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[硕士论文] ANUM BASHIR
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是一种已被深入研究的革兰氏阴性植物病原细菌,但该菌对动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的致病性最近也已被研究证实。铁是自然环境中最丰富的元素之一,但其生物利用率一直相对较低。多种不同的微生物类群已经发展出具有对铁具有高亲和性能的铁吸收系统,包括血红素摄取系统、铁载体系统和细胞膜受体等。假单胞菌属(Pseudomonas)的主要铁载体是pyoverdine。它是一种低分子量、高亲和力的铁清除荧光分子,仅在铁限制条件下由荧光假单胞细菌群产生。除了具有对铁的吸收性能,铁载体pyoverdine也可以作为细菌毒素。本学位论文主要研究了基于液体培养条件下的线虫致病模型中,在铁限制条件下丁香假单胞菌野生菌株MB03和秀丽隐杆线虫之间的相互作用,以及铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌致病性中的作用。
  鉴于铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aerugionosa)PAO1菌株已经鉴定出几乎所有与pyoverdine生物合成和分泌相关的基因,使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作为参考序列,利用在线工具Anti-SMASH对丁香假单胞菌MB03基因组中pyoverdine编码基因簇进行了预测和定位分析。结果发现,发现丁香假单胞菌MB03中缺少5个与PAO1中的直系统同源基因(pvdX,pvdY,pvdA,pvdF和fpvI)。在这些基因中,pvdX和pvdY编码调节蛋白;pvdA和pvdF编码合成N5-甲酰基-N5羟基鸟氨酸残基所需的酶,这些残基存在于PAO1的pyoverdine的肽链中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一种为PAO1中所没有的基因,即syrP。推测syrP的编码产物可能参与存在于MB03-PVD肽链中的羟基天冬氨酸残基的β-羟基化作用此外,在PAO1中,两个Sigma因子编码基因pvdS和fpvI分别参与pyoverdine生物合成和pyoverdine受体FpvA的激活,但是,在丁香假单胞菌MB03的基因组中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一个pvdS IS基因框,表明在丁香假单胞菌MB03中的pvdS可能参与fpvA基因的转录。
  Pyoverdine在结构上由3个不同的结构域组成,即生色团(最保守的部分)、肽链(最可变部分)和侧链(羧酸衍生物)。在MB03的铁载体pyoverdine基因簇中的非核糖体基的多肽合成酶(NRPS)基因编码参与pyoverdine的肽链和发色团部分合成的一种大分子量酶。通过NRPS预测因子对丁香假单胞菌MB03的5个推定的NRPS基因进行计算机模拟表征表明,MB03-PVD的肽链呈线性形式并且由L-1ys,D-Asp,L-Thr,L-Thr,L-Ser,D-Asp和L-Ser。经测定铁载体pyoverdine特定光吸收值,发现MB03产生的pyoverdine与培养基中的Fe3+浓度成反比,而铁对于pyovidine生产的临界抑制浓度约为20μmol/L。
  通过使用RecTE重组系统来进行pyoverdine生物合成2个相关基因的中断,获得了相应基因中断突变株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一种分泌的非核糖体多肽,所以可通过LC-MS和荧光光吸收测定来鉴定中断菌株是否丧失产铁载体pyoverdine的活性。结果发现,两株突变株的破碎细胞滤液均缺乏pyoverdine特征性的黄绿色荧光,表明突变株未能产生pyoverdine。经质谱鉴定,2株突变株也缺乏pyovine的特征峰,而野生型MB03产生了具有1123.412m/z和1142.4165m/z的两类pyovidine。
  为调查铁在MB03对线虫致病性中的作用,在添加或不添加铁的M9培养基中来培养MB03菌株,然后进行对秀丽隐杆线虫的杀虫生物测定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假单胞菌中发现的几种常见致病因子(如AHL,EPS和Tabtoxin)的产生,因此,pyoverdine有可能在培养过程中由于铁在培养基浓度的不同从而调节了细胞毒性、并导致对线虫杀虫效果的差异性。为验证这一假设,将过夜MB03培养物产生的滤液分成两半,其中之一添加额外的100μmol/L铁并培养过夜。生物测定结果发现,野生菌株MB03导致供测线虫的显著性致死(p=0),但通过在M9中添加外源铁(100μmol/L)或通过在MB03过夜培养物中直接添加外源铁的细胞滤液可在一定程度上减小致死率。此外,液相生物测定的致死效应通常发生在培养30h之后,因此,足够的培养时间对于细菌的致死作用也是进行生物测定时要考虑的。
  将基因中断突变株ΔpvdD和ΔvdJ与野生菌株MB03在贫铁的M9培养基中生长后进行液相杀虫生物测定,另外,使用纯化铁载体pyoverdine进行相应生物测定,因为推测pyoverdine可能是具有杀虫活性的MB03滤液中的一种作用导致线虫死亡的活性因子。在液相生物测定中使用的纯化pyoverdine的浓度与在MB9中在48h内在M9培养基中产生的pyoverdine的浓度相当。测量暴露于各种滤液的线虫的相对死亡率,结果如预期相符:与M9和大肠杆菌(Escherichia coli OP50滤液相比,MB03滤液显示显着的杀死作用(p=0),而两种突变株的杀虫试验都没有发现线虫死亡。
  为了证实突变体的减毒活性是由于缺乏pyoverdine产生的,将纯化的pyoverdine加入突变体中以测量与野生型相当的相对死亡率,结果证实pyoverdine是导致线虫死亡的细菌滤液中的活性因子。通过pyoverdine生物合成缺陷的突变株的减毒活性、以及两突变株在添加纯化的pyoverdine后又可杀线虫的实验结果可以证实,pyoverdine在MB03介导的液相杀虫实验中是决定杀虫活性的重要因素。此外,通过测量MB03和两种突变株的生长曲线,发现突变株在贫铁M9培养基中生长缓慢。因此,这表明pyoverdine对丁香假单胞菌MB03生长也是至关重要的。
  总之,本研究结果表明,丁香假单胞菌MB03具有产生pyoverdine的遗传潜力。通过RecTE重组系统构建获得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因中断突变株。铁载体pyoverdine在MB03菌株对秀丽线虫的杀虫活性中发挥重要作用。同时,pyoverdine也是影响宿主细胞生长的重要因素。就我们所知,本项研究是研究丁香假单胞菌铁载体pyoverdine在丁香假单胞菌与动物宿主之间相互作用的第一例研究。
[硕士论文] 王文君
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:转Bt基因抗虫作物对大部分鳞翅目害虫具有较高的抗性。Bt杀虫蛋白可能通过对寄主的寄生而传递至其天敌体内。鳞翅目寄主取食转Bt基因抗虫作物后,其生长发育通常受到显著不利影响,从而产生“猎物质量介导效应”导致无法对其天敌进行准确的安全性评价。消除这种效应后,能大大提高转基因植物安全性评价的可靠性。本研究选择鳞翅目害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)及其寄生天敌麦蛾柔茧蜂(Habrobracon hebetor)作为研究对象,通过显微注射Bt蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴中,将印度谷螟幼虫血淋巴作为Bt蛋白的载体,构建了一种适合外寄生寄生蜂的Tier-1安评体系。结果表下:
  (1)单头印度谷螟老龄幼虫注射70ng浓度为0.5ng/nl的Cry1C蛋白至印度谷螟幼虫血淋巴后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中先快速下降,后缓慢下降。在注射0h时,近注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量显著高于远离注射端印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白的含量;注射0.5h后,两者无差异。被麦蛾柔茧蜂寄生后,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的浓度在7天内趋于稳定,且含量始终高于直接取食转Bt基因稻谷印度谷螟幼虫血淋巴Cry1C蛋白含量(1.72ng/g)的10倍以上,生测结果表明印度谷螟幼虫血淋巴中Cry1C蛋白具有生物活性。而未被麦蛾柔茧蜂寄生的状态下,Cry1C蛋白在印度谷螟幼虫血淋巴中的含量会一直下降。
  (2)印度谷螟幼虫血淋巴中的高剂量Cry1C蛋白对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率、卵至成虫发育历期、雌性率、蛹重、初羽化(雌、雄)成虫体重、成虫寿命、存活率以及生殖力均无显著负面影响;而阳性对照GNA对麦蛾柔茧蜂的卵孵化率初羽化雌成虫体重、初羽化雄成虫体重、成虫寿命以及生殖力造成负面影响。(3)Cry1C蛋白能通过印度谷螟血淋巴传递至麦蛾柔茧蜂体内。Cry1C蛋白可在麦蛾柔茧蜂幼虫体内不断累积,在麦蛾柔茧蜂老熟幼虫体内富集量最高;麦蛾柔茧蜂蛹内、成虫体内的Cry1C蛋白含量不断下降,低于麦蛾柔茧蜂幼虫的Cry1C蛋白蛋白含量,远低于印度谷螟血淋巴中的Cry1C蛋白含量。然而,麦蛾柔茧蜂成虫体内Cry1C蛋白含量低于检测值下限。
[硕士论文] 田甜
微生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物寄生线虫(Plant Parasitic Nematodes)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和主要的作物虫害线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:
  基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955(41.032~125.246)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825(30.139~264.375)μg/mL,线性回归方程(相关系数)为:y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。
  为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10_C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10_C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。
  将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12h和24h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。
[硕士论文] 何有为
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:芽孢杆菌广泛存在于自然界中,可产生丰富的次生代谢物质,具有极强的抗逆能力和环境适应性,是一类具有实际用途和经济价值的微生物类群。本研究通过室内筛选获得对油菜根肿病菌(Plasmodiphora brassicae)具有较好抑制效果的生防芽孢杆菌F85和T113,此外还发现了一株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有很强拮抗效果的枯草芽孢杆菌BJ-1。本研究以此为材料,分别对生防菌株抑制油菜根肿病和稻瘟病的生防机理进行探讨,并综合评价生防芽孢杆菌的生防效果。主要研究结论如下:
  1.从湖北省当阳市油菜根肿病发生严重田块的健康油菜根际土壤先后分离微生物菌株667株,其中细菌323株,真菌253株,放线菌91株;以棉花枯萎病菌及稻瘟菌作为根肿菌指示菌进行平板对峙筛选,其中有54株分离菌株抑菌带宽度大于3mm;通过离体试验发现有20株生防菌株对根肿菌休眠孢子萌发抑制率达30-50%,16株可使根肿菌休眠孢子失活率达40-55%;通过盆栽防治试验发现有2株生防菌株F85和T113对根肿病防治效果达60%以上;两株生防菌处理后显著降低根肿菌的根毛侵染率,降低根肿菌休眠孢子初级原质团的分化,抑制次级游动孢子囊的形成。进一步对生防菌株F85和T113进行鉴定。生防菌株F85和T113菌体细胞均呈杆状,革兰氏染色反应显示阳性,16S rDNA分子鉴定且系统进化树分析都表明菌株F85和T113属于Bacillus,利用Biolog微生物快速鉴定系统鉴定结果也显示为芽孢杆菌属,但不能准确鉴定到种。
  2.通过传统的形态学,16S rDNA序列分析和Biolog微生物快速鉴定系统将对稻瘟菌具有强拮抗作用的菌株BJ-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液经不同温度(4-100℃)和不同pH(2-12)处理后对稻瘟菌菌丝的生长抑制效果不变,表明枯草芽孢杆菌BJ-1分泌产生的抑菌成分具有热稳定性及耐强酸、碱能力。平板对峙试验结果表明,枯草芽孢杆菌B J-1具有较广的抑菌谱,对多种植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对稻瘟菌的抑菌带达22.7mm。显微观察发现,枯草芽孢杆菌BJ-1发酵滤液(0.5%v/v)处理后的稻瘟菌菌丝尖端膨大畸形,有菌丝溢断现象。分生孢子经发酵液处理后萌发不正常,产生的芽管畸形膨大,对附着胞形成具有明显的抑制作用。在离体叶片上,浓度为1x108CFU/mL的BJ-1菌体悬浮液和浓度为5%的发酵液和发酵滤液已可完全防治稻瘟病。盆栽试验结果表明,10%枯草芽孢杆菌BJ-1发酵液喷雾处理,防治效果达50.0%;BJ-1发酵液浸种处理防效更好,对稻瘟病防效可达74.3%,且对水稻植株生长有促生作用。通过实时荧光定量PCR检测,发现BJ-1发酵液处理种子后能诱导SA信号通路PAL、ICS1基因、JA信号通路AOS2基因以及抗性相关蛋白PR1a和PR10的上调表达。说明BJ-1发酵液处理种子可诱导水稻植株体内SA和JA信号通路相关基因的表达,激活水稻的防卫反应,诱导寄主产生系统抗性。
[硕士论文] 王梅菊
植物病理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究旨在分离和筛选生防细菌菌株,明确其分类属性,评估其生防潜力。取得了如下研究结果:
  1.分离筛选获得了促生细菌菌株AW-17和CanL-30。
  分别从湖北武汉、湖北咸宁和安徽芜湖采集的植物样品中分离到82个菌株,包括细菌菌株和酵母菌菌株。采用拟南芥平板对峙培养试验和油菜浸种促生试验相结合的方法筛选得到2个促进植物生长的细菌菌株AW-17和CanL-30。菌株AW-17和CanL-30均能够通过产生挥发性有机物促进拟南芥幼苗生长,另外菌株AW-17还能够产生吲哚乙酸IAA,具有溶解不可溶性磷的能力。将这两株细菌用于盆栽油菜促生试验,结果表明:菌株AW-17对油菜生长有稳定促生效果,而菌株CanL-30则不具备盆栽促生能力。
  2.明确了菌株AW-17和CanL-30的生物学特性,并对其进行了鉴定。
  菌株AW-17单菌落乳黄色,质地光滑粘稠,在8℃~35℃条件下均能生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阴性,不产生芽孢。生理生化测定结果和16SrDNA序列分析表明:菌株AW-17属于液质沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)。菌株CanL-30单菌落乳白色,质地光滑干燥,在15℃~40℃条件下能较好的生长,最适生长温度范围为20℃~30℃,在7%及以下的盐浓度条件下均能生长,但无法在10%盐浓度条件下生长,革兰氏染色阳性,产生芽孢。鉴定结果表明菌株CanL-30属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
  3.筛选出拮抗菌株CanL-30,并对其产生的抗真菌代谢产物进行了分离纯化。
  利用平板对峙培养和离体油菜叶片接种相结合的方法,筛选到1株能够稳定抑制灰葡萄孢的拮抗菌株CanL-30,其能够对多种病原菌产生拮抗作用,二分格皿试验和带毒平板试验结果表明菌株CanL-30主要通过产生抗真菌代谢产物抑制病原菌的生长。菌株CanL-30在NB培养基中,28℃、150r/min的条件下摇培72h,产生的抗菌代谢产物抑菌效果最好,抑菌率达到90%,利用酸沉淀和甲醇萃取的方法对该条件下CanL-30产生的抗菌代谢产物进行提取,带毒平板试验结果显示,不同浓度粗提物平板对灰霉菌均有不同程度的抑制作用,其中365μg/mL粗提物平板对灰霉菌的抑菌率高达100%。CanL-30抗真菌粗提物具有耐高温、抗紫外的特性,其在100℃的水浴锅中处理60min钟后,抑菌活性与对照相比无差异。用紫外灯(UV-C,30W)处理抗菌粗提物150min后,其抑菌圈大小与对照无显著差别。对粗提物中的活性物质进行了分离和鉴定,发现CanL-30产生的代谢产物中含有iturin。
  本研究获得的油菜促生菌株AW-17和灰葡萄孢生防菌CanL-30存在着进一步研究和开发的潜力。
[硕士论文] 易时雨
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:灵敏的嗅觉系统在昆虫寄主定位、寻找配偶等行为过程中起着重要的作用。目前的研究表明,气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)等多种蛋白在对气味分子的识别过程中起着重要的功能,但对于OBPs或CSPs在昆虫中确切的生理功能及识别气味分子的机制并不是很清晰。前期在对林业重要害虫松褐天牛Monochamus alternatus Hope寄生性天敌松褐天牛肿腿蜂Sclerodermus sp.触角转录组测序中,鉴定了多个OBPs和CSPs基因,但对于OBPs和CSPs在其嗅觉感受中功能并未深入了解。为此,本课题以松褐天牛肿腿蜂为研究对象,分析了SspCSP2的时空表达特征及与气味分子的结合特性,探索了SspOBP7与寄主挥发物的结合特性及结合机制,以期为探明OBPs和CSPs在其嗅觉感受中的功能奠定理论基础。主要的研究结果如下:
  (一)松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的功能分析
  1.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因的克隆及时空表达特性
  通过PCR技术,克隆得到了1个CSPs(SspCSP2,GenBank登录号:ALG36155.1)的全长,其开放阅读框为360bp,编码120个氨基酸。qRT-PCR实验技术分析了SspCSP2在松褐天牛肿腿蜂不同虫态、不同组织的表达情况,结果表明,SspCSP2显著表达于幼虫、有翅雌虫的腹部及无翅雌虫的腹部,其中在有翅雌虫腹部的表达量最高。
  2.重组SspCSP2与气味物质的结合特性
  成功构建重组质粒SspCSP2-pET20b,并大量表达于大肠杆菌BL21(DE3)中,利用DE52阴离子交换柱成功获得纯净重组SspCSP2。以1-NPN为探针,利用荧光竞争性结合试验,分析SspCSP2在pH7.4和pH5.0条件下与24种气味分子的结合特性。结果表明,在酸性条件下,SspCSP2与大多数气味物质的结合能力高于中性条件,22种物质展现出与SspCSP2具有较强的结合能力(Ki<20μM),其中(-)石竹烯氧化物、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和壬醛3种气味物质与SspCSP2的结合能力最强(Ki<10μM);相反,SspCSP2与顺-3-己烯醇和(+)-α-长叶蒎烯这2种气味物质的结合能力则为在中性条件下的高于酸性条件;但pH对SspCSP2与反式-2-己烯醇的结合能力无影响。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspCSP2的荧光猝灭分析
  Stern-Volmer方程分析SspCSP2与4种具有电生理活性物质(α-蒎烯、β-蒎烯、γ-异松油烯与(+)-α-长叶蒎烯)的猝灭类型,结果显示4种物质均为静态猝灭;结合位点分析发现,4种物质与SspCSP2的结合比例均为1∶1。热力学方法分析发现,4种物质与SspCSP2之间的相互作用力均为疏水性作用力。
  (二)松褐天牛肿腿蜂SspOBP7与气味分子的结合机制
  1.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的荧光猝灭分析
  SspOBP7与24种气味分子的猝灭类型和相互作用研究结果表明,SspOBP7与18种气味分子的猝灭类型属于动态猝灭,余下的6种物质属于静态猝灭;6种静态猝灭的物质中有3种物质属于非极性分子,分别为s-(-)柠檬烯、(+)-α-长叶蒎烯和异松油烯,与SspOBP7形成疏水性作用力;余下3种物质,反式-2-己烯醇、顺-2-戊烯-1-醇和癸醛则属于极性分子,与SspOBP7形成氢键作用;双对数方程分析结果显示,6种物质与SspOBP7的结合比例均为1∶1。
  2.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的结构分析
  利用圆二色谱法分析了SspOBP7在不同pH值、不同配体配比条件下的二级结构变化。结果表明,pH值的变化会引起SspOBP7的α螺旋含量的变化,其中pH7.4条件下SspOBP7的α螺旋数最多,其次是pH3.0,最少的为pH5.0;设定pH7.4,SspOBP7的α螺旋数会随着配体配比的增加而减少;当SspOBP7与配体按1∶1结合后,改变体系pH值,蛋白的α螺旋数变化规律与SspOBP7纯蛋白的一致。
  以意大利蜜蜂Apis mellifera的AmelOBP5(3R72)为建模模板,对SspOBP7进行同源建模。结果显示,SspOBP7具有6个α螺旋,3个二硫键,属于Classical OBP;分子对接结果显示SspOBP7中央具有一个结合腔,呈球状,结合腔的表面具有三处极性区域,分别为Thr86、Tyr105和Phe118。分析极性区域处形成的氢键作用,发现Thr86处与配体形成氢键作用时,需要Tyr105的参与,Phe118与配体形成氢键作用的位置为主链上的氧原子,Tyr105可以单独与配体形成氢键作用,且形成的位置为侧链羟基上的氧原子。
  3.松褐天牛肿腿蜂SspOBP7的定点突变及与气味分子结合机制
  针对Tyr105设计定点突变,突变成Phe105,目的是破坏氢键作用。表达、纯化出重组突变蛋白,测定了突变蛋白与6种静态猝灭物质的结合情况。结果显示,这6种物质与突变蛋白的结合能力均有一定程度的减弱,但结合比例没有改变。突变后的SspOBP7与极性分子葵醛的结合能力显著下降,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变之后氢键作用消失;而突变后的SspOBP7与其它2种极性分子,反式-2-己烯醇和顺-2-戊烯-1-醇,仍具有较强的结合能力,荧光猝灭和分子对接结果显示,蛋白突变之后,氢键作用还存在,只是位置发生改变;突变后的SspOBP7与3个非极性分子结合能力明显减弱,荧光猝灭和分子对接结果显示,突变后仍为疏水性作用,但3个分子在结合腔内的取向均发生了改变。通过对比分析蛋白的结合腔,发现SspOBP7突变之后,结合腔的体积明显变大。
  综上,松褐天牛肿腿蜂SspCSP2基因主要分布在虫体腹部,SspCSP2对气味物质的选择性差,SspCSP2与电生理活性物质主要是通过疏水性作用力结合;SspOBP7与24种物质中的3种极性分子和3种非极性分子结合,结合力分别为氢键作用和疏水性作用力,环境中改变pH值和配体的浓度均会使蛋白的二级结构发生改变,极性区域的破坏会导致SspOBP7的结构发生转变,从而影响蛋白与气味分子的结合,相比之下,非极性分子结合力的改变更明显,疏水性作用力所受影响比氢键作用力更明显。
[硕士论文] 李秋玲
昆虫与害虫防治 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis Tinsley)是一种严重危害棉花的重要入侵性害虫,而班氏跳小蜂(Aenasius bambawalei Hayat)是其专性寄生性天敌,在扶桑绵粉蚧生物防治过程中具有较好的应用潜力。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是气味分子和气味受体之间的桥梁,能够携带疏水性气味分子穿过亲水性淋巴液到达受体细胞,对气味的特异性结合和选择运输上有着重要的研究意义,若能明确班氏跳小蜂气味结合蛋白与配体的相互作用关系,将为筛选班氏跳小蜂寄主定位行为活性物质提供理论依据,也为扶桑绵粉蚧的生物防治提供绿色通道。为此,本课题以班氏跳小蜂为研究对象,在构建转录组的基础上筛选并克隆出了5个AbamOBPs基因,完成AbamOBP50与AbamOBP1的表达与纯化:测定了AbamOBP50与22种寄主挥发物的结合特性;利用荧光猝灭、圆二色谱及同源建模和分子对接分析了AbamOBP1与配基的相互作用关系;利用RNAi及Y型嗅觉仪初步筛选出了对班氏跳小蜂具有行为活性的物质。主要研究结果如下:
  1、班氏跳小蜂AbamOBPs基因克隆、蛋白表达和纯化
  通过RT-PCR技术成功克隆出了班氏跳小蜂基因AbamOBP50、OBP47、OBP43、OBP41及OBP1。开放阅读框分别为369bp、378bp、405bp、402bp、408bp,分别编码123个、126个、135个、134个、136个氨基酸,分别包含有21个、21个、17个、23个、20个氨基酸残基的信号肽,氨基酸序列结果显示AbamOBP50、OBP1和OBP41属于Classic OBPs,OBP47属于Plus-C OBPs,OBP43属于Minus-C OBPs。成功构建重组质粒pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1。pET30a-AbamOBP50和pET17b-AbamOBP1主要在包涵体中表达,分别通过Ni离子亲和层析柱及DE52弱阴离子交换柱,在体外成功获得AbamOBP50和AbamOBP1的纯蛋白。
  2、班氏跳小蜂AbamOBP50结合特性分析
  以1-NPN(N-苯基-1-萘胺)为荧光探针,利用荧光竞争结合实验测定了班氏跳小蜂AbamOBP50在中性和酸性环境下与22种棉花挥发物单体的结合特性。在中性环境下,AbamOBP50与挥发物单体均有较强的结合能力;在酸性环境下,AbamOBP50与8种物质结合能力较强,分别是1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、S-(-)-柠檬烯、月桂烯、α-水芹烯、β-石竹烯、莰烯和橙花叔醇,其中月桂烯、S-(-)-柠檬烯、α-水芹烯和β-石竹烯在酸性环境下的结合能力高于中性环境下的结合能力。
  3、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体荧光猝灭分析
  利用荧光猝灭测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯的相互作用关系。实验结果表明,AbamOBP1与1-NPN在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,在pH5.0条件下AbamOBP1与1-NPN是通过静电作用结合,在pH7.4条件下是以疏水作用结合,AbamOBP1与1-NPN是以1∶1比例结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下的猝灭过程都是静态猝灭,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是静态猝灭,在pH5.0条件下是动态猝灭。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇在pH7.4和pH5.0条件下都是通过疏水作用结合,与S-(-)-柠檬烯在pH7.4条件下是以氢键作用结合。AbamOBP1与2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇、S-(-)-柠檬烯是以二聚体的方式结合。AbamOBP1与1-辛烯-3-酮可能以二聚体,三聚体甚至多聚体结合。
  4、班氏跳小蜂AbamOBP1与配体圆二色谱分析
  利用圆二色谱(CD)仪测定了AbamOBP1与1-辛烯-3-酮、2,4,4-三甲基-2-戊烯、1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯的CD光谱。通过CD光谱可以观察到AbamOBP1与配基结合后二级结构构象的变化。实验结果表明,AbamOBP1在pH7.4条件下,在208和222nm处负峰值最低,表明α-螺旋含量最高,其次是pH3.0,在pH5.0条件下的负峰值最高,表明α-螺旋含量最低。在pH7.4条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置四种配比1∶1;1∶3;1∶5和1∶10。在pH5.0和pH3.0条件下,AbamOBP1与四种气味物质设置两种配比1∶1和1∶3。在这三种不同pH条件下,随着蛋白与气味物质比例的增加,AbamOBP1的CD光谱中负峰逐渐减弱,表明AbamOBP1蛋白中的α-螺旋含量逐渐降低。说明蛋白与气味物质的结合导致蛋白肽链延伸,改变了蛋白二级结构。
  5、AbamOBP1在班氏跳小蜂寄主定位中的功能
  利用Y-型嗅觉仪测定了班氏跳小蜂雄蜂对1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、2,4,4-三甲基-2-戊烯和S-(-)-柠檬烯这4种挥发物单体的行为选择实验。结果发现1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯对其有明显的吸引作用,而1-辛烯-3-醇和S-(-)-柠檬烯对其没有吸引作用。RNAi实验表明在干扰48h和72h后AbamOBP1基因的相对表达量显著降低。干扰后对具有吸引作用的两种物质1-辛烯-3-酮和2,4,4-三甲基-2-戊烯进行行为选择验证。结果表明在干扰48h和72h后,这两种物质对班氏跳小蜂雄蜂的吸引作用明显降低。
  6、班氏跳小蜂AbamOBP1同源建模和分子对接
  以同源蛋白Apis mellifera的ASP1(3CAB pH7.0,3CDN pH4.0)为模板,建模得到AbamOBP1的三维结构,其具有六个α-螺旋,三个二硫键,属于Classic OBPs。通过预测发现在pH4.0条件下的结合腔要比pH7.0条件下的结合腔要大。分子对接显示,在pH4.0条件下,氨基酸lle3、Phe51、Phe54、Leu56、Leu63、Va168、Arg71、lle72、Gly80、Met83、lle84、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115、Val116和lle117主要参与了AbamOBP1与配基的结合。在pH7.0条件下,氨基酸Phe51、Leu56、Leu57、His62、Leu63、Asp64、Lys67、Val68、Leu69、Arg71、lle72、Ala99、Leu102、Val103、Phe106、Lys113、Tyr114、Phe115和Val116主要参与了AbamOBP1与配基的结合。
[博士论文] Severin Marie Marc HATT
农业昆虫与害虫防治 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:面对集约化农业的局限性,农业生态学旨在思考如何设计一种在经济上可行和社会相关的可持续农业。农业生态学强调在农业生态系统中加强生态系统的功能以减少化学杀虫剂的使用。为了加强对害虫的生物防治,增加农业生态系统的植物多样性是常见策略之一。而植物多样性的增加一方面可以直接对害虫发展产生负面影响(即自下而上的效应),另一方面间作的开花植物可以增强对天敌调控而对害虫种群产生影响(即自上而下的效应)。本研究通过作物与作物以及非寄主开花植物进行条带式间作(即在同一领域同时种植至少两种作物物种),以提高农业生态系统植物多样性,增强对害虫以及其天敌的调控作用。
  文献分析显示,在大多数研究中,与小麦(Triticum aestivum L)单作相比,小麦间作可以显著减少害虫危害,但是对害虫天敌的发生无显著提高作用。此外,前人研究显示可以通过种植野花带提高访花天敌和寄生蜂的数量。
  第一部分田间试验,综合研究了作物间作和野花带间作两种增加农田生态系统植物多样性的策略。首先在中国田间采用小麦与油菜(Brassica napus L.)间作,与单作相比,它既不能减少蚜虫(Hemiptera:Aphididae)为害,也没有增强蚜虫天敌的发生。其次在比利时田间采用小麦和野花进行条带间作,与小麦单作相比,间作田间的蚜虫发生显著降低,蚜虫的天敌食蚜蝇(Diptera:Syrphidae)发生量显著增加。然而,野花条带的存在并没有影响其他天敌的发生量,如草蛉(Neuroptera:Chrysopidae),瓢虫(Coleoptera.Coccinellidae)和寄生蜂(Hymenoptera:Braconidae)。
  第二部分田间实验,研究了间作不同野花品种和种植密度组合对天敌的吸引作用。主要考虑了开花特性对天敌昆虫行为的影响。首先,假设尽可能提而单位面积内野花的种类,以提高吸引访花天敌的丰度和多样性,但是结果不支持这个假设。相反,多品种混作反而掩盖了已知对访花天敌有吸引力的一些开花植物(特别是菊科植物Leucanthemum vulgare Lam)的功能。其次在这个实验中,开发了一种可以确定与天敌丰富度相关的花的性状的方法,测试对象为油菜甲虫的寄生蜂[Meligethes spp(Coleoptera:Nitidulidae),Ceutorhynchus spp(Coleoptera:Curculionidae)]。在花的七个性状中,视觉特征(即颜色和紫外反射率)和与食物可利用性(即花冠形态)可以显著影响寄生蜂的丰度。
  这些结果表明:(i)田间增加植物多样性只能减少部分害虫为害;(ii)间作野花带的开花特征对一部分的天敌吸引作用影响较大;(iii)野花带的开花特征比密度对天敌的吸引作用更大。
  诚然,这些结果有待进一步讨论。事实上在农业生态系统中,管理和设计作物和非寄主作物多样化的战略是很多的。此外,大规模的区域景观生态比单一的田间生态更加重要,害虫也不是农业生态系统中唯一需要监管的生物或非生物因素,同时控制多种害虫,可以提供多重监管服务是未来农业研究的挑战。
[硕士论文] 田雪莹
植物病理学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:植物内生菌能够增强宿主植物耐逆、抗病能力,促进养分吸收,其次级代谢产物更在农业、工业及医学等领域有广泛应用。近年来,植物内生菌的研究主要集中于甜土植物或农作物,对极端环境下的植物内生菌群落知之甚少。砂引草(Messerschmidia sibirica)作为滨海滩涂的先锋物种,是中国北部滨海滩涂的主要泌盐植物,在保护生态环境方面发挥着重要作用,同时还具有较高的医用、饲用和观赏价值。目前鲜有关于砂引草内生菌方面的报道,因此,本文以砂引草为研究对象,深入分析其内生菌群落多样性和分布规律,筛选具有农用活性的生防菌株及其次级代谢产物,以期为盐生植物砂引草内生菌资源开发利用提供依据。
  1、利用传统可培养方法和高通量测序技术,分析了砂引草内生菌种类和群落结构进行,探讨了盐生植物内生细菌与宿主植物适应高盐、贫瘠的海岸沙地环境的关系。从450个砂引草根茎叶组织块中共分离得到198株内生细菌,82株内生真菌。经分子生物学和形态学鉴定,共有细菌16个属,41个分类单元,真菌8个属,31个分类单元。系统发育分析表明,砂引草内生菌种群丰富。以该植物根、茎、叶、根际土壤和非根际土壤为样本,通过Illumina HiSeq2500对内生菌和根际细菌的16S rRNA V5-V7区测序,结果显示根际土壤中细菌种群数量明显高于砂引草组织器官,但略低于非根际土壤样本。这些细菌分属37个门438个属,其中变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria是优势菌门,假单胞菌属Pseudomonassp,芽孢杆菌属Bacillus sp,鞘氨醇单胞菌属Sphmgomonas sp,链霉菌属Streptomyces sp,细杆菌属Microbacterium sp,根瘤菌属Rhizobium sp和雷诺卡氏菌属Nocardioides sp是主要的优势菌属。综合分析两种不同方法下优势菌属(相对丰度大于1%)和稀少菌属(相对丰度低于01%)表现的差异性说明,在研究植物内生菌多样性时,应综合运用传统分离方法和高通量测序技术。
  2、共筛得27株拮抗菌株,其中Bacillus toyonensis JM2和B subtilis BS13对烟草黑胫病菌(Phytophthora mcotianae),黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv lachrymans)等多种植物病原菌拮抗效果明显,根据形态学排重,最终选定30株内生真菌进行小规模发酵筛选,琼脂扩散实验结果表明有16种粗提物抑菌效果显著,尤其是Fusarium oxysporum P14对果斑病菌(Acidovorax avenae subsp citrulh),大白菜软腐病菌(Erwinia carotovora subsp carotovora),黄瓜角斑病菌(P syringae pv lachrymans)和柑橘溃疡病菌(Clavzbacter michiganensis)的抑制效果堪比阳性药。这也是首次报道盐生植物砂引草内生菌在拮抗农业病原菌方面的应用。
  3、结合化学多样性分析和抑菌活性,选定Alternaria sp P8进行实验室规模发酵,分离得到9个化合物,包括5个苯丙呋喃类化合物、3个苝醌类和1个甾体类,其中T1化合物为新化合物。化合物生物活性研究结果表明,9种化合物对几种植物病原菌都具有不同程度的抑制作用,以alterperylenol类化合物抑菌效果最佳。除此之外,T6、T7和T8化合物能够显著抑制反枝苋、生菜种子萌发,药效同草甘膦相当。新化合物altenuene T1也表现出较高的除草活性。
  本文首次系统的分析了砂引草内生菌群落多样性。运用抗菌、除草等药理学活性模型对分离到的次级代谢产物进行活性评价,探索了化合物在农业病原菌及除草方面的价值,拓宽了天然产物的应用范围。
[硕士论文] 梅杰
生物防治学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:木霉菌(Trtchoderma)作为生物活体制剂农药和肥料的有效成分,在植物病害生物防治、土壤环境改良方面有巨大的应用潜力。近年来由于铜及含铜化合物被广泛应用于杀菌剂、化学杀虫剂及畜牧食品添加剂等,致使土壤铜含量不断增加,对土壤微生物造成不良影响,引起土壤生态系统失衡和土壤质量下降。研究木霉菌铜耐受及代谢相关机制,对提高防病效果、改善土壤生态环境等具有重要意义。本实验室前期研究发现,生防菌哈茨木霉(T harzianum)Th33中存在一种C2H2型转录因子,命名为thmea1,该基因在铜胁迫下发生差异表达,其编码的蛋白序列中存在3个与酵母金属硫蛋白表达激活因子ACE2保守的C2H2结构域,推测该基因可能参与哈茨木霉菌的铜胁迫应答及代谢过程。为进一步研究其功能,本研究采用基因敲除和过表达技术,结合荧光定量PCR技术和转录组测序分析,探究了thmea1基因的功能,结果如下:
  1、参照哈茨木霉Th33基因组信息,设计特异性引物,以Th33菌株cDNA为模板,PCR扩增获得thmea1基因编码区序列。测序结果显示,该基因全长1446bp,无内含子,拥有1个外显子,编码蛋白序列与酵母金属硫蛋白表达激活因子ACE2及其同源蛋白SWI5存在3个较为保守的C2H2锌指结构域,推测thmea1为C2H2型转录因子基因,序列提交NCBI获得GenBank登录号为MF802279。
  2、采用同源敲除原理构建获得thmea1基因敲除载体pKH-KO-△thmea1,采用PEG介导的原生质体转化法,将敲除载体转入哈茨木霉Th33原生质体,筛选获得thmea1基因敲除突变株△thmea1。以构巢曲霉gpdA和trpC为启动子和终止子构建获得thmea1基因过表达载体pKH-KO-Othmea1,采用PEG介导的原生质体转化法,将过表达载体转入Th33原生质体,筛选获得thmea1基因过表达突变株Othmea1。
  3、对野生菌Th33、敲除突变株△thmea1和过表达突变株Othmea1的铜离子耐受实验显示,在0~24mM/L铜离子浓度下,△thmea1的生长速度显著快于Th33和Othmea1,气生菌丝量略多,且铜离子耐受中浓度(MIC50)为192mM/L,较Th33(MIC50170mM/L)和Othmea1(MIC50174mM/L)提高了约129%。铜离子吸附实验显示,野生菌和突变株对铜离子的吸附率无显著差异。综上表明thmea1基因的缺失提高了哈茨木霉对铜离子的耐受性。
  4、铜代谢相关基因的qRT-PCR分析显示,铜胁迫下,△thmea1中的金属硫蛋白基因(Tha07074)表达水平显著高于Th33和Othmea1,表达量约为Th33的5倍,推测thmea1基因负调控金属硫蛋白基因的表达。P型-ATP酶基因(Tha_08191)在Th33和Othmea1中的表达水平显著高于△thmea1,该转运酶能够协助细胞内铜离子进入高尔基体分泌系统,暗示thmea1的缺失可能会影响铜离子的胞外释放过程。
  5、对野生菌Th33和敲除突变株△thmea1进行了08mM/L铜离子处理下的转录组测序,显示在铜胁迫下,核糖体蛋白合成相关基因、逆境修复功能类热激蛋白相关基因及泛素蛋白相关基因在△thmea1中发生上调表达,推测thmea1可能具有调控功能性蛋白质再生循环的作用,其调控机制有待进一步研究。
[硕士论文] 韩艳华
生物防治学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:七星瓢虫Coccinella septempunctata L是一种优良的捕食性天敌昆虫,在生物防治中具有重要作用。该瓢虫能以成虫进行兼性滞育越冬或越夏,通过调控其滞育,不仅能延长产品货架期,提高产品防控作用效果,也可促进其大规模生产和应用。滞育七星瓢虫可显著积累脂质,脂质是昆虫滞育发育过程中的重要营养和能源物质,研究脂质积累对揭示滞育调控的分子机制至关重要。脂肪酸合成是腊积累的重要组成部分,脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)和酰基-CoAΔ11去饱和酶(acyl-CoA Delta(11)desaturase,FADΔ11)是七星瓢虫脂肪酸合成的关键调控酶。FAS是一种多功能复合酶,其催化产物软脂酸以甘油三酯的形式储存能量,还能参与合成磷脂、细胞膜构造等,FADΔ11能催化饱和脂肪酸氧化生成不饱和脂肪酸,也可在昆虫性信息素合成中发挥作用,但这两种酶在滞育中的功能及其调控机制等尚不明确。
  本研究以七星瓢虫为试验对象,克隆了七星瓢虫2个Fas基因和1个FadΔ11基因全长,分析了这三个基因在七星瓢虫滞育发育及解除过程中的表达模式,并利用RNA干扰技术验证了脂肪酸合酶及酰基-CoAΔ11去饱和酶在七星瓢虫滞育中的功能。主要研究结果如下
  1基于七星瓢虫转录组数据,参考注释为Fas和FadΔ11的序列设计引物,以滞育七星瓢虫eDNA为模板,经PCR扩增、测序、拼接,获得了七星瓢虫CsFas和CsadΔ11的全长序列。CsFas1的cDNA全长为6563bp,CsFas2为7642bp,CsFadΔ11为1447bp。其中,两种CsFAS具有不同的功能域,且分属于系统进化树的不同分支,推测这两种CsFas编码的蛋白参与不同代谢途径;经氨基酸序列分析,发现CsFadΔ11编码的蛋白具有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,是典型的去饱和酶。
  2研究表明2个CsFas基因和1个CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导不同时期、滞育维持期、滞育解除期及正常发育状态下均有表达,但荧光定量结果显示,这三个基因在滞育诱导末期及滞育初期的表达量显著高于其他时期,且整体变化趋势与七星瓢虫滞育发育及解除过程中脂含量变化趋势基本一致。
  3采用显微注射法将目的基因的双链RNA片段dsCsFas1、dsCsFas2、或dsCsFadΔ11导入到七星瓢虫体内(以dsGfp为对照),目的基因的表达量均显著低于对照组,干扰七星瓢虫注定滞育个体的CsFas基因或CsFadΔ11基因后,处理组的总脂及甘油三酯含量显著降低,过冷却点升高,耐寒性下降,且消化道发育较为成熟,内中充满食物残渣,与正常发育个体的状态类似。
  4滞育诱导条件下的七星瓢虫接收到滞育信号刺激后,CsFas表达量升高,催化合成大量的软腊酸,软脂酸作为前体物质进一步合成其他种类脂肪酸,同时,本研究证实CsFadΔ11也能参与腊积累,推测与七星瓢虫不饱和脂肪酸的含量和种类有关,从而提高滞育七星瓢虫的耐寒性。
[硕士论文] 杨静逸
生物防治学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:烟粉虱Bemista tabaci(Gennadius)是一种世界性小型农业害虫,发生重、防治难。采用天敌防治无毒无害且针对性强,在植绥螨这一优秀的天敌类群中,有一些种类具有防止烟粉虱的潜能。津川钝绥螨Amblyseius tsugawai是一种本土优势捕食螨,室内试验发现津川钝绥螨对烟粉虱卵具有较强的捕食能力,它是否可以用于田间防控烟粉虱?为了探究这一问题,我们对津川钝绥螨进行了捕食功能反应、捕食喜好性以及种群生命表的研究,结果显示津川钝绥螨以烟粉虱为食产卵少或卵不孵化,针对此现象,我们进一步探究了是否雌、雄螨的营养(不同猎物)都会对其后代(产卵量及后代性比)产生影响,同时研究了雄螨年龄对其后代(产卵量及后代性比)的影响。
  具体研究内容如下.
  在25±1℃条件下,研究了津川钝绥螨雌、雄螨对烟粉虱卵及1龄若虫的捕食功能反应。除雄螨对1龄若虫几乎不取食,其雌、雄螨对烟粉虱卵及雌螨对1龄若虫的捕食功能反应均符合HollingⅡ型方程,分别为Na=1151*Nt/(1+00587*Nt)、Na=0741*Nt/(1+02112*Nt)、Na=0973*Nt/(1+00910*Nt),攻击率分别为1151、0749、0973,处理时间分别为0051d、0282d、0094d,理论日最大捕食量分别为196粒、36粒、107头。可见,津川钝绥螨雌螨对烟粉虱卵有较高的捕食能力。
  通过研究津川钝绥螨雌螨对烟粉虱低龄虫态、二斑叶螨三种螨态,以及对两者最适虫(螨)态的捕食喜好性,发现津川钝绥螨偏好捕食烟粉虱卵、二斑叶螨幼螨。当烟粉虱卵和二斑叶螨幼螨共存时,津川钝绥螨对烟粉虱卵、二斑叶螨幼螨的捕食喜好性分别为075±006、089±005,不存在显著性差异,即表现为随机选择。
  以烟粉虱或二斑叶螨为食,津川钝绥螨均能完成正常的生长发育繁殖。津川钝绥螨以烟粉虱为猎物时的生长发育历期(705d)比以二斑叶螨为猎物(675d)情况下高出44%,未成熟期存活率为以二斑叶螨为猎物时的773%。以烟粉虱为猎物,津川钝绥螨的总产卵量为455粒/头,后代性比为042,内禀增长率为0013;以二斑叶螨为猎物,津川钝绥螨的总产卵量为3154粒/头,后代性比为057,内禀增长率为0145。可见,津川钝绥螨以烟粉虱为猎物时,虽可维持其种群,但存在产卵少或卵不孵化的现象,由此说明烟粉虱不是津川钝绥螨一种较好的猎物。
  针对产卵少或卵不孵化这一现象,探究是否不利因素都会对其后代(产卵量及性比)产生影响。从以下两个方面探究,第一部分为以不同猎物(烟粉虱、二斑叶螨)为食的雌、雄螨交配对后代的影响,第二部分为雄螨不同年龄(0d、5d、10d、20d)与初羽化雌螨交配对其后代的影响。
  结果显示津川钝绥螨雌、雄螨在至少一方取食烟粉虱的情况下,雌螨的产卵量及其后代性比都呈显著性降低;当雌螨以烟粉虱为猎物,其产卵量都显著降低且卵存活率较低。津川钝绥螨雌、雄螨均以二斑叶螨为食,其总产卵量为3033粒/头,雌性比为061,后代未成熟期存活率为8080%;当仅雄螨取食烟粉虱时,其总产卵量下降483%,后代雌性比下降344%,后代未成熟期存活率为7279%,雌螨取食烟粉虱,雄螨以二斑叶螨、烟粉虱为猎物时,其总产卵量分别下降865%、886%,后代存活率分别为3889%、2290%。可见,津川钝绥螨雌、雄螨营养都对其后代的产卵量及性比产生影响,而雌性对其后代的影响更显著。
  随着津川钝绥螨雄螨年龄的增大,与其交配的初羽化雌螨产卵量呈现显著性下降,雌性比数值也表现为降低。与雄螨年龄0d、5d、10d、20d交配的初羽化雌螨总产卵量依次为3033、2953、1973、1847粒/头,0d、5d处理与10d、20d处理总产卵量存在显著性差异,与0d处理相比较,10d、20d处理的总产卵量分别下降了350%、391%。由此可见,津川钝绥螨雄螨年龄的增加不利于与其交配的初羽化雌螨的生殖能力。
  综上,津川钝绥螨对烟粉虱低龄虫态具有较强的捕食能力,以烟粉虱为食可维持种群繁殖,是我国目前捕食烟粉虱最好的捕食螨品种之一。在田间应用中,津川钝绥螨的使用可以搭配丽蚜小蜂等能够捕食烟粉虱高龄虫态的天敌,以达到更好的防控效果。另外,津川钝绥螨可用甜果螨大量饲养,饲养简单且成本低廉,为田间应用提供了可能性,并且其作为Ⅲ型泛食性捕食螨,在随机取食烟粉虱的同时,也可以随机选择叶螨作为猎物,还可以取食花粉等替代猎物补给营养,我们推测津川钝绥螨在田间防控烟粉虱可以维持一个长期防控的效果。
[硕士论文] 李敏
入侵生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)是一种优良的虫生真菌,对农业病虫害具有很好的防治效果。然而,蜡蚧菌在应用时为活菌制剂,杀真菌剂对其有致命的影响,在田间不能与杀菌剂等化学药剂同时施用。针对蜡蚧菌对杀菌剂敏感的问题,有必要对蜡蚧菌进行菌株改良而用于生物防治。本研究筛选对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具有高抗性的真菌菌株,克隆其抗性基因,利用其抗药性基因转化蜡蚧菌的敏感菌株,筛选获得抗性较强的转化子,为蜡蚧菌的田间应用提供基础。研究已取得了如下结果。
  1、筛选对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具高抗性的真菌菌株。从分离纯化的多类植物病原菌中,应用孢子萌发法,筛选对醚菌酯药剂表现出高抗药性水平的菌株F-2。F-2菌株对醚菌酯的EC50值大于2500μg/ml(田间常用浓度为250μg/ml)。菌株经ITS序列测序鉴定为极细枝孢菌(Cladosporium tenuissimum)。
  2、克隆抗性基因。从筛选得到的高水平抗药性突变菌株F-2菌株中,克隆抗药性高抗性基因Cytb,同时从野生型敏感性枝孢菌菌株B-3中也克隆出Cytb抗性基因,二者Cytb基因编码区序列进行比较分析。通过普通PCR和3'RACE实验扩增出Cytb基因编码区序列全长,二者序列比对后,结果为F-2菌株在核酸编码区序列429位点处发生碱基突变,氨基酸序列中143位点的氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸(G143A)。因此,F-2菌株对醚菌酯药剂表现出高抗药性水平,与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的已知抗性机制相符合。
  3、构建表达载体。构建Cytb抗药性突变基因的真菌ATMT表达载体,以pBHt2载体为基础,应用重叠PCR方法连接真菌表达强启动子PtrpC基因和Cytb抗性基因两个片段。然后,利用T4DNA连接酶将KpnⅠ和HindⅢ双酶切后的pBHt2载体和连接目的片段连接起来,构建含Cytb抗药性基因的pBHt2重组质粒。
  4、农杆菌介导法转化蜡蚧菌。将构建成功的含Cytb抗药性突变基因的pBHt2重组质粒导入农杆菌AGL-1中,然后,通过农杆菌和蜡蚧菌分生孢子共培养的方法,实现农杆菌介导的蜡蚧菌的转化,将外源Cytb抗药性基因导入蜡蚧菌中,获得含Cytb抗药性基因的转化子菌株,并对转化子菌株进行一系列验证。
  5、转化子验证。以转化子菌株基因组DNA为模板,PCR扩增出目的片段,证明外源Cytb抗药性基因已成功导入蜡蚧菌,以转化子菌株cDNA为模板,RT-PCR扩增出目的片段,证明外源Cytb抗药性基因已成功在蜡蚧菌中进行转录反应,测定转化子菌株对醚菌酯药剂的抗药性,结果得转化子菌株对醚菌酯抗药性最高提高了77倍,证明外源Cytb突变基因已成功在蜡蚧菌中翻译并表达。由此获知,对醚菌酯具有抗药性的蜡蚧菌工程菌株构建取得成功,菌株抗药性显著提高,具有很好的应用前景。
[硕士论文] 田小娟
植物保护 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:半翅目中姬蝽科和花蝽科是优良的捕食性天敌,可捕食蚜虫、蓟马、飞虱、叶蝉等多种农林害虫。但大部分种类形态相似尤其花蝽体型微小使其形态鉴定工作十分困难。DNA条形码技术从分子层面克服了困扰分类专家的难题,已在全球得到了普遍应用。本文对国内姬蝽和花蝽科采集样本进行了COI条形码的测序工作,为今后国内姬蝽和花蝽种类的快速鉴定奠定基础,同时提供物种的地理分布信息为天敌资源的保护和应用提供参考,对姬蝽科优势种泛希姬蝽的不同地理种群进行遗传分化的探讨,基于盲蝽科复杂食性的背景,对姬蝽科、花蝽科、蝽科和盲蝽科不同食性种类的遗传关系进行了探讨。
  测序获得姬蝽科160个样本长度均为658bp的COI序列,目前根据遗传距离、NCBI和BOLD数据库检索确认了4个属.姬蝽属Nabis、捺姬蝽属Nabicula、希姬蝽属Himacerus和高姬蝽属Gorpis。样本中至少存在35个物种,其中6种可与数据库条形码高度匹配,样本数量由多到少分别为泛希姬蝽Himacerus apterus、黄缘捺姬蝽Nabicula flavomarginata、窄姬蝽Nabs capsiformis、黑纹捺姬蝽Nabicula nigrovttata、小翅姬蝽Nabis apicalis、原姬蝽Nabis ferus,其中泛希姬蝽比例达到225%,其它物种均是首次获得条形码记录。按照分布数据将姬蝽分为3类,国内广布类.姬蝽属和泛希姬蝽;北方分布类.捺姬蝽属,南方分布类.高姬蝽属和希姬蝽属。
  对泛希姬蝽宁夏、内蒙古、山西和陕西4省12个地理种群33头个体的遗传多样性研究表明存在19个COI单倍型,共享单倍型仅有1个,4个省中宁夏的各项DNA多态性指数最低,内蒙古最高。AMOVA分析表明泛希姬蝽COI种群内和种群间的分子变异高于组间变异,种群内和种群间均存在极度的遗传分化。同时在宁夏组与其他三组间也有极度分化的现象,其中宁夏与内蒙古和山西组间差异达极显著水平,这种遗传分化可能是基因流受限和区域间气温、猎物等因素差异所致。
  测序获得29条长度均为658bp的花蝽COI序列,根据遗传距离、NCBI和BOLD数据库检索确认了4个属:小花蝽属Orius、原花蝽属Anthocoris、叉胸花蝽属Amphiareus和齿股花蝽属Scoloposcelis。花蝽样本共17种以上,4种已有条形码记录.东亚小花蝽Orius sauteri、微小花蝽Orius minutus、萧氏原花蝽Anthocoris hsiaoi和Amphiareus sp,其它13种均是其首次COI条形码记录。进化树表明东亚小花蝽O sauteri、微小花蝽O minutus与南方小花蝽Orius strigicollis之间的亲缘关系相比肩毛小花蝽Orius niger较近;萧氏原花蝽Anthocoris hsiaoi与川藏原花蝽Anthocoris thibetanus亲缘相近。
  应用COI基因对姬蝽科、花蝽科、蝽科和盲蝽科中3种食性偏好的代表种类进行系统发育分析表明盲蝽科与花蝽科和姬蝽科亲缘关系相近,与蝽科亲缘关系较远。蝽科中捕食性种类由植食性种类进化而来,其中益蝽属Picromerus的种类最为原始,而蠋蝽属Arma是较晚分化出来的。盲蝽科捕食性种类由植食性或动植性种类进化而来。
[硕士论文] 宋静
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:放线菌不仅是土壤生态系统中主要的组成部分,也是各种药用价值天然产物的重要来源。受植物生长和根部微生物的影响,植物根内、根际放线菌的种类比较多样、功能比较复杂。植物根内和根际放线菌不仅能在植物受到病原菌侵袭时协助植物免受病原体的侵染,也能通过产生生物活性物质来帮助植物抵抗病害。从放线菌中获得新型活性化合物或者寻找合适的微生物菌剂,来帮助植物抵抗病虫害,从而提高农产品的产量和质量,是新世纪人们所关注的一个热点问题。基于植物根内和根际放线菌的特殊性,许多研究人员开始将其作为活性放线菌的分离源。本研究首次选用传统药用植物半夏和感条锈小麦品种taichun29为实验材料,探索了这两种植物根内和根际放线菌的资源,旨在发现新型生物活性物质和新种放线菌。
  本实验选用5种分离培养基,分离纯化出了168株放线菌。在药用植物半夏的根内和根际分别分离出33株和64株放线菌;在感条锈小麦品种taichun29的根内和根际分别分离出17株和54株放线菌。利用1种病原细菌和13种病原真菌作为靶标菌来研究这些放线菌的活性,结果表明有23株放线菌具有生物活性的。其中17株至少能抑制3种病原菌的生长,10株至少能抑制5种病原菌的生长,6株至少能抑制10种以上病原菌的生长,发现有4株菌分别对苹果轮斑菌、柑橘痂圆孢菌、核盘菌和尖孢镰刀菌黄瓜专化型抑菌直径达18mm以上,有1株菌不仅对12种病原菌都有抑制作用外对其中的六种病原菌产生的抑菌直径超过20mm。此外,还有1株放线菌BXT54均能抑制这14种病原菌的生长,通过筛选确定了两种适合BXT54发酵的液体培养基(Medium2和PTM),并探究了其发酵产生活性化合物的稳定性,结果表明此活性物质具有一定的耐高温和耐酸碱的能力。这为接下来代谢产物分离纯化及化合物结构鉴定提供了理论依据。
  通过观察分离得到的菌株在培养基上生长的形态特征,并结合菌株16S rRNA在EzBioCloud网站上序列比对分析的结果,确定对菌株SJ21进行多相分类学鉴定。基于16S rRNA基因的系统发育分析和形态学特征比较,推断菌株SJ21属于螺孢菌属(Spirillospora)。与SJ21相似度最高的菌株是Spirillospora albida IFO12248T(98.75%,16S rRNA序列的相似度),其次是Actinomadura montaniterrae JCM16995T(98.68%)、Actinomadura fibrosa ATCC49459T(98.53%)和Actinomadura nitritigenes DSM44137T(98.38%)。通过在表型特征、生理生化特征、化学分类特征和分子生物学特征四方面对菌株SJ21和与其相似性较高的四个菌株进行综合分析,得出菌株SJ21是螺孢菌属的新种。将其命名为Spirillospora tritici。对Spirillospora tritici基因组框架图的测定及次级代谢产物基因簇的预测,为Spirillospora tritici在螺孢菌属中分类学地位的研究和次级代谢产物的预测提供了重要的信息基础。
[博士论文] 王泽宇
生物防治学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)可以产生多种杀虫蛋白,如营养期的Vip蛋白和芽胞期形成的Cry晶体蛋白。由于Bt杀虫蛋白对鳞翅目、鞘翅目和双翅目等多种害虫具有特异的杀虫效果,因此被广泛用于转基因作物中。然而在转Bt作物的广泛种植过程中,其显著的抗虫效果被靶标昆虫所产生的抗性日益削减。而两种或多种Bt蛋白组合不仅能有效克服或延缓靶标害虫对Bt蛋白抗性的产生,而且能扩大杀虫谱;其中,特定的蛋白组合还能产生协同增效作用,显著提高杀虫活性。
  在前期研究中发现Cry9Aa和Vip3Aa蛋白组合对水稻二化螟(Chilo suppressalis)具有显著的协同增效杀虫效果。但迄今为止全世界范围内关于Cry和Vip蛋白之间的增效作用机制的研究仍为空白。
  本研究首先对Cry9Aa和Vip3Aa蛋白对水稻二化螟的协同增效杀虫机制进行了深入的研究,在此基础上,开展了对玉米害虫高效的Bt蛋白组合筛选,主要进展如下:
  1.证明了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV存在特异性结合;明确了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白在BBMV上存在不同的受体结合位点。
  2.发现了Cry9Aa和Vip3Aa两种蛋白之间可以通过很高的亲和力特异性结合。
  3.明确了Cry9Aa蛋白通过结构域Ⅱ和Ⅲ与Vip3Aa蛋白结合。进一步发现Cry9Aa结构域Ⅱ-loop3的RRS495-497AAA突变体与Vip3Aa蛋白的结合明显减弱。通过将Cry9Aa合成重叠多肽再次印证了Cry9Aa-495RRS497区域与Vip3Aa蛋白存在结合。另一方面,为了明确Vip3Aa中参与和Cry9Aa蛋白互作的关键位点,发现了Vip3Aa的Lys352-Asp451区域与Cry9Aa存在结合。进一步发现其中两个肽段356-ALIGFEISNDS-366和428-TKKMKTL-434参与了和Cry9Aa蛋白的结合。通过氨基酸定点突变得出Vip3Aa-432KTL434AAA突变体与Cry9Aa的结合能力显著降低。最后通过对水稻二化螟的增效杀虫活性测定证实,Cry9Aa-495RRS497AAA和Vip3Aa-432KTL434AAA突变体蛋白的增效杀虫活性明显下降。这些结果证实了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的相互作用引发了协同增效杀虫作用。
  4.在上述研究的基础上,通过筛选对玉米害虫有协同增效杀虫作用的Bt蛋白组合,发现了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白同样对亚洲玉米螟(Os trinia furnac al is)有一定的增效作用,而Cry1Bb和Cry9Ee蛋白对东方粘虫(Mythimna separata)也有一定的增效活性。同时还发现亚洲玉米螟对Cry9Ee与Cry1Ab蛋白不存在交互抗性,其机制可能是两种蛋白在亚洲玉米螟的BBMV上不存在竞争结合。
  本研究阐明了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV存在特异性结合并具有不同的受体结合位点是协同增效杀虫作用的前提,在此基础上,两种蛋白之间的相互作用直接引发了增效杀虫活性。这一发现不仅完善了多Bt蛋白杀虫作用机制,并且为两种蛋白在“Pyramids”转基因作物中的应用奠定了理论基础。此外,Cry9Aa和Vip3Aa蛋白结合位点的明确,则为获得高效Bt蛋白的定向改造提供了理论支撑。
[硕士论文] 王峰
生物防治学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:金龟子绿僵菌一直被定位为昆虫病原真菌,并作为生物农药去防治田间害虫,在防治花生地下害虫蛴螬有明显效果。近年发现,绿僵菌能促进植物根生长,在根内宿存,是一种互惠共生关系。如果能很好地理解植物如何响应有益的绿僵菌,将可充分利用和促进共生建立,达到防控虫害和促进植物生长的双重效果。为了探讨绿僵菌作为内生菌与植物互作的分子机制,本文以绿僵菌和致病性尖孢镰刀菌对比处理,通过转录组测序分析和相关基因的转录及蛋白水平的表达分析,探讨绿僵菌诱导宿主植物建立共生的机理。主要研究结果如下
  1、金龟子绿僵菌和尖孢镰刀菌处理的花生根转录组测序分析。两种真菌处理花生根后,得到203个差异基因,其中免疫反应相关基因表达受到两种真菌抑制,以便成功地完成侵染过程,尖孢镰刀菌诱导一些防御基因的表达,例如抗病转录因子、JA介导的免疫反应;绿僵菌则未见防御基因明显表达上调,反而存在一些有利于植物生长的途径,例如糖、氮和脂代谢相关的基因上调表达。从而初步推断了有益菌和病原菌与植物相互作用的分子机理的共通性和差异性。
  2、花生根-绿僵菌互作相关基因的转录及蛋白水平的表达分析。根据转录组数据,筛选得到28个植物-菌互作相关的候选基因,利用RT-qPCR和PRM技术分别检测了这些基因转录水平和蛋白水平的相对表达量。结果表明,两种真菌处理的花生根中识别受体、MAPK级联反应、免疫相关的基因下调表达,且镰刀菌的抑制程度更强,而绿僵菌可以特异性地诱导利于植物生长发育和共生相关的基因上调表达。因此微生物为了成功地侵染植物,可以主动抑制寄主植物的免疫反应,同时绿僵菌还可以促进植物生长和发育,且可能激活了共生识别信号的转导。
  3、金龟子绿僵菌粘附素Mad1基因克隆及表达分析。以金龟子绿僵菌eDNA为模板克隆了Mad1基因,经测序并进行NCBI比对分析,该序列具有完整的开放阅读框为2136bp,并且编码711个氨基酸,该蛋白的理论分子量为748KD。构建了Mad1重组表达载体,通过毕赤酵母真核表达系统,得到了纯化后Mad1蛋白,体外处理花生根组织后表明,Mad1可诱导花生根防御相关的基因表达下调,促使免疫反应受到抑制,证明了粘附素Mad1参与了诱导抑制植物免疫反应,是启动绿僵菌与植物建立共生关系的开端。
  本研究初步揭示了绿僵菌与植物互作时,通过抑制寄主植物免疫,促进共生关系建立的协同调控机制,为进一步探索绿僵菌环境宿存机理、指导促进绿僵菌种群增殖提供理论支撑。
[硕士论文] 吴林珂
农业昆虫与害虫防治 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:转基因作物对非靶标生物的影响是转基因作物环境安全性评价的重要内容。龟纹瓢虫是棉田的优势捕食性天敌,不仅捕食棉田中多种害虫,还取食棉花花粉,是评价转基因棉花环境安全的重要指示性非靶标昆虫。本研究运用高通量测序技术,系统研究了Bt蛋白对龟纹瓢虫解毒、消化基因的表达量和对共生微生物组成和结构的影响。本研究旨在明确Bt蛋白对龟纹瓢虫的安全性,为我国转基因生物安全评价和安全管理提供技术支撑和依据。本研究获得以下主要研究结果。
  1、选择未取食蚜虫的龟纹瓢虫初孵幼虫,分别用合有500μg/ml Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ac+Cry2Ab蛋白的2mol/L蔗糖水处理1龄期龟纹瓢虫48h,以蔗糖水处理为对照,利用高通量测序技术检测龟纹瓢虫体内解毒和消化相关基因的表达量变化。结果表明,高浓度Bt蛋白对龟纹瓢虫1龄幼虫体内解毒基因CarE、P450、GST、CCE和消化基因APN、CP、TPs的表达量没有显著影响。
  2、选择未取食蚜虫的龟纹瓢虫初孵幼虫,分别用含有500μg/ml Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ac+Cry2Ab蛋白的2mol/L蔗糖水处理1龄期龟纹瓢虫48h,以蔗糖水处理为对照,利用Illumma Hiseq平台的高通量测序技术检测龟纹瓢虫体内共生菌的结构和组成。结果表明,葡萄球菌属Staphylococcus、肉杆菌属Carnobacterium双歧杆菌属Bifidobacteium、芽孢杆菌属Bacllus、布赫纳氏菌Buchnera为优势菌属。葡萄球菌属Staphylococcus在取食过Cry2Ab和Cry1Ac蛋白的龟纹瓢虫体内丰度增大。Cry1Ac+Cry2Ab处理的龟纹瓢虫体内肉杆菌属、双歧杆菌属丰度相对增大。但整体上优势共生菌的结构和组成无明显差异。
  3、选择取食蚜虫的龟纹瓢虫初孵幼虫,分别用Cry2Ab蛋白含量为0、100μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml的2mol/L蔗糖水和豌豆蚜隔天饲养至四龄末期。以单一取食蚜虫的龟纹瓢虫为对照组。称量4龄龟纹瓢虫幼虫的虫重,调查单对龟纹瓢虫三天的产卵量。结果表明,Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫的虫重和产卵量没有显著影响。高通量检测龟纹瓢虫体内优势共生菌的组成和多样性。主要的菌门是厚壁菌门(Firmicutes),丰度都高达80%以上。葡萄球菌属(Staphylococcus)的丰度分别为8368%、9639%、9536%、83.72%、93.72%、9845%、8480%,为龟纹瓢虫的优势菌属。结果表明:Bt蛋白不影响龟纹瓢虫的优势共生菌;不同浓度的Bt蛋白优势共生菌一致;Bt蛋白对龟纹瓢虫的体重和产卵量没有显著影响。
  4、选择取食蚜虫的龟纹瓢虫初孵幼虫,用0(T)、500μg/ml(BL)Cry2Ab蛋白的2mol/L蔗糖水和豌豆蚜分别间隔喂养至幼虫的4个不同龄期(1d/1d=蚜虫/Bt)。只取食蚜虫的不同龄期龟纹瓢虫幼虫为对照组YC。酶联免疫试验(ELISA)结果表明Bt蛋白在蔗糖水中稳定存在。高通量检测各龄期龟纹瓢虫体内共生菌的组成和结构。葡萄球菌属(Staphylococcus)为龟纹瓢虫幼虫4个龄期的优势菌属,是常住菌属。T组中,葡萄球菌属在4个龄期的丰度分别为94.11%、7527%、9409%、93.71%;BL组中,葡萄球菌属在4个龄期的丰度分别为78.02%、96.75%、83.38%、71.74%;YC组中,葡萄球菌属在4个龄期的丰度分别为16.14%、83.04%、80.04%、84.80%。结果表明:龟纹瓢虫体内存在Cry2Ab蛋白;龟纹瓢虫幼虫整个发育历期,优势共生菌相同。
[博士论文] 郭义
生物防治学 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:胆甾醇对昆虫发育至关重要,它是细胞膜的重要组成部分和合成蜕皮激素的前体。昆虫自身不能合成胆甾醇,必须从食物中摄取。植食性昆虫可将植物甾醇转化为胆甾醇,肉食性昆虫从猎物体内直接获取胆甾醇。植物体内甾醇含量的降低对植食性昆虫生长发育产生显著不利的影响,采用植物体内甾醇调控的方法可有效防治害虫,但是采用天敌昆虫进行生物防治时,天敌取食这些害虫后对自身产生何种影响,倍受关注。
  蠋蝽是重要的天敌昆虫。粘虫是世界性害虫,也是蠋蝽的天然猎物。本研究基于植物-害虫-天敌三级营养关系,以粘虫的人工饲料代替天然植物,采用化学工艺获得甾醇含量由高到低4个梯度的人工饲料,分别饲喂粘虫,进而饲喂其天敌蠋蝽。测定了4种处理人工饲料中、粘虫体内、蠋蝽体内甾醇的种类和含量;研究了人工饲料中甾醇水平的降低对粘虫及其天敌蠋蝽生长发育的影响;进一步从生化角度对蝎蝽体内营养代谢物质、代谢轮廓和代谢通路进行分析。研究表明:
  1、在甾醇含量方面,不同处理人工饲料中均检测到4种甾醇类物质,无胆甾醇,随着脱甾醇程度增加,4种甾醇的含量均降低。粘虫能够将植物甾醇转化为胆甾醇,且含量随所取食人工饲料中总甾醇含量的降低而显著降低。蝎蝽体内胆甾醇含量在各处理间有显著性差异,均显著低于所取食粘虫体内胆甾醇的含量。
  2、在生物学指标方面,人工饲料中甾醇含量的降低对粘虫生长发育产生显著不利的影响。取食脱2次和脱5次甾醇人工饲料的粘虫幼虫体重从第20天后显著低于其他两个处理,且均未能成功化蛹;粘虫取食脱1次甾醇人工饲料后,幼虫体重和蛹重与对照无显著差异。取食4种处理粘虫的蝎蝽在各龄若虫体重、成虫体重、雌雄虫寿命、单雌产卵量、卵孵化率、卵孵化历期方面相比均无显著性差异。说明4种处理粘虫体内胆甾醇的含量均能满足蠋蝽的生长发育。
  3、在营养代谢方面,4种处理蝎蝽体内均检测到7类共53种代谢物,其中丙氨酸、甜菜碱、二甲胺等8种物质在不同处理中与对照相比有显著性差异。代谢轮廓分析表明,蝎蝽取食用脱5次甾醇饲料饲养出的粘虫后,其体内代谢物的代谢轮廓与对照相比有较大分离,麦芽糖、葡萄糖、酪氨酸、脯氨酸对分离贡献重大,可做为生物标志物。代谢通路分析表明,蠋蝽取食用脱2次和5次甾醇饲料饲养出的粘虫后,各有一个代谢通路与对照有显著差异,但通路影响值为0,对整个代谢通路无影响。
  综上,人工饲料中甾醇含量的降低,对植食性昆虫粘虫生长发育有显著不利的影响,对天敌蠋蝽生长发育和营养代谢的影响较小。未来可以采用调控植物体内甾醇含量与释放天敌昆虫并举的方法控制害虫,达到协同控害的效果。
[硕士论文] 王尧
入侵生物学 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:莲草直胸跳甲是防控入侵杂草空心莲子草的重要生防天敌,夏季高温跳甲种群骤减导致该天敌在空心莲子草繁盛期的生物防治缺位。本论文围绕高温对莲草直胸跳甲蛹、卵巢发育的影响,通过分析短时间高温胁迫下莲草直胸跳甲蛹羽化和产卵情况;利用高温暴露、卵巢解剖、显微拍照等技术,初步探讨了高温胁迫对莲草直胸跳甲卵巢发育的影响;以及利用荧光定量PCR检测技术,检测了高温胁迫下莲草直胸跳甲雌性昆虫卵巢中Vg基因的表达量。综上,得出以下结论:
  (1)明确了高温胁迫莲草直胸跳甲蛹不利于其后续的的生长发育。我们利用短时(2h/d,5d)高温(40℃)处理莲草直胸跳甲的蛹,观察其羽化,以及羽化后成虫产卵情况。发现其羽化数量与对照组相比显著降低,羽化出来成虫的产卵量较对照组也显著降低,且所有的卵均不能孵化。因此我们可以明确高温对莲草直胸跳甲的蛹存在着显著的负面影响。
  (2)本文首次确定了周期性重复高温对莲草直胸跳甲产卵前卵巢发育和产卵过程有不利影响。周期性重复39℃高温下,莲草直胸跳甲卵巢生长和卵黄沉积的速度都明显较慢。39℃处理后,与25℃和36℃相比卵巢畸形率最高,高达43.8%。这一结果进一步证实,周期性重复39℃高温显著影响莲草直胸跳甲的卵巢发育。
  (3)通过对莲草直胸跳甲湖南长沙种群的卵黄原蛋白基因的克隆分析,利用荧光定量PCR检测技术,检测了莲草直胸跳甲卵巢中Vg基因的表达量。其Vg基因在36℃与对照处理下具有不同的相对表达,温度越高则表现出较低的表达水平。解释了在夏季高温条件下莲草直胸跳甲卵巢受损,Vg基因表达量显著降低,导致其生殖力下降。
  本文从生物学现象和分子生物学机理中解释了为什么在夏天(7-9月)时莲草直胸跳甲会出现种群骤减,导致空心莲子草难以控制,甚至暴发成灾。为莲草直胸跳甲的热驯化和耐热种群筛选奠定基础,也为下一步空心莲子草的防控提供指导。
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