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[博士论文] 高景霞
药理学 复旦大学 2004(学位年度)
摘要:酪氨酸激酶型受体和G蛋白偶联受体信号不是孤立的,而是相互联系的。两者之间存在广泛的对话。G蛋白偶联受体可以反式激活酪氨酸激酶型受体,酪氨酸激酶型受体也可以利用经典的G蛋白偶联受体信号通路的分子来实现其信号转导。本研究初步探讨了GRK2对EGF信号通路调控的分子机制。 本研究结果表明:(1)激动剂EGF刺激能诱导GRK2与EGFR的结合,使GRK2由细胞浆转位至细胞膜,并与EGFR共定位在细胞膜上。激动剂EGF诱导的GRK2与EGFR的结合依赖于EGFR自身的酪氨酸激酶活性。(2)激动剂EGF诱导的GRK2与EGFR的结合不依赖于GRK的激酶活性。参与识别GPCR并与GPCR相互作用的GRK2氨基末端域对激动剂EGF诱导的GRK2与EGFR的结合也不是必需的。(3)激动剂EGF诱导的GRK2与EGFR的结合依赖于游离的Gβγ亚单位,而不依赖于Gi/o蛋白的激活。(4)GRK2不影响激动剂EGF诱导的EGFR内吞,而能增强激动剂诱导的G蛋白偶联的δ阿片受体的内吞。
[硕士论文] 王宁
药物分析学 烟台大学 2016(学位年度)
摘要:单克隆抗体是一类结构复杂的生物大分子,很多原因会导致分子表面电荷数量发生变化而形成电荷异构体。贝伐单抗是抗VEGF受体的重组人源化单克隆抗体,临床用于结直肠癌的治疗,而且对非小细胞肺癌、肾癌和其它多种实体瘤治疗前景乐观。本文主要研究贝伐单抗生物类似物电荷异构体的理化修饰是否对体外活性及体内药代动力学产生影响。论文内容包含三个部分:
  1.贝伐单抗类似物电荷异构体的制备
  使用AKTA AVANT150自动层析仪,分别采用SP-HP及MonoS强阳离子交换层析柱用于制备高纯度的酸性变体、碱性变体及主体蛋白。酸性变体分离方法经过优化,分离条件为强阳离子交换柱SP-HP,洗脱缓冲液为25 mmol/L MES,75 mmol/L NaCl,pH5.9;主体蛋白和碱性变体的分离方法经过优化,分离条件为强阳离子交换柱MonoS,洗脱缓冲液A(25mmol/LMES,50mmol/LNaCl,pH5.9),洗脱缓冲液B(25mmol/LMES,500mmol/LNaCl,pH5.9),线性梯度洗脱(B:10%-30%,20 CV),流速为4 mL/min,检测波长为280 nm,分离得到的蛋白使用弱阳离子交换色谱进行纯度的检测,结果显示酸性变体的纯度最高达到97.6%,主体蛋白纯度达到94.6%,碱性变体纯度达到88.7%。
  2.表征及体外活性
  使用CEX-HPLC、CZE、SEC-HPLC、iCIEF及Biacore-X100等分析方法分别对贝伐单抗类似物电荷异构体、贝伐单抗类似物及原研药的纯度、等电点、单体含量及亲和力常数等理化特性进行表征。弱阳离子交换色谱测定酸性变体、碱性变体及主体蛋白的纯度分别为97.6%、88.7%及94.6%,贝伐单抗类似物和原研药中酸性变体含量分别14.8%、15.0%,碱性变体含量分别为10.2%、11.0%,主体蛋白含量分别为75.0%、74.0%;酸性变体、碱性变体、主体蛋白、贝伐单抗类似物及原研药的SEC-HPLC单体检测结果分别为99.4%、98.6%、99.0%、98.5%及97.4%;iCIEF测定贝伐单抗类似物的等电点与原研药完全一致为8.10~8.40,酸性变体、主体蛋白及碱性变体等电点分别为7.60~8.20、8.20~8.30、8.30~8.70;酸性变体、碱性变体、主体蛋白、贝伐单抗类似物和原研药的亲和力常数分别为(2.90±0.12)×10-10 M、(2.64±0.13)×10-10 M、(2.08±0.16)×10-10 M、(3.18±0.22)×10-10 M、(3.21±0.24)×10-10 M。使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对电荷异构体、贝伐单抗类似物及原研药进行体外活性的比较研究,与原研药相比,酸性变体、碱性变体、主体蛋白及贝伐单抗类似物的相对活力分别为94%、100%、114%和100%。
  3.大鼠体内药代动力学研究
  实验使用SD(Sprague dawley)雄性大鼠,共分5组,分别为酸性变体、碱性变体、主体蛋白、贝伐单抗类似物及原研药组;给药剂量为10 mg/kg,静脉注射,眼内眦取血200μL,取血时间点为0min、5min、15min、30min;1h、4h、8h、24h;2d、3d、7d、10d、14d、17d、21d、24d、28d、31d、35d、42d;冰水浴中全血静置30 min,离心取上清,血清-70℃保存。使用受体结合的直接Elisa方法测定血清样品中抗VEGF的抗体的浓度。运用非室模型模拟及WinNonlin6.3软件计算药代动力学参数最大血药浓度,半衰期及药时曲线下面积。酸性变体、碱性变体、主体蛋白、贝伐单抗类似物和原研药的最大血药浓度(Cmax)分别为216.45±59.07μg/mL、212.63±52.30μg/mL、202.31±57.06μg/mL、207.00±41.95μg/mL、211.97±44.54μg/mL;半衰期(t1/2)分别为8.67±2.46 d、6.85±2.18 d、8.47±2.38 d、7.68±1.75 d、8.84±1.86 d;药时曲线面积(AUC0-42d)分别为1060.08±256.4μg·day/mL、932.24±108.2μg·day/mL、1130.75±240.3μg·day/mL、1023.29±321.0μg·day/mL、1310.11±394.9μg·day/mL。药代动力学参数使用统计学软件SPSS的单因素方差分析(One-Way Anova)比较,结果表明电荷异构体、贝伐单抗类似物及原研药的体内药代动力学参数无统计学差异。
[硕士论文] 高欣
细胞生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2016(学位年度)
摘要:蛋白质泛素化修饰在细胞周期进程、信号转导、DNA损伤修复等多种细胞生命进程中发挥重要的调控作用。常见的泛素化修饰可按照在泛素分子上的赖氨酸残基位置分为以下七种泛素连接形式:K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位泛素化修饰,又可根据泛素的数目分为单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。不同的泛素连接形式发挥不同的生物学功能,如单泛素化修饰多参与膜转运和胞内吞,而多聚泛素化修饰中,K48位多聚泛素化修饰最常见,是26S蛋白酶体的降解信号,K63位多聚泛素化修饰主要是参与DNA损伤修复和信号转导,K11位多聚泛素化修饰参与细胞周期过程中的蛋白质降解。蛋白泛素化过程涉及包括泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme,E1),泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)和泛素连接酶(ubiquitin ligase,E3)在内一系列酶的级联反应。在ATP供能的情况下,E1酶连接泛素,泛素分子的赖氨酸残基被激活,E1将激活的泛素转移给E2酶,E3酶识别底物蛋白,E2酶携带激活的泛素与E3酶结合,将泛素连于底物上,完成对底物的泛素化修饰,在不同蛋白质的泛素化修饰过程中E3酶起关键作用。2006年日本大阪大学Kazuhiro Iwai教授实验室发现了一种新的泛素化修饰,其泛素连接形式不是已知的泛素内部赖氨酸相关的,而是泛素首尾相连形成线性泛素化链,即一个泛素单体N端的甘氨酸与上一个泛素单体C端的甲硫氨酸之间形成线性泛素化链,称为线形泛素化修饰。
  在已知发现的600多种E3酶中,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)复合物是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。该复合物由HOIP(HOIL-1-interacting protein,又称RNF31、ZIBRA或PAUL)、SHARPIN(Shank-associated RH domain-interacting protein)和HOIL-1L(longer isoform of haem-oxidizediron-regulatory proteinubiquitin ligase1)组成,其中HOIP是核心组分,主要行使线性泛素化E3酶的活性,HOIP的突变或缺失均不能使该复合物发挥线性泛素化修饰E3酶的功能。
  自从线性泛素化修饰和线性泛素化E3酶LUBAC被发现后,人们对LUBAC的功能和底物产生了极大兴趣。目前报道LUBAC复合物的底物有NEMO(NF-kappa-B essential modulator)、TRIM25(ISG15 ligase TRIM25)、RIPK2(Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase2)和ASC(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)。初步发现的线性泛素化修饰的生物学功能主要体现在先天性免疫和抑制炎症反应等过程,更多的由线性泛素化所调控的生物学功能尚待探索,因此系统筛选和鉴定LUBAC的线性泛素化底物对于充分理解线性泛素化的生物学功能具有重要意义。本论文拟采用新型的CRISPR/Cas9基因编辑技术结合高分辨亲和质谱分析技术,建立高通量线性泛素化位点鉴定和底物筛选体系,为进一步深入探索线性泛素化的生物学功能提供线索。
  CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences)技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具被广泛应用。CRISPR/Cas9技术通过单链向导RNA(single guide-RNA,sgRNA)对目的基因上下游进行靶标并招募Cas9核酸酶对DNA双链进行切割,利用细胞非同源性末端接合(non-homologous end joining,NHEJ)的DNA修复机制的不准确性,从而达到敲除目的基因的作用[9]。和锌指核酸酶技术(Zinc-finger nuclease,ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶技术(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)相比,CRISPR/Cas9技术更简单更容易实现,也越来越受瞩目,是目前靶向基因编辑的重要技术。
  作为蛋白质组学研究的重要工具,质谱分析在蛋白翻译后修饰类型识别、位点鉴定、结构解析以及定量测定等方面发挥着不可或缺的作用。质谱技术的发展有力推动了蛋白翻译后修饰研究,促进修饰位点的鉴定效率、覆盖率、定位精确度以及定量准确度不断提高。目前以质谱技术为核心蛋白质组学分析平台对于包括泛素化在内的多种翻译后修饰研究正在向精细化、规模化、协同化和定量化的方向发展。复杂生物体系中的翻译后修饰蛋白通常具有丰度低、动态范围广以及不均一性等特点,为获得高的鉴定效率和准确度,常需针对含有修饰位点的蛋白或肽段开发特异性的纯化/富集方法。目前对于泛素化的富集策略主要有在肽段层面针对K-diGly残基的特异性抗体免疫纯化方法和在蛋白层面基于UBD结构域的亲和纯化方法等。这些技术为在蛋白质组层面进行深入的规模化蛋白泛素化鉴定提供了有利条件。采用质谱技术结合特异性的亲和纯化方法对包括线性泛素化在内的蛋白翻译后修饰位点进行协同式鉴定和量化分析将有力推动线性泛素化的生物学功能研究。
  LUBAC复合物除具有线性泛素化E3酶的活性外,其组分(如Sharpin和HOIL-1L)能使蛋白发生其他类型的泛素化修饰(如K48,K63)等。为尽可能特异性地鉴定出线性泛素化修饰蛋白质,排除其他类型泛素化修饰的干扰,本项研究的策略是首先在HeLa细胞中使用CRISPR/Cas9系统将LUBAC的核心组分HOIP敲掉后,再外源瞬转HOIP野生型( HOIPWT)和HOIP线性泛素化酶失活型(HOIPCS),以LUBAC的已知底物NEMO的线性泛素化作为体系的阳性对照,通过亲和质谱分析鉴定泛素化肽段,系统比较两组样品的泛素化蛋白和位点的差异,从而推测LUBAC新的未知底物。首先,我们参照CRISPR在线设计网站(http://crispr.mit.edu)选定了2条高评分的CRISPR敲除序列,将其构建到lenti-CRISPRv2载体上,通过慢病毒包装系统构建出稳定敲除HOIP效果良好的HeLa细胞系。之后,在敲除细胞基础上构建了过表达HOIP野生型和HOIP线性泛素化E3酶失活型的细胞体系,并在此细胞体系中观察到LUBAC已知底物NEMO线性泛素化的发生,验证了HOIP与NEMO的酶和底物关系。
  综上,我们利用CRISPR/Cas9技术和蛋白质组学相结合的方法,建立了在敲除内源HOIP的基础上转染E3酶和酶活突变型的细胞体系,在此基础上,我们拟通过规模化的亲和质谱蛋白质组学分析鉴定LUBAC新的底物,发现LUBAC新的功能,探索线性泛素化参与调控不同细胞生物学功能的具体机制,扩展人们对线性泛素化修饰调控细胞功能的认识。
  
[硕士论文] 吕青
药物分析学 浙江大学 2006(学位年度)
摘要:细胞色素P450同工酶属于血红蛋白超家族,是参与催化众多外源物和内源物生物转化反应的重要酶系,主要存在于肝脏中。细胞色素P450酶系催化致癌物、环境污染物以及药物的代谢,使这些化合物亲水性或极性增加,促进排泄,防止毒性物质在体内累积。其中CYP1、2、3族负责大多数外源物的代谢,具有广泛的底物特异性。细胞色素P4502B6,简称CYP2B6,是研究相对较少的同工酶,主要原因是一方面该酶在人肝中的mRNA水平和蛋白质含量比较低,另一方面是缺乏合适的探针工具。随着高灵敏度和选择性的免疫检测方法的应用,人们在人肝中检测到CYP2B6较高的表达水平。近年来CYP2B6引起了更多的关注,越来越多的数据表明CYP2B6参与催化许多重要临床药物的代谢。其中安非他酮是CYP2B6的特异性药物,可作为酶活性测定的探针底物。体外表达CYP2B6重组酶对研究该酶在药物代谢中的作用具有重要意义。近年来杆状病毒介导的昆虫表达系统得到了广泛地应用,本课题通过该系统表达CYP2B6重组酶,并进行活性鉴定。
  1.CYP2B6基因的克隆根据基因库CYP2B6的cDNA序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到CYP2B6的cDNA基因片段,cDNA片段与pGEM-T载体连接,重组质粒进行DNA测序。通过定点突变方法获得野生型基因序列,经测序的CYP2B6基因片段亚克隆到穿梭载体pFastBac载体上,该载体能够与Bacmid发生特定位点的转座重组。连接后的重组质粒CYP2B6-pFastBac转化到含有Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白筛选获得含有CYP2B6基因片段的重组粘粒,该重组粘粒通过脂质体法转染昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。
  2.CYP2B6同工酶与CYPOR的共表达 将高滴度的CYP2B6病毒液和CYPOR病毒液共转染Sf9细胞,表达体系中的血红素浓度为3μg/mL。表达三至四天后,收获细胞,细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤后进行超声破碎,即得到含有CYP2B6重组酶的细胞破碎液。3.表达产物分析细胞破碎液进行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳,将分离胶电转移到PVDF膜上,用鼠His抗体和二抗分别先后室温孵育1h,用PBS洗过后,用DAB法进行显色。通过Western Blot法检测到带有his标签的目的蛋白的表达。细胞破碎液进行超速离心后用CO-差示光谱法进行P450含量测定,没有检测到450nm处的吸收峰。4.活性鉴定采用CYP2B6的特异性底物安非他酮进行重组酶活性测定,在再生系统溶液中加入CYP2B6重组酶、系列浓度的底物进行孵育。按Lineweaver Burk法求得酶动力学参数,重组酶催化安非他酮的Km值为138士42μmo1/L,Vmax值为0.676士0.21nmo1/min/mg蛋白。综上所述,本实验采用杆状病毒昆虫表达系统成功表达了具有催化活性的人CYP2B6重组酶,为体外药物代谢研究提供了有价值的工具。
[硕士论文] 邓莉
内科学 重庆医科大学 2008(学位年度)
摘要:目的:通过对健康志愿者单次和多次静脉注射比阿培南的药代动力学研究,了解药物在人体内代谢、消除的规律,为该药制定合理给药方案提供依据。 方法:首先建立高效液相色谱分离检测的内标法定量测定血清中比阿培南浓度,然后选择11名健康成人进行人体药带动力学研究,给药方式分别为单次静滴比阿培南300mg,或300 mg静滴比阿培南每12小时给药一次,连续给药5天后。应用高效液相色谱法测定比阿培南血药浓度,采用DAS2.0软件进行数据处理,求出药动学参数。 结果:该方法灵敏度、选择性、精密度等符合生物样品分析测定要求。单剂量给药药代动力学研究:单次和多次静滴比阿培南300mg后,测定比阿培南的血药浓度经时过程,矩量法计算主要药代动力学参数如下:Cmax分别为(16.635±3.323)mg/L,(17.01±3.92)mg/L;t1/2β分别为(1.172±0.687)h,(0.85±0.137)h;AUC(0-∞)分别为(27.275±8.914)(mg/L)﹡h,(26.85±7.455)(mg/L)﹡h。单剂静脉注射比阿培南未出现严重不良反应。 结论:研究中未见严重不良反应发生,表明比阿培南注射液安全性好;建立的人血浆比阿培南浓度的反相高效液相色谱测定方法专属性、准确度、灵敏度适宜;国产注射用比阿培南在健康人体内的药代动力学符合二房室模型特征。
[硕士论文] 肖茹
药理学 中山大学 2004(学位年度)
摘要:为探索Nor-1在神经元中的功能及作用机制,我们首先必须明确其在神经元损伤过程中蛋白表达的情况,因此作为工具抗NOR-1抗体的制备是必须的.为此,我们运用原核基因融合表达系统表达Nor-1的部分蛋白,以此作为抗原制备抗NOR-1多克隆抗体;使用这种抗体检测Nor-1在小脑颗粒神经元低钾诱导的凋亡模型及缺氧模型中蛋白的表达情况,并在模型中给予forskolin、MK801和海洋甾体YC-1这些神经元保护药物,观察Nor-1的表达与神经保护及与神经元存活的关系.我们发现,这些药物在神经元损伤模型中促神经元存活的同时,诱导Nor-1蛋白的表达上调,提示Nor-1可能参与这些药物促神经元存活作用的信号转递.这些药物的神经元保护作用机制的研究已经较为深入,而我们的实验为这些药物的神经保护机制的研究提供了新的线索和思路.抗NOR-1多克隆抗体的获得为Nor-1的生物学功能研究奠定了良好的基础.作为新的促神经元存活的基因,明确Nor-1在小脑颗粒神经元损伤模型中蛋白表达的情况为探索新的神经元保护信号转导通路打下基础.第一章大鼠Nor-1在大肠杆菌中高效表达及其抗体的制备选取Nor-1中能表达较好特异性及免疫原性蛋白的一段基因,构建其原核表达系统,在大肠杆菌中高效表达GST-NOR-1融合蛋白并以此制备抗NOR-1的特异性抗体.第二章Nor-1在小脑颗粒神经元损伤模型中表达的研究利用制备的抗NOR-1多克隆抗体探讨Nor-1在低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡模型及小脑颗粒神经元缺氧模型中的表达情况,分别加入forskolin,NMDA受体抑制剂MK801,及海洋甾体化合物YC-1等药物处理,观察药物对模型中Nor-1表达的影响.
[硕士论文] 唐青
药学 中南大学 2013(学位年度)
摘要:目的:构建重组人CYP3A5基因多态性酿酒酵母表达体系;评价CYP3A5基因多态性对氨氯地平等药物代谢的差异及效应的影响;初步探索microRNA对CYP3A5基因表达的调控。
  方法:⑴通过PCR扩增得到CYP3A5各基因多态性cDNA全片段,PCR产物经双酶切后,将目的基因片段插入到经相同内切酶双酶切过的质粒pYES2/CT上,转化大肠杆菌JM109,用含氨苄青霉素的培养基培养,筛选阳性克隆,提取CYP3A5基因多态性重组表达质粒。将构建成功的重组表达载体CYP3A5-pYES2/CT转化酿酒酵母INVSc1,用SG培养基诱导其蛋白表达,并提取酵母蛋白微粒体,即为CYP3A5药物代谢酶。⑵体外代谢:将CYP3A5基因多态性酶代谢氨氯地平、地尔硫卓,非洛地平和中药三七总皂苷等药物,采用LC-MS和HPLC仪测定其代谢反应量,以曲线拟合方法优化分析,并计算Km、Vmax和Vmax/Km值,绘制米氏动力学曲线。⑶体内代谢:筛选湘雅三医院健康管理中心的服用氨氯地平原发性高血压患者57例和肾移植科服用地尔硫卓移植后高血压患者32例;分别治疗4周后抽取外周血,离心后提取血浆,一方面,模拟体内环境对血浆中药物进行CYP3A5酶处理,LC-MS和HPLC分别测定各处理组代谢前后的血药浓度,计算CYP3A5各基因型酶对氨氯地平和地尔硫卓的代谢速率;另一方面,对患者进行CYP3A5基因分型,LC-MS和HPLC测定各基因型患者氨氯地平和地尔硫卓血药浓度,分别计算其体内代谢速率。⑷筛选湘雅三医院健康管理中心的服用氨氯地平原发性高血压患者57例,提取患者DNA,对患者进行CYP3A5的基因型检测,分为CYP3A5*1/*,CYP3A5*1/*3,CYP3A5*4和CYP3A5*6四个不同的基因型组,在氨氯地平治疗前后分别测量各基因型组患者血压,记录治疗前后患者血压的变化情况,分析CYP3A5基因多态性对氨氯地平降压效应的影响。⑸使用targetscan、miRanda和Pictar等软件预测可能作用CYP3A5基因的miRNA,并进行统计和筛选,发现miR-410在很大程度与CYP3A5 mRNA的3'-UTR结合;为了验证该结果,选用HepG2细胞进行转染实验,实验共分5组,分别为空白对照组,miR-410 mimic(类似物)组,miR-410 mimic阴性对照物组,miR-410 inhibitor(抑制剂)组,miR-410 inhibitor阴性对照物组;空白对照组加入等量的细胞培养液,转染48小时后,采用real-time和western-blot鉴定CYP3A5 mRNA和蛋白质的表达。
  结果:①体外构建了人重组细胞色素CYP3A5酿酒酵母表达体系,包括CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3、CYP3A5*4和CYP3A5*6等4个单核苷酸突变株酿酒酵母表达载体,并成功在酿酒酵母细胞中进行真核表达。②CYP3A5基因多态性对氨氯地平的代谢速率大小为:CYP3A5*1/*3>CYP3A5*6>CYP3A5 wt>CYP3A5*4;对地尔硫卓的代谢速率大小为:CYP3A5 wt>CYP3A5*6>CYP3A5*1/*3>CYP3A5*4;对非洛地平的代谢速率大小:CYP3A5 wt>CYP3A5*4> CYP3A5*6>CYP3A5*3;对三七总皂苷的代谢速率大小:CYP3A5WT>CYP3A5*4>CYP3A5*6>CYP3A5*1/*3.体内和体外代谢速率大小一致。③CYP3A5基因分型:对湘雅三医院健康管理中心的57名服用氨氯地平的高血压患者基因型的测定,结果发现服用氨氯地平的高血压患者中CYP3A5*1/*1共7名(12.3%),CYP3A5*1/*3共28名(49.1%),CYP3A5*4共2名(3.5%)和CYP3A5*6共2名(3.5%)。④与CYP3A5*1/*基因型相比,CYP3A5*1/*3和CYP3A5*4基因型患者的氨氯地平降压疗效显著增强(P<0.05),CYP3A5*6基因型患者的降压疗效无明显差异。⑤与空白对照组相比,miR-410 mimic转染组CYP3A5蛋白质表达水平明显升高(P<0.01),而miR-410 inhibitor转染组结果正好相反(P<0.001),其他两个阴性对照组CYP3A5蛋白质的表达水平与空白对照组没有明显差异。各转染组的CYP3A5 mRNA的表达水平无显著变化。
  结论:⑴构建了重组人细胞色素CYP3A5基因多态性酿酒酵母表达体系。⑵所构建的CYP3A5基因多态性酿酒酵母表达体系可以用于临床评价氨氯地平等药物的体内、外代谢和疗效的差异。⑶miR-410参与CYP3A5蛋白表达的调控,是一种转录后调控机制。
[硕士论文] 杨世磊
药理学 大连医科大学 2011(学位年度)
摘要:目的:建立快速、灵敏的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),同时测定血浆中的决奈达隆和活性代谢产物SR35021,并应用于盐酸决奈达隆片在比格犬相对生物利用度和人体药动学的研究。
   方法:50μL犬血浆样品经乙腈沉淀蛋白处理,以托伐普坦作为内标,以乙腈-甲醇-5 mmol/L乙酸铵-甲酸(55:10:35:0.07)为流动相,在Capcell Pak C18 MG柱进行色谱分离;50μL健康人血浆样品经乙腈沉淀蛋白处理,由于人血浆中内源性物质较多,对检测有较大干扰,换用胺碘酮作为内标,选用Capcel Pak C18 MG色谱柱,以乙腈-5 mmol/L乙酸铵-甲酸为流动相,采用梯度洗脱进行色谱分离;均采用大气压化学电离源,多反应监测(MRM)方式进行正离子检测。用于定量分析的离子反应分别为m/z557→100(决奈达隆)、m/z501→114(代谢物SR35021)、m/z449→252(内标,托伐普坦)和m/z646→100(内标,胺碘酮)。药动学参数采用非室模型计算。
   结果:测定人和比格犬血浆中决奈达隆和SR35021方法的线性范围均为0.200~200 ng/mL,定量下限均为0.200 ng/mL。日内、日间精密度均小于15%,准确度在±15%以内。每一样品色谱运行时间小于5.5 min。
   Beagle犬餐后给予相同剂量(400 mg)的受试制剂或参比制剂,原形药物决奈达隆和活性代谢物SR35021的平均血浆达峰时间均约为1.8 h,血浆消除半衰期分别约为6h和3h。原形决奈达隆的血浆暴露量是代谢物SR35021的8倍。经剂量校正后,以决奈达隆和SR35021的AUC0-t计算,受试制剂决奈达隆和SR35021的相对生物利用度分别为96.9%和104%。
   食物影响决奈达隆在比格犬体内的吸收,餐后给药后,决奈达隆的Cmax和AUC0-t分别比空腹给药增加了5.16倍和5.54倍;活性代谢产SR35021的Cmax和AUC0.t分别比空腹给药增加了2.39倍和2.95倍。
   决奈达隆的药动学性质有明显的种属差异。健康受试者餐后口服盐酸决奈达隆片后,原形药物决奈达隆和活性代谢物SR35021平均血浆达峰时间分别约为4h和4.5h,血浆消除半衰期分别约为16h和22h。活性代谢物SR35021在人体内的血浆暴露量明显高于在比格犬体内,其在人血浆中的暴露量略高于原形药物。
   结论:建立了快速、灵敏的LC-MS/MS法同时测定决奈达隆和活性代谢产物SR35021血浆浓度,并成功应用于盐酸决奈达隆片药动学研究。
[博士论文] 王雪丁
药理学 中山大学 2006(学位年度)
摘要:药物代谢是药物在体内消除的主要决定因素。药物在体内代谢向两个方向发展:代谢解毒和代谢活化,其中大部分药物的代谢在肝脏进行。细胞色素(CYP450)酶系是肝脏中主要的代谢酶系,其中CYP3A4是细胞色素P450系统的重要亚型,占肝脏中P450酶总含量的25%,临床上50%的药物通过此酶代谢而排出体外。临床实践中发现,大多通过CYP3A4.代谢的药物都存在显著的个体差异和种族差异,这对于治疗窗窄、安全指数低的药物很易发生药物毒性反应和达不到疗效。并且绝大部分药物因需要长期应用和合并用药,常发生自身代谢诱导,即随着药物应用时间和剂量的增加,药物在体内的代谢增强,从而需不断加大用药剂量。但不同患者增加强度不同。 近年来一系列研究发现,人孕烷X受体(human pregnane X receptor, hPXR)作为关键的转录调控因子参与CYP3A4基因诱导表达。hPXR可以被许多临床药物激活,包括钙通道拮抗剂、抑制素、降糖药、HIV蛋白酶抑制剂、抗激素药、抗癌药,这些药物的大多数都是依赖CYP3A4代谢而排出体外的。hPXR基因已进行了功能研究的29个SNP中,发生在编码区的11个SNP有7个可引起hPXR蛋白序列的差异,经细胞重组表达研究显示出利福平诱导CYP3A4转录活化的差异;另外,在3,端和5’端非编码区及近端内含子的18个SNP中,经细胞重组表达研究已明确有8个SNP影响药物代谢酶CYP3A4的转录表达。 目的: 第一部分hPXR基因SNP检测及单倍型分析 在中国健康汉族人群中广泛筛查hPXR基因的SNP,明确其单倍型分布,并与其它种族比较,明确种族差异。 方法: 用PCR-直接测序法对hPXR基因的编码区、近端内含子、3’及5'-UTR的SNP进行广泛筛查,计算各SNP频率,并验证是否符合Hardy—Weinberg平衡。与其它种族比较SNP频率差别采用x<'2>检验。PHASE V.2.1进行单倍型分析。 结论: 中国健康汉族人群发现16种SNP,其中未见报道的新SNP有2个(-25439A>G和7637C>T);有9个为在NCBI的SNP数据库中直接登陆而未经确证的SNP(其中两个位于hPXR基因启动子的关键部位,本研究将在第二部分对这两个突变的功能进行进一步的研究);另外,本试验发现的SNP的种类,频率和常见的单倍型的种类与已报道的其它种族存在显著性差异。 目的: 第二部分 hPXR启动子区域的突变-24622A>T 与-24446C>A的功能研究 第一部分试验中在hPxR基因启动子的关键调控区域发现一24622A>T及一24446C>A两个突变,发生频率分别为3.5%及2.4%,前者在美国黑人中有报道(发生率3.1%),后者仅见于亚洲人群(发生率3.6%),在高加索人和美国黑人中未见报道。鉴于此两突变所处位置,推测可能会影响hPXR自身表达,从而影响受hPXR调控的下游基因的转录与表达。用报告基因的方法检测这两个突变对hPxR启动子功能的影响。 方法: 通过构建三种1.2kPxR—pGL3—Basic表达质粒(T—24622T—pGL3、A-24446A—pGL3与靶片段无突变—pGL3),以pGL3重组质粒与phRL—CMV共转染HepG2细胞,考察一24622A>T及—24446C>A对PXR自身表达的影响。t-检验进行统计学评价,P<0.05有统计学意义。 结论: 这两个发生于hPXR基因启动子关键区域的SNP-24622A>T与-24446C>A使PXR自身转录活性增强。 第三部分 CYP3A4底物硝苯地平的质谱检测方法的建立与确认 目的: 硝苯地平经CYP3A4代谢,因而常用作探针药反应CYP3A4代谢活性。本实验将在第四部分考察hPXR的不同单倍型对与CYP3A4代谢表型的关系,将以硝苯地平为探药。故先建立硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平的质谱检测方法,并进行验证,为下一步检测受试者血浆中硝苯地平及氧化硝苯地平浓度,从而反应相应的CYP3A4活性奠定基础。 方法: 1.建立硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平检测的质谱方法、液相方法及血浆样本的萃取方法。 2.进行全面的方法学验证:包括方法的精密度、准确度、线性及最低检测限、稳定性及基质效应等。 结果: 1.建立了硝苯地平及其代谢物氧化硝苯地平的LC/MS/MS的检测方法。萃取方法以尼群地平为内标,以无水乙醚:正己烷(3:1,v/v)为萃取剂。质谱条件为:离子源EST,正离子扫描及选择反应监测模式(SRM),监测离子为:m/z 347.1→315.0(硝苯地平),m/z 345.1→248.3(氧化硝苯地平)及m/z 361.0→315.0(内标)。液相条件:分离柱Hypersil BDS C18(150 mm×2.1 mm,i.d.,3μm,Elite HPLC,China)、流动相为甲醇—水(80:20,v/v)(0.1%甲酸),流速200μl/min。色谱保留时间为2.5分钟。 2.方法学验证:硝苯地平及氧化硝苯地平的线性范围均为0.5-100 ng/ml。两者的萃取回收率分别为81.3-89.1%和71.6-80.4%,两者的日内及日间精密度、准确度、稳定性的RSD及偏离度均小于15%,符合生物样本检测的要求。结论:建立了LC/MS/MS方法检测人血浆中硝苯地平及氧化硝苯地平浓度,方法精密度、准确度好,灵敏度高,适用于人体药动学研究。 目的: 本实验主要考察hPXR诱导剂SJW(St John’s Wort,金丝桃素制剂)应用前后,hPxR的不同单倍型对与CYP3A4代谢表型的相关性,同时也考察了SNP-24622A>T和-24446C>A与CYP3A4代谢表型的相关性,为明确hPXR单倍型与CYP3A4药物代谢表型间的关系,为探讨CYP3A4代谢表型个体差异的原因提供试验依据;最终为临床用药个体化提供理论指导。 方法: 1.以本试验人群中最常见的两种单倍型组成的三种单倍型对为研究对象,挑选10例受试者进入药动学试验研究。(4人hapl&1,3人hapl&2和3人hap2&2) 2.对上述所选受试者的CYP3A4的基因型进行检测,保证进入药动学研究的受试者CYP3A4的基因型一致。 3.试验为双周期自身对照,受试者服用SJW片剂每日三次,每次300mg。试验前后的CYP3A4活性用硝苯地平及其代谢物的AUC以及两者的比值表示。硝苯地平及其代谢物的血药浓度用LC/MS/MS检测。4.试验数据通过mean±SD表示,采用秩和非参数统计检验,P<0.05认为具有显著意义。结果: 1.Hapl&1,Hapl&2和Hap2&2组中硝苯地平的药动学特点 在服用诱导剂SJW前后,所有受试者硝苯地平的AUC均显著下降,相应地,对于代谢物氧化硝苯地平,AUC均显著升高,经t-检验,试验前后的改变有统计学意义(P<0.05),表明PXR被SJW诱导后,使CYP3A4的转录表达增强,其底物(硝苯地平)的代谢加速,同文献报道一致。 2.Hapl&2组中有与无突变-24622A>T对硝苯地平人体药动学的影响 在Hapl&2组中,两名受试者具有突变-24622A>T,而两名受试者无此突变。无论有无-24622A>T突变,受试者服用诱导剂后,硝苯地平的AUC均下降约40%~45%;但代谢物AUC的升高却因有无-24622A>T突变而有差异,无-24622A>T突变的受试者代谢物AUC升高33.8%,而有-24622A>T的受试者代谢物AUC仅升高11.3%。不过经秩和检验,差异无统计学意义。因而,该突变是否会对PXR的转录激活作用造成影响,还需进一步研究。 3.Hap7&1l组中有与无突变-24446C>A对硝苯地平人体药动学的影响 在第二部分实验中,我们运用报告基因的方法发现突变-24446C>A使PXR自身表达显著增强,推测其可能使PxR对下游基因的转录调控作用增强。因而我们利用人体药动学试验对其进行初步验证。不过,受试者的选择非常困难,因为要保证入选的受试者的hPXR单倍型组成必须一致,但具有突变-24446C>A的7个健康志愿者中,其相互间的单倍型组成差异很大,很难找到阴性对照,最终只入选了两例受试者,单倍型组成为Hap7&ll,一个有-24446C>A突变,一个无此突变。 结论: 1.在中国人群常见的两种hPXR基因单倍型组成的三种单倍型对中(Hapl&1,Hapl&2和Hap2&2),Hap1&1对CYP3A4的基础转录激活作用最弱,诱导转录激活作用最强。 2.单倍型组成Hap7&11的hF)XR对肠道P—gp及CYP3A4的诱导转录激活作用强于Hap1&1,Hap1&2和Hap2&2。 3.位于启动子关键调控序列的突变-24622A>T与-24446C>A可能使PXR自身表达增强,从而使PXR对肠道P—gp及CYP3A4的转录调控作用强于无突变类型,不过因受试者少,需进一步研究确证。
[硕士论文] 徐云婷
药物分析学 苏州大学 2016(学位年度)
摘要:莱鲍迪苷A(RA),是从甜叶菊的叶子中提取出来的一种糖苷,已经作为一类天然甜味剂广泛用于食品、保健品等日常饮食生活中。食用莱鲍迪苷A后,在肠道菌群的作用下水解生成其苷元甜菊醇,甜菊醇吸收进入血液循环,进一步发生葡萄糖醛酸化然后经尿液排泄排出体外。甜菊醇酰基葡萄糖醛酸结合物(SVAG)是人和大鼠服用RA后,在体循环中存在的主要形式。
  本文主要通过体内外方法,探讨SVAG与一些药物之间的相互作用。大鼠体内动力学研究表明,大鼠灌胃口服 RA6小时后,SVAG逐渐达到最大血药浓度,并且发现肝脏中SVAG浓度远远高于血浆,肝-血浆比大于20倍。当大鼠给予抗生素处理后,胃肠道中β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性明显降低。结果显示,SVAG最大血药浓度(Cmax)和曲线下面积(AUC)都降低大于3倍,但是,抗生素处理并不会影响SVAG体内肝-血浆分布比值。最近有研究报道显示,吉非贝齐和氯吡格雷酰基葡萄糖醛酸结合物是 CYP2C8代谢酶的时间依赖性抑制剂,于是考察SVAG对主要细胞色素P450代谢酶抑制作用影响。研究结果表明,SVAG不会对主要细胞色素P450酶,如CYP1A2、2C9、2C19、2D6和3A4产生抑制作用,但是会抑制CYP2C8代谢酶活性。进一步考察其抑制类型,SVAG可逆性抑制 CYP2C8介导的紫杉醇6α-羟基化反应,但 SVAG并不是CYP2C8的时间依赖性抑制剂。SVAG还能够在人肝微粒体和人源重组酶CYP2C8体系中,抑制CYP2C8介导的瑞格列奈3’-羟基化反应,抑制常数(Ki)分别为15.8μM和11.6μM。可是在大鼠肝微粒体中,SVAG并不能抑制CYP2C8活性。另外,当莱鲍迪苷A和瑞格列奈联合用药时,瑞格列奈大鼠体内血浆Cmax和AUC并没有显著变化。于是继续用数学静态模型考察SVAG与瑞格列奈人体内药物相互作用,数据显示,SVAG可能会影响瑞格列奈体内处置过程,影响瑞格列奈体内AUC。所以,当人体同时服用瑞格列奈和莱鲍迪苷A用于血糖控制时,SVAG可能会提高瑞格列奈体内暴露量,必须谨慎注意由此带来的低血糖症状。肾脏是参与药物和外源性物质排泄的主要器官,有机阴离子转运体(OATs)则主要位于肾近端小管基底膜上,对药物和外源性物质从血液中摄取排泄到尿液中起至关重要的作用。SVAG在人体中主要是经肾脏排泄排出体外,我们之前的实验研究表明SVAG是有机阴离子转运体3(OAT3)的底物。利用稳定转染人源OAT3基因的HEK293细胞株模型,研究显示丙磺舒能够抑制SVAG细胞摄取,半数抑制浓度(IC50)为4.95μM。在大鼠肾切片模型中,SVAG主动摄取曲线很好地符合米氏动力学方程,米氏常数(Km)值为368.1μM。SVAG肾摄取会被人源OATs抑制剂丙磺舒和硫酸-3-雌酮抑制。当莱鲍迪苷A和20 mg/kg丙磺舒联合用药时,SVAG大鼠体内动力学变化明显,SVAG大鼠体内血浆Cmax增加2.15倍,AUC0-2增加1.71倍。综上所述,肠道菌群对SVAG体内生成起非常重要的作用,OAT3调控SVAG肾摄取和尿排泄,并且该排泄途径能够被强抑制剂抑制。另外,SVAG能够中等强度、可逆性抑制CYP2C8活性。总而言之,当莱鲍迪苷A与瑞格列奈联合用药,用来控制血糖的时候,应谨慎避免同时服用像丙磺舒之类的OATs抑制剂药物,值得注意的是,肾功能障碍患者更应该谨慎注意莱鲍迪苷A与瑞格列奈的联合用药。
[博士论文] 刘章锁
内科学(消化) 郑州大学 2004(学位年度)
摘要:环孢素A(cyclosporine A,CsA)系一具有划时代意义的免疫抑制剂,其临床应用显著改善了实体器官移植的近期存活率,尽管新型免疫抑制剂不断涌现,CsA仍然是器官移植后免疫抑制和抗排斥反应的首选药物.但CsA也有很强的副作用,是限制其临床应用的主要原因,CsA慢性肝、肾毒性所致的肝肾纤维化已成为器官移植领域亟待解决的问题.罗格列酮(rosiglitazone,RGZ)属噻唑烷二酮类(thiazolidinediones,TZDs)胰岛素增敏剂,通过激活过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR γ)而发挥作用.PPAR γ属Ⅱ型核受体超家族成员,参与脂肪代谢、核酸代谢、细胞周期和细胞分化等代谢过程,亦参与炎症和细胞外基质重塑,从而在抗炎、抑制纤维化等非代谢性调节方面起着重要作用.因此,我们推测PPAR γ可能是防治CsA导致的肝、肾器质性病变的一个新靶点,到目前为止,有关RZG对CsA慢性肝、肾毒性保护作用的研究国内外均未见报道.该实验采用低盐饮食(low salt diet,LSD)饲养的大鼠CsA慢性肝、肾毒性模型,观察RGZ对CsA慢性肝、肾毒性的保护作用,并在体外分别培养肾间质成纤维(normal rat kidney,NRK)细胞和肝实质(Buffalo Rat Liver,BRL)细胞,进一步监测RGZ对CsA细胞毒性的干预作用,初步探讨其内在的可能机制.该实验分为以下两个部分:第一部分罗格列酮对环孢素A慢性肾毒性保护作用的实验研究.第二部分罗格列对环孢素A肝毒性保护作用的实验研究
[硕士论文] 刘晓旦
中药学 河南大学 2016(学位年度)
摘要:背景:肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,其致死率在肿瘤相关疾病中排名第三位。近年来虽然早期诊断,以及放疗、化疗和手术治疗的联合使用使肝癌的治疗有了一定的提高,然而,到目前为止,肝癌患者的预后仍然不容乐观。化疗是治疗肿瘤的重要手段之一。化疗药物的主要缺陷是缺乏肿瘤细胞选择性,将药效基团与多胺基团结合,形成多胺缀合物,可提高药效团与肿瘤细胞的亲和力,进而具有肿瘤细胞选择性。萘内酰胺及其衍生物是DNA嵌入剂,具有显著的抗肿瘤活性。将萘内酰胺与多胺缀合,可增加萘内酰胺的水溶性和抗肿瘤活性,并使之具有肿瘤细胞选择性。因此,开发具有靶向性转运萘内酰胺进入肿瘤细胞的萘内酰胺-多胺缀合物是当今化疗研究领域中一个新的热点。然而,对萘内酰胺-多胺缀合物抗肿瘤机制的研究尚不广泛,其机制尚未完全澄清,近些年来经过对多胺的修饰合成的多胺缀合物在抗癌方面的应用引起了人们的广泛关注,研究表明:天然或合成多胺有潜力发展成为一种有效利用细胞膜上多胺转运体的勒向载体,它们可能具备提高化合物细胞选择性和生物活性的能力。萘酰亚胺类化合物在抗癌类药物研究方面,己经发现一些经典化合物,如氨萘菲特(Amonafide)和米托萘胺(mitonafide),氨萘菲特已处于III期临床试验。但在临床试验中发现很多不足之处,如具有神经毒性、骨髓抑制以及对不同肿瘤表现出差异性等。大量实验发现萘酰亚胺类化合物能够在抗肿瘤方面,表现出较强的抑制作用,同时在抑制肿瘤转移方面也有较好的作用,对萘酰亚胺类衍生物进行结构修饰的目的是增加疗效以及减少毒性等不良反应,增加该类化合物对肿瘤细胞的靶向作用。
  目的:本文以肝癌细胞SMMC-7721、Hep G2为研究对象,以期探讨萘内酰胺-多胺缀合物TRG9在肝癌细胞中的生物学功能及其潜在的作用机制。
  方法:通过MTT法来检测TRG9的抗肿瘤活性,通过AO/EB,Annexin V-FITC/PI荧光染色法检测TRG9对细胞的凋亡的影响;通过transwell小室实验和划痕实验,研究TRG9对细胞迁移的影响;通过免疫印迹法来检测Caspases家族,Bcl-2家族,PARP,MMP家族等相关的蛋白的表达,并对其相互关系进行了分析。通过小鼠荷瘤实验检测TRG9对实体瘤以及小鼠肺转移活性的影响。
  结果:目前的数据表明TRG9抑制两种肝癌细胞SMMC-7721以及Hep G2,通过对两种细胞处理48h,发现都有生长抑制作用,对SMMC-7721细胞的IC50值是(3.30±1.92)μM,对Hep G2细胞的IC50值是(3.51±1.36)μM,相应的,阳性化合物氨萘菲特IC50值分别为(13.47±2.28)μM,(6.57±1.39)μM。两种肝癌细胞对于TRG9不耐受,并且凋亡呈时间剂量依赖性。通过transwell小室的迁移实验发现TRG9可以抑制肝癌细胞的迁移,并呈现剂量依赖性。通过染色观察 TRG9会诱导肿瘤细胞发生凋亡。免疫印迹实验结果表明TRG9引起Caspases家族的活化,Caspases-3的表达增多,Bcl-2家族参与了凋亡的过程,Bcl-2蛋白的下调,Bax蛋白的上调,侵袭相关的MMP家族的成员MMP-2的下调。体内实验表明TRG9原位抑瘤率55.79%,抑制肺转移率为78.46%。
  结论:萘内酰胺-多胺缀合物TRG9抑制肝癌细胞的增殖、迁移,并能诱导肝癌细胞通过Caspase途径发生凋亡,体内活性研究可有效降低肿瘤原位生长以及肺转移结节数。
[硕士论文] 王伟美
药理学 河北医科大学 2016(学位年度)
摘要:目的:建立大鼠血浆中酒石酸美托洛尔的UPLC测定方法,并考察盐酸沙格雷酯对酒石酸美托洛尔在大鼠体内药代动力学的影响,完善两药合用的药代动力学研究。
  方法:色谱条件:色谱柱为Acquity UPLC(R) BEH C18柱(2.1mm×50mm,1.7μm),流动相为甲醇∶0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲液(以磷酸调至pH3.6)(31:69,V/V),检测波长225nm,流速0.36mL/min,柱温30℃,进样量2μL,选择拉莫三嗪为内标。
  动物实验方法:将整个实验分为单次给药实验部分和连续给药7天部分。单次给药实验部分,将健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为2组,每组20只,对照组大鼠灌胃给予酒石酸美托洛尔27mg·kg-1,实验组大鼠灌胃给予盐酸沙格雷酯10mg·kg-1和酒石酸美托洛尔27mg·kg-1,分别于给药后0h、0.17h、0.33h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h和5h并于眼内眦取血0.5mL,置放有肝素钠的抗凝离心管中,离心(16600×g)2min后取上层血浆,置-40℃冰箱保存待测;连续给药7天实验部分,将健康雄性Wistar大鼠40只,随机分为2组,每组20只,实验组灌胃盐酸沙格雷酯10mg·kg-1每天3次和酒石酸美托洛尔27mg·kg-1每天1次,连续7d;对照组灌胃给予酒石酸美托洛尔27mg·kg-1,每天1次,连续7d。第7天灌胃后分别于0h、0.17h、0.33h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h眼内眦取血0.5mL于肝素钠抗凝离心管中,离心(16600×g)2min后取上层血浆,置-40℃冰箱保存待测。
  血浆处理方法:取大鼠血浆200μL,置5mL离心管中,加内标溶液20μL,混匀后加入提取剂乙酸乙酯1mL,涡旋混合1min,离心(16600×g)2min,取上清液于5mL离心管中,40℃水浴氮气流吹干后以流动相100μL复溶,2μL进样并测定。
  药动学参数处理方法:用DAS2.1.1软件对每只大鼠的系列血药浓度进行统计矩自动拟合得到药动学参数,用SPSS13.0软件对2组的主要药动学参数进行统计学分析。若进行比较的2组数据均服从正态分布,用两个独立样本的t检验进行分析,若其中任意一组不服从正态分布,用非参数检验进行分析。当检验的P值小于0.05时则认为两组间差异有统计学意义。
  结果:酒石酸美托洛尔的保留时间为1.45min,拉莫三嗪的保留时间为1.75min,血浆内源性杂质对其浓度的测定无干扰;标准曲线为Y=1.358X+0.006(r=0.9995);酒石酸美托洛尔低(0.0625μg·mL-1)、中(0.5μg·mL-1)、高(2μg·mL-1)三个浓度的方法回收率依次为96.69%,93.51%和95.33%,提取回收率分别为67.12%,69.48%和70.57%,拉莫三嗪的提取回收率为84.86%;酒石酸美托洛尔低、中、高三个浓度的日内RSD分别为9.45%,5.20%和5.68%,日间RSD分别为8.75%,1.05%和7.87%;酒石酸美托洛尔血浆样品于-40℃低温保存7天及反复冻融三次后性质稳定,且处理后的血浆样品于4℃放置4h对测定无影响。
  药动学参数:单次给药实验部分,实验组和对照组主要药动学参数如下,AUC0-5h分别为(0.82±0.37)mg·h·L-1和(0.96±0.46)mg·h·L-1;AUC0-∞分别为(0.93±0.44)mg·h·L-1和(1.05±0.49)mg·h·L-1;t1/2分别为(1.45±0.58)h和(1.42±0.41)h;Tmax分别为(0.89±0.27)h和(0.85±0.28)h;V分别为(66.3±22.9)L·kg-1和(61.5±30.6)L·kg-1;CL分别为(35.1±16.1)L·h-1·kg-1和(30.1±11.2)L·h-1·kg-1;Cmax分别为(0.49±0.24)mg·L-1和(0.64±0.35)mg·L-1。结果显示,数据显示二组间无显著性差异(P>0.05)。连续给药7天实验部分,实验组和对照组主要药动学参数如下,AUC0-5h分别为(0.98±0.41)mg·h·L-1和(0.84±0.40)mg·h·L-1;AUC0-∞分别为(1.08±0.42)mg·h·L-1和(0.91±0.41)mg·h·L-1;t1/2分别为(1.40±0.36)h和(1.23±0.36)h;Tmax分别为(0.66±0.31)h和(0.51±0.10)h;V分别为(57.02±23.46)L·kg-1和(58.19±22.61)L·kg-1;CL分别为(28.60±10.89)L·h-1·kg-1和(33.94±13.59)L·h-1·kg-1;Cmax分别为(0.62±0.39)mg·L-1和(0.71±0.40)mg·L-1。实验组的AUC0-5h、AUC0-∞、t1/2、CL、V、Cmax和Tmax与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。
  结论:本文所建立法测定大鼠血浆中酒石酸美托洛尔浓度的UPLC-UV法,较HPLC法分析速度快,灵敏度高,而且节省试剂;较LC-MS/MS法费用较低,仪器易得,操作简便。进行全面的方法学验证后,证明所建立的方法专属性、灵敏度、精密度、准确度较好,适用于盐酸沙格雷酯对酒石酸美托洛尔大鼠体药动学变化研究。
  单次给药实验,大鼠单独灌胃给予酒石酸美托洛尔以及联合给予盐酸沙格雷酯后,体内药动学参数均无统计学差异,提示盐酸沙格雷酯不影响酒石酸美托洛尔的代谢,初步推断大鼠体内盐酸沙格雷酯对酒石酸美托洛尔无竞争作用。连续给药7天实验,大鼠单独灌胃给予酒石酸美托洛尔以及联合给予盐酸沙格雷酯连续7天后,体内药动学参数无统计学差异,提示盐酸沙格雷酯不影响酒石酸美托洛尔的代谢,初步推断大鼠体内盐酸沙格雷酯对酒石酸美托洛尔无抑制作用。
[硕士论文] 阮昊
药物分析学 浙江大学 2006(学位年度)
摘要:药物大多是外来分子,进入人体后,一些药物可以以原形从人体排泄出去,然而大多数药物需要进行结构修饰才易于被排泄。这一结构修饰过程就被称为“药物代谢”。细胞色素P450(CYP)是最大的药物代谢酶蛋白超家族之一,主要分布于肝脏中,催化药物的氧化反应,90%以上的药物代谢都要通过肝微粒体酶的细胞色素P450进行。CYP催化药物的代谢具有范围广、专一性差、结构差别大、个体差异大、催化底物有交叉重叠性以及易受诱导和抑制等特点。在临床联合用药时,药物易在代谢环节产生相互干扰,结果使疗效增强甚至产生毒副作用,或疗效减弱甚至治疗失败,形成代谢性药物相互作用。FDA己就药物代谢及其相互作用的研究公布了相应的指导文件,以求在创新药物的早期研究阶段进行安全性评价,减少新药开发的风险,提高研发成功率。多年来,由于伦理道德方面的原因,使得对人P450酶的研究受到限制,而主要采用实验动物如小鼠、大鼠、兔等作为研究对象,但因P450酶存在较大的种属差异,故从实验动物模型中所获数据并不能直接反映人P450酶的特征。并且,由于P450类型较多而相对含量较少,其分离纯化十分困难,很难获得P450单一酶用于药物代谢研究。随着生物化学和分子生物学,如分子克隆、蛋白质纯化等技术的发展和应用,使我们有可能对人P450酶进行广泛而深入的研究,探讨其在内源性及外源性物质代谢中的作用。目前,人们已开始广泛采用体外克隆并表达人体药物代谢酶来进行药物代谢研究,且大多数CYP同工酶已通过不同表达系统在体外获得表达。例如在大肠杆菌(E.coli)、酵母、杆状病毒感染的昆虫细胞和哺乳动物细胞中已成功表达多种人P450酶。其中,杆状病毒.昆虫表达系统被认为具有高蛋白表达量及蛋白活性接近天然蛋白的综合特点,在异源表达P450酶时应用广泛。
[硕士论文] 张晓璐
药理学 中国医科大学 2006(学位年度)
摘要:本文对18名健康男性志愿者随机交叉口服受试制剂阿奇霉素分散片和参比制剂阿奇霉素分散片进行了药代动力学研究,采用微生物法测定了受试者服药后不同时间点血药浓度,计算了其药代动力学参数及相对生物利用度,以代替临床疗效观察。研究表明,受试制剂与参比制剂相比,受试制剂AUC0-t的90%置信区间为参比制剂相应参数的87.4%~104.0%,受试制剂AUC0-∞的90%置信区间为参比制剂相应参数的88.5%~102.9%,受试制剂Cmax的90%置信区间为参比制剂相应参数的75.0%~105.3%,受试制剂Cmax/AUC的90%置信区间为参比制剂相应参数的100.3%~114.2%。
[硕士论文] 郭喻
药理学 武汉大学 2005(学位年度)
摘要:  精密肝切片技术作为一种体外研究手段,近年来已广泛应用于异物(包括药物和毒物)代谢转化和毒理学的研究。但是目前尚未见病理状态下尤其是肝纤维化状态下肝切片代谢特征的报道。本文在建立肝纤维化精密肝切片技术,摸索体外最佳培养条件的基础上,研究了肝纤维化切片中Ⅰ、Ⅱ相药物代谢酶的表达及其诱导性,并运用该技术研究和比较了钙拮抗剂维拉帕米在正常和肝纤维化大鼠切片中的代谢情况。一、肝纤维化精密肝切片方法学的建立及药物代谢酶的诱导性研究。二、维拉帕米在正常和肝纤维化切片中的代谢对比研究
[硕士论文] 陈仁海
生物化学与分子生物学 中国科学院上海生命科学研究院 2005(学位年度)
摘要:  本文针对G蛋白偶联受体的SPA药物筛选技术进行了研究。 本文利用SPA技术,建立了快速灵敏、操作简单、可高通量的针对GPCR的药物筛选模型。通过SPA微球的最小化和细胞膜用量、孵育时间等实验条件的优化,建立了SPA-WGA法[35S]GTPγS结合实验和SPA-WGA法配体受体结合实验;由于SPA-WGA法[35S]GTPγS结合实验只能检测与Gi/o蛋白偶联的GPCR,而SPA-WGA法配体受体结合实验无法区别激动剂、拮抗剂和反向激动剂,为了弥补上述方法的局限,建立了SPA-抗体-[35S]GTPγS结合实验方法。
[博士论文] 王凤翔
眼科 解放军总医院;解放军医学院;军医进修学院;中国人民解放军军医进修学院 2005(学位年度)
摘要:目的:观察药物维甲酸(Retinoicacid,RA)对培养的人视网膜色素上皮(Retinapigmentepitheliumcell,RPE)细胞生长的抑制,以及对连接蛋白Cx43的表达的影响,分析维甲酸对细胞生长的抑制和细胞间缝隙连接功能、细胞间通道蛋白Cx43表达的相互关系;研制可以作为玻璃体腔内注射的可以生物降解的RA缓释系统;维甲酸和海藻酸钠制成海藻酸钠-维甲酸(alginatesodium-retinoicacid;AGS-RA)微球,研究该RA药物缓释系统对激光损伤模型中视网膜下增殖反应区形成的抑制作用。 方法:免疫组化方法观察缝隙连接蛋白(connexin43,Cx43)在培养的人RPE细胞中的表达特点;不同浓度的RA作用于培养的第4代人的RPE细胞,用MTT的方法观察RA对体外培养人RPE细胞生长的影响;用LY染料传输方法测定细胞间隙连接功能;免疫组化方法鉴别不同浓度RA影响后的缝隙连接蛋白Cx43的表达;Westernblot实验测定RA影响后RPE细胞的蛋白表达量的变化;原位杂交观察Cx43mRNA在RPE细胞中的表达特点;RT-PCR对RA影响后的RPE细胞的mRNA进行半定量观察;有机溶剂将维甲酸溶解,与1.5%的海藻酸钠均匀混合,用静电微囊发生器一次成型制作海藻酸盐-维甲酸微球;紫外分光光度仪测定微球的药物含量;体外释药试验:通过紫外分光光度仪测定RA的体外释放规律;玻璃体腔注入AGS-RA药物微球及空白微球,应用电生理、电镜、光镜的方法评价微球对视网膜的毒性;利用高压液相的方法观察微球的房水药代动力学特点;建立激光损伤动物模型(激光照射时间0.20s,光斑200μm,能量输出功率分别为420mw);激光光凝后立即玻璃体内注射AGS-RA微球、空白微球或BBS对照;激光光凝后1,2,3,4,6W周分别做视网膜病理组织连续切片,每一个时间点的各组取6个激光斑,分别测量激光斑的高度、宽度和面积并进行统计学分析。 结果:免疫组化染色显示体外培养的人RPE细胞表达缝隙连接蛋白Cx43,表达的部位主要在细胞浆和细胞膜;RA对人RPE细胞的生长有明显的抑制作用,其抑制作用呈剂量依赖性;LY染料传输试验表明在RA的作用下RPE细胞间通讯功能明显增强;Westernblot实验测定细胞的蛋白表达量显示维甲酸使RPE细胞中Cx43蛋白表达增加;原位杂交给Cx43mRNA定位显示表达部位主要在细胞浆和核;RT-PCR实验显示细胞所有细胞均表达mRNA,对mRNA进行半定量观察显示维甲酸使RPE细胞的mRNA表达量明显减少;我们制作的AGSS-RA微球经测定,大小是95.244±8.6265微米;药物包含量是1.7644±0.0453ug/mg;体外实验表明AGS-RA微球的RA药物均匀释放;玻璃体腔注射药物显示该微球缓释系统没有任何毒副作用;房水药代动力学研究显示药物在6W内基本均匀释放,仅第3天有一个释放峰;激光损伤后不同时间段病理连续切片发现激光损伤后视网膜全层细胞分布形态改变,局部增殖形成;经AGS-RA微球注射药物治疗,局部也有增殖反应,但是程度较轻,激光损伤增殖反应区的宽度经测量后,经过统计学分析,各组之间无明显区别(P=0.1205);激光增殖反应区的高度和面积经测定后,同一时间点的各空白微球组和对照组的高度和面积无显著差异,而和相应的实验组相比均有显著差异(p<0.05);同一组内的不同时间点之间的面积有显著差异(p<0.001),其中空白微球组、对照组的第4,6周的高度明显比前三周低,而实验组第三周开始面积明显降低(p<0.001);RS-RA微球的在玻璃体腔内的分解过程大致是:第一周保持形态上的完整性,基本上是圆形;第二周开始微球周边有些破解;第三周,破解程度加重;第四周时微球形态不规则;到第六周则完全崩解呈束状物。在整个实验过程中,微球周围的玻璃体无增殖、渗出等改变。 结论:RA抑制培养的RPE细胞的生长,其抑制作用呈剂量依赖性;RA提高RPE细胞间隙连接通讯功能、上调Cx43蛋白和Cx43mRNA在人RPE细胞中的表达;体内和体外实验结果表明AGS-RA微球可以起到药物RA的缓释作用;AGS-RA缓释系统对眼球没有任何毒副作用;激光损伤后药物应用后可以减轻激光损伤增殖反应的形成。
[硕士论文] 刘骅
药理学 安徽医科大学 2007(学位年度)
摘要:A771726是免疫调节药来氟米特 (leftunomide,LEF)在机体内的活性代谢物,后者在临床上主要用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、抗移植排斥反应和银屑病。A771726是原形药物,将其制成口服制剂在体内直接吸收起作用,省略了前体药物转化的环节,目前正在申报一类新药。本实验旨在观察A771726在大鼠体内的吸收、血浆蛋白结合、分布、排泄特点,并与来氟米特的相关药动学参数进行比较,进行合理评价,提供新药临床前研究资料,以支持人体药代动力学研究并为临床用药提供参考依据。 1.生物样品中A771726分析方法的建立 本文采用沉淀蛋白处理血浆样品和液液萃取处理生物样品,建立A771726的HPLC分析方法。色谱分离条件为:色谱柱:Kromasil ODS C<,18>(150×4.6mm);流动相为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH4.5)和甲醇(43:57);检测波长288nm;柱温:30℃。采用本文建立的生物样品预处理方法和反相高效液相色谱法分离测定生物样品中A771726的含量,生物样品预处理方法回收率高,色谱分离选择性好。本法的准确度、精密度、灵敏度、专属性和定量线性范围均达到了体内药物分析的要求。该方法成功运用于A771726的大鼠药代动力学研究。 2.A771726在大鼠体内的药代动力学研究 SD大鼠单次口服给药(3、6、12mg/kg)后不同时间点取血,用上述建立的HPLC法测定血浆中A771726的浓度,根据所得的血浆药物浓度一时间曲线,计算药动学参数,T<,1/2Ke> (h):16.71±2.34、14.69±1.94、16.4.5±2.49;AUC<,(0-tn)>(mg/L·h):271.38±78.87、785.57±170.92、994.13±165.43;C<,max>(mg/L):11.42±2.59、29.38±5.41、42.10±5.73;T<,max>(h):4.00±0.82、4.10±0.74、4.20±1.03;MRT<,(0-tn)>(h):22.07±1.80、21.91±1.60、20.71±1.88。单剂量口服A771726三个剂量组的药物吸收均成线性关系,其血药浓度-时间曲线符合一级吸收的一房室模型。 3.A771726的血浆蛋白结合率研究 血浆中加入A771726使最终浓度分别达到3,6,12μg/ml,每份加药血浆样品用平衡透析法在4℃条件下透析108h,透析结束后,用HPLC法分别测定血浆及缓冲液样品中的药物浓度,计算药物的血浆蛋白结合率,结果表明在上述范围内A771726与人的血浆蛋白结合率约97.7%,无浓度依赖性。 4.A771726在大鼠体内的组织分布研究 SD大鼠口服给药A771726 (6mg/kg)后,分别于给药后2h、12h、24h股动脉放血处死,立即取出各脏器组织,滤纸吸干浮血,称重后用生理盐水制成匀浆,取匀浆液处理,用HPLC法测定各组织中药物浓度。结果显示,给药后A771726分布于主要组织,各脏器组织中的药物含量均低于血浆,肝肾组织中A771726浓度较高,大多数组织在12h达高峰,脑、骨髓、胸腺、睾丸中含量较低。 5.A771726在大鼠体内的排泄研究 SD大鼠口服给药A771726(6mg/kg)后收集胆汁、粪便、尿液样品,记录体积和重量,用HPLC法分析样品中A771726的浓度,将胆汁、粪便、尿液中的药物浓度乘以相应的胆汁排泄量、粪便量、尿量,并累加求和,计算药物的累积排泄量。结果显示大鼠单次灌胃给药后,粪便的排泄结果显示,0~48h排泄量占总给药量的1.61%;尿液中的排泄结果显示,0~48h排泄量占总给药量的0.87%:0~24h内从胆汁排泄的A771726量占总给药量的13.88%。
[博士论文] 庞晶
微生物与生化药学 清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院 2012(学位年度)
摘要:第一部分,三聚氰胺和三聚氰酸在大鼠体内毒动学相互作用研究
   自2004年起至今,相继发生的亚洲和北美宠物中毒事件以及中国婴幼儿泌尿系统结石事件,都将矛头指向了三聚氰胺(Melamine,MEL),一时之间MEL作为公认的肾毒素被推到了风口浪尖,成为食品公共安全的焦点,受到广泛的社会关注。然而,一系列体外细胞实验和动物实验却证实MEL的肾脏毒性较低。
   研究表明,MEL在动物体内的肾脏毒性可能与其类似物三聚氰酸(cyanuricacid,CYA)的同时存在有关。MEL和CYA可通过结构上的羟基与氨基形成分子间氢键,从而组装成高度有序的网状聚合物。该聚合物在水中溶解性极差,在肾小管析出,从而形成肾结石,进一步引发毒性。
   两种药物联用往往引起二者在体内的药物动力学特性的变化。而目前对于MEL和CYA的动力学研究主要集中在不同种属动物单独给药方面,却未见MEL和CYA同时给药后哺乳动物的药动学研究报道。故本论文意在深入研究比较MEL和CYA单独给药和同时给药后毒动学特性,从而阐明毒性与动力学之间的关系。
   本研究首先从MEL入手,研究其单独给药以及与CYA同时给药后,MEL毒动学特性的差异。大鼠经灌胃单独给予MEL100mg/kg或同时给予MEL和CYA各100mg/kg后,我们分别开展了对肾脏毒性、MEL药物动力学和MEL肾脏组织浓度的研究。
   血清生化监测结果显示,单独给药组给药前后肾功能指标血尿素氮(BUN)和肌酐(Cre)未见明显变化,而混合给药组多数动物给药后BUN和Cre有不同程度的增大。病理检查结果显示,单独给药组肾脏组织未见明显异常,混合给药组除MIX1-M1,MIX1-M3和MIX1-F4轻度病变,其余动物为中度病变。毒理监测结果证实混合给药后毒性的增加。
   我们建立了大鼠血浆和肾脏中MEL的液相色谱—质谱联用的定量分析方法,用于评价MEL在大鼠体内的毒动学。取大鼠给药后不同时间点的血浆,并于处死后取肾脏进行分析。混合给药组与单独给药组相比,各动力学参数均显著变化(P<0.05),MEL的吸收减少,组织分布增加,消除变慢,产生一定程度的蓄积。
   肾脏MEL浓度检测结果表明,单独给药组肾脏中未检出或只检出微量MEL,而混合给药组各动物肾脏中均检测到一定量的MEL(2.96-274.15μg/g),也进一步证实了混合给药后MEL在肾脏产生了蓄积。另外,我们也间接证实了混合给药组肾脏中MEL-CYA聚合物的存在。
   我们的研究结果也预示着肾脏组织MEL的浓度与毒性的相关性。单独给药组肾脏中无MEL,未见毒性。混合给药组中肾脏MEL浓度较低的三只大鼠,血清生化监测显示无毒,病理检查显示轻度病变。而混合给药组中肾脏MEL浓度较高的大鼠血清生化监测显示出一定的毒性,病理检查显示中度病变。故我们推测,高浓度的MEL可能是肾脏毒性的一个风险因素。
   随后采用相同的思路和策略,我们研究了CYA单独给药以及与MEL同时给药后,CYA毒动学特性的差异。与第一部分研究结果相似,同时给予MEL后,CYA的动力学过程受到干扰,造成了肾脏CYA的蓄积。
   综上所述,我们的研究表明,MEL和CYA同时给药后,二者互相影响了对方的动力学性质,导致了MEL和CYA在肾脏的蓄积,这种蓄积也被证实与肾脏毒性具有强烈的相关性。我们对MEL-CYA聚合物的肾毒性有了更全面的认识。一方面,如文献报道其作为沉淀物在肾脏中形成物理阻滞,进而引发肾脏毒性;另一方面,聚合物形成造成了MEL在肾脏的滞留,逐步分解出来的MEL作为化学毒素不断损害肾脏。至此,我们以全新的视角切入,从动力学角度对MEL和CYA毒性的产生提供了全新的解释,对已有的毒性机制进行了完善与补充。
   第二部分,对新型抗微管抗肿瘤药IMB-105代谢性药物相互作用的预测
   N-(2,6-二甲氧基吡啶-3-取代)-9-甲基咔唑-3-磺酰胺(IMB-105)是我研究所研发的结构全新的小分子微管解聚剂,体内外抗肿瘤活性高,对耐药肿瘤有效,安全性好,具有良好的研发前景。在肿瘤的综合治疗中,药物治疗占有重要地位,在治疗过程中为了增强疗效,减少耐药发生,目前常采用多种抗肿瘤药物进行联合化疗。但药物联用的过程中往往由于药物相互作用而引发不良反应,其中代谢性药物相互作用最为常见。本论文旨在预测IMB-105发生代谢性药物相互作用的潜在可能性,为该药物的进一步开发和应用奠定理论基础。
   首先为考察IMB-105是否为受害药(Victimdrug),被单一的P450酶代谢,我们开展了IMB-105的生物转化研究。IMB-105与人肝脏S9组分和人肝微粒体共同孵育不同时间后,原药浓度逐渐降低,证明IMB-105在人肝脏中可被代谢。接下来,我们选取了最常见的10种重组表达的人源P450酶,分别与IMB-105共同孵育,考察参与IMB-105代谢的P450酶种类。结果显示,除了CYP2A6和CYP2E1外,其他8种P450酶CYP1A2,CYP286,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP3A4和CYP3A5均可以代谢IMB-105。因此IMB-105可以被多种P450酶代谢,不是受害药,与P450酶抑制剂联用时,代谢不会受到干扰。
   在此基础上,借助质谱的不同扫描模式,我们对IMB-105的代谢产物进行了初步的探索和预测,寻找到了5种代谢产物M1-M5。同时,在动物实验中,也证实了大鼠血浆和肝脏中这5种代谢产物的存在。
   随后,我们考察了IMB-105对主要P450酶的抑制作用,评价其是否为凶手药(Perpetratordrug),干扰其他药物的代谢。为选择合适的剂量,我们首先开展了IMB-105在大鼠体内的药动学研究,并同时对毒性进行了监测。结果显示IMB-105毒性较小,1000mg/kg剂量未见明显急性毒性。但药动学数据显示IMB-105吸收较差,治疗剂量250mg/kg给药后吸收达到饱和,血药浓度低于1μM。
   以大鼠体内血药浓度数据为依据,加10倍的风险因素,我们选取10μM为IMB-105最高浓度,评价0.1μM,0.5μM,1μM,5μM和10μM浓度的IMB-105对5种最重要的P450酶的抑制作用。
   结果:显示,IMB-105对主要P450酶的半数抑制率(IC50)除CYP2D6外均大于10μM,对CYP2D6的IC50值为6.7μM,比对IMB-105在大鼠体内的血药浓度,我们认为IMB-105对主要P450无强烈的抑制作用。
   综上所述,我们使用体外代谢方法预测了IMB-105与其他药物联用后发生代谢性药物相互作用的潜在可能性。结果表明,IMB-105被多种P450酶所代谢,不是受害药,与P450酶抑制剂联用时,代谢不会受到干扰;IMB-105对主要P450酶无强烈抑制作用,不是凶手药,不会干扰其他药物的代谢。
   从研究结果出发,我们对IMB-105未来的进一步研究与开发提出以下建议:
   1.IMB-105吸收较差,建议进行剂型优化。
   2.剂型优化之后,密切关注动物实验血药浓度,如浓度有显著提升,应重新评价酶抑制活性。
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