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[硕士论文] 王琳
细胞生物学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:过氧化氢(H2O2)是活性氧分子(ROS)的主要成分之一,在植物发育过程中发挥着重要调节作用。植物遭受生物和非生物胁迫后ROS生成量增加,不仅能够导致蛋白质、DNA和脂类的氧化损伤,同时也作为一种重要的信号分子,启动氧化还原传感器触发信号转导以激活防御反应。
  本研究以耐盐牧草星星草(Puccinellia tenuiflora)为材料,应用基于iTRAQ标记的蛋白质组学技术,分析了通过对不同浓度H2O2(0mM、12mM、24mM和36mM)胁迫响应蛋白质的丰度变化模式。在星星草根中共鉴定到2025种蛋白质,其中114种H2O2应答蛋白质丰度变化显著,包括21种丰度上升蛋白质和93种丰度下降蛋白质。这些蛋白质的丰度变化模式暗示着星星草根部启动了多种H2O2应答策略,主要包括:(1)通过调节信号转导相关蛋白的丰度感受并传递氧化胁迫信号;(2)多种氧化胁迫相关蛋白的丰度显著变化,从而抵御氧化损伤;(3)H2O2胁迫影响了根部离子稳态,导致物质转运相关蛋白丰度降低;(4)蛋白质合成与命运相关蛋白丰度降低,导致蛋白质周转受到抑制。这些研究结果为深入解析解星星草氧化胁迫应答的信号与代谢网络提供了重要信息。
[硕士论文] 杨艳婷
草学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:叶绿体基因组对研究叶绿体基因工程、优良品种培育、分子谱系地理学及较低分类单元的系统发育关系具有重要价值。本文以禾本科赖草属牧草羊草(Leymus chinensis)为例,经过叶绿体基因组测序、拼接组装、基因功能注释、基因组特征分析、基因组比较及系统发育分析,开发了叶绿体非编码区及SSR分子标记,并应用在不同的羊草居群上,开启了赖草属牧草叶绿体基因组测序的先例,为羊草进一步分子标记开发、遗传多样性及分子谱系地理学研究、种质资源保护、抗逆性品种培育奠定基础,羊草叶绿体基因组为叶绿体基因工程、系统进化关系的研究提供重要依据。
  羊草叶绿体基因组全长136783bp,具有典型的四分体结构,包括大单拷贝区(LSC,80946bp),小单拷贝区(SSC,12715bp)和一对反向重复序列(IRa,IRb,各21561bp)。共注释得到131个基因,包括91个蛋白编码基因,32个tRNA基因和8个rRNA基因。羊草叶绿体基因组中91个蛋白基因共编码22917个密码子,基因组中共检测到49个长重复序列和26个SSR位点,A/T碱基含量丰富。通过与已测序的5个羊草近缘种叶绿体基因组比较发现,羊草非编码区的变异程度高于编码区,大部分变异发生在基因间隔区;IR区比LSC和SSC区序列保守,且IR区内非编码区序列比LSC和SSC区非编码区序列更为保守;IR边界的扩张或收缩表现为基因rps19和ndhH位置的变化。通过与小麦族已测序的18个羊草近缘种系统发育分析得到,羊革与小麦(Triticum timopheevii)和冰草(Agropyron cristatum)亲缘关系较近,与大麦(Hordeum vulgare)较远。
  通过对12个叶绿体DNA片段测序及其序列间变异分析,结果得到ndhF-rpl32、trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH4条序列变异相比较丰富。9个羊草居群37个个体在4条非编码区片段的合并序列中,共检测到15种单倍型,单倍型多态度Hd为0.928,核苷酸多态度Pi为0.00101;遗传分化指数Fst为0.58884,基因流Nm为0.17,基因流较小;中性检验Tajima's D(-1.08542)和Fu's Fs(-5.301)均为负值,且差异不显著(P>0.1);AMOVA分析结果显示,分子变异主要出现在居群间(65%);Mantel检验得到,羊草各居群的地理距离与遗传距离具有显著相关性(R=0.449,P<0.05)。通过系统发育树和单倍型网络图分析均得到,单倍型H2和H10(即居群Pop6和Pop8)的亲缘关系较近。
  对羊草叶绿体基因组中检测到的26个cpSSR位点多态性进行分析,筛选到8个具有多态性的标记。Nei's遗传多样性指数办为0.2024,Shannon's信息指数I为0.3095;9个羊草居群的Nei's遗传多样性指数h平均为0.0587,Shannon's信息指数I平均为0.0865;整体来看,羊草cpSSR多态性小,遗传多样性水平偏低。聚类分析与Structure软件分析均得到,居群Pop6和Pop8亲缘关系最近。羊草cpSSR和叶绿体非编码区标记分析得到的结果基本一致。
[硕士论文] 张婧蕾
园林植物与观赏园艺 浙江农林大学 2018(学位年度)
摘要:为了揭示南方型紫花苜蓿(Medicago sativa)在分子水平上对盐胁迫环境的适应机制,在正常培养和盐处理下,对南方型紫花苜蓿‘Millennium’耐盐突变体的2个样品根部分别进行蛋白质组和转录组关联分析,以期发现一些可能作为紫花苜蓿耐盐潜在的靶标蛋白。本研究结果如下:
  (1)利用RNA-seq技术,经过250mmol/L NaCl胁迫72h,南方型紫花苜蓿耐盐突变体根部样品中有31815个基因表达量发生改变,其中被检测到的差异基因有5282个(2477个表达上调,2805个表达下调),包括隶属于43个转录家族的363个转录因子(上调表达125个,下调表达238个)。GO功能显著性分析显示,差异表达基因广泛涉及细胞过程、催化活性、代谢过程和细胞组分等方面。KEGG Pathway显著性富集分析显示,差异表达基因广泛涉及代谢途径和次生代谢产物生物合成。转录因子分析发现,应答基因数量最多的是MYB基因家族,其次是AP2-EREBP和MYB-related等转录因子家族。
  (2)利用iTRAQ技术,经过250mmol/L NaCl胁迫72h,南方型紫花苜蓿耐盐突变体根部样品中发现共鉴定到3857种定量蛋白,747种差异蛋白发生显著性表达变化(370种表达上调,377种表达下调)。GO功能显著性分析显示,这些差异表达蛋白主要参与催化活性、结合、细胞、代谢过程和细胞组成部分。COG功能分类中,差异表达蛋白功能大多数集中在功能性预测、能量产生和转换、氨基酸转运与代谢和糖类转运与代谢等。KEGG Pathway显著性富集分析显示,差异表达基因广泛涉及代谢途径、次生代谢产物的生物合成、苯丙素的生物合成和苯丙氨酸代谢等。
  (3)利用高通量多组学技术,经过250mmol/L NaCl胁迫72h,南方型紫花苜蓿耐盐突变体根部样品中,关联到的基因与定量蛋白共有2099个,关联系数为0.0269,其中,在变化趋势相反的情况下,差异蛋白和基因表达的关联系数为-0.6653;在变化趋势相同的情况下,差异蛋白和基因表达的关联系数较高,为0.6717。另外,鉴定出104个与差异基因表达趋势相同的差异蛋白(上调表达70个,下调表达34个)。这些差异蛋白所行使的功能主要涉及以下8个方面:抗氧化物、细胞膜合成、信号传导、蛋白质合成、防御、能量产生与转运、代谢和其它及未知功能蛋白等。下调表达的蛋白主要与防御相关,而上调表达的蛋白主要参与蛋白质合成、抗氧化物、信号传递和代谢等。此外,关联发现了过氧化物酶、铁蛋白、LRR类受体激酶、病程相关蛋白和热激蛋白70等差异蛋白,这些蛋白可能与紫花苜蓿盐胁迫相关。
[硕士论文] 黄寿臣
园林植物与观赏园艺 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:星星草(Puccinellia tenuiflora)为禾本科碱茅属植物,广泛分布于东北地区松嫩盐碱草地,良好的耐盐碱性使其成为盐碱地区先锋植物。星星草是一种优质牧草,兼具土壤改良的特点,因此被大面积种植以应用于畜牧业和土壤改良等方面。AM真菌是土壤中的一种有益真菌,具有提高植物对逆境胁迫的耐受性、改善土壤理化性质等特点,这些作用的发挥得益于菌根结构的形成。AM真菌能够与陆地上80%的植物建立共生关系,形成菌根结构,地下庞大的菌丝网络促进了植物根系、土壤以及微生物的联系。AM真菌侵入植物根系后会形成丛枝结构以此与植物进行营养交换,满足自身生长需要,并通过活化土壤中的有机物为植物提供源源不断的营养,而为了自身的繁衍则分泌产生大量的泡囊。
  本研究以星星草为植物材料,以前期研究中确定的摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae)和根内根生囊霉(Rhizophagus intraradices)两种星星草根围的优势AM真菌为接种菌剂,研究两种AM真菌在星星草应答NaCl和NaHCO3胁迫时生理学特性方面的影响。星星草种子在播种时连同AM真菌一同接种,待星星草播种80天后进行盐(NaCl)与碱(NaHCO3)分别胁迫,胁迫浓度区间为0至400mM,胁迫梯度变化为100mM,胁迫处理10天后对星星草根系侵染指标、生长及生理指标进行测定。实验结果简要概述如下:
  1.与星星草共生80天后,AM真菌与星星草形成了共生关系,但由于高浓度的NaCl和NaHCO3胁迫的影响,星星草根系各侵染指标均出现一定程度的降低现象。各侵染指标均在胁迫浓度为400mM时达到最低值,此时接种摩西管柄囊霉后的星星草在NaHCO3胁迫下根系侵染密度降至0.9%,泡囊丰度为0.07%,丛枝丰度也仅为0.06%;而接种根内根生囊霉的星星草根系侵染密度降至1.3%,泡囊丰度仅0.12%。总体而言,接种根内根生囊霉后星星草根部各侵染指标均低于接种摩西管柄囊霉的类型。
  2.上述结果表明,摩西管柄囊霉、根内根生囊霉已经分别与星星草形成了共生体系,在此基础上本研究考察了在NaCl和NaHCO3胁迫的影响下各接种类型星星草生长指标的变化,其中包括干重、鲜重、根长、叶长、组织含水量以及水分饱和亏。研究结果表明,接种两种AM真菌均能提高星星草生长量,从整体看接种根内根生囊霉对星星草生长的促进作用较明显,而接种摩西管柄囊霉的促进作用仅在某些特定胁迫浓度下大于接种根内根生囊霉类型,如接种摩西管柄囊霉的星星草地下部干重在400mM NaCl胁迫下高于接种根内根生囊霉类型的星星草。
  3.除生长指标外,本研究考察了摩西管柄囊霉与根内根生囊霉这两种AM真菌对NaCl和NaHCO3胁迫下星星草叶片生理指标的影响,包含可溶性糖、叶绿素、单宁、酚酸和黄酮的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。本研究中两种AM真菌提高了星星草叶片中叶绿素含量、可溶性糖含量,以维持星星草细胞的结构及渗透调节平衡;同时相应提高了星星草叶片中抗氧化酶的活性,酶促反应的代谢物质——单宁、酚酸和黄酮也相应积累,以应对盐碱胁迫带来的伤害,上述生理指标的含量及活性几乎均在200mM浓度下达到峰值。从生理角度分析,NaHCO3胁迫对星星草的生理指标影响较大,同时发现星星草在NaCl和NaHCO3浓度大于200mM时生长受到抑制,表明在这两种胁迫下200mM是星星草生长的临界浓度。
  4.摩西管柄囊霉与根内根生囊霉提高星星草的耐盐碱性也表现在对金属离子的选择性吸收。研究中测定了NaCl和NaHCO3胁迫条件下星星草分别接种摩西管柄囊霉与根内根生囊霉后其地上部及地下部K+、Ca+和Na+三种金属离子的含量,结果表明AM真菌能够促进星星草对K+和Ca2+的积累而降低Na+的积累,但随着胁迫浓度的增加星星草体内Na+含量依然呈现逐渐增加的趋势。接种AM真菌对降低NaHCO3胁迫下星星草地上部Na+含量作用最明显,其中除100mM外,接种任意一种AM真菌均能有效降低星星草地上部Na+的积累,并达到显著水平(P<0.05)。
[硕士论文] 周薇
遗传学 哈尔滨师范大学 2018(学位年度)
摘要:低温、盐碱、干旱是非常普遍的非生物胁迫,这些胁迫在不同程度上限制植物生长发育及分布,其中,低温时最常见的一种非生物胁迫,使农作物产量下降,制约着发展,使农民的收益受到危害。WRKY是植物体内存在较为广泛的转录因子,对植物的生长发育、开花、生殖起到起到重要的调控作用。本研究从紫花苜蓿中克隆得到MsWRKY46基因,连接到植物表达载体pCBM上,将MsWRKY46基因通过农杆菌转化法,转入模式植物烟草中,验证MsWRKY46基因的功能。主要研究结果如下:
  1.MsWRKY46基因的克隆与序列分析
  根据肇东苜蓿低温胁迫下转录组测序序列信息设计克隆引物,通过RT-PCR方法克隆获得MsWRKY46基因,该基因全长为1023bp,编码340个氨基酸。该蛋白含有一个WRKY结构域,经NCBI protein BLAST分析,发现MsWRKY与MtWRKY氨基酸相似性为90%,且在结构域内有3个差异位点。
  2.MsWRKY46基因植物表达载体的构建
  构建Ms WRK Y46基因植物表达载体,含有CaMV35S启动子和草丁膦(PPT)抗性。
  3.MsWRKY46基因对烟草的遗传转化
  利用农杆菌介导法将MsWRKY46基因转入模式植物烟草中,经过草丁膦(PPT)筛选共获得86株抗性植株。通过PCR初步鉴定共获得22株烟草阳性苗,通过qRT-PCR法对转基因烟草中基因的表达情况进行检测,其中10,16,86号三个株系表达量较高。
  4.转MsWRKY46基因烟草的抗寒性分析
  低温胁迫处理转基因烟草,对转基因烟草的抗寒能力进行分析。对胁迫处理后烟草进行观察,转基因烟草和野生型烟草的叶片都变得下垂和蔫枯,但是根据萎蔫的程度上来看,低温胁迫处理下野生型烟草严重,而转基因烟草程度轻。生理指标显示,在低温胁迫处理下,转基因烟草的相对电导率值、丙二醛含量、超氧阴离子含量、过氧化氢含量均低于野生型,可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、脯氨酸含量均高于野生型,说明MsWRKY46基因具有抗低温能力。
[硕士论文] 马小娟
水利工程 宁夏大学 2018(学位年度)
摘要:本文针对宁夏紫花苜蓿地下滴灌技术实施中的有关水肥耦合等科学问题,立足宁夏红寺堡区富阳工贸集团红寺堡农林科技有限公司苜蓿生产基地,采用对比试验、正交试验、二次通用旋转组合设计试验方法,系统的研究了地下滴灌水肥等因素对紫花苜蓿生长(株高、茎粗、分枝数)、产量及品质(粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、相对饲喂价值)的影响,为宁夏紫花苜蓿节水灌溉提供理论依据。主要研究结果如下:
  1.采用单因素对比方法,设置了7、10、13、16、19、22、25、28m3/667m2共8个灌水定额处理,研究了地下滴灌不同灌水定额对紫花苜蓿生长、产量及品质的影响。试验表明:随着地下滴灌定额的增大,苜蓿的生长指标、产量、品质粗蛋白、相对饲喂价值随之增大,而品质酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维随之减小。综合干草的灌溉水生产效率、水分生产效率、需水量与产量关系的增长梯度、品质酸性洗涤纤维指标的下降梯度、潜在腾发量及作物系数等指标变化规律,建议在红寺堡区水资源特别紧缺和丰水年条件下,地下滴灌定额以19m3/667m2、滴灌10次,灌溉定额为190m3/667m2的非充分灌溉制度为宜。此时,处理5的鲜草、干草产量分别为1456kg/667m2、347.4kg/667m2,水分生产效率分别为4.25kg/m3、1.01kg/m3,需水量为513mm,品质粗蛋白为16.8%、酸性洗涤纤维38.4%、中性洗涤纤维45.5%、相对饲喂价值119.03%。
  2.采用正交设计试验方法,设置了灌水技术、灌水定额及复合肥量三因素三水平共9个试验处理,研究了灌水技术和水肥因素对紫花苜蓿生长、产量及品质的影响,试验得出了各因素影响苜蓿生长指标、产量和品质的主次因素、单因素变化规律和最优水肥组合方案。其中得出影响紫花苜蓿产量的主次因素顺序为灌水技术A(主)>灌水定额B>复合肥量C(次);随着灌水定额从6增大到18,产量由1058.47kg/667m2增加到1381.59kg/667m2;随着复合肥由2增加到10,产量由1289.99kg/667m2增加到1231.75kg/667m2;三种灌水技术中地下滴灌比地表滴灌和微喷的产量分别增加22.9%和45.2%。影响产量的因素最优水平组合为A1B3C3,即灌水技术为地下滴灌、灌水定额为18m3/667m2、复合肥量为2kg/667m2时的紫花苜蓿产量最大,为582.39kg/667m2。
  3.采用四因素五水平二次通用旋转组合设计方法,研究了地下滴灌条件下灌水定额、纯氮量、纯磷量及纯钾量四因素对苜蓿生长指标、品质和产量等指标的影响。试验建立了各指标与四因素的回归数学模型,分析得出了四因素影响苜蓿生长指标、产量和品质的主次因素、单因素变化规律、交互作用规律以及最优水肥组合方案。各因素对苜蓿产量的影响大小依次为:灌水定额(主)>纯磷量>纯氮量>纯钾量,灌水定额对苜蓿产量影响极显著,其余因素影响不显著。根据对产量指标建立的水肥耦合回归模型解析,得出产量大于550.79kg/667m2条件下的水肥最优组合方案为灌水定额18.84~19.8m3/667m2、纯氮量1.48~1.65kg/667m2、纯磷量1.50~1.7kg/667m2、纯钾量8.38~9.49kg/667m2。
[硕士论文] 张振境
果树栽培与管理 广西大学 2018(学位年度)
摘要:本课题通过在龙眼园行间株间种植假地豆、阔叶丰花草、白花三叶草和鼠茅草,研究各草种在南方果园的试种表现,并研究草种本身对环境的适应性、营养价值和生物产量;同时研究生草栽培各种草种对果园土壤物理状况、土壤微生物、土壤酶活性等方面的影响,以期从中选择适宜本地果园生草栽培的草种,为本地果园生草栽培模式的推广提供理论依据和的实践经验。研究结果表明:
  1.鼠茅草不能安全越夏,秋播翌年6月初干枯死亡,生育期短。鼠茅草枯死后,杂草恢复生长,每年需要重复播种和人工拔除杂草,投入人工较大。其余三种生草品种均能安全越夏,但白花三叶草安全越夏需要果园内有灌溉条件。年生物产量以白花三叶草最高,为10286.5kg/hm2;其次分别是自然生草(6618.6kg/hm2)、假地豆(5179.6kg/hm2)、阔叶丰花草(4941.4kg/hm2);年生物产量以鼠茅草最低,为2165.8kg/hm2。假地豆长得较高,且属匍匐型,在一定程度上妨碍人工进园操作,其成熟的种子颊壳密被粘毛,给进园工作带来一定的麻烦。白花三叶草推广价值高于阔叶丰花草和假地豆。
  2.生草栽培能有效的保持土壤水分,各草种在不同程度上降低了土壤的pH值,除了鼠茅草增加土壤电导率外,其余草种均能降低土壤的电导率。生草栽培对土壤中各种矿质元素均有影响,其中对0~15cm土层矿质元素的影响大于对15~30cm土层土壤的影响,其表现为草种生长发育需量大的N元素含量较种草前土壤N元素含量有明显的下降;但从整体上看,第一年果园生草在没有补充肥料的情况下,白花三叶草能明显降低土壤中N、P、K、Ca、Mg元素含量,对土壤中Mg、Fe元素含量作用不明显,假地豆能明显降低土壤中N、P元素含量,能增加土壤中K、Ca、Mg、Fe元素含量;鼠茅草能明显降低土壤中的N、P、Ca、Mn元素含量,能增加土壤中的K元素含量,阔叶丰花草能明显降低土壤中的N、Fe元素含量,增加土壤中Ca元素含量,对其它元素无明显作用;自然生草能降低土壤中的N、P、Ca、Mn元素含量,增加土壤中的K、Mg、Fe元素含量。
  3.生草栽培对根际土壤可培养微生物有增加作用,自然生草、鼠茅草和白花三时草都能明显的增加土壤中细菌的含量;自然生草、阔叶丰花草和白花三叶草能明显增加土壤中真菌的含量;鼠茅草能明显增加土壤中放线菌的含量,其余处理对放线菌数量影响相差不大。清耕的微生物量C和微生物量N含量都明显比于其它生草栽培品种低;清耕处理土壤β-葡糖苷酶活性和氨肽酶活性都显著低于其它生草品种,清耕处理的土壤磷酸二酯酶与其它生草品种间没有显著差异,但比其它生草品种活性低。
[博士论文] 李佶恺
草学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:羊草具有较强的抗盐性,是一种兼具经济价值和生态价值的重要禾本科牧草,因此对羊草耐盐机制的深入研究将为耐盐牧草育种提供重要的理论基础和科学依据。本研究采用NaCl对羊草幼苗进行胁迫处理,观测不同NaCl胁迫浓度和时间对羊草幼苗生长发育及叶绿素、细胞膜、渗透调节物质和抗氧化酶活性等生理指标的影响,并对差异蛋白质组进行分析,目的是揭示羊草响应盐胁迫的调控机制。试验的主要内容包括:不同盐胁迫条件下羊草生长发育及生理生化机制的研究探索;不同盐胁迫条件下羊草差异蛋白质表达丰度的变化和差异蛋白质功能的鉴定分类;综合分析羊草响应盐胁迫的调控机制。研究结果如下:
  (1)当对羊草幼苗分别进行浓度为0-700mmol/LNaCl胁迫处理时发现:盐胁迫抑制了羊草幼苗的生长,随着胁迫强度的增大和胁迫时间的增长,抑制作用愈发明显。
  (2)NaCl胁迫下羊草的各项生理生化指标测定结果显示:羊草幼苗的叶绿素含量随着胁迫强度的增大先升高后降低,随着胁迫时间的增长叶绿素含量略有升高;羊草幼苗相对电导率随着NaCl浓度增加和胁迫时间的增长而增高;渗透性调节物质(可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸)的含量随着盐胁迫强度的增大均呈现先升高后降低的趋势,随着胁迫时间的增长含量略有升高;NaCl胁迫激发了羊草幼苗叶片中抗氧化酶的保护机制,POD、SOD、CAT的活性均增加。
  (3)通过iTRAQ技术在羊草叶片组织中共分析鉴定特有肽段10858条,有定量信息的蛋白质3814个,共筛选出差异表达蛋白274个。其参与的生物过程主要是代谢过程和细胞过程;行使的功能主要是催化活性和结合蛋白;所处的细胞位置主要是细胞和细胞组成部分。参与的最主要的生化代谢途径和信号转导途径是氨基酸的生物合成和碳代谢。
  (4)羊草耐盐机制如下:
  ①盐胁迫降低了羊草幼苗叶绿素合成前体蛋白和合成途径中关键酶的表达,抑制叶绿素合成。
  ②盐胁迫影响了参与光反应过程中蛋白的表达,一方面抑制了FNR调节的循环电子转移(CET)的反应;另一方面却促进Na+的跨膜逆向转运,维持植物正常的生理机能。
  ③盐胁迫下卡尔文循环中相关酶(C6YBD7、W5I7D1和W5AFA2)表达下调,导致碳同化过程受到影响,从而抑制了羊草叶片和根的生长。
  ④羊草通过调节柠檬酸循环中特定蛋白的表达响应盐胁迫,上游关键酶(W5FJ50)的下调表达导致下游过程中关键酶的下调表达(W5EKJ6、W5F8D5和W5C6B8),降低植物的能量代谢;而脯氨酸生物合成的关键酶(Q53UC8)上调表达,可能提高了脯氨酸的合成能力,脯氨酸含量增加,以此来维持细胞渗透平衡。
  ⑤盐胁迫下羊草提高了抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性,清除ROS,减轻盐胁迫对机体的影响。
  ⑥盐胁迫下,羊草通过渗透保护剂(如脯氨酸,可溶性糖和可溶性蛋白)的积累,来保持膨压和细胞结构稳定性;蛋白V-ATPase(W5BNG7)的表达水平上调,表明盐胁迫时液泡中积累了更多的钠离子来维持细胞膜的渗透势。
  本研究的创新之处如下:
  (1)利用iTRAQ技术找到盐胁迫下羊草的差异蛋白质组,通过生物信息学分析差异蛋白在盐胁迫时的功能及分类。
  (2)通过观测羊草在盐胁迫下的生长发育、叶绿素、细胞膜、渗透调节物质和抗氧化酶活性等生理指标的变化,结合差异蛋白质的表达进行综合分析,从卡尔文循环、柠檬酸循环、叶绿素合成等不同的生物途径解析羊草耐盐机制。
[硕士论文] 刘仁泽
遗传学 哈尔滨师范大学 2018(学位年度)
摘要:紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是重要的多年生豆科牧草,土地盐碱化所造成的可溶性铁含量的降低会严重影响紫花苜蓿的正常生长。本实验以黑龙江本地紫花苜蓿品种肇东苜蓿为实验材料,利用Illumina Hi-SeqTM4000测序平台对缺铁、高铁和正常处理7d的紫花苜蓿全株进行转录组测序,分别进行了基因注释、功能富集、基因结构分析、基因表达量分析和差异表达基因分析。主要的研究结果如下:
  1.通过转录组测序,三次重复的9个样品共获得约250万条Reads,总数据量为7.67G左右,共得到59,345条注释信息,约占总体Unigene序列的65.75%。共获得75,970个CDS序列、8,948个SSR位点和2,198,312个SNP位点。
  2.差异表达分析发现正常组与缺铁胁迫组筛选出1251个差异表达基因(857个上调);正常组与高铁胁迫组共有758个基因(529个上调);缺铁组与高铁组之间筛选出681个差异表达基因。KEGG分别富集到到84、72和68条通路,并对对糖酵解/糖异生、氮代谢和碳代谢通路进行深入研究,分别发现14、14、28个与其通路相关的差异表达基因。
  3.利用qRT-PCR技术手段对MsFIT1、MsIRT1、MsFRO2、MsVIT1、MsOPT1和MsAHA2等6个注释出来的基因进行了表达水平验证,qRT-PCR结果与转录组测序表达量变化趋势基本一致。
  4.分别从转运蛋白、转录因子和氧化应激等三个方面进行铁胁迫关键功能基因的挖掘。筛选出55个差异表达转运蛋白基因,包含氨基酸转运蛋白、糖转运蛋白、磷酸盐转运蛋白、金属离子转运蛋白和多元醇转运蛋白等参与非生物胁迫的关键蛋白;40个差异表达转录因子基因,覆盖了WRKY、bHLH、MYB和bZIP等植物主要的转录因子家族以及锌指蛋白、MADS-box蛋白、HSF蛋白和AP2蛋白具有转录因子功能的蛋白分子;29个氧化应激相关的基因,包括谷胱甘肽S-转移酶基因、过氧化物酶基因、过氧化氢同功酶基因以及超氧化物歧化酶基因。利用PFAM数据库和在线软件预测了筛选出的相关基因的保守结构域和对应蛋白质的理化性质。
[硕士论文] 张婉茹
遗传学 哈尔滨师范大学 2018(学位年度)
摘要:黑龙江省寒地稗草资源丰富,种类多样,但是分布混乱,遗传基础复杂,给其推广和应用带来了很大的困难。为进一步推广和发展应用这些优质稗草,应加强对稗草种群分布、资源搜集、系统分类及遗传多样性的研究。本研究共收集到43份寒地稗草,利用形态标记和ISSR分子标记技术对寒地稗草的遗传多样性进行分析,旨在为黑龙江省寒地稗草的分类鉴定及其种质资源的利用提供参考依据。
  (1)本试验选择了21个形态性状来研究黑龙江省寒地稗草的遗传多样性,结果显示有15个性状表现出不同程度的遗传差异。其质量性状多样性指数为0.20-1.36,数量性状变异系数为6.40%-23.28%。这表明黑龙江省寒地稗草的遗传多样性丰富,在种质变异和创新方面蕴藏着很大潜力。
  (2)聚类分析将43份寒地稗草划分成4大类群,其中第Ⅱ类群的种质特点是花序和小穗都比较大,适合加工成精饲料或做酿酒的原料;第Ⅳ类群的植株高大粗壮、茎叶丰茂,可作为优质牧草进一步推广和利用。此外,主成分分析也将全部材料分成了4大类,且与聚类结果较一致。
  (3)方差分析和显著性检验表明,叶长、叶宽、圆锥花序长度、总状花序长度、小穗长度、主茎直径、株高、小穗脱粒性、圆锥花序弯曲程度、总状花序是否贴向主轴和总状花序弯曲程度这11个形态性状在上述4大类群间表现出显著性差异,这些性状是鉴定寒地稗草的重要形态指标。
  (4)通过正交试验法对寒地稗草的ISSR-PCR反应体系进行优化。确定了寒地稗草的最佳反应体系(20μL)为:dNTPs0.3mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq DNA酶0.75U、模板DNA20ng、10×PCRBuffer(Mg2+plus)2μL。以该体系为基础对引物进行筛选,从哥伦比亚大学公布的50条通用引物中共筛选出8条适合寒地稗草扩增的引物,分别为UBC808、UBC826、UBC827、UBC856、UBC857、UBC888、UBC889和UBC890,并利用梯度PCR仪确定了这8条引物的最适退火温度。
  (5)利用筛选出的8条ISSR引物对43份稗草的DNA进行扩增,共扩增出101个条带,其中多态性条带有87个,多态性比率高达86.14%。通过Popgene软件分析了43份寒地稗草的遗传多样性,发现其种质间的遗传变异丰富。聚类分析把43份寒地稗草划分成了4大类群,经检验发现其各类群间的形态差异显著。
[硕士论文] 臧辉
饲草遗传育种与种子科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:羊草是优良的禾本科牧草之一,对于退化草地修复治理、人工草地建设和优质饲草生产具有重要的作用。甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变是当前被广泛应用的植物高效诱变技术之一,因其具有成本低、诱变频率高、变异类型丰富等特点,在小麦、水稻等重要作物育种中得到广泛应用。目前有关羊草EMS诱变研究少见报道。开展羊草EMS化学诱变技术研究,不仅可获得丰富的突变体材料,为后续开展基因功能分析研究和新品种选育提供良好的材料基础,还对丰富羊草育种技术和方法具有重要意义。本研究以“吉生四号”羊草品种种子为材料,通过研究不同EMS浓度和诱变时间对羊草种子萌发及其种苗生长状况的影响,旨在建立羊草种子EMS诱变技术方法,并在此基础上,构建羊草EMS诱变群体,通过表型性状调查与分析,筛选突变体,并对其变异类型、频率进行分析,揭示羊草EMS诱变变异规律及其特性,为后续开展羊草EMS诱变育种提供支撑。主要研究结果如下:
  1EMS诱变对羊草种子萌发具有抑制作用,表现为随着EMS诱变浓度的增加和诱变时间的延长,“吉生四号”羊草种子的发芽率、相对发芽率、发芽势、相对发芽势、发芽指数、相对发芽指数显著降低,不同浓度和时间EMS诱变对羊草种子发芽进程具有明显的延迟作用,起始发芽时间延迟2d-10d;EMS诱变对羊草种苗具有显著性影响,表现为诱变后种苗的根长和苗长显著降低。
  2EMS诱变浓度与时间之间具有显著的互作效应,以半致死剂量为标准,筛选到EMS诱变羊草种子的半致死剂量为15%EMS诱变16h。
  3通过EMS诱变处理羊草种子,获得了由643个单株构建的羊草M1代诱变群体,进一步表型性状分析,筛选得到120株表型性状发生明显变异的EMS诱变材料,突变频率为1866%。其中,叶色突变频率1509%,叶形突变频率327%,同时获得14株矮株突变体,14株生长受到抑制突变体,1株多分蘖突变体,1株宽叶突变体,初步构建了羊草M1代EMS诱变群体。
  本研究对羊草EMS诱变效应进行研究,筛选出了羊草种子最佳的诱变技术方法,并对羊草种子EMS诱变变异类型、频率进行了初步统计和分析,为后续开展羊草遗传改良及育种工作提供基础研究材料和支撑。
[硕士论文] 陈权
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:为进行饲料油菜推广应用,本研究对油菜、大麦,紫云英、黑麦草和毛苕子等进行了比较研究,以评价油菜的饲用特性。同时对12个油菜品系进行了产量与品质的比较研究,以期筛选出具有饲料应用前景的油菜品种。以高产优质油菜品种华油杂62为主要研究对象,设置油菜种子处理试验、播期密度试验、收获次数与施肥试验。总结了饲料油菜直播壮苗、适宜播期及密度、简化施肥,适时收获的高效栽培技术。主要研究结果如下:
  1.筛选出用于饲料用途的品种材料
  与对照华油杂62相比较,6-3914、16-P35外和15P24母的平均鲜重产量超过了对照,15-兰凡1、16-P35外和6-3914的平均干重产量超过了对照;植株地上部含水率以16-P32外、16-P35外、6-1907、6-2660和15-兰凡1等材料相对较低。综合鲜重、干重和含水率三项指标,以品系16-P35外鲜重高、干重高、含水率低,更适宜作饲料油菜。
  2.锐胜包衣油菜种子可以显著提高种子出苗率和最终成苗率
  不同材料处理的油菜种子,10月9日播种,第5天开始出苗,第6天出苗速度最快,播种后锐胜的出苗速度明显快于对照。播种后第10天锐胜出苗率显著高于对照20.9个百分点;播种后第50天锐胜的最终成苗率为55.0%,显著高于对照18.5个百分点。2月12日播种,第10天开始出苗,第12天出苗速度最快。锐胜的出苗速度明显快于对照。播种后第15天锐胜处理的出苗率显著高于对照15.9个百分点;播种后第30天锐胜处理的最终成苗率为48.9%,显著高于对照15.7个百分点。
  不同材料处理的油菜种子进行秋播和春播,锐胜处理的出苗率和最终成苗率都显著高于对照。表明锐胜处理油菜种子可以显著提高种子出苗率和最终成苗率。
  3.饲料油菜适当早播有利于获得更高的饲料产量
  综合两年试验结果,饲料油菜播期为9月20日和9月30日的产量都是随着密度的增加先上升后下降。饲料油菜适当的早播有利于获得更高的饲料产量,拟获得60000kg/hm2以上的较高生物产量,适宜播期在9月下旬到10月10日。适宜的密度在45-75万株/hm2。
  4.饲料油菜在12月中旬至4月下旬循环收获可获得较高生物产量
  饲料油菜可以在11月中旬开始收获。在不同循环收获时间处理中,以第一次收获时间为12月18日,第二次收获时间为3月26日,第三次收获时间为4月30日的处理收获的鲜重产量最高。
  5.不同施肥次数、收获次数及收获方式对饲料油菜总产量的影响效果不同
  在三次收获条件下,一次追肥处理的干重总产量显著高于二次追肥处理的干重总产量,二次追肥处理的干重总产量显著高于三次追肥处理的干重总产量。
  在不同追肥次数和收获方式条件下,三次收获的鲜茎叶生物产量为45971.33-105290.33kg/hm2。在相同追肥处理条件下,第一次收获时采用三种收割方式收获的平均生物产量的大小顺序是留三叶>留心叶>去心叶,且差异达到显著水平。留三叶的收获方式平均鲜重产量最高可达到96216.89kg/hm2,其中一次追肥处理平均产量为105290.33kg/hm2,明显高于留心叶和去心叶的收获方式;去心叶的收割方式明显不利于油菜再生,第二次收获的产量大大降低,总产量也明显降低。
  收获次数为一次、二次和三次收获的鲜重累计产量平均值分别为78237.00kg/hm2、87560.11kg/hm2和91216.89kg/hm2。
  6.饲料油菜产量显著高于豆科牧草紫云英和毛苕子
  与2月27日收获相比,4月18日收获时油菜和毛苕子的鲜重产量降低,紫云英和黑麦草的上升。不同饲料材料适宜收获时期具有差异。如只收获一次,油菜在3月下旬以前收获,其鲜重产量在各种作物都是最高的,大麦在2月份收获生物产量仅次于油菜,黑麦草在3-4月份生物量迅速增长,4月份超过油菜的生物量,紫云英和毛苕子在3月收获生物产量较高。如收获两次,油菜在3月初、4月中旬二次收获可获得较高鲜重产量。黑麦草和大麦在3月底、4月中旬收获二次可获得较高的鲜重产量。
  2月27日到4月18日收获,毛苕子的平均蛋白质含量上升6.52%;但油菜、紫云英和黑麦草的平均蛋白质含量下降明显,分别下降63.62%、29.11%和27.16%,以油菜的蛋白质含量下降最为明显。因此如要获得油菜较高蛋白质含量,可在2月下旬以前收获。
[硕士论文] 于飞
风景园林学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:本研究采用盆栽试验,研究不同浓度Pb(0、250、500、1000、2000、4000mg/kg)污染土壤对金发草(Pogonatherum paniceum)和狗牙根(Cynodon dactylon)的生长生理影响,分析比较两种草的Pb耐受能力以及喷施不同浓度外源GSH(0、10、20、40、60、80mg/L)对其Pb胁迫的缓解效果,探讨外源GSH对其Pb胁迫的缓解机制以及外源GSH缓解的最佳浓度。为城市绿化和探索外源GSH的缓解机制提供一定的理论依据。主要研究结果如下:
  (1)在Pb污染土壤中,金发草和狗牙根的生长受到抑制,叶片外观质量、生物量及叶绿素含量均出现不同程度得的下降,膜脂过氧化水平升高,两种草能够通过增加渗透调节物质和提高抗氧化酶活性来抵御土壤Pb胁迫。高浓度Pb(≥1000mg/kg)胁迫下狗牙根的耐受能力优于金发草,4000mg/kgPb浓度时金发草达到了自身Pb耐受阀值,表现出明显的Pb毒害特征,狗牙根则未达到自身阀值;2000mg/kgPb浓度时金发草和狗牙根均出现轻微的Pb毒害特征。
  (2)喷施适宜浓度的外源GSH能够有效缓解Pb(2000mg/kg)胁迫引起的植物损伤,改善植物生长状况。原因是外源GSH能够及时补充细胞内源GSH,提高抗氧化酶的活性来清除因重金属离子诱导产生的H2O2、O·-2等ROS,但具体作用机制有所不同,外源GSH对金发草主要通过提高POD、CAT、APX、GR活性来实现ROS的清除,狗牙根则主要通过提高SOD、POD、APX、GR活性来实现ROS的清除。
  (3)金发草和狗牙根对Pb均具有较高的吸收富集能力,但未达到超富集植物标准。外源GSH对金发草和狗牙根各个部位Pb的吸收转运机制存在差异,但均能够增强两种草地上部分和根系的Pb吸收富集能力,其主要机制可能是GSH能够促进植物络合素PCs的合成,将Pb2+螯合至液泡等细胞器中,降低植物细胞内的游离Pb2+含量。
  (4)综合分析指标得出,在Pb胁迫(2000mg/kg)下,外源GSH对金发草的最佳缓解浓度为60mg/L,对狗牙根的最佳缓解浓度为40mg/L。
[硕士论文] 侯瑞
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:青贮玉米属于青饲作物,其茎、叶及果穗经发酵后均可用作家禽、家畜的饲料。加强青贮玉米的育种研究不仅可以解决当前青饲作物生产能力不足的问题,还能大幅度提高农牧交错区农民的收入,对实现农业由数量型增长向优质高效型增长的方向转变有着深远意义。
  本研究利用以大刍草为供体、优良玉米自交系综3为受体构建的重组自交系群体(BC2F7-RIL)为材料,从中选取138个家系作为母本,分别与5个青贮玉米自交系进行杂交,进而在多环境下对杂交组合的单株生物量及4个生物量相关性状进行表型评价,主要结果如下:
  1.以138个家系为母本分别与3个青贮玉米自交系进行杂交,共组配了263个杂交组合。基于这些杂交组合在黄冈和鄂州环境下的单株生物量、株高、穗位高、茎粗和单株绿叶数的表型,筛选了28个生物量大的杂交组合。
  2.利用当选的28个杂交组合的20个母本系,继续与4个青贮玉米自交系进行杂交,共组配了80个杂交组合。对这80个杂交组合的单株生物量和4个生物量相关性状进行评估,筛选到了2个生物量高于对照材料(雅玉8号)的杂交组合:ZT70×HZ2和ZT209×HZ2。
  3.杂交组合ZT70×HZ2和ZT209×HZ2的平均株高分别为331.81cm和315.28cm,单株生物量分别为1.75kg和1.80kg,分别比对照高38.89%和42.46%,具备作为青贮玉米的潜在价值。当选杂交组合中的2个渐渗系(ZT70和ZT209)也为青贮玉米育种提供了优良种质资源。
[硕士论文] 李巍
遗传学 哈尔滨师范大学 2018(学位年度)
摘要:紫花苜蓿是多年生优质牧草,富含蛋白质等营养成分,具有“牧草之王”的美誉。在我国,紫花苜蓿生长主要集中在北方地区,这些地区气候寒冷,容易发生低温冻害,造成苜蓿减产,大大降低苜蓿的生产效益。因此,如何发掘紫花苜蓿的抗寒基因资源,培育抗寒苜蓿新品种,已成为我国苜蓿产业高产优质目标亟待解决的问题。肇东苜蓿广泛种植于我国东北地区,适应当地严寒气候,是紫花苜蓿中优异的抗寒品种。因此,本研究以肇东苜蓿为研究材料,进行寒冷转录组测序、miRNA测序以及降解组测序,发掘紫花苜蓿中寒冷胁迫相关的miRNA基因、功能基因以及它们的调控模式。同时,整合模式植物的基因调控网络信息,构建紫花苜蓿基因调控网络,解析紫花苜蓿抗寒分子调控机制。主要研究结果如下:
  1.紫花苜蓿寒冷胁迫的转录组分析
  通过转录组测序,获得了紫花苜蓿75551条UniGene序列,发掘寒冷胁迫响应基因5767个,主要集中在胁迫响应、激素调节和抗氧化调控等过程。进一步分析发现,AP2/ERF、WRKY、MYB等转录因子家族基因在紫花苜蓿寒冷胁迫过程中起重要调控作用。其中,10个AP2/ERF转录因子的表达模式得到了qRT-PCR的验证,证实转录组测序分析结果可靠。
  2.紫花苜蓿寒冷胁迫的小RNA测序分析
  通过小RNA测序,鉴定了197个紫花苜蓿miRNA基因在寒冷胁迫下的表达模式,其中,新的miRNA基因24个。发掘寒冷胁迫响应miRNA基因35个,其中12个miRNA基因表达模式得到qRT-PCR验证。通过降解组测序,鉴定了105个miRNA调控的靶基因,建立了miRNA与mRNA间的调控模式。
  3.紫花苜蓿抗寒分子调控机制研究
  通过系统生物学方法,挖掘模式植物基因调控网络数据,构建紫花苜蓿基因调控网络,整合本研究发掘的miRNA与mRNA间调控模式,建立紫花苜蓿寒冷胁迫基因调控网络,系统地解析紫花苜蓿抗寒分子调控机制,为紫花苜蓿的抗寒品种培育提供基因资源和科学依据。
[硕士论文] 陶爽
细胞生物学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:羊草(Leymus chinensis)是禾本科(Poaceae)赖草属优质牧草,不但具有丰富的营养价值,还具有很强的抗逆性,是东北松嫩盐碱草地的建群种,也是人工草地建设的优良草种。丛枝菌根真菌(AMF)是一类能与80%以上陆地植物共生且分布广泛的土壤微生物,对植物生长以及抗逆性具有重要的调节作用。本文以羊草-丛枝菌根共生体为对象,对其进行盐碱-干旱交叉胁迫,研究共生体对逆境交叉胁迫的生理响应,为羊草逆境生物学的研究提供一定的理论依据。主要试验结果如下:
  (1)随着盐碱胁迫(100、200 mmol/L的NaCl或NaHCO3)与干旱胁迫(5%、10%的PEG)强度的增加,摩西球囊霉(Glomus mosseae)侵染率显著降低,且在碱胁迫下降低幅度更大(P<0.05)。在盐碱-干旱交叉胁迫作用下,丛枝菌根真菌(AMF)的侵染率同样降低,且碱-旱交叉胁迫影响程度更明显,在碱浓度为200 mmol/L、PEG(聚乙二醇)浓度为10%时,AMF的侵染率仅为46.6%,较对照组就降低了26.7%。
  (2)在单一类型胁迫下,与未接种AMF处理组相比,接种AMF使羊草幼苗的鲜重、干重显著增加(P<0.05)。在交叉胁迫处理组中,羊草幼苗的生长受到抑制,鲜重、干重随胁迫的增加而降低,但在低盐浓度(100 mmol/L)、PEG浓度为5%的交叉胁迫处理组中,羊草幼苗的鲜重、干重呈增加的趋势,表明低浓度的盐-旱交叉胁迫并未抑制羊草幼苗的生长,而是表现出了盐-旱交叉适应性。在交叉胁迫下,接种AMF同样缓解了逆境胁迫对羊草幼苗的伤害。
  (3)随着盐(NaCl)浓度的增加,羊草幼苗中Na+、Ca2+、Mg2+、Cl-含量明显增加,K+、NO3-含量明显降低(P<0.05),而碱(NaHCO3)胁迫下,随着胁迫程度的增加,Na+、Cl-含量增加,Ca2+、Mg2+含量呈小幅度下降趋势,同时K+、NO3-含量明显降低。干旱胁迫下,各离子含量未见显著变化。接种AMF后,羊草幼苗的K+含量增加,Na+、Cl-含量降低,同时增加了NO3-含量,表明接种AMF会抑制羊草幼苗对Na+、Cl-的吸收,从而减少Na+的毒害作用,同时增强其对K+的吸收,维持细胞内的离子平衡,进而在一定程度上减轻盐、碱胁迫对羊草幼苗伤害。另外,在盐胁迫下,低浓度干旱胁迫并未加剧植物对Na+的吸收,而在碱胁迫下,碱-旱交叉胁迫增加了Na+的含量,表明碱-旱胁迫对植物-丛枝菌根共生体的影响更大,而丛枝菌根具有一定缓解胁迫伤害的作用。
  (4)羊草幼苗的脯氨酸含量随着单一胁迫浓度的增加而呈上升趋势,接种AMF后的菌根共生体脯氨酸含量的增加,增强了渗透调节作用,对羊草幼苗的抗逆性发挥了积极的调节作用。交叉胁迫处理组,羊草幼苗受到的损害高于单一胁迫,脯氨酸积累量升高。
  (5)盐、旱胁迫对羊草幼苗有机酸含量的变化影响较小,而碱胁迫下,各处理有机酸含量均呈不同程度提高。接种AM真菌后,有机酸含量呈下降趋势。而交叉胁迫下,无论是否接种AMF,除草酸外,苹果酸和柠檬酸,随交叉胁迫程度的增加而呈上升趋势,接种AMF会减缓增加的幅度。
  (6)接种AMF后,羊草幼苗叶片中的POD、CAT和APX的活性明显提高,表明菌根共生体缓解了膜质过氧化,增强宿主植物体内氧自由基的清除能力。接种AMF后,交叉胁迫处理组SOD、POD和APX的活性酶活性也增加,说明AMF减小了活性氧自由基对细胞的伤害。但CAT活性在未接种AMF的交叉处理组中呈上升趋势,这可能是在交叉胁迫下植物产生某种适应机制,改变了其CAT活性。
[硕士论文] 王登平
草业 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,西南农区多采用高耗粮养殖模式,节粮草畜牧业快速发展,使得该地区饲草需求量加大,市场上出现了大量的从国外引进的牧草品种,导致该地区牧草品种繁杂混乱,然而这些品种往往未经过适应性试验,生产表现不稳定。为减少因品种繁杂、产量不稳定导致农户遭受损失,以及缓解该地区单一牧草品种难以满足家畜整年日常需求量的现象;为此,本研究选取8份鸭茅品种(系)和124个青贮玉米品种(系)为供试材料,进行成都平原区牧草的品种(系)生产性能研究,试验结果表明:
  1、选取8份鸭茅品种(系)进行品比试验,各材料均能在试验点完成生育期。新品系‘埃施朗’在产量上表现最优,干草产量年平均产量达11.45t/hm2,比国审品种‘滇北’干草产量10.33t/hm2高出10.84%,比国审品种‘安巴’干草产量9.27t/hm2高出23.51%;就营养物质而言,新品系‘尼沃’粗蛋白含量最高,平均达15.08%,比对国审品种‘滇北’粗蛋白含量高出2.31%,表明其良好的品质;通过对各鸭茅品种(系)每茬营养物质粗蛋白的动态监测发现,鸭茅在第一茬第二茬粗蛋白含量较高,而第三茬相对较低。
  2、在青贮玉米品种(系)品比试验中,品种编号为214、227、243产量表现较好,鲜草产量分别为19198kg/hm2、18446kg/hm2、17733kg/hm2,比对照品种CS-CK4产量30.4t/hm2分别高出30.4%、24.3%、21.9%。另外品种(系)编号为215、219、231、300、229也较对照品种CS-CK4有更大的生物产量,可以作为候选品种。在绿叶数方面,22个品种(系)中,编号219、214、298、243、CS-CK4(对照)、227、284、229均具有其较多的绿叶数,是青贮的理想材料。品种(系)231、229、300、225、336、284、215的粗蛋白含量分别7.4%、7.1%、6.4%、6.4%、6.3%、6.2%、6.2%均明显高于对照品种CS-CK1粗蛋白含量5.9%;基于以上三个主要指标和其它试验数据综合分析,品种编号为243、300和214可以作为成都平原地区优选品种进行试验种植。
[硕士论文] 薛晓华
生物工程 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是镰刀菌属(Fusarium)真菌生长过程中的代谢产物,是主要毒素污染源,在玉米仓贮和秸秆青贮方面尤为突出。ZEN通过农副产品的食物链传入生物体,对动物血液、肝脏、肾脏、免疫系统等有严重的危害,威胁人类健康。
  为消除玉米赤霉烯酮带来的严重威胁,本试验首先从青贮、动物粪便、土壤等样品中筛选出能够高效降解玉米赤霉烯酮的菌株,对其进行种属鉴定、生长特性及降解特性研究,最后将菌株应用于玉米秸秆青贮中。主要结果如下:
  1、本试验首先从不同样品中分离单菌株,经酶联免疫检测试剂盒和酶标仪初筛,选出能高效清除玉米赤霉烯酮的菌株,又使用功能菌株的发酵上清液对玉米赤霉烯酮进行降解试验,筛选出能够高效降解玉米赤霉烯酮的菌株命名为Y-1d。经菌体菌落形态鉴定、分子生物学鉴定和生理生化鉴定,确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
  2、对Y-1d菌株的生长特性进行研究,发现该菌株可以承受一定的不利条件,在pH值为4.5的培养条件下可以生长,可以适应27-47℃的温度范围,耐受猪胆盐的浓度为0.3g/L,能够产生纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶、脂肪酶,且对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)有拮抗作用。对降解性质研究,发现该菌株具有降解活性的物质主要存在于发酵上清液中,推测为蛋白性质的酶类,对不同浓度的ZEN有不同的降解效率,随着ZEN浓度的升高降解率逐渐降低,最佳降解pH值为7.0,最佳降解时间为72h。
  3、对Y-1d菌株降解后的安全性进行评价。将40只昆明鼠等分为四组进行灌胃试验,第一组为生理盐水组,第二组为毒素组,第三组为毒素降解后组,第四组为功能菌株菌体组。毒素组采用100μg/kg ZEN的体质量进行灌胃,其他组采用相同体积溶液进行灌胃,分别于7d、14d、28d进行眼球取血测定SOD、ALT、AST、ALP、ALB、LDH等生化指标。结果表明,第二组的小白鼠肝脏、心脏、体内自由基浓度等都受到了显著的影响(P<0.05),其他组没有明显差异(P>0.05),综合各指标情况可以得出Y-1d菌株降解ZEN后的产物以及菌体本身对小白鼠健康状况没有明显的影响(P>0.1)的结论。
  4、菌剂生产条件的探索,对Y-1d菌株的产芽孢条件进行优化。通过对Y-1d菌株的单因素试验和正交试验得出最优培养基为玉米粉2.0%,酵母浸粉1.5%,MnSO4·H2O0.01%,CaCl2·H2O0.1%。最优培养条件为发酵时间48h,接种量6%,pH值7.0,装液量100mL/250mL三角瓶,为生产提供参考。
  5、通过镰刀菌侵染的玉米秸秆青贮试验验证功能菌株的应用效果。分析结果得出,实验组中ZEN毒素残留显著低于对照组,而且Y-1d菌株对玉米秸秆的纤维降解优于对照组,同时能够产生以乳酸为主的有机酸,对提高秸秆的发酵品质起到一定作用。
  6、本研究通过筛选得到了一株能够高效降解玉米赤霉烯酮的菌株Y-1d,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),符合国家规定的饲喂用菌,该菌株性质优良,适应性广,稳定性强,安全性高,可以应用于青贮生产。
[硕士论文] 李岩
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:本研究对紫花苜蓿中SKIP同源基因的cDNA片段进行了克隆,并对克隆得到的SKIP同源基因进行了功能鉴定。利用含有20%PEG6000的1/2MS培养基模拟干旱环境,对紫花苜蓿幼苗进行胁迫处理,以胁迫6h的紫花苜蓿叶片总RNA作为模版进行反转录,利用RT-PCR的方法扩增得到紫花苜蓿抗逆相关RNA剪切因子SKIP基因的全长cDNA片段,命名为MsSKIP(GeneBank登录号:KX240083.1)。对紫花苜蓿MsSKIP基因的cDNA片段的序列分析结果显示,MsSKIP基因的cDNA全长2256bp,包含一个1836bp完整的开放阅读框,编码611个氨基酸,分子量为69.08kDa,理论等电点8.78,含有一个以S-N-W-K-N多肽为标签的SNW_SKIP结构域,是SKIP基因家族的典型结构域。对紫花苜蓿基因组中MsSKIP的序列分析表明该基因无内含子。
  本研究以植物双元表达载体pKGWRR为基本骨架,运用tasi-RNA干扰技术,分别将MsSKIP和本实验室前期克隆的黄花苜蓿MfSKIPcDNA片段构建到植物双元表达载体,得到了分别干扰MsSKIP和MfSKIP的植物双元表达载体pKGWRR-tasi-MsSKIP和pKGWRR-tasi-MfSKIP,以及不含tasiRNA片段的对照载体pKGWRR-MsSKIP。运用冻融转化法将重组质粒转入到发根农杆菌Arqua1中,运用毛根转化法将三种重组质粒转入截形苜蓿A17根组织中无菌培养2周,每种载体做三组实验重复。荧光体视显微镜下检测根组织转化有外源基因的截形苜蓿植株,每种转化体各选取长势基本一致的30株幼苗分别进行不同的胁迫处理(0℃、300mM Mannitol、200mM NaCl)10天,之后测量、统计胁迫处理后根组织的生长长度、根鲜重等表型指标;单株提取根组织总RNA,Q-PCR检测抗逆相关基因MtDREB1c的相对表达量。结果表明,三种胁迫下转化了pKGWRR-tasi-MsSKIP和pKGWRR-tasi-MfSKIP载体的幼苗的根长以及根鲜重都显著小于对照,MtDREB1c相对表达量显著降低,说明MsSKIP、MfSKIP基因能够增强植物的抗非生物胁迫能力,DREB1c基因可能存在于SKIP基因下游,受SKIP基因调控。
[博士论文] 张婷
生物化学与分子生物学 内蒙古大学 2018(学位年度)
摘要:钙是植物生长发育必需大量元素之一,通过调节不同Ca2+结合蛋白的活性,发挥维持细胞结构和介导细胞感应内外环境信号的功能。生态学研究发现,酸雨导致全球表层土壤游离Ca2+含量逐年下降,森林植物和淡水生物生存受到威胁。内蒙古草原土壤从东到西,有机质含量逐渐降低,可溶性Ca2+含量也随之降低。羊草是包括内蒙古草原在内的、欧亚草原优势建群种。目前,羊草如何应对生理性缺Ca2+环境,是否具有专属Ca2+结合蛋白,基本未知。本文在建立羊草无菌培养和基因瞬时表达实验体系的基础上,深入研究了羊草Ca2+依赖性生长的细胞和分子机理,进一步探索了羊草特有组氨酸富集Ca2+结合蛋白的生理功能,主要结论和成果如下:
  (1)羊草无菌培养和基因瞬时表达技术体系的建立。本论文用不同消毒剂对羊草种子进行不同时间的消毒,建立了羊草种子无菌条件下均一发芽的实验方法,可使羊草种子发芽率达到90%以上,无染菌。基本消毒剂配方:5%NaClO+0.1%Triton X-100。进一步以羊草幼苗为材料,建立了农杆菌介导的基因瞬时表达体系,分别在羊草细胞质膜、液泡膜、线粒体、高尔基体、内质网、溶酶体、质体表达了红色荧光蛋白。
  (2)降低Ca2+,而不是其他矿质离子,诱导羊草主根伸长,伴随根细胞内H2O2的产生及三酰基甘油(TAG,triacylglycerols)的积累,低浓度H2O2诱导羊草主根伸长、抑制羊草根毛生长,高浓度H2O2抑制羊草主根、根毛及叶的生长,转录组测序分析发现低Ca2+调节羊草根中木糖基转移酶基因表达量上调,免疫荧光实验证明低Ca2+培养基上羊草根半纤维素含量增加。这些实验结果说明本论文使用的低Ca2+培养基虽然能够诱导羊草主根伸长,但对于羊草是非生物胁迫生存环境,这种胁迫会使TAG及H2O2在羊草根细胞积累,积累的H2O2作为信号分子调节羊草根中初生细胞壁合成相关基因的表达诱导羊草主根的伸长,帮助羊草应对低Ca2+非生物胁迫生长环境。
  (3)深入分析羊草转录组测序数据,发现了一个编码组氨酸富集Ca2+结合蛋白(HRC,histidine rich calcium-binding protein)的转录本,命名为LcHRC1(Leymus ChinensisHRC1),植物中只有羊草和羊草近缘种小麦中有此蛋白,证明HRC为羊草和小麦特有Ca2+结合蛋白,LcHRC1基因没有内含子,通过染色体步移技术获得LcHRC1基因上游5?侧翼端2923bp、下游3?侧翼端4056bpDNA序列,其启动子区只有CpG岛,没有TATA启动子元件。分别以羊草基因组DNA以及羊草cDNA为模板进行LcHRC1基因的扩增,发现羊草中LcHRC1基因没有内含子,基因的表达没有特异性,在羊草叶中、根中均可表达,且表达量基本一致。
  (4)LcHRC1蛋白只有组氨酸富集的酸性结构域,没有半胱氨酸富集结构域,动物中HRC蛋白包括这两个结构域。利用MicroCal iTC200高灵敏等热滴定热量计研究LcHRC1同离子的结合特性,发现LcHRC1可以和Ca2+、Zn2+特异性结合,同Mg2+、Mn2+没有结合特性。酵母双杂交筛选拟南芥cDNA酵母文库实验发现LcHRC1可以同拟南芥的AtTPM1蛋白互作,AtTPM1蛋白功能未知,预测作为转录因子与甲基化组蛋白上的赖氨酸结合,调控生物体的生长发育。AtTPM1与羊草的LcTPM1蛋白同源,酵母双杂交实验证明LcHRC1和LcTPM1互作。通过构建荧光蛋白融合表达载体,证明LcHRC1及LcTPM1都位于羊草细胞核内。
  (5)与野生型拟南芥相比,转LcHRC1基因拟南芥生长对ABA敏感。但转基因拟南芥中ABA含量与非转基因拟南芥无显著性差异,证明LcHRC1不参与ABA代谢。ABA信号应答相关基因ABI4、DREB1A、ABI5定量结果显示ABA处理拟南芥植株6h后,在转LcHRC1基因拟南芥中这三个基因表达量上调倍数显著低于非转基因拟南芥。有研究表明ABI4、DREB1A、ABI5基因的表达受ABA诱导,表达的蛋白作为转录因子与靶基因启动子区顺式元件结合调节靶基因的表达,序列比对发现LcHRC1基因启动子区有ABI4、DREB1A可结合的顺式元件。对转基因拟南芥和非转基因拟南芥进行干旱处理,发现转基因拟南芥抵抗干旱能力提高,证明LcHRC1参与ABA依赖信号通路对干旱胁迫的应答。ABA处理拟南芥叶片,转LcHRC1基因拟南芥叶片细胞质内Ca2+浓度升高倍数低于非转基因拟南芥。ABA还会抑制羊草叶片中LcHRC1基因的表达。
  通过以上探究可以得出结论:羊草中LcHRC1与LcTPM1相互作用,两者互作可能受LcHRC1与Ca2+结合的调节,两者相互作用可能通过调节细胞质内Ca2+浓度的变化参与到ABA依赖信号通路对干旱胁迫的应答。
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