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[硕士论文] 于天武
园艺 山东农业大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 雷雨
作物遗传育种 华中农业大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 余涛
农业资源利用 福建农林大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 李来燕
环境工程 西安理工大学 2019(学位年度)
[博士论文] 武辉
作物栽培学与耕作学 华中农业大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 唐明
会计 山东农业大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 路国艳
土壤肥力 西北农林科技大学 2018(学位年度)
[硕士论文] 许慧慧
生物学;植物学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:紫花苜蓿是中国重要的多年生的豆科植物,其具有高产、营养成分多样化及抗逆性强的特点,但恶化的土地条件仍限制了苜蓿的产量。多个研究表明RCI2/PMP3类基因作为多基因家族普遍存在于植物中,可响应多种非生物胁迫,包括低温、干旱、盐,且被激素诱导。且多个研究表明RCI2/PMP3基因在植物中的超量表达可通过提高膜的稳定性及保持细胞内的离子平衡来增加抗多种非生物胁迫的耐力。关于RCI2类基因在苜蓿中的超量表达是否可以提高苜蓿抗非生物胁迫的能力仍是未知的。本研究从紫花苜蓿中克隆了MsRCI2A,MsRCI2B和MsRCI2C基因,构建了三个植物表达载体以连接目的基因。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法转化紫花苜蓿子叶节,并通过分子生物学技术对所筛选的抗性植株进行检测。分析了MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因超量表达对苜蓿耐碱性的影响,为培育出耐逆性转基因苜蓿提供重要的理论依据以及为促进畜牧业的蓬勃发展奠定基础。
  本研究的主要研究结果如下:
  1.在紫花苜蓿中克隆了RCI2类基因家族成员MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因,蛋白质分子质量分别为5.931-kDa、5.946-kDa、6.05-kDa,它们的序列高度同源,都对碱、干旱、低温胁迫和ABA诱导产生响应,但它们对每种胁迫响应程度不同,并且在根和叶中具有不同的表达模式。本研究构建了三个连接目的基因植物表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化方法转化紫花苜蓿的子叶节。每个基因分别获得了两株超量表达的植株。
  2.对转基因株系及野生型株系扦插扩繁,对各株系进行100mM NaHCO3(pH调至8.5)处理。经碱处理15d后,超量表达MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的各株系仍能保持良好的生长状态,而WT株系的生长受到了明显的抑制,叶片变得枯黄且萎蔫。并且碱处理后超量表达MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的各株系相对于非转基因株系有更高的叶绿素含量,积累了更高水平的可溶性糖含量且抗氧化物酶SOD、POD及CAT的活性更高,而丙二醛的含量及相对电导率更低。在未处理和碱胁迫处理5d、10d时,超量表达MsRCI2A,MsRCI2B和MsRCI2C基因的各株系比非转基因株系积累了更多的脯氨酸,但碱胁迫处理15d时,由于非转基因株系受损伤的程度更为严重,以至于积累更多的脯氨酸响应胁迫。
  3.分析了碱处理后各转基因株系中的碱胁迫相关基因H+-ATPase及与所转基因相同源的RCI2类基因的表达情况。相对于对照条件下,碱胁迫处理12h后,H+-ATPase在WT及超量表达MsRCI2B基因株系B13与B19中的表达削弱,在超量表达MsRCI2A基因株系A12、A22中略有上调,而在超量表达MsRCI2C基因的株系C2、C10中的表达呈显著上调趋势。有趣的是,碱胁迫处理12h时,MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因在野生型株系中的表达呈上调趋势,MsRCI2A、MsRCI2B基因在超量表达MsRCI2C基因株系C2与C10中呈上调表达趋势,其中MsRCI2A基因上调的程度较野生型大,而MsRCI2B、MsRCI2C基因在超量表达MsRCI2A基因株系A12、A22中的表达受到了抑制,MsRCI2A、MsRCI2C基因在超量表达MsRCI2B基因株系B13、B19中的表达受到了抑制。
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