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[博士论文] 高亚莉
眼科学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:本文从以下几个部分展开论述:
  一、LncRNA-MEG3在视网膜母细胞瘤中的表达
  目的:检测lncRNA-MEG3在视网膜母细胞瘤组织及细胞中的表达。
  方法:qRT-PCR检测21例视网膜母细胞瘤组织与瘤旁正常组织、视网膜母细胞瘤细胞(Weri-Rb1、Y79)与正常视网膜色素上皮细胞(hTERT RPE-1)中lncRNA-MEG3的表达。
  结果:视网膜母细胞瘤组织中lncRNA-MEG3的表达显著低于瘤旁正常组织,Weri-Rb1、Y79细胞中lncRNA-MEG3的表达显著低于hTERT RPE-1细胞。
  结论:LncRNA-MEG3在视网膜母细胞瘤组织及细胞中均为低表达。
  二、LncRNA-MEG3对视网膜母细胞瘤细胞功能的影响
  目的:检测Weri-Rb1、Y79细胞中lncRNA-MEG3表达量对细胞功能的影响。
  方法:用pcDNA-MEG3或si-MEG3转染Weri-Rb1或Y79细胞后,CCK-8实验及流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡能力。
  结果:转染pcDNA-MEG3的Weri-Rb1细胞增殖显著减弱,凋亡显著增加;转染si-MEG3的Y79细胞增殖显著增强,凋亡显著降低。
  结论:LncRNA-MEG3在视网膜母细胞瘤中发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。
  三、视网膜母细胞瘤细胞MEG3基因启动子DNA甲基化状态对lncRNA-MEG3表达及细胞功能的影响
  目的:检测视网膜母细胞瘤组织及细胞MEG3基因启动子DNA甲基化状态,探讨其与lncRNA-MEG3表达量及细胞功能之间的关系。
  方法:MS-PCR检测21例视网膜母细胞瘤组织、瘤旁正常组织、Weri-Rb1、Y79细胞MEG3基因启动子DNA甲基化状态及lncRNA-MEG3表达量。5-Aza-CdR处理细胞后,检测lncRNA-MEG3表达量、细胞增殖及凋亡能力。5-Aza-CdR和siRNA-MEG3共同干预后,检测细胞增殖、凋亡能力。
  结果:视网膜母细胞瘤组织中MEG3基因启动子DNA处于甲基化状态的比例显著高于瘤旁正常组织,甲基化组lncRNA-MEG3表达量显著低于部分甲基化组及非甲基化组;Weri-Rb1、Y79细胞MEG3基因启动子DNA处于甲基化状态;用5-Aza-CdR处理后,lncRNA-MEG3表达量显著增高,细胞增殖显著减弱,凋亡显著增加;经5-Aza-CdR和si-MEG3共同干预后,5-Aza-CdR抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的能力均被逆转。
  结论:LncRNA-MEG3在视网膜母细胞瘤中低表达与MEG3基因启动子DNA过甲基化有关。
  四、LncRNA-MEG3在视网膜母细胞瘤中对Wnt/β-catenin信号通路活性的调控
  目的:探讨在视网膜母细胞瘤中lncRNA-MEG3是否可通过调节Wnt/β-catenin信号通路活性而发挥作用。
  方法:用pcDNA-MEG3或si-MEG3转染Weri-Rb1、Y79细胞后,用TOP-Flash reporter实验检测Wnt/β-catenin信号通路活性,Western blot实验检测β-catenin蛋白表达量;Wnt/β-catenin信号通路激活剂或拮抗剂与pcDNA-MEG3或si-MEG3共同转染Weri-Rb1、Y79细胞后,检测β-catenin蛋白表达量、细胞增殖及凋亡能力。
  结果:转染peDNA-MEG3的Weri-Rb1细胞,荧光素酶活性、β-catenin蛋白表达量均显著降低;转染si-MEG3的Y79细胞,荧光素酶活性、β-catenin蛋白表达量均显著增强;激活Wnt/β-catenin信号通路活性后,pcDNA-MEG3对Weri-Rb1细胞的抑癌作用被逆转;抑制Wnt/β-catenin信号通路活性后,si-MEG3对Y79细胞的促癌作用被逆转。
  结论:LncRNA-MEG3在视网膜母细胞瘤中可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性而发挥作用。
[博士论文] 杨亚丽
临床医学 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:1.研究SYK(spleen tyrosine kinase)在视网膜母细胞瘤和假性视网膜母细胞瘤组织中的表达情况;2.研究SYK的表达与肿瘤组织坏死、组织学危险因素之间是否有相关性;3.研究SYK在视网膜母细胞瘤细胞系Y-79和WERI-RB-1中的表达情况;4.研究SYK抑制剂R406对肿瘤细胞凋亡的作用;5.研究SYK抑制剂R406对肿瘤细胞移植动物模型的作用。
  方法:1.通过免疫组化染色检测62例视网膜母细胞瘤、9例假性视网膜母细胞瘤和6例非肿瘤性视网膜组织中SYK蛋白的表达;2.Spearman秩相关分析法分析SYK蛋白的表达强度与肿瘤组织的坏死、病理组织学危险因素之间的相关性;3.免疫荧光染色检测SYK蛋白在视网膜母细胞瘤细胞系Y-79和WERI-RB-1中的表达;4.对培养的Y-79细胞和WERI-RB-1细胞给予R406来抑制SYK蛋白活性,观察其对Y-79细胞和WERI-RB-1细胞活力和细胞凋亡的作用,并通过流式细胞仪检测easpase-3的表达情况;5.对Y-79细胞和WERI-RB-1细胞移植瘤模型中给予R406抑制SYK蛋白活性,观察其对动物模型的成瘤和肿瘤细胞坏死/凋亡的作用。
  结果:1.免疫组化染色结果显示SYK蛋白在62例视网膜母细胞瘤组织中全部为阳性表达,表达率高达100%,在9例假性视网膜母细胞瘤和6例非肿瘤性视网膜组织中均为阴性表达(仅有1例弱阳性表达);2.统计学分析显示SYK蛋白的表达强度与肿瘤坏死之间呈负相关(P<0.01),但SYK蛋白的表达强度与肿瘤的组织学危险因素之间无相关性(P=0.126);3.SYK蛋白在视网膜母细胞瘤细胞系Y-79细胞和WERI-RB-1细胞中高表达;4.SYK抑制剂R406能促进Y-79细胞和WERI-RB-1细胞凋亡,抑制细胞活力,增加细胞caspase-3的表达水平;5.SYK抑制剂R406注射组动物肿瘤细胞移植后皮下见肿块,但HE染色见细胞大片坏死,而未注射SYK抑制剂R406组动物肿瘤细胞移植后皮下见肿块,肿瘤细胞活力较好,坏死少见。
  结论:1.SYK蛋白在视网膜母细胞瘤中的表达具有高度特异型性,是区分视网膜良恶性病变较好的特异性蛋白标记,对鉴别眼内恶性肿瘤为原发性还是转移性的也有提示意义;并且SYK蛋白的表达强度和肿瘤组织的坏死程度呈负相关;2.SYK蛋白在视网膜母细胞瘤细胞系Y-79细胞和WERI-RB-1细胞中高表达;3.SYK抑制剂可以促进Y-79细胞和WERI-RB-1细胞凋亡,抑制细胞活力,增加肿瘤细胞中caspase-3的表达水平,在肿瘤细胞移植的动物模型中促进肿瘤细胞的凋亡,因此SYK在视网膜母细胞瘤中可以促进肿瘤细胞存活起到促瘤作用。
[硕士论文] 齐丹
眼科学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究AEG-1(astrocyte elevated gene-1)、LEF-1(即淋巴细胞增强因子)在眼附属器粘膜相关组织淋巴瘤(marginalzone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue type,MALT)和反应性淋巴组织增生的表达,从蛋白和基因水平探讨AEG-1和LEF-1的表达与眼附属器MALT淋巴瘤发生发展关系,其蛋白表达与临床病理特征的关系和两者蛋白表达的相互关系及可能的机制。
  方法:搜集1995年1月到2015年1月青岛大学附属医院眼科病理实验室眼附属器MALT淋巴瘤石蜡包埋标本和冻存组织,其中40例石蜡标本、8例冻存组织为实验组,对照组为反应性淋巴组织增生,其中石蜡标本20例、冻存组织8例。应用免疫组织化学染色法检测AEG-1和LEF-1蛋白水平的表达,应用实时荧光定量PCR法检测实验组和对照组中AEG-1和LEF-1mRNA水平的表达,统计学分析采用SPSS17.0。
  结果:1. AEG-1的蛋白表达及mRNA含量:a. AEG-1阳性颗粒主要定位在细胞胞膜上,少量在胞浆内(图3)。b.眼附属器MALT淋巴瘤中AEG-1的阳性表达率(62.5%)显著高于反应性淋巴组织增生(P<0.05,表1)。c.AEG-1的阳性表达与眼附属器MALT淋巴瘤的临床分期有关(P<0.05,表2),随着临床分期的增加,其表达增加,而与性别、年龄、肿瘤发生部位无关。d. AEG-1 mRNA在眼附属器MALT淋巴瘤中显著高于反应性淋巴组织增生(P<0.05,图9)。
  2.LEF-1的蛋白表达及mRNA含量:a. LEF-1阳性颗粒主要定位在细胞胞核内(图6)。b.眼附属器MALT淋巴瘤中LEF-1的阳性表达率(65%)显著高于反应性淋巴组织增生(P<0.05,表3)。c. LEF-1的阳性表达与眼附属器MALT淋巴瘤的临床分期有关(P<0.05,表4),随着临床分期的增加,其表达增加,而与患者性别、年龄、肿瘤发生部位无关。d. AEG-1 mRNA在眼附属器MALT淋巴瘤中显著高于反应性淋巴组织增生(P<0.05,图10)。
  3. AEG-1和LEF-1蛋白表达与眼附属器MALT淋巴瘤的关系:AEG-1和LEF-1在眼附属器MALT组织中表达增高,阳性表达率分别为62.5%、65%,两者之间存在正相关(P<0.05,表5)Spearman相关系数为r=0.406。
  结论:AEG-1和LEF-1的表达增高可能参与眼附属器MALT淋巴瘤的发生发展,两者表达成正相关,可能通过某种模式在眼附属器MALT中发挥作用。两种因子可能成为眼附属器MALT淋巴瘤的诊断标记物,为眼附属器淋巴瘤病理诊断提供依据。
[硕士论文] 高焱
眼科学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究MTDH、β-catenin在眼附属器MALT淋巴瘤中的表达情况,以及二者相关性,探索二者在眼附属器MALT淋巴瘤中的作用与意义。
  方法:收集青岛大学附属医院眼科1999年06月至2015年12月手术切除的眼附属器MALT淋巴瘤作为实验组(n=30例),反应性淋巴组织增生组织作为对照组(n=20例)。两组中MTDH与β-catenin的mRNA和蛋白的表达分别采用PCR法与免疫组化法检测。采用SPSS统计学软件分析MTDH、β-catenin与眼附属器MALT淋巴瘤临床特征(包括年龄、性别、部位、临床病理分期)的关系,并探索MTDH与β-catenin二者表达的相关性。
  结果:在眼附属器MALT淋巴瘤中,MTDH与β-catenin的mRNA表达均较对照组增加(P<0.01);MTDH与β-catenin蛋白在眼附属器MALT淋巴瘤中的阳性表达率分别为50%(15/30)、26.67%(8/30),而在对照组中的阳性表达率分别为10%(2/20)、0(0/20),其差异存在显著性(P=0.003,P=0.033)。并且MTDH与β-catenin的表达与眼附属器MALT淋巴瘤患者Ann Arbor临床病理分期有关,在Ann Arbor临床病理分期Ⅰ-Ⅳ的患者中,MTDH的阳性表达率分别为36.36%(8/22)、83.33%(5/6)、100%(1/1)、100%(1/1),差异具有统计学意义(P=0.042),β-catenin的阳性率分别为13.63%(3/22)、50%(3/6)、100%(1/1)、100%(1/1),差异存在统计学意义(P=0.016),而MTDH与β-catenin的表达与患者年龄、性别及发病部位均无关(P>0.05)。并且MTDH与β-catenin蛋白的表达呈正相关(r=0.452,P=0.035)。
  结论: MTDH与β-catenin在眼附属器MALT淋巴瘤中的表达增加,且二者的表达水平均与临床病理分期呈正相关,MTDH与β-catenin的高表达可能在眼附属器MALT淋巴瘤的发生、发展中起重要作用,同时MTDH与β-catenin的表达为正相关关系。联合检测二者表达,有助于MALT淋巴瘤的临床诊断与鉴别诊断。
[硕士论文] 赵波
外科学(神经外科学) 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:目的:研究眼动脉及其周围组织结构的解剖间隙和解剖关系,探讨其眼动脉解剖应用在颈内动脉眼动脉段动脉瘤的显微手术治疗中的手术技巧、应对策略和疗效观察。
  方法:选择20具成人国人尸头,共40侧,做眼动脉的灌注和解剖,进行观察和测量,研究其眼动脉的周围组织结构及其解剖关系。以单人单中心回顾性研究的方法纳入青大附院神经外科由丰育功教授主刀完成的自1996年10月至2015年12月之间经翼点入路行颅内眼动脉动脉瘤夹闭术的病人共计42例,占所有在此时间内由术者所行颅内动脉瘤夹闭术的患者的2.7%。观察和统计42例颈内动脉眼动脉段动脉瘤患者的基本资料、手术治疗和术后疗效等相关临床资料,对相关显微手术治疗策略进行探讨。
  结果:42例颈内动脉眼动脉段动脉瘤患者中,总计44个颈内动脉眼动脉段动脉瘤,全部经过开颅手术夹闭治疗。术中在分离和暴露动脉瘤过程中未发生破裂的动脉瘤计数41个,占总数的93.2%,发生破裂的动脉瘤计数3个,占总数的6.8%。33例眼动脉段动脉瘤患者术后未出现相应并发症,其中共2例患者因 ICA闭塞而发生大面积脑梗死造成死亡,共计6例患者术后视力未改善(包括术前已经存在视力障碍或丧失的患者),有1例患者术后发生硬膜外血肿造成二次手术。根据格拉斯哥预后分级(Glasgow Outcome Scale,GOS)将研究组内42例患者的动脉瘤显微手术治疗预后分为四级:Ⅳ级(治愈,无遗留相关神经功能障碍,完全恢复正常工作和生活),共计39例,占总体的92.8%;Ⅲ级(自理,指有轻微的神经功能障碍,但日常的生活能自理),共计数1例,占总体的2.4%;无Ⅱ级(有重度的神经功能障碍,正常生活不能自理)病人;Ⅰ级(死亡),共计数2例,占颈内动脉眼动脉段动脉瘤患者总体的4.8%。
  结论:颈内动脉眼动脉的发出与眼动脉瘤的解剖位置密切相关,掌握眼动脉及周围解剖是颈内动脉眼动脉段动脉瘤显微手术治疗、获得良好治疗效果的基础,可以有效的减少误损伤和并发症的发生。在处理大动脉瘤和复杂动脉瘤时,根据病人的个体差异,根据需要行颈内动脉的解剖或瘤体临时阻断,在眼动脉瘤的减压、阻断和夹闭中有较好效果。在磨除前床突的过程中,选择规格合适的磨头,减少和消除在磨除视神经管骨质的过程中高速磨钻产生的热量,封堵开放的气房,可以有效降低磨除骨质的过程中高速磨钻产生的热损伤并减少脑脊液漏等并发症的发生。
[博士论文] 桂馥
眼科学 南昌大学;南昌大学医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:研究微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)Weri-RB-1细胞恶性生物学行为中的影响作用,及其与同源磷酸酶-张力蛋白(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信号通路、p53/p21信号通路之间的关系。
  方法:本研究采用脂质体转染技术、实时定量PCR技术(qRT-PCR)对RB及Weri-RB-1细胞miR-21的表达水平进行检测;并通过流式细胞术、免疫蛋白印迹法对细胞凋亡比率及相关蛋白表达水平进行了研究。
  结果:与视网膜正常组织相比,RB组织中miR-21过表达,并具有显著差异(P<0.01)。在Weri-Rb-1细胞中,miR-21抑制剂明显降低了miR-21的水平,并降低了细胞存活率(P<0.01)。与miR-21阴性对照组(negative control,NC)相比,miR-21抑制剂增加了细胞凋亡比率,并提高了凋亡相关蛋白PDCD4和Bax的表达(P<0.01)。而且miR-21抑制剂不仅抑制了细胞的迁移与侵袭,而且降低了MMPs的蛋白表达水平(P<0.01)。此外miR-21抑制剂还通过调节p53/p21蛋白通路,促进了细胞的周期阻滞。
  结论:miR-21抑制剂通过干扰PTEN/PI3K/AKT信号通路以及p53/p21蛋白通路,抑制了细胞的存活、迁移与侵袭以及细胞周期阻滞。这些实验结果表明:RB中miR-21为促癌基因,为RB的有效治疗提供了新的作用靶点与方法。
[硕士论文] 谢佩玲
眼科学 温州医科大学 2017(学位年度)
摘要:实验目的:
  Legumain高表达是RB(Retinoblatoma,视网膜母细胞瘤)及其微环境的重要特征之一。基于此,我们设计和构建 legumain酶响应的DOX(Doxorubicin,阿霉素)纳米药物控释载体,并对其进行表征、优化,确定其体内外释放规律及其对癌细胞的抑制效果,以获得一种理想的有效抑制视网膜母细胞瘤的药物载体。
  实验方法:
  通过玻璃体腔注射Y79悬浮细胞液(Y79是一种较成熟的人类RB细胞株,源自于视网膜内丛状层肿瘤,具有视网膜细胞的特性)制备RB动物模型。使用Trizol试剂和RIPA裂解液分别从Y79细胞、ARPE细胞(Adult Retinal Pigment Epithelium, ARPE,是一种广泛使用的人源视网膜细胞系)和 RB实体瘤提取mRNA和蛋白。通过实时荧光定量PCR法和Western blot检测Legumain蛋白酶在Y79、ARPE以及RB实体瘤中的表达水平。结果表明Legumain在Y79和RB实体瘤中的表达水平远高于在ARPE中的表达水平,为后续Legumain响应药物载体设计奠定基础。
  在此项研究中,我们首先设计和合成一种 Legumain蛋白酶活化胶束,以Legumain的底物肽(PEP)将亲水性聚乙二醇和疏水性聚谷氨酸苄酯(PBG)桥接来递送DOX。我们推测该胶束将在高Legumain活性位点活化释放,从而增加DOX的靶向性和抗癌活性。通过核磁共振氢谱(1H-NMR, Varian, USA)和傅里叶转换红外光谱仪(FT-IR, NICOLET6700, USA)确定共聚物的化学结构,凝胶渗透色谱系统(GPC, Malvern, UK)测定其分子量,高效液相色谱法(HPLC, Agilent, USA)检测DOX的包封率和包载率。动态光散射(DLS,Malven, UK)测量粒径及其稳定性。接着通过透析法使两亲共聚物自组装形成胶束。高分辨率透射电子显微镜观察胶束的形貌。使用游离DOX和包载DOX的胶束处理Y79和RPE细胞(Retinal Pigment Epithelium,RPE,视网膜色素上皮细胞)并测定其细胞毒性。使用荧光显微镜和流式细胞仪(Partec, German)进一步表征游离DOX与包载DOX的胶束的细胞摄取量。
  为了改善药物释放的可控性,根据 RB高表达 Legumain的特性,DOX与Legumain底物肽(PEP)缀合形成 DOX-PEP,再进一步与琥珀酸苷反应,在末端添加一个羧基(DOX-PEP-COOH)。DOX-PEP-COOH嫁接到壳聚糖骨架结构形成CS-PEP-DOX,在微乳液体系中与京尼平交联形成纳米颗粒。通过物理作用将姜黄素(Curcumin, CUR耐药蛋白抑制剂)包载到纳米颗粒的核心形成共包载体系(CS-PEP-DOX/CUR)以进一步提高其抗癌效果。经 MS、FT-IR、DLS、SEM(Phenom-World,The Netherlands)表征和分析中间产物和终产物的分子量、化学结构、粒径分布和表面形貌。CCK-8法(CCK-8, Dojindo, Japan)测定游离药物和包封药物的细胞毒性作用,以处理细胞和未处理细胞吸光度百分比计算细胞存活率。由于缺少成熟的耐药型 RB细胞系,我们采用公认的耐药细胞模型(MCF-7/ADR)来评价CS-PEP-DOX/CUR纳米颗粒逆转耐药的效果。在体实验中,25只3-4周龄的雌性裸鼠多耐药肿瘤模型构建成功。选取其中18只裸鼠随机分为3组(即A、B、C组),每组6只。在造模后8w左右,当观察到有肿瘤形成并可用游标卡尺测量时,A组、B组、C组分别通过腹腔注射250μL共包载悬浮液(阿霉素浓度为60μg/ml,姜黄素浓度为100μg/ml),等量的游离阿霉素和游离姜黄素混合液和 PBS平衡盐溶液。每周测量和记录肿瘤大小。使用以下等式计算肿瘤体积(mm3):V=a×b2/2(其中a和b分别代表最长和最短直径)。取荷瘤裸鼠4只,随机再分为两组,分别腹腔注射250μL Cy5.5荧光探针标记的CS-PEP-DOX/CUR悬浮液和250μL Cy5.5荧光探针标记的DOX和姜黄素的混合溶液。Maestro2体内成像系统在激发波长为670 nm处观察评估肿瘤靶向性,近红外荧光发射强度为710 nm处的间隔时间内拍照记录。
  实验结果:
  荧光定量PCR研究表明,Legumain在视网膜母细胞瘤细胞Y79和正常视网膜上皮细胞ARPE均有表达,且在Y79中表达量是ARPE的6-8倍。Western blot实验表明在RB实体瘤中Legumain蛋白含量显著高于ARPE。
  设计合成Legmain响应两亲嵌段共聚物,通过1H-NMR和FT-IR分析,结果表明该两亲共聚物已经成功合成。进一步用透析法自组装包载DOX形成球形纳米胶束,直径约为100 nm。该纳米胶束中DOX的释放速度受Legumain调配,且与Legumain浓度呈正相关关系。纳米胶束显著提高了Y79对DOX的细胞摄取量,并且增加了DOX对肿瘤的细胞毒性,同时降低了其对RPE的细胞毒性。表明该载体可作为Legumain高表达肿瘤的药物载体。
  为了增加药物释放的可控性,我们进一步设计制备了Legumain响应的化学键合包载的药物载体。我们首先合成了DOX多肽(Legumain底物多肽)衍生物(DOX-PEP)。核磁共振、红外以及质谱数据表明我们已经成功合成了DOX-PEP。我们将DOX-PEP进一步嫁接至壳聚糖(Chitosan, CS)上,优化反应参数,考察不同催化体系对嫁接效率的影响。结果表明,EDC/DMAP催化得到较高的催化效果。在微乳化的溶剂体系中交联形成粒径约为400 nm,带正电的非球形纳米粒子。该纳米药物(CS-PEP-DOX纳米药物)能够显著增加DOX对Y79的抑制效率。为了进一步提高DOX的抗癌效率,我们将CUR(Curcumin,CUR,姜黄素)进一步包载到 CS-PEP-DOX纳米药物疏水核心,形成共包载药物体系(CS-PEP-DOX/CUR纳米药物)。研究CS-PEP-DOX/CUR纳米药物逆转肿瘤多耐药性的效果。结果表明,CUR能够显著增加 Y79细胞对 DOX的敏感性。CS-PEP-DOX纳米粒子对Y79的抑制率从游离DOX的5%提高到25%。共包载CUR后对Y79的抑制率进一步调高到35%。由于Y79并非耐药细胞模型,我们进一步用成熟的耐药型细胞系 MCF-7/ADR进一步评价 CS-PEP-DOX/CUR纳米药物逆转多耐药性的效果,结果显示1.8μg/mL DOX处理浓度下, CS-PEP-DOX纳米粒子对MCF-7/ADR的抑制率从游离DOX的5%提高到35%。共包载CS-PEP-DOX/CUR进一步提高药物的处理效果,对MCF-7/ADR的抑制率进一步调高到57%。我们制备了裸鼠肿瘤模型用于评价CS-PEP-DOX/CUR纳米药物的治疗效果。结果表明CS-PEP-DOX/CUR纳米药物能够显著抑制肿瘤生长的效果,表现出较好的治疗效果。
  实验结论:
  本研究设计合成了Legumain响应的两亲共聚物,自组装包载DOX形成的纳米胶束(疏水相互作用载药)。该药物载体能够促进Y79对DOX的吸收,增强 DOX对 Y79的抑制效果。同时,本研究进一步设计制备了基于壳聚糖的Legumain响应DOX载体(化学键合载药),结果表明该纳米药物能够显著增加DOX对Y79的抑制效果。为了使药物载体具有逆转多耐药性的效果,我们将CUR(耐药蛋白抑制剂)共包载形成CS-PEP-DOX/CUR纳米颗粒。该载体能够进一步增加 DOX对 Y79的处理效果。同时,相比 CS-PEP-DOX纳米颗粒, CS-PEP-DOX/CUR纳米颗粒能显著增强对耐药型肿瘤的抑制效率(细胞水平和动物水平),表现出逆转多耐药性的效果。本研究为寻找 RB新的药物处理方法提供参考。
[硕士论文] 彭小梅
遗传学 温州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  MicroRNA(miRNA)是一类内源性、单链非编码小RNA分子,长约22个核苷酸,通过与靶基因的3′端非编码区(3′UTR)互补配对抑制靶基因的翻译,或者直接降解靶基因的mRN A,其在个体发育、细胞分化、肿瘤形成等过程中发挥着重要的作用。研究发现, miRN A影响肿瘤细胞的增殖和迁移、周期等过程。葡萄膜黑色素瘤(UM)是一种起源于葡萄膜黑色素细胞的恶性肿瘤,是成年人眼部发病率最高的恶性肿瘤,目前尚不清楚其发生机制。前期研究结果表明在葡萄膜黑色素瘤中 miR-135a表达显著下调,本论文将进一步研究 miR-135a在葡萄膜黑色素瘤中的功能与分子调控机制,这将为临床的诊断和治疗提供新的思路。
  方法:
  在体外培养人眼葡萄膜黑色素瘤细胞M17和M21。
  (1)采用real-time PCR技术检测miRNA-135a在6例葡萄膜黑色素瘤组织样本和正常对照中的表达情况。
  (2)以阳离子脂质体Lipo fecta mine为载体将 miR-135a转染进葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M21中,使miR-135a在M17、M21细胞中过表达。
  (3)利用MTS方法检测miR-135a对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响。
  (4)流式细胞技术检测miRNA-135a对葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响。
  (5) Transwell移行实验检测miR-135a对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移的影响。
  (6)Western blot检测转染miR-135a后细胞内重要的信号通路蛋白表达水平的变化。
  (7)用生物信息学预测和荧光素酶报告基因实验鉴定miR-135a的靶基因。
  (8)利用 RNAi技术干扰靶基因的表达,检测其对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖和迁移的影响。
  结果:
  (1)Real-time PCR技术检测结果表明miR-135a在葡萄膜黑色素瘤组织中表达显著下调。
  (2) MTS结果显示miR-135a显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞M17和M21的增殖能力。
  (3)细胞周期检测结果发现miR-135a使葡萄膜黑色素瘤细胞M17和M21阻滞在G1期。
  (4) Transwell结果表明miR-135a显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的迁移。
  (5)荧光素酶报告基因结果显示在葡萄膜黑色素瘤中SIRT1是miR-135a作用的靶基因。
  (6)Western blot结果显示葡萄膜黑色素瘤细胞M17和M21在转染miR-135a后,细胞内重要信号通路中的蛋白表达量下调。
  (7)荧光素酶报告基因结果显示在葡萄膜黑色素瘤中SIRT1是miR-135a作用的靶基因。
  (8)利用RNAi技术干扰靶基因SIRT1的表达后,MTS、Transwell检测结果显示:葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖受到抑制,细胞的迁移受到显著抑制。
  结论:
  以上实验结果表明,miR-135a在葡萄膜黑色素瘤组织中表达下调,miR-135a能够显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖和迁移。M iR-135a的作用机制之一是通过调控靶基因 SIRT1,同时可下调细胞内重要信号通路蛋白 FAK、AKT的磷酸化水平,并可抑制 C DK4的表达并下调周期相关蛋白 Rb的磷酸化水平。用siRNA抑制靶基因SIRT1的表达后,葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力同样受到抑制。因此, miR-135a可通过作用于靶基因 SIRT1来抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖和迁移。
[硕士论文] 贾书娟
生物医学工程 温州医科大学 2017(学位年度)
摘要:实验目的:
  使用边缘功能化球磨法一步制备生物分子(多肽)修饰的石墨烯(TG)纳米材料,以传统化疗药物丝裂霉素 C(MMC)为模型,针对眼部恶性肿瘤—脉络膜黑色素瘤,构建对肿瘤具有高度核靶向性的新型纳米载药体系多肽石墨烯(TG-MMC)。以实现将抗肿瘤药物直接递送至肿瘤细胞的细胞核内,达到选择性杀伤肿瘤细胞的目的,从而有效改善传统化疗药物无靶向性、副作用大的缺陷。
  实验方法:
  通过边缘功能化球磨法将TAT多肽和石墨粉以一定的比例混合球磨,一步制备获得多肽石墨烯;通过酰胺共价键接载丝裂霉素C,构建TG-MMC纳米载药体系。采用紫外光谱、傅里叶红外光谱、拉曼光谱、原子力显微镜等多种表征技术确认 TG-MMC的成功合成。将 TG-MMC与正常眼细胞系(ARPE-19)和肿瘤细胞系(OCM-1)共培养,检测纳米载药体系对肿瘤细胞的靶向性和杀伤性。通过透射电子显微镜(TEM)和共聚焦显微镜(CLSM)进一步确认所制备的纳米材料TG对肿瘤细胞具有较明显的核靶向性。
  实验结果:
  1)材料表征:原子力显微镜、扫描电子显微镜等表征手段证明一步法球磨获得平均厚度约为0.7 nm的单层片状石墨烯,并可见边缘被TAT多肽分子功能化;拉曼光谱显示产物具有TAT多肽的特征峰,且具有石墨烯明显的特征峰D峰(1362cm-1)G峰(1609cm-1)和2D峰(2708cm-1)。从紫外光谱、红外光谱等表征结果证实 TG-MMC体系构建成功,并计算得到 TG-MMC中MMC的载药率为21.6%,包封率为54.8%。
  2)细胞毒性测试:采用CCK-8法检测了所制备的TG对于视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的细胞毒性,50μg/ml浓度的材料作用于细胞72小时,细胞存活率达90%以上,显示了TG良好的生物相容性,为TG作为纳米载药体系的制备提供了保障。
  3)核靶向性检测:分别用含有TG的培养液培养ARPE-19细胞和OCM-1细胞,在不同时间点洗去材料,固定细胞后分别用 TEM和共聚焦显微镜观察,发现纳米材料可以在6h后分布于正常细胞和肿瘤细胞内,并且在36h后开始代谢。在肿瘤细胞的细胞核内也发现有纳米材料分布,但是并未在正常细胞的细胞核内发现纳米材料,说明TG材料具有对肿瘤细胞的特异核靶向性。
  4) Transwell共培养:分别用不同浓度的TG-MMC对ARPE-19细胞和OCM-1细胞进行共培养,发现不同时间点载药体系对肿瘤细胞的杀伤性都远远大于正常细胞;对照组采用单纯的MMC抗肿瘤药物共培养两种细胞,发现药物并没有靶向性,在相同浓度下对ARPE-19细胞和OCM-1的杀伤性基本相同,表明TG的存在,是载药体系具有肿瘤细胞靶向性的决定因素。
  实验结论:
  本论文以边缘功能化球磨法制备获得了原子厚度的多肽石墨烯,简化了石墨烯的制备及相应的生物分子改性过程,将石墨烯的剥离、生物分子的改性、及肿瘤高靶向性等多个繁琐过程简化为高效简便的一步法。同时所有反应均在常温常压下进行,没有使用任何的有毒化学试剂,相较传统方式更为环保高效,所得产物具有良好的生物相容性以及载药性能,且具备对肿瘤细胞具有明显的核靶向性,是一种非常理想的抗肿瘤药物载体。进一步将载药体系通过Transwell模板与肿瘤细胞及正常细胞共培养,发现TG-MMC对于肿瘤细胞具有高靶向性,可以选择性杀伤肿瘤细胞,减小了对正常细胞的伤害,为药物抗癌的发展提供新的动力和方法。
[博士论文] 彭德伟
眼科学 温州医科大学 2017(学位年度)
摘要:MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为22 nt的内源性非编码小RNA,参与基因表达的转录后水平的调控,是个体发育、免疫保护、肿瘤发生等很多生理机能的重要调节分子。葡萄膜黑色素瘤是成人眼内最常见的原发性恶性肿瘤,预后差,其发病机制尚不明确。本实验室的前期研究发现,miR-142-3p在葡萄膜黑色素瘤细胞中显著下调。我们进一步探索 miR-142-3p在葡萄膜黑色素瘤细胞中的功能以及作用机制。
  本研究采用荧光定量PCR明确了miR-142-3p在葡萄膜黑色素瘤细胞和肿瘤组织中的表达水平显著下调。然后通过 MTS、克隆形成实验、细胞凋亡分析、划痕实验、Transwell实验,以及活体生物荧光成像技术,证明了miR-142-3p对葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖(包括体内)、迁移和侵袭能力有明显的抑制作用,但不影响细胞的凋亡水平以及对阿霉素药物的敏感性。细胞周期分析和EdU实验结果显示,过表达miR-142-3p会导致葡萄膜黑色素瘤细胞的G1、G2期阻滞和DNA合成障碍。通过miRNA芯片分析,表明miR-142-3p在葡萄膜黑色素瘤细胞中主要调控 TGFβ、MAPK、PI3K-AKT等信号通路,参与调节细胞的内吞作用、粘着斑、肌动蛋白细胞骨架、细胞连接等生物功能。我们进而筛选并利用荧光素酶报告分析和Western Blot,验证了CDC25C、TGFβR1、GNAQ、WASL和RAC1是miR-142-3p的靶基因。利用RNAi技术分别下调这些基因的表达后,都能抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖;其中下调TGFβR1、GNAQ、WASL和RAC1还有抑制细胞迁移的作用。另外下调CDC25C或RAC1的表达可以明显导致细胞周期阻滞和DNA合成障碍。在细胞形态上,敲减CDC25C和WASL会引起细胞伪足变短或变成圆球状,以及细胞聚集的现象,和过表达miR-142-3p引起的变化相似。综上,miR-142-3p通过调节CDC25C、TGFβR1、GNAQ、WASL和 RAC1靶基因进而影响葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及细胞形态。揭示了miR-142-3p在葡萄膜黑色素瘤中的功能和分子机制,为该疾病的临床诊断和治疗提供新的靶点和思路。
[硕士论文] 钟佳云
生物学 温州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt(核苷酸单位)的功能性RNA分子,无开放阅读框(ORF),不编码蛋白。LncRNA功能广泛,几乎参与了从基因表达到蛋白质翻译等所有方面的细胞生命活动。葡萄膜黑色素瘤是成年人中最常见的一种恶性眼内肿瘤,易发生转移,目前缺乏有效的治疗手段。近年来研究表明lncRNA在肿瘤的发生和发展过程中起着至关重要的作用,然而有关lncRNA在葡萄膜黑色素瘤中的研究仅有少数相关报道,总体上处于空白状态。有鉴于此,本论文旨在探讨lncRNA在葡萄膜黑色素瘤中的表达谱与特定lncRNA的功能,以求更加深入地理解lncRNA在葡萄膜黑色素瘤中的作用。
  方法:
  (1)利用LncRNA芯片技术检测葡萄膜黑色素瘤中的lncRNA表达谱;
  (2)采用生物信息学方法对差异表达的lncRNA进行功能和信号通路分析;
  (3)在差异表达的lncRNA中选取lncRNA-5,通过定量PCR技术验证其在葡萄膜黑色素瘤组织标本以及葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达情况;
  (4)利用siRNA干扰技术下调lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5中的表达,定量PCR技术检测siRNA的抑制效率;
  (5) MTS方法检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响;
  (6)平板克隆形成实验检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞克隆形成能力的影响;
  (7)流式细胞技术检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响;
  (8) Transwell迁移实验检测lncRNA-5下调对葡萄膜黑色素瘤细胞迁移能力的影响;
  (9) Western blot法检测lncRNA-5下调对细胞周期相关蛋白的影响;
  (10)活体荧光成像技术在体检测lncRNA-5 siRNA对葡萄膜黑色素瘤生长的影响。
  结果:
  (1) LncRNA芯片实验揭示了5例葡萄膜黑色素瘤组织与正常组织之间的lncRNA差异表达谱,鉴定出显著差异表达的lncRNA(Fold change>2)共1563个,其中肿瘤中显著下调的lncRNA700个,显著上调的863个;
  (2)生物信息学分析构建了差异表达的lncRNA以及与细胞生长、增殖和细胞周期等功能相关的lncRNA-信号通路网络;
  (3)定量PCR结果显示:与正常葡萄膜黑色素细胞相比,lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达明显升高;同时,与正常组织相比,lncRNA-5在6例葡萄膜黑色素瘤组织中的表达均显著升高(P<0.001);
  (4)定量PCR结果显示:lncRNA-5 siRNA能显著抑制 lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达(P<0.001);
  (5) MTS增殖实验结果显示:lncRNA-5 siRNA能明显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5的增殖(P<0.001);
  (6)平板克隆形成实验结果显示:lncRNA-5 siRNA能显著降低葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5的克隆形成能力;
  (7)细胞周期检测结果显示:lncRNA-5 siRNA能使葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5在G1期出现明显的滞留现象;
  (8) Transwell迁移实验结果显示:lncRNA-5 siRNA能显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5的迁移(P<0.01);
  (9) Western blot结果显示:lncRNA-5 siRNA能使葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5中的细胞周期相关蛋白p-Rb、E2F1、Cyclin B1、Cyclin E2、CDK6、CDK2、p-cdc2的表达有不同程度的下调;
  (10)活体荧光成像实验结果显示:转染lncRNA-5 siRNA的葡萄膜黑色素瘤细胞在裸鼠眼内的生长明显受到抑制(P<0.05)。
  结论:
  本研究系统揭示了葡萄膜黑色素瘤中lncRNA的差异表达谱,生物信息学分析构建了lncRNA-信号通路网络。进一步的研究发现lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤组织及细胞中的表达显著上调,功能实验表明在葡萄膜黑色素瘤细胞中下调lncRNA-5的表达可显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、细胞周期和迁移,并可下调细胞周期相关蛋白p-Rb、E2F1、Cyclin B1、Cyclin E2、CDK6、CDK2、p-cdc2的表达水平。活体荧光成像实验表明下调lncRNA-5的表达可在体抑制葡萄膜黑色素瘤的生长。综上,本研究系统阐明了葡萄膜黑色素瘤中lncRNA的差异表达谱,以及lncRNA-5在葡萄膜黑色素瘤细胞中的生物学功能。研究成果进一步完善了葡萄膜黑色素瘤的分子病理机制,并为该疾病的临床诊断和治疗提供了新的靶点和策略。
[硕士论文] 夏杰军
影像医学与核医学 广州医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨经眼动脉灌注化疗(Intra-arterial chemotherapy,IAC)治疗视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)患儿保眼率、生存率以及不良反应,为临床评估RB患儿预后及指导个体化治疗提供临床参考。
  材料与方法:
  回顾性分析广州市妇女儿童医疗中心2009年4月至2016年4月介入血管瘤科收治行IAC治疗的271例(305只患眼)视网膜母细胞瘤患儿,对其临床特征、治疗情况、患者保眼率及生存率进行研究;采用Kaplan-Meier法绘制保眼率生存曲线与生存曲线,对性别、国际眼内RB肿瘤的分级、年龄、术前的治疗史等因素与疗效的关系进行单因素分析,用COX比例风险模型探讨RB预后影响因素。
  结果:
  共有全部271例患儿纳入研究,患儿IAC术后中位随访时间为15个月(1~96个月),246例生存(5年生存率92.8%),15例死亡。经眼动脉灌注化疗共943次(中位3次)。246例生存患儿自最后一次IAC治疗日开始,RB患儿最短保眼时间1月,最长保眼时间96月,5年总体保眼率为63.1%,根据IIRC分期,其中A期(n=1)、B期(n=12)、C期(n=22)RB患者随访时间内保眼率为100%,D期(n=208)1年保眼率为77.4%,2年保眼率为74.1%,3年保眼率为70.0%,5年生为64.1%;E期(n=42)1年保眼率为42.9%,2年保眼率为32.2%,3年保眼率为26.8%,5年保眼率为26.8%;经单因素分析结果显示,临床分期与RB患儿保眼率有统计学关联。多因素COX回归分析显示IIRC分期(RR3.866,95%CI:2.558-5.843)是RB患者保眼率的影响因素。
  结论:
  IAC是一种安全有效的治疗RB方法。肿瘤分期是影响其保眼率的重要因素,治疗史、性别、治疗时年龄对保眼率无统计学意义,为临床提供了重要参考。
[硕士论文] 张倩
眼科学 华中科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  分析眼部浆细胞瘤的临床特点、免疫组化和荧光原位杂交结果、以及针对眼部浆细胞瘤的多种治疗方法的治疗效果和对预后的影响等,以提高对本病的认识,诊断及治疗水平。此外,结合国内外近年来的相关文献,分析眼部浆细胞瘤的临床特点、免疫组化和荧光原位杂交的结果及不同治疗方法的有效性、影响预后的因素等。
  方法:
  收集并分析自1986-2014于武汉协和医院眼科就诊并进行眼眶肿瘤手术切除并确诊浆细胞瘤的共计8例患者的临床资料,就其临床特点、实验室检查结果、诊断、治疗、预后等进行回顾性分析。所有患者的诊断均符合英国骨髓瘤论坛指南工作组的国际诊断标准。实验室检查主要包括病变组织常规病理HE染色,免疫组化分析,荧光原位杂交等。主要的治疗方法包括放疗、单纯手术、手术联合放疗、手术联合化疗等。对治疗后的患者进行随访,定期行骨髓穿刺和CT、MRI等影像学检查,以检测疾病对治疗的反应情况,治疗后有无复发,是否进展为多发性骨髓瘤等。随访时间为2年,在对患者进行随访的过程中,根据患者病情,必要时给予相应的对症支持治疗。
  结果:
  在本组8例患者中,男3人,女5人。年龄范围为34-67岁,中位年龄为55.4岁。眼部浆细胞瘤可以发生在眼眶、泪腺、结膜等部位,在本组研究中,8例患者的具体发病部位及相应例数如下:5例肿瘤位于眼眶颞上方,眼眶颞下方、眼睑和泪腺各1例。眼部浆细胞瘤的临床表现由局部肿物及因此产生的压迫症状引起。眼部浆细胞瘤的诊断依赖病理学免疫组化分析,证实表达浆细胞特有的标记物CD38和CD138。本组研究的8例患者均经病理学诊断为浆细胞瘤。其免疫组化的结果如下:所有肿瘤细胞呈CD38、CD138阳性,Kappa阳性5例,Lambda阳性3例,CD20阳性3例,CD79a阳性4例,cyclin D1阳性2例,仅1例显示CD3阳性,CD5和CD23均为阴性,Ki-67的表达介于5-40%。另外对本组8例患者的石蜡标本采取荧光原位杂交检测,结果如下:5名患者检测出IGH易位,其中3名患者检出t(4;14)(p16;q32),2名患者为t(11;14)(q13;q32)。比较不同染色体异常患者的预后,发现t(4;14)(p16;q32)和 t(11;14)(q13;q32)的中位无疾病生存期分别为12.7月 vs17.5月,推测伴有t(4;14)(p16;q32)的预后差于t(11;14)(q13;q32)。随访时间为2年。
  结论:
  眼部浆细胞瘤的临床和影像学皆无特征性表现,确诊有赖于病理诊断。我们首次应用FISH分析眼部浆细胞瘤的染色体异常情况,并由此推断病人的治疗和预后情况。本组病人中伴有t(4;14)(p16.3;q32)相比于t(11;14)(q13;q32)患者的生存期及预后较差,推测浆细胞瘤中存在的染色体异常可能对病人的治疗和预后存在影响。由于我们这组病人由于病例数少且缺乏长期随访资料,尚不足以对病人的治疗和预后做出明确推断,还需更大样本的进一步观察与分析。
[硕士论文] 侯萍
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  眼眶神经鞘瘤绝大多数为良性肿瘤,患者以眼球突出、视力下降、眼动障碍或复视等就诊,眶内肿瘤常引起眼部这些改变,与眶内其他肿瘤不易鉴别。肿瘤生长位置变化较大,瘤外包膜菲薄,术中囊膜破裂肿瘤残留往往是导致肿瘤术后复发的主要原因。本文研究目的主要是通过临床和影像学分析做出肿瘤组织学判断,根据肿瘤位置和范围制定最佳手术方案,取得最佳预后。
  方法:
  收集天津医科大学第二医院眼科1985年至2014年间经病理组织学确诊的眼眶神经鞘瘤226例,通过分析这些病例的临床表现、影像学特征以及查阅相关文献以分析、总结该病的临床特点,提高术前诊断正确率。总结本文病例资料以及借鉴国内外关于本病的治疗经验,探讨该病的最佳治疗方法。
  结果:
  1、临床表现:患者多以渐进性眼球突出就诊,典型临床表现为眼球突出、视力下降、扪及肿物以及眼球运动障碍。
  2、影像学检查结果:B型超声检查(B mode ulthasonography)肿瘤内回声多不均匀,占57.00%,多为实体回声显示大小不等无回声区。彩色多普勒(color Doppler imaging,CDI)检查显示肿瘤血流分布多样。CT(computed tomography,CT)检查显示肿瘤分布位置广泛,以上方及外侧居多,常累及眼眶后1/3段。形状多样,主要为长条形及类圆形。磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查显示肿瘤内部信号丰富,特别是T2WI像,以低、中、高混杂信号为主。
  3、术式选择:前路开眶术、外侧开眶术、内侧开眶术、内外联合开眶术、眶内容切除术以及经颅开眶术分别为89例、110例,5例、9例、5例、4例。行外侧开眶术者较前路开眶术者并发上睑下垂、视力下降、眼动受限风险大。累及眶后1/3段行前路开眶术较外侧开眶术肿瘤易残余,未累及者则无差异。
  4.良恶性鉴别及处理原则:当发现肿瘤生长较快,疼痛感明显,眼眶骨壁有破坏时,应高度怀疑恶性病变。良性肿瘤未累及眶后1/3段多采用前路开眶术,累及眶后1/3段肿瘤多采用外侧开眶术。恶性肿瘤需行肿瘤扩大切除术或眶内容摘除术,术后辅助放射治疗。恶性者较良性易复发。
  结论:
  大多数眼眶神经鞘瘤可通过影像学检查确定术前组织学判断。B型超声显示肿瘤内部回声少且不均匀,实体肿瘤内显示数个小片状或融合成片透声区,应高度怀疑为眼眶神经鞘瘤。CT显示肿瘤呈串珠状或葫芦状生长,或呈与眼轴平行长条形或长锥形生长时,多为眼眶神经鞘瘤,结合经眶上裂向颅内海绵窦区蔓延基本可以肯定诊断。哑铃形生长眶颅沟通肿瘤,哑铃形中间部在眶上裂处,两端分别在眶内和海绵窦区,眶顶骨质不增厚或缺失,亦应高度怀疑神经鞘瘤可能。MRI显示肿瘤T2WI呈低、中、高混杂信号,结合肿瘤特殊形状,如串珠状、长条形、哑铃形等,多数可以肯定为眼眶神经鞘瘤。未及眶后1/3段肿瘤、粘连不严重者多行前路开眶术,累及眶后1/3段粘连严重者可选择外侧开眶术,若位置靠近内侧、体积较大,可联合内侧开眶术。眶颅沟通者开眶取出苦难者可考虑经颅开眶。良性肿瘤多选择肿瘤局部切除术,恶性肿瘤需行肿瘤扩大切除术或眶内容切除术。
[硕士论文] 吴琛
眼科学 南昌大学;南昌大学医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究玻璃体腔注射雷珠单抗联合激光治疗视网膜大动脉瘤的疗效观察。
  方法:
  本研究回顾性分析2014年9月至2016年4月期间经眼底检查、光学相干断层扫描(OCT)及眼底荧光素血管造影(FFA)后明确诊断为视网膜大动脉瘤并发黄斑水肿患者共26例(26眼),按治疗方法分为2组:单纯激光组12眼,治疗期间单纯行眼底视网膜激光光凝;联合治疗组14眼,先行玻璃体腔雷珠单抗注射,一周后再行激光光凝。于治疗后1、2、3、6、12个月随访,观察两组各随访点的最佳矫正视力( BCVA),黄斑中心凹厚度( CMT)、激光次数,以及并发症情况等。
  结果:
  本次临床观察中,我们在术后12个月随访期间主要观察了两组患眼的最佳矫正视力( BCVA),黄斑中心凹厚度(CMT)、激光次数,并发症情况进行监测,试验结果如下:
  (1)最佳矫正视力(BCVA)
  在术后1、2、3、6、12个月5个随访点,联合组的BCVA均优于单纯激光组。与治疗前相比,激光组的BCVA于第2个月开始提高0.049±0.017->0.08±0.010(P<0.05),联合组自第1个月显著提高0.054±0.021->0.24±0.050,其最佳视力出现在第3个月0.43±0.047,而单纯激光组的最佳视力出现在第6个月0.10±0.017。第12个月单纯激光组和联合组的视力分别为0.10±0.018和0.42±0.032。
  (2)黄斑中心凹厚度(CMT)
  在术后1、2、3、6、12个月5个随访点,联合组的CMT均低于单纯激光组(P<0.05)。与治疗前相比,联合组各随访点的CMT均低于基线水平(P<0.05),单纯激光组于治疗后3月开始低于基线水平388±62.14->336.08±40.19μm(P<0.05)。术后12月单纯激光组和联合组的CMT分别为312.4.37±42.35μm,173.42±14.82μm。
  (3)激光光凝次数
  单纯激光组行激光4.25±0.97次,联合组行激光2.29±0.47次。联合组较单纯激光组激光次数少,两组对比具有统计学差异。
  (4)并发症情况
  整个观察期间,我们观察了两组患者的术后并发症有一过性高血压、眼压升高、眼底出血、玻璃体出血、球结膜下片状出血以及眼内炎。联合组出现一过性高血压3例(3/14),球结膜下片状出血4例(4/14),所有患者未出现眼内炎(0/14)、玻璃体出血(0/14)、眼底出血(0/14)和眼压升高(0/14)。单纯激光组一过性高血压3例(2/12),眼底出血(2/12),患者未出现球结膜下片状出血(0/12),玻璃体出血(0/12),眼内炎(0/12),眼压升高(0/12)。两组患者的并发症无明显差异(P>0.05)。
  结论:
  玻璃体腔注射雷珠单抗联合激光治疗视网膜大动脉瘤可以显著提高患眼的BCVA,降低患眼的CMT,同时可减少激光治疗次数,进而减少视网膜损伤。因此联合治疗组对比单纯激光组在视网膜大动脉瘤方面具有更好的疗效。
[博士论文] 盛艳
眼科学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  脉络膜黑色素瘤(choroidal melanoma,CM)是成年人最常见的眼内原发性恶性肿瘤,可在肿瘤早期随血行播散,CM一旦发生转移,死亡率极高。传统的治疗方法是眼球摘除术,近几十年出现多种保眼治疗的方法,如放射治疗,局部切除术,经瞳孔温热疗法,激光光凝等;这些新的治疗方法虽然实现了保留眼球、维持部分视功能的作用,但未能明显改善脉络膜黑色素瘤的转移率和生存率。近年来,肿瘤生物治疗成为新兴且疗效显著的肿瘤治疗新模式,其中的溶瘤病毒治疗作为生物疗法之一在多种肿瘤的研究中显示出较好的肿瘤杀伤作用。水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)具有遗传适应性强,病毒拯救体系成熟高效,病毒复制迅速等特点,是肿瘤治疗的良好载体。由于眼部解剖的特殊性,对脉络膜黑色素瘤的治疗需要对眼部健康组织友好的VSV突变株。本研究尝试对野生型水泡性口炎病毒(WT-VSV)进行突变拯救出对神经组织更为安全的致弱型VSV,研究WT-VSV与致弱VSV毒株对体外培养的恶性黑色素瘤细胞特异性杀伤作用及在体内的抗肿瘤作用,并探讨其抗肿瘤作用方式及其相关机制。
  方法:
  1.拯救实验:利用VSV反向遗传系统和定点突变技术,对野生型VSV的1650与1691位点的氨基酸进行突变成功拯救获得VSV-Y1650A与VSV-F1691A两株致弱水泡性口炎病毒株。
  2.噬神经性实验:通过VSV滴鼻感染小鼠后进行神经组织的HE及免疫组化检测了解野生型VSV与新拯救的VSV-Y1650A与VSV-F1691A噬神经作用特点。
  3.体外细胞杀伤实验:使用BHK-21细胞扩增三种VSV病毒,应用TCID50法测定病毒滴度;以体外培养的小鼠黑色素瘤细胞B16细胞为研究对象,通过CCK-8法检测比较不同毒株VSV病毒对B16细胞增殖的影响,并通过流式细胞仪检测不同毒株VSV对B16细胞周期及凋亡的影响。
  4.体内抑瘤实验:利用小鼠黑色素瘤细胞B16细胞经皮下注射构建裸鼠实体荷瘤模型,瘤体内注射接种VSV-WT与VSV-Y1650A,通过观察肿瘤生长趋势、Westernblot法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达,探讨VSV的体内抑瘤作用效果以及相关的作用机制。
  结果:
  1.利用单股负链RNA病毒反向基因操作技术,对野生型VSV基因组内L蛋白VI功能域的1650与1691位点的氨基酸进行突变成功拯救获得VSV-Y1650A与VSV-F1691A两株致弱的水泡性口炎病毒突变株。
  2.WT,Y1650A,F1691A三株VSV分别滴鼻感染小鼠后7天脑部病理切片显示,接种WT-VSV的小鼠脑部出现脑部血管充血,脑实质炎症细胞浸润呈袖套反应等温和的病理变化,而Y1650A和F1691A组小鼠脑部未观察到显著的病理变化。
  3.体外实验中CCK-8法检测发现WT,Y1650A,F1691A三株VSV均对B16细胞有明显杀伤作用,且杀伤作用存在剂量效应关系。流式细胞仪检测三组VSV病毒作用于B16细胞72h后,与空白组相比,其晚期凋亡细胞的比例均极显著上升(44.44%/WT,28.36%/Y1650A,24.19%/F1691A vs2.14%,P<0.01)。流式细胞周期结果显示,感染病毒的三组均出现G1期细胞数量减少;WT-VSV组(67.96% vs86.42%, P<0.01); Y1650A-VSV组(76.42% vs86.42%, P<0.05); F1691A-VSV组(81.70% vs86.42%,P>0.05);相比,其S期细胞均有明显的上升,感染过VSV的B16细胞有明显的S期阻滞的现象。
  4.裸鼠荷瘤模型的体内治疗实验结果显示,接种VSV-WT与VSV-Y1650A均可以明显的抑制小鼠体内接种的B16肿瘤的生长,而未见明显的毒副反应。Westernblot法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白结果显示,WT与Y1650A能上调小鼠恶性黑色素瘤组织中的caspase-3,Bax基因的蛋白的表达;同时可以抑制小鼠恶性黑色素瘤组织中CDK-2蛋白的表达。
  结论:
  1.拯救获得VSV-Y1650A与VSV-F1691A两株致弱的水泡性口炎病毒突变株的噬神经性较WT-VSV明显减弱。
  2.WT,Y1650A,F1691A三株VSV在体外能够杀伤B16肿瘤细胞,引起细胞凋亡,阻滞细胞周期,在体内实验中能够抑制肿瘤生长,且无明显的毒副反应。
  3.体外实验的流式细胞凋亡检测及体内实验的凋亡相关蛋白检测均提示VSV杀伤B16细胞的机制与细胞凋亡的途径有关。
  综上所述,Y1650A-VSV呈现出应用于恶性黑色素瘤治疗的潜力,本研究为脉络膜黑色素瘤溶瘤治疗的进一步研究提供依据。
[硕士论文] 张双梅
眼科学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:脉络膜转移癌是最常见的眼内恶性肿瘤。在女性,原发灶多见于乳腺癌,其次为肺癌,男性患者,原发癌多见于肺癌。脉络膜转移癌好发于中老年人,发病年龄多为40-70岁,女性多于男性,左眼多于右眼。脉络膜转移癌患者眼部症状表现为视力下降、眼部疼痛,视野缺损、视物变形、眼前黑影、闪光感等。眼底表现为后极部均匀一致的灰黄色或黄白色类圆形、宽基底的无蒂实质性隆起肿物,多伴渗出性视网膜脱离。脉络膜转移癌的诊断需要结合病史,临床表现、辅助检查,治疗需要多学科联合治疗,主要包括全身治疗和局部治疗。脉络膜转移癌的治疗旨在改善及保护视力,改善患者生活质量。本文主要介绍了脉络膜转移癌的病因、临床表现、诊断及治疗。
[硕士论文] 麻丽薇
眼科学 温州医科大学 2016(学位年度)
摘要:实验目的:
  脉络膜黑色素瘤是成年人最常见的原发性眼内恶性肿瘤。该病转移早,预后差,生存率低,治疗常需联合化疗。但传统化疗药物抗癌效率低,副作用大。本课题组在前期研究中发现,以羟基石墨烯聚乙二醇作为药物载体,可极大地加强传统化疗药物的靶向性和肿瘤杀伤力。同时,由于纳米载药体系通过表面修饰和官能团化,可聚集并滞留在肿瘤部位,增强了对实体肿瘤的靶向杀伤力。本研究进一步确认了纳米载体羟基石墨烯(GOH)对细胞的基因安全性,以此为载体合成羟基石墨烯聚乙二醇载阿霉素体系(GOH-PEG/DOX),从体外肿瘤模型和体内肿瘤模型检测其抗癌效果,进一步深入探索其在抗脉络膜黑色素瘤治疗中的应用。
  实验方法:
  1) GOH-PEG/DOX体系的合成及表征:通过球磨KOH与石墨固体粉末制得羟基石墨烯,再利用化学氧化,与聚乙二醇(PEG)共价结合获得GOH-PEG,最后在COG-PEG的表面通过物理静电吸附接载阿霉素,构建GOH-PEG/DOX体系。通过傅里叶红外表征、拉曼表征和紫外分光光度计法证明GOH-PEG/DOX构建成功,并计算阿霉素载药率。
  2)单细胞凝胶电泳(彗星实验):将经不同浓度GOH溶液培养后的ARPE-19细胞,裂解、解螺旋后,置于电泳槽中电泳,用染料对DNA进行染色,通过观察和计算DNA迁移的长度判断GOH对ARPE-19是否具有基因毒性。
  3)流式细胞检测:将经过GOH溶液培养后的ARPE-19细胞,进行双染后,通过流式细胞仪检测各组凋亡水平。
  4)3D肿瘤模型实验:以凝胶悬滴法将人眼脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1制成3D细胞体外肿瘤模型,加入GOH-PEG/DOX,通过测量肿瘤模型的长轴和短轴来计算体积,并与传统DOX治疗效果作对比,检验纳米载药体系对体外实体肿瘤的渗透性及杀伤力。
  5)体内肿瘤模型实验:在裸鼠左侧腋下注射OCM-1细胞,建立OCM-1肿瘤小鼠模型,给药后,监测小鼠体重及肿瘤体积变化,评价载药体系的体内抗肿瘤效果。取各组的肿瘤组织和全身重要脏器(心、肝、肾、肺)进行石蜡切片、HE染色,观察病理生理变化。
  实验结果:
  1) GOH-PEG/DOX的表征结果:从红外光谱、拉曼光谱等证明GOH-PEG/DOX体系构建成功。并计算得到GOH-PEG/DOX中DOX的载药率为56.4%,包封率为64.8%。
  2)彗星实验:50μg/ml浓度以下的GOH组的彗尾DNA百分率没有明显增加。浓度达到100μg/ml时,彗尾DNA百分率略高于阴性对照组,但即使在培养72小时后,增加量在5%以内,远远低于阳性对照组。
  3)流式细胞检测:在各个浓度GOH组中,正常存活的ARPE-19细胞的百分率均高于阴性对照组,凋亡细胞所占的百分率均比阴性对照组低。
  4)3D肿瘤模型实验:GOH-PEG/DOX的抗癌效果随着时间及作用浓度的增加,对肿瘤体积的抑制作用呈正比。与传统DOX相比,GOH-PEG/DOX显示出更强的抑制效果,50μg/ml作用72小时肿瘤体积可减小近40%,远大于同浓度同时间的DOX作用效果(20%左右)。
  5)体内肿瘤模型实验:GOH-PEG/DOX组的小鼠体重下降比DOX组更少到中后期甚至有所增长,GOH-PEG/DOX组比DOX组小鼠体重多增加0.5g左右。与此相反,GOH-PEG/DOX组的肿瘤体积增长缓慢,实验结束时,无治疗组肿瘤体积增长225%, DOX组增长90%,而GOH-PEG/DOX组增长小于40%且有下降趋势。HE染色显示,肿瘤切片上细胞排列紊乱,多形性明显,细胞核深染,核浆比例大。GOH-PEG/DOX组肿瘤切片显示明显坏死。在心脏和脾脏的组织切片中没有发现异常,在GOH-PEG/DOX组的肾和肺切片中发现了棕色类圆形小颗粒。在肺组织切片中,无治疗组发现大的转移瘤,在DOX组中可见较小的转移瘤,但是在GOH-PEG/DOX组没有明显的转移瘤生成。
  实验结论:
  本研究证实,GOH-PEG/DOX可以被成功合成,其中DOX的装载率约为56.4%,包封率约为64.8%。GOH纳米载体本身对细胞无明显基因毒性,具有极高的安全性,可以作为药物载体用于生物体内。与传统化疗药物DOX相比,我们所构建的GOH-PEG/DOX对体外实体肿瘤模型具有更好的渗透力、更强的杀伤力,可快速有效地缩小肿瘤体积。GOH-PEG/DOX载药体系的体内抗肿瘤效果亦强于DOX,瘤体积明显小于DOX组,同时由于其药物靶向性,对肿瘤小鼠的健康影响更小,肿瘤小鼠的生存质量更高。除了抑制肿瘤本身,GOH-PEG/DOX还有效阻止肿瘤细胞的转移,极大地提高了生存率。因此我们认为,羟基石墨烯聚乙二醇载药体系可极大地增强传统化疗药物的肿瘤杀伤性,并使药物具有靶向性,减少对正常组织器官的伤害,控制肿瘤增长的同时可阻止肿瘤细胞的远处转移,极大地提高肿瘤小鼠的生存质量及生存率,为临床抗脉络膜黑色素瘤的治疗提供了极有意义的科研数据,具有很大的临床应用前景。
[硕士论文] 黄沈妤
眼科学 浙江大学 2016(学位年度)
摘要:目的:
  分析利用Hughes法对下睑肿瘤切除术后患者眼睑缺损的重建效果。
  方法:
  回顾性系列病例研究。
  对浙江大学医学院附属第二医院眼科中心2011年11月至2015年12月间收治的10例眼睑肿瘤患者(其中男性5例,女性5例)行下睑肿瘤切除术联合Hughes法眼睑重建术,术后进行随访,评价其手术治疗效果。
  结果:
  共有10例患者(年龄58岁~75岁)10只眼,随访3至52个月。10例患者的术后病理诊断中8例为基底细胞癌,1例为睑板腺癌,1例为鳞状细胞癌。所有患者随访期内均未发现肿瘤复发及转移,重建后的眼睑形态良好、功能正常,2例患者术后出现睑缘红斑的情况,未见其他术后并发症。
  结论:
  利用Hughes法修复下睑肿瘤切除术后眼睑睑缺损,可获得理想的功能及外观效果。
[硕士论文] 王双双
眼科学 青岛大学 2016(学位年度)
摘要:目的:研究腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)中ACC-2细胞在三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)作用下,ACC-2细胞生长情况及细胞中MDM2基因及蛋白表达的变化,进一步分析As2O3促进ACC-2细胞发生凋亡的具体机制。
  方法:将腺样囊性癌ACC-2细胞在体外进行培养并将其分为实验组和对照组,实验组于细胞长至指数生长期时,向其中加入浓度分别为2、4、6、8μmol/L的含As2O3的细胞培养液,对照组仅加入相同体积的全细胞培养液,在倒置显微镜下,持续观察各时间段在不同浓度的As2O3溶液的刺激下,ACC-2细胞的生长与凋亡状况变化,应用荧光定量RT-PCR和免疫细胞化学技术分别检测MDM2基因(24、48h)与MDM2蛋白(24、48、72h)的表达变化。
  结果:
  (1)As2O3对ACC-2细胞的生长具有抑制作用,且伴随着药物浓度和作用时间的增加,细胞的生长抑制作用逐渐加强,显微镜下可见贴壁细胞出现缩小、变圆、脱落,细胞接触减少间隙变大,胞膜完整,胞内颗粒增多,细胞密度增大,胞核核分裂相减少呈空泡样变,随着时间和As2O3浓度增加,贴壁细胞减少,悬浮凋亡的细胞逐渐增多;
  (2)RT-PCR结果显示MDM2 mRNA在各组细胞中均有表达,且随着As2O3溶液浓度不断升高和作用时间延长,MDM2 mRNA的表达明显下降,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),各组两两比较差异有统计学意义(P<0.05);
  (3)免疫细胞化学检测结果示MDM2蛋白主要在细胞核中表达,细胞浆中存在少量表达,MDM2蛋白在对照组ACC-2细胞中存在基础表达,ACC-2细胞在不同浓度As2O3刺激下,随浓度及作用时间增加,阳性颗粒逐渐减少,平均光密度值(IOD/area)逐渐减小,即MDM2蛋白表达下降,不同As2O3浓度与作用时间各组,两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)。MDM2蛋白的表达水平和As2O3的浓度及作用时间有明显的负相关性(r<-0.7,P<0.05)。
  结论:
  (1)As2O3能够抑制ACC-2细胞的生长,并且能够促进其凋亡;
  (2)As2O3可以使腺样囊性癌ACC-2细胞中MDM2基因和MDM2蛋白的表达量下降,因此,我们认为MDM2基因可能参与了药物As2O3诱导腺样囊性癌ACC-2细胞的凋亡过程,其具体作用机制需要更多的实验结果的支持。
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