绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 31
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 603 条结果
[硕士论文] 阚智慧
药理学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:1.建立简便、灵敏的高效液相色谱法(HPLC)测定患者血浆样本中伏立康唑的浓度。2.采用伏立康唑检测试剂(酶放大免疫测定,Enzyme Multiplied Immunoassay Technique,EMIT)法测定患者血浆中伏立康唑的浓度。3.比较HPLC和EMIT两种方法测定伏立康唑血浆浓度结果的相关性,以期寻求一种更适合于临床伏立康唑浓度的测定方法。4.根据所测不同样本浓度数据,评价伏立康唑血浓度与患者治疗方案、联合用药等的相关性。
  方法:1.建立HPLC法测定人血浆中伏立康唑浓度,色谱柱为:Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相为:乙腈∶水(40∶60,V/V),在线脱气;流速为:1.0mL/min;柱温:25℃。血浆样本经过液液萃取处理,进样30μL进行分析,样本分析时间9min。
  2.采用EMIT法测定患者血浆中伏立康唑的浓度,伏立康唑血浆样本按一定其专属测定试剂盒处理后,注入西门子Viva-E全自动生化分析仪。
  3.患者血浆样本用HPLC法和EMIT法分别完成测定,测定结果进行相关统计学分析,以HPLC法的测定结果为自变量X,以EMIT法测定结果为因变量Y,使用SPSS17.0做线性回归分析,建立两测定结果的一元线性回归模型,评价两种方法的相关性;另外,对HPLC法和EMIT法测定的伏立康唑血浓度数据进行Bland-Altman和Pass-Bablok分析处理,进一步评价两方法测定数据的一致性。
  4.收集接受伏立康唑治疗患者的相关信息,疗效及不良反应发生情况,根据所测不同个体伏立康唑血浓度数据,深入分析并总结其血浓度与相关治疗方案、联合用药等的相关性,根据患者信息总结相关规律。
  结果:1.本课题所建立HPLC方法的专属性较强,血浆中内源性杂质对伏立康唑和内标艾司唑仑的测定均无影响,且伏立康唑血浆样品的稳定性良好,符合实验测定要求。伏立康唑血浆浓度在0.2-8μg/mL范围内的线性关系良好(R2=0.992330),最低定量限可达0.2μg/mL。在对该方法学的验证中,低、中、高(0.3、1.5和7.5μg/mL)三个质控浓度的点的日内、日间的准确度、精密度分别为89.6%-106.5%、95.8%-107.5%和86.7%-103.9%,RSD%为3.12-9.29、1.05-8.39和1.44-8.84,相对标准差均在±15%之内,方法的精密度和准确度良好。伏立康唑提取三个质控浓度水平的回收率平均值分别为:70.61%、73.13%和76.98%,内标艾司唑仑的提取回收率为86.92%。伏立康唑血浆样品提取后室温放置(8h),提取前室温放置(8h),-20℃冰箱内冷冻放置(1、3、7、14、20、41天)以及冻融(1、2、3、4次)的稳定性研究均符合规定。最终建立的方法学稳定准确灵活,可以进行临床研究中伏立康唑血浆样品的批量分析。
  2.HPLC和EMIT两方法测定伏立康唑血浓度结果的线性回归方程为y=1.071x+1.733,(R=0.713,p<0.001),因此可认为两种方法有较大的相关性。
  3.HPLC法测定伏立康唑血浆样本浓度范围为0.31-6.84μg/mL,平均值为4.01μg/mL,EMIT法测定患者的浓度范围为0.36-10.93μg/mL,平均值为6.03μg/mL;两种方法的95%的置信区间为-1.9-5.8μg/mL,说明两测定方法没有显著性差异,可认为两方法对伏立康唑血浓度测定结果的一致性良好。
  结论:1.本课题建立了测定血浆样本中伏立康唑浓度的HPLC法,此方法准确、高效、灵敏、可靠,满足临床患者血浆中伏立康唑浓度的测定要求。
  2.EMIT法测定患者伏立康唑血浓度,具有灵敏高效、简便快速、易操作,自动化程度高、样品所需体积量少等优点,适用于临床患者伏立康唑血浓度的常规监测。
  3.分析HPLC法与EMIT法测定的伏立康唑血浓度数据值,二者具有相关性和显著的临床一致性界限。EMIT法可以尝试作为常规的临床监测方法在临床上加以推广使用,这能够为医师对患者进行及时的诊断判定和开展伏立康唑个体化用药提供一定的科学支持和依据。
[博士论文] 王冬尧
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:尽管组合化学、超高通量筛选、后基因组计划、计算机技术的联合应用等多种技术快速发展,在药物研发的过程中仍然存在两个瓶颈,一是靶标生物大分子的确定和验证;二是具有生物活性小分子的设计和发现。本文主要关注第一方面,即其中的靶标分析方面。
  1.整合细胞膜色谱系统的构建及在VEGFR-2受体抑制剂靶标鉴定上的应用
  细胞膜色谱技术(cell membrane chromatography,CMC)是一种生物膜技术和色谱技术结合的分析方法,在一定程度上保留了细胞膜的生物学特征,可以模拟生理状态下生物活性小分子与其细胞膜上靶蛋白相互结合的过程。
  整合细胞膜色谱系统由多种细胞膜色谱模型、高效液相色谱、飞行时间质谱整合而成,其中,多种细胞膜色谱模型既相互补充,又相互验证,弥补了生物膜生命周期短、重现性差的内在缺点;高效液相色谱可以对复杂样品进行有效分离;飞行时间质谱可以准确鉴定其中每种组分,使得到的结论与常规的细胞膜色谱相比,更加真实、准确、可信。
  本部分应用SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC两种不同原发性肝癌的细胞膜色谱模型,构建了整合细胞膜色谱分析系统,并用于8个人工合成化合物的活性和靶点评价研究中,这8个喹唑啉类化合物是针对血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)进行设计合成的。在使用整合细胞膜色谱系统进行靶标验证的同时,也采用经典的激酶抑制方法测定了以上8个化合物对VEGFR-2的抑制率。结果表明,化合物在整合细胞膜色谱系统中的保留行为与激酶抑制率高低排序一致,即上述两种方法存在相关性。与分别测定每个待评价化合物样品的传统方法相比,整合细胞膜色谱系统可以直接分析含有多种样品的复杂体系,得到结论真实、可靠,同时,更加节约时间和成本,可成为药物研究中的一种实用分析方法。
  2.TCP-matrine探针的合成及在matrine靶标分析中的应用
  整合细胞膜色谱系统可以快速、有效地分析生物活性小分子与细胞膜蛋白质间是否存在相互作用,然而自然生物膜上含有成百上千种活性蛋白,小分子药物可能与多种受体存在协同结合,受到各种非特异结合因素的干扰,在没有其他关于可能结合靶标相关信息的线索下,很难鉴定、确证或排除某种膜蛋白作为潜在靶标的可能性,因此,将整合细胞膜色谱系统用于生物活性小分子结合靶标的准确鉴定和验证中,尚有困难,仍然需要其他更加深入、精细、直接的靶点鉴定技术的支持和配合,如基于亲和探针的靶点分析技术。
  三功能探针(tri-functional probe,TCP)是亲和探针的一种,是一种同时具有配体基团、光反应基团、标签基团三种功能基团的探针,是生物活性小分子靶标鉴定的有效手段。
  苦参碱(matrine)是一种天然生物碱,被发现具有抗肿瘤的活性,但其直接结合靶标和相关分子作用机制尚不明确,这也是阻碍将苦参碱进一步进行结构改造、活性增强、药物剂型改良等研究开发,最终成为临床一线治疗药物的众多障碍之一。因此,寻找并鉴定到苦参碱的直接作用靶标,意义重大。
  TC P-matrine探针是一个同时具有matrine、4-苯甲酸叠氮基、生物素的亲和探针,其中matrine作为配体基团,4-苯甲酸叠氮基作为光反应基团,生物素作为标签基团,与链霉亲和素构成生物放大系统,用于靶蛋白的纯化分析。本部分将TCP-matrine亲和探针用于matrine的靶点鉴定研究中,首次证明了膜联蛋白A2(annexin A2,ANXA2)是中药苦参中的活性成分苦参碱(同时也是一个有前景的抗癌药)的直接结合靶蛋白,通过抗体阻断实验和敲低表达实验进一步证实了ANXA2是苦参碱发挥抗迁移药效的关键分子,苦参碱可以有效抑制ANXA2介导的纤溶酶原(plasminogen,PLG)向纤溶酶(plasmin,PN)的生物转化,从而抑制肿瘤细胞的迁移。
  3.TCP-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用
  MLN8237是极光激酶A(Aurora Kinase A,AKA)的小分子选择性抑制剂,具有抑制细胞生长、发育,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移、侵袭等多种活性,Ⅰ期临床试验也表明MLN8237在恶性肿瘤方面具有较好的治疗作用,同时存在一定程度的不良反应,如恶心、呕吐、发热、贫血等,在理论上,MLN8237可能存在其他潜在靶蛋白。寻找并鉴定到小分子MLN8237的其他直接作用靶点,为阐明其作用机制,更全面地掌握该分子特性,最终实现其广泛的临床应用,具有重要的意义。
  在明确MLN8237构效关系的基础上,对其羧基部分进行结构修饰,首次合成了TCP-MLN8237探针,该探针含有MLN8237、4-苯甲酸叠氮基、生物素三种不同的功能基团,且探针与药物分子本身在促进细胞凋亡上没有明显差异。与对照探针(骨架相同但不含有配体基团MLN8237,只含有4-苯甲酸叠氮基、生物素基团的探针)处理组相比,经紫外光照射、磁珠纯化富集、凝胶电泳分离、银离子染色等操作后,只分离得到一个差异蛋白条带,经多级蛋白质谱技术分析鉴定,该蛋白为AKA,即目前公认的MLN8237的最强靶点,说明TCP-MLN8237探针是有效的,但由于探针为刚性结构,可能对配体基团与苴靶蛋白间相互结合过程有影响,仍然存在一些的局限,具有优化和改进的空间。
  4.DNA-MLN8237探针的合成及在MLN8237靶标分析中的应用
  在TCP亲和探针的基础上,将赖氨酸的刚性骨架更新为寡核苷酸链的柔性骨架,称为DNA亲和探针,由结合探针(binding probe,BP)与捕获探针(capture probe,CP)共同组成。
  本部分利用DNA亲和探针标记方法,合成了含有MLN8237的BP,含有4-苯甲酸叠氮基、荧光素的CP,经过BP(MLN8237)与靶蛋白结合、CP(4-苯甲酸叠氮基)与靶蛋白光交联、CP(荧光素)在聚丙烯酰胺电泳胶上成像的步骤,最终鉴定得到除AKA之外的7个潜在靶蛋白,在这些潜在靶蛋白分子中,对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen activated protein kinase,p38)和层粘连蛋白受体(laminin receptor,LAMR)进行了生物学验证,其中,MLN8237与p38亲和力约为8μM,相关生物学功能效应(促进细胞凋亡)可能被AKA所掩盖;MLN8237与LAMR亲和力约为1.8μM,可以部分解释其抗肿瘤迁移和侵袭的生物学功能,为更深入地理解MLN8237的药效、毒性、副反应提供有效信息,为全面评价MLN8237作为潜在临床候选药物提供进一步证据。同时,也说明,利用DNA亲和探针寻找小分子的靶点,是一种十分有效的分析方法。
[硕士论文] 李凯莉
生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:热原是一类在宿主体内可以引起发热和诱导炎症反应的异构类化合物。在临床上,热原是指能使哺乳动物产生热原反应的物质。热原按照来源分为外源性热原和内源性热原。外源性热原主要来源于机体外,分别为微生物(如细菌、病毒、真菌)与非微生物(如抗原、抗肿瘤药)性热原,内源性热原主要包括机体内的激素(如类固醇、前列腺素)与细胞因子(如肿瘤坏死因子、干扰素、生长因子、白介素)。使用热原污染的药品和医疗器械会引起系统性炎症,在最糟糕的情况下,则会引起败血性休克。因此,准确和快速量化热原对药品安全是至关重要的。到目前为止,家兔法、鲎试剂法和单核细胞激活试验检测法对于热原的检测都存在限制。在我们的研究中,我们致力于开发一种利用荧光素酶报告系统来灵敏、可靠、快速地检测热原的方法。
  先前的报道已经表明,细菌鞭毛蛋白可以通过Toll样受体TLR5刺激人肺泡上皮细胞产生细胞因子IL-8。然而,其他的热原物质是如何诱导激活肺上皮细胞还没有完全被阐释清楚。脂多糖(LPS,也被称为内毒素)作为最主要的热原,是细胞因子最有效的细菌诱导剂之一。在感染过程中,热原刺激人的单核细胞去合成或者释放炎症细胞因子,包括白介-1β,白介-6,肿瘤坏死因子-α。而NF-κB是调控编码这些促炎因子基因的主要转录因子。与此同时,人类β-干扰素(IFN-β)通过增强TNF依赖的TNF的产生,显著性增加了正常家兔对内毒素的发热反应,而且也恢复了致敏原耐受的家兔对内毒素的正常发热反应。鉴于此,我们把含有NF-κB应答元件或者IFN-β启动子的荧光素酶基因插入到慢病毒载体中,然后稳定转染到A549细胞中,再经过流式分选单克隆,最后利用荧光素酶报告系统来鉴定单克隆细胞的活性,从而构建出稳定的人A549荧光素酶报告细胞系。
  我们的结果表明几株NF-κB单克隆稳定细胞对0.1EU/mL的内毒素响应,而这是少于人的发热阈值0.3EU/mL内毒素的。我们进一步使用灵敏度为0.125EU/mL的鲎试剂与报告细胞比较,这是药物中广泛使用的鲎试剂灵敏度,以评估相同条件下的热原,结果显示报告细胞达到了鲎试剂检测法同等的灵敏度。此外,我们进一步研究报告细胞发现,和原始的A549相比,报告细胞克隆在低浓度内毒素刺激下就能被激活并上调TLR4的表达。这些结果表明以人肺泡上皮细胞为基础的报告实验对于进一步开发可替代的热原检测方法很有潜力同时也是可行的。因此,稳定的荧光素酶报告细胞很有可能进一步发展成为一种既快速又灵敏的热原评估方法。
[硕士论文] 黄银银
公共卫生 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:恶性肿瘤,其主要危害是侵袭相邻组织或向远端脏器转移并破坏侵袭,致机体衰亡。癌症产生的主要特征是正常的细胞周期和凋亡调节失控。由于各类癌症的病程发展速度都很快,从目前的临床实践来看,大多数癌症患者发现后为晚期,治疗难度大,预后的结果不理想。因此,癌症的治疗是全球医学界面临的重大问题。化学药物治疗在现代肿瘤内科治疗中具有很重要的作用,目前大部分化疗药物在临床上仍然作为一线药在使用。但是,由于这些化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞均有抑制或杀伤作用,导致化疗的副作用令人难以承受,患者大多不得不使用化学药物治疗以延续生命,但并未从根本上改善患者生活质量。
  随着分子生物学、基因工程的飞速发展和肿瘤发生发展分子机制的深入研究,抗肿瘤药物的研发也进入了一个新的阶段,出现了生物技术抗肿瘤药物,因其针对性强、多靶向性、疗效好、不良反应小等特点成为目前发展最快的抗肿瘤药物研发方向之一,例如单克隆抗体。
  在对于单克隆抗体蛋白一级结构分析中,肽图分析方法起到至关重要的作用。建立了重组单抗药物的肽图分析方法。在变性条件下向抗体溶液加入还原剂,打开抗体内部所有交联的二硫键,再加入烷基化试剂封闭所有的自由筑基,使抗体分子在溶液中以游离伸展肽链的形式存在。加入胰蛋白酶,将充分伸展的肽链酶解成小的肽段。用反相高效液相色谱层析分析肽图谱。通过本试验的开发出的肽图分析方法实用有效,适于进行重组单抗等结构复杂的大分子蛋白药物的肽图检查分析。
[硕士论文] 肖梦杰
药剂学 湖北中医药大学 2017(学位年度)
摘要:环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂是以喹诺酮类药环丙沙星结合糖皮质激素类药地塞米松的耳用无菌混悬滴耳液,每mL混悬滴耳液中含有盐酸环丙沙星3.5mg(相当于环丙沙星3mg)、地塞米松1mg及防腐剂苯扎氯铵0.1mg,其他辅料分别为氯化钠、羟乙基纤维素、泰洛沙泊、醋酸、醋酸钠、硼酸、依地酸二钠、氢氧化钠/盐酸(pH调节剂)、纯化水。我们对环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂进行了以下相关的研究工作:
  首先我们对环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂进行了处方工艺研究,筛选出合适的防腐剂、助悬剂和表面活性剂等,并对羟乙基纤维素、泰洛沙泊等的用量进行筛选。通过对混悬滴耳剂的性状、pH值、黏度、渗透压、粒度分布、体积沉降比等指标进行考察,并最终确定了最佳处方和处方工艺。
  其次我们对环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂进行了系统的质量研究:参考环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂的美国药典标准、环丙沙星和地塞米松原料药的中国药典标准,我们对环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂进行了系统研究。考察环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂的性状、鉴别、pH值、渗透压、粒度、微生物限度、有关物质、主药含量及防腐剂含量等指标,我们选用高效液相色谱法分别测定两种主药及防腐剂的含量和两种主药的有关物质,对含量和有关物质的测定方法进行了方法学研究,并建立了一系列控制环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂质量的检测标准。为担保临床用药安全、有效和质量可控提供了实验依据。实验结果显示,按照拟定的质量标准,我们研制的环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂的各项考察指标均符合要求。
  最后我们对环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂进行了初步的稳定性研究。稳定性研究是质量研究中不可或缺的一个部分,是研究药物随温度、湿度和光照的变化随时间变化的趋势,本实验从影响因素、加速试验和长期试验三个方面对环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂进行初步考察,实验结果显示,环丙沙星地塞米松混悬滴耳剂中两主药的杂质均略有增长,应选择在避光,阴凉处贮藏。
[硕士论文] 周星彤
药物分析学 青岛大学 2017(学位年度)
摘要:仿制药是非原创性药物,其完全仿制原研药的主成分,要求在有效成分、剂型和给药途径上与原研药一致,最关键的是仿制药必须要与原研药具有生物等效性。我国是一个仿制药生产和使用大国,但我国生产的仿制药绝大部分都达不到原研药效。在这种形势下,国家提出并开始实施一致性评价任务。本次实验的品种,硝苯地平(Nifedipine),最先由Bayer公司研发并上市,其生产的Adalat硝苯地平缓释片,是市场占有率最高的硝苯地平制剂。目前国内有7家企业在仿制Adalat,其仿制药的市场销售量巨大,但药效不尽如人意。
  本实验主要是针对国产仿制药硝苯地平缓释片Ⅱ进行仿制药质量一致性评价工作。通过建立一个完整的体外一致性评价方法,包括安全性、等效性和质量工艺的评价,将仿制药同参比制剂进行比较,评价部分市售的硝苯地平缓释片Ⅱ是否达到等效性。
  安全性评价,主要对制剂中有关物质及杂质进行评价。选用的方法为高效液相色谱法,经过方法学验证,该方法灵敏、准确,适合硝苯地平缓释片Ⅱ中有关物质的测定。检测结果显示,参比制剂和国产仿制药的有关物质都在质量标准范围内,但国产仿制药的有关物质总量偏高。
  等效性评价,通过测定体外溶出行为来考察药物的等效性,作为一致性评价的参考数据。选用日本橙皮书中规定的pH1.2、pH4.5、pH6.8和水四种溶液作溶出介质,并添加0.3%的吐温80做表面活性剂。溶出的含量测定方法选用高效液相色谱法。取样时间延长至24h,最终绘制4条不同pH的溶出曲线,并比较相似度。经过验证,该方法稳定、准确,适合硝苯地平缓释片Ⅱ的溶出曲线测定。检测结果显示,一批仿制药的溶出曲线全部与参比制剂不相似,另外一批仿制药的溶出曲线与参比制剂相似,但相似度不高。
  质量工艺评价,通过测定原料药的晶型和制剂的含量来评价。晶型测定选用 X射线粉末衍射作为检测方法,测定了3批原料药、参比制剂和国产仿制药制剂。最终初步推断参比制剂可能选用了与这3批原料药不同晶型的原料药来生产。含量测定方面,选用了高效液相色谱法,最终结果显示国产仿制药的含量与参比制剂相似,控制的比较好。
  通过上面3个大方面的评价,得出的结论是国产仿制药在含量方面与参比制剂相似,有关物质方面也符合标准规定,但体外的等效性却达不到要求,即使是溶出曲线相似的仿制药,也存在相似度不高的现状。这也就是我国仿制药都能达到药典质量标准要求,但却达不到原研药效的原因。我国的仿制药只是简单粗劣的仿制了原研药的表面指标,却没有从制剂工艺上剖析原研药,最终的结果就是药效差,达不到等效性。
  我国的仿制药存在的问题很多,要想真正的提高仿制药质量水平,就必须严守等效性这个标准,淘汰达不到药效的劣质仿制药,将市场资源集中到高质量优势产品上来,真正意义上实现制药的集中化,最终形成一些具有竞争力和创新力的药企,增强我国制药企业在国际市场上的竞争力。
[硕士论文] 王倩
药理学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:脱靶效应的评估对核酸酶应用于人类基因治疗中至关重要。本课题运用蓝白筛选技术,建立CRISPR/Cas9剪切效率的原核评估系统,并利用该系统评估PAM位点处碱基突变时对其效率的影响,以及探讨不同个数及位置的碱基突变对CRISPR/Cas9靶效应及脱靶效应的影响。同时,通过白变蓝实验,评价EGFR突变相关gRNA的活性。
  方法:在探讨PAM位点处对CRISPR/Cas9效率的影响中,分别将PAM位点处碱基突变的靶点克隆至PMD19-T载体的LacZ区,保持原有阅读框编码状态,在X-Gal和IPTG诱导下,上述载体转入E.coli可产生蓝色菌落。通过共转靶点和含对应gRNA的CRISPR载体,观察菌落的颜色变化及结合溶菌实验定量分析CRISPR/Cas9效率。为了在序列水平反映CRISPR/Cas9的效率,构建含HBV双重复片段的载体,将靶点序列插入重复片段之间,使待测靶序列和双重复片段均位于LacZ区内,并使阅读框发生移码突变,但当双重复片段重组后,其阅读框可恢复编码。通过菌落白变蓝的颜色变化以及结合测序技术,验证CRISPR/Cas9的剪切效果。
  在探讨不同个数及位置的碱基突变对 CRISPR/Cas9脱靶效应影响中,分别将含有1-3个且不同位置碱基突变的靶序列克隆至PMD19-T载体的LacZ区,保持其阅读框处于编码状态。利用上述所建立的原核评估体系,通过观察共转后所产生的颜色变化以及溶菌之后蓝白菌落的比例,分别比较了七个突变载体的靶效应及脱靶效应。
  利用已构建原核系统中的白变蓝方法评估非小细胞肺癌EGFR基因15del突变的相关靶点效率。分别将以NGG,NGA及NAG为PAM位点的靶点序列插入HBV双重复片段载体中。将与这三个靶点配对的gRNA分别插入pCas9载体中。通过共转两种载体,观察所产生的的蓝色菌落数量,对三个靶点的效率进行定量分析,并通过后续的测序结果进一步验证剪切的发生。
  结果:在探讨PAM位点处碱基突变对CRISPR/Cas9脱靶效应的影响中,当靶序列与gRNA完全配对时,共转后菌落均呈白色;当完全不配对时,共转后菌落则呈蓝色。实验结果表明NAG可作为一种潜在的PAM位点,并仍有一定的酶活性。当对PAM位点进行单碱基突变时,NNG和NGN两类突变靶点剪切效率明显降低;当对PAM位点NGG中的两个碱基G分别进行突变时,CRISPR/Cas9虽仍具有部分剪切活性,但其效率仅剩NGG时的五分之一。由于靶点PAM位点处均含有突变,故此时的剪切活性即为脱靶效应。当含有 PAM位点突变靶点的 HBV重复片段载体与对应的gRNA共转时,均有蓝色菌落产生,且蓝色菌落的数量与溶菌结果大体一致,测序结果同样也验证了CRISPR/Cas9剪切效应。
  在探讨不同个数及位置的碱基突变对 CRISPR/Cas9脱靶效应的影响中,将含有不同靶点的载体与其对应的 gRNA载体共转后,菌落颜色呈现了由白至蓝的梯度变化。突变碱基的个数越多,其菌落的颜色越蓝。后续的溶菌实验也同样表明,突变的碱基个数越多,剪切后的菌落蓝色越深,其剪切效率越低,脱靶效应也越低,即剪切效率与突变碱基个数成负相关。
  在评估非小细胞肺癌EGFR基因15del突变的相关靶点效率中,NGG型PAM位点与对应的 CRISPR/Cas9载体共转后,其产生的蓝色菌落最多,靶效率最高;而在NAG型和NGA型中,靶效率明显下降。比较这两种类型的靶点可发现,NAG型的靶点其剪切效率明显高于NGA型,此实验结果也验证了第一部分的实验结果。
  结论:本课题以蓝白筛选为基础,构建了 CRISPR/Cas9靶效应及脱靶效应的原核评估体系,为快速高效地检测核酸酶活性提供了一种新方法。并成功利用该体系比较了不同碱基突变对CRISPR/Cas9酶活性的影响,以及将该评价体系用于针对EGFR一个热点突变相关gRNA的筛选,为将来在人类疾病的基因治疗中更充分的了解靶点的选择提供了理论依据。
[硕士论文] 刘婧
内科学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2017(学位年度)
摘要:肉毒毒素(BoNT)是由肉毒梭菌在厌氧的情况下,产生的神经外毒素,依据毒素抗原性的不同,分A~G七个亚型,其中以A型的毒性最强,是生物毒素和化学毒物中毒性最强的物质,引起的临床症状也远远重于B型和E型。A型肉毒毒素现已被广泛应用于眼睑痉挛、面肌痉挛、脑瘫、整容除皱、瘦腿瘦脸等神经肌肉阻滞功能的治疗,多汗症、胃失弛缓症等自主神经系统功能紊乱的治疗以及偏头痛、慢性疼痛等感觉神经功能的治疗。
  随着经济和社会的飞速发展,人们对美容的需求也越来越多。最近几年,使用肉毒毒素美容除皱、瘦腿瘦脸的爱美女士也越来越多。目前用于市场上的品牌有国外的Botox(保妥适,美国Allergen公司)、Dysport(英国Ipsen公司)、Myobloc(美国 Elan公司)以及国内BTXA(中国衡力)等。在我国,批准上市的用于肉毒毒素治疗疾病及美容目的的,只有美国的Botox(保妥适)和中国兰州生物制品研究所有限责任公司生产的衡力。Botox的治疗作用有颈部肌张力障碍、严重的原发性腋窝多汗症、神经源性逼尿肌过度活动、膀胱过度活动症、斜视、睑痉挛、慢性偏头痛、上肢痉挛。BTXA的治疗作用有眼睑痉挛、面肌痉挛的成人患者;急性麻痹性、内分泌肌病所引起的斜视和无法手术治疗12岁以上患者的斜视;暂时性改善65岁以下的眉间纹。但在这类肉毒毒素制品的使用过程中,也出现了一些中毒的案例,主要由注射剂量过大、注射部位药物不适当的弥散作用引起,不同程度的出现了眼睑痉挛、视物模糊、上睑下垂、饮水呛咳、吞咽困难、构音障碍、发声困难、肌力减退甚至呼吸困难等症状。
  当肉毒毒素作为一种商业用的生物制剂,对其活性的研究尤为重要。生物制品普遍采用质量和活性两种表示方法,即单位质量的生物制品中所含有的生物学活性,反映活性组成比具体情况。本研究目的是研制一种方便易用的胶体金试纸条,基于金属锌的酶切反应动力学及免疫反应原理来检测肉毒毒素的活性。检测的原理为BoNT/A掺杂的血清样品和特别设计的底物肽在孵育一段时间后,可将特异性底物肽酶切从而使氨基端的生物素与羧基端的组氨酸标签分离,使得标记胶体金颗粒的链霉亲和素-底物肽复合物不能被层析试纸条的检测线上包被的抗组氨酸标签抗体捕获,从而呈现出一个不同于BoNT/A阴性血清的结果。
  首先我们进行了 A、B型肉毒梭菌的人工培养。将 A型肉毒梭菌菌种接至TPYG液体培养基,进行肉毒梭菌的人工增菌培养。在37℃的厌氧温箱中培养48 h后,将获得的新鲜培养液接种至1 L的TPOM培养基进行产毒培养。用硫酸溶液沉淀抽提,得到粗毒。然后用硫酸铵沉淀,去除核酸。最后用凝胶柱和离子交换柱进行精制纯化。对纯化的肉毒毒素进行蛋白定量后用小鼠毒力试验来测定毒素的生物学活性。B型肉毒梭菌的培养、肉毒毒素纯化、定量及生物学活性鉴定同A型肉毒毒素,但没有精制步骤。由此而得到的A、B型肉毒毒素用于掺杂模拟临床血清样本。
  然后设计 A型肉毒毒素底物序列如下: N端生物素化-TRIDEANQRATKM-6×His-Tag。该底物肽包含三个部分:N端生物素标签、A型肉毒毒素特异性底物肽序列和组氨酸标签。其中Q-R为BoNT/A特异性切割的位点。当BoNT/A对肽段发生作用时,作为肽链内切酶,会引起肽链断裂,从而产生含有不同生物标签的肽段,从而在胶体金试纸条上呈现不同的显色模式。将抗His标签单克隆抗体、抗链霉亲和素单克隆抗体分别作为T线和C线,胶体金包被的链霉亲和素作为探针按常规的制备方法制成层析试纸条后,我们对T线浓度、底物肽最小剂量、毒素和底物肽在体外孵育时间进行了优化。根据优化结果, T线浓度为1 mg/mL;特异性底物肽的优化剂量为1 ng/μL;毒素和底物肽的体外孵育时间为12 h。此外,我们用空白对照血清、B型肉毒毒素掺杂的模拟血清和不同稀释度的A型肉毒毒素掺杂的模拟血清对试纸条的特异性及灵敏性进行了评估。根据实验的结果,胶体金层析试纸条的最低检测限可达到1.3 LD50/mL,约为20 pg/mL,灵敏度与金标准的小鼠致死实验相当,但检测时间从4天减少到12 h。
  本研究建立的方法样本和试剂消耗量少,检测流程短,操作简便易行,更适于在基层医疗机构和资源有限的偏远地区使用。通过检测活性肽酶的含量并优化酶联信号放大的反应条件,使针对有活性的A型肉毒毒素的检测较之前实验室使用的方法更加精确。在我国,肉毒中毒事件常集中发生在经济欠发达地区,交通的不便与专业设备的欠缺给肉毒中毒的诊断和救治带来很大的困难。该检测方法的建立可以有力的缓解上述地区感染肉毒中毒后的误诊及漏诊,提高诊治率。而且通过设计毒素特异性的底物肽的思路,该方案也可扩展用于其余血清型肉毒毒素的检测。此外,A型肉毒毒素目前被一些国际恐怖势力和极端组织用来制造恐慌,被列为最有可能使用的生物恐怖剂之一,因此研究它的检测对国防、军事也有着重要意义。我国现有的检测手段费时费力、成本高且需要具备专门知识的专业人员在设施齐备的专业实验室内进行。设计、开发一个快速、灵敏、方便易用的现场检测方法用于肉毒毒素的诊断和鉴定对我国的肉毒中毒,特别是目前尚无定论的婴幼儿肉毒中毒和食品安全保障体系的完善具有重大的现实意义和战略意义。
[硕士论文] 伏为峰
控制工程 桂林电子科技大学 2017(学位年度)
摘要:药品对人民的健康生活至关重要,然而当今社会假药泛滥,严重影响了人们的生命财产安全,为此真假药鉴别技术在药品监管领域有着极其重要的实用价值。近红外光谱分析技术有着快捷、绿色、无损等优点,目前已经广泛地应用于各个领域,在药品鉴别领域也取得飞速的发展。
  然而,在近红外光谱(NIRS)药品鉴别中,由于近红外光谱往往特征维数较高,传统的特征提取方法在处理高度复杂的特征时往往比较乏力,缺乏良好的特征提取效果;同时近红外光谱药品鉴别具有显著的代价敏感性,以传统的非代价敏感方法进行药品鉴别也不科学。
  鉴于此,针对近红外光谱特征往往高度复杂的问题,本文提出了基于深度信念网络与随机森林(DBN-RFS)的药品鉴别方法,结合了深度学习在特征提取阶段展现出的优势与传统分类器良好的分类能力。首先采用深度信念网络对高维数据特征进行非线性特征提取,取DBN隐含层中最后一层的全部特征,加上随机抽取的倒数第二层的部分特征,作为随机森林的输入数据。并通过以不同活性物质浓度药品的NIR光谱数据、琥乙红霉素等药品的NIR光谱数据、多潘酮片NIR光谱数据等进行实验验证,三种样本集实验表明,DBN-RFS在分类问题中具有良好的性能,并且随着数据特征维数的上升,DBN-RFS越发显示出深度信念网络在高度复杂的特征下进行特征提取的优越性。
  同时,针对近红外光谱药品鉴别问题的代价敏感性,本文提出一种代价敏感的深度信念网络(CS-DBN)算法,先以原始数据预训练 RBM,在反向微调阶段,将评价准则由最小错分误差改为最小错分代价。并通过以不同活性物质浓度药品的NIR光谱数据、琥乙红霉素等药品的NIR光谱数据、多潘酮片NIR光谱数据等进行实验验证,三种样本集实验表明,基于最小误分类代价的深度信念网络能够体现出良好的代价敏感特性,可以很好的应用于代价敏感问题的分类。
[硕士论文] 王秉鹏
中药学 甘肃中医药大学 2017(学位年度)
摘要:本论文以分离制备马铃薯茎叶中具有重要药用价值的医药原料—茄尼醇的工艺研究为目标,分别开展了对马铃薯茎叶中茄尼醇的提取分离研究、马铃薯茎叶提取前处理研究、茄尼醇酯皂化工艺的研究和测定不同品种马铃薯在生长期内茎叶中茄尼醇含量变化规律的研究,主要研究内容包括以下方面:
  1、茄尼醇提取工艺研究。以浸膏得率和茄尼醇提取率作为考察指标,分别考察了甲醇和95%乙醇作为提取溶剂时,冷浸提取、加热回流提取和超声提取等三种不同提取方法对茄尼醇提取效率的差异,并对提取次数和提取时间等参数进行了优化。最终得到了马铃薯茎叶提取茄尼醇的最佳工艺参数条件:95%乙醇加热回流提取2次,每次1.5h。在此条件下,茄尼醇的提取率为96.86%;同时,为了降低成本,又考察了不同浓度乙醇对茄尼醇提取率的影响,结果表明,用80%乙醇提取茄尼醇后茄尼醇提取率与95%提取差异不大,但其浸膏得率较高,不利于后期茄尼醇的精制,可在后期茄尼醇皂化时利用此溶剂系统。
  2、马铃薯茎叶提取前处理研究。分别研究了运用酶解法和高速剪切技术对马铃薯茎叶进行前处理后对茄尼醇提取效率的影响。研究结果表明:使用纤维素酶对马铃薯茎叶酶解破壁处理后,茄尼醇提取率可达到91.38%,远高于不进行酶解时的79.98%,浸膏得率也仅为8.02%,明显低于不进行酶解时的23.29%。
  3、茄尼醇酯皂化工艺研究。以马铃薯茎叶提取液的浓缩液为研究对象,进行了提取液中茄尼醇酯皂化为游离茄尼醇的工艺研究。通过对皂化溶剂的筛选,皂化溶剂浓度、皂化温度、皂化时间等工艺参数条件的优化筛选,最终确定了最佳皂化条件:用NaOH作为皂化溶剂,NaOH浓度0.75moL·L-1,皂化时间0.5h,皂化温度40℃。在此优化的条件下,提取液浓缩液中茄尼醇的质量提高了77.82%。
  4、同步提取、皂化马铃薯茎叶中茄尼醇研究。以加入含0.75moL·L-1 NaOH的80%乙醇、石油醚为提取溶剂,同步提取皂化马铃薯茎叶茄尼醇。结果表明,石油醚同步提取、皂化茄尼醇效果优于80%乙醇,且其浸膏得率也较80%乙醇略低;但由于石油醚沸点低,沸程长且易挥发,因此在适宜的设备条件下,可用于工业化提取茄尼醇;NaOH固体不溶于石油醚(60~90℃),其作用机理尚不明确。
  5、不同品种马铃薯在生长期内茎叶中茄尼醇含量考察研究。以宁夏固原同一马铃薯种植基地不同品种的马铃薯为研究对象,分别采收其不同生长时期的茎叶,测定其中茄尼醇含量,为筛选马铃薯茎叶提取分离茄尼醇原料提供研究基础。研究发现在马铃薯块茎增长期,其茎叶中茄尼醇含量最高,之后茄尼醇含量又逐渐下降。
  本文的创新性研究工作主要体现在:
  (1)建立了一个提取马铃薯茎叶中茄尼醇的工艺,95%乙醇(工业生产可用80%乙醇)加热回流提取2次,每次1.5h;
  (2)考察了不同前处理方法对茄尼醇提取效率的影响,确定采用50mg·mL-1的纤维素酶溶液酶解3h效果最佳;
  (3)建立了将提取物中茄尼醇酯皂化成游离茄尼醇的工艺,并筛选优化了皂化的相关参数,为提高游离茄尼醇含量提供了理论依据;
  (4)研究用石油醚同步提取、皂化茄尼醇,为工业上提取茄尼醇提供理论依据;
  (5)测定了不同品种的马铃薯在各个生长时期茎叶中茄尼醇含量,为茄尼醇的提取原料储备提供数据支撑。
[硕士论文] 牛浩
生物化学与分子生物学 华侨大学 2017(学位年度)
摘要:微生物燃料电池是利用微生物将有机的化学能转化成电能的装置,具备构造简单、成本低廉、环境友好等特点。因此,微生物燃料电池作为一种新型的传感器在环境、医药等领域,引起了普遍的关注。由于其传感特性受限于产电性能,因此,如何增强产电性能成为研究微生物燃料电池的关键要素。
  微生物燃料电池的产电性能主要取决于电子的传递速率,而电子从微生物传递至电极表面的阻力是影响电子传递速率的重要因素。阳极作为微生物燃料电池中直接与产电细菌接触的重要部件,其材料的性质与表面结构直接影响了细菌的吸附量、电子传递效率和氧化反应情况等,决定着微生物燃料电池的产电性能。本文采用层层自组装技术,制备不同纳米结构材料修饰阳极,研究其对微生物燃料电池产电性能的影响。在此基础上,构建基于微生物燃料电池的生物传感器用于抗生素检测。主要研究内容有:
  1.采用层层自组装技术,在ITO电极表面修饰聚电解质碳纳米管/聚烯丙基胺的盐酸盐,增大了电极的比表面积。实验结果表明,修饰后的电极明显提高了电池的产电性能,微生物燃料电池的电流密度由0.266μA/cm2提高到3.87μA/cm2,功率输出密度由4.63mW/m2增加到5.98 mW/m2,能够有效地促进希瓦氏菌电子传递效率。
  2.采用层层自组装技术,在ITO电极表面修饰了碳纳米管/聚苯胺复合多层膜。研究不同修饰层数对微生物燃料电池产电性能的影响。研究结果表明,基于(CNTs/PANI)12-ITO电极的微生物燃料电池的功率密度比空白ITO电极电池提高了29.1%。
  3.构建基于(CNTs/PANI)12-ITO电极的微生物燃料电池生物传感器,以E.coli25922作为传感接收元件,考察传感器对不同浓度庆大霉素的响应情况。研究结果表明,传感器最低检测限为0.25mM。
[硕士论文] 刘俊杰
药剂学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:1.建立测定人血清中水溶性维生素B1、B2、B6和B9的高效液相色谱-质谱顺谱联用法并验证。
  2.比较高效液相色谱-质谱/质谱联用法和电化学分析法用于临床常规测定患者血清中维生素浓度结果的相关性与一致性。
  方法:1.齐鲁医院常规送检患者血清经乙酸乙酯萃取。色谱条件;Venusil XBP-C18色谱柱(150×4.6 mm,3μm,100 A)。柱温30℃,流动相5mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇(40∶60,v/v),流速0.5 mL/min。质谱条件:ESI离子源,正离子模式检测;干燥气温度为350℃,干燥气(N2)流速9.0 L/min,干燥气压力40 psi,毛细管电压4000 V,全扫描设定范围为m/z150-700。维生素B1、B2、 B6、 B9和内标碎片电压分别为100V、140V、100V、110V和130V,碰撞能分别为8eV、25 eV、11 eV、10 eV和25 eV。扫描方式为多反应监测(MRM)。维生素B1、B2、B6、 B9和内标用于定量的母离子-子离子对分别为m/z265→122.1、377→244、170→152、442.2→295.8、195.1→137.8。EMV为200V。采用液液萃取法萃取出血清中的维生素后,进行方法学的考察与验证。采用所建立方法,测定患者常规送检血清样本。
  2.电化学分析法:同一患者血清样本,按照规定程序操作,采用LK3000V维生素检测仪测定人血清维生素B1、B2, B6和B9的浓度。取适量的患者待测血清加入到样本处理液中,电极经过预处理后进行检测。维生素B9的检测需要电极处理后再按电极活化步骤进行电极活化。
  3.患者血清样本分别用高效液相色谱-质谱/质谱(HPLC-MS/MS)法和电化学分析法(LK3000V维生素检测仪)测定,测定结果进行统计分析。统计学处理采用SPSS19软件和MedCalc16.2.0软件。以HPLC-MS/MS法测定值作为自变量X,以电化学分析法(LK3000V维生素检测仪)测定值作为因变量Y,建立一元线性回归模型并评价相关性。运用Bland-Altman法并制图分析两种方法所测维生素B1、B2, B6和B9值的一致性。
  结果:1.维生素B1、B2、B6、B9线性范围分别为1-200 ng/mL、5-40 ng/mL、1-80ng/mL和5-40 ng/mL;r2值分别为0.9916、0.9968、0.9922和0.9914;最低定量限分别为1 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL,5 ng/mL;批内、批间RSD均小于8.5%。维生素B1、B2, B6、B9,咖啡因(内标)基质效应分别71.82%、69.94%、70.91%、61.20%、81.42%;绝对回收率分别29.01%、69.39%、63.22%、26.21%、63.79%。配制低、中,高浓度维生素B1、B2、B6和B9血清样本,室温放置6h、-20℃冷冻放置1天和7天及冻融1次和处理后血清样本室温放置20h,准确度为89.8%-107.7%,RSD小于10%。结果表明,维生素B1、B2、B6和B9稳定性良好。
  2.运用电化学法测定160份患者血清中维生素B1、B2、B6和B9的浓度结果。电化学法测得维生素B1、B2、B6和B9血清浓度均值分别21.44±5.26、6.50±0.80、12.36±3.54,5.59±1.49。
  3.采用统计软件处理HPLC-MS/MS法与电化学法测定数据。建立一元线性回归模型可得:B1∶y=1.145x-2.741,n=160,决定系数r2=0.965;B2∶y=0.923x+1.091,n=160,决定系数r2=0.956;B6∶y=1.006x+0.391,n=160,决定系数r2=0.901;B9∶y=1.084x-2.241,n=160,决定系数r2=0.978.由计算结果可见,HPLC-MS/MS法测定值与电化学分析法测定值呈正相关关系,相关程度较高。运用Bland-Altman法并制图分析两种测定方法一致性,维生素B1、B2, B6和B9的95%一致性界限分别为-2.00~2.70,-0.29~1.00,-1.70~2.60,-2.12~-1.15 ng/mL。结果表明HPLC-MS/MS法与电化学法测定人血清维生素B1、B2, B6和B9的测定值具有较好的一致性。
  结论:1.所建立的HPLC-MS/MS法灵敏度高,方法准确,结果可靠,可用于常规送检患者血清水溶性维生素B1、B2、B6和B9测定。
  2.电化学法测定人血清中水溶性维生素B1、B2、B6和B9,具有方便快捷,简便易操作,灵敏度高等优点,适用于临床血清中维生素浓度的常规测定。
  3.本研究建立了金标准HPLC-MS/MS测血清中水溶性维生素浓度的方法,并与电化学法进行相关性、一致性分析。HPLC-MS/MS法与电化学法测定人血清4种维生素的测定值具有显著相关性,并且一致性较好。提示电化学法用于水溶性维生素B1、B2、B6和B9临床常规检测的准确性和实用性。电化学法(LK3000V维生素检测仪)已常规用于临床检测患者血清中维生素的浓度。
[硕士论文] 石海英
制药工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:目的:1.建立复方酮洛芬缓释奥美拉唑肠溶微丸胶囊含量测定的方法;2.建立复方酮洛芬缓释奥美拉唑肠溶微丸胶囊溶出度测定的方法,并对自制样品和参比制剂的溶出曲线进行比对;3.酮洛芬缓释微丸和奥美拉唑肠溶微丸有关物质的研究;4.建立复方酮洛芬缓释奥美拉唑肠溶微丸胶囊的质量标准。方法:1.采用HPLC法测定复方酮洛芬缓释奥美拉唑肠溶微丸胶囊含量;2.采用篮法每分钟100转为溶出方法,先盐酸溶液后缓冲液为溶出介质,HPLC法为测定方法,采用多种介质对自制样品和参比制剂的溶出曲线进行了比对;3.采用HPLC法测定酮洛芬缓释微丸和奥美拉唑肠溶微丸的有关物质;4.进行了初步的稳定性研究。结果:1.含量测定中,酮洛芬在139.93μg·ml-1~259.87μg·ml-1范围内线性关系良好,r=0.9999,中间精密度RSD为1.01%(n=12),平均回收率为98.6%;奥美拉唑线性范围为14.08μg·ml-1~26.14μg·ml-1,r=0.9998,中间精密度RSD为0.97%(n=12),平均回收率为99.5%。2.溶出度测定中,酮洛芬在2.29μg·ml-1~229.09μg·ml-1范围内线性关系良好,r=1.0000,平均回收率为98.5%,,中间精密度RSD为1.03%(n=12);奥美拉唑在0.24μg·ml-1~23.62μg·ml-1范围内线性关系良好,r=0.9999;平均回收率为99.3%,中间精密度RSD为1.67%(n=12);自制样品和参比制剂在不同的溶出介质中的f2因子均大于50。3.酮洛芬缓释微丸有关物质的检测方法中流动性、柱温、色谱柱的改变对检测均无影响,酮洛芬与杂质有较好分离,辅料不干扰测定,酮洛芬及7个已知杂质的回收率和线性均良好。4.奥美拉唑肠溶微丸有关物质的检测方法中流动性、柱温、色谱柱的改变对检测均无影响,检测限低,奥美拉唑与杂质分离良好,辅料不干扰测定,奥美拉唑及6个已知杂质的回收率和线性均良好。5.根据稳定性研究结果制定了贮存条件。结论:1所建立含量测定的方法专属性强、重现性好,检测时间短,耐用性强,测定结果准确、可靠。2.所建立的溶出度测定方法操作简便;测定结果准确可靠;可同时满足测定肠溶和缓释两种制剂形式;各批自制样品在不同的溶出介质中与市售样品的溶出行为一致,相似度较好,为两者在体内生物利用度的一致性提供了初步保障。3.酮洛芬缓释微丸和奥美拉唑肠溶微丸有关物质的检测方法均专属性强、灵敏度高、重现性好,方法准确、简便。4.所建立的质量标准能够反映本品的质量变化,为复方酮洛芬缓释奥美拉唑肠溶微丸胶囊的质量控制提供了有效的分析标准。
[硕士论文] 郭庆丽
药学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:药用辅料在药品中占据很大的质量比例,是药品中的重要组成部分之一,在制剂中主要用作填充剂、粘合剂、崩解剂、载体材料等。药用辅料的加入有利于原料药加工成药品,提高药品的稳定性和病人的顺应性,改善药品贮藏时的安全性与有效性。因此,药用辅料的质量是影响药品质量的关键因素。在药品生产过程中,首先要对药用辅料进行质量检测,以确保其质量符合投料要求。2010版药品生产质量管理规范已经明确规定,要采取核对或检验等措施,确认每一包装内的原辅料正确无误。这就对药品生产企业提出了更高要求,需要采用一种快速、准确的分析方法来满足需要。近红外光谱分析技术(Near Infrared Spectroscopy,NIRS)以其快速、方便、不破坏样品等优势成为药品生产过程中原辅料的质量分析的一种重要工具。
  本研究主要采NIRS快速鉴别药品生产过程中常用的两大类药用辅料,即淀粉类与纤维素类药用辅料。以羟丙甲纤维素(Hydroxypropyl methylcellulose,HPMC)为特征辅料,鉴别不同生产厂家、不同粘度的HPMC,并对HPMC的关键质量指标进行定量分析。为药品生产过程中药用原辅料的快速质量分析提供理论基础。
  本研究具体内容如下:
  (1)基于NIRS的淀粉类、纤维素类药用辅料的定性分析
  本研究以药物制剂生产中常用的淀粉类、纤维素类药用辅料为研究对象,分别采用AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪与Micro NIR1700微型近红外光谱仪建立淀粉类、纤维素类辅料的定性判别模型。本研究首先采用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)对淀粉类与纤维素类这两大类辅料进行聚类分析,然后再单独对每一大类辅料进行PCA分析,分析过程中,对于用PCA无法聚类的辅料,采用偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminantanalysis,PLS-DA)方法进一步分析,最终实现辅料的鉴别。Micro NIR1700微型近红外光谱仪虽然采集的数据点较少,但是光谱数据涵盖了样本的基本信息,分析结果准确度也较高,可以满足生产的需要。
  (2) NIRS用于不同生产厂家的HPMC以及不同HPMC粘度的定性鉴别分析研究
  本实验研究主要采用NIRS光纤漫反射模块对不同生产厂家的HPMC以及不同HPMC粘度进行鉴别分析,为药品质量稳定性与一致性提供快速分析方法。在鉴别不同生产厂家的HPMC时,分别采用线性模式识别方法PLS-DA与非线性模式识别方法支持向量机判别分析(Support vector machine discriminateanalysis,SVM-DA)建立定性分析模型,并比较这两种模型结果,结果表明SVM-DA所建模型结果较好,校正集识别率与拒绝率均达到0.90以上,验证集的均达到1.00,模型的预测能力也较高。在鉴别不同粘度的HPMC时,分别采用无监督的模式识别方法K最邻近法(K nearest neighbor, KNN)与有监督的模式识别方法PLS-DA建立定性分析模型。研究结果表明PLS-DA方法所建定性分析模型的识别率与拒绝率均优于KNN方法,达到0.95以上。因此可以采用光纤探头实现不同生产厂家、不同HPMC粘度的快速鉴别分析。
  (3) NIRS用于HPMC中羟丙氧基与甲氧基的定量分析研究
  本实验研究采用NIRS对HPMC分子上两种取代基羟丙氧基与甲氧基进行含量测定。首先用气相色谱法测定HPMC中羟丙氧基与甲氧基的含量,作为参考值;其次采集HPMC的近红外光谱,建立羟丙氧基、甲氧基含量与近红外光谱关联的偏最小二乘回归(Partial least squares,PLS)模型。在建立定量分析模型时,采用不同的预处理方法、不同的波段选择方法优化PLS模型,以建立最佳的定量分析模型。羟丙氧基含量的PLS模型结果为Rc、Rp、RMSEC、RMSEP分别为0.997、0.983、0.0799、0.132;甲氧基含量的PLS模型结果为Rc、Rp、RMSEC、RMSEP值分别为0.980、0.973、0.671、0.771。研究结果表明模型的稳健性与预测能力均较高。
  本论文的创新点包括:
  (1)本研究首次采用NIRS快速鉴别不同生产厂家的HPMC与不同HPMC粘度。
  (2)本研究首次将NIRS用于HPMC中羟丙氧基与甲氧基的含量测定,为快速分析HPMC的质量提供一种分析方法。
  (3)本研究首次采用iPLS-CARS波段选择方法优化PLS模型,所建模型具有较强的稳健性和较高的预测能力。
[硕士论文] 郭小桢
药物分析学 山西师范大学 2017(学位年度)
摘要:食品药品中可能存在的化学污染物影响着人类健康。由于食品样品中所含成分种类繁多,因此,在分析化学中要排除存在于不同食物样品中的各种化学物质的干扰以实现目标物质的准确分析与测定,就需要对样品进行处理。在现有的样品处理技术中,磁固相萃取(MSPE)环保简单,灵敏度和准确性高,不仅缩短了分析时间,而且实现了分析物的高效分离和富集。本文使用合成的新型磁性材料作为吸附剂,结合荧光光谱法和气相色谱法分别测定了生物样品和食品中不同种类的药物:
  1.简要介绍了磁性固相萃取的优势与应用,总结了磁性纳米材料的修饰与应用以及近年来磁性固相萃取结合磁性纳米材料在食品和生物样品中的应用。
  2.合成了聚合离子液体包覆的Fe3O4磁性材料,将其作为吸附剂,使用磁性固相萃取技术与荧光光谱法结合,用于药片,尿样和血浆样品中阿呋唑嗪,多沙唑嗪,特拉唑嗪和哌唑嗪的测定。与其他方法相比较,我们建立的方法得到了更好的分析测定结果,四种药物的线性浓度范围在0.5-45 ng mL-1之间。阿呋唑嗪,多沙唑嗪,特拉唑嗪和哌唑嗪的检出限分别为0.035、0.034、0.027和0.028 ng mL-1(n=11)。
  3.使用合成的磁性材料作为吸附剂,建立了一种应用磁性固相萃取技术结合荧光光谱法萃取人体血浆和尿液中的两种β-阻断剂卡维地洛和普萘洛尔的方法。得到了低的检出限和宽的线性范围,卡维地洛的线性范围在0.08-4.8 ng mL-1之间,普萘洛尔的线性范围在0.08-6.4 ng mL-1之间。两种药物的检出限分别为0.024和0.030 ng mL-1。样品中两种药物所得回收率的平均值分别为99.01%至100.50%和99.75%至106.01%。
  4.聚合离子液体包裹的磁性材料作为吸附剂萃取火锅样品中的罂粟碱,并通过气相色谱测定。实验结果表明,在最佳萃取条件下,吸附剂对罂粟碱有较强的吸附能力。所建立的方法测定罂粟碱得到了良好的分析结果,线性范围为0.5-20μg·mL–1,检出限为0.01μg·mL–1,加标回收率为93.3%-106.8%。说明该方法在样品前处理方面具有潜在的利用价值和发展前景。
[硕士论文] 张香
光学 大连理工大学 2017(学位年度)
摘要:阿魏酸(Ferulic acid,4-羟基-3-甲氧基肉桂酸),是一种具有重要抗氧化作用的酯类化合物。本文采用表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman Spectroscopy, SERS)技术对阿魏酸分子进行检测,SERS最主要的特点是附着在粗糙金、银或铜表面,此时它的分子截面增加了104-107倍。金、银或铜普遍被用于做SERS的金属基底,且大部分的SERS实验均用银作基底。但在实际应用中,SERS仍需克服诸多难题,其一是增强效应产生的必备条件为金属基底表面粗糙化,只有在上述金属表面被粗糙化后,SERS效能才会显现,而且要选取适宜的粗糙度。二是如何制备出性能稳定的基底,研究表明,某些半导体,例如氧化锌、二氧化钛等。文中形成的Ag/TiO2—石英载玻片复合表面增强拉曼基底并与阿魏酸通过羧基结合。研究得出对阿魏酸的检测限能达到10-5 mol/L。
  其次,阿魏酸在植物中不以游离的形式存在,存在方式为酯,且含量低。不过在一些当归、阿魏、川芎等中药材中含量较高。本文选取中药材当归为研究对象,利用相干反斯托克斯拉曼光谱(Coherent anti-Stokes Raman Spectroscopy,CARS)成像观察当归中阿魏酸的分布情况。可以对具体的测试点位置处阿魏酸的特征峰位成像,来确定测试点处阿魏酸的存在情况,作为一项判定中药材优劣的重要检测手段。
  利用制备的表面增强拉曼基底,获得了低浓度的阿魏酸-乙醇溶液的表面增强拉曼光谱,并对该技术的应用做了进一步延伸。兼用CARS成像技术对当归中阿魏酸的具体分布状况做了详尽的测试与阐述,为表面增强拉曼光谱和相干反斯托克斯拉曼散射技术在药品检测中高效、灵敏的检测提供了新的技术检测途径。
公共卫生 新疆医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:建立采用可调激光-光纤传感快速检测维生素B2和盐酸小檗碱片含量的方法及建立用荧光分光光度法测定瑞舒伐他汀钙,且用正交试验优化及提升其含量测定的质控方法,为其质量控制的研究尊定基础。
  方法:采用可调激光光源(激发波长分别为520 nm和620 nm)光纤传感技术分别快速检测药品中盐酸小檗碱和维生素B2的含量。将实验数据汇总录入Excel数据库中,并对不同厂家的盐酸小檗碱和维生素B2的激光强度等指标进行统计描述分析。运用SPSS22.0软件,对计量资料的两组比较使用t检验,两组以上的资料使用方差分析,画散点图,绘制标准曲线,做线性回归。瑞舒伐他汀钙在激发波长为ex:250 nm,发射波长em:516 nm的条件下测定其荧光强度,用三因素三水平的正交试验优化条件,后用线性回归方程找出荧光强度与浓度的回归方程。
  结果:盐酸小檗碱片剂85-120 mg,国内市场上卖的维生素B2片1-20 mg,国外的维生素B285-120 mg范围内有较强的特征波峰,质量与光的强度之间呈良好的线性关系及呈负相关,相关系数R小檗碱=0.9999、R维生素B2=0.9997(国内),R维生素B2=0.9998(国外);荧光强度与瑞舒伐他汀钙浓度在3.17-39.72 mg/L范围内具有良好的线性关系,检出限为:0.38 mg/L,以荧光强度为指标,考察pH值,甲醇浓度和时间等3个因素,选定最佳条件,将正交试验数据进行统计分析,差异有统计学意义(P<0.05)。按最佳条件进行3次重复实验,结果显示用荧光分光光度法测定瑞舒伐他汀钙含量特异性好,灵敏度高,检测线低。
  结论:本方法经过方法学验证,可用于盐酸小檗碱及维生素B2的质量控制。选用荧光分光光度计检测瑞舒伐他汀钙,结果采用紫外-分光光度法进行验证,结果令人满意。
[硕士论文] 邓罗文
药剂学 重庆医科大学 2017(学位年度)
摘要:姜黄色素是一种天然的从根状茎获得的多酚姜黄,其主要存在于姜科、桦木科植物当中。姜黄素(Curcumin,CUR)是姜黄色素中最主要的有效成分,其含量约占75%。CUR药理作用广泛,具有抗炎,抗氧化,和抗肿瘤等生物学活性。其抗癌谱广,对多种癌症具有细胞毒作用,如胃癌、骨肉瘤、肺腺癌等。CUR可以与不同的分子靶点相互作用来参与炎症,有抗炎效果,并对高血脂和动脉粥样硬化等心血管疾病也有不错的应用前景,展现出了较好的研发潜力与临床应用价值。但是,CUR不仅溶解性较差,而且生物利用度低,这大大限制了CUR在临床上的广泛应用。国内外研究报道表明,通过对药物的结构进行改造和修饰,可以提高药物的生物利用度,增强药物对肿瘤细胞的靶向抑制作用。研究发现,经过三苯基磷(Triphenylphosphine,TPP)修饰得到的CUR衍生物,因具有电子移位亲脂性阳离子能够选择性地聚集于肿瘤细胞线粒体内,可增强肿瘤细胞靶向抑制作用。
  本文的主要工作涉及以下几部分:
  以CUR为原料,通过与卤代烷烃的醚化反应合成到CUR氯代衍生物(Curcumin Chlorinated Derivatives,CURCD),CURCD再与TPP发生加成反应,合成得到CUR三苯基磷衍生物(Curcumin triphenylphosphine derivative,CURTP)。考察了反应物的摩尔比、反应时间、温度及重结晶溶剂等对产物收率的影响。通过质谱、核磁共振氢谱对产物结构进行表征鉴定,结果显示最终成功合成了CURTP。
  测定CURTP在水中的平衡溶解度为53.31μg/mL,油水分配系数为0.61。与CUR相比,CURTP的水中溶解度有较大提高。测得CURTP熔点为128.50~130.50℃。
  通过将透明质酸与N-boc-甘氨酸、甲氧基聚乙二醇接枝,合成了透明质酸-甘氨酸-甲氧基聚乙二醇(Hyaluronic acid-glycine-methoxy polyethylene glycol,HA-g-mPEG),并以红外鉴定HA-g-mPEG的合成。以HA-g-mPEG为载体,成功制备了三苯基磷衍生物纳米粒(Curcumin triphenylphosphine derivative loaded hyaluronic acid graft methoxy polyethylene glycol/hydroxypropyl-β-cyclodextrin CHHPS),测得其平均包封率为81.60%,平均粒径为200.00nm,Zeta电位为-31.30mV。nanoparticles,
  采用了大鼠尾静脉给药方式,进行了大鼠体内药代动力学的考察,结果表明:相对于CUR和CURTP,CHHPS的药代动力学性质改变明显。CURTP和CHHPS的AUC(0-72h)分别为721.30μg/L·h和2217.33μg/L·h,后者为前者的近3倍;CURTP和CHHPS的MRT(0-72h)分别为0.54h和2.94h,CHHPS的平均滞留时间更长,在体内作用时间更长。CURTP和CHHPS的Cl分别为10949.50L/h/kg和3583.42L/h/kg,CHHPS的总清除率相比CURTP明显降低,说明CHHPS消除慢,体内作用时间更长。
[硕士论文] 文琼芳
药学 重庆医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs,NSAIDs)因为有解热、降低疼痛、对抗炎症和对抗风湿等临床作用而被广泛的应用于临床。本实验拟建立一种同时测定血浆和尿液中吲哚美辛和布洛芬的药物浓度的HPLC方法。并运用该方法对实际样品进行测定,考察两种药物的血药浓度变化情况。
  方法:ZORBAX SB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈和醋酸铵溶液(20mmol/L,pH=3.5)=85:15(v/v),流速为1mL/min,进样量80μL,布洛芬保留时间为8.57min左右,吲哚美辛的保留时间6.78min左右,柱温为室温,检测波长220nm。
  结果:吲哚美辛和布洛芬能够与内源性物质有效分离,在较宽的浓度范围内吲哚美辛和布洛芬的峰面积和与其浓度呈较好的线性关系(R≧0.9985),方法的精密度小于4.0%,方法回收率大于85%。生物样品在4℃冰箱中放置48小时性质稳定。
  结论:本方法专属性好,实验所用时间短。可作为生物样品中吲哚美辛和布洛芬的药物浓度测定的方法。运用此方法对数只大鼠血药浓度监测结果表明,布洛芬在1h左右达到最大血药浓度(27.65μg/mL),吲哚美辛在3h左右达最大血药浓度(2.71μg/mL)。本研究为进一步研究吲哚美辛和布洛芬体内利用度奠定基础,为临床安全合理用药提供了依据。也为其他非甾体抗炎药的分析提供了参考。
[硕士论文] 靳贵林
中药学 甘肃中医药大学 2017(学位年度)
摘要:党参为常用大宗药材,主产于山西、陕西、甘肃、四川等地,甘肃文县为纹党的道地产区。本文以纹党为研究对象,在进行纹党的品质形成影响因素研究、药材来源、性状描述的基础上,主要从纹党所含药效化学成分入手,采用紫外-可见分光光度法测定不同采收期样品中所含纹党总皂苷、纹党总黄酮的含量;采用高效液相色谱法测定党参炔苷、紫丁香苷的含量,通过对纹党所含主要化学成分的动态监测,来探究纹党中各成分含量随季节变化而增减的规律,从而为纹党的质量评价提供较为有效的数据基础,也为进一步解释其品质形成机制提供科学的依据。本课题主要研究内容及结果如下:
  一、通过测定不同采收期纹党总皂苷的含量来研究纹党品质形成。纹党用甲醇超声提取后回收甲醇,残渣用蒸馏水溶解后以正丁醇萃取,萃取液回收正丁醇后,残渣用甲醇定容;精密取定溶液于低温下挥干甲醇,加1%香草醛-冰醋酸0.5mL,加入高氯酸0.5mL,60℃下静置反应30min,冷水浴2min后,加入5mL冰醋酸,在540nm处测定吸光度计算总皂苷含量。研究发现纹党总皂苷含量在16.4~38.56mg/g之间波动,且生长期最旺盛的8-9月间总皂苷含量最大。纹党总皂苷含量受温度和季节的变化影响较大,生长最旺盛的8、9月为纹党皂苷含量最高时期。
  二、通过测定不同月份纹党所含黄酮总量的多少来研究其品质的形成。以75%乙醇进行超声提取,提取液过滤定容后,取2mL于25mL容量瓶,加入5%亚硝酸钠1mL,静置6分钟;加入10%硝酸铝1mL,静置6分钟;加入5%氢氧化钠10mL,静置15min显色,在510nm处测定吸光度,计算总黄酮值,其含量在15.75~29.37mg/g之间波动。结果表明纹党所含总黄酮含量呈现出先下降后升高的趋势,含量最高月份为7、8两个月。
  三、党参炔苷及紫丁香苷含量测定,采用高效液相色谱法测定同一产地不同月份纹党炔苷和紫丁香苷含量,以Agilent1200高效液相色谱仪配有二极管阵列检测器,AT.Lichom C18液相分析色谱柱(250mm×4.6mmid.5um,兰州中科凯特),柱温30℃,进样量10μL,以乙腈-0.3%磷酸为流动相,1~10min乙腈6%、10~20min乙腈16%、20~30min乙腈26%、30~40min乙腈45%、40~45min乙腈45%、45~50min乙腈6%,梯度洗脱;于267nm检测波长下计算两种化合物含量。研究发现纹党生长期内党参炔苷和紫丁香苷随着季节的变迁先降低而后升高,且生长最旺盛的季节7~8月份所含党参炔苷含量最低。
  四、以紫丁香苷与党参炔苷为指标性成分用HPLC鉴定白条党与纹党,采用Agilent1200高效液相色谱仪配有二极管阵列检测器,AT.Lichom C18液相分析色谱柱(250mm×4.6mmid.5um,兰州中科凯特),柱温30℃,进样量10μL,以乙腈-0.3%磷酸为流动相,1~10min乙腈6%、10~20min乙腈16%、20~30min乙腈26%、30~40min乙腈45%、40~45min乙腈45%、45~50min乙腈6%,梯度洗脱;于267nm处检测纹党和白条党是否含有紫丁香苷与党参炔苷。研究结果显示纹党含有紫丁香苷,白条党不含紫丁香苷,以紫丁香苷为指标可以区别鉴定白条党和纹党。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

万方选题

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部