后的关系,验证评分系统的准确性。收集骨盆GCT患者肿瘤组织、瘤旁组织及血液标本,采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS),对肿瘤组织及瘤旁组织切片进行MALDI分子成像对比研究,对比研究骨盆GCT患者和健康对照的血清蛋白质谱。
  多中心回顾性研究骨盆骨巨细胞瘤患者资料显示,髋臼区的骨盆GCT手术治疗后术后并发症常见、肢体功能差。29例患者中有3例患者出现了术后复发,包括1例病灶内手术的患者和2例整块切除的患者。接受病灶内手术的8例患者,肢体功能MSTS评分平均得分为25.4分,21例接受整块切除的患者平均肢体功能评分为21.9分。1例接受病灶内手术的患者和6例接受整块切除的患者出现了手术并发症。基于专家咨询法和层次分析法建立的骨盆GCT临床评分系统包含4个一级指标及12个二级指标,具体包括:①肿瘤部位:非髋臼区(1分)、髋臼区(2分)、同时累及非髋臼区及髋臼区(3分);②肿瘤大小(在标准正位骨盆X线片上将半骨盆九格均分):肿瘤大小占1格(1分)、肿瘤大小占2格(2分)、肿瘤大小占2格以上(3分);③软组织肿块:无软组织肿块(1分)、软组织肿块存在皮质骨一侧(2分)、软组织肿块突破双侧皮质骨(3分);④骨盆环连续性:骨盆环连续性正常(1分)、非负重区受累(2分)、负重区受累(3分)。评分系统评分合计最低4分,最高12分。多中心38例骨盆骨巨细胞瘤患者评分平均为(7.8±2.6)分,低分组(4~6分)12例、中分组(7~9分)17例,高分组(10~12分)9例。三组之间患者的性别、年龄、年龄构成比及随访时间的差异均无统计学意义,而切除方式、重建方式、复发、并发症及MSTS功能评分的差异均有统计学意义,高评分患者接受切除术可能性大,多需要重建,术后局部控制好,但并发症发生的可能性大、术后功能差。采用MALDI分子成像技术对比骨盆GCT肿瘤组织与瘤旁组织的切片分子成像,发现4个差异表达的蛋白质峰,分别是3198.437Da、3329.489Da、3904.425Da、4747.853Da。本研究中使用了弱阳离子交换磁珠、疏水磁珠和铜离子螯合磁珠,将骨盆GCT患者血清样本同健康对照者的血清样本进行比对时发现了12个差异表达明显的蛋白质峰,分子量分别为4209Da、5904Da、7764Da、9285Da、5904Da、1466Da、3263Da、4209Da、7764Da、4371Da、4209Da、9285Da。
  基于以上结果,我们认为在髋臼区域的骨盆GCT的外科治疗很难选择,髋臼区GCT手术并发症常见且肢体功能一般较差。相比整块切除术,病灶内手术联合辅助治疗可以获得良好的局部肿瘤控制,并获得更好的术后肢体功能。创建的骨盆GCT临床评分系统涵盖了影响骨盆GCT治疗方案和预后判断的主要因素,对于肿瘤切除、重建方式及预后判断具有临床指导价值。MALDI分子成像技术和MALDI-TOF MS血清蛋白质谱分析是检测发现骨盆GCT的组织切片生物标志物和血清差异蛋白的有效方法。
[博士论文] 刘磊
临床医学(麻醉学) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  随着医学科学技术水平的发展,癌症的检出率越来越高,治疗方法和疗效也得到了提高,生存期逐渐延长。然而,癌性疼痛却严降低了恶性肿瘤病人的生存质量。迄今为止,阿片类药物仍然是癌性疼痛治疗最有效和最常用的药物,但大剂量长时间的应用阿片类药物极易造成耐受甚至痛觉过敏。临床上还没有比阿片类药物效果更好的治疗癌性疼痛的药物,因此阿片类药物耐受是癌性疼痛治疗中急需解决的棘手问题。
  目前单纯吗啡耐受动物模型几乎是国内外关于阿片耐受的研究的全部基础,但此动物模型并不能与癌性疼痛临床情况完全相符合。癌痛是最复杂的慢性疼痛,既有炎症痛和神经病理性疼痛的参与,又比二者而复杂的多。所以要想深入的研究癌痛吗啡耐受机制,必需建立能模拟临床实际情况的动物模型。
  趋化因子是参与免疫细胞募集、成熟和激活的重要介质,其化学成分是分泌型的小分子量蛋白质(约8~12ku)。有研究发现趋化因子MCP-1在疼痛的产生和维持过程中发挥重要的作用。也有研究证实小胶质细胞在神经病理性疼痛的形成中有重要的作用。既往研究还发现正常小鼠鞘内给注射MCP-1能激活CCR2活化脊髓小胶质细胞,并能诱发机械痛敏且成剂量依赖性,但预先鞘内注射MCP-1的中和抗体就能阻止小胶质细胞的激活并且预防机械性痛敏的发生。此外,免疫荧光双标发现脊髓小胶质细胞OX-42和CCR2共表达,鞘内注射MCP-1中和抗体能够抑制神经病理性疼痛模型中脊髓背角小胶质细胞的激活和有效缓解神经病理性疼痛。
  炎性细胞因子在慢性痛的调控中具有重要作用。IL-1、IL-6不但在神经-内分泌免疫功能系统中发挥重要作用,也是急性炎性反应的敏感指标,伤害性刺激可引起IL-1、IL-6水平升高,其升高的程度与疼痛关系密切。TNF-a可通过激活环氧化酶-2诱导前列腺素E的合成导致痛觉过敏,也可通过诱发缓激肽、P物质、儿茶酚胺的释放导致痛觉过敏。通过激活神经元和胶质细胞上的TNF-a、IL-1和IL-6受体可致神经兴奋性提高,从而导致中枢敏化和痛觉敏感性增加。
  然而,骨癌痛吗啡耐受大鼠中MCP-1是否参与吗啡耐受的产生,是否通过CCR2激活小胶质细胞释放炎症细胞因子,从而导致吗啡耐受呢?这正是本课题要研究的问题。
  第一部分 MCP-1在骨癌痛吗啡耐受大鼠中的作用
  目的:观察骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓MCP-1、CCR2的表达情况。研究鞘内注射MCP-1中和抗体后骨癌痛吗啡耐受大鼠疼痛行为学指标机械缩足阈值(PWT paw withdrawal threshold)和热缩足潜伏期(PWL paw withdrawal latency)的变化。
  方法:成年雌性SD大鼠,体重150~170g,24只大鼠,随机分为4组(n=6):对照组(S组)、吗啡耐受组(M组)、骨癌痛组(B组)、骨癌痛吗啡耐受组(BM组)。S组大鼠胫骨髓腔注射NS5μl,第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d;M组大鼠胫骨髓腔注射NS5μl,第9天鞘内注射20μg/k g吗啡,2次/d,连续9d;B组胫骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d;BM组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/k g吗啡,2次/d,连续9d。于术后18d处死各组大鼠,取L4-5脊髓组织,采用Western-blot法检测大鼠脊髓MCP-1表达情况,采用RT-PCR法测定大鼠脊髓MCP-1、CCR2表达情况。
  成年雌性SD大鼠48只,随机分为6组(n=8):骨癌痛组(B组)、骨癌痛吗啡耐受组(BM组)、骨癌痛吗啡耐受注射中和抗体组(BM+Ab组)、骨癌痛吗啡耐受注射IgG组(BM+IgG组)、骨癌痛注射中和抗体组(B+Ab组)、骨癌痛注射IgG组(B+IgG组)。B组大鼠胫骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d;BM组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d;BM+Ab组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;BM+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d;B+Ab组大鼠胫骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;B+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d。术前、术后3d、6d、9d、12d、15d、18d检测各组大鼠机械缩足阈值(PWT paw withdrawal threshold test)和热缩足阈值(TWL thermal withdrawal latency)。
  结果:M组大鼠较S组、M组和B组大鼠脊髓MCP-1、CCR2表达明显增多(P<0.05)。BM+Ab组大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体后机械缩足阈值(PWT paw withdrawal threshold test)和热缩足阈值(TWL thermal withdrawal latency)明显升高(P<0.05)。
  结论:MCP-1可能在骨癌痛吗啡耐受中起重要作用。
  第二部分 鞘内注射MCP-1中和抗体对骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓OX-42和炎症因子TNFα、IL-1、IL-6表达的影响。
  目的:研究鞘内注射MCP-1中和抗体后骨癌痛吗啡耐受大鼠脊髓OX-42和炎症因子TNFα、IL-1、IL-6表达的变化。
  方法:成年雌性SD大鼠72只,随机分为6组(n=12):骨癌痛组(B组)、骨癌痛吗啡耐受组(BM组)、骨癌痛吗啡耐受注射中和抗体组(BM+Ab组)、骨癌痛吗啡耐受注射IgG组(BM+IgG组)、骨癌痛注射中和抗体组(B+Ab组)、骨癌痛注射IgG组(B+IgG组)。B组大鼠胫骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d;BM组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/kg吗啡,2次/d,连续9d;BM+Ab组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/k g吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;BM+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天开始鞘内给予20μg/k g吗啡,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d;B+Ab组大鼠胫骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射MCP-1中和抗体10μg,连续3d;B+IgG组大鼠胫骨骨髓腔注入Walker256细胞5μl(2×107个细胞/mL),第9天鞘内注射NS4μl,2次/d,连续9d,第15天开始每天注射IgG10μg,连续3d。术后18d处死全部大鼠,取L4-5脊髓组织,采用免疫组化法测定OX-42的表达情况,采用RT-PCR法检测炎症因子TNFα、IL-1、IL-6的表达情况。
  结果:BM+Ab组大鼠鞘内注射MCP-1中和抗体后脊髓OX-42和炎症因子TNFα、IL-1、IL-6表达明显减少(P<0.05)。
  结论:MCP-1可能通过激活小胶质细胞引发炎症反应从而导致骨癌通吗啡耐受。
[博士论文] 石辉
临床医学(骨外科) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是直接来源于骨骼系统的原发性恶性肿瘤,其特征是肿瘤细胞为未成熟骨或骨样组织。典型骨肉瘤是一种罕见的(占所有恶性肿瘤的0.2%)高度恶性肿瘤,估计每年每万人有3例发病。骨肉瘤主要在长骨发病,很少出现在软组织。相对应骨骼系统的快速发育期,其发病率达到顶峰。虽然现代的多模式治疗已经显著提高了肿瘤的可切除性和远期疗效,25-50%的病人初始没有转移,后续发生转移,这仍是造成病人死亡的主要原因。尽管采取积极的联合化疗和外科手术,仍有超过30%的病人发展为肺部转移。20世纪80年代新辅助化疗药物大大提高了骨肉瘤患者的5年生存率,然而此后无论在骨肉瘤患者的治疗升级还是预后改善等方面未再有新的研究进展。在骨肉瘤患者发生肺部及其它部位远隔转移后,其长期生存率仍较低,仅为10-30%。目前大剂量应用的常规化疗药物副作用大,因此,新的治疗目标应着重于探索寻找安全有效的化疗药物。
  值得注意的是,癌症患者的数量和治疗成本不断增加,这对政府来说成为一项巨大的财务负担。在发达国家的抗癌治疗的费用是螺旋式增长的,其对经济影响正日益成为与国家卫生服务密切相关的事件。国家公共卫生系统急需新的既有效而且价格低廉的抗癌策略。在这方面,探寻针对肿瘤治疗的药物“重用”,也就是用现有药物寻找新的治疗适应症,将是一种高效、现实和便宜的策略。
  基因的扩增、缺失、移位及其他突变将会引起肿瘤的发生,基因组不稳定性所引起的骨组织的增殖和分化异常,将会导致骨肉瘤的发生。研究证实基因组突变在骨肉瘤的发生中起着重要的作用。包括DNA甲基化在内的众多表观遗传学改变也被证实在肿瘤的发生发展中扮演重要角色,骨肉瘤也不除外。研究证实DNA甲基化在多种恶性肿瘤的发生和发展中作用尤其重要。癌症的发生存在相关基因的变化,这些变化主要为癌基因的低甲基化状态和抑癌基因的甲基化程度升高。OS的特征是频繁的基因组不稳定性、高度异质核型、基因表达的变化和复发性表观遗传改变。在骨肉瘤的多项研究中,基因甲基化水平的变化与骨肉瘤的临床分期、外科分级、转移及预后等临床指标关系密切。
  S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine,SAM)是多种生化反应的甲基供体,它对甲基化的调控主要是通过抑制DNA去甲基化的过程并导致促癌基因去甲基化和沉默来实现的。据报道,SAM有抗癌的特性,在多种癌细胞中发挥抗增殖作用,可以作为抗癌药物应用。在骨肉瘤的相关研究中,SAM主要是通过阻滞细胞周期和诱导肿瘤细胞凋亡发挥抑制骨肉瘤细胞增殖的作用。然而其分子机制的研究才刚刚开始。SAM在肿瘤治疗的优势在于它是天然存在的分子,在人体内通过甲硫氨酸腺苷转移酶同工酶合成,并且是FDA批准的营养补充剂,价格低廉,非常安全。
  Sox2是属于高迁移率族蛋白(High mobility group protein,HMG)家族的核转录因子,其在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新中起决定性作用。Sox2也是骨肉瘤细胞保持干细胞特征的关键因素。研究发现,人和小鼠骨肉瘤细胞株显示高表达的Sox2,通过内源性Sox2基因敲除或RNA干扰Sox2基因表达,骨肉瘤细胞侵袭和转移体外明显减少。这意味着Sox2具有促进骨肉瘤发生和转移的作用。Wnt信号通路通过β-catenin与Tcf/Lef家族的结合调节基因转录,β-catenin在细胞质内的稳定性是Wnt信号通路发挥作用的核心因素。当细胞内β-catenin蛋白水平降低时,Wnt通路闭合;当β-catenin蛋白水平升高时,Wnt通路开放。Wnt/β-catenin信号通路在骨细胞的成骨和分化中起着重要作用。在肿瘤发生、发展的机制中Wnt/β-catenin信号通路往往是激活的。研究表明Wnt/-catenin信号通路的激活促进成骨细胞过度增殖,并抑制破骨细胞导致骨肉瘤的发生。
  研究目的:
  1、观察Sox2和β-catenin蛋白在人骨肉瘤组织中的表达,明确其与骨肉瘤病例临床特征的关系。
  2、观察SAM对骨肉瘤细胞活性的影响,分析SAM对Sox2及Wnt/β-catenin信号通路的调节作用,探索SAM抑制骨肉瘤细胞活性的作用机制。
  3、为SAM治疗骨肉瘤应用于临床提供理论参考和依据。
  研究方法:
  根据研究目的,本实验分为以下三部分:
  1、通过免疫组织化学的方法研究人骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin的表达,分析骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin的表达与患者临床特征的关系,为两种蛋白在骨肉瘤发生和转移中的作用提供组织学证据。
  2、体外实验采用MTT法检测SAM对人类骨肉瘤U2OS细胞的增殖影响。通过流式细胞术检测U2OS细胞的凋亡情况。通过Caspase活性定量检测试剂盒检测Caspase-3,8,9的活性。细胞划痕实验用于检测骨肉瘤细胞的迁移。Westernblot和实时荧光定量PCR检测Sox2,β-catenin和C-myc的表达。观察SAM对人骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响,探讨SAM在人骨肉瘤细胞中的作用机制。
  3、采用骨肉瘤K7M2细胞株建立裸鼠骨肉瘤模型,HE染色观察其组织学特点,观察SAM对动物模型肿瘤细胞增殖的影响并分析其安全性,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达,Western blot和实时荧光定量PCR检测Sox2,β-catenin和C-myc的表达,体内实验探讨SAM可能的作用机制。
  研究结果:
  1、骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin呈现为高表达(阳性率分别为80.77%和75.0%),与骨软骨瘤组织中两种蛋白的表达阳性率比较有显著性差异(P<0.05)。Sox2和β-catenin阳性表达率在不同的Enneking临床分期间比较有显著性差异(P<0.05)。Sox2和β-catenin的阳性率在发生转移(94.74%和78.95%)和未发生转移(72.73%和51.51%)组间比较差异有显著性(P<0.05)。而Sox2和β-catenin的蛋白表达水平与患者年龄、性别、病变部位以及病理分型均无明显相关性(P>0.05)。
  2、体外实验结果表明,随着SAM剂量(50,100,200,400μM)的增加、时间延长(24,48,72小时)实验组OD值与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。SAM可明显抑制U2OS细胞增殖,具有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞仪技术显示,200μM的SAM作用于骨肉瘤的U2OS细胞24和48,随着时间延长,早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐升高(P<0.05),处理48小时的U2OS细胞凋亡率明显高于处理24小时的,所以SAM可以诱导人骨肉瘤U2OS细胞的凋亡,并且存在时间依赖性。在划痕实验中SAM处理48小时,与对照组相比,随着SAM(50、100、200、400μM)浓度的增加,实验组细胞划痕之间的距离显著增加(P<0.01),说明SAM显着降低了U2OS骨肉瘤细胞的迁移能力。Caspase活性检测结果显示:50、100μM的SAM作用于U2OS细胞24小时、48小时,Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9的活性相对于对照组没有明显的增强(P>0.05),三种酶的活性随时间和药物浓度的变化无明显的增加。200μM的SAM作用于人骨肉瘤U2OS细胞24小时,与对照组相比,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性显著升高(P<0.05),同剂量下48小时与24小时相比酶的活性没有显著升高(P>0.05)。400μM的SAM作用于U2OS细胞24小时,其Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9的活性相对于对照组及200μM组有明显的增强(P<0.05),药物作用48小时与24小时相比酶活性无显著升高(P>0.05)。在200μM的SAM作用48小时后对骨肉瘤U2OS细胞采用Western blot和实时荧光定量PCR的方法检测Sox2、β-catenin及C-myc蛋白及mRNA表达的变化,与对照组相比实验组表达水平明显下降(P<0.05)。
  3、体内实验中,经大体外观及组织学检查证实K7M2细胞成功建立裸鼠骨肉瘤模型。与对照组相比,SAM可明显抑制肿瘤生长。同时,裸鼠体重无明显下降,说明SAM具有明显的抗肿瘤效果和良好的安全性。SAM治疗组细胞凋亡蛋白Bcl-2表达下调,Bax呈现为高表达,与对照组相比差异显著,有统计学意义(P<0.05)。SAM治疗组Sox2、β-catenin和C-myc无论蛋白水平还是mRNA水平表达明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。表明SAM可能下调Sox2的表达并降低Wnt/-catenin信号通路的活性起到治疗骨肉瘤的作用。
  研究结论:
  1、人骨肉瘤组织中Sox2和β-catenin表达升高,其表达水平与骨肉瘤的临床分期、远处转移有密切的关系。
  2、SAM可明显抑制骨肉瘤U2OS细胞有的增殖、迁移。通过增强Caspase-3,8,9的活性起到诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。
  3、SAM治疗骨肉瘤的机制可能与其下调Sox2的表达、降低Wnt/β-catenin信号通路的活性有关。
  4、SAM为骨肉瘤的治疗提供了新的思路和方法。
[博士论文] 张栋
外科学(骨外) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:骨肉瘤(Osteosarcoma)是当前阶段临床上较为常见的一种恶性肿瘤。放射治疗以及截肢是1970年之前该症最为主要的治疗方法,肺癌转移率非常高,5年生存率不足20%。随着手术切除治疗方案的广泛应用,以及多药联合化疗的大规模推广,该症的5年生存率总体水平提升非常明显。但是我们必须认识到,虽然化疗在该症的临床治疗过程中已经发挥了可喜的作用,并得到了更为广泛的关注和重视,但是整体化疗有效率始终限制在60%上下。
  含表皮生长因子结构域的Fibulin样胞外基质蛋白2(EFEMP2,在部分文献资料中也同样被又称fibulin-4,MBP1,UPH1)。临床上发现其功能主要包括促进相关组织的形成和稳定。目前研究发现fibulin家族成员参与调解细胞生长、形态以及运动的一系列过程,并在临床数据统计中表现出和肿瘤因子的显著关联。EFEMP2在多种肿瘤发挥着不同的功能,它在肿瘤中的表达关系到肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移和血管生成,目前为止对其在骨肉瘤发生发展的作用尚不清楚。本研究拟观测EFEMP2对骨肉瘤细胞生物学行为的影响、其潜在的关联性和可能的分子机制,为骨肉瘤的检测和治疗提供新策略。
  研究目的:
  1.探讨EFEMP2在骨肉瘤组织中的表达,与患者预后的相关性,及其临床意义;
  2.探讨EFEMP2对骨肉瘤侵袭、迁移能力的影响;
  3.探讨EFEMP2在骨肉瘤细胞中对上皮间充质转化的影响;
  4.探讨EFEMP2影响骨肉瘤细胞侵袭和迁移的相关信号通路。
  研究材料和方法:
  一、EFEMP2在骨肉瘤细胞生物学行为中的表达及相关性研究
  1.免疫组织化学
  选取自2005年至2015年间收集自山东大学齐鲁医院和山东省立医院骨科就诊的骨肉瘤病例石蜡组织标本共计160例,骨纤维结构不良标本60例,瘤旁正常组织40例,所有骨肉瘤病例均无术前的放射及化学治疗,常规随访。免疫组织化学检测的石蜡包埋切片首先在二甲苯中脱蜡,并在乙醇中再水化,然后在添入0.01M柠檬酸盐的PH为6.0缓冲液的高压锅内恢复;当达到压力时,切片在高压锅内孵化3分钟。免疫细胞化学中,细胞被接种于盖有载玻片的含有75%-80%混合液的培养皿中,24小时后收集盖玻片,PBS清洗三次,在95%的乙醇中处理30分钟。按照Streptavidin-Peroxidase Detection Kit(ZSGB-BIO),接下来的步骤对于免疫组织化学检测和免疫细胞化学检测是相同的。
  2.软琼脂克隆形成实验
  用20%FBS培养基1.5ml与1.2%琼脂1.5ml混合加载至3.5cm培养皿,并凝固为底层;0.7%琼脂1.5ml混合20%FBS培养基1.5ml及200μl(MG63、U-2OS及hFOB)细胞悬液(含600个细胞)立即加入培养皿上层;所有的培养皿在37℃、5%CO2饱和适度下孵育2周,实验每个重复一式三份。在倒置显微镜(Nikon Eclipse)下,培养皿分为各个象限,对每个象限内的直径2mm以上的集落进行计数和平均数;所有数据用均数±标准误表示。、
  3.细胞侵袭实验
  被覆PVPF的Boyden小室(MA)加入50μl1∶3滴度的无血清Matrigel胶。上室内加入200μl(含2×105个细胞)的(MG63、U-2OS及hFOB)细胞悬液,下室内加入600μl无血清的上清NIH3T3细胞作为趋化因子,Boyden小室在37℃下孵育24小时。移除上表面基膜内非侵袭性细胞,下表面细胞以4%多聚甲醛固定,苏木精伊红染色,于倒置显微镜下随机5个高倍视野内计数。每个重复一式三份,所有数据用均数±标准误表示。
  4.细胞迁移实验
  细胞迁移实验同时按照上述步骤进行,不需Matrigel基膜,只孵育12小时。每个重复一式三份,所有数据用均数±标准误表示。
  5.免疫细胞化学实验
  各细胞被接种于盖有载玻片的含有75%-80%混合液的培养皿中,24小时后收集盖玻片,PBS清洗三次,在95%的乙醇中处理30分钟;余步骤同免疫组织化学实验。
  二、EFEMP2在骨肉瘤细胞侵袭及转移能力的研究
  1.单细胞克隆技术分离MG63细胞亚克隆株
  取对数期生长的MG63细胞稀释至10个/ml,并以0.1ml/孔接种于96孔板,尽可能使之每孔内一个细胞,添加培养液至0.2ml/孔,在37℃、5%CO2孵化箱一周后,收集生长良好的每个孔内的单克隆细胞,依次移至24孔和6孔培养板,最后移至培养瓶中扩大培养。在细胞电泳设备(DY-100)中,分别测定各亚克隆细胞的迁移率。最终获得31株单克隆细胞亚系,编号为MG63-1~MG63-31。
  2.细胞电泳率的测定
  取克隆的31株细胞,常规培养至汇合状态,对其进行离心处理后去除上清液,通过滴加1%蔗糖溶液重悬获得单细胞悬液,利用光电显微镜对其活细胞数量进行统计,调整细胞密度至1×106/ml,加入细胞电泳仪。计数12~16个瘤细胞/株,在电场中自动泳动250μm正向和反向各一次所需时间,根据公式计算细胞电泳速度。根据电泳结果,MG63-1细胞株速度最快,MG63-31细胞株最慢。
  3.生长曲线
  各个细胞亚系收集于对数增长期,接种于24孔板(1×104个细胞/孔),在37℃、5%CO2孵育;每日在三个孔内加入胰酶消化,收集活细胞,并计数和均数;细胞倍增时间按照patterson公式计算,连续7天按照细胞计数和均数标绘生长曲线。结果显示MG63-1克隆株的生长最快,MG63-31最慢。
  4.慢病毒转染
  pLVX-EFEMP2慢病毒载体和EFEMP2shRNA慢病毒载体以及阴性对照,均由GeneChem Inc.获得。根据载体的说明,优先将病毒感染的靶细胞接种于24孔板,每孔细胞数0.5×105,于37℃、CO2孵化箱孵育24或48小时,至60-80%的细胞汇合;然后通过加入病毒库将细胞感染,多重感染指数(MOI)达到100。另外,也包括阴性对照的病毒构建转导孔。细胞在37℃、5%CO2条件下孵育整晚,转染混合物放置在正常培养基内,避免细胞毒作用。48小时后,细胞通过荧光显微镜检查进行评估;转染效率由蛋白免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应法和免疫细胞化学法确认。EFEMP2的siRNA序列是:sense5'-CAGAUCCGUGCUGGAAACUCG-3'和antisense3'-AGUUUCCAGCACGGAUCUGAA-5'。阴性对照(杂乱次序)是:sense5'-AUCGACGAUCCCUAUUGGCGU-3'和antisense3'-GCCAAUAGGGAUCGUCGAUCU-5'。
  三、EFEMP2通过PI3K-AKT-mTOR信号途径诱导上皮间质转化在促进骨肉瘤侵袭及转移的作用及机制研究
  1.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
  实验方法同前。
  2.Western blot实验
  实验方法同前。
  统计学分析
  免疫组化检测数据使用x2检验。双侧t检验用于比较两组的均数比较,三组均数间的比较使用单边方差分析。Kaplan-Meier检验、秩和检验和生存曲线分析用于EFEMP2与骨肉瘤病例预后之间的相关性分析。所有数据使用SPSS13.0软件分析,以P<0.05(双侧)认为具有统计学差异。
  研究结果:
  1.EFEMP2在入骨肉瘤组织内表达
  我们发现在人骨肉瘤组织内EFEMP2蛋白高表达,而在大多数的正常组织内EFEMP2的免疫反应性很低;而且,EFEMP2高表达肯定与低分化类型和淋巴结转移相关。在qRT-PCR实验中,发现骨肉瘤组织中的EFEMP2mRNA高表达与肿瘤的低分化和淋巴结转移同样具有相关性。利用Kaplan-Meier检验的生存曲线分析表明,骨肉瘤中EFEMP2高表达的病例的不良预后要高于低表达者。
  2.高侵袭及低侵袭亚克隆细胞株的建立
  使用单细胞克隆技术,从MG63细胞中亚克隆出31株;相对于MG63-31亚克隆细胞株的低迁移率(7.68±0.13μm/s),MG63-1亚克隆细胞株据有更高的迁移率(19.59±0.56μm/s),并表现出更高的增殖力和侵袭能力。在体内,高侵袭亚克隆组的皮下肿瘤形成率为100%,并伴有肿瘤的迅速生长;而低侵袭组的皮下肿瘤形成率只有大约50%,生长速度亦缓慢。MG63-1组的肿瘤体积为479.82±34.31mm3,要显著大于MG63-31组的瘤体体积(35.91±3.73mm3,P<0.01)。
  3.人骨肉瘤细胞系与正常成骨细胞系的不同增殖和侵袭力
  与正常成骨细胞系hFOB相比,人骨肉瘤细胞系U-2OS和MG63表现出更强的增殖能力;在软琼脂克隆形成实验中,细胞系U-2OS和MG63所形成的克隆数也显著的高于细胞系hFOB;在细胞迁移实验和Matrigel侵袭实验中,细胞系U-2OS和MG63的迁移和侵入均数都高于细胞系hFOB。在两个骨肉瘤细胞系中,MG63组的增殖能力和侵袭力要强于U-2OS组。
  结论:
  1.EFEMP2在骨肉瘤组织中呈阳性表达,并与不良预后正相关
  2.EFEMP2在体内外试验中均促进骨肉瘤细胞的侵袭及转移
  3.EFEMP2通过PI3K-AKT-mTOR信号途径诱导上皮间质转化。
[博士论文] 王一帆
生物材料与组织工程 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,在肿瘤治疗领域中,新兴了一类极具吸引力的诊疗材料:释放抗肿瘤元素的组织衍生纳米颗粒。其应用极有可能帮助我们同时实现组织修复和肿瘤抑制。此类材料中最具特色的代表要属硒元素掺杂的羟基磷灰石纳米粒子(Selenium-doped hydroxyapatite nanoparticles, Se-HANs),其组分中的HA提供了良好的生物相容性和骨修复功能,而材料释放的元素Se则具备优良的抗肿瘤功能。以上双重功能的结合,使Se-HANs可以在促进骨缺损修复的同时抑制骨肉瘤复发,从而为骨肉瘤的术后治疗提供有力的帮助。
  我们在早期的研究中发现Se-HANs可以显著抑制骨肉瘤的生长。然而,元素Se究竟是如何从Se-HANs中释放出来,又是通过何种途径产生抗骨肉瘤效果,仍没有得到清楚的阐释。为了揭示 Se-HANs抑制骨肉瘤的具体途径,本课题首先制备了Se-HANs,随后从材料降解与 Se的控制释放,材料-细胞相互作用,ROS的产生以及凋亡分子信号通路等多方面逐层深入地评价与探索了Se-HANs的体内外抗骨肉瘤功能与作用机理。不仅如此,我们还进一步考察了 Se-HANs的系统毒性,证实了Se-HANs是一种安全的抗肿瘤材料。本课题的主要研究内容包括以下几点:
  1. Se-HANs的制备、表征和体外pH响应释放。以亚硒酸钠为Se源,利用优化工艺的湿化学沉淀法制备了一系列不同 Se掺杂量的Se-HANs。通过 XRD、元素mapping、FTEM、DLS等表征发现,制备的纳米粒子具有典型的HA物相,且 Se元素被成功掺杂到HA的晶体结构当中;Se-HANs尺寸小于100nm,具有规整而统一短针状形貌,良好的分散性和胶体稳定性。分别在pH7.4和pH5.0的PBS溶液中考察Se-HANs的降解与Se释放,结果发现Se-HANs具有酸性响应且依赖于材料降解的Se释放特性,是理想的抗肿瘤载药体系。
  2. Se-HANs的体外抗骨肉瘤功能及相关机理。体外条件下,将 Se-HANs与MNNG/HOS细胞共培养。首先利用LSCM、TEM及FCM,研究了Se-HANs通过非特异性细胞内吞途径进入骨肉瘤细胞的过程;然后通过CCK-8检测,证实了Se-HANs具备肿瘤细胞毒性;接着利用FCM考察了细胞内的ROS水平,进一步通过抑制ROS的生成探索了ROS与Se-HANs细胞毒性之间的关系,证明了Se-HANs的肿瘤细胞毒性依赖于ROS的生成;最后通过WB和IF检测Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9和Cyt-c等关键凋亡调控因子,深入挖掘了Se-HANs诱导骨肉瘤细胞凋亡的分子机制,由此总结出Se-HANs的体外抗骨肉瘤作用机理:Se-HANs通过非特异性细胞内吞途径进入骨肉瘤细胞,有效地响应溶酶体酸性微环境,快速降解和释放出无机 Se离子,诱导产生ROS,协同激活内源和外源两条caspase依赖的细胞凋亡途径,从而导致骨肉瘤细胞凋亡。
  3.Se-HANs的体内抗骨肉瘤功能及相关机理。我们在裸鼠的肩胛骨处构建了骨肉瘤原位模型,并将Se-HANs直接注射到肿瘤内部进行治疗。通过观察荷瘤动物的生存状态,绘制肿瘤的生长曲线,记录实验终点的肿瘤体积、重量,以及对肿瘤组织切片进行HE、TUNEL、vonKossa等染色发现,Se-HANs可以在肿瘤酸性微环境下有效降解和释放出 Se,从而减少肿瘤血管生成,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长。进一步通过肿瘤组织的免疫染色发现,Se-HANs可以诱导8-OHdG以及剪切激活的Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3在肿瘤组织中表达,由此证实Se-HANs的体内外抗骨肉瘤分子机理基本相互一致。最后通过血液生化分析发现,10%Se-HANs组中动物的肝、肾等器官损伤程度最轻,表明 Se-HANs材料不仅能够抑制骨肉瘤,还能够维护正常器官的生理功能。
  4.Se-HANs的系统毒性。对比各组动物体征、血液生化指标、脏器指数以及肝脏组织病理染色的结果发现,过高剂量的Se直接作用于机体会产生以肝脏毒性为主的系统毒性,而Se-HANs可以通过酸性pH介导的控制释放,减少直接作用于正常机体的Se剂量,从而避免系统毒性的产生。由此可知,Se-HANs是一种安全可靠的抗肿瘤材料。
[硕士论文] 刘义灏
外科学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  制备一种新型磁性骨水泥并对其形貌,磁性性能,力学性能,凝固时间,体内、外生物安全性及其在交变磁场下对体外骨肿瘤细胞和体内VX-2动物模型的治疗效果进行评价。
  方法:
  (1)对于不同尺寸的CoxFe1-xO4磁性纳米颗粒,我们使用高温有机溶剂法制备并用扫描电镜并表征其形貌,测定其成分,并在交变磁场下对其磁学性能和产热性能进行评价同时分别绘制磁滞回线和升温曲线。
  (2)选择加热性能达到热疗要求的磁性纳米颗粒,按照磁性纳米颗粒质量占粉末总质量的不同比例分别按ISO5833标准制得0%、5%、10%、15%的磁性骨水泥并测定其抗压强度、凝固时间。
  (3)从不同比例的磁性骨水泥中筛选出符合临床力学标准ISO5833的磁性骨水泥,测量其在390 KHz、22KA/m的交变磁场中的体外加热效率并绘制升温曲线。同时对其在交变磁场中诱导人成骨肉瘤细胞(MG-63)凋亡和抑制MG-63细胞增殖效果进行评价。此外CCK-8法被用来检测其对小鼠成纤维细胞(MEF)的毒性作用。
  (4)构建VX-2兔骨肿瘤模型,通过评价对照组和治疗组的存活时间和瘤体最大直径来评价磁性骨水泥在交变磁场中对骨肿瘤的治疗效果。同时通过血生化检测的方法对磁性骨水泥体内安全性做出评价。
  结果:
  (1)所制得的CoxFe1-xO4磁性纳米颗粒成分测定为Co0.04Fe2.96O4。所有尺寸的Co0.04Fe2.96O4均为超顺磁性,其中22nm的磁性纳米颗粒里拥有最高的饱和磁化强度(78.06emu/g)和较为优异的升温效率(60s升温60℃)。
  (2)磁性骨水泥的凝固时间随着Co0.04Fe2.96O4磁性纳米颗粒含量的增加而延长。仅含5%Co0.04Fe2.96O4磁性纳米颗粒的磁性骨水泥的抗压强度为(77.1±6.3)MPa满足ISO5833标准要求(>70MPa)。
  (3)在390 KHz、21KA/m的交变磁场中含5%Co0.04Fe2.96O4磁性纳米颗粒的磁性骨水泥3min可达到治疗温度50℃,6min可达55℃。维持温度在50℃,30min时MG-63细胞的凋亡率为77.78%,同时抑制了88%骨肿瘤细胞的增殖。而直接升温6min时MG-63细胞的凋亡率为80.78%,同时抑制了96%骨肿瘤细胞的增殖。此外含5%Co0.04Fe2.96O4磁性纳米颗粒的磁性骨水泥对MEF细胞的细胞毒性和对照组比无统计学差异。
  (4)对照组的存活时间(27±6)天,治疗组的6只兔中2只没有发现复发,4只复发的兔中2只分别于肿瘤移植后的第40天和第43天死亡,还有两只已存活了49天(还未死亡)。于此同时21天观测对照组的肿瘤最大直径为(42±6.2)mm,而治疗组的肿瘤最大直径为(11.1±5.5)mm,这说明治疗对肿瘤生长速度抑制的效果明显。
  结论:
  本实验制得的22nm的Co0.04Fe2.96O4具有良好的磁学性能、产热性能和生物安全性。含5%Co0.04Fe2.96O4磁性纳米颗粒的磁性骨水泥在交变磁场中不仅能诱导骨肿瘤细胞的凋亡还能有效地抑制骨肿瘤细胞的增殖。此外其在兔体内能有效地抑制骨肿瘤的生长的同时对兔的肝、肾功能无影响。这种新型的磁性骨水泥不仅能在交变磁场中对体内外骨肿瘤有很好的治疗效果,而且可以很好地解决骨肿瘤引起的病理性骨折,为临床骨肿瘤的治疗提供了一个新的治疗策略。
[硕士论文] 周洁
影像医学与核医学 江苏大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  (1)合成Fe3O4@OA NPs、Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs及Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs,并对纳米粒子进行表征。
  (2)比较横纹肌肉瘤细胞对 Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs和 Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs以及4.5 g/L葡萄糖竞争抑制下的Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs的吸收差异,检测横纹肌肉瘤细胞对Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs靶向摄取情况。
  方法:
  (1)采用热分解法合成Fe3O4@OA NPs,经表面修饰后合成Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs及Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs。电镜下观察纳米粒的形态、大小及分散性,振动样品磁强计检测其磁学性质,热重分析仪检测纳米粒子表面修饰物的情况。(2)将0.3μmol/mL Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs、Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs及4.5g/L游离葡萄糖竞争抑制下的Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs与横纹肌肉瘤A-673细胞孵育10 min、30 min、1h、2 h时,采用普鲁士蓝染色检测细胞株的靶向吸收情况,MRI扫描观察T2WI、SWI信号强度和多回波序列T2值,原子吸收光谱法检测细胞内铁含量。
  结果:
  (1)Fe3O4@OA NPs的形态似立方体,平均粒径10.4±0.8 nm,在正己烷中呈单分散性,Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs在水中分散稳定性良好。两者的磁饱和强度分别为81.2±5.3 emu/g、59.7±4.8 emu/g,没有剩磁及矫顽力。热重分析图显示,油酸及聚乙二醇连接在纳米粒子表面。
  (2)普鲁士染色结果显示,Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs、Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs与横纹肌肉瘤A-673细胞孵育10 min、30 min时,细胞对纳米粒的吸收不明显;1h时, Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组细胞内蓝染颗粒稍增加;2 h时, Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组细胞内蓝染颗粒显著增加,明显多于Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组,并可被4.5 g/L游离葡萄糖竞争抑制。
  (3) MRI T2WI上显示,与横纹肌肉瘤A-673细胞孵育10 min、30 min, Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组、Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组及竞争抑制组信号下降不明显;1h时,三组信号降低,Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组信号稍低于其他两组;2 h时, Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组信号显著下降,明显低于Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组及竞争抑制组。
  (4) MRI多回波序列显示,与横纹肌肉瘤A-673细胞孵育10 min、30 min, Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组T2值和Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组T2值、Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组T2值和竞争抑制组T2值比较无统计学差异;与横纹肌肉瘤A-673细胞孵育1h、2 h, Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组T2值和Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组T2值、Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组T2值和竞争抑制组T2值比较有显著差异。
  (5)MRI SWI信号显示,与横纹肌A-673细胞孵育的Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组、Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组及竞争抑制组均随着孵育时间的延长信号逐渐呈下降趋势,并且任意时间点Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组信号明显低于Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组及竞争抑制组。
  (6)铁含量测定结果显示,不同时间点,Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组铁吸收量明显多于Fe3O4@OA-OA2-PEG NPs组及竞争抑制组,并且Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs组与其他两组各时间点比较均有统计学差异。
  结论:
  (1)纳米粒表面成功包被油酸和聚乙二醇,具有较好的稳定性和水溶性。
  (2)横纹肌肉瘤细胞对Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs有明显靶向吸收,PEG在抗细胞非特异性黏附的基础上更好地实现了2-DG的靶向性识别作用,从而使纳米粒子更精准地定位于肿瘤细胞,Fe3O4@OA-OA2-PEG-DG NPs有望成为新型的分子磁共振探针靶向恶性肿瘤。磁共振SWI序列对较低浓度的氧化铁纳米粒很敏感,为检测低浓度对比剂靶向肿瘤的活体动物实验提供了有效的检测方法。
[硕士论文] 董然
机械电子工程 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:癌症肿瘤在中晚期常常伴随着骨骼尤其是脊椎骨区域的转移。计算机辅助诊断系统能够依据CT断层图像提供的像素信息协助影像科医师及早发现脊椎骨转移的病灶。脊椎骨区域的分割作为CT断层图像处理中的重要步骤之一,一方面能够极大地减少脊椎骨区域配准以及骨转移识别的时间;另一方面其分割精度也直接影响着计算机辅助诊断系统的确诊率。论文针对多名骨转移患者CT断层图像,在研究数学形态学运算、连通区域标记算法以及图割算法理论的基础上,实现了脊椎骨区域的自动式、交互式以及两者相结合的分割,论文主要工作如下:
  (1)采用数学形态学运算对脊椎骨区域进行预处理,在保证骨转移患者的CT断层图像中各个器官、组织拥有明显灰度级差别的前提下,通过减弱图像二值化结果中的椒盐噪声,有效地避免了其它器官、组织的误分割,极大地提高了基于标记算法的脊椎骨区域分割的准确率。
  (2)提出一种基于标记算法的脊椎骨区域自动式分割方法,先后采用基于连通区域标记算法的二值化脊柱区域快速填补和基于行程标记算法的脊椎骨区域分割两个主要步骤,解决了由于癌症骨转移病灶的侵蚀致使患者CT断层图像中的脊椎体边缘模糊,无法保证高质量边缘信息提取的问题,使得计算机辅助诊断早期骨转移病灶成为可能。
  (3)基于经典Graph Cuts算法,提出了针对CT断层图像中脊椎骨区域分割的前景(目标)和背景区域初始种子点的选取方法。该方法在保证脊椎骨区域有效分割的条件下,选取矩形像素区域作为约束条件,避免了大范围的迭代运算,从而较大程度地降低了GraphCuts算法的处理时间,提高了分割的效率。
  (4)提出了一种改进Graph Cuts方法。该方法首先运用基于连通区域标记算法与数学形态学运算实现了脊柱区域分割,再利用Graph Cuts算法实现了脊椎骨区域的最终分割,解决了由于脊柱CT断层图像灰度级梯度幅值小导致经典Graph Cuts算法对脊椎体边缘分割不敏感的问题。
  (5)提出了一种基于区域像素点的真阳性率(TPR)和假阳性率(FPR)的分割结果评价方法。该评价法以日本产业医科大学多名资深影像科医师的人工分割作为参照标准,对基于经典Graph Cuts算法以及本文改进Graph Cuts方法的脊椎骨区域分割结果分别进行量化分析。分析结果表明:改进的Graph Cuts算法能够更好地分割脊椎骨的区域与边缘,为进一步的图像处理以及骨转移病灶的诊断提供了准确的病变组织信息。
[硕士论文] 陈川
外科学 宁波大学 2017(学位年度)
摘要:本研究的目的是提供一个结合局部药物释放以及潜在组织再生能力的去细胞支架,目的是来治疗治疗骨肉瘤。我们设计了化疗药物阿霉素的缓释微球(ADM),和携带这些微球的脱细胞骨膜支架。脱细胞骨膜(去细胞骨膜支架)是通过物理和化学的方法获得的。组织学结果表明,细胞成分被有效地去除。骨膜去细胞支架具有良好的细胞相容性,能促进成纤维细胞的粘附和生长。研究中制备了两种缓释微球,阿霉素明胶微球(ADM-GMS)和阿霉素聚乳酸聚羟基乙酸明胶微球的制备(阿霉素聚乳酸羟基乙酸明胶微球)并且将这两种微球与骨膜去细胞支架连接。研究中对这两个支架的潜在治疗效果进行了测试,体外将人骨肉瘤细胞与该复合支架共同培养来检测其药物效力。总之,该研究发明了一个可以局部释放化疗药物的生物支架。
[硕士论文] 陈炳艺
中医骨伤科学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本课题以前期采用阿霉素大剂量间隙干预的方法成功建立的骨肉瘤阿霉素耐药株MG63/ADM细胞为研究对象,观察PTEN、p-Akt、Akt在MG63/ADM细胞中的表达,通过体外实验观察片仔癀对骨肉瘤MG63/ADM细胞增殖、凋亡的作用,及对PTEN、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达的影响,进而深入剖析片仔癀对骨肉瘤耐药细胞增殖抑制作用与PI3K/Akt信号通路的关系,进一步为临床治疗骨肉瘤提供理论基础。
  方法:
  1、PTEN、Akt、p-Akt蛋白在MG63/ADM细胞中的表达。
  以成功建立的骨肉瘤阿霉素耐药株MG63/ADM细胞为研究对象,采用Western blot方法检测PTEN、Akt、p-Akt蛋白在MG63/ADM细胞中的表达情况。
  2、片仔癀对MG63/ADM细胞的作用及对PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响。
  采用MTT法检测不同浓度、不同作用时间的片仔癀对MG63/ADM细胞增殖的影响;Hoechst33342染色荧光显微镜下观察片仔癀对MG63/ADM细胞凋亡的影响;Westernblot法观察片仔癀作用后MG63/ADM细胞中PTEN、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved-PARP蛋白的表达。
  结果:
  1、Western blot结果表明,PTEN在MG63/ADM细胞中的表达明显低于MG63细胞,p-Akt蛋白在MG63/ADM细胞中呈高表达,与MG63细胞之间有显著差异性(P<0.05);Akt蛋白在两者间的表达差异不明显。说明MG63/ADM细胞的耐药性可能与PTEN表达下调,Akt的磷酸化水平提高有关。
  2、MTT结果示片仔癀能明显抑制MG63/ADM细胞的增殖,相同干预浓度下,细胞增殖抑制率随作用时间延长而增加;在相同干预时间情况下,细胞增殖抑制率随片仔癀浓度的增高而增加;与对照组之间有显著的差异(P<0.01)。说明片仔癀对MG63/ADM细胞的增殖抑制作用与片仔癀浓度与干预时间相关。
  3、不同浓度片仔癀作用MG63/ADM细胞48h,荧光显微镜下观察Hoechst33342染色后MG63/ADM细胞核的形态变化,可见对照组细胞核表现为椭圆形的蓝色均匀荧光,片仔癀组则出现细胞核聚缩,月牙状改变等凋亡的表现,尤其是1.2mg/mL组细胞数量明显减少,剩余细胞的细胞核出现典型的凋亡小体。说明片仔癀可明显促进MG63/ADM细胞凋亡。
  4、Western Blot结果表明,片仔癀干预MG63/ADM细胞48h后,PTEN表达水平随着片仔癀浓度增大而增加;Akt蛋白的表达水平变化不明显;p-Akt表达水平随片仔癀浓度的增大而减少;PARP蛋白的表达有下降;Cleaved-PARP表达水平随片仔癀浓度增大而增加,说明片仔癀可促进PARP的裂解。PTEN、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达量与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示片仔癀可上调PTEN的表达,抑制Akt蛋白的磷酸化(p-Akt)水平,促进PARP蛋白裂解,Cleaved-PARP表达明显上调,促进了MG63/ADM细胞的凋亡。
  结论:
  1、骨肉瘤耐药性与PI3K/Akt信号通路的异常表达相关,表现为PTEN蛋白表达抑制,Akt蛋白磷酸化水平提高。
  2、片仔癀可通过促进MG63/ADM细胞PTEN的表达,使Akt蛋白磷酸化减少,发挥其抑制MG63/ADM细胞增殖,促进凋亡的作用。
[硕士论文] 徐波
中医骨伤科学 南京中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  明确肿瘤骨转移疼痛(骨癌痛)具有冷刺激痛敏的症状特点;TRPA1、TRPM8参与肿瘤骨转移疼痛敏感状态的发生和维持机制。
  方法:
  选取健康4月龄SD雄性大鼠60只,体重350-450g,随机分成骨癌痛模型组(仅造模,无药物干预)、模型-通道阻滞剂干预组(造模2周后应用TRPA1、TRPM8拮抗剂干预的大鼠)、空白对照组、假手术组。分别于造模前1周、造模后2、4、6、8周,检测冷刺激痛阈;并在造模后8周后,运用Western Blot、Real-time PCR、免疫荧光等技术检测各组大鼠背根神经节组织TRPA1、TRPM8蛋白及mRNA表达,并观察肿瘤种植部病理切片形态。
  结果:
  病理组织切片HE染色可见骨癌痛模型组大鼠肿瘤细胞种植部周围骨组织中肿瘤细胞簇集浸润和广泛炎性反应。造模后2周,模型组大鼠冷刺激痛阈对比正常组显著降低,且至造模后8周仍维持在相对较低水平(P<0.05)。TRPA1和TRPM8的选择性通道阻断剂能够有效改善骨癌痛大鼠的冷刺激痛敏(P<0.05)。假手术组大鼠的冷刺激痛阈对比空白对照组无显著差异(P>0.05)。骨癌痛大鼠背根神经节中TRPA1、TRPM8蛋白及mRNA表达均较空白对照组显著增高(P<0.05)。假手术组背根神经节中TRPA1、TRPM8蛋白及mRNA表达对比空白对照组并无显著差异(P>0.05)。
  结论:
  肿瘤骨转移的癌性疼痛具有冷刺激痛敏的症状特点;TRPA1、TRPM8与肿瘤骨转移所致骨癌痛的冷刺激痛敏具有高度相关性。
[硕士论文] 任晓杰
骨科学 中国人民解放军陆军军医大学;第三军医大学 2017(学位年度)
摘要:背景与目的:
  巨噬细胞作为广泛存在于组织、器官中的一类免疫细胞,在机体非特异性免疫反.应中发挥主要作用,具有清除病原体和组织碎片的作用,担负着抵御外来侵袭第一道防线的任务。研究表明,其功能受微环境的制约与调控。炎性因子、细菌产物可导致巨噬细胞分化成为M1型的巨噬细胞;M1型的巨噬细胞表现为高表达白细胞介素12(interleukin12,IL-12),低表达IL-10,参与促炎反应;IL-4、IL-10、IL-13和糖皮质激素等可促进巨噬细胞向M2型的巨噬细胞进行分化;M2型巨噬细胞高表达IL-10但低表达IL-12,在促进免疫耐受中起重要作用。肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)是一种浸润入肿瘤组织内存在的巨噬细胞,来源具有多样性,可由外周募集的单核细胞分化而来。文献报道TAMs可与肿瘤细胞发生相互作用,相互影响,TAMs可分泌多种细胞因子,进而调节干细胞微环境,广泛参与肿瘤进程,发挥促瘤血管生成、促瘤细胞侵袭及转移、促瘤免疫耐受等作用。在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等临床病人组织样本中,巨噬细胞标志性分子CD68的表达水平与不良预后正相关。
  乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一,约有8%的患者发生了骨转移,其中高度恶性患者骨转移率甚至可高达69。乳腺癌脊柱转移患者约占所有骨转移患者的三分之二,大多数乳腺癌脊柱转移是呈溶骨性改变的,可使脊椎骨质量下降,患者发生压缩性骨折概率较高,容易发生神经损伤甚至截瘫等严重并发症;加之此类患者预期寿命较长,伴随剧烈癌性疼痛,患者承受严重的身心痛苦。有研究报道,乳腺癌中肿瘤相关白细胞的浸润水平很高,且巨噬细胞占其中的多半。TAMs与乳腺癌发生、发展存在密切联系,其浸润程度与肿瘤转移呈正相关,是乳腺癌独立的预后因素。乳腺癌中最常见的是浸润性导管癌,但其病理学机制仍尚未研究清楚。乳腺癌患者原发灶和骨转移灶中肿瘤相关巨噬细胞的差异国内外尚未见相关报道。分析TAMs在乳腺癌发生、发展、转移等过程中的表型变化,或可为肿瘤诊治提供思路和借鉴。鉴于肿瘤进程经历发生、发展多个过程,那么,肿瘤微环境的变化是否介导TAMs表型的转换,从而调控TAMs的功能就成为一个十分重要的问题[20]。本研究利用MMTV-PyMT基因型的小鼠乳腺癌自发模型,模拟乳腺癌发生、发展过程,通过分离、比较不同病程中TAMs的M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞标志性分子的表达,进而分析TAMs的表型变化。筛选临床乳腺癌原发肿瘤及乳腺癌骨转移瘤病灶样本进行组织学染色观察,对其中的肿瘤相关巨噬细胞进行计数,统计学计算分析肿瘤相关巨噬细胞数目及M2型肿瘤相关巨噬细胞所占阳性比例有无差异,分析M2型肿瘤相关巨噬细胞所占阳性比例与发生淋巴结转移、骨转移的相关性。
  方法:
  1.1 小鼠自发乳腺癌模型中肿瘤相关巨噬细胞的表型检测与分析
  筛选出MMTV-PyMT基因型的小鼠后,按试剂盒说明书的方法提取小鼠基因组并对该小鼠自发乳腺癌模型进行基因型的鉴定。通过分析不同周龄小鼠肿瘤体积的普遍规律,对肿瘤的进程进行早期与晚期的区分(16周且肿瘤总体积小于100mm3的肿瘤分为早期组;20周且肿瘤总体积大于800mm3的肿瘤分为晚期组)。进而分离肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞。按照试剂盒说明书将分选好的肿瘤相关巨噬细胞经RNA提取及反转录。获得早期及晚期肿瘤相关巨噬细胞的cDNA,实时定量PCR测定M1型巨噬细胞标志性分子及M2型巨噬细胞标志性分子种类。
  1.2临床原发肿瘤及骨转移瘤病灶中TAMs的观察研究
  查询解放军总医院2006年1月至2016年12月诊断为“乳腺癌并发骨转移”的临床病例资料,选取原发病灶及骨转移病灶蜡块均留存于解放军总医院病理科的病例为研究对象共6例样本,另选取单纯乳腺癌病人中同样病理类型且无转移灶的乳腺癌6例样本作为对照组。所选蜡块均做连续切片6张(每张切片厚度约5μm),选取紧邻的两张切片依次进免疫组化染色,余切片分别行HE染色和甲苯胺蓝染色,镜下观察染色结果,记录并分析相关数据,根据镜下观察对其中的肿瘤相关巨噬细胞进行计数,统计学计算分析肿瘤相关巨噬细胞数目及M2型肿瘤相关巨噬细胞所占阳性比例有无差异,分析M2型肿瘤相关巨噬细胞所占阳性比例与发生淋巴结转移、骨转移的相关性。
  结果:
  2.1.1 待鉴定小鼠基因组进行PCR,筛选出与阳性对照出现相同条带的小鼠即为MMTV-PyMT小鼠,可用于后续实验。
  2.1.2 根据出生日期相差1周内的10只MMTV-PyMT雌性小鼠进行肿瘤体积的跟踪监测,通过求和得到单只小鼠肿瘤的总体积,将总体积小于100mm3的小鼠定为处于肿瘤早期,而总体积大于800mm3的小鼠定为处于肿瘤晚期。
  2.1.3 通过CD45的表达圈选肿瘤组织浸润CD45+白细胞,然后通过MHCⅡ及CD11b的表达,圈选出MHCⅡ+CD11b+的TAMs亚群(图4)。其中,白细胞占肿瘤组织细胞2.07%,而TAMs占白细胞中的31.3%。
  2.1.4 利用M1型的标志性分子以及M2型的标志性分子的引物检测早期及晚期TAMs的表型后,结果证实,在肿瘤的进程中,肿瘤相关巨噬细胞发生了由M1型到M2型的表型转换。
  2.2.1 根据文献报道,可用CD68抗体来标记巨噬细胞,CD163抗体标记M2型肿瘤相关巨噬细胞。在乳腺癌并发骨转移的患者中,其原发灶中CD68阳性细胞数比单纯乳腺癌患者要高,差异有统计学意义(P<0.01),亦比其对应骨转移灶中高,差异有统计学意义(P<0.01);而单纯乳癌患者病灶中CD68阳性细胞数比乳腺癌骨转移病灶高,差异有统计学意义(P<0.01)。
  乳腺癌骨转移灶中CD163阳性细胞/CD68阳性细胞比值较其原发灶高,差异具有统计学意义(p<0.05);
  合并骨转移的乳腺癌原发灶中CD163阳性细胞/CD68阳性细胞比值较单纯乳腺癌患者高,差异具有统计学意义(p<0.01);
  乳腺癌骨转移灶中CD163阳性细胞/CD68阳性细胞比值较单纯乳腺癌患者高,差异具有统计学意义(p<0.01)。
  2.2.2 乳腺癌患者是否发生淋巴结转移及骨转移与肿瘤组织中CD163阳性细胞/CD68阳性细胞比值正相关。
  结论:
  1.小鼠自发乳腺癌模型中,TAMs在肿瘤早期到晚期的进程中发生了由M1型到M2型的表型转换。
  2.本研究中可见乳腺癌骨转移灶中M2型TAMs的阳性率较其原发灶高;乳腺癌合并骨转移的患者其原发灶的M2型TAMs的阳性率要高于未发生骨转移的乳腺癌患者的原发灶。CD68阳性及CD163阳性细胞在乳腺癌骨转移灶中均低于其原发灶相应数目,但乳腺癌骨转移灶中CD163阳性细胞数/CD68阳性细胞数比值(即可认为M2型巨噬细胞)要高于原发灶。此外,乳腺癌患者是否发生淋巴结转移或骨转移与肿瘤组织中M2型TAMs的阳性率呈正相关。由此推测M2型巨噬细胞阳性比例增多可能是促进恶性肿瘤进展、甚至发生骨转移的原因之一。
[硕士论文] 雷明星
外科学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:【目的】:
  本研究旨在提出并验证脊柱转移瘤脊髓压迫症(Metastatic spinal cord compression,MSCC)术后预后预测新型评分模型,以指导MSCC患者的个体化治疗选择。
  【内容】:
  预期生存期和功能预后可以指导MSCC患者的个体化治疗选择。目前,一般认为患者预期生存期大于3~6个月,则可行手术治疗;预期生存期小于3个月,适宜接受单纯放疗或者姑息性治疗。脊柱转移瘤预后预测评分模型可以评估患者预期生存期。研究者已经提出较多脊柱转移瘤预后预测评分模型并运用于临床,包括Tokuhashi评分模型、Tomita评分模型、Bauer评分模型、Linden评分模型、Sioutos评分模型、Rades评分模型以及Katagiri评分模型等。临床上,最为常用的评分模型是2001年Tomita评分模型和2005年修订版Tokuhashi评分模型。这些评分模型给临床医师治疗脊柱转移瘤提供了重要参考,为避免过度医疗和医疗不足作出了重大贡献。但是,这些评分模型主要均为10年前提出,没有考虑一些新兴治疗手段对患者生存期的改善。国内外诸多文献报道提示,这些经典评分模型的准确性呈下降趋势。因此,本研究运用回顾性病例建立新型评分模型,并多中心前瞻性招募患者以验证模型的有效性。
  【方法】:
  本研究回顾性遴选2005年5月~2015年9月期间我院连续收治的206例MSCC减压内固定术患者。运用单元和多元Cox比例风险模型筛选年龄,性别,原发肿瘤类型,术前行走状态,ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group)表现评分,受累椎体数目,内脏转移,术前化疗,癌症诊断时骨转移,术前运动缺失发生时间,术前白蛋白值以及原发肿瘤部位手术12项术前相关因素与术后生存期的相关性。多元Cox比例风险模型具有统计学意义的指标则被纳入预测模型。根据多元Cox比例风险模型的风险比对模型中有意义的指标进行赋分,预后评分的总分为各项有意义指标的得分之和。根据各评分的中位生存期和6个月生存率将模型进行分组,基于模型分组分析患者的功能预后。而后,本研究于2015年6月~2016年9月期间在三家三甲医院前瞻性招募了89例MSCC患者,其中86例被纳入分析。患者依据评分模型进行预后分组,运用Kaplan-Meier法和log-rank检验比较各组生存预后差异。通过卡方检验分析比较各组术后能行走率差异。通过绘制ROC曲线(Receiver Operating Characteristic curve,受试者工作特征曲线)和计算C值来评估并比较本模型与Tomita评分模型的有效性以及准确性。本研究在中国临床试验注册中心进行注册,并通过审核,注册号为ChiCTR-POC-16008393。
  【结果】
  多变量Cox比例风险模型发现,原发肿瘤类型(P<0.01),术前行走状态(P<0.01),内脏转移(P<0.01),术前化疗(P=0.02)以及癌症诊断时骨转移(P=0.03)与术后生存期相关,这些因素被纳入预测模型。根据多变量Cox比例风险模型的风险比对这些因素进行赋分:慢速生长性肿瘤为2分,中速生长性肿瘤为1分,快速生长性肿瘤为0分;术前能行走为2分,术前不能行走为0分;无内脏转移为3分,有内脏转移为0分;术前化疗为2分,术前无化疗为0分;癌症诊断时骨转移为0分,癌症诊断时无骨转移1分。本预测模型总分10分,评分越高预后越好。本模型可分为三个预后组:0~2分(A组)、3~5分(B组)和6~10分(C组)。三组患者的中位生存期分别为3.3个月(95%CI,2.5~4.4个月),6.6个月(95%CI,5.8~7.3个月)以及16.4个月(95%CI,13.7~21.4个月)(P<0.01),术后6个月生存率分别为8.2%,56.5%,以及91.5%,术后1个月能行走率分别为35.7%,73.3%和95.9%(P<0.01)。同理,依据模型将前瞻性患者分为三组,三组患者的中位生存期分别为3.9个月,6.7个月以及12.0个月(P<0.01),术后6个月生存率分别为27.8%,66.0%以及88.0%,术后1个月能行走率分别为55.6%,73.5%以及94.1%(P<0.01)。本模型预测3、6以及12个月生存率ROC曲线的C值分别为0.75,0.74以及0.70,准确率分别为69.1%,69.2%以及64.9%;Tomita评分模型预测3、6以及12个月生存率ROC曲线的C值分别为0.70,0.68和0.66,准确率分别为58.4%,58.4%和56.4%。
  【结论】:
  本评分模型具有重现性和有效性,是预测MSCC患者术后预后的良好模型,可以指导MSCC患者的个体化治疗选择。评分为0~2分的患者预期生存期、功能预后较差,宜接受单纯放疗或者姑息性支持治疗;评分为3~5分的患者预期生存期、功能预后尚可,则可行减压内固定术;评分为6~10分的患者术后生存、功能预后佳,可以考虑较为激进的转移瘤切除术以更好地控制疾病进展和预防复发。依据ROC曲线C值以及准确率,本模型的预测效能优于Tomita评分模型,有望在临床上进一步推广运用。
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