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[硕士论文] 魏翠云
生态学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:全氟辛基磺酸盐(Perfluorooctane sulfonate,PFOS),作为一种典型的全氟类化合物,具有生殖毒性、发育毒性、神经毒性、基因毒性等多种生物毒性效应,但目前关于PFOS影响脂代谢和糖代谢的分子致毒机制尚不清楚。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,Celegans)作为一种模式生物,体内的多不饱和脂肪酸合成通路结合了植物和动物的过程,与高等动物相比,具有完整的从头合成多不饱和脂肪酸的能力。本文以C.elegans作为研究对象,用不同浓度梯度PFOS暴露C.elegans研究其对脂代谢与糖代谢的影响,主要研究结果有:
  1.建立了C.elegans脂肪酸甲酯化方法,并用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)定量检测了C.elegans体内9种典型脂肪酸含量,实验结果表明用0.5%甲酯化试剂(H2SO4/MeOH),甲酯化时间2h,甲酯化回收率较高,且GC-MS检出限都在ng/mL范围,远远低于C.elegans体内的μg/mL浓度范围,分析方法灵敏度高。
  2.不同浓度梯度(0,0.01,0.1,0.5,1.5μmol/L)PFOS暴露L1期C.elegans72h,GC-MS定量检测结果表明PFOS会导致C.elegans中脂肪酸含量降低,与饱和脂肪酸相比,不饱和脂肪酸降低相对显著;进一步发现脂肪酸合成关键基因,如乙酰辅酶A羧化酶的相关基因acc-4,△9去饱和酶的相关基因fat-7相对表达量随PFOS浓度的增加而显著下调(p<0.05),说明PFOS可能通过影响脂肪酸合成初期反应关键酶的表达,而导致C.elegans体内各脂肪酸含量下降。
  3.脂质代谢与糖代谢与氧化磷酸化水平密切相关,PFOS暴露72h后,C.elegans中葡萄糖含量也随PFOS浓度的升高而降低,1μmol/L PFOS暴露后C.elegans中的丙酮酸和ATP含量都显著降低于对照组(p<0.05);我们分别测定了C.elegans体内与葡萄糖代谢有关的糖异生、糖酵解和胰岛素通路中相关基因pck-1,pyk-1,pyk-2,pfk-1.1,gpd-2,ctl-1,daf-2,daf-16的相对表达量,结果表明PFOS暴露可能通过影响C.elegans体内与糖代谢相关基因的相对表达,从而导致C.elegans体内糖代谢紊乱;PFOS暴露会导致C.elegans中脂肪酸、葡萄糖含量的降低,而丙酮酸和ATP含量下降,提示三羧酸循环也发生紊乱,这可能是PFOS暴露造成C.elegans死亡的原因。
  总之,本文建立了灵敏可靠的C.elegans体内脂肪酸的GC-MS分析方法,定量测定了PFOS暴露对C.elegans体内脂肪酸代谢及相关基因表达的影响,并进一步分析了PFOS暴露对C.elegans体内糖代谢和三羧酸循环的影响,实验结果表明PFOS可以显著抑制C.elegans体内脂代谢、糖代谢和ATP的合成,具有明显的毒性效应。
[硕士论文] 赵晶
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本研究以4-壬基酚(4-Nonylphenol,NP)为受试物,以SD雄性大鼠和睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)为研究对象,应用生物光谱技术研究NP的雄性生殖毒性效应。
  方法:
  1、用对照组(玉米油)、系列浓度(25、50、100mg/kg)NP腹腔注射,每两天一次,连续20天染毒不同日龄(21、35、50日龄)SD雄性大鼠,构建动物模型;取睾丸组织、提取原代睾丸细胞后,分别用Raman光谱和ATR-FTIR光谱检测大鼠睾丸组织和细胞的生物化学改变;
  2、用对照组(DMSO)、系列浓度(2.5、5、10和20μM)NP对睾丸SCs进行染毒培养24h,细胞经消化、洗涤、固定后用ATR-FTIR检测;
  3、采用主成分分析和线性判别分析(PCA-LDA)对获取的图谱进行多变量分析。
  结果:
  1、ATR-FTIR检测不同日龄大鼠的睾丸细胞,NP暴露组和对照组之间集群分离明显;且除了脂质区50日龄组中25mg/kgNP暴露组(P>0.05),其他暴露组与对照组的差异均具有统计学意义(P<0.001),并且显示出剂量-效应关系;聚类向量分析显示不同NP暴露下各组发生变化的生物标记物不同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率相比对照组均存在显著性差异(尸<0.001);
  2、ATR-FTIR分析不同浓度NP暴露下体外培养的睾丸SCs,NP暴露组和对照组集群图是分离开的,且在LD1平面NP暴露组和对照组效应差异显著(P<0.001);聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异(P<0.001);在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、肽聚集水平、酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ比率及磷酸盐与碳水化合物比率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  3、Raman分析不同日龄大鼠的睾丸组织,观察到各组大鼠的睾丸间质组织远离对照组,且不同NP暴露组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.001)。聚类向量分析显示各组发生变化的生物标记物不相同且与对照组相比具有明显的差异;在不同NP暴露下脂质与蛋白质比率、不饱和脂肪水平与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);
  结论:
  1、通过体内体外实验发现,不同浓度的NP对于睾丸组织和细胞产生的效应是不同的,而且伴有剂量效应关系;同时对不同的日龄大鼠所产生的的效应也各不相同;
  2、通过检测细胞的生物分子特征性变化,发现NP暴露可以干扰睾丸SCs和睾丸间质细胞脂代谢和糖代谢等细胞代谢过程,对睾丸细胞增殖活性有影响,也可以诱导蛋白质二级结构发生改变.
[博士论文] 徐汉卿
农药学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:氟虫腈作为苯吡唑类杀虫剂,因具有高效的杀虫活性,而一度被广泛地使用。但由于氟虫腈对环境中非靶标生物,尤其是水生生物造成严重危害,因此,多个国家已经限制其在农业上的使用。氟虫腈在环境中的残留所引发的对非靶标生物的高毒性成为环境科学领域研究的热点话题。
  本文通过二代测序、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术等方法,研究了氟虫腈对斑马鱼幼鱼发育早期阶段的急性毒性作用以及氧化胁迫和神经信号传导相关基因的表达影响,氟虫腈诱导斑马鱼幼鱼的DGE表达谱分析及相关转录因子的初步探究;以及氟虫腈对人SH-SY5Y和HaCaT细胞的毒性作用,并且结合表型变化初步探索了氟虫腈的毒性机理。本文得到结果如下:
  1发育75hpf的斑马鱼幼鱼在氟虫腈中暴露96h后的死亡率和畸形率显著升高,对应的LC50和EC50值分别为460μg/L和340μg/L,骨骼发育受到抑制导致体长显著变短,死亡率、畸形率及体长变化与氟虫腈浓度之间均呈现一定浓度依赖的关系。
  2亚致死浓度下,斑马鱼幼鱼对氟虫腈产生了氧化应激反应。CAT、CES、GST、POD、SOD酶活性在浓度分别为05、5、50、100μg/L的氟虫腈处理72h后均有不同程度的升高,且随着氟虫腈胁迫浓度的升高,酶活性均呈现先升高后降低的特征,都在氟虫腈浓度为5μg/L时,酶活性达到最大值。
  3亚致死浓度下,氟虫腈影响了斑马鱼幼鱼神经信号传导相关基因ache、chat、glrba的表达。氟虫腈浓度分别为5、10、50、100μg/L时,基因的相对表达量均呈现随着暴露时间延长而升高。
  4在环境浓度下,发育75hpf的斑马鱼幼鱼在浓度为05、5、50μg/L的氟虫腈诱导72h后的DGE表达谱分析结果显示,我们获得了一个高质量的DGE测序结果;3个浓度氟虫腈诱导下分别得到的差异表达基因数为58、75和98,其中上调基因数分别为2、4和7,下调基因数分别为56、71和91,各浓度下共同的差异表达基因数为44个,其中有9个为转录因子AP-1蛋白家族的编码基因,各浓度诱导下分别得到了12、112和23个显著富集的GO条目,包含生物过程和分子功能两个GO分类,各浓度诱导下共同富集到的GO条目主要涉及到细胞增殖、脂肪细胞代谢及转录因子活性,分别获得了7、6、9个显著富集的通路,其中HTLV-I refection(ko05166)、Osteoclast differentiation(ko04380)和HepatitisB(ko05161)为各浓度诱导下共同富集到的通路,qPCR验证结果显示,15个基因的相对表达量与DGE所得结果展现出高度的一致性,其Pearson's相关系数r=097018且P<0001。
  5分析了转录因子JDP2、Fosab和MIDN的编码基因在环境浓度为50μg/L的氟虫腈诱导下72h后的相对表达量。JDP2和Fosab两个转录因子分别调控破骨细胞的生成与分化,推测Jdp2b和fosab基因的显著下调表达能影响斑马鱼幼鱼的骨骼生长和发育,从而导致幼鱼脊柱弯曲或体长变短,JDP2能抑制细胞增殖及原癌基因的转化,推测Jdp2b基因显著下调对发育早期的斑马鱼幼鱼有致癌风险,midn基因的相对表达量与氟虫腈的环境浓度呈现剂量依赖的关系,可以成为斑马鱼幼鱼对环境浓度氟虫腈响应的新的潜在生物标记物,此外,MIDN是帕金森病致病机制中重要的调控因子,推测氟虫腈诱导的midn基因的显著下调表达有诱发鱼类等脊椎动物出现类似帕金森病的风险。
  6SH-SY5Y和HaCaT细胞都可以响应氟虫腈诱导而导致细胞存活率显著下降,且呈负相关性,HaCaT细胞对氟虫腈诱导表现得更加敏感,两种细胞的凋亡率都随氟虫腈浓度升高而升高,且随着氟虫腈作用时间的延长细胞凋亡率也在升高,表明氟虫腈对这两种人源细胞具有一定的毒害作用,且这种毒害会随着时间延长而累积。
[硕士论文] 张牧臣
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:食品遭受霉菌毒素污染的现象在世界范围内普遍存在,不仅给农业生产带来巨大经济损失,还给人类健康带来威胁。在众多霉菌毒素中,黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)是较常见且毒性较强的一类。在不同类型的黄曲霉毒素中,黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是毒性最强的一种,主要污染谷物粮油类食品,黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)是AFB1的衍生物,主要污染奶及奶制品。肠道作为机体免疫系统的第一道重要防线,是机体抵御肠腔内细菌、内毒素等病原体以及营养型抗原、毒素等外来污染物进入血液循环和组织器官的重要黏膜屏障。这种屏障功能依赖于完整的肠道上皮层结构,以及稳定健康的肠道内微生物区系结构。肠道细胞作为霉菌毒素早期暴露的细胞,暴露剂量往往高于其他组织细胞;另外肠道细胞属于蛋白质合成及代谢周转率较高且活性较强的细胞,容易成为霉菌毒素攻击的靶细胞,因此在最近的研究报道中,肠道组织及其功能已经逐渐成为研究霉菌毒素毒性作用的新靶点。随着人们生活水平的提高,“牛奶+谷物”的饮食模式已逐步成为常见的家庭膳食模式,在这种模式下,AFB1与AFM1在人体内共存并产生交互作用的潜在风险增加,但是与AFB1或AFM1单独作用相比,AFB1与AFM1共存后对人体健康危害风险是否改变,AFB1与AFM1联合毒性作用发生的分子机制及调控网络是什么等问题未得到解答。
  因此为了揭示AFB1与AFM1单独及联合作用对动物模型肠道健康的影响,解析毒性作用的蛋白组分子机理,筛选毒性作用靶蛋白开展本试验。本研究首先建立了单一剂量AFB1(03mg/kgb w)、单一剂量AFM1(30mg/kg b.w)及单一剂量AFB1与AFM1联合(0.3mg/kgb.w.AFB1+30mg/kgb.w AFM1)重复灌胃的ICR小鼠模型,并与灌胃毒素溶剂的小鼠做对照,每组10只小鼠,每天一次重复灌胃28天,期间记录小鼠健康状况及体增重。灌胃结束后处死小鼠,采集小鼠血液、肠道组织及肠道内容物。随后测定脏器指数,血液中的肠道损伤指标水平(血清中二胺氧化酶活性、D-乳酸含量、血清肠型脂肪酸结合蛋白含量及瓜氨酸含量),制作肠道组织切片观测小肠绒毛形态,检测肠道上皮细胞凋亡率,测定肠道杯状细胞数目,观测紧密连接蛋白定位变化规律;分析肠道内容物细菌群落结构变化规律,分析肠道组织蛋白质组变化规律,最后结合本试验结果及文献数据,探讨AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道结构、细胞活力及其屏障功能的损伤途径,发掘AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道细菌群落结构的改变规律,解析AFB1与AFM1单独及联合肠道毒性作用的分子机制。主要试验结果如下:
  一,AFB1与AFM1联合灌胃组小鼠血液中瓜氨酸含量显著低于对照组及单独灌胃组(p<005)。AFB1单独灌胃及其与AFM1联合灌胃组小鼠血液中二胺氧化酶活性显著高于AFM1单独灌胃组及对照组(p<005)。AFM1单独灌胃组及其与AFB1联合灌胃组小鼠血液中肠型脂肪酸结合蛋白含量显著高于对照组(p<005),且AFB1与AFM1联合灌胃组显著高于AFM1单独灌胃组(p<0.05);各处理组小鼠血液中D-乳酸含量均显著高于对照组(p<005),AFB1与AFM1联合灌胃组小鼠血液中D-乳酸含量显著高于单独灌胃组(p<005)。与对照组相比,AFB1单独灌胃组小肠全段(十二指肠、空肠及回肠)的绒毛长度显著降低(p<005),AFM1单独灌胃组小肠中后段(空肠及回肠)绒毛长度显著降低(p<005),AFB1与AFM1联合灌胃组小肠全段的绒毛长度显著降低(p<005),且对中后段的影响程度大于两毒素单独作用。AFB1与AFM1单独及联合灌胃未影响十二指肠绒毛隐窝深度,但AFM1单独灌胃组及其与AFB1联合灌胃组小鼠小肠中后段绒毛隐窝深度显著提高(p<005)。AFB1和AFM1单独及联合灌胃诱导小肠中后段细胞凋亡,且联合灌胃组细胞凋亡率明显高于单独灌胃组。AFB1和AFM1联合灌胃组结肠杯状细胞的数目显著降低(p<005)。另外,AFB1和AFM1联合灌胃组小鼠肠道上皮细胞Occludin1蛋白在细胞顶膜及细胞侧面膜顶端区域的分布减少,而在细胞质的分布增多,ZO-1蛋白在细胞质内发生由顶侧像基底侧的分布移位。
  二,在细菌群落的门水平、科水平及属水平,三个毒素处理组与对照组相比,小鼠肠道内容物细菌优势菌群均未发生明显排序变化,但不同的毒素处理,仍造成了不同分类水平下细菌菌群丰度的显著变化,其中AFB1灌胃组及其与AFM1联合灌胃组小鼠肠内致病菌或条件致病菌,如Facklamia属、Staphylococcus属、Corynebacterium属细菌丰度显著升高(p<005)。而AFM1灌胃组未见显著差异。
  三,(1)与对照组相比,AFB1与AFM1单独及联合灌胃组与小鼠肠道细胞活力,蛋白质转运,细胞形状及骨架调控,响应真菌及药物代谢等生物过程相关的蛋白质丰度差异表达,且联合灌胃组相关差异表达蛋白质数量多于单独灌胃组。(2)与对照组相比,AFB1与AFM1单独及联合灌胃组小鼠肠道细胞凋亡信号通路,细胞癌变相关信号通路均被激活,且联合灌胃组更显著;此外,两毒素单独灌胃组相比及分别与联合灌胃组相比,差异表达蛋白质所富集的通路存在差异:AFB1单独灌胃组差异表达蛋白质主要富集在醚脂类代谢、磷酸肌醇代谢、甘油磷脂代谢、脂肪的消化和吸收等信号通路;AFM1单独灌胃组主要富集在蛋白质输出、病毒感染、内质网中的蛋白合成等信号通路;AFB1和AFM1联合灌胃组主要富集在补体和凝血级联、蛋白质输出、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、癌症MicroRNAs、药物代谢-细胞色素P450、MAPK等信号通路。(3)与单独灌胃组相比,两毒素联合灌胃组小鼠肠道细胞中负责解毒及代谢外来异物的蛋白质,如UDP-GT1、UDP-GT2、Gstm6等的表达量显著下调(p<005),细胞紧密连接结构相关蛋白质Claudin7及IQGAP2的表达量显著下调(p<005),细胞凋亡相关蛋白质MAP4K3表达量显著上调(p<005)。
  本试验的主要结论包括:AFB1与AFM1联合作用增强了两者单独作用对小鼠肠道细胞活力、紧密连接结构的损伤,导致肠道物理屏障功能受损;两毒素联合作用主要通过抑制肠道细胞对毒素及外来异物的代谢解毒通路活性,抑制肠道紧密连接结构相关蛋白质表达,以及激活细胞凋亡相关通路等机制增强肠道毒性,涉及的主要靶蛋白包括UDP-GT1、UDP-GT2、Gstm6、MAP4K3、Claudin7及IQGAP2。AFB1单独作用及其与AFM1联合作用诱导小鼠肠道内致病菌或条件致病菌,如Facklamia属、Staphylococcus属、Corynebacterium属细菌增殖,改变肠道内健康微生物区系,损伤肠道微生物屏障功能。
  综上,本研究在动物模型上系统性验证了AFB1与AFM1对肠道细胞、肠道结构完整性及屏障功能的损伤毒性,并发现了AFB1与AFM1联合摄入后存在增强肠道毒性的风险,首次从蛋白质组学水平解析了AFB1与AFM1单独及联合损伤肠道结构与功能的分子机制,筛选了毒性作用靶蛋白。研究结论对于科学评估黄曲霉毒素联合作用的健康危害、防控新的食品安全隐患具有重要的科学意义。
[硕士论文] 宋月
食品科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:布洛芬(Ibuprofen,IBU),作为一种非处方药常用于缓解病痛和退烧症状,同时也是一种广泛存在于水环境中的新型环境污染物—药品及个人护理用品(PPCPs)。研究表明,布洛芬可以导致氧化损伤,免疫功能紊乱和神经损伤等。布洛芬属于手性药物,R-(-)-布洛芬和S-(+)-布洛芬在环境中都有检出且在性质和毒性方面存在差异。所以,研究布洛芬对水生生物的立体选择性毒性影响具有重要的现实意义。
  目前对于布洛芬对映体的立体选择性毒性研究较少。本论文以斑马鱼为模式生物,借助于组学技术探究了布洛芬外消旋体及对映体对斑马鱼成鱼的立体选择性毒性效应及作用机制,并得出以下结论:
  本论文首先采用高效液相色谱技术对布洛芬进行拆分,制备暴露实验所需对映体单体,并考察在24小时内,R-(-)-布洛芬和S-(+)-布洛芬单体在不同环境条件(温度,光照)及不同溶剂中的转化情况。结果表明,单体稳定,可用于暴露试验。
  采用UPLC-Qtof-MS对暴露结束后的斑马鱼脑组织中的极性小分子代谢物进行非靶向代谢组学分析。筛选出45种生物标志物和26条相关的代谢通路,主要涉及能量代谢、氧化应激、基因调控、神经发育及细胞生长等。此外,借助于LC-MS/MS对22种氨基酸进行定量分析。结果发现,与神经系统发育相关的酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸等,与氧化应激相关的半胱氨酸、甘氨酸和蛋氨酸等,与免疫功能精氨酸等,与能量代谢相关的谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸等,均发生了变化,且经过布洛芬不同单体暴露后均表现出明显的立体选择性差异。
  借助于UPLC-Qtof-MS对布洛芬暴露结束后的斑马鱼脑组织样品中的脂质分子进行脂质组学分析,鉴定出46种生物标志物,主要包括甘油磷脂,胆固醇酯,孕烯醇酮、甘油脂和鞘脂。同时,进行了代谢通路分析。此外,借助于Qtrap建立了46种鞘脂的定量方法,并对暴露结束后的斑马鱼成鱼脑组织内的46种鞘脂进行定量分析。结果显示,有16种鞘脂存在明显的组间差异。结果表明,长期布洛芬暴露会导致成鱼脑组织出现脂质代谢紊乱,且布洛芬的不同单体对于斑马鱼脑部脂质代谢物种类和含量的影响存在明显的立体选择性差异。
  分别采集暴露后7天、14天和28天的斑马鱼脑组织,测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的变化。结果表明,脑组织中的SOD和CAT在暴露初期和中期并未发生明显变化,但是28天出现了明显的上升,不同单体暴露组中SOD未表现出明显差异,而外消旋体和单体暴露组之间的CAT表现出显著差异。脑组织中的GST在暴露初期表现出明显上调,暴露中期和后期均表现出显著的组间差异。结果表明,长期布洛芬暴露可能会导致斑马鱼成鱼脑部一定程度的氧化损伤,且不同单体暴露组表现出明显的立体选择性差异。
  本文通过对经布洛芬暴露后的斑马鱼成鱼的脑组织进行代谢组学分析、脂质组学分析和抗氧化酶活分析,证明了环境浓度的布洛芬会导致斑马鱼体内发生代谢紊乱和氧化应激反应。本研究为环境中其他新兴环境污染物的毒理学研究提供了新思路。
[硕士论文] 余静
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在基因治疗的过程中,病毒载体和非病毒载体作为两大转载工具被广泛运用。但是由于病毒载体具有较高的细胞毒性以及其他缺陷,它的使用已经越来越受到实际条件的限制。此时,阳离子脂质体(cationic liposomes,CLs),作为最有发展前景的非病毒载体逐渐被重视。CLs作为一种常用的非病毒载体,可用来输送基因或药物分子进入细胞,是一种具有巨大临床应用潜力的纳米载体。由于其能够反复、多次运用于转染实验,表面不含有抗原反应成分并且可以携带转染的外源性基因的容量大等优势,近年来在医学研究方向得到了快速的发展。但是,也有部分研究人员从另一方面指出,尽管CLs已经具备了多种优势,但是仍然无法避免细胞毒性现象的出现。尽管多年来研究人员致力于优化CLs的制备方法以及结构改良,但是都无法避免的存在一定的细胞毒性问题。由于脂质体粒径较小,进入生物体后,靶向聚集于肝脏等体内器官,引起炎症等不良反应以及毒副作用,更可惜的是,尽管CLs的毒性现象很早就被察觉,到目前为止,很多文献也仅报道了CLs出现细胞毒性的现象以及部分作用机制,对于CLs产生毒性的深层次研究并没有十分透彻。因此,想要在纳米毒理学方面获得全部的、准确的生物信息是目前研究面临的最大挑战,这也在一定程度上阻碍了CLs的临床应用。
  有研究指出,CLs具有较高的细胞膜活性,在进入机体穿过生物膜后,会影响细胞膜和细胞器膜的完整性和功能,引起毒性反应。本文通过整合多种系统生物学方法,构建CLs造成细胞毒性的蛋白-代谢层面分子网络机制图,用以阐述CLs细胞毒性的潜在机制。用于研究CLs毒性机制的细胞模型较多,但鉴于人体内摄入和产生的绝大多数化合物的代谢和清除主要经过肝脏,而肝脏也因此被公认是药物和纳米颗粒进行代谢的主要场所;同时,100-200nm范围内的纳米颗粒主要优先沉积于肝脏,肝细胞株作为机体致癌性和肝毒性有关研究的主要模型广泛应用于各类细胞毒性试验,也是大多数纳米载体作用的靶细胞。因此,本实验也选用人正常肝细胞L02作为靶向分析的对象进行后续研究。薄膜分散法因为操作简便、对仪器精密度要求不高而且操作方便等优势被广泛运用于制备过程中。本课题采用薄膜分散法制备出了一批物理特征明显、性质稳定的CLs,通过CCK-8实验计算得到这批CLs的半数致死量(IC50值),并以1/2IC50值作为后期实验组给药剂量。再利用多组学技术平台对L02细胞内物质进行全面分析和检测。
  通过对特定研究对象内全部的蛋白质的表达水平以及翻译过程进行探索和研究的方法就叫做蛋白质组学(Proteomics)。某一细胞或者组织内全部的蛋白、特定时间或条件生物体内全部的蛋白都可以作为蛋白质组学的研究对象,并可采取不同特性的技术平台对其进行定性、定量或者功能性分析研究。其中,同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ),是最近几年来建立起来的一种具有较多优势的蛋白质组学定性、定量检测技术。iTRAQ方法对于实验样品的选择性较低,无论是复杂样品、单一体液还是特殊成分的蛋白质鉴定分析都具有一定的精确性和准确性。代谢组学所研究的对象主要是某一特定时间下生物体内全部的、分子量小于1000的代谢物,通过对基因、蛋白下游的这些代谢物进行分析,不仅能够直观展示出生物体内发生的改变,也可用于探索外界刺激或药物对于机体的相互作用以及作用机制。其中,液质联用技术对测试样品的适应性非常好,而且还具备较高的精确性和灵敏度,因此被广泛应用于代谢组学研究中。通过对实验数据的深入挖掘,一共筛选出65个差异代谢物和368个差异蛋白质。再借助各类组学数据分析软件对寻找到的差异代谢物和差异蛋白质进行了整合分析,构建出CLs导致细胞毒性的蛋白-代谢整体网络机制图。
  随后,本实验利用了蛋白免疫印迹方法对前期聚焦寻找到的核心差异蛋白进行分析验证。根据免疫印迹试验数据结果,发现这些差异蛋白的含量变化趋势与iTRAQ数据完全一致。总而言之,本实验采用的基于iTRAQ技术的蛋白质组学方法用于分析CLs纳米粒细胞毒性机制具有准确性和适用性。本研究表明,单一的组学分析方法只能给出部分层面的信息,将多种组学技术结合进行研究是必需而可行的。因此本文选用的多组学技术整合策略方法能够进一步全面的探索CLs导致细胞毒性的潜在机制。
[硕士论文] 屈满
公共卫生与预防医学;劳动卫生与环境卫生学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作为一种新型纳米材料在许多领域有广泛的应用。同时伴随GO而来的其安全性以及环境暴露可能产生的毒副作用与潜在毒作用机制也逐渐引起人们的关注。胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)信号通路重要的一部分,其在调控工程纳米材料的响应机制还不是很清楚。
  在本研究中,我们借助秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)的在体毒性评价体系,以寿命和活性氧含量(reactive oxygen species,ROS)作为评价终点,对ERK信号通路在响应GO暴露过程中潜在的分子机制进行研究。当用浓度大于10mg/L的GO暴露秀丽线虫之后发现ERK信号通路中的MEK-2/MEK和MPK-1/ERK在转录水平上明显上调。同时进一步对mek-2和mpk-1突变体进行表型的鉴定发现,mek-2和mpk-1的突变体相较野生型秀丽线虫N2更加易感。通过对MEK-2和MPK-1进行组织特异性分析,发现MEK-2和MPK-1在神经元发挥调节GO的毒性的作用,并且对MEK-2和MPK-1在神经元过表达之后发现其对GO的毒性相较于野生型N2表现为抗性。通过对mpk-1下游在神经元里表达的靶基因的筛选,发现SKN-1b/Nrf位于MPK-1的下游,GTP酶的鸟嘌呤交换因子AEX-3进一步位于SKN-1b的下游。由此,鉴定出一条调控GO毒性的神经级联信号通路MEK-2-MPK-1-SKN-1b-AEX-3。进一步研究发现鉴定到的神经元ERK信号通路与实验室之前鉴定的参与GO毒性调节的肠道的p38MAPK信号通路是位于平行的信号通路协同调控GO所致秀丽线虫的毒效应。
  我们的研究阐明了神经元ERK信号通路在响应纳米材料暴露过程中起到了至关重要的调控作用。在研究ERK信号调控对环境纳米工程材料的应答作用领域,本实验数据将提供重要依据。同时对ERK信号通路所作探究在特定纳米工程材料毒性消减的研究和为后续化学修饰和纳米工程材料引起毒性的药物防治提供了宝贵而有效的分子靶点。
[硕士论文] 成熙
军事预防医学 中国人民解放军海军军医大学;第二军医大学 2017(学位年度)
摘要:近年来全世界许多海域出现了浮游动物水母暴发的问题,水母的反复暴发对于游客、海水浴者尤其是海洋从业人员存在着健康和经济方面的严重威胁。水母属于刺胞动物门,包括整个钵水母纲以及水螅虫纲的少数种类,共约300余种,其中对人类有害的约100种。水母的身体呈伞状,体型大小相去甚远,水母触手布满刺丝囊,一旦受激便高速发射带有倒钩的刺丝进入猎物体内并注毒,导致蜇伤。不同种属水母的刺丝囊有着较大的差异,同一种水母的刺丝囊也形态多样,在水母的进化、生存等方面承担着不同的作用。
  刺丝囊内毒液主要由蛋白和肽类毒素构成,通常水母蜇伤仅造成局部症状,但心血管、溶血和神经并发症也时有发生。目前尚无单一蛋白成分的腔肠动物心血管毒素报道,关于溶血毒素的报道主要来自对栖底生物的研究,如海葵、珊瑚虫,近年来在几种管水母,方水母,钵水母中同样发现了溶血毒素,且这些营浮游生活的水母与人类蜇伤更为相关。
  研究目的:
  本课题的研究对象为中国东南海域水母暴发的主要大型品种——发形霞水母(Cyanea capillata)与越前水母(Nemopilema nomurai)。为深入了解这两种水母刺丝囊毒素蛋白的活性与蜇伤机理,首先分离鉴别其未发射刺丝囊及同种水母单型刺丝囊,继而获得刺丝囊毒素蛋白,分析比较不同类型刺丝囊毒素的心血管活性和溶血活性,并以活性为导向,对水母刺丝囊毒素蛋白进行分离纯化。
  研究方法:
  1、发形霞水母及越前水母刺丝囊的制备:建立抑制刺丝囊发射的制备体系,利用水母组织与刺丝囊,以及单型刺丝囊之间大小、密度、沉降系数的不同,通过分级过筛、密度梯度离心的方法,制备保留生物活性的水母未发射刺丝囊。
  2、水母刺丝囊毒素蛋白获取,活性检测和定位:低温超声破碎法获取水母刺丝囊毒素蛋白。通过大鼠血压监测,溶血活性测定法评价比较东海大型水母刺丝囊毒性,以及越前水母两种单型刺丝囊的毒素活性,确定心血管活性和溶血活性存在的位置。
  3、越前水母刺丝囊心血管和溶血活性蛋白的定向纯化:利用凝胶过滤层析和HPLC反相层析,结合MALDI-TOF质谱分析,对越前水母刺丝囊毒素(Nemopilema nomurai nematocyst venom,NNV)进行分离纯化,并筛选其中具有心血管活性和溶血活性的组分。
  研究结果:
  1、本实验成功制备了大量纯净未发射的水母刺丝囊及单型刺丝囊。经鉴定,中国东海海域的发形霞水母触手包含的刺丝囊有:①b-长棒型中轴穿刺丝囊②多倒刺哑铃型中轴穿刺丝囊③紧密刺丝等直径型钩刺丝囊④松散刺丝等直径型钩刺丝囊;越前水母触手包含的刺丝囊有:①松散刺丝等直径型钩刺丝囊②多倒刺哑铃型中轴穿刺丝囊③紧密刺丝等直径型钩刺丝囊④刺丝渐细型钩刺丝囊。该方法制备的刺丝囊发射率低于1%,且基本保留生物活性,在渗透压改变时刺丝囊发射率达80%以上。
  2、本方法制备了不含水母自身组织杂质的水母刺丝囊毒素。NNV有强心血管致死活性和溶血活性,分别较发形霞水母刺丝囊毒素(Cyanea capillata nematocyst venom,CNV)强20-50倍和10-20倍。在越前水母刺丝囊(Nemopilema nomurai nematocyst,N3)中,松散刺丝等直径型钩刺丝囊毒素(O-isorhiza nematocyst venom,ONV)有强心血管致死活性,而刺丝渐细型钩刺丝囊毒素(Anisorhizas nematocyst venom,ANV)并无致死活性,ONV的溶血活性略高。
  3、通过对NNV凝胶纯化各组分的初筛,确定了心血管毒素F和溶血毒素D这两个组分。F组分的心血管致死活性明显高于NNV,约为NNV的5-10倍,且无溶血作用。D组分的溶血活性比NNV略低。
  研究结论:
  本研究首次依据对刺丝囊形态结构的描述对不同类型刺丝囊进行中文命名;通过分级沉降过滤,梯度密度离心的方法获得大量纯净未发射的水母刺丝囊及单型刺丝囊,进而获得不含组织杂质的水母刺丝囊毒素蛋白。相对于以往所制备毒素,本研究制备的纯刺丝囊毒素的心血管毒性和溶血毒性均大大提高,且毒性稳定。
  本研究重点优化了越前水母刺丝囊的分离技术,得到了两种越前水母单型刺丝囊Anisorhizas和O-isorhiza,通过对以上两种刺丝囊的活性检测,定位越前水母的心血管(致死)毒素主要存在于O-isorhiza中,两种刺丝囊均含有溶血毒素。证明O-isorhiza是越前水母触手具有主要攻击功能的刺丝囊。本研究还对越前水母毒素蛋白进行了初步分离纯化,得到了具有明确溶血活性和心血管活性的纯化组分,纯化组分电泳条带相对单一,性质稳定,可以用于下一步结构鉴定与机制研究。
  本课题组前期研究及其他文献报道都指出,水母毒素中穿孔机制可能是其造成溶血作用和心血管作用,甚至致死的原因。通过对越前水母单型刺丝囊毒素之间,以及纯化组分D与F之间的活性比较,联合电泳蛋白条带的分析,可以确定:虽然越前水母NNV的溶血活性可能致死动物,但严重的心血管致死效应与溶血效应这两者之间无关联性,是两类不同的蛋白造成了这两种毒性反应。
  由于心血管毒素F和溶血毒素D均为电泳检测含有3-4个条带的混合蛋白,有待更进一步的纯化实现完全分离,并进行结构鉴定和毒理学机制研究。通过凝胶和HPLC二次纯化得到了一个单一蛋白条带的组分E,但其并未表现出明显心血管活性和溶血活性,这一组分的活性和结构也有待下一步实验阐明。
[硕士论文] 简子海
公共卫生与预防医学;劳动卫生与环境卫生学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  全氟化合物(PFCs)具有独特的疏水、疏油性和化学稳定性,被广泛地应用于多种工业与民用领域的产品生产中,使其可以通过多种途径进入到环境中。全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)是两种最具代表性的的全氟化合物,作为重要的全氟化表面活性剂,在工业和生活中的广泛应用造成了严重的环境污染,引起了全世界的关注。作为持久性有机环境污染物,PFOS和PFOA具有难降解性、生物蓄积性和生物毒性,近年来在全世界范围内的各类环境介质(水体、土壤、降雪等)、生物体(哺乳类、鱼类、禽类等)和人体(血液、母乳、尿液)内都检测到了该种化合物的存在,其已经对生态系统及人类造成了不同程度的影响。本研究利用秀丽隐杆线虫研究PFOS和PFOA的雄性生殖毒性,寻找评价PFOS和PFOA生殖毒性的敏感指标,探讨PFOS和PFOA对精子发生过程的损伤作用及其毒作用机制。
  方法和结果:
  1、PFOS和PFOA的暴露水平分析
  利用XAD-2树脂柱富集江苏某水厂原水、出厂水水样,再利用液相色谱串联质谱仪测定原水、出厂水水样中PFOS和PFOA的浓度。其中原水中PFOA的浓度为12.62ng/L,出厂水中PFOA的浓度为10.18ng/L,原水和出厂水中未检出PFOS。
  2、PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫生育力的影响
  2.1 PFOS和PFOA对L4期N2线虫生育力的影响
  PFOS和PFOA分别设3个染毒组(0.1、0.01、0.001mmol/L)和1个空白对照组,应用后代数目和世代时间评价PFOS和PFOA对L4线虫生育力的影响。同步化后L4期幼虫用24孔板染毒24h,每组挑取10条染毒后的N2线虫,测定其后代数目和世代时间。结果显示L4期幼虫染毒24h后,与对照组比较,PFOS高、中剂量组后代数目减少具有统计学差异(P<0.05),PFOA的3个剂量组后代数目差异均有统计学意义(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组世代时间差异均无统计学意义(P>0.05)。
  2.2 PFOS和PFOA对L1期N2线虫生育力的影响
  PFOS和PFOA分别设3个染毒组(0.1、0.01、0.001mmol/L)和1个空白对照组,应用后代数目和世代时间评价PFOS和PFOA对L1期线虫生育力的影响。L1期幼虫染毒48h,L1期幼虫染毒48h后,与对照组比较,PFOS和PFOA高、中剂量组后代数目减少具有统计学差异(P<0.05);PFOS的3个剂量组的世代时间差异均具有统计学意义(P<0.05)。
  2.3 PFOS和PFOA对L1期him-5线虫生育力的影响
  PFOS和PFOA分别设3个染毒组(0.1、0.01、0.001mmol/L)和1个空白对照组,应用后代数目评价PFOS和PFOA对L1期him-5线虫生育力的影响。L1期him-5线虫暴露于PFOS和PFOA48h后,将him-5雄虫和同步化后的fog-2雌性年轻成虫按1∶1的比例先后挑入杂交试验NGM培养皿,杂交12h后,将fog-2雌虫单独挑入一个新的带有OP50的NGM培养皿,此后,每36h将fog-2雌虫转入新的种有OP50的NGM培养皿,至fog-2雌虫不再产卵,计数每条fog-2雌虫产生的后代数目。与对照组相比,PFOS和PFOA各个浓度组him-5雄虫杂交后代数目均减少,且具有统计学差异(P<0.05)。
  3、PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫精子发生的影响
  3.1 生殖细胞计数
  采用DAPI染色线虫分离性腺法计数生殖细胞。染色后,在荧光显微镜下观察线虫生殖细胞。与对照组比较,PFOS各个剂量组的生殖细胞数减少均有统计学意义(P<0.05);PFOA的中、高剂量组生殖细胞数目的减少均有统计学意义(P<0.05),低剂量组生殖细胞数目减少无统计学意义(P>0.05),随染毒剂量增加,生殖细胞数目减少具有剂量反应关系(R2=0.963)。
  3.2 精子形态大小观测
  染毒结束后,将线虫洗净,取包埋过的载玻片,加入10μL SM buffer溶液,挑入10条雄虫,用1mL注射器针头在不超过其尾部三分之一处划破,盖上盖玻片,微分干涉显微镜下观察精子形态和大小并随机拍片。统计200个精细胞,计算其大小和畸形率。暴露48h后,PFOS、PFOA各组him-5雄虫均出现非圆形精细胞。与对照组比较,PFOS高、中浓度组和PFOA高浓度组him-5雄虫精细胞大小(直径)显著降低,具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,PFOS各暴露组非圆形精细胞百分率显著升高(P<0.05),具有剂量效应关系(R2=0.995)。PFOA各暴露组非圆形精细胞百分率显著升高(P<0.05),具有剂量效应关系(R2=0.991)。
  3.3 精子活化实验
  在已包埋的载玻片上挑入染毒好的线虫,将精细胞用1ml注射器针头分离后,加入10l200μg/ml的Pronase,5分钟后盖上盖玻片,微分干涉显微镜下观察精子活化的程度,计算精子活化率。以是否具有伪足作为判断精细胞是否成功活化的标准。结果显示,与对照组比较,PFOS和PFOA中、高剂量组精子活化率显著下降,具有统计学意义(P<0.05),PFOS和PFOA低剂量组精子活化率下降没有统计学意义(P>0.05)。PFOS、PFOA剂量组精子活化率下降具有剂量效应关系(R2=0.890,R2=0.938)。
  4、PFOS和PFOA影响秀丽隐杆线虫精子发生的作用机制
  4.1 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫生殖细胞减数分裂相关基因表达的影响
  利用RT-qPCR检测减数分裂相关基因的mRNA表达水平。暴露后,与对照组相比,PFOS和PFOA各剂量组wee-1.3基因表达均显著上调(P<0.05);PFOS高、中剂量组和PFOA高剂量组puf-8基因表达水平均显著下调具有统计学差异(p<0.05)。
  4.2 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫FB-MO复合体相关基因表达的影响
  与对照组相比,PFOS各剂量组spe-4基因mRNA的表达没有明显变化,PFOA高、中剂量组spe-4基因表达上调,但仅高剂量组显著上调(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组spe-5、spe-6和spe-17基因表达水平上调且具有统计学差异(P<0.05);PFOS各剂量组和PFOA高、中剂量组spe-10基因表达水平下调且具有统计学差异(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组fer-1基因mRNA的表达均明显下调(P<0.05)。
  4.3 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫精子活化相关基因表达的影响
  与对照组相比,PFOS各剂量组swm-1和try-5基因mRNA的表达均下调且有统计学差异(P<0.05);PFOA各剂量组swm-1和try-5基因mRNA的表达均下调且有统计学差异(P<0.05)。
  4.4 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫精子物质运输相关相关基因表达的影响
  与对照组相比,PFOS和PFOA高、中剂量组spe-15基因的表达水平下调且有统计学意义(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组spe-26基因表达水平上调且具有统计学差异(P<0.05)。
  结论:
  江苏某水厂原水、出厂水以PFOA污染为主。作为评价PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫生殖毒性的指标,生殖细胞数目的改变、精子细胞畸形率和精子活化率比后代数目和世代时间敏感。L1期幼虫对PFOS和PFOA比L4期幼虫更敏感,PFOS和PFOA在线虫幼年期发育全程暴露可显著诱导其生殖毒性。PFOS和PFOA可能通过干扰减数分裂相关基因、FB-MO复合体相关基因、精子活化相关基因和物质运输相关基因的表达,使得精子细胞变小、畸形、活化率下降,从而导致生殖细胞数目减少,最终引起后代数目减少而发挥其生殖毒性作用。PFOS对秀丽隐杆线虫的生殖毒性略强于PFOA,PFOS对puf-8、spe-10的抑制作用强于PFOA,而PFOA可显著诱导spe-4的上调,而PFOS对其没有影响。
[硕士论文] 孙晋都
公共卫生与预防医学;卫生毒理学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:在纳米科技迅猛发展的21世纪,各种各样的纳米材料相关产品出现在我们的日常生活中。由于纳米银的特殊理化性质以及生物学效应,尤其是良好的广谱抗菌性促进了纳米银在医药生物领域的广泛使用。随着纳米银商品化程度的升高,人们暴露纳米银的途径也变得多元化。目前,在纳米银的生物效应与毒性评价方面进行了大量的体外研究,对于纳米银的体内研究还不够丰富,因此进一步的展开纳米银的体内生物效应以及相关体内动力学相当必要,为纳米银的安全性评价提供科学依据。
  进行纳米银的生物安全性评价时需要有一种工具或方法来整合各种实验数据和信息,概括其中的规律,能更加科学合理的应用纳米银的大量的体内外研究数据。PBTK模型建立在生理学和解剖学基础之上,以血流的传送为动力,反映毒物随血流进入各个脏器和组织,进行代谢、转化和排泄的过程。然后根据质量平衡关系,对每一生理学室可建立一个微分方程描述化学物在室内动态变化,求解方程组可得到各组织或器官的毒物浓度与时间的关系。可以更好的描述毒物在体内动态变化的具体状况,从而预测靶组织中毒物的剂量。
  本研究使用三种纳米银材料AgNPs-20,AgNPs-50(无包被20nm、50nm纳米银粉体,银含量99.99%)和AgNPs-PVP(聚乙烯吡咯烷酮包被的20nm纳米银粉体,银含量25%),考察纳米银在不同条件下的银离子释放情况。使用纳米银材料AgNPs-20(无包被20nm,银含量99.99%)和AgNPs-PVP(聚乙烯吡咯烷酮包被的20nm纳米银粉体,银含量25%),小鼠连续28d经口灌胃,研究纳米银对小鼠的亚急性毒性作用。在以上研究的基础之上,通过文献搜集整理小鼠的生理生化参数,使用MATLAB软件求解各脏器的微分方程,最后用纳米银体内实验数据验证与优化模型。
  1、纳米银材料的表征和体外离子释放研究:纳米银材料的表征结果发现,三种纳米银材料均呈球形;AgNPs-PVP分散良好,无团聚,平均粒径为22.08±4.74nm,平均水合粒径为64.27±21.42nm,实际银含量25.48%;AgNPs-20和AgNPs-50两种纳米银有团聚,平均粒径分别为20.14±3.67nm和49.84±8.02nm,平均水合粒径为542.73±64.83nm和912.34±76.25nm,实际银含量分别为98.97%和99.53%。体外离子释放研究发现,在不同pH(3.6、6.0和7.0)溶液中的银离子释放量与浓度和时间呈正相关,在细胞培养液中的银离子释放量与浓度呈正相关。同一浓度下,AgNPs-PVP的银离子释放量显著高于无包被纳米银(P<0.05),同时纳米银在纯水中的银离子比率要高于其他三种溶液。表明纳米银在溶液中的银离子释放受包被、浓度、pH以及时间的影响。
  2、纳米银对小鼠亚急性毒性研究:小鼠经口灌胃浓度为10mg/kg、50mg/kg、250mg/kg的AgNPs-PVP和AgNPs-20,1%的HPMC(羟丙基甲基纤维素)为阴性对照,5mg/kg的AgNO3为纳米银在体内可能释放银离子的对照,每天一次,连续28d,后期观察28d。①一般性指标和脏器系数研究中,与HPMC组比较,发现两种纳米银高剂量组能引起小鼠精神不振和体重增长缓慢,AgNO3和两种纳米银对小鼠的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏以及脑的脏器系数有不同程度的升高(P<0.05)。②血清生化指标研究中,观察28d内,与HPMC组比较,Ag-NPs-20和Ag-NPs-PVP高剂量组的TP、ALT和AST有不同程度的升高(P<0.05),其他指标与HPMC组比较无显著差异,推测两种纳米银对小鼠肝脏有亚慢性毒性效应。③组织病理学研究中,AgNO3、Ag-NPs、Ag-NPs-PVP可以引起小鼠肺脏、肝脏、脾脏以及肾脏不同程度的病理改变,其中肺脏和肝脏的病理改变比较明显,有轻微的炎症反应。随着观察时间的延长病理改变减轻,说明小鼠存在一定地自愈能力。
  3、纳米银在小鼠体内的生物分布及排泄研究:小鼠灌胃染毒28d后,按照设定时间点(1d、7d、14d、21d和28d)取血液、脏器、粪便和尿液并检测其中的银含量,血液、各脏器、粪便和尿液中的银含量与剂量呈正相关,与时间呈负相关。其中血液中银含量在7d内急剧下降,之后下降缓慢呈平稳状态;脏器中银含量最高的器官分别是肝脏和脾脏,并在脑中也检测到一定量的银。说明纳米银可以经胃肠道的吸收进入血液,随着血液分布到其他组织器官中,其中肝脏和脾脏是纳米银在小鼠体内的主要储存器官,而且纳米银能透过血脑屏障进入脑组织中。粪便和尿液中银含量检测发现粪便中的银含量约是尿液中银含量的500倍,说明粪便是小鼠排泄纳米银的主要途径。
  4、小鼠灌胃纳米银的PBTK模型的构建与验证:①根据纳米银在小鼠体内的生理学过程作出合理的模型假设;②在假设合理的基础上,构建经口灌胃的PBTK模型框架;③通过阅读文献搜集模型中相关参数并构建PBTK模型的微分方程;④使用ACSLX软件对部分纳米银动力学参数进行优化,再使用MATLAB软件对微分方程求解获得模型的拟合值;⑤通过SPSS19.0对拟合值和小鼠灌胃实验中的实测值进行相关性分析,用获得的Pearson相关系数来评价该模型的拟合效果。在拟合结果中显示AgNPs-PVP其中高剂量组肺脏脏的相关系数为0.7182,其余各剂量组的相关系数均在0.8以上,AgNPs-20高剂量组心脏的相关系数为0.6787,其余各剂量组的相关系数均在0.8以上,说明该模型的拟合效果较好。
  综上所述,纳米银在溶液中可以释放一定量的银离子,受包被、浓度、pH以及时间的影响。小鼠连续28d灌胃染毒纳米银,在250mg/kg剂量下对小鼠的体重、脏器系数以及病理改变都有明显的影响,其中主要作用靶器官为肝脏,病理学研究发现小鼠对纳米银的毒性有一定地自愈能力。纳米银在小鼠体内的主要蓄积器官是肝脏和脾脏,并且纳米银可以穿过血脑屏障进入脑组织中,其中小鼠对纳米银的主要排泄途径为粪便。通过构建小鼠灌胃纳米银的PBTK模型,对主要脏器进行了银含量的模拟,拟合值与实测值的相关系数大部分在0.9左右,说明该模型拟合效果较好,可以初步模拟纳米银在小鼠体内的变化情况。在对模型中部分参数进行优化后可以初步进行外推,为纳米银的生物安全性评价提供数据支持。
[硕士论文] 郭晋锋
公共卫生 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  本研究选用Wistar大鼠作为受试对象,观察苏复宁洗液(冻干)连续重复膀胱灌注给予Wistar大鼠4w所产生的毒性反应,首先出现那些症状、严重程度如何,毒性反应累及的主要靶器官及其下一步的毒性发生发展情况,并进行恢复期2w的可逆性观察,以进一步了解所发生毒性反应的可逆程度及可能出现的迟发性毒性反应,为临床一线用药提供毒理研究资料。
  方法:
  选用健康的Wistar大鼠作为研究对象,以试验组苏复宁洗液(冻干)21mg/kg、10.5mg/kg、5.25mg/kg及对照组0.9%氯化钠注射液为灌注用液,采用随机对照研究,膀胱灌注给药周期为4w。最后一次给药24h后,每组处死动物2/3(对照组、高剂量组、低剂量组分别为5只,中剂量组为6只),检测各项指标,余下动物停药后,继续观察2w后再进行相关指标的监测。比较试验组和对照组大鼠一般行为、摄食量、体重、血液学、血清生化、脏器重量及系数、组织病理学等指标的差异。
  结果:
  1、5.25mg/kg组2只大鼠,21mg/kg组1只大鼠,对照组1只大鼠均在给药期间死亡,10.5mg/kg组大鼠在给药期间没有出现死亡,药物对大鼠摄食量、一般行为及活动影响不明显,由于死亡动物数与给药剂量和给药时间之间无药物相关性,因此推断动物死亡系非药物因素所致。
  2、实验各组动物体重随日龄增长而增加,但是在试验第3天与10天测体重时发现,21mg/kg组与对照组比较体重的增长速度较为缓慢,差异显著;试验第10天与26天测体重时发现,5.25mg/kg组与对照组比较体重增长速度较为缓慢,差异显著;恢复期时仅5.25mg/kg组体重增长速度较对照组缓慢,差异显著。虽然存在统计学差异,但无药物量效关系。
  3、对血液学指标的检测结果表明,给药4w末21mg/kg组、10.5mg/kg组PLAT高于对照组,差异显著,但均在参考值范围;给药各剂量组Hb、MCV、MCH均高于对照组,21mg/kg、5.25mg/kg组RBC高于对照组,这些提示苏复宁洗液(冻干)可能对促进红细胞生成有一定作用。恢复期末检测各项指标与对照组比较均无显著性差异,无统计学意义。
  4、血清生化学检测结果显示,给药4w末,21mg/kg组AST、TBIL、TG低于对照组;10.5mg/kg组Cl高于对照组、TC低于对照组,虽有统计学差异,但无药物剂量相关性。恢复期末,21mg/kg、10.5mg/kg组AST低于对照组;21mg/kg组TP高于对照组;10.5mg/kg组Crea、Glu高于对照组,虽然有统计学差异,但无药物量效关系。
  5、骨髓检查结果表明,给药4w末21mg/kg组中性中幼粒细胞、中性杆状粒细胞、粒红比低于对照组,中性晚幼粒细胞、中性分叶粒细胞低于对照组,晚幼红细胞高于对照组;10.5mg/kg组中性杆状粒细胞、粒红比低于对照组,中性中幼粒细胞低于对照组,且有显著性差异,提示苏复宁洗液(冻干)可能对促进红细胞生成有一定作用。恢复期末检测各项指标与对照组比较均无显著性差异,无统计学意义。
  6、脏器重量及脏器系数测定结果显示,给药4w末21mg/kg组肝脏重量低于对照组,脑系数高于对照组;10.5mg/kg组心脏系数、肺系数、脑系数、肾脏重量及系数高于对照组,虽有统计学差异,但无药物剂量相关性;5.25mg/kg组胸腺重量及系数高于对照组,虽有统计学差异,但无药物剂量相关性。恢复期末,各剂量组脏器系数及重量与对照组比较均未见显著性差异,无统计学意义。
  7、组织病理学检查结果显示,给药4w末与对照组比较,高剂量组3只大鼠骨髓红细胞增生较为活跃,苏复宁洗液(冻干)可能对红细胞增生有一定作用,但根据Fisher精准检验,P﹥0.05,不具有统计学意义。其余病变脏器,根据Fisher精准检验,P=1,无统计学意义。恢复期结束,与对照组比较高剂量组未见与受试物有关的病理改变。
  结论:
  1、苏复宁洗液(冻干)连续膀胱灌注给药4w,雌性Wister大鼠21mg/kg为相对安全剂量。
  2、苏复宁洗液(冻干)对雌性Wister大鼠红细胞生成有一定作用。
  3、苏复宁洗液(冻干)对雌性Wister大鼠PLAT升高有一定作用。
  4、苏复宁洗液(冻干)对雌性Wister大鼠AST、TBIL、TG降低有一定作用。
[硕士论文] 李诺
公共卫生 东南大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)属于邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs),是目前世界范围内应用最广泛的增塑剂之一。由于DEHP与产品基质间为非共价结合,因此随着使用时间的推移,DEHP容易从产品中释放到周围环境造成污染,继而通过饮水、摄食和呼吸等多种途径进入生物体,最终对环境和生物体健康造成危害。2011年台湾塑化剂事件发生后,DEHP所引起的食品安全问题得到了公众的广泛重视。2012年我国食品安全风险评估专家委员会给出人群接触DEHP的推荐值,认为对于60kg体重的人来讲,每天摄入3.0mg的DEHP是安全的。研究认为,人体摄入DEHP的途径90%来自于饮食,而饮食的摄入实际上是指用于食品的包装材料中DEHP的含量[1-4]。因此,在即将于2017年10月19日实行的关于限制在食品接触材料及用品中添加剂使用的新国标(《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》GB9685-2016)中,不仅规定DEHP在PVC材料中添加量不得超过5%,而且规定含DEHP的材料和制品不能用于接触性脂肪性食品、乙醇含量高于20%的食品和婴幼儿食品,且迁移量不得超过1.5mg/kg[5]。
  虽然国标从食品接触材料的方面控制了DEHP的迁移量,但是目前研究报道的在医疗器材、装修材料以及化妆品等其他材料中的迁移也不容小觑。近年来DEHP被认定为是一种环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors,EEDs),能够对生物体的生殖发育和繁殖能力造成一定影响,关于DEHP毒性影响的研究报告也日趋增加,人们越来越关心DEHP对人体健康不造成影响的安全限量[6]。因此,本实验对实验大鼠进行DEHP的90天经口毒性实验,以风险评估委员会推荐的DEHP的安全限量值(3.0毫克/人/天),设人的体重为60kg,即以0.05mg/kg为最低剂量,考虑到不确定系数100(10×10),即大鼠试验以5mg/kg为最低剂量组,再以5mg/kg的10倍、100和500倍分别设立DEHP实验组,即5、50、500、2500mg/kg剂量组,同时设对照组和DEHP染毒恢复组(2500mg/kg),共6组大鼠,每组20只,雌雄各半。恢复组动物停止给予DEHP后继续观察30天,以观察DEHP毒性的可逆性、持续性和迟发效应。试验期间至少每天观察一次动物的一般毒性表现,并记录大鼠出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。每周记录体重、摄食量、计算食物利用率;进行血液学检查、血生化检查等常规指标的检测和全面的病理检查等。为初步确定DEHP的经口安全性、得到DEHP毒性作用的靶器官进行DEHP对大鼠的90天经口毒性试验,以期得到关于DEHP毒性的安全限值,为DEHP进一步的风险评估奠定基础。
  研究方法:
  1、DEHP亚慢性染毒对大鼠一般性指标的影响:观察并记录大鼠在饲养期间的一般情况(如日常行为表现、中毒和死亡情况等);于每周称量记录体重、摄食量,并计算总的食物利用率;对肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、附睾、全脑进行解剖称重,计算脏/体比值,并进行统计学分析。
  2、DEHP亚慢性染毒对大鼠生化及血液学指标的影响:取大鼠全血,并分别应用①全自动生化仪检测总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cre)、血清葡萄糖(GLU)、血清钾(K)、钠(Na)、钙(Ca)、磷(P)、血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHOL)等14个生化及电解质指标;②全自动血细胞分析仪检测白细胞总数(WBC)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、直接测定的血红蛋白浓度(CMCH)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血红蛋白含量分布宽度(HDW)、血小板总数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、中性粒细胞(NEUT)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)、单核细胞(MONO)、淋巴细胞(LYM)和未染色的大细胞数量(LUC)以及其相应的百分比等指标。SPSS统计软件分析结果。
  3、DEHP亚慢性染毒对大鼠精子运动能力和脑脂质过氧化的影响:①DEHP对大鼠精子运动能力影响的研究:利用大鼠附睾尾精子制备精子悬液,应用计算机辅助精子分析仪(CASA)对精子的运动参数进行测量,包括:VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、STR、BCF、ELON等;②DEHP对脑脂质过氧化的影响:将脑组织利用超声匀浆机制备成脑匀浆液,离心取上清液-20℃冷冻保存,分别进行活性氧(ROS)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)以及蛋白浓度的测定。
  4、DEHP亚慢性染毒对大鼠组织病理学的影响:处死大鼠,迅速分离取出大鼠的肝脏、肾脏、肾上腺、脾脏、胃肠、睾丸(卵巢)、附睾及全脑,将取下的组织立即置于事先准备好的10%的福尔马林固定液中固定。制作组织病理学石蜡切片,观察组织病理学改变。
  研究结果:
  1、DEHP亚慢性染毒对大鼠一般性指标的影响:在染毒期间,对照组、5、50和500mg/kg剂量组均无观察到明显的差异;而2500mg/kg DEHP染毒组动物则均表现出精神亢奋、被毛蓬松、局部脱毛(头颈部、四肢及腹部)等中毒体征,摄食量减少,大鼠体重在染毒后显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);各剂量组动物的总食物利用率之间差异无统计学意义(P>0.05)。计算大鼠的脏/体比值结果得到DEHP染毒剂量为500mg/kg时,与对照组相比大鼠的肝脏、肾脏、附睾体比值有明显的变化,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);染毒剂量增加到2500mg/kg时,大鼠肝脏、肾脏、脾脏、脑、睾丸、附睾的脏/体比值与对照组比较均出现较大差异,且差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),实验期间2500mg/kg剂量组未出现大鼠死亡。
  2、DEHP亚慢性染毒对大鼠生化及血液学指标的影响:①血液生化指标的影响:与肝脏、肾脏相关的生化指标在DEHP染毒剂量为500mg/kg时开始出现异常;与无机盐代谢相关的生化指标在DEHP染毒剂量为2500mg/kg时均出现异常;与脂类代谢相关的生化指标中,CHOL含量在500和2500mg/kg时降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),雌、雄大鼠在各个染毒剂量组均未见TG含量异常。②血液血细胞的影响:对于白细胞相关指标,在染毒剂量为500mg/kg时,LYM上升,EOS、HGB和MCH指标下降,在2500mg/kg时,白细胞数量减少,并且相关指标发生改变。
  3、DEHP亚慢性染毒对大鼠精子运动能力和脑脂质过氧化的影响:①大鼠精子运动能力的影响:5mg/kg剂量摄入DEHP即可影响精子运动LIN,DEHP染毒剂量为50mg/kg时,对BCF也有影响,这表明精子的活跃程度也降低;在500mg/kg剂量组中,与对照组相比较,VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、LIN、STR和ELON均有下降,DEHP染毒最高剂量组和恢复组中所有CASA检测结果显示无活动精子。②脑脂质过氧化的影响:随着染毒剂量的上升,ROS水平先上升后下降,MDA水平随着染毒剂量的增加不断上升。
  4、DEHP亚慢性染毒对大鼠组织病理学的影响:DEHP染毒5mg/kg时,仅观察到个别大鼠器官见少量炎症反应,未见病理性病变;当染毒剂量为50mg/kg大鼠的肝脏、肾脏、睾丸、附睾和卵巢均出现病理改变,并随着剂量的上升病变加重;在经过30天恢复期后,附睾未见明显恢复。
  研究结论:
  通过对大鼠90天经口毒性试验可以得出,雄性大鼠的生殖器官是DEHP毒性作用的靶器官,其中附睾对DEHP毒性作用最为敏感。试验得出5mg/kg的染毒剂量即可以对大鼠精子的运动直线性有影响,并且经过30天的恢复期,附睾的病理及各项检测指标未见任何恢复。试验得出DEHP对雌性和雄性大鼠的毒性作用有所差别,雌性大鼠对DEHP毒性的耐受性明显强于雄性大鼠,且具有一定的迟发效应,对雌雄大鼠的毒性耐受差异还应进一步进行长期试验观察。观察试验指标可以得到DEHP具有明显的剂量-效应关系,多数指标都随着DEHP的剂量上升出现明显的增大或者减小的趋势。同时,DEHP对大鼠的代谢过程产生影响,在大鼠脑脂质过氧化的试验得出DEHP可能是通过其对大鼠脑神经细胞的氧化损伤作用,对大鼠的脑组织产生损害的,具有明显的神经毒性。
[硕士论文] 李莎
药物分析学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究二氧化钛纳米粒子(TiO2-NPs)与 Cu2+联合,对牛血红蛋白(Bovine Hemoglobin, BHb)、人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial cells,16HBE)、斑马鱼胚胎的毒性作用,从分子、细胞和动物整体水平评价TiO2-NPs与Cu2+联合产生的毒性效应。
  方法:
  采用透射电镜等表征TiO2-NPs及其与Cu2+混合物的表面形貌、粒径及Zeta电位。以BHb为模型蛋白,采用紫外-可见吸收光谱法、荧光光谱法、同步荧光光谱法、时间分辨荧光光谱法及圆二色光谱法结合,探讨TiO2-NPs、Cu2+及二者联合与BHb的相互作用,并评价它们对BHb的毒性作用。
  以16HBE细胞为研究对象,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定TiO2-NPs、Cu2+及二者联合对16HBE细胞的毒性作用,利用吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)荧光双染色法检测16HBE细胞凋亡。
  选用斑马鱼胚胎为动物模型,以斑马鱼胚胎的孵化率、死亡率、畸形率及鱼鳔正常发育率为指标,构建体内评价TiO2-NPs、Cu2+及二者联合的毒性体系。
  结果:
  TiO2-NPs粒径约20 nm,Zeta电位为0.0606 mV,在水溶液中的平均粒径为76.44 nm。光谱学结果表明,TiO2-NPs、Cu2+及二者混合物与BHb均发生相互作用,均使BHb的荧光发生猝灭,其猝灭机制主要为静态猝灭;TiO2-NPs、Cu2+及二者联合均使BHb的构象及二级结构发生变化,螺旋结构变得更为松散,三者对BHb均产生毒性效应。TiO2-NPs、Cu2+及二者联合对16HBE细胞的毒性作用均呈剂量效应、时间效应;AO/EB结果证明TiO2-NPs、Cu2+及二者联合均可以诱导16HBE细胞凋亡;0-800 mg·L-1的TiO2-NPs联合10 mg·L-1的Cu2+对16HBE细胞的毒性作用强于TiO2-NPs。
  当TiO2-NPs浓度介于0-200 mg·L-1时,斑马鱼胚胎死亡率均小于15%,畸形率、孵化率及鱼鳔正常发育率与对照组均无显著性差异;当Cu2+浓度大于0.125 mg·L-1时,斑马鱼胚胎72 h孵化率(<26%)和染毒终点时鱼鳔正常发育率(<27%)较低、染毒终点时的死亡率(>8%)和畸形率(>25%)较高,且存在剂量依赖关系;0-1 mg·L-1 TiO2-NPs与0.125 mg·L-1 Cu2+联合对斑马鱼胚胎的毒性作用与单独Cu2+相近,当TiO2-NPs的浓度为5-200 mg·L-1时,二者联合后斑马鱼胚胎的孵化率和鱼鳔正常发育率均增高,死亡率和畸形率均降低。
  结论:
  TiO2-NPs、Cu2+及二者联合均对BHb具有一定的毒性作用。体外0-800 mg·L-1的TiO2-NPs联合10 mg·L-1 Cu2+对16HBE细胞呈增毒效应。体内5-200 mg·L-1的TiO2-NPs与0.125 mg·L-1的Cu2+联合对斑马鱼胚胎呈减毒效应。
[硕士论文] 贺泽芳
药理学 山西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  观察酸中毒(pHex6.8)对大鼠离体冠状动脉(coronary artery, CA)静息张力的影响,并探讨其作用机制。通过观察Na+-H+交换体亚型1(NHE-1)抑制剂和Na+-HCO3-共同转运体(NBC)抑制剂对pHex6.8收缩大鼠离体CA的影响,探讨酸碱转运体在酸中毒引起大鼠离体CA收缩中的作用;通过观察氯通道阻滞剂(NPPB和NFA)及细胞外去除氯离子对pHex6.8收缩大鼠离体CA的影响,探讨氯离子跨细胞膜转运在酸中毒引起大鼠离体CA收缩中的作用;通过观察Rho激酶(ROCK)抑制剂、蛋白激酶C(PKC)抑制剂和细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂对pHex6.8收缩大鼠离体CA的影响,探讨蛋白激酶在酸中毒引起大鼠离体CA收缩中的作用。
  方法:
  1.将SD雄性青年大鼠(230~260 g)断头处死后,快速从胸腔内取出心脏,置于4℃、pH7.40、95%O2+5%CO2饱和的生理盐溶液(Physiological saline solution, PSS)中。在解剖显微镜下,用显微剪和显微镊将大鼠冠状动脉(室壁支、室间隔支及前降支)快速分离干净,游离出来,剪成约2 mm长的冠脉血管环,固定于微血管张力记录仪(Multi Myograph System-610M,DMT)。采用PowerLab微血管环张力系统,记录大鼠离体CA血管环的张力。
  2.分别观察NHE-1选择性抑制剂 HOE-642(30μmol/L)预孵和NBC抑制剂S0859(100μmol/L)预孵对pHex6.8引起大鼠离体CA收缩的影响。
  3.分别观察氯离子通道阻滞剂NPPB(10、30、100μmol/L)和NFA(10、30、100μmol/L)对pHex6.8引起大鼠离体CA收缩的影响;分别观察氯离子通道阻滞剂NPPB(10、30、100、300μmol/L)和NFA(10、30、100、300μmol/L)对KCl(60 mmol/L)引起大鼠离体CA收缩的影响;以及分别观察NPPB(100μmol/L)和NFA(100μmol/L)对血栓素A2类似物U46619(1μmol/L)引起大鼠离体CA收缩的影响。此外,观察用L-天冬氨酸钠等量代替细胞外PSS液中氯化钠后,对pHex6.8、KCl(60 mmol/L)和U46619(1μmol/L)引起大鼠离体CA收缩的影响。
  4.分别观察ROCK抑制剂Y-27632(3μmol/L)、PKC抑制剂Go6983(1μmol/L)和ERK抑制剂PD98059(10μmol/L)对pHex6.8引起大鼠离体CA收缩的影响。
  结果:
  1.在静息状态时,pHex6.8引起大鼠离体CA张力升高,最大张力为(3.90±0.95) mN,相当于KCl(60 mmol/L)最大收缩幅度的(105.07±10.65)%。
  2. HOE-642(30μmol/L)使pHex6.8引起的大鼠离体CA收缩幅度降低(18.46±5.29)%(P<0.01),S0859(100μmol/L)使其收缩幅度降低(14.90±3.24)%(P<0.01)。
  3. NPPB和NFA均浓度依赖性(10、30、100μmol/L)地抑制pHex6.8引起的大鼠离体CA收缩,最大抑制百分比分别为(66.61±7.07)%(P<0.01)和(64.48±11.68)%(P<0.01)。NPPB和NFA均浓度依赖性(10、30、100、300μmol/L)地抑制KCl(60 mmol/L)引起的大鼠离体CA收缩,最大抑制百分比分别为(83.51±3.13)%(P<0.01)和(52.37±12.31)%(P<0.01)。NPPB(100μmol/L)和NFA(100μmol/L)均可抑制U46619(1μmol/L)引起的大鼠离体CA收缩,其抑制百分比分别为(44.04±9.68)%(P<0.01)和(46.23±5.24)%(P<0.01)。用L-天冬氨酸钠代替PSS溶液中的NaCl后,几乎完全抑制pHex6.8引起的大鼠离体CA收缩(P<0.01),而对KCl(60 mmol/L)和U46619(1μmol/L)引起的大鼠离体CA收缩无显著影响(P>0.05)。
  4. Y-27632(3μmol/L)、G?6983(1μmol/L)和PD98059(10μmol/L)均可抑制pHex6.8引起的大鼠离体CA收缩,其抑制百分比分别为(29.37±13.44)%(P<0.01)、(29.84±10.58)%(P<0.01)和(23.14±9.47)%(P<0.01)。
  结论:
  1.酸中毒引起大鼠离体CA收缩与激活NHE-1和NBC有关。
  2.氯离子跨细胞膜转运和氯离子通道在酸中毒引起大鼠离体CA收缩中起重要作用。
  3.酸中毒引起大鼠离体CA收缩与激活ROCK、PKC和ERK有关。
[硕士论文] 张福
环境工程 山西大学 2017(学位年度)
摘要:近年来随着人们健康意识的不断提高,污染性气体对人体健康的危害性越来越为人们所重视。对于有害气体如甲醛、二氧化硫等对人体所造成的危害已经进行了大量的科学研究,而氨气作为一种普遍存在的污染物却往往容易被人们所忽视,对于氨气的毒理学效应的相关研究也比较缺乏。本实验室通过前期大鼠离体血管环实验发现,氨气会导致离体血管张力发生改变,而且可能与一氧化氮-环鸟苷酸(NO-cGMP)信号通路、电压依赖性 L型钙离子(L-Ca2+)通道和大电导钙激活钾离子(BKCa)通道有关。在此基础上,本研究课题通过Western-blot、PCR和酶活性检测等多种方法,进一步探究了氨气对大鼠血管和心脏中NO/cGMP通路和两种离子通道的影响及其主要机制。
  本次实验选用Wistar成年雄性大鼠72只,无差异性地分成四组,进行氨气熏气处理。其中,低含量氨气刺激组氨气浓度为27 mg/m3,中等含量氨气刺激组氨气浓度为81 mg/m3,高含量氨气刺激组氨气浓度为243 mg/m3,熏气时间为每组每天连续4 h,持续处理一周。在最后一次处理完24 h之后剥离胸主动脉血管和心脏,迅速置于液氮中冷冻,再通过蛋白质凝胶电泳、PCR和酶活性测定等分子生物学手段进行系列实验。
  最终结果表明:氨气对血管与心脏造成的效应基本类似。主要表现在:①氨气达到一定浓度后,会对结构型一氧化氮合酶(cNOS)的基因表达、蛋白含量、活性均起到抑制作用。②氨气会明显促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的合成,增强iNOS的活性。③氨气会导致NO与环鸟苷酸(cGMP)含量显著升高,环腺苷酸(cAMP)含量显著降低。④ L-Ca2+通道的基因转录、蛋白合成均受到氨气的明显抑制。⑤氨气使BKCa通道的亚型基因BKCaα基因表达降低。以上结果表明氨气会使大鼠血管和心脏的NO/cGMP信号通路、L-Ca2+和 BKCa通道的表达发生改变,从而进一步影响心血管系统的生理功能。
[硕士论文] 林霖
生物化学与分子生物学 石河子大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  评估纳米四氧化三铁(Fe3O4)颗粒对小鼠的生殖和发育毒性,并从氧化应激和P38、Nrf2基因调控的角度探讨其影响的可能机制,为今后纳米材料的安全性评估和应用奠定理论基础。
  方法:
  ⑴采用透射电子显微镜、激光粒度仪、X射线衍射仪等仪器对纳米材料理化性质进行表征。⑵采用6~7周龄ICR小鼠为实验对象,将120只雄性、雌性小鼠,随机分为低(4.5 mg/kg BW)、中(9 mg/kg BW)、高(45 mg/kg BW)剂量纳米Fe3O4染毒组和生理盐水对照组,以尾静脉注射的方式分别对雌雄小鼠染毒30天。检测雄鼠精液质量和雌鼠动情周期变化。ELISA法检测小鼠血清促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、睾酮(T)和孕酮(PG)激素水平。HE染色观察小鼠睾丸或卵巢器官的组织病理学变化。用生化试剂盒测定组织SOD活性和MDA含量。实时定量PCR检测P38和Nrf2基因mRNA表达水平。Western blot检测雄鼠睾丸Nrf2蛋白表达量变化。⑶6~7周龄ICR雌性小鼠60只,设置高剂量(45mg/kg BW)染毒组和生理盐水对照组。分别在孕前15日至孕5日,孕5日至孕15日,孕15日至哺乳期21日染毒,共6组,每组小鼠10只。分别观察和检测活胎数、死胎数、吸收胎数,卵巢、胎盘和活胎鼠重量,活胎鼠的体长、尾长和外观、骨骼、内脏畸形等指标。孕鼠卵巢和胎盘作 HE染色观察组织病理学变化。检测子代小鼠生存率及身体发育(耳廓分离、下门齿萌出、睁眼、张耳)和反射发育指标(平面翻正、负趋地性、悬崖回避、空中翻正)。
  结果:
  ①所用纳米Fe3O4颗粒的粒径约20 nm,球形结构,晶像正常,无杂质。②染毒后小鼠生长正常,各剂量组雄鼠雄鼠精子活性和活率呈降低趋势,且在高剂量组与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。高剂量组与对照组相比雌鼠动情间期显著性延长(P<0.05)。随着染毒剂量升高,雌雄小鼠的睾丸和卵巢组织均出现不同程度的病理学变化。各染毒组小鼠睾丸和卵巢组织SOD活性和MDA含量均呈升高的趋势,各剂量组睾丸组织SOD活性和MDA含量与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),各剂量组卵巢组织 SOD活性和中、高剂量组卵巢组织 MDA含量与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。染毒组雌雄小鼠血清生殖激素水平均无明显变化。实时定量PCR结果显示睾丸和卵巢组织中 Nrf2 mRNA表达量呈降低趋势,且中、高剂量组睾丸组织 Nrf2 mRNA表达量显著性低于对照组(P<0.05)。P38 mRNA表达量略微升高,但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示各剂量组睾丸组织 Nrf2蛋白含量显著性高于对照组(P<0.05)。③孕前15日至孕5日染毒导致雌鼠吸收胎率升高,胎鼠体重和体长下降,与对照组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。孕5日至孕15日染毒导致雌鼠胎盘重量显著性下降(P<0.05),胎盘组织有病理性变化。染毒对小鼠其他生殖发育指标及子代的发育指标均未发现明显影响。
  结论:
  纳米Fe3O4颗粒在亚急性的情况下会对雄鼠精子活性和雌鼠动情周期造成影响,且会引起睾丸和卵巢组织病理学变化和氧化应激反应,其对小鼠血清生殖激素无明显影响。纳米 Fe3O4会影响小鼠睾丸中Nrf2基因的表达,该影响的机制仍需进一步探讨。纳米Fe3O4对孕鼠和后代的影响有限,但由于会直接接触人体,该材料的生物安全性还需要更全面和深入的探究。
[博士论文] 陈禾
生物学;遗传学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  秀丽线虫是十分经典的模式动物,自上个世纪开始就被广泛应用于生命科学研究领域,相关的研究策略、工具及数据十分齐全。作为最简单的模式动物,它有许多其他模式动物所没有的优点,如培养条件极简单、生活周期短、通体透明、体细胞数目固定甚至每个细胞都可以追溯其发生的源头。围绕秀丽线虫中仅有的Neuroligin:NLG-1的研究有助于我们理解Neuroligins和它的生物学功能。作为神经元突触上的重要组织分子,它与多种神经精神疾病相关。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的一种衍生纳米材料,由于其特殊而优异的理化性质,被广泛应用于包括药物载体、生物传感器、生物成像等许多研究与应用领域。有一定的体外及在体证据证明GO对生物体具有潜在毒性,然而其致毒的神经调控机制尚不十分明确。本研究以秀丽线虫NLG-1调控GO毒效应为切入点,探究GO毒效应的神经调控机制,同时为工程纳米材料在生物医学上使用时面对特殊人群需要考虑的问题提供相应依据。
  方法:
  对功能缺失突变体、RNA干扰敲降的秀丽线虫进行GO暴露并选取ROS水平、运动行为能力等毒性评价终点来判断特定基因是否参与了GO毒效应。利用遗传学手段进行秀丽线虫基因过表达、恢复表达,或突变、敲降与过表达、恢复表达的组合方式进行GO毒效应评价来寻找参与GO毒效应调控的神经元,以及探索相关基因在GO毒效应调控时的上下游靶向关系。以qRT-PCR、GFP荧光分析、生物信息学分析、免疫共沉淀、免疫印迹等手段进一步确认相关分子机制。用分子探针RhoB探索GO在体转运分布情况。建立行为学模型,探索秀丽线虫对工程纳米材料感知及回避行为。
  结果:
  1.秀丽线虫中间神经元NLG-1调控氧化石墨毒烯效应分子机制
  利用秀丽线虫这一在体系统,证明了氧化石墨烯会导致NLG-1/Neuroligin介导的分子信号功能异常。GO暴露会导致突触后膜神经黏附因子Neuroligin表达量的下降。nlg-1功能缺失型突变会造成秀丽线虫对于GO毒性更加敏感。突变体NLG-1恢复表达实验证明,AIY中间神经元的NLG-1可以参与GO毒效应调控。秀丽线虫的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶C,PKC-1是AIY中间神经元中NLG-1调控GO毒效应的下游靶点。进一步的实验证明,秀丽线虫ERK信号通路中编码Rap蛋白的基因LIN-45是PKC-1的下游靶点参与了GO毒效应调控。因此,GO暴露会导致中间神经元中NLG-1介导的分子信号NLG-1-PKC-1-LIN-45功能失调,而这一信号在秀丽线虫响应GO暴露过程中可能发挥重要功能。此外,肠道RNAi敲降编码FOXO转录因子daf-16基因能够抑制过表达NLG-1秀丽线虫对于GO毒性的抗性,暗示了秀丽线虫神经元中NLG-1信号通路与肠道胰岛素信号通路之间的重要关联。
  2.神经元中突触后膜复合物分子DLG-1及MAGI-1作为NLG-1的直接靶点参与了GO毒效应调控:
  利用特异性启动子Punc-14或Pmyo-3分别恢复表达神经元或肌肉中的NLG-1于nlg-1突变体,发现NLG-1仅在神经元中发挥调控GO毒效应的功能。利用生物信息学手段找到秀丽线虫dlg-1、lin-2、magi-1、nmr-1、nmr-2为哺乳动物突触后膜复合物的同源基因,对相关突变体或敲降秀丽线虫进行GO毒性应评价。结果显示,只有dlg-1RNAi及magi-1突变体对GO毒性更加敏感。dlg-1RNAi或magi-1突变均可以导致神经元过表达NLG-1秀丽线虫对GO毒性抗性表型的消失。经过分析预测DLG-1及MAGI-1潜在的与NLG-1直接结合的蛋白结构域位点,通过原核表达相关结构域,并在NLG-1-C端融合GST标签、靶蛋白结构域融合6×His标签的方式进行免疫共沉淀分析,确认了NLG-1-C端可以结合DLG-1-PDZ-3、MAGI-1-WW(1-2)、MAGI-1-PDZ-3。在共沉淀条件中加入暴露浓度GO,则会直接影响NLG-1-C与DLG-1-PDZ-3、MAGI-1-WW(1-2)、MAGI-1-PDZ-3的结合效率。
  3.筛选GO感知与毒效应调控的神经元:
  基于建立的行为学模型,发现野生型秀丽线虫会对GO产生回避的行为。NLG-1的两种突变体(nlg-1(ok259)及nlg-1(tm474))存在GO回避行为缺陷。在突变体的AIY或AIB神经元中恢复表达NLG-1能够恢复nlg-1(ok259)突变体GO回避行为缺陷,暗示AIY与AIB中间神经元可能参与了秀丽线虫回避GO行为的调控。
  结论:
  神经粘附因子NLG-1在GO毒效应调控中发挥了重要的功能。秀丽线虫AIY中间神经元中NLG-1-PKC-1-LIN-45信号通路参与了GO毒效应调控。而且,神经元中NLG-1-DLG-1、NLG-1-MAGI-1的直接结合作用参与了GO毒效应调控。此外,AIB、AIY中间神经元参与了秀丽线虫GO回避行为。本研究将加深我们对于GO毒效应神经调控分子机制的理解。
[硕士论文] 王栩俊
食品科学与工程 浙江工业大学 2017(学位年度)
摘要:河豚毒素曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素,食用海鲜时误食0.5g即可致人于死命,每年河豚毒素致死的事故时有发生,河豚毒素的安全问题成为重要问题。传统检测河豚毒素的方法如小白鼠生物法、液相色谱法、薄层色谱法等方法费时费力,且重复性差,缺乏特异性,均不适合现场快速检测。表面增强拉曼散射(SERS)是一种与粗糙表面相关的增强效应,在表面科学、分析科学和生物科学等领域得到广泛的应用,从而发展成一种新型的快速分析方法。本文首先采用柠檬酸钠还原氯金酸得到大小均匀的金纳米颗粒,再以Fe3O4纳米颗粒为核,经过表面氨基化修饰后将金纳米颗粒组装在磁纳米颗粒表面,再在外层包覆一层硅烷层,形成具有核壳结构的Fe3O4/SiO2/Au/SiO2的金磁纳米颗粒,最后利用此结构作为拉曼活性基底快速检测河豚毒素(TTX),取得了较为理想的的实验结果。
  (1)通过改变柠檬酸钠添加量制备不同粒径的金纳米颗粒,并考查金纳米颗粒粒径对SERS增强效应的影响,确定金纳米颗粒的最佳平均粒径为40nm。修饰磁纳米颗粒的最佳条件是同时加入等量的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)与MPTES(3-巯丙基三乙氧基硅烷),实验发现组装金磁纳米颗粒的最佳方式是使用振荡的方式。为了提高金磁纳米颗粒的稳定性,再次包覆硅烷层时只需使用少量的TEOS(四乙氧基硅烷)便可包覆整个金磁纳米颗粒,既保证了稳定性同时又不致使SERS效果下降。
  (2)最佳条件下制备的金磁纳米颗粒作为拉曼活性基底,并同时标记Fe3O4/SiO2/Au/SiO2-antiTTX(金磁纳米颗粒与河豚毒素抗体复合物)与RhB-antiTTX(罗丹明B与河豚毒素抗体复合物),对河豚毒素(TTX)进行间接快速检测,发现在外磁体浓缩金磁纳米颗粒的情况下检测限降低可达到0.01μg/mL,单个样品检测时间小于10分钟,检测线性范围0.5μg/mL~0.01μg/mL,检测的样品回收率84.54%~90.67%,相对标准偏差2.6%~11.1%,能满足现场快速检测的要求。
[硕士论文] 赵志行
临床兽医学 河南农业大学 2017(学位年度)
摘要:铅是人类最早使用的重金属之一,对人体造成的危害主要来自于大气、土壤、水、食物及与含铅制品的长期接触。工业废水、废渣和大气降尘中的铅先沉积土壤,后向水体迁移,土壤、地下水中的铅通过食物链不断富集到机体;日常生活中,铅质焊锡制作的食品罐、化妆品、涂料、油漆、香烟等所含的可溶性铅都可以通过接触经消化道进入体内,对机体主要脏器造成不同程度的慢性铅损伤,而且铅有半衰期长和不可降解的特点,扩大了慢性铅中毒的毒副效应。
  1.研究目的:本试验通过研究醋酸铅对不同剂量染铅组雌性小鼠体质量、主要脏器脏器系数及其凋亡基因表达量的影响,观察主要脏器显微和超显微结构的改变,探讨铅对主要脏器的毒性作用,为进一步研发解毒效果佳、无毒副作用的新型解铅中药提供理论基础,同时也是测试板蓝根多糖解铅效果的前中期中毒试验,为研发新型无副作用的高效解铅药板蓝根多糖复合物提供临床实验疗效依据。
  2.研究方法:将360只性未成熟的雌性昆明系小鼠随机均分为对照组和300,600,900mg/L剂量染铅组,每组设6个重复,每个重复15只小鼠,对照组自由饮用无铅去离子水,染铅组自由饮用不同浓度的醋酸铅去离子水溶液,连续染毒12周。期间,每隔一周称一次体重并做记录,统计各组的平均体重变化,并仔细观察、记录各组动物的饮欲、食欲、和精神状态。于染毒的第10,12周,分批采用脱颈椎法处死小鼠,分离心脏、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、卵巢,肉眼观察其病变、称脏器湿重并做记录,统计上述各器官的脏器指数,制作石蜡切片和电镜标本切片,在光学显微镜和透射电子显微镜下观察其病理组织学变化,记录并拍照;同时,用实时定量PCR检测卵巢颗粒细胞中凋亡基因Bax、Bcl-2和P53在各处理组卵巢的表达量。
  3.研究结果:(1)体质量指数显示,随着醋酸铅染毒浓度的升高,尤其是醋酸铅浓度≥600mg/L时,可明显影响母鼠的生长发育;(2)脏器指数和组织学观察结果总体趋势较一致,醋酸铅对肾脏的影响最大,且对左肾的影响明显高于右肾,其次是脾脏、肝脏,对心脏和肺脏的损伤程度最低;(3)凋亡基因Bax、p53的表达量随醋酸铅剂量的增加而逐渐增多,而Bcl-2表达量随醋酸铅剂量的增加逐渐减少。
  4.结论:慢性铅诱导对小鼠肾脏的损伤最为严重,脾脏、肝脏次之,肺脏、心脏受损伤程度较小,铅能够上调凋亡基因Bax、P53的表达量和下调Bcl-2的表达量来介导细胞凋亡,对主要脏器造成损伤。
[硕士论文] 宫璞
中医内科学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  应用流行病学方法与量表技术,研究冰毒成瘾者情绪状态与流行病学特征间可能存在的关系,结合生物反馈训练,探讨冰毒成瘾者情绪状态变化与中医证素的关联,为临床应用中医心理疗法开展戒毒防复吸提供一个新的思路。
  方法:
  1.采用随机筛选方法选取284例冰毒成瘾者为研究对象,采用情绪状态测试量表进行调查,分析和探讨冰毒成瘾者的情绪状态分布特征及影响因素。
  2.采用随机筛选方法选取129例冰毒成瘾者,对其进行生物反馈脑波训练治疗,在脑波治疗前后分别进行四诊信息的采集和情绪状态的测评,分析治疗前后情绪状态和中医证素的变化,并探讨情绪状态变化与中医证素的相关性。
  结果:
  1.冰毒组在紧张-焦虑(T)、抑郁-沮丧(D)、愤怒-敌意(A)、有力-好动(V)、困惑-迷茫(C)情绪得分明显高于非吸毒组,其差异具有统计意义(P<0.05);
  2.冰毒成瘾者情绪状态与年龄、性别、使用毒品次数、吸毒方式、戒毒次数具有相关性(P<0.05);
  3.冰毒成瘾者的紧张-焦虑(T)、愤怒-敌意(A)情绪积分在生物反馈治疗后积分下降,其差异具有统计学意义(P<0.05);
  4.生物反馈治疗前后冰毒成瘾者的证素分布基本一致。病位证素均以肝为主,其次为肾、脾、心;实性病性证素以气滞为主,其次为湿、痰;虚性病性证素以气虚为主,其次为血虚、阳虚、阴虚;
  5.生物反馈治疗后冰毒成瘾者病位证素心、心神及病性证素阴虚、热积分下降,差异具有统计学意义(P<0.05);
  6.生物反馈脑波治疗前后除有力-好动情绪与证素相关不显著外,五类负性情绪与各证素间呈显著性正相关。
  结论:
  1.冰毒成瘾者的心理健康状况很差,其中紧张-焦虑、抑郁-沮丧、愤怒-敌意负性情绪尤为突出。
  2.男性冰毒成瘾者较女性成瘾者的负性情绪更明显;年龄越大、采用混吸方式吸毒且每日吸毒次数越多、戒毒次数越多的冰毒成瘾者的心理健康水平最差;提示应针对各自不同的特点采取不同的心理防治策略。
  3.冰毒成瘾是毒品导致的多脏腑的功能失衡,气血阴阳俱损的结果。
  4.紧张-焦虑、抑郁-沮丧、愤怒-敌意、疲劳-惰性、困惑-迷茫五类负性情绪可造成不同的脏腑之气血阴阳失调,从而形成不同的病理状态。具体关系如下:(1)紧张-焦虑情绪变化与病位证素肝、肾,与病性证素阴虚、气虚关系最为密切;(2)抑郁-沮丧情绪变化与病位证素肝、脾,与病性证素气滞、湿关系最为密切;(3)愤怒-敌意情绪变化与病位证素肝、心神,与病性证素气滞、阴虚的关系最为密切;(4)疲劳-惰性情绪变化与病位证素脾、肾,与病性证素气虚、湿的关系最为密切;(5)困惑-迷茫情绪变化与病位证素脾、心神,与病性证素气虚、湿的关系最为密切。提示可以依据情志变化与机体的内在联系,指导中医药更有效的戒除毒瘾,发挥中医心理治疗作用。
  5.生物反馈脑波治疗在对冰毒成瘾者的戒毒工作中尤其是心理治疗方面有应用价值。
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