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[硕士论文] 张婷
控制工程 安徽理工大学 2018(学位年度)
摘要:我国农业种植面积广大,而且一直都是农民凭借经验进行人工灌溉,故用于灌溉的水资源消耗一直很大。随着近几年环境的恶化,大部分地区的小河、水井等都已经干枯,所以提高水资源的利用率、加快转变农业的发展方式迫在眉睫。国家也一直在号召农业现代化,随着国家政策的推出,越来越多的技术被逐渐地应用在农业上,比如智能控制、物联网技术、云计算等。针对目前的形式,本文以小麦田为例,设计了一套基于物联网的小麦智能灌溉系统。
  基于物联网的小麦智能灌溉系统主要包括四部分:下位机的终端监控设备模块、网关模块、上位机的智能灌溉决策模型和交互界面。终端监控设备用于监测小麦的环境参数和控制电磁阀的开关,该部分主要完成了ZigBee芯片、各类传感器和电源模块的软硬件设计。网关模块是整个智能灌溉系统的协议转换设备,它将来自终端监控模块的数据包进行分析、压缩和融合后,利用4G网络传输到上位机,此部分主要是ZigBee、处理器、4G模块的硬件电路设计和网关处理数据的软件工作流程设计。上位机的智能灌溉决策模型主要包括规则模型和数学模型,规则模型是根据小麦灌溉管理的专家知识和种植人员的经验设计的,数学模型是利用彭曼公式和水平衡方程对小麦需水量和所需灌溉量进行的建模,这两种模型均可对小麦的灌溉进行预报和决策,从而达到节水灌溉的目的。最后设计了可实时显示的监控界面,将采集的信息和灌溉决策更直观的展现给用户。
  本文设计的基于物联网的小麦智能灌溉系统以ZigBee技术和4G技术相结合的方式实现无线传输,解决了有线传输中布线麻烦、不易维修等问题。同时,该系统的智能灌溉决策模型给出了两种基于不同的灌溉策略下的灌溉决策方法,提高了小麦智能灌溉的准确性,为小麦节水灌溉提供了参考,具有一定的实际意义。
[博士论文] BASIR UL HAQ
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一种重要的植物次生代谢物,它在调节植物根的生长、根毛发育、芽枝产生、植物共生菌的互作等生理过程中都发挥着重要作用。通过对拟南芥、豌豆、水稻和矮牵牛的芽枝突变体研究已经鉴定出多个参与独脚金内酯合成和信号传导的关键基因,然而,其在大豆中是如何合成以及信号是如何传导等却仍然并不清楚。
  鉴于独脚金内酯如此重要而它们的生物合成底物(类胡萝卜素)又是普遍存在的,因此在本研究中,我们主要对大豆基因组中控制独脚金内酯合成和信号传导相关的基因进行了鉴定。我们首先在大豆基因组中找到MORE MAXILLARY BRANCHING(MAX)的同源基因:GmMAX1s,GmMAX2s,GmMAX3s,GmMAX4;然后根据表达水平对这些基因进一步筛选,最后挑选出四个基因在根中表达量相对较高,且与根中独脚金内酯合成相关。为了进一步研究GmMAX的基因功能,我们挑选GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a作为候选基因并借助相关突变体材料进行了深入研究。在拟南芥中,通过突变体、突变体互补以及超表达株系对这四个基因进行了功能鉴定,并鉴定了它们在芽枝、株高、叶形、主根长度、毛状发根、表皮毛数目和长度等表型中的作用。我们发现在互补材料中不仅外在表型得到了恢复,而且突变体植株中被破坏的激素平衡比如所有突变体中JA和ABA的含量显著降低,生长素在atmax1,atmax3,atmax4中显著偏高等变化也恢复到正常水平。而在超表达转基因株系中,相比于野生型其激素含量及平衡又被打破。
  非生物逆境对许多作物的产量产生不利的影响,因此我们也在转基因拟南芥和大豆根毛中检测独脚金内酯合成和信号转导相关基因的功能。在独脚金内酯合成和信号转导相关基因的拟南芥突变体atmax1,atmax2,atmax3,atmax4中,发现在干旱条件下突变体的存活率比野生型有显著降低,同时发现超表达独脚金内酯合成和信号转导途径的GmMAXs基因同对照超表达GUS基因相比,可以显著提高根毛的抗旱性。表型分析发现突变体也表现出对干旱胁迫更为敏感的表型。这些结果表明独脚金内酯合成途径和信号转导途径在干旱胁迫中起着重要作用。
  GmMAXs的材料根毛形态的变化,发现转基因阳性株系的根毛显著长于对照组。转录组分析发现这些基因超表达后许多激素相关基因的表达也都发生显著变化。与之对应,GmMAX1a,GmMAX3b和GmMAX4a超表达材料根毛中ABA含量减少,JA含量增加;GmMAX1a和GmMAX4a超表达株系根毛中生长素含量增加,而GmMAX3b超表达株系的根毛中生长素含量并未检测到明显差异。GmMAX2a超表达株系与GUS对照材料相比ABA和JA含量都显著增加,IAA含量降低,而在抑制株系GmMAX3b-KD则观察到完全相反的表型。
  同时,我们也在大豆的超表达和抑制株系中检测了这些基因对结瘤的影响。超表达GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a的株系(GmMAX1a-OE,GmMAX2a-OE,GmMAX3b-OE和GmMAX4a-OE)中结瘤数目增多,而在GmMAX3b的抑制株系(GmMAX3b-KD)中结瘤数目减少。GmMAXs转基因发根中几个关键结瘤基因的表达水平也发生了改变。说明独脚金内酯相关的GmMAXs系列基因正调控结瘤。另外,我们也发现在B.japonicaUSDA110菌株处理48h后,超表达株系中的结瘤早期基因如GmNSP1a,GmNSP1β表达量显著高于GUS对照组。
  另外,亚细胞定位显示独脚金内酯合成相关的GmMAX1a-GFP,GmMAX3b-GFP,GmMAX4a-GFP融合蛋白定位在叶绿体,信号传导相关的GmMAX2a定位于细胞核。该研究不仅揭示了独脚金内酯合成和信号转导途径在大豆中的保守性,还表明独脚金内酯跟其他激素之间的互作可能在控制植物发育及大豆结瘤中发挥重要的作用。GmMAX1a,GmMAX2a,GmMAX3b和GmMAX4a参与的独脚金内酯合成和信号传导可能通过影响根毛形成及与根瘤菌互作来调控大豆的结瘤。
[硕士论文] 金诚
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物油脂不仅为人体提供能量与营养,也是重要的工业原料。甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国第一大油料作物,菜籽油是我国食用油的主要来源之一。近年来,食用植物油消费总量不断提高,提高油菜种子含油量是保障我国食用植物油供需平衡的关键因素。了解油菜种子油脂合成调控机制可以为油菜高油育种提供理论支持。
  本研究从500余份油菜种质资源挑选出2个“双低”油菜材料中双11号(ZS11,高含油量)和WH5557(低含油量)并利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定了不同发育阶段种子的脂肪酸含量及组成。结果表明,ZS11与WH5557成熟种子的含油量和脂肪酸组成具有明显差异,并且在种子发育过程中ZS11油脂积累速度显著快于WH5557。
  利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术(MALDI-MSI)分析了成熟种子不同组织(外子叶、内子叶与胚根)中三酰甘油(TAG)与磷脂酰胆碱(PC)的含量与组成。结果显示,不同组织之间的TAG与PC的含量与组成存在显著差异,脂质分布具有空间分布差异性。同时通过电喷雾质谱串联质谱(ESI-MS/MS)分析了种子中的TAG及PC各组成成分的mol%,此结果与MALDI-MSI的结果总体一致,表明MALDI-MSI结果是可靠的。在显微镜下分离成熟种子的外子叶、内子叶及胚根并提取脂质,利用液相色谱电喷雾质谱串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测了种子各组织的脂质含量及组成成分。结果表明,不同组织中脂质含量与组成具有显著差异。此结果与MALDI-MSI结果一致,进一步验证了MALDI-MSI结果的可靠性。
  收集发育34天的种子,提取种子不同组织的RNA并进行转录组测序。转录组数据表明,糖酵解、脂肪酸从头合成、TAG合成、脂滴形成等油脂代谢途径中多个关键基因的表达量均存在差异。以上结果表明,油脂合成过程中的关键基因的表达水平对不同种类脂质的空间分布起着一定的作用。而2个材料中蛋白质、可溶性糖及淀粉含量的差异则暗示了WH5557种子中的碳更倾向于积累到碳水化合物中,这可能是造成其含油量低的原因之一。
  此外,为了更高效地分析油菜脂质代谢物,实现高通量脂质组分析,我们开发并建立了基于高分辨质谱UPLC-TripleTOF的脂质组高通量分析方法。相比于传统的脂质组分析方法,此方法具有高效、快速、样品需求量少和准确度高等特点。基于此方法,我们分析了ZS11的根、茎、叶、叶柄及发育中的种子的脂质含量及组成成分。结果表明,基于UPLC-TripleTOF的脂质组分析方法重复性良好,可以对甘油酯、磷脂和糖脂等13类脂(总计146个脂质分子)进行准确地定性与定量。油菜中不同器官及不同发育阶段种子的脂质组的测定为脂质组学的研究提供了参考依据。基于UPLC-TripleTOF的脂质组学分析方法可成为高通量脂质组分析的重要手段。
[博士论文] MUHAMMAD MAHMOOD AHMED
CROP BIOTECHNOLOGY 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着世界人口的增长,人们对棉花的需求也越来越大,导致棉花育种工作的主要目标是保障棉花纤维产量的稳定。由于单铃籽棉重是由多重产量性状决定,因此提高棉花的产量是一个巨大的挑战。产量和纤维品质共同调控棉铃发育。解析调控棉铃大小农艺性状的遗传和生物学机制,对棉花研究者来说仍是一个巨大的挑战。为了解析其遗传机制,一个通过种间杂交获得的小棉铃突变体BS41,在调控单铃籽棉重,皮棉重,百粒重等性状表现出杂种衰败。通过多重标记的检测,在12染色体上鉴定到了一个稳定的调控位点,qSCW-c12。在后代BC2F4群体中,这个位点qSCW-c12在AD-A12_07和AD-FM_44标记之间,大小为0.89cM。
  一个主效的杂交衰败多效性位点(qSCW-c12),其在多个连续的群体中被证实调控棉铃的大小和产量性状。通过连续的精细定位,在12号染色体上将其缩小到0.89cM遗传区间,与之相对应是包含11个基因的180Kb的物理区段。同源比对也测到了一个40个碱基插入缺失位点在AD-FM_44克隆序列,在与SCW紧密连锁的GhBRH1_A12基因的上游341的位置。通过在BS41中超表达GhBRH1_A12和Li1的转录组分析显示,其在棉铃发育早期调控棉花纤维的发育。忽略其生长抑制,BS41表现出油菜素甾醇平衡在棉铃发育过程中,即BR信号受抑制,导致在BS41中GhBRH1_A12下调表达。
  本研究表明GhBRH1_A12在调控BR平衡中发挥了重要的作用,其可能通过在棉花中影响棉铃的大小调控植株的生长发育和棉铃的发育。GhBRH1_A12作为一个决定棉铃重,皮棉重和百粒重的候选基因,通过调控BR信号路径影响衣分,纤维密度和单铃种子数。总的来讲,通过精细定位和图位克隆的SCW调控位点qSCW-c12,鉴定到了GhBRH1_A12候选基因,一个BR响应的RING结构域包含E3连接酶。
  在具有完整注释信息的四种棉花基因组中我们预测了BRH1基因。BRH1基因的遗传多样性,结构和功能变异被强调,在AtBRH1多肽中发现两个结构域,一个是推测的具有信号传导作用的跨膜螺旋(TMH)结构域,一个是具有E3连接酶活性的RING锌指结构域。四种棉花基因组中完整的注释信息有利于BRH1候选基因的预测。在陆地棉、海岛棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉中分别预测到16、4、7、8个BRH1基因。利用转录组数据测定棉花基因组中BRH1基因在根,叶,茎,花瓣,花药,柱头,胚珠,10天,20天纤维和种子的组织表达模式。在第1天和第3天,野生型比Li1中观察到更高的GhBRH1_A12转录本丰度。这些发现表明GhBRH1_A12可能在棉铃发育早期通过调控纤维发育来参与调控SCW。
  细胞中的分子过程可以通过一种重复的DNA序列,既微卫星定位,由于其长度变异和基序的不完整性。这种遗传变异的机制在不同的有机体中得到了广泛的研究。然而,基因组内容复制的进化过程主要被植物所占据,关于非编码的DNA还了解的很少。本研究第一次详细在植物界的5个分类学家族的13个植物物种中,研究了在基因组合的基序的不完整模式。
  我们研究了不同种类植物的基因组范围内的基序不完整模式,并利用各种分析工具,研究了微卫星重复密度、不完整程度和长度等特征关系。此外,比较基因组学方法有助于探索在棉花进化中微卫星的保守性。根据我们的研究结果,在棉花中,长基序重复的较慢衰减导致第二高频率的5nt基序占主导。此外,2nt的重复在四倍体棉花中有一个较快的衰减速率。与可可相比较发现,“AT”重复变得越来越少在分化过程中,因为棉花这一分之在现在的棉花驯化过程中经历了全基因组复制和多倍体化的过程。
  这项研究的结果可能对探索简单的非编码遗传元素的相对进化足迹,如重复,通过对棉花基因组特异性特征的进化,提供了参考。类似地,短的基序重复出现了快速的减少,伴随棉花进化的过程2nt重复急剧减少,“AT”在四倍体棉花中减少的最为激烈。然而,如果对目前的研究结果加以考虑,对“AT”基序的衰减热点全面分析,以及四个基因组的不完整性,可以揭示其对基因调控要素的影响,是进一步了解其基础机制的必要条件。
[硕士论文] 刘晓斐
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:倒伏是影响水稻高产稳产优质的重要因素之一,倒伏的发生严重限制了水稻机械化收割的推广。白叶枯病是水稻生产中最为严重的细菌性病害,该病侵染源复杂且危害严重,而化学防治效果甚微,培育抗白叶枯病水稻品种是目前最经济有效的途径。稻瘟病已经成为我国六大稻区的共性病害,目前大面积应用的光温敏核不育系的稻瘟病抗性水平低。因此,培育既抗倒伏抗、抗白叶枯病和稻瘟病的光温敏核不育系对我国水稻生产有着极其重要的意义。
  本研究对“华1015S”与抗倒伏材料“XJ12200-1”杂交后代中选育的7份不育系新材料进行抗倒伏性、白叶枯病和稻瘟病抗性、育性转换特性、主要农艺性状和配合力的评价,为后续的育种应用提供了有实用价值的依据。主要研究结果是:
  1、通过育性转换特性、生育特性、主要农艺性状和开花习性的鉴定表明,华5091S、华5124S、华5306S、华5310S和华5325S育性转换的起点温度约为23℃、自然条件下稳定不育期55-80天,基本符合水稻光温敏核不育系的育性要求,可以对其他性状做进一步的评价。其中,华5325S的生育期与华1015S一致,平均播始历期82天左右,其他4个新不育系比华1015S迟1~4天。华5325S的植株较矮、穗大粒多、但分蘖较少。华5306S的植株最高,达到98.3cm,比华1015S高9.6cm,其他3个不育系的株高比华1015S稍矮。5个新不育系的每穗总粒数均多于华1015S。但是柱头总外露率都比华1015S低。
  2、通过抗倒伏性相关参数的测量结果表明,与亲本华1015S相比,华5124S、华5306S和华5325S的倒三节节间直径大,长度短,抗折力明显提高,而华5091S和5310S与亲本相当。其中,华5306S的抗折力最大。
  3、白叶枯病和稻瘟病抗性鉴定结果表明,华5091S、华5124S、华5306S、华5310S和华5325S的白叶枯病鉴定表现抗至高抗,分别比亲本华1015S提高1到2个抗级。华5091S、华5124S、华5306S、华5310S和华5325S的叶瘟1-3级,与华1015S相似。除华5124S的穗颈瘟发病率达到47%,明显高于华1015S以外,其他4个不育系的穗颈瘟发病率都在4.0%-13.0%,与华1015S相似。用35个稻瘟病菌株人工接种鉴定叶瘟表明,除华5306S的抗性频率为94.3%以外,其他4个新不育系的抗性频率均为100%。
  4、配合力分析表明,华5325S的产量一般配合力最强。并且容易配制出早熟、植株较矮、产量较高的组合,但直链淀粉含量较低。通过优势鉴定,筛选出2个早熟、高产、米质优的组合华5325S/华润2号和华5325S/五山丝苗,可以进一步进行试制种和比产试验。
[博士论文] 沈钰森
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:甘蓝型油菜(Brassica napus L.,2n=38,AACC)是世界上重要的油料作物,为人类提供了食用油、为动物提供了蛋白饲料、也为工业发展提供了生物质能。理想株型的甘蓝型油菜品种可以提高植株对光能的利用、便于合理密植及适宜机械化收获,是我国当前油菜育种的重要目标。开展甘蓝型油菜株型相关性状的QTL定位及遗传调控机制解析,可为分子定向育种奠定基础。本研究利用甘蓝型油菜和荠菜(Capsella bursa-pastoris)杂交产生的分枝紧凑的异源渗入系为亲本之一,构建了DH群体和高密度的SNP遗传连锁图,进行了分枝角度的QTL定位及候选基因预测,发现控制株高、第一分枝高、茎秆直径与开花期的共定位QTL,主要结果如下:
  1.DH群体与高密度遗传连锁图谱的构建
  以紧凑分枝的渗入系Y689和甘蓝型油菜品种Westar为亲本、利用小孢子培养技术构建了包含208个株系的YW-DH群体,用60K SNP芯片进行基因分型,构建了一张包含3,073个SNP标记的高密度遗传连锁图谱,总长为2,242.14cM,平均标记密度为0.73cM。将SNP标记比对到甘蓝型油菜参考基因组上,发现A02和C02染色体上存在易位现象,而在A06,A08,C01和C07染色体上存在明显的染色体缺失,显示渗入系在培育过程中可能发生了较大的基因组变异。
  2.分枝角度性状的QTL定位
  2014-2016年将YW-DH群体在半冬性、冬性和春性的六个环境中种植并考察了分枝角度性状,结合群体的基因型数据,在全基因组范围内共检测到17个QTL,其中位于A03上的QTL(qBA.A03-2)能被重复检测到,解释10.21%-13.21%的表型变异;位于C03染色体上的两个相邻的QTL(qBA.C03-3和qBA.C03-4)也能被重复检测到,分别解释10.55%-21.73%和14.02%-17.21%的表型变异。与他人的结果对比表明,这三个都是新发现的主效QTL。候选基因预测生长素早期响应基因SAUR30(BnaC03g14890D)和SA UR55(BnaC03g16420D)可能参与调控油菜分枝角度大小。
  3.株高、第一分枝高、茎秆直径和开花期的主效QTL共定位
  对YW-DH群体中株高、第一分枝高、茎秆直径和开花期多年多点的表型考察发现,这四个性状相互间存在显著相关性。其中株高与第一分枝高、茎秆直径和开花期的相关系数分别为0.67、0.76和0.61;第一分枝高与茎秆直径和开花期的相关系数分别是0.53和0.68;茎秆直径与开花期的相关系数是0.54。
  对这四个性状进行QTL定位,检测到调控株高的主效QTL有5个,解释平均表型变异10.81%-22.97%;调控第一分枝高的主效QTL有5个,解释平均表型变异9.69%-21.99%;调控茎秆直径的主效QTL有5个,解释平均表型变异11.19%-16.58%;调控开花期的主效QTL有4个,解释平均表型变异11.76%-30.89%。在这19个主效的QTL中,有11个是新发现的QTL,包括调控株高的3个,调控第一分枝高的3个和调控茎秆直径的5个;并且这19个主效QTL都分布在A02和A07染色体的末端,在A02上1.4-24.6cM和A07上104.0-122.2cM处形成两个QTL簇。将这两个QTL簇内的QTL用元分析的方法进行区分和整合,分别得到3个和4个控制两个或以上性状的共定位QTL。为探究这几个性状的遗传基础(调控基因是紧密连锁或一因多效),我们进行了条件QTL分析。结果表明位于A02染色体上的QTL簇内控制四个性状的基因可能是一因多效;位于A07染色体上的QTL簇内控制四个性状的基因可能存在紧密连锁。这为主效QTL的进一步精细定位及其在分子育种中的合理利用提供了有价值的参考。
[硕士论文] 侯瑞
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:青贮玉米属于青饲作物,其茎、叶及果穗经发酵后均可用作家禽、家畜的饲料。加强青贮玉米的育种研究不仅可以解决当前青饲作物生产能力不足的问题,还能大幅度提高农牧交错区农民的收入,对实现农业由数量型增长向优质高效型增长的方向转变有着深远意义。
  本研究利用以大刍草为供体、优良玉米自交系综3为受体构建的重组自交系群体(BC2F7-RIL)为材料,从中选取138个家系作为母本,分别与5个青贮玉米自交系进行杂交,进而在多环境下对杂交组合的单株生物量及4个生物量相关性状进行表型评价,主要结果如下:
  1.以138个家系为母本分别与3个青贮玉米自交系进行杂交,共组配了263个杂交组合。基于这些杂交组合在黄冈和鄂州环境下的单株生物量、株高、穗位高、茎粗和单株绿叶数的表型,筛选了28个生物量大的杂交组合。
  2.利用当选的28个杂交组合的20个母本系,继续与4个青贮玉米自交系进行杂交,共组配了80个杂交组合。对这80个杂交组合的单株生物量和4个生物量相关性状进行评估,筛选到了2个生物量高于对照材料(雅玉8号)的杂交组合:ZT70×HZ2和ZT209×HZ2。
  3.杂交组合ZT70×HZ2和ZT209×HZ2的平均株高分别为331.81cm和315.28cm,单株生物量分别为1.75kg和1.80kg,分别比对照高38.89%和42.46%,具备作为青贮玉米的潜在价值。当选杂交组合中的2个渐渗系(ZT70和ZT209)也为青贮玉米育种提供了优良种质资源。
[硕士论文] 古风
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:了解作物气候适宜度及产量差对当前玉米生产具有重要意义。本文拟对湖北省主要玉米生产区包括,中部低丘陵平原玉米产区(HP),北部岗地夏玉米生产区(NH),西部山区玉米生产区(WM),进行玉米气候适宜度及产量潜力评估,以期为湖北省玉米合理生产布局及种植管理,了解气候变化对湖北玉米生产的影响提供参考依据。本文以当地推广的中熟玉米品种郑单958为例,基于2012-2013年该品种每年8个播期试验获取气候适宜度模型中一些参数,利用湖北省26个基准气象站1967-2016年气象数据,分析了不同产区春玉米(SpM),夏玉米(SuM),秋玉米(AuM)不同生育阶段的温度适宜度、降水适宜度、光照适宜度及综合气候适宜度。继而利用Hybrid-maize模型湖北省玉米产量潜力及产量差进行了分析。主要研究结果如下:
  1.湖北省不同玉米产区玉米不同生产阶段气候资源与气象胁迫均有差异。中南部低丘平原区(3136AAT℃.d)玉米全生育期内的有效积温最多。而鄂北岗地(2943AAT℃.d)及鄂西山区(2939AAT℃.d)玉米生长期内有效积温在近50年内的年际趋势变化显著,表明该区域玉米有效积温有增加趋势明显,且播种始期有明显提前的趋势。三个玉米生产区以夏玉米的伤害积温(KDD)最高,其次是春玉米(219KDD),秋玉米KDD最少。全生育期降水量以HP生产区春玉米最多。三个玉米生产区玉米吐丝.乳熟期干旱发生频率最高,而播种至拔节期渍害发生频率最高。低丘平原区秋玉米生育期内日照时数最多。
  2.从温度适宜度看,以夏玉米(S(T)0.87:CV4.6%:Tr0)温度适宜度最高,其次是秋玉米。春玉米降水适宜度明显高于夏玉米与秋玉米(R587:CV23.8%:-13.73)。而三季玉米中,秋玉米具有最高的光照适宜度,且在低丘平原区玉米光照适宜度要优于其他2个玉米产区。从气候适宜度看,三大玉米产区中均以春玉米与夏玉米气候适宜度较高,而秋玉米气候适宜度较差。
  3.研究结果表明低丘平原区玉米产量潜力(3.65mg.ha-1)要高于鄂西山地(4.23mg.ha-1)与鄂北岗地玉米区(6.03mg.ha-1)。低丘平原区玉米试验产量与农户产量也较高,分别达到8.62t ha-1与6.27t ha-1。鄂北岗地玉米试验产量最低(7.94mg.ha-1),但农户玉米产量水平(5.09mg.ha-1)在三大玉米产区中居于第2位。低丘平原区玉米产量差最小,且与鄂北岗地产量差差异不大。鄂西山地玉米区玉米产量差最大。三个玉米产区中,模拟产量与试验产量之间的产量差(YGM)5.86mg.ha-1最高,农户产量与雨养产量潜力之间的产量差(YGE)5.04mg.ha-1次之,试验产量与农户产量之间的产量差(YGR)3.01mg.ha-1最低。三大生产区域之间的玉米产量差较小。
  该研究表明低丘平原区玉米具有较好气候适宜度与产量潜力.导致玉米产量差的原因主要是气候适宜度的变化及管理措施。在湖北省不同玉米产区应针对不同种植季玉米气候资源特点,采取适当的措施,以缩小产量差。
[硕士论文] 夏亦涛
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:镉是一种有毒元素,我国耕地土壤镉超标点位数达7.0%,同时小麦是中国的第二大粮食作物,因此筛选小麦镉低积累品种并探明其镉低积累的生理及分子机制具有重要理论与实践意义。本文以全国范围内收集的小麦主栽品种为材料,分析不同品种籽粒镉含量差异的基础上,探讨小麦高低积累品种分子标记特征及离子组特征,进一步分析典型小麦籽粒镉高、低积累品种在镉吸收、转运之间的差异机制,取得的主要结果如下:
  1.小麦籽粒镉高低积累品种筛选。通过2年多点的大田试验,以成熟期籽粒镉含量为主要指标,从134个中国小麦品种(系)中筛选出籽粒镉、低积累品种各15个,并初步发现小麦籽粒镉含量与苗期地下部至地上部的镉迁移系数呈显著正相关。
  2.小麦籽粒镉高、低积累品种的分子标记特征。分析了镉积累相关分子标记Usw47、Scopc20与小麦籽粒镉含量之间的关系。结果表明,单独使用Usw47或Scopc20分子标记对小麦镉高、低积累品种的鉴别率不高,但应用Usw47标记结合苗期镉迁移系数的方法,可以将小麦籽粒镉高、低积累品种的鉴别率由原来的66.7%和46.7%,提高到88.9%和85.7%。
  3.小麦籽粒镉高、低积累品种离子指纹特征。聚类分析结果表明,小麦籽粒镉高积累品种可分为颖壳镉高积累和颖壳镉低积累两类,小麦籽粒低积累品种可分为颖壳镉高积累和茎秆镉高积累两类;小麦籽粒、颖壳和茎秆的镉累积与锌、钙、镁、锰关系密切,小麦籽粒镉含量与锌、钙、镁、铁、锰含量呈显著正相关,叶片镉含量与锌含量呈负相关,茎秆镉含量与钙、锰含量呈负相关;小麦籽粒镉与锌存在共富集现象,且两者符合一元二次方程(R=0.765,P<0.05)。
  4.小麦籽粒镉高、低积累品种吸收转运的差异机制。品种H86具有更加发达的根系以及更高的根系TaIRT1表达量,而品种L15具有较低叶片、根系镉含量,其叶片至茎秆、籽粒至颖壳的镉迁移系数低于品种H86,同时镉在品种L15的根系细胞壁和叶片液泡中分配比更高,品种L15各部位TaHMA3基因表达量均显著高于品种H86;推测籽粒镉低积累品种L15较弱的镉吸收转运能力弱,并将更多的镉区隔化在根系细胞壁和叶片液泡中,是导致其籽粒镉低积累的主要原因。
[硕士论文] 张倩雯
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:磷是植物生长发育必需的大量营养元素。在种子发育阶段,植酸(肌醇六磷酸)是种子中磷的主要贮存形式,对植物感知体内磷水平和维持无机磷的稳态起到关键作用。但是,植酸容易与金属阳离子螯合,形成植酸盐。由于人和单胃动物的消化道不含植酸酶,无法分解植酸盐,从而降低金属元素的可利用性,引起微量元素缺乏症。同时,植酸盐随粪便排出体外,造成磷资源的浪费,流入江海湖泊甚至导致水体富营养化。油菜是我国主要的油料作物,其主产区土壤有效磷较低。此外,菜籽饼(粕)常用来作为饲料。因此研究甘蓝型油菜种子植酸积累的遗传特性,对油菜磷高效研究和低植酸育种具有重要意义。课题组前期利用甘蓝型油菜60K Illumina SNP芯片对甘蓝型油菜关联分析群体进行基因分型分析,最终获得19397个高质量SNP标记。本研究利用铁沉淀法测定油菜关联分析群体390个品种种子植酸浓度和含量,结合SNP标记对甘蓝型油菜种子植酸浓度和含量进行全基因组关联分析。同时测定不同磷水平下,甘蓝型油菜BnaTNDH群体182个株系以及亲本Tapidor和宁油7号种子植酸浓度和含量,基于BnaTNDH群体2041高密度遗传连锁图谱定位了油菜种子植酸相关的QTL。结合前期油菜苗期营养液培养和纸培根形态性状,分析种子植酸浓度、植酸含量与苗期根形态性状的相关性。主要结果如下:
  1.油菜关联分析群体种子中植酸浓度与含量呈正态分布,具有较大的遗传变异。利用TASSEL5.0软件,构建GLM和MLM模型进行植酸含量相关性状的全基因组关联分析,共检测到35个与种子植酸浓度、植酸含量关联的显著SNP位点,解释表型变异范围为5.33%-7.29%,分别分布在甘蓝型油菜A2、A3、A4、A5、A6、A9、A10、C1、C2、C3、C4、C7和C8染色体。这些SNP位点表型贡献率较低,表明油菜种子植酸浓度和含量可能是由微效多基因控制。在A09染色体上,重复检测到一个与种子植酸含量显著关联的SNP(Bn-Scaffold000321-p23083),对SNP标记LD区间内的基因进行分析,预测了4个候选基因,它们分别参与了磷的吸收转运,种子中植酸的合成运输。该SNP位点附近紧密连锁的5个SNP形成8种不同的单倍型,其中单倍型C(AANAA)是植酸含量较低的单倍型,单倍型E(AAYNA)是植酸含量较高的单倍型。
  2.本研究测定了低磷(LP,9P2O5kg/ha)和正常磷(HP,90P2O5kg/ha)处理BnaTNDH群体182个株系种子植酸浓度和植酸含量,结合BnaTNDH群体2041高密度遗传连锁图谱,共检测到6个油菜种子植酸相关的QTL,分别分布在A3、A9和C6连锁群。以欧洲冬油菜品种Darmor-bzh的基因组为参考基因组,对QTL区间的基因进行GO富集分析,结合拟南芥注释,预测了5个候选基因,这些基因的功能主要与植酸合成、硫酸盐转运和磷饥饿响应有关。
  3.甘蓝型油菜BnaTNDH群体种子植酸浓度与纸培无磷处理的地上部鲜重和地上部干重呈负相关。甘蓝型油菜关联分析群体种子植酸含量与纸培无磷处理地上部干重、根干重、主根长和总根长呈正相关。由于相关性系数较低,只具有统计学意义,不具有生物学意义。种子植酸浓度、植酸含量与苗期根形态性状的相关性需要进一步通过生理试验验证。
[硕士论文] 谢赛
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,全球变暖引发的区域性高温是导致农作物雄性不育的重要因素之一,并且严重威胁农业生产。研究表明GhCKI在响应高温导致棉花雄性不育方面具有重要功能,因此为了进一步解析高温胁迫导致棉花雄性不育的败育机理,通过酵母双杂筛选出与GhCKI互作的GhACBP4(acyl-CoA-binding protein4)蛋白,并且从超表达GhCKI拟南芥花蕾和棉花H05(高温敏感型)花药的磷酸化蛋白质组中筛选出3种ACBP4的磷酸化肽段。因此,本研究主要解析GhACBP4在花药中的功能,主要结果如下:
  1、经过序列分析发现,在陆地棉基因组中GhACBP4存在6个同源基因。组织表达模式分析表明Gh_A13G0893/Gh_D13G1134在花药中优势表达。然而转基因材料proGh_A13G0893::GUS的组织表达模式表明,该基因在花药、胚珠和萌发后的种子中高量表达。而且,高温诱导表达模式分析表明,在花药开裂期(ADS,>24mm花蕾)GhACBP4同源基因总体的表达量受高温诱导后可能会下调表达。
  2、综合比较6个同源基因的表达水平和3种磷酸化肽段,选取Gh_A13G0893做进一步的功能研究。在超表达Gh_A13G0893和Gh_A13G0893-3'UTR-RNAi特异干涉棉花材料中,都出现了雄性不育的表型。在Gh_A13G0893-3'UTR-RNAi不育材料中GhACBP4的6个同源基因表达量均降低,可能与拟南芥acbp4acbp5突变体败育表型相一致。借助透射电镜观察超表达不育材料的花药,在绒毡层降解时期,小孢子内部缺乏淀粉和脂滴,内壁缺失,而且绒毡层中没有脂滴;在花药开裂期,花粉外壁没有含油层。
  3、相比野生型,超表达GhACBP4不育材料的花药中脂肪酸含量下降。并且野生型YZ1和H05的花药中脂肪酸的含量受高温胁迫后也发生显著变化。利用薄层层析发现,在超表达GhACBP4不育材料的花药和高温诱导H05的花药中,脂质的含量也显著变化。这些结果表明超表达GhACBP4不育的表型同高温诱导野生型败育的表型具有相似性。
  4、为了验证GhCKI和GhACBP4是否存在互作,并了解它们发生互作的位置,通过酵母双杂、双分子荧光互补实验和双分子荧光素酶互补实验发现,GhCKI和GhACBP4存在互作,同时这两个蛋白共定位于过氧化物酶体中。然而,如果将GhACBP4蛋白的501和517氨基酸位点由丝氨酸(S)突变为甘氨酸(A)后,含有501位点突变的GhACBP4就不能与GhCKI发生互作,但含有517位点突变的GhACBP4与GhCKI仍有微弱互作。
  5、在原核表达过程中发现,带有His标签的GhACBP4蛋白可能具有多种磷酸化修饰状态,进而无法在体外被GhCKI磷酸化。
  6、经过综合分析,推测GhACBP4过量表达会激活GhCKI转录,导致大量GhACBP4蛋白被GhCKI磷酸化;而GhACBP4的活性可能降低,或被降解。当GhACBP4转录水平受到抑制,其蛋白水平也降低。并且,在高温诱导条件下,这两种情况可能同时存在。因此,这可能造成过氧化物酶体中脂质转运发生异常,最终导致花粉败育。
[硕士论文] 刘红玲
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:棉花是世界上极其重要的油料作物和纤维作物。在整个生长周期中,棉花会遭受各种各样昆虫的为害,严重影响棉花的品质和产量。在棉花和昆虫长期的博弈中,棉花形成了复杂的防御体系来应对昆虫的袭击。昆虫取食植物时,植物会产生伤口(Wounds),同时植物也可以感知昆虫口腔分泌物(OS),进而产生防御响应。本研究中,对棉花进行机械损伤后,在机械伤口处滴加昆虫口腔分泌物(W+OS)和水(W+W),比较在OS是否存在的情况下,植物转录水平上的差异,来探究OS在植物响应昆虫中的作用。从转录组获得的差异表达基因中选取9个,利用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除,且对其中的LOX基因进行基因家族进化分析,本研究主要结果如下:
  1.对发生机械损伤和昆虫口腔分泌物处理的棉花进行比较转录组分析
  对转录组测序得到的reads进行过滤、拼接、组装和样品间基因差异表达分析。在这两种口腔分泌物处理的样品中,下调表达的基因数量均多于上调表达的基因数量。GO(Gene Ontology)富集分析中,差异表达基因主要富集于“酶的催化活性”、“转运蛋白”、“转录调节因子”和“对刺激的响应”等类别。W+OS和W+W处理的样品中,茉莉酸(JA)和茉莉酸-异亮氨酸(JA-Ile)的含量随着时间的推移均升高,但是W+OS处理的植物中,JA和JA-Ile含量比W+W高1倍多。两种口腔分泌物处理的共同差异基因主要富集在“倍半萜和三萜生物合成”、“苯丙烷代谢”和“类黄酮生物合成”等抗虫代谢路径。这些结果意味着,由于鳞翅目昆虫口腔分泌物的存在,棉花调整体内基因的表达,以应对昆虫的继续危害,并且印证了口腔分泌物在棉花-昆虫互作中起着重要的作用。
  2.基因的遗传转化和LOX基因家族的全基因组鉴定和进化分析
  由棉花与鳞翅目昆虫互作的转录组数据,筛选到LOX(脂氧合酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)、Gols(肌醇半乳糖苷合成酶)和MIPS(肌醇-1-磷酸合酶)等9个差异表达基因,利用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除。通过全基因组分析,在四个已测序的棉种雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉中分别鉴定了18、13、23和28个LOX基因。系统进化分析将LOX基因家族基因分为三个亚组,9-LOX,Ⅰ类13-LOX和Ⅱ类13-LOX。在同一个亚组内,LOX基因结构相似。陆地棉中的23个LOX基因,随机的分布在14条染色体上。这些生物信息分析结果为今后棉花LOX基因的功能研究奠定了基础。
[硕士论文] 靳宏沛
生理学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻是重要的单子叶模式作物,也是我国主要的粮食作物之一。水稻在生长发育中,低温冷害是常见的问题。研究水稻耐冷性的分子生理机制对我国水稻高产高效生产和粮食安全具有重要意义。为了研究低温在水稻中的作用机制,最直接有效的工具就是构建水稻突变体,基因敲除是实现该目标的最有效方法。本研究从水稻低温表达芯片中挑选了11个受低温胁迫诱导表达的基因,利用CRISPR/Cas9技术创制了8个基因的功能缺失突变体,以及3个购自RISD(Rice T-DNA Insertion Sequence Database)的T-DNA突变体,研究这些基因与耐冷性的关系,主要结果如下:
  1.水稻低温响应基因的筛选:根据日本晴幼苗低温芯片基因表达谱筛选出11个低温响应基因(Metall、UL、WRKY45、WI12、ADT、RBP、OS2、POT、PRP、CP12和RCI2-6)。qRT-PCR检测了这11个基因在4℃条件下诱导表达水平,发现PRP基因的表达受诱导最为显著;WRKY45和WI12基因在4℃诱导表达也明显;ADT、RBP、OS2和POT基因受低温诱导水平较低;而Metall、UL、CP12和RCI2-6基因在4℃低温条件下有一定变化。初步说明这些基因与低温有一定的关系。
  2.CRISPR/Cas9缺失突变体的创建:利用CRISPR/Cas9技术构建了WI12、ADT、RBP、OS2、POT和PRP基因的CRISPR/Cas9双靶位点载体。另外,CP12和RCI2-6基因各选取一个靶位点,构建了这两个基因的共同双靶位点载体。利用农杆菌遗传转化法获得了52株基因编辑突变体。其中,WI12、RBP、OS2、POT和PRP基因转基因株系已筛选到纯合突变体,ADT基因已筛选到杂合突变体,而CP12和RCI2-6基因已筛选到杂合双突变体。其中,POT基因转基因株系P-56,编辑比较特殊,发生了不在靶位点(在两个靶位点之外)编辑的大片段缺失。
  3.Metall、UL和WRKY45蛋白的亚细胞定位:构建了3个基因(Metall、UL和WRKY45)的亚细胞定位表达载体,分别转化到水稻原生质体。激光共聚焦显微镜观察发现,Metall定位在细胞质中,UL定位在叶绿体中,WRKY45定位在细胞核中。
  4.Metall、UL和WRKY45基因T-DNA纯合突变体株系农艺性状调查:共分离检测筛选获得了3个T-DNA纯合突变体,qRT-PCR检测T-DNA纯合突变体目的基因表达均比野生型低。Metall、UL和WRKY45T-DNA纯合突变体株系的结实率、穗长、1-4级节间长度、株高和有效分蘖数等指标均比野生型DJ显著下降,说明这3个基因缺失影响了水稻的生长发育。
  5.T-DNA纯合突变体耐冷性鉴定:水稻纯合突变体和野生型株系的三叶期幼苗4℃胁迫处理。Metall纯合突变体4℃处理4d,UL和WRKY45纯合突变体4℃处理5d,恢复生长后发现Metall、UL和WRKY45基因的T-DNA突变体株系均对低温比较敏感,这3个基因可能正调控水稻的耐冷性。
[硕士论文] 张桑里
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻是我国的主要粮食作物之一。利用两系法杂交水稻是人们更好地实现水稻杂种优势利用的重要途径。稻瘟病和白叶枯是目前导致水稻减产的主要病害,而过量施用农药会污染环境、降低稻米品质。因而,培育抗稻瘟病和抗白叶枯病的两系杂交水稻品种,将有利于提高产量和保护环境。广占63-4S是两系杂交水稻育种中的优良不育系之一。本研究的主要内容如下:(1)以本实验室前期选育的抗稻瘟病、抗白叶枯病不育系华1015S为供体、广占63-4S为受体,通过杂交和分子标记辅助选择培育新的抗稻瘟病、抗白叶枯病不育系;(2)华1015S为供体、广占63-4S为受体,通过连续回交、自交,分子标记进行前景选择和背景选择,创建具有广占63-4S遗传背景的Xa23单片段渗入系和Pi2、Xa23双基因渗入系;(3)以华1201S为供体、广占63-4S为受体,通过连续回交、自交,分子标记进行前景选择和背景选择,创建具有广占63-4S遗传背景的Pi2单片段渗入系。主要研究结果如下:
  1.从‘广占63-4S/华1015S’后代中选出3个携带Pi2、Xa23基因的新不育系,分别命名为华3222S、华4821S和华5111S。
  2.抗性鉴定结果表明,华3222S、华4821S和华5111S抗稻瘟病和白叶枯病,抗性水平与供体亲本华1015S相当。3个新不育系的生育期和主要农艺性状介于两个亲本之间,与华1015S相比,株高明显降低。稻米品质与广占63-4S相似,但产量配合力不如广占63-4S。华5111S的综合性状表现较好,建议在后期的育种计划中重点使用。
  3.创建了Pi2基因单片段(约1.22Mb)渗入广占63-4S背景的株系三个,编号是SL16024-27、SL16024-95和SL16024-115,背景回复率99.68%,初步观察表型与广占63-4S相似,稻瘟病抗性明显提高。创建了Xa23基因单片段(约4.77Mb)渗入广占63-4S背景的株系一个,编号为SL16025-15,背景回复率98.72%,初步观察农艺性状与广占63-4S有一定差异,白叶枯病抗性明显提高。创建了Pi2、Xa23双基因渗入系1个,编号是SL16026-111,其中Pi2基因在6号染色体插入片段0.80Mb,Xa23基因在11号染色体插入片段3.34Mb,在10号染色体上有非目标基因插入片段10.88Mb,背景回复率达到95.96%,稻瘟病和白叶枯病抗性都有明显提高,但是农艺性状与广占63-4S也有一定差异。后期需要对这些基因渗入系进一步进行性状鉴定和基因聚合。
[博士论文] 王转茸
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:菌核病是由核盘菌引起的一种严重威胁油菜产量和品质性状的真菌性病害。核盘菌通过向寄主植物分泌细胞壁降解酶CWDEs、多聚半乳糖醛酸酶PGs和病原菌相关的分子PAMPs等与寄主植物建立侵染关系。为了抵御病原菌的侵染,植物进化出一类多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PGIPs来抑制PGs的活性。本研究在甘蓝型油菜7-5(低抗)、P61-5(高感)和T45(高感)材料中超表达水稻的OsPGIP2基因,通过分子鉴定和抗性鉴定筛选出了16个菌核病抗性显著提高的T1代转基因家系,之后继续对转基因家系的T2、T3和T4代进行分子鉴定、菌核病抗性鉴定、种子品质性状和千粒重的考察,最终获得了菌核病抗性显著改良且遗传稳定的转基因油菜种质资源。此外,利用RNA-seq技术分析了转基因和非转基因家系核盘菌侵染后的差异表达基因,提出转基因甘蓝型油菜中由OsPGIP2介导的抗病调控网络。主要研究结果如下:
  1.转基因家系中OsPGIP2的拷贝数鉴定和表达量分析
  对16个转基因家系进行Southern blot检测,确定7-5B、7-5C、7-5D、7-5G、7-5H、7-5J、T45B#1、T45B#2和T45C为单拷贝插入植株,7-5A、P61-5A、P61-5B#1和P61-5B#2为双拷贝插入植株,7-5M含有5个拷贝。qPCR检测发现,在不同转化事件的转基因家系中,OsPGIP2基因的表达水平存在较大差异;在同一转化事件中,OsPGIP2基因的表达量无显著性差异;在含有5个拷贝的7-5M家系中,OsPGIP2基因的表达量最低。同时,T2和T3代抗病性鉴定显示,除了7-5M家系,其它转基因家系菌核病抗性与非转基因对照相比都提到了显著提高。这些结果表明OsPGIP2基因已成功整合到甘蓝型油菜基因组中,OsPGIP2基因的低拷贝插入事件能够增加甘蓝型油菜的抗病性,而多拷贝插入事件易导致目的基因沉默。
  2.OsPGIP2转基因家系的抗病性鉴定与种子千粒重和品质性状分析
  T4代转基因家系离体叶片接菌72hpi的菌斑面积都显著小于非转基因家系;喷菌丝存活率实验显示转基因家系具有良好的苗期抗性;成株期模拟极端疾病压力实验证明转基因家系的发病率低于非转基因家系;在离体茎秆接菌和田间茎秆接菌实验中,转基因家系菌斑长度都显著小于非转基因家系。成株期接种核盘菌后,转基因家系种子中芥酸和蛋白质的含量与非转基因家系相比无显著差异,而转基因家系种子千粒重和含油量都显著高于非转基因家系。以上结论证明,转化OsPGIP2基因能够改良甘蓝型油菜7-5、T45和P61-5的苗期和成株期菌核病抗性,同时能够保证种子的千粒重和品质性状更少的受到菌核病影响。
  3.解析OsPGIP2介导的防卫反应途径
  RNA-seq结果显示,OsPGIP2介导的抗病反应主要依赖于调节与RLKs(receptor-like kinases)、细胞内钙和离子转运、过氧化物产生和H2O2清除相关基因、JA/ET及生长素、转录因子、疾病防卫反应相关基因、细胞壁重建、CYP/GSH/Histone、碳源代谢和转运等相关的植物先天免疫反应路径。DAB staining和qPCR结果显示,OsPGIP2转基因家系中H2O2的积累和氧化还原反应相关基因的表达都显著高于非转基因家系。OsPGIP2转基因家系茎秆细胞壁单糖含量的测定结果显示,油菜茎秆中阿拉伯糖、木糖、纤维素、甘露糖和木质素的含量随花期的发展逐渐增加,在终花期OsPGIP2转基因家系的纤维素、半纤维素和甘露糖的含量都显著高于非转基因家系,说明转入OsPGIP2可能影响细胞壁糖类组成相关途径来提高油菜的菌核病抗性。
  4.SsPGs和OsPGIP2互作分析
  油菜叶片提取物培养核盘菌发现,核盘菌在加入OsPGIP2转基因叶片提取物的培养基上生长显著延缓,菌丝排布紧密,而对照中核盘菌生长快,菌丝排列松散。qPCR检测接菌茎秆中的核盘菌致病基因SsPGs的表达量显示,OsPGIP2转基因家系中SsPGs的表达显著低于对照。比较OsPGIP2与核盘菌PGs之间互作的亲和性发现,OsPGIP2与SsPG3和SsPG6的亲和性高于OsPGIP2与SsPG1和SsPG5的亲和性。利用Splite luciferase(LUC)互作实验进一步证实OsPGIP2能够与SsPG3和SsPG6互作,而不与SsPG1和SsPG5互作。
  综上所述,在油菜中超表达OsPGIP2能显著增强甘蓝型油菜的苗期和成株期菌核病抗性,而不损害种子的千粒重和品质性状。OsPGIP2转基因家系的叶提取物能延迟病原菌侵染,从而增强其对核盘菌的抗性。组成型表达OsPGIP2可增加活性氧的产生,提高茎秆细胞壁纤维素、半纤维素和甘露醇的含量,并影响油菜先天免疫反应相关基因的表达。同时,OsPGIP2蛋白能与核盘菌SsPG3和SsPG6发生互作,表明OsPGIP2在转基因甘蓝型油菜防卫反应机制中起着重要作用。
[博士论文] 张丹
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物的形态建成是由细胞的不确定性与细胞命运的决定性之间的平衡来决定。分生组织和有多向分化功能的干细胞都具有不确定性,是侧生器官产生的基础。本研究鉴定到一个分生组织确定性与不确定性平衡上存在缺陷的玉米突变体,在叶片和茎细胞中不确定性细胞减少,突变体的花序分生组织顶端扁化,失去对侧生分生组织不确定性的控制。通过图位克隆的方法确定一个生长调节共转录激活因子GROWTH REGULATING FACTOR-INTERACTING FACTOR1(GIF1),是引起突变体表型变化的基因。本研究的主要结果如下:
  1.突变体gif1植株及细胞学表型变异
  与野生型相比,突变体gif1植株矮化且叶片窄;雄穗长分支数目减少但雌穗基部有额外的分支发生且顶端呈现扁平化现象;突变体表现雌雄败育,与其它自交系正反交均不能结实,通过杂合基因型植株自交获得突变体。细胞学研究表明突变体gif1雌雄花序分生组织顶端扁平化且不确定性异常,突变体雄穗分支数减少且分生组织发育滞后,雌穗的分支数增加;雄花序小花分生组织中颖片原基发育受到抑制,雌花序的下位花和雄蕊原基的退化进程相对滞后。
  2.图位克隆鉴定突变基因为ZmGIF1
  遗传分析表明该突变体表型受一对隐性单基因控制。图位克隆结果显示候选基因位于玉米第1号染色体的长臂,编码一个GIF1的转录因子(GRMZM2G180246,是拟南芥AtGIF1/ANGUSTIFOLIA3(AN3)和水稻OsGIF1的同源基因。对GRMZM2G180246基因进行重测序分析发现,野生型和gif1突变体中植株该基因存在显著差异,其中第3外显子上一个51bp的序列插入是主要的变异位点,包括一个43bp的Popin转座子和一个8bp的正向重复序列,转座子插入到蛋白结构域中,引起转录终止,是导致该基因的转录效率显著降低的直接原因。
  gif1-mum1转座子Mu7插入到GIF1基因的5'端非编码区(5'-UTR)的突变体,通过gif1-mum1表达分析及单株及与W22的回交后代群体表型的鉴定,证明GIF1是所克隆到的基因。GIF1基因组全长3656bp,CDS全长686bp,编码227个氨基酸;GIF1属于GIFs家族,是共转录激活因子,编码高度保守的SNH结构域蛋白和GRFs-N端保守结构域QLQ特异识别,形成不同形式的互作复合物。
  3.GIF1基因的特异性表达
  GIF1在分生能力较强的组织中表达量较高,主要包括茎顶端分生组织和幼嫩的雌雄穗分生组织;GIFs和GRFs的表达模式分析表明,ZmGIF1在花序发育中具有明显的特异性,且在花序发育早期高于晚期;GRFs的表达在不同组织间存在一定的差异。原位杂交表明GIF1在SAM中除了顶端部位外不仅在幼嫩的叶原基中强烈表达,而且在SAM的基部即未来发育为节间的部位表达;gif1突变体中,SAM和叶片无表达。在花序分生组织中,GIF1在除去顶点的IM中及在SPM和SM都是高水平表达的,而且在花序分生组织周围尤其是内外稃原基中特异富集,突变体中未检测到表达。另外,GIF1在SM及SPM分生组织中的表达方式与ramosa2(ra2)有重叠,同时ra2在突变体中的表达显著减少,说明二者可能在功能上存在部分重叠。
  4.GIF1基因的调控与互作
  利用未成熟雄穗RNA-seq分析共鉴定出1468个差异表达基因(DEGs)(q<0.05),其中在突变体gif1中上调的基因有350个,1118个为下调基因。GO聚类分析表明差异表达基因主要集中于生物过程及分子功能等转录调节相关途径。在gif1中,几个重要的花序发育相关基因ub3、ra2、te1、zfl1/2、vt2等显著下调,它们是腋生分生组织身份决定性和确定性(identity and determinacy)的重要调节因子,与细胞周期、生长素合成及响应相关的基因在gif1中显著下调。GRFs中GRF3上调,GRF7和GRF17显著下调,GIF2和GIF3的表达未受影响。
  染色质免疫共沉淀分析发现GIF1以32.4%的比例结合在基因区,以12.0%结合在转录起始位点TSS上游的1.0kb的启动子区;peak附近10Kb以内共检测到1275个GIF1可能的靶基因,包括一些已知的转录调节因子。通过ChIP-seq与RNA-seq数据比较分析共发现差异表达基因在gif1突变体中有50个基因与GIF1直接结合,37个基因表现下调,13个基因上调。
  GIF1蛋白与16个GRFs中除了GRF7、GRF11和GRF20外的13个蛋白互作,GIF1能够在转录水平上自我调节丰度,并通过直接结合UB3影响玉米雄穗的分支发育。
  5.候选基因的关联位点
  通过对具有丰富的自然变异且来源于不同亚群的玉米自交系进行重测序,检测到最小等位基因频率(MAF)大于0.05的多态性位点22个,其中5个位点与植株和花序发育显著相关。主要集中在转录起始位点上游1.0Kb左右的位置和5'-UTR区,说明该基因的遗传变异主要分布在转录调控区域,GIF1可能是在表达水平的调控,而不是功能上出现变异;表型数据与GIF1的遗传变异进行候选基因关联分析,位于exon1的A/G和intron2C/G两个SNP位点与雄穗分支数紧密关联。
[博士论文] 李洪戈
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:油菜是世界上最重要的油料作物之一,中国油菜种植面积和菜籽产量均居世界前列。油菜株型对其产量具有重要影响,分枝角度是决定油菜株型的主要性状之一。此外,分枝角度还影响油菜的种植密度和机械化收获。茎秆倒伏是油菜的两种倒伏类型之一,其不仅与油菜株型密切相关,而且还会造成油菜产量损失和菜籽品质降低。鉴于分枝角度和茎秆倒伏性状对于油菜生产的重要影响,了解其分子作用机制和挖掘优良候选基因对于油菜的遗传改良显得尤为重要。本研究首先利用两个甘蓝型油菜分离群体对分枝角度和茎秆抗折力性状进行遗传分析研究,随后利用472份甘蓝型油菜构建的关联作图群体对分枝角度和茎秆倒伏相关性状(茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数)进行全基因组关联分析,最后对在分枝角度和茎秆抗折力性状上存在显著差异的甘蓝型油菜进行转录组测序分析。主要研究结果如下:
  1.分枝角度性状的遗传分析
  利用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析方法,对甘蓝型油菜2个分离群体F2和F2∶3的分枝角度性状分别进行遗传分析,结果显示F2代分枝角度性状的最适模型是1MG-AD模型,而F2∶3代是1MG-A模型,即分枝角度受到一对主基因控制,主基因间具有加性-显性效应或只具有加性效应。
  2.分枝角度的全基因组关联分析
  利用芸薹属60K SNP芯片对关联作图群体进行群体结构分析,结果显示472份甘蓝型油菜能够分配到3个亚群,分别包含64份、199份和209份材料。单倍型块分析表明,甘蓝型油菜基因组上存在2423个单倍型块,总长度为181.53Mb,覆盖28.28%的染色体区域。此外,大的单倍型块(≥1Mb)往往位于C基因组并且在着丝粒附近富集。油菜植株随着分枝部位的逐渐升高,分枝角度也逐渐增大,植株中部3个分枝的角度值最能够代表全株分枝的角度。分枝角度在作图群体中存在广泛的表型变异。利用MLM和MRMLM两种模型分别鉴定到46和38个与分枝角度显著关联的QTL,对表型变异的累计解释率分别为62.2%和66.2%。在这些QTL中,分别鉴定到73和64个候选基因,包括在油菜中第一次鉴定桷Bna.TAC1(BnaC04g00780D)、Bna.SGR1(BnaC08g25070D)、Bna.SGR3(BnaA06g35880D和BnaC09g19750D)和Bna.SGR5(BnaA06g34390D)。
  3.分枝角度差异材料的转录组分析
  对2个分枝角度存在显著差异的油菜材料进行转录组测序分析,在两个材料分枝的背地侧和近地侧之间共同上调的基因中鉴定到49个与生长素反应相关的差异表达基因,其中包括Bna.YUCCA6(BnaC09g03930D)和Bna.IAA19(BnaC03g39170D);在共同下调的基因中鉴定到32个与生长素反应相关的差异表达基因,包括Bna.AXR3(BnaCnng41350D)和Bna.SGR5(BnaC07g48900D)。另外,5个TCP1基因(BnaA02g13010D、BnaA07g26270D、BnaA07g25110D、BnaC06g26860D、BnaC06g28330D)在2个材料的背地侧组织中共同上调表达,2个YABB Y2基因(BnaA06g04870D和BnaC08g13560D)共同下调表达,并且这些共同表达基因在分枝的背地侧和近地侧的差异表达倍数存在差异。联合GWAS和RNA-seq分析,共同鉴定到22个基因,包括1个Bna.TAC1(BnaA05g01220D)和2个Bna.LAZY1(BnaA10g19550D和BnaC03g06250D)。
  4.茎秆抗折力的遗传分析
  甘蓝型油菜两个分离群体6个世代(P1、P2、F1、B1∶2、B2∶2和F2∶3)茎秆抗折力的联合遗传分析显示,该性状的最适模型为MX2-ADI-ADI,即两对加性-显性-上位性主基因+加性-显性-上位性多基因模型;该性状受两对主基因和微效多基因共同控制,以主基因遗传为主,两个群体的平均主基因遗传率分别为19.46%和69.93%。两对主基因的加性效应和显性效应在一个群体中作用方向相反,而在另一个群体中作用方向相同,同时还存在多种上位性效应。两个群体中环境变异占到表型变异的54.68%和13.23%,说明环境对茎秆强度的影响较大。
  5.茎秆倒伏性状的全基因组关联分析
  茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数4个茎秆倒伏相关性状在作图群体中存在广泛的表型变异。四个性状间存在显著相关。关联分析分别检测到与茎秆抗折力、茎秆直径、茎秆强度和倒伏系数显著关联的26、18、17和13个QTL,并在这些位点中鉴定到29、19、18和25个候选基因,包括茎秆抗折力的候选基因Bna.ESK1(BnaC08g26920D)和Bna.CESA6(BnaA09g06990D)、茎秆直径的候选基因Bna.EXPA16(BnaC08g26400D)和Bna.BRX(BnaA08g07050D)、茎秆强度的候选基因Bna.FRA2(BnaC02g23170D)和Bna.ARF2(BnaA05g14370D)以及倒伏系数的候选基因Bna.CEL5(BnaA07g10240D)和Bna.IRX14-L(BnaA07g12000D)。
  6.茎秆抗折力差异材料的转录组分析
  在花期和角果前期对高、低茎秆抗折力材料进行RNA-Seq分析,发现在花期上调表达的基因有1679个、下调表达的有2586个,在角果期上调表达的基因706个、下调表达的414个。在2个发育时期发现一个共同上调表达的基因Bna.TBL1(BnaC01g23560D)和一个共同下调表达的基因Bna.ARF2(BnaA05g14370D)。鉴定到7个差异表达的转录因子,包括MYB类的MYB26、MYB43、MYB61和MYB85,WRKY类的WRKY47以及KNAT7。权重基因共表达网络分析(WGCNA)和GO富集分析发现,‘绿色’模块内的基因或主要在花期参与茎秆强度的调控并且主要通过参与纤维素的合成与代谢途径来完成。联合RNA-Seq、GWAS和WGCNA鉴定到Bna.ARF2(BnaA05g14370D)、Bna.CESA6(BnaA09g06990D)和Bna.FRA8(BnaC04g39510D)3个重要的候选基因。
[硕士论文] 孙梦丹
生物质能 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:纤维素是植物细胞壁的主要成分,影响细胞壁的理化特性和生物质利用。纤维素是由纤维素合酶(Cellulose synthase,CesA)复合体催化合成。纤维素合酶基因家族已分为初生和次生细胞壁纤维素合酶两类。其中次生壁纤维素合酶基因在细胞壁合成和植物生长发育中的一些功能业已研究,但初生壁纤维素合酶基因的相关功能报道较少。本研究分析了水稻和拟南芥初生壁合成相关基因在水稻中的功能,初步解析了初生壁对水稻生长发育的影响,测定了木质纤维素的产糖效率。其主要结果如下:
  1.鉴定了水稻OsCesA5基因T-DNA插入突变体,纯合水稻突变体株高和茎秆各节间长度均显著降低。水稻超表达OsCesA5基因可以促进转基因水稻幼苗和倒1节节间伸长。
  2.基于Q-PCR基因表达量定量分析,突变体Oscesa5-3材料中与初生壁合成相关的OsCesA3、5、6基因表达量显著下降,与次生壁相关的OsCesA4、9表达量升高,而超表达p35S::OsCesA5水稻转基因材料植株相关基因表达量呈相反的趋势。
  3.透射电镜观察细胞壁厚度,突变体初生壁变薄而次生壁厚度不变;超表达植株初生壁加厚,次生壁变薄。
  4.测定成熟茎秆纤维素的聚合度(DP)和结晶度(CrI),突变体纤维素的DP和CrI均显著降低,而超表达植株则显著升高。
  5.分析成熟茎秆细胞壁成分,突变体中纤维素、半纤维、木质素含量显著降低,超表达植株中均显著升高。
  6.突变体中半纤维素合成相关基因GT43和木质素合成相关基因4CL1、4CL3、4CL4表达量均显著下降,超表达植株中相关基因表达量均显著上升。
  7.在1%NaOH预处理条件下,突变体木质纤维素酶解产糖效率显著提高,乙醇产量高达21%(%干重)。
  8.在水稻中异源超表达拟南芥AtCesA3、6、7、9,其转基因植株株高均显著降低。
[硕士论文] 谢勇军
生物化学与分子生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:水稻是世界上最重要的作物之一,同时也是一种单子叶模式植物。在生长发育的过程中,水稻会遭到许多非生物逆境的胁迫,这给水稻产量造成了重大损失。因此,培育出具有抗逆性的水稻新品种具有十分重要的意义。现有的研究虽然已经报道了许多逆境相关基因,但这距离人们全面了解水稻的抗逆机制还有很长的一段距离。
  为了更进一步地了解水稻的抗逆机制,本研究从公共数据库和本实验室中共搜集得到了491张与水稻非生物逆境相关的基因芯片。计算得到了各个非生物逆境下的差异表达基因之后,我们对这些差异表达基因行了GO富集分析以及启动子区顺式作用元件分析。最后,我们构建了各个非生物逆境下的基因共表达网络。研究的主要结果如下:
  1.计算得到了各个非生物逆境下的的差异表达基因。其中干旱胁迫下的差异表达基因有2506个,低温胁迫下的差异表达基因有2936个,高温胁迫下的差异表达基因有2259个,盐胁迫下的差异表达基因有2463个,且有174个基因在四种非生物逆境下都差异表达。
  2.提取各个逆境下的差异表达基因转录起始位点上游1.5kb的序列作为启动子区,对这些启动子区进行顺式作用元件分析。在干旱胁迫条件下,我们鉴定到了26个顺式作用元件,其中有20个顺式作用元件与数据库中已知的顺式作用元件具有较高的相似性,其余6个则是功能未知的。在低温胁迫条件下,我们鉴定到了16个顺式作用元件,其中有12个顺式作用元件与数据库中已知的顺式作用元件具有较高的相似性,其余4个则是功能未知的。在高温胁迫条件下,我们鉴定到了17个顺式作用元件,其中有13个顺式作用元件与数据库中已知的顺式作用元件具有较高的相似性,其余4个则是功能未知的。在盐胁迫条件下,我们鉴定到了24个顺式作用元件,其中有18个顺式作用元件与数据库中已知的顺式作用元件具有较高的相似度,其余6个则是功能未知的。
  3.计算得到基因的表达量之后,我们构建了各个非生物逆境下的的基因共表达网络,并鉴定到了相应的基因模块。通过对基因显著性以及模块关系进行筛选,我们得到了与各个非生物逆境相关的候选基因。在干旱胁迫条件下,我们鉴定到了13个基因模块和200个与干旱胁相关的候选基因。在低温胁迫条件下,我们鉴定到了17个基因模块和441个与低温胁迫相关的候选基因。在高温胁迫条件下,我们鉴定到了22个基因模块和139个与高温胁迫相关的候选基因。在盐胁迫条件下,我们鉴定到了11个基因模块和57个与盐胁迫相关的候选基因。
[博士论文] 黄聪
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:陆地棉为世界纺织业提供了最多的天然纤维,是我国最重要的经济作物之一。生育期、株型、产量和纤维品质等是陆地棉重要的农艺性状,关乎到棉花的经济价值和生产方式。这些性状为复杂的数量性状,受到微效多基因的控制,通过传统的育种方法很难改良。解析这些性状的遗传基础对实现高效的陆地棉分子育种具有重要意义。
  关联分析作为近年来发展起来的一种检测QTL的高效手段,被得到广泛应用。本研究主要基于两个群体关联分析解析陆地棉生育期、株型、产量和纤维品质性状的遗传基础。
  1基于503份种质资源全基因组关联分析解析陆地棉重要农艺性状的遗传基础
  本研究广泛收集了中国国内的503份陆地棉种质资源,这些种质资源主要包括国内的5个主要棉区的栽培品种以及美国和前苏联引进的品种。利用CottonSNP63K芯片以及一张己发表的基于该芯片构建的高密度遗传图谱对503份材料进行基因分型,筛选获得了11975个高质量的多态性SNP。群体的多态性系数和遗传多样性系数均值分别为0.332和0.391。通过估算群体的连锁不平衡水平,发现LD衰减距离为6.1cM(r2=0.1)。经过STRUCTURE模拟、PCA分析和绘制N-J进化树,将503种质资源划分成了3个明显的亚群。考察获取了503份种质材料8个环境共16个重要农艺性状的表型值。利用11975个SNP标记和BLUP后的表型值,选择能够很好地控制假阳性的混合线性模型MLM(Q+K)进行全基因组关联分析。16性状共检测到324个显著关联的SNPs,解释率范围为3.17%-9.04%。参考LD衰减距离将324个显著关联到的SNPs划分为160个QTLs,其中有7个QTLs在最近的研究中被报道。有28个QTL区间和11个处于连锁的QTLs与多个性状关联,表现出位点或基因的多效性,通过绘制QTL网络图展示了性状与QTL之间的网络联系。此外,参考基因组织表达信息和已报道基因的功能,分别筛选出了336和18个可能的候选基因。在一个LD衰减较快的位点上,鉴定到了一个可能跟LP相关的候选基因(Gh_D08G2376)。
  2基于8亲本MAGIC群体的关联分析解析陆地棉重要性状的遗传基础
  构建了一个8亲本的陆地棉MAGIC群体,群体大小为960个株系(MLs)。MAGIC群体及亲本在2013-2015年共进行了5个环境的表型实验,考察了14个重要农艺性状。性状的的遗传力在PMs和MLs中的变化范围分别为0.11-0.87和0.17-0.85。比较表型的变异范围,发现单环境和BLUP的表型值中,MLs的变异范围都高于PMs,说明MLs比PMs的表型变异更丰富。
  在研究前期,利用PMs从本实验室发表的高密度的陆地棉-海岛棉遗传图谱上筛选获得284个高质量且多态性好的SSR标记。基于284个SSR标记对MLs进行基因分型。SSR标记遗传多样性系数在PMs和MLs中的平均表现为0.415和0.463,MLs的遗传变异比亲本丰富。此外,通过PCA分析发现MAGIC群体没有明显的群体结构。估算MAGIC群体的LD水平,衰减距离为0.76cM(r2=0.1)。利用忽略群体结构干扰的混合线性模型MLM(K)将14个性状BLUP的值与SSR标记关联,在p<0.01水平上检测到139个显著关联的SSR标记。显著位点的解释率范围为0.71%-7.23%。139个位点覆盖了96个SSR标记,有40个标记在前人的研究中被报道,6个被报道的结果与本研究结果一致。另外有26个SSR标记同时关联到多个性状,表现出位点多效性。此外,我们发现了9个热点位点,这对后续的遗传研究和指导育种具有非常重要的价值。
  为了深度对MAGIC群体进行基因分型,基于表型和219对SSR标记挑选出了一个较小的MAGIC群体(SMLs),群体包含372株系。在2016年增加了一个地点的SMLs的表型试验。利用SLAF-seq技术对PMs和SMLs进行基因分型获得60495个SNPs。估算SMLs的连锁不平衡水平,当r2衰减到0.1时,LD衰减距离为600kb。利用SNP基因分型数据和SMLs的表型数据进行全基因组关联分析。14个性状6个单环境和BLUP的表型数据共检测到975个显著关联的SNP,覆盖400个QTLs,对表型变异的解释率范围为5.08%-53.80%,平均值为11.01%。其中有30个QTLs在多个环境中被检测到,另外有88个QTL区表现出位点多效性。参考组织表达模式数据库,在144QTL区间内筛选到了271个相关组织特异表达的基因,此外鉴定到18个功能已知的基因位于相关性状的QTL区间内,这些基因可以作为候选基因。
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