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[硕士论文] 吴艳迪
果树学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:褪黑素是一种吲哚胺类激素,广泛存在于大多数有机体中。作为一种抗氧化剂和自由基清除剂,褪黑素可参与调节动、植物体内多种生理功能。人体可通过外源摄入褪黑素含量丰富的水果以增加血液中内源褪黑素含量和抗氧化能力。葡萄作为一种经济栽培果树,营养价值丰富,目前有关葡萄中内源褪黑素含量变化的研究不多。本研究调查了不同胁迫条件和不同发育时期对葡萄内源褪黑素含量的影响,并且对葡萄中褪黑素合成基因进行初步的筛选,结合qRT-PCR技术分析果实不同发育阶段褪黑素合成基因的表达模式,进一步探究褪黑素及其前体物质的含量与褪黑素合成基因之间的相关性,此外还克隆了葡萄5-羟色胺-N-乙酰转移酶(SNAT)基因的CDS序列,采用原核表达系统在大肠杆菌中诱导该基因产生可溶性蛋白,初步研究了葡萄SNAT基因的特性和酶学功能。主要研究结果如下:
  1.干旱胁迫和盐胁迫下葡萄幼苗根系和叶片中褪黑素含量较对照组均显著增加,且胁迫程度越强增幅越大。用120mmol/l的Nacl溶液处理葡萄幼苗,6d后幼苗根系和叶片中褪黑素含量分别达到627.25和3220.42pg/g,均为相应对照组幼苗根系和叶片中褪黑素含量的7倍。10%聚乙二醇PEG6000模拟的干旱胁迫处理葡萄幼苗,6d后其根系和叶片中褪黑素含量也远远高于对照组。
  2.不同发育阶段的葡萄果实中均检测到褪黑素的存在。果实开始转色后,褪黑素含量上升,在转色末期,褪黑素含量降低,随着果实逐渐成熟又表现出上升的趋势,在转色初期含量达到最高峰,为1.32±0.06ng/g FW。而且在果实发育过程中,褪黑素合成前体物质——色胺和5-羟色胺含量变化趋势与褪黑素一致,均在转色初期含量最高。
  3.以水稻褪黑素合成基因为模板,采用同源比对方法对从葡萄基因组中初步筛选了4个Vv TDC基因,7个VvT5H基因,3个Vv NAT基因,5个VvASMT基因作为葡萄褪黑素合成候选基因,在果实发育过程中VvT5H1、Vv T5H5、VvT5H7、VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNA T3、VvASMT1、VvASMT2等基因的表达模式和褪黑素含量相一致,而VvTDC1、VvASMT5基因的表达量变化趋势与褪黑素不完全一致。
  4.克隆了葡萄SNAT基因全长CDS序列,长741bp,编码246个氨基酸,与其他植物SNAT基因编码的氨基酸序列存在较高的相似性。采用原核表达方法诱导得到葡萄SNAT可溶性蛋白。体外酶活测试表明,重组SNAT蛋白具有N-乙酰基转移酶的活性,能够将乙酰基从乙酰辅酶A转移到5-羟色胺。系统发育树结果表明,葡萄SNAT基因与羊SNAT基因亲缘关系较远,与拟南芥、水稻等单子叶被子植物的亲缘关系较近。
[硕士论文] 张倩
果树学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:根结线虫(Meloidogyne spp)是影响世界作物安全生产的重要病害,同时也是造成桃树“短寿病”和“重茬病”的重要致病因素之一,其中尤以南方根结线虫(Meloidogyne incognita)危害最为广泛和严重。培育抗根结线虫桃品种是控制南方根结线虫病害的绿色安全、经济高效措施。对桃抗根结线虫基因进行全面系统研究,探索抗病基因在免疫系统中的位置和作用,为认识桃抗根结线虫的本质奠定基础。本课题组前期围绕红根甘肃桃1号(Prunus kansuensis L)抗南方根结线虫基因进行了大量的基础工作研究建立了一种快速鉴定桃对根结线虫抗性的方法,确定了桃表观形态发生变化的重要时期,利用‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’构建了桃连锁图谱,将抗根结线虫基因定位在2号染色体,完成‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’南方根结线虫侵染后各时期的转录组测序,用二代分子标记定位红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因,将抗性基因定位至NBS29(6cM)和SRAPs标记M4E11-100(20cM)之间。为更精确对红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因定位,本研究将继续进行该抗性基因的定位和发掘工作,为抗病品种的利用提供思路,同时为抗病育种工作奠定理论依据。
  本研究首先以BC1代构建抗、感基因池进行BSA测序。而后用‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’杂交F1自交构建F2代分离群体,利用BSA测序结果以及KASP基因分型确定抗性候选位点区段,深入分析基因序列以及基因表达量,逐步发掘控制红根甘肃桃1号抗南方根结线虫的关键基因。通过以上试验,本研究初步明确了控制红根甘肃桃1号抗南方根结线虫的候选关键基因,获得的主要结果如下
  1、利用亲本为‘红根甘肃桃1号’和‘贝蕾’的BC1群体构建抗、感混池,以全基因组重测序为基础进行性状BSA定位,共检测到2,442,036个SNPs。筛选亲本中纯合且F1中杂合的SNP位点,共挑选出1,569,564个多态性标记。选择‘红根甘肃桃1号’作为参考亲本,分析计算两个子代池的△SNP-index。选择95%置信水平下,在全基因组范围内挑选两个子代在SNP-index差异显著的SNP位点,得到候选的77个多态性标记位点。
  2、利用15个SNPs对302份F2代材料进行KASP基因分型,共获得3883个位点的基因型,占总位点数的857%。独立性检验结果表明SNP3(CHR24905737)、SNP5(CHR25397749)、SNP7(CHR25582276)与红根甘肃桃1号抗南方根结线虫基因相关性最高。
  3、利用不同侵染时期的‘红根甘肃桃1号’、‘贝蕾’根部样品,对25个候选基因进行基因表达分析,结果发现关键候选基因ppa020745m在红根甘肃桃1号中随根结线虫侵染表达量升高,在侵染后12h表达量显著升高,在贝蕾中基本不表达。其上游启动子序列在抗病种质中存在一个35bp的缺失。在250个F2后代中进行验证,结果表明在86个抗病后代中该片段均缺失,115个抗病后代测序时该缺失片段处为双峰,推测该缺失片段在抗病材料中为缺失或杂合,在49个感病后代中该片段存在。
[博士论文] 周喆
果树学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:苹果再植病是一个复杂又难以解决的历史性问题,也是保障我国苹果产业可持续健康发展必须解决的问题。筛选抗重茬苹果砧木品种是目前防治苹果再植病最为环保且有效的途径。开展苹果砧木中参与调控抗再植病相关基因的筛选及作用机制研究,对于通过基因工程手段选育苹果再植病抗性砧木具有重要意义。以往研究表明,苹果再植病的关键发病因子主要是真菌,几丁质是真菌细胞壁的重要组成成分。模式植物研究结果显示,植物的几丁质受体蛋白可通过识别几丁质而触发植物的免疫反应,从而对随后的病原菌侵染表现出抗性。本研究借鉴了模式植物的研究成果,通过生物信息学分析,结合两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种(G935与B9)的转录组分析结果,成功获得了抗苹果再植病相关基因MdCERK1,并通过qPCR、pull-down及质谱测序等技术对该基因的表达特性及相互作用蛋白进行了筛选,获得了以下主要的研究结果:
  1.使用Pythium ultimum分别对两个在苹果再植病抗性方面存在差异的品种进行侵染,通过RNA-seq筛选差异表达基因来获得在苹果再植病抗病中起关键作用的目标基因。因为CERK(chitin elicitor receptor kinase)基因包含的胞外LysM(lysin motif)结构域,对几丁质的识别具有特异性。理论上,CERK基因对苹果再植病真菌性病原菌具有广谱抗性,具有很高的研究意义和应用价值,所以我们选择其作为进一步研究的目标基因。
  2.在利用qPCR研究基因表达时,需要内参基因对实验过程进行校正,而当前有关苹果根组织响应不同胁迫条件后的基因表达尚少有研究。所以我们利用了我们的转录组数据,选择了10个表达水平变化最小的基因和5个之前有过报道的内参基因。然后采用Delta Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper等分析方法对这15个基因在不同实验条件与不同基因型根组织中的稳定性进行了分析。结果表明,MDP0000095375、MDP0000147424、MDP0000233640、MDP0000326399和MDP0000173025等5个基因无论是非生物胁迫还是生物胁迫条件下都较为稳定,可以用作相关研究的内参基因。
  3.利用已公布的苹果基因组数据库GDR和The Apple Genome and Epigenome,鉴定苹果LysM基因家族成员。通过系统的鉴定,共得到30个苹果LysM家族成员。使用在线工具ExPASy Proteomics Server对MdLysM蛋白的基本信息进行预测。根据聚类分析可将这些基因分为A、B和C三组,且C组又可进一步被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个亚族,说明它们的功能可能已经发生了分化,基因结构的复杂程度与进化树聚类存在联系。MdLysM蛋白结构域预测的结果及基因结构分析的结果均与进化树聚类结果吻合。序列相似性及对MD09G1111800的基因组结构、结构域组成的序列分析以及其对外源几丁质的响应等结果显示,MD09G1111800是AtCERK1的同源基因,因此我们将其命名为MdCERK1。
  4.组织特异性表达分析显示,相比花、果实、种子等组织来说,MdCERK1还是主要在根、叶等营养组织中表达。立枯丝核杆菌侵染的苹果根组织中MdCERK1的转录调控模式证明,MdCERK1是一个功能性模式识别受体(pattern recognition receptor protein,PRR)。pull-down结果显示,GST-MdCERK1具有几丁质分子绑定能力,进一步从生化角度上证明了其就是苹果中的几丁质受体蛋白基因。其在不同抗性品种均能响应病原侵染,但是调控模式存在差异。
  5.使用pull-down联合质谱筛选到MdCERK1可能的互作蛋白PR4,进一步解析MdCERK1的抗病信号转导机制。
  综合以上所有的数据,得到结论,MdCERK1是一个几丁质绑定受体类激酶,主要在苹果营养器官中发挥作用,并且在响应苹果再植病病原菌侵染中发挥重要作用。
[硕士论文] 肖壮
农业电气化与自动化 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,随着我国经济的快速发展和人们消费水平的普遍提高,葡萄产业得到了很大的发展,葡萄已成为我国最受欢迎的水果之一。但是我国葡萄商品化处理程度低,一直制约着葡萄产业向规模化和产业化的方向转变。葡萄为穗状结构、果粒较多、果实柔软、易碰伤,故葡萄产后加工存在较大困难。目前,我国绝大多数地区仍采用人工分级方法,利用简陋的工具根据经验分级。人工分级效率低下、成本高、强度大,因此,市场迫切需要葡萄品质在线检测分级技术及装备。
  本文以葡萄的一个品种——红提为研究对象,运用机器视觉技术,建立了红提果粉附着率和红提果粒尺寸的在线分级模型,设计了一套红提在线检测与分级硬件与软件系统,具体研究内容如下:
  (1)搭建了红提图像采集试验平台。在一个试验用环形运输线上,搭建红提图像在线采集装置,设计了尺寸大小为600×450×450mm3的暗箱,暗箱顶端的切槽保证了夹持机构的持续运输,暗箱内的光电传感器感知红提串并触发相机,实现红提图像的连续采集;分析对比了多种不同光源的优缺点,选用了环形光源和前光源的照明方式;为能够同时提取红提形态轮廓和颜色特征,选用了能同时获取红提彩色图像和近红外图像的工业相机和镜头。
  (2)研究了红提果粉附着率等级的判别方法。在图像的预处理阶段,采用了归一化超绿法,去除了红提图像中的绿色果梗信息的干扰;采用交互式取点的方法,提取了果粉及果肉区域的颜色特征,分别采用朴素贝叶斯、BP神经网络和SVM支持向量机的方法建立了果粉的判别模型,通过比较发现,SVM支持向量机模型检测时间短,预测准确率高,应用于果粉的在线识别可行。通过对比人工的分级结果,红提果粉附着率的分级准确率为93%。
  (3)研究了红提果粒尺寸检测和分级方法。采用了基于形态学的开闭重构和局部极大值的方法,采集到近红外图像每粒果粒表面光斑位置,获取果粒中心位置坐标,完成果粒的粗定位。采用梯度分割算法,获取每粒果粒轮廓像素点,但一些轮廓重叠严重的像素点仍会干扰目标果粒的拟合,因此设计了一种随机最小二乘的椭圆拟合算法,提取目标果粒尺寸,并完成果粒的精确定位。经过与人工实测分级结果的验证,本研究设计的红提尺寸检测和分级准确率为91%,实现了整串红提果粒大小的自动分级。
  (4)针对红提果粉和尺寸的检测和分级模型,设计了基于机器视觉的在线控制系统和检测软件。在线控制系统主要包括了电机控制系统和图像采集控制系统,分别实现了环形运输生产线速度的实时控制和红提图片的在线采集。在线检测软件是利用VS软件中MFC控件设计的,其主要功能包括了上位机的协议设定、实时显示红提图像、监测串口通信状态和获取红提果粉和尺寸模型的分级结果等。
  (5)设计了一套红提在线检测分级流水线装备。流水线装备主要包括输送装置、图像采集装置、分级踢出装置和分拣装置。输送装置采取了环形悬挂输送链式的设计方法,保证了红提运输的稳定性,模拟了实际生产应用的场景;设计了具有棘齿自锁功能的夹持机构,方便了红提上下料过程,减少了人工工作量;设计有固定缺口形状的分级踢出装置实现了对红提自动连续的分选;设计由多个皮带滚筒组合成的分拣装置,实现了对应等级的红提分拣。
[硕士论文] 位高生
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:针对当前福建省平和县琯溪蜜柚施肥过量问题,以酸柚砧木白肉琯溪蜜柚为试验材料,以前期问卷调查结果为依据设置氮磷最高施肥量:N1.60kg/(株·年),P2O51.30kg/(株·年),结合平和当地土壤养分状况和琯溪蜜柚需肥特性,以30%梯度递减氮肥用量,设高氮(N1)、中氮(N2)和低氮(N3);以35%梯度递减磷肥用量,设高磷(P1)、中磷(P2)和低磷(P3),采用双因素交互设计以及田间试验方法,研究分析了氮磷减量施肥对琯溪蜜柚果实产量、品质以及树体和土壤养分的影响,为建立试验区琯溪蜜柚化肥减量与提质增效技术,推进当地琯溪蜜柚产业绿色高效发展提供依据和技术指导。获得的主要结果如下:
  (1)2016年,各氮磷减量施肥处理均比施肥量最高的N1P1处理有不同程度的增产,增产率在27.04%-58.93%之间。2017年,与N1P1处理相比,其他氮磷减量施肥处理的产量增减不一,其中N1P2、N1P3、N3P1和N3P3处理产量有所下降,以N1P2处理下降幅度最大,达20.11%;N2P1、N2P2、N2P3和N3P2处理产量有所上升,以N2P3处理上升幅度最大,达11.55%。在不同氮磷水平下,随着氮肥施用量的降低,产量均呈现先增加后降低的趋势,而随着磷肥施用量的降低,均以低磷水平(P3)下的产量最高。
  (2)综合2016年和2017年琯溪蜜柚内外果实品质结果可知,减少氮磷肥施用,可以提高果实出汁率、可食率、可溶性固形物、固酸比和维生素C含量,并降低纵横比、单果重、果皮厚和可滴定酸含量;与氮水平相比,磷水平对琯溪蜜柚各品质指标的影响相对较小;氮磷水平及交互作用对各品质指标的影响因时间不同而有所差异。总体而言,N2P2、N2P3和N3P1处理的果实品质相对较好,其中主成分分析的综合得分以N2P3处理最高,达1.65,其果实品质也相对较好。
  (3)果肉磷、钾、镁含量和果皮磷、钙、镁含量在不同氮水平之间无显著差异,果肉氮、磷、钾、钙、镁含量以及果皮氮、磷、钾含量在不同磷水平之间无显著差异。整体来说,氮磷减量施肥对琯溪蜜柚果肉和果皮氮、磷、钾、钙和镁含量的影响较小。此外,果皮钙、镁含量高于果肉,而果肉的磷含量高于果皮,果肉和果皮的氮、钾含量基本相当。
  (4)2016年和2017年两年5、7、9、11月琯溪蜜柚叶片氮、磷、钾、钙和镁含量结果表明,各处理叶片中氮、磷、钾和镁含量均在5月份相对较高,在7月份和9月份有所下降,在11月份相对稳定或略有上升;叶片钙含量随叶龄增加而增加。根据丰产琯溪蜜柚叶片矿质养分诊断标准,2016年和2017年各月份叶片氮、磷、钾和钙的含量均值基本均处在适宜范围,而镁含量均值相对较低。
  (5)2016年-2017年各处理表层土壤有机质、碱解氮和交换性钙、镁含量均高于亚表层土壤;各处理表层和亚表层土壤速效磷含量较高,且其磷环境均处于高风险等级,面临磷素面源污染的风险较大;各处理表层和亚表层土壤速效钾含量均处于丰富范围内,甚至有超标的风险,当地果农也应重视钾肥施用过量的问题;氮磷减量施肥以及于3月上中旬撒施钙镁混合物有助于缓解因过量施肥造成的土壤酸化并可有效补充土壤交换性钙镁含量。
  (6)综合考虑,建议对土壤磷处于高风险的果园,氮肥减量30%,磷肥减量70%,即氮肥(纯N)1.12kg/(株·年),磷肥(P2O5)0.39kg/(株·年);土壤磷环境风险相对较低的果园,氮肥减量30%,磷肥减量35%,即氮肥(纯N)1.12kg/(株·年),磷肥(P2O5)0.85kg/(株·年)。
[硕士论文] 陈世伟
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:番茄(Solanum lycopersicum)是我国种植十分广泛的一类蔬菜作物,并主要采用温室种植。番茄芽期和苗期抗寒能力对于露天种植时节省资金投入、减少农业经济损失有十分重要的作用。番茄的起源中心是安第斯山脉,当前栽培番茄的祖先是樱桃番茄。番茄是一种喜温作物,经过不断的驯化,番茄在一生不同生长阶段的抗寒能力都有了提升。本研究对252份番茄重测序材料在15℃和25℃下进行发芽实验,对其发芽指数进行了统计,并利用关联分析,最终候选了一个番茄种子萌发期抗寒基因(Cold Resistance,SlCR1)。主要的实验结果如下:
  1.在萌发期抗寒基因SlCR1的编码区内,存在1个SNP位点与材料的表型差异紧密相关,这个SNP位点位于SlCR1的编码区,在抗寒材料中,该位点的碱基趋向于G,在抗寒敏感材料中,该位点的碱基趋向于A,该位点上单碱基的改变使得氨基酸发生了变化。其启动子序列在材料间没有差异。同时,极端材料表达量在15℃和25℃下没有差异,说明编码区序列的变化是造成极端材料间性状表型差异的原因。
  2.转基因功能验证表明,超量表达SlCR1转基因株系(T2代)的萌发速率指数(GRI)降低,而萌发速率指数越低,种子就可以越早地突破低温胁迫发芽,表明SlCR1可以提高番茄芽期的抗寒水平,促使种子萌发。对超量表达转基因株系幼苗进行低温处理发现,其萎蔫程度低于野生型对照WT。超量表达SlCR1能提高番茄幼苗时期耐受冷害胁迫的能力,表明了SlCR1能够正向调控番茄萌发期和苗期的抗寒性。
  3.酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)实验表明:SlCR1和一个转录因子SlPP2-B1互作,SlPP2-B1是F-box转录因子家族中的一个基因,F-box蛋白是泛素连接酶E3中的一员。SlPP2-B1可以在多个组织中表达,在绿果、花和茎表皮的表达较高。在低温胁迫下,番茄抗寒材料中LA1777中,SlPP2-B1表达量迅速显著升高。超量表达SlPP2-B1转基因系在芽期的抗寒表现与WT无差异,但其在苗期的抗寒能力低于WT。这表明,该基因负调控番茄苗期的抗寒性。
  4.将SlPP2-B1在AC中进行超量表达后,在其转基因T1代检测SlCR1的表达量,发现SlCR1的表达量降低,与之相反的是,而在SlCR1的T1代超量表达植株中,SlPP2-B1的表达量升高,说明二者可能存在反馈调节机制。
  5.SlPP2-B1与一个电压门控型阴离子通道蛋白VDAC1互作。与此同时,VDAC1与ShCIGT互作。VDAC蛋白在植物的逆境响应中有十分重要的作用。ShCIGT不与SlPP2-B1互作,也不与SlCR1互作。
[博士论文] 宋放
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柑橘根系根毛稀少,严重依赖与丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhzial Fungi,AMF)形成菌根来吸收土壤养分。除了AMF,根际其他微生物也能够促进植物生长,同时提高植物对病原菌入侵、干旱、寒冷和高盐和重金属等生物或非生物胁迫的抗性。因此,系统鉴定柑橘根系微生物尤其是AMF的群落结构,并探讨其功能和调控对柑橘生产具有重要的实践意义。本研究采用高通量测序技术鉴定了柑橘根系的AMF群落结构以及柑橘响应菌根共生的miRNA,并通过超表达或干涉技术对关键miRNA进行了功能验证,为深入研究菌根共生形成的分子机制提供了依据。利用微生物组和宏基因组技术对柑橘根系微生物群落的结构和功能及其受黄龙病侵染的影响进行了鉴定。本研究主要研究结果如下:
  1.柑橘根系AMF群落鉴定及其主要影响因素分析
  以来自8个柑橘产区的柑橘实生苗及不同嫁接组合为材料,通过对柑橘根系AMF的18S rRNA基因片段进行454焦磷酸测序,鉴定了柑橘AMF的遗传多样性,并且评估了生境、砧木和接穗基因型对AMF群落结构的影响。通过测序我们从77个柑橘根系样品中总共得到740000条有效序列,对应产生1028个AMF的OTU分子种。这些序列被进一步注释到75个AMF种中,其中66个都属于球囊霉属,说明球囊霉属真菌为柑橘AMF的优势菌属。主成分分析(PCA)表明:柑橘AMF群落结构受到生境和寄主基因型的显著影响,其中生境是最主要的影响因素。有意思的是,尽管AMF与砧木根系存在直接接触,但我们发现柑橘接穗基因型可能比砧木基因型对AMF群落结构的影响更大,意味着接穗可能通过代谢物运输或其他途径远距离调控菌根共生形成。
  2.柑橘响应菌根共生miRNA的鉴定及功能分析
  以常用柑橘砧木枳为材料,采用Small RNA测序鉴定了枳根系响应丛枝菌根共生的miRNA。结果共鉴定到148个己知miRNA和15个新miRNA,其中20个miRNA及miRNA*受到菌根诱导或抑制表达。这20个差异表达miRNA包括了两个已知共生相关的miRNA(miR171b和miR167h),以及可靶定丛枝菌根共生相关基因(如GRAS家族基因RAD1和RFCb)的miRNA,如miR473,miR1446b/c和miR477a/c。为验证这些miRNA的功能,我们选取miR477a构建了超表达及STTM载体并遗传转化枳获得了阳性植株,为下一步表型鉴定提供了材料。此外,我们找到了其在苜蓿中的同源miRNA(miR5037a/b/c),定量PCR发现miR5037a/b/c在苜蓿中同样受到菌根诱导表达。由于miR5037a/b/c有3个前体但只有1个成熟体,我们分别构建了3个超表达载体和1个STTM载体并转化苜蓿毛状根。表型检测发现miR5037的超表达植株的菌根侵染率与丛枝丰度均轻微上升但未达显著水平,而miR5037的STTM转基因株系的菌根侵染率与丛枝丰度均显著下降,说明miR5037a/b/c可能参与了丛枝菌根共生调控。
  3.柑橘根系微生物群落结构鉴定及其对黄龙病侵染的响应
  以赣州柑桔科学研究所同一果园健康和感染黄龙病的枳砧纽荷尔脐橙根系为材料,通过对细菌16S rRNA特异区段进行高通量测序,鉴定了柑橘根系内生及根际细菌群落结构,并分析了感染黄龙病对柑橘根系细菌群落的影响。我们从16个柑橘根系及根际样品中获得1010116条有效序列,总共鉴定到2464个细菌OTU。其中变形菌门细菌在柑橘根系内生及根际细菌群落均为优势菌种,占总OTU数的37.42%,占总序列数的58.25%,说明变形菌门细菌为柑橘根系微生物群落的优势菌。与健康树相比,感染黄龙病的树其根系的细菌总丰度和多样性无显著性差异,但部分细菌种类的相对丰度发生了显著变化从而影响细菌群落结构。其中与抗病相关的拟无枝酸菌属和与降解相关的鞘氨醇盒菌属在感染黄龙病的柑橘根系中的丰度均显著上升,暗示这两类菌参与了黄龙病胁迫响应过程。
  4.基于宏基因组学的柑橘根际微生物群落结构及功能鉴定
  本研究以赣州柑桔科学研究所同一果园健康和感染黄龙病的枳砧纽荷尔脐橙根际土壤为材料,采用宏基因组测序鉴定柑橘根际微生物群落结构及功能,同时检测黄龙病侵染对柑橘根际微生物功能的影响。我们对16个样本测序后总共获得102474个基因。通过基因注释,我们总共检测到43个门类,1167个属以及3571个种的微生物类群,说明柑橘根际微生物群落具有极高的多样性,并且宏基因组方法在属和种水平测序精度较高。柑橘根际宏基因组中细菌基因占总基因数的99.59%,其中变形菌门是基因数最多的菌种门。柑橘根际微生物群落的功能主要为氨基酸转运和代谢、能量产生与保存、水化合物运输与代谢、细胞壁/薄膜/膜生物合成、转录、信号转导机制等。受黄龙病侵染影响的柑橘根际微生物中超过74%的丰度差异基因均参与代谢相关通路,其中丰度最高的三个通路为代谢通路、不同环境中细菌代谢、次级代谢产物生物合成,说明黄龙病侵染对柑橘根际微生物的代谢功能具有重要影响。在黄龙病侵染的柑橘根际微生物群落中麦芽糖酶、β-葡糖苷酶、磷酸葡萄糖异构酶、烯醇酶和丙酮酸激酶这些降解糖分的关键酶的丰度均显著降低,而降解芳香烃类化合物的乙醛脱氢酶和4-草酰巴豆酸异构酶的丰度则显著升高。该结果表明,黄龙病侵染引起的柑橘韧皮部的筛管堵塞会减少柑橘根系分泌物,并导致柑橘根际微生物群落中以根系分泌的代谢物为主要碳源的细菌丰度的降低;另外根系因为缺乏碳水化合物而坏死,增加了土壤中难降解的木质素等芳香烃类化合物的含量,从而导致降解芳香类化合物的丛毛单胞菌属、雷氏菌属、鞘氨醇盒菌属和鞘氨醇杆菌属的丰度增加。因此我们推断黄龙病侵染能够通过改变柑橘根际分泌物以及根际的环境条件来改变其群落结构。
[硕士论文] 刘建雄
农业电气化与自动化 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:柚子重量分级是柚子采后处理的重要环节,然而现有分级设备多为适用于工厂的大型通用果品重量分级装备,园地分拣仍以人力为主。因此,开发适用于中小农户的柚子称重分级设备对于提高生产效率具有重要意义。该文提出小型模块化柚子称重分选方案,设计了由上果机构、疏离机构、分选机构组成的分选线,编写了基于LABVIEW与MATLAB的数据采集与分析软件,设置6个柚子重量等级,设计了基于PLC的分选机构控制程序,以实现自动上果、自动单排化、电子称量与智能分选,理论分选速度为6000个/小时,用户可根据需要选择是否为称重分级核心模块搭配其他机构;此外,针对柚子单果重量大而导致的对称重传感器的冲击载荷和称重信号干扰,开展了信号分析区间均值重量预测的称重算法研究与基于BP神经网络的称重算法研究。主要研究结果如下:
  1.设计了小型模块化柚子重量分选机,分选机上果机构由具有挡板的带式输送机构成,上果机底部设置果箱收集倾倒的柚子,疏离机将柚子单排化后有序进入分选机构,分选机构对柚子进行电子称量,自动分级。
  2.搭建了分选系统控制电路和通讯电路。分选机硬件上使用单点式悬臂梁传感器产生重量信号,信号经电压变送器放大后送入数据采集卡,采集卡以串口通讯形式与PC连接,将采集电压信号以数字量形式传入PC,PC通过LABVIEW与MATLAB软件分析处理后得到重量,重量通过PC送入PLC内,PLC根据编好的分级程序对柚子进行等级判断,光电开关作为柚子到来触发装置,触发信号将传入PLC,当满足当前等级时PLC输出分选执行信号控制电磁铁动作,实现柚子分选。
  3.开发了分选系统电子称量软件,设计了基于LABVIEW与MATLAB的滤波算法与重量预测模型,设计了符合分级标准的分级程序和上位机界面等。
  4.动态称重装置固有频率测量,采用单位脉冲方式作用于称重装置,将输出信号进行傅里叶变换观察信号频率情况,测试显示称重装置有一个频率为39Hz的较强共振峰,此外频域图中还有一个较弱频率为54Hz的共振峰。称重装置空载试验,在三种速度下测试空载信号,结果表明不同速度下信号主频大小不同,在0.33m/s时主频为82Hz,在0.4m/s时为85Hz,在0.5m/s时为90Hz,且主频峰值随速度变大而变大。动态称重信号分析,使用5种数字滤波器对信号滤波,分析滤波后信号重量预测结果,结果表明,使用IIR滤波器、FIR滤波器与小波去噪均具有较好精度,其中使用IIR滤波器误差最小,而使用自适应滤波器误差最大。数字滤波算法执行时间分析,IIR程序运行时间为0.9ms,FIR程序运行时间为2.78ms,小波去噪程序运行时间为3.085ms,NLMS程序运行时间为12.4ms,RLS程序运行时间为39.6ms。基于BP神经网络进行重量预测,选择动态称重信号特征变量,建立神经网络模型,利用模型对数字IIR滤波后信号进行重量检测,试验中最大平均误差和最大误差均出现在速度为0.5m/s时,BP神经网络算法误差较均值法更小,且最大平均误差为2.17%,最大误差为4.56%,分选准确率为92.3%。
[硕士论文] 陈晨
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:以钾低效基因型西瓜早佳(ZJ),钾高效基因型西瓜勇士(YS)为材料,通过构建不同嫁接组合以及外源施用生长素类似物(NAA)、生长素极性运输抑制剂(NPA和TIBA),以正常钾(3mM)为对照,对低钾(0.01mM)条件下三方面进行了研究:(a)ZJ和YS根系构型差异及生长素相关转运基因的表达特点;(b)不同西瓜接穗对砧木根系钾吸收和生长素含量的影响;(c)外源生长素及抑制剂对ZJ和YS钾吸收的影响。研究结果如下:
  1.研究了低钾对西瓜根系构型特点、以及钾吸收和生长素转运基因的影响,结果表明,在受到低钾处理12d后,ZJ和YS幼苗均受到抑制,但YS受到的抑制程度相对较轻。ZJ和YS在低钾下根系和叶片的钾含量比对照均下降,ZJ根系及叶片的钾含量下降幅度大于YS,高亲和钾吸收基因Cla012760(HAK5)在YS中的表达量相对于对照上调幅度更大,生长素转运基因Cla017975(AUX1)、Cla018455(PIN1)等在YS植株根系内的相对表达量更高,暗示了生长素可能在西瓜钾吸收中发挥作用。
  2.研究了不同接穗对西瓜幼苗生长、钾吸收和生长素含量及转运基因表达量的影响,结果表明,耐低钾西瓜YS作为接穗提高了低钾敏感西瓜ZJ在低钾下的适应能力,与Z/Z自嫁相比,Y/Z西瓜幼苗的根系总长、根系体积、根系表面积以及根尖数量均有所增加,叶片和根系的组织钾含量也显著提高,低钾下根系和叶片生长素的含量均显著增加,相关基因Cla012760(HAK5),Cla017975(AUX1),Cla018455(PIN1),Cla01887(PIN2)的相对表达量显著提高,表明植株对低钾的耐受型与其地上部分通过生长素调控钾的吸收存在联系。
  3.研究了外源生长素类似物NAA、生长素运输抑制剂NPA和TIBA对ZJ、YS根系生长及钾吸收能力的影响,结果表明,正常钾条件下,NAA能够提高ZJ和YS根系及叶片钾含量,但在低钾条件下对ZJ和YS的影响存在差异,从根系构型和基因表达的结果看,YS对外源NAA更为敏感,可能与本身内部已经具有较高的生长素含量有关。抑制剂NPA、TIBA对正常和低钾下ZJ和YS生长存在抑制作用,NPA和TIBA处理同时提高了低钾下ZJ和YS的根系钾含量,降低了叶片钾含量。
  本研究结果表明,嫁接西瓜接穗能通过生长素调控砧木根系生长和钾吸收,但是详细的作用机制还需要进一步研究。
[博士论文] 徐君驰
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:中国甜柿自然脱涩性状受显性单基因控制,因而在完全甜柿遗传改良中具有重大的应用价值,但其自然脱涩关键基因及其调控网络尚不完全明确。已知中国甜柿自然脱涩过程与乙醛介导的“凝固效应”(即可溶性单宁向不溶性单宁的转化过程)有关,但乙醛代谢下游的关键基因ALDH2(醛脱氢酶2基因家族)在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中国甜柿(‘鄂柿1号’和‘罗田甜柿’),日本甜柿(‘阳丰’)和非完全甜柿(‘磨盘柿’)为试材,首先基于转录组数据库中ALDH2基因相关差异表达片段,从‘鄂柿1号’(Diospyros kaki Thunb.‘Eshi1’)中分离获得了ALDH2基因家族成员的cDNA全长,分析其表达模式并利用柿叶片瞬时表达技术体系对ALDH2基因进行功能验证;进而,应用酵母单杂交系统筛选与ALDH2基因互作的转录因子,进一步明确中国甜柿自然脱涩的分子调控网络;最后,结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系,分析ALDH2及部分单宁代谢关键基因在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的差异表达基因,进一步挖掘与中国甜柿自然脱涩直接相关的候选基因,以期为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供科学依据。
  主要研究结果如下:
  1.基于转录组数据库中的序列信息,通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术获得ALDH2基因家族两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b,其cDNA序列全长分别为1,984bp和1,933bp,分别编码542和540个氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中国甜柿叶片中瞬时超表达后,叶片可溶性单宁和不溶性单宁含量均显著升高;瞬时干涉表达后,叶片中可溶性单宁含量前者无明显变化,后者显著降低。二者均可通过减少可溶性单宁的消耗进而抑制脱涩。
  2.DkALDH2a主要作用于种子器官,其表达量在果实发育过程中逐渐降低,以致大量乙醛从种子扩散到果肉中,进而通过凝固效应促进脱涩。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表达,这可能是由于果肉中底物乙醛的积累所致,但其消耗的乙醛不足以阻止中国甜柿自然脱涩。因此,DkALDH2a和DkALDH2b的表达量与中国甜柿自然脱涩呈负相关关系。
  3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全长序列信息,通过染色体步移技术分别分离到515bp和1,209bp启动子序列。以DkALDH2b启动子构建pALDH2b-AbAi诱饵载体并转化Y1HGold酵母菌株,应用酵母单杂交技术从酵母文库中筛选到16个阳性克隆,经序列分析后新发现1个与ALDH2b互作的BBR/BPC1转录因子。
  4.结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系,筛选ALDH2及单宁代谢关键基因LAC1和ANR在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的特异表达基因,共得到119.63GbClean Data。通过Trinity软件从头拼接(de novo assembly),共得到192,597个转录本、100,371条Unigene。其中56,009条Unigene(约55.8%)获得了功能注释信息。注释为ERF家族的转录因子基因数目最高,且在三种处理中上调表达,说明其可能参与中国甜柿自然脱涩的调控过程。
  综上所述,本研究明确了ALDH2基因家族的两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b与中国甜柿自然脱涩之间的关系,并发现可能调控中国甜柿自然脱涩的两类转录因子BBR/BPC1和ERF。该结果为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供了参考。
[博士论文] 谭丰全
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:多倍体化是一种普遍的自然现象,是植物进化的主要动力。绝大多数开花植物在进化历程中至少经历过一轮以上多倍体化事件。目前农业生产中很多农作物为多倍体,包括小麦、油菜、棉花、马铃薯、甘蔗等。果树类作物中多倍体也十分普遍,包括香蕉、草莓、猕猴桃、柿等。现存的二倍体包括拟南芥、玉米、水稻等,其实是经过二倍体化的古多倍体。多倍体化通常伴随着多种多样的性状变异,具有很好的农业利用价值,尤其是在提高生物量和环境适应性等方面。前人研究主要集中在多倍体化后植物形态生理变异和涉及的基因组、转录调控、表观修饰变异等相关机制解析。代谢物与植物生长、发育及环境适应性等密切相关。同时,植物很多代谢物如糖、有机酸、Vc、氨基酸、类胡萝卜素、类黄酮等,是人类生命活动必须的营养物质。然而,多倍体化对植物的代谢影响及其分子机制还很大程度上不清楚。本研究以我国常用柑橘砧木—资阳香橙、红橘、枳,短童期资源—早实枳,以及栽培品种‘鄂柑1号’椪柑为实验材料,在己发掘其双二倍体的基础上,比较了双二倍体(4x)与二倍体(2x)在形态和代谢水平上的差异,并从转录水平解析其变异机制。主要研究结果如下:
  1.基因组加倍提高资阳香橙(Citrus junos Sieb.ex Tanaka)叶片胁迫相关代谢物积累和胁迫相关基因表达,促进其耐胁迫能力。与2x亲本相比,资阳香橙4x具有典型的形态和解剖特征,如植株矮小,叶片大而厚,气孔变大,气孔密度变低。GC-MS分析表明,四倍体化对叶片初级代谢产物的积累有促进作用;许多与胁迫相关的代谢物如蔗糖、脯氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)在4x显著上调。LC-MS分析表明,四倍体化对次生代谢的积累有抑制作用;检测到的33种黄酮均在4x下调。RNA-seq分析表明,4x和2x叶片之间212个基因(检测到的基因的0.8%)显著差异表达。值得注意的是,这些基因与逆境响应高度相关,包括对盐胁迫、水和脱落酸的反应。此外,部分转录差异和代谢变化不吻合,可能由转录后调控引起。
  2.基因组加倍在红橘(Citrus reticulata Blanco)、枳(Poncirus trifoliata L.Raf.)和早实枳(P.trifoliata L.Raf.)叶片引起的代谢变异不是完全随机的,其促进TCA循环中间底物积累,抑制次生代谢物积累。红橘、枳和早实枳的4x具有典型的多倍体形态特征,表现为植株矮化、叶片增大增厚、气孔增大和气孔密度降低,表明基因组加倍在柑橘属和枳属中引起共同的形态变化。对3组4x和2x亲本进行非靶向代谢组学分析,结果表明:主成分分析将3组4x和2x的代谢组明显区分,意味着基因组加倍引起明显的代谢组成变异;3组4x和2x有11%-34%的总检测代谢物含量存在显著差异,绝大部分差异代谢物的差异倍数都小于5,表明基因组加倍对代谢的影响程度有限。初生代谢在基因组加倍后增强,尤其是TCA循环中间物,柠檬酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸的含量在所有4x都高于2x。因此,基因组加倍后的代谢变化并非完全随机,其中TCA循环在植物应对多倍体化过程中可能起着重要的作用。同时,次生代谢在基因组加倍后受到抑制,3组材料4x中,大部分苯丙烷类和萜类代谢物的含量普遍比2x低。此外,3组材料的C/N比在基因组加倍后都显著降低。以上结果表明:为应对基因组加倍初期引起的基因组胁迫,植物通过促进初生代谢为生长发育提供所需的碳源和能量,同时通过抑制次生代谢减缓碳源和能量消耗。
  3.基因组加倍通过抑制成熟后期柠檬酸的运输和降解利用,促进椪柑(Citrus reticulata Blanco)果实柠檬酸积累。椪柑4x的形态特征和2x亲本明显不同,4x具有更大的叶片、花器官、果实和种子。值得注意的是,4x果实中种子大幅减少。果实品质分析表明,4x果实可滴定酸、Vc和总酚含量连续3年比2x亲本显著提高。柠檬酸是椪柑果实的主要有机酸,其含量增高是4x果实有机酸显著提高的主要原因。4x果实的主要可溶性糖和氨基酸含量和2x亲本相比无明显差异,表明柠檬酸含量增高不影响4x果实中糖和氨基酸的积累。类胡萝卜素和类黄酮组成分析表明,4x果实的大部分类胡萝卜素和类黄酮含量相比2x亲本显著降低,表明基因组加倍对果实次生代谢物积累有抑制作用。基因表达分析显示,果实成熟过程中柠檬酸合成相关基因在同源4x和2x间无表达差异,表明4x果实积累更多柠檬酸,不是因为其柠檬酸合成能力高于2x。果实成熟后期(花后180d和210d),柠檬酸运输相关基因,包括液泡H+-ATPase(VHA)、液泡H+-PPase(VHP)和柠檬酸/H+协同转运体(CsCit1),在4x中显著下调表达,意味着其柠檬酸运输能力低于2x。同时,柠檬酸降解途径中的GABA支路相关基因,包括谷氨酸脱羧酶(GAD)、γ-氨基丁酸透性酶(GABP)和γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T),以及ACL支路相关基因柠檬酸裂解酶(ACL)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和果糖-1,6-二磷酸酶(FBPase)也在4x显著下调表达,表明4x柠檬酸降解和利用效率在果实成熟后期低于2x。因此,在果实成熟后期,4x的柠檬酸运输能力低于2x,同时柠檬酸降解和利用效率也低于2x,导致4x果实积累更多柠檬酸。
  本研究从代谢角度阐释多倍体化对柑橘类植物的影响,丰富了植物多倍体化相关基础理论;本研究同时为植物多倍体育种,特别是柑橘砧木抗性和果实品质改良提供了新的基础理论支撑。
[硕士论文] 孙世航
园艺 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:为了进行猕猴桃种质资源抗寒性评价、抗寒性机理探索,本试验以来自不同生态区的猕猴桃种及品种休眠期枝条为试材,建立了猕猴桃抗寒性评价方法体系,并对收集保存的种质资源进行评价。冬季落叶后将发育良好的一年生猕猴桃枝条分别置于低温胁迫处理(-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃),测定相对电导率以及与抗寒性相关的生理生化指标:丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD),通过分析低温下枝条相对电导率、生理生化指标与综合评价结果之间的关系,确定一个适合的抗寒性评价方法,对16个种下51个不同基因型的猕猴桃种质进行评价,获得以下结果:
  1、猕猴桃枝条相对电导率测定方法的改进;猕猴桃休眠期枝条在梯度低温下处理8h,并在去离子水中浸泡2h,能够测得稳定的枝条相对电导率;利用上述改进的电导率方法去评价以下三个基因型的猕猴桃,软枣猕猴桃(Actinidia arguta):‘长江一号’、‘红宝石星’,中华猕猴桃(Actinidia chinensis):‘Hortl6A’,利用相对电导率计算获得的半致死温度与前人的研究结果一致。初步得出,本试验确定的电导法参数,可以对猕猴桃的半致死温度进行确定。
  2、利用上述的相对电导率测定方法评估了9个不同基因型的猕猴桃抗寒性,其中6份为软枣猕猴桃种质,它们分别来源于中国的北部、中部和南部。9个不同基因型共包含软枣猕猴桃(Actinidia arguta):‘长江一号’,‘RB-4’,‘红宝石星’,‘浙江15-10’,‘紫果’;对萼猕猴桃(Actinidia valvata):‘中砧一号’;美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)品种‘布鲁诺’;中华猕猴桃(Actinidia chinensis)‘Hortl6A’。9个基因型的休眠期枝条相对电导率均随温度的降低呈现“S”型曲线变化,结合Logistic方程得出不同基因型的猕猴桃半致死温度介于-14.78℃~-35.53℃之间,其抗寒性强弱依次为‘长江一号’>‘牡丹江软枣’>‘RB-4’>‘红宝石星’>‘中砧一号’>‘浙江15-10’>‘紫果’>‘布鲁诺’>‘Hort16A’。
  3、根据不同基因型猕猴桃的平均隶属度确定抗寒强弱顺序为:‘长江一号’>‘牡丹江软枣’>‘RB-4’>‘中砧一号’>‘红宝石星’>‘浙江15-10’>‘紫果’>‘布鲁诺’>‘Hort16A’。
  4、综合评价的结果与电导率评价的结果基本一致,只在‘中砧一号’和‘红宝石星’两个基因型之间有细微差异,且两者的评价结果相关性为0.877,用相对电导率的方法代替综合评价的方法去评价抗寒性得出:同一种内(软枣猕猴桃)的猕猴桃,随着分布位置纬度的增高,猕猴桃的抗寒性也逐渐升高;不同种间的猕猴桃,来自北方的软枣、狗枣、葛枣类猕猴桃,抗寒性要强于中华猕猴桃和美味猕猴桃;美味猕猴桃和中华猕猴桃由于其分布区域存在重叠的现象,所以两者的抗寒性差异不大。
[硕士论文] 高菲
环境科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:硒是人体的必需营养元素,农产品硒含量的增加对于人体健康水平的提高以及特定疾病的预防具有重要意义。本项目采用大田区组试验,分别研究外源硒肥对西瓜、罗汉果和砂糖桔果实硒和镉含量以及其它品质指标的影响,旨在为开展优质高效富硒降镉瓜果的生产提供参考和理论依据。主要研究结果如下:
  1.研究了基施不同剂量硒肥(0.26、0.51、1.03kg/hm2)和不同时期(花期、坐果期)叶面喷施硒肥处理对西瓜硒含量和品质及抗氧化系统的影响,以探讨适宜的西瓜硒肥施用方式。结果表明,所有处理西瓜果肉硒含量为0.014~0.106mg/kg,均达到了湖北省果蔬富硒标准(硒含量>0.01mg/kg)。基施和花期喷施硒肥均提高了果肉中硒的含量,其中基施硒肥处理较对照组提高了63%~282%、花期喷施提高了9%,所有处理中基施0.26kg/hm2硒肥处理果肉硒含量最高。施用硒肥还显著提高了西瓜果肉可溶性糖的含量(P<0.05),且坐果期喷施显著高于基施和花期喷施处理。基施低剂量(0.26kg/hm2、0.51kg/hm2)的硒肥、以及叶面喷施硒肥均可以提高西瓜抗氧化的能力,显著降低叶片丙二醛含量。综合考虑,西瓜硒肥适用方式为基施亚硒酸钠0.26kg/hm2。
  2.研究了基施(G)、基施与叶面喷施混施(G+Y20)以及不同浓度叶面喷施(Y40+40、Y20+20、Y40)硒肥处理对罗汉果果实中硒、镉及其它营养元素的含量和分布,以及果肉维生素C含量的影响。结果表明,罗汉果中的硒主要分布在果肉和籽粒中,在果皮中分布较少。施用硒肥显著提高了罗汉果中硒的含量(P<0.05)、其含量是对照组的1.6~21.6倍,其中G、G+Y20、Y40三个处理罗汉果硒含量满足湖北省干果类富硒标准(硒含量在0.1~0.5mg/kg范围内)。所有处理罗汉果中的镉含量均满足湖北省水果及其制品的镉污染限量要求(镉含量<0.05mg/kg),且G、G+Y20、Y40处理进一步降低了罗汉果中镉的含量(P<0.05)。但是,外源硒肥的施加也显著降低了罗汉果中铁的含量、以及果肉中维生素C和可溶性糖的含量。
  3.研究了基施(G)和叶面喷施一次(Y40)和两次(Y20+20)砂糖桔果肉硒、镉、铁、锌含量及营养品质的影响。结果表明,施用硒肥有增加砂糖桔果肉中硒含量的趋势,但与对照组相比差异未达到显著水平(P>0.05)。施用硒肥降低了果肉中镉的含量,较对照组降低了29.6%~50.3%。施用硒肥对果肉中可溶性糖和可溶性固形物的含量无显著影响(P>0.05),但基施处理显著提高了果肉中铁、维生素C及可滴定酸度的含量(P<0.05)。
[硕士论文] 张小双
果树学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:中国是梨的起源中心和主要的多样性中心之一,且梨属植物被认为是第三世纪起源于中国西部和西南山区。梨树在中国已有3000多年的栽培历史,在中国主要水果中其栽培面积和总产量均排第三。根据梨种质资源的原生地理分布,可划分为东方梨和西方梨两种。中国作为东方梨主要原产地之一,具有丰富的种质资源,且现已经定名的梨属植物有13个种。面对如此多的梨种质资源,进行种质鉴定和亲缘关系及种群结构分析,不仅对梨种质繁育具有重要的意义,也是保护这些种质知识产权的需要。SSR标记具有数量多、多态性丰富、共显性遗传、特异性强、出现频率高、重复性好和操作简便等优点,有利于构建分子身份证、亲缘关系分析和种群结构分析等的研究。
  本试验选取294份梨种质材料,包括137份白梨、57份秋子梨、25份砂梨、19份新疆梨、43份杂交品种、1份川梨、3份杜梨、1份河北梨、2份褐梨、4份木梨和2份西洋梨,利用SSR分子标记技术进行亲缘关系及种群结构分析,并构建种质分子身份证。主要试验结果如下
  1、利用17对荧光标记SSR引物对294份梨种质进行扩增,获得400个等位基因,每个位点扩增的等位基因数从15-35个不等,平均为23.5个,片段长度63-364bp,位点期望杂合度在0.710-0.904,表观杂合度为0.418-0.833,香农信息指数为1.697-2.707。引物可区分供试梨种质的数量从42份到103份不等,平均每对引物可区分种质数量为72份,区分率为14.3%-35.0%,平均区分率为25.6%。
  2、构建了294份梨种质的分子身份证和条形码标识。聚类分析在相似系数0.871处,294份梨种质聚为四个组,与地理位置相关,除了‘绥中谢花甜’和‘粉红宵’,均能将其他种质材料区分开,其中‘南果梨’的芽变品种‘南果4号’和‘大南果’,‘尖把’与其芽变品种‘尖把王’,及‘秋子’与其芽变品种‘甜秋子’也均被区分开。SSR标记可以区分梨的芽变品种,可用于梨种质的鉴别和保护。
  3、中国西部地区的梨种质亲缘关系较近,梨种质的亲缘关系与地理位置相关。白梨的遗传背景明显区别于别的种群,分为两种类型,即华北平原地区的白梨和燕山山脉附近的白梨。新疆梨的遗传关系与西部地区的梨种质亲缘关系较近。野生秋子梨与栽培秋子梨具有不同的遗传背景,亲缘关系较远。
  4、‘库尔勒香梨’是具有燕山山脉附近白梨、野生秋子梨和栽培秋子梨基因渗透的新疆梨品种,‘铁皮’、‘红密’和‘费县红梨’应归类为白梨,白梨也具有褐皮的品种。‘苹果梨’是具有白梨基因渗透和秋子梨基因渗透的品种,‘野梨1’和‘野梨2’应该归类为白梨。
[博士论文] 耿晶晶
果树学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子(TF)是植物最大的基因家族之一,广泛参与植物生长发育的多种生理过程,包括生物和非生物胁迫应答。目前,虽然在一些植物中已经鉴定出了bHLH基因并进行了研究,但主要集中在模式植物;大多数非模式植物,尤其是多年生果树bHLH转录因子所发挥的生理作用以及调控功能仍然不清楚。基于甜橙(Citrus sinensis)全基因组数据库信息,我们在全基因组水平上发掘甜橙bHLH家族基因,筛选低温响应的成员,并对受低温诱导最明显的一个成员CsbHLH18的功能与作用机制进行了研究。得到的主要结果如下:
  1、从甜橙中共鉴定出56个非冗余的bHLH家族候选基因,分别命名为CsbHLH1-CsbHLH56。除4个成员外,其他的Csb HLHs基因以不同密度不同数量分布于甜橙的9条染色体上。甜橙CsbHLHs分为19个亚家族,相同亚家族成员之间具有类似的基因结构和DNA结合特性。
  2、对CsbHLHs响应低温处理的表达模式进行分析,结果表明,大多数甜橙bHLH基因会响应冷胁迫,但呈现出不同的表达模式,所有低温响应成员中表达上调最强烈的是CsbHLH18。CsbHLH18全长783bp,编码260个氨基酸,相对分子质量和等电点分别为28.92kDa和7.09。CsbHLH18定位于细胞核,并具有转录激活活性且激活结构域位于N端。
  3、为验证CsbHLH18的抗寒功能,通过农杆菌介导获得了超表达CsbHLH18的烟草与柠檬转基因植株。低温胁迫下,烟草转基因植株生长状态比野生型好,有更高的存活率、光合能力及脯氨酸含量,但活性氧(ROS)含量及电导率降低。同样,柠檬转基因株系在低温处理后叶片萎蔫程度轻于野生型,电导率、MDA(丙二醛)及活性氧含量显著降低,但SOD、POD及CAT三种抗氧化酶活性及基因表达量明显增加。通过RNAi技术获得枳bHLH18被干涉的转基因系,发现干涉系比野生型对低温更敏感,低温处理后干涉系相关生理指标及基因表达的趋势与超表达系相反。
  4、SOD、POD及CAT三个基因启动子分别有3、8、4个潜在的E-box元件,酵母单杂交发现CsbHLH18只与POD基因启动子上的E-box元件结合,EMSA吸双荧光素酶活性检测表明CsbHLH18可以特异结合并激活CsPOD启动子。此外,CsbHLH18与CsICE1互作,后者能结合CsSOD及CsCAT基因启动子上的E-box元件。上述结果表明CsbHLH18通过直接或间接调控抗氧化酶基因的表达调节ROS稳态,最终在增强植物抗寒性方面发挥功能。
  5、对低温处理前后的柠檬野生型和超表达系进行RNA-Seq,结果发现低温处理后富集在植株激素信号传导途径的差异基因数量最多且富集程度最显著,同时在淀粉蔗糖合成途径也有一定数量差异基因的富集,说明C sbHLH18增强植物抗寒性的作用机制可能与这些途径相关,但具体的作用方式还需进一步的实验验证。
[硕士论文] 李晓兰
植物营养学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:城郊农业是我国现代农业的重要板块,近年来由于城郊工业化推进、化肥不合理施用等原因导致城郊蔬菜重金属污染及硝酸盐含量过高问题比较突出,这不仅大大降低蔬菜的品质和安全,同时这些污染物也会通过食物链积累危害人体健康。本文依托武汉市典型城郊蔬菜种植区,以常见蔬菜品种为研究对象,通过盆栽试验和田间试验探究减少30%无机肥施用量和配施有机肥前提下配施DMPP(3,4-二甲基吡唑磷酸盐)和甲壳素对蔬菜硝酸盐和Cd含量的影响,旨在为解决城郊蔬菜硝酸盐含量过高和Cd污染提供理论依据。主要结果如下:
  1.与推荐施肥相比,减少30%化肥施用量可显著降低蔬菜中硝酸盐含量,其中叶菜类蔬菜和果菜类蔬菜降幅分别为16.75%和25.52%,蔬菜产量分别降低14.02%和1.4%;蔬菜中可溶性糖与Vc含量随施肥量减少而降低,可溶性蛋白含量无显著变化;叶菜中N、K吸收量随施肥量减少显著降低,但果菜中N、P、K吸收量变化不显著;化肥施用量减少30%,对土壤基本理化性质无影响,但能提高N、P、K肥利用率至少3个百分点。
  2.减少30%化肥施用量时,单施及配施DMPP和甲壳素,蔬菜中硝酸盐含量显著降低了23.49%-55.36%,降低效果为DMPP+甲壳素>DMPP>甲壳素;DMPP和甲壳素单施及配施对叶菜类蔬菜产量影响不显著,但可显著提高果菜类蔬菜产量,其中DMPP处理果菜类蔬菜增产率最大为34.23%。DMPP和甲壳素单施或配施均能改善土壤性能,提高土壤有机质含量,虽有降低叶菜类蔬菜氮磷钾的吸收量的趋势但可显著增加果菜类蔬菜氮、磷、钾吸收量(除DMPP处理外);DMPP与甲壳素配施果菜类蔬菜当季N、P、K肥利用率分别提高了15.64、7.63、19.51个百分点。
  3.推荐施肥时,DMPP和甲壳素单施及配施,蔬菜硝酸盐含量降低了9.86%-49.86%,降低效果为DMPP+甲壳素>DMPP>甲壳素,蔬菜Cd含量降低了9.2%-30.22%;蔬菜增产率为果菜类蔬菜>叶菜类蔬菜,其中甲壳素在叶菜类蔬菜上应用效果最优,增产率为19.66%,DMPP+甲壳素在果菜类蔬菜中应用效果最显著,增产率为64.79%。DMPP和甲壳素单施及配施均能改善蔬菜Vc、可溶性蛋白与可溶性糖含量(除果菜中可溶性糖外);DMPP和甲壳素单施及配施均能提高土壤有机质含量,促进土壤速效养分的释放,显著提高蔬菜NPK积累量及N、P、K肥肥料利用率,其中果菜类蔬菜当季肥料利用率增幅大于叶菜类蔬菜。
  4.配施有机肥,蔬菜硝酸盐和Cd含量降幅分别为4.5%-24.1%和12.95%-22.59%,蔬菜Vc、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有增加的趋势。配施有机肥叶菜类蔬菜产量提高了5.62%,蔬菜氮、磷、钾吸收量、土壤中速效氮、磷、钾含量及有机质含量均有上升趋势,并且使用有机肥,使N、P、K肥当季利用率提高了5.65个百分点。
  5.配施有机肥时,DMPP和甲壳素单施及配施,蔬菜中硝酸盐和Cd含量分别降低了11.5%-52.6%和17.95%-41.35%,DMPP+甲壳素处理降低蔬菜硝酸盐含量显著优于单施处理,但DMPP+甲壳素在果菜类蔬菜上降镉效果最优,甲壳素处理在叶菜上的降镉效果最优;DMPP和甲壳素配施及单施,均能改善蔬菜品质,提高土壤中有机质等养分含量,提高了氮磷钾肥当季利用率,其中以DMPP和甲壳素配施处理试验效果最优,N、P、K肥当季利用率分别提高了34.64、13.77、52.83个百分点。
  综上所述,减量施肥和配施有机肥时应用DMPP和甲壳素,可同时降低蔬菜中硝酸盐和Cd积累,改善蔬菜品质,提高肥料当季利用率,促进城郊蔬菜安全生产。
[硕士论文] 刘明磊
蔬菜学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的园艺蔬菜作物,辣椒对不同农业气候有很强的适应性,广泛种植于世界各地。辣椒果实中维生素C、维生素A、维生素B6含量丰富,是人们膳食营养的重要组成部分。辣椒果实的形状、大小、色泽、口味丰富多样,这种多样性使其成为果实发育生物学研究的一个重要模型。辣椒与其他茄科植物相比基因组庞大(约3.3Gb)且重复序列占比高(81%)、病毒诱导的基因沉默困难、遗传转化体系不成熟,种种原因致使辣椒相关研究进展缓慢。此外,缺乏一个综合性的辣椒生物信息平台也在一定程度上阻碍了辣椒组学的研究。
  基于前人的研究成果和本研究团队新的测序数据及其分析结果,本研究构建了PepperHub辣椒组学生物信息平台,其主要研究成果如下:
  1.下载已公布的CM334辣椒和Zunla辣椒的基因组序列和基因注释文件,组装并注释pacbio三代重测序得到的“6421”株系辣椒基因组数据,利用GBrowse基因浏览器可视化各组数据,结合本地安装的BLAST工具和建立的辣椒文库共同构建Gemome模块。
  2.处理分析测序得到的根、叶、花、果实在不同发育时期的转录组数据和根、叶喷施脱落酸、赤霉素等生长调节剂或高盐、低温等逆境处理后的转录组数据。基于分析后的数据,利用Perl语言、R语言编写脚本展示基因在各个组织的不同发育时期的表达状况和基因在喷施生长调节剂后和不同非生物胁迫下的表达状况,比较基因在各个组织的不同发育时期的表达差异和基因在喷施生长调节剂后和不同非生物胁迫下的表达差异,构建某一基因与其相关基因的共表达网络。
  3.利用已发表的辣椒sRNA数据库和miRNA列表编写sRNA注释文件和miRNA注释文件,并用GBrowse可视化不同辣椒sRNA和known miRNA、novel miRNA在基因组中的分布。同时构建miRNA靶基因数据库,检索特定名称、特定序列的miRNA在辣椒基因组中的靶基因。
  4.分析处理辣椒基因组重测序数据,找出辣椒基因组的SNP和InDel位点,并用其生成注释文件。用GBrowse读取注释文件,可视化SNP和InDel位点。建立SNP、InDel数据库,查询特定区域的SNP、InDel位点。
  5.使用HTML、CSS、JavaScript、Perl等工具和语言将各个功能模块整合成一个综合性辣椒生物信息平台——PeperHub。
[硕士论文] 张祺恺
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是世界范围内重要的园艺作物,枯萎病和根腐病等土传病害是限制西瓜产业发展的瓶颈,采用嫁接可提高西瓜对土传病害的抗性。南瓜是适合西瓜嫁接的砧木材料,但目前对砧用南瓜的资源评价和利用研究尚不够深入。本课题对南瓜资源的耐旱性和根腐病抗性进行鉴定,以期筛选出优异的种质资源,为进一步砧木选育奠定基础。针对部分南瓜作为砧木嫁接后导致西瓜果实品质下降的问题,本课题选用对嫁接西瓜果实品质影响较小和较大的南瓜砧木材料,以西瓜自交系97103为接穗,以自嫁为对照,通过对果实膨大停止期和商品成熟期的果肉样品的转录组和代谢组进行分析,来研究不同砧木对嫁接西瓜果实品质形成的影响,获得的主要结果如下:
  1.对不同南瓜种质一叶一心时期的性状进行评价。以126份南瓜种质为材料,包括33份中国南瓜(C.moschata),93份印度南瓜(C.maxima)。以2份商业砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’作为对照,进行南瓜种质资源嫁接适宜时期(一叶一心时期)的性状调查与评价,发现27份材料下胚轴长度较商业砧木等同或更短;大部分南瓜种质资源材料都具有与商业砧木同等茎粗或大于商业砧木,仅有13份材料下胚轴茎粗较细;31份材料具有比对照商业砧木更大的子叶展开角度;9份材料具有与商业砧木相似的子叶叶绿素相对含量;18份材料具有与商业砧木类似大小的子叶长宽积。
  2.对不同南瓜种质资源的耐旱性进行评价。选用94份南瓜种质为材料,包括29份中国南瓜(C.moschata),63份印度南瓜(C.maxima),以及2份商业砧木‘青研1号’和‘京欣砧4号’,对材料进行耐旱性鉴定。幼苗3叶1心期时进行干旱处理,计算干旱胁迫指数、株高胁迫指数、茎粗胁迫指数和干物质胁迫指数,使用UPMGA法(非加权算数平均法)对所得结果进行聚类分析,将南瓜种质资源按耐旱等级分为6类。18份材料属于最耐旱材料;14份材料为次耐旱类材料;13份材料为较耐旱类材料;7份材料为最不耐旱材料;24份材料为次不耐旱类材料;18份材料为较不耐旱材料。
  3.对不同南瓜种质资源的根腐病抗性进行评价。选用45份南瓜种质资源为材料,包括25份中国南瓜(C.moschata),18份印度南瓜(C.maxima)和2份商业砧木‘青研1号’(C.maxima×C.moschata)和‘京欣砧4号’(C.maxima×C.moschata)。使用孢子悬浮液蘸根法对南瓜种质材料进行根腐病抗性鉴定,经过对病害的分级统计及病情指数计算,筛选出R7S11-4、R7S20、R7S82等19份高抗根腐病材料和R7S21-1、R7S28-2、R7S06等26份中抗根腐病材料。
  4.研究不同南瓜砧木对嫁接西瓜果实的影响。以10份南瓜材料为砧木与97103嫁接,筛选出2份对西瓜果实品质影响具有差异的材料。发现L12为砧木嫁接后对西瓜果实品质无显著影响,L9嫁接后显著降低西瓜果实可溶性固形物含量,嫁接组合L12/97103的西瓜果实中的果糖含量和葡萄糖含量显著高于嫁接组合L9/97103的西瓜果实,而苹果酸含量显著低于后者。
  5.研究L9和L12砧木在转录水平对西瓜果实品质的影响。南瓜砧木L9在转录水平影响了嫁接西瓜果实的柠檬酸代谢、果糖与甘露糖代谢和蔗糖与淀粉代谢途径,导致西瓜果实品质变差,而L12并未在以上途径对西瓜果实产生影响,所以对西瓜果实品质无影响。
  6.研究L9和L12砧木在代谢水平对西瓜果实品质的影响。南瓜砧木L9影响了西瓜果实果糖与甘露糖代谢与柠檬酸循环,导致西瓜果实品质变差,而L12在代谢水平仅在柠檬酸代谢上对西瓜果实产生影响,所以对西瓜果实品质无显著影响。
[硕士论文] 朱文召
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:病害是制约番茄生产的最重要因素之一,其中青枯病被称为番茄上的癌症,在长江流域及华南地区尤为盛行,并逐步向北发展,给我国番茄生产造成较大影响。青枯病防治极为困难,各种传统防治措施均无太大效果。实践证明,培育综合性状优良的抗青枯病番茄新品种是防治青枯病最有效的途径。
  本课题采用传统的人工接种鉴定技术,结合分子标记技术、农艺性状统计及田间观察,对本课题组现有的抗青枯病自交系进行筛选,选育出主要经济性状优良、青枯病抗性较强且稳定、兼抗其他多种常见病害的番茄自交系;然后利用所选育的自交系与其他综合性状优良的自交系配制杂交组合,通过组合比较试验,选育出青枯病抗性强且稳定,兼抗其他多种病害、生长势强、果形好、耐储运、产量高的优良番茄杂交组合,通过对各组合及其双亲各性状的分析,为今后抗青枯病杂交组合的配制提供信息。主要研究结果如下:
  1.自交系的筛选:以本课题组经多年田间筛选的青枯病抗性表现较好的27份自交系为材料,进行连续三代自交,对各代自交系进行人工接种鉴定,结合主要抗病基因检测、农艺性状调查分析及田间观察,并结合2017年春秋两季杂交组合性状分析选育出青枯病抗性较强且经济性状优良的自交系4个,另有10个自交系基本符合育种要求。
  2.杂交组合的选育:利用上述自交系与其他综合性状优良的自交系配制杂交组合,参与2017年春季和秋季的组合比较试验。两季参试组合共计140个,通过品种比较试验,对各组合进行综合考察和分析,最终筛选出9个青枯病抗性较强且在抗病性、生长势、果形、硬度、产量等方面表现优良的杂交组合。
[硕士论文] 刘越
设施园艺学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:西瓜(Citrullus lanatus)是世界范围内广泛种植的重要园艺作物,在早春露地栽培以及反季节设施栽培中常常遭遇低温胁迫。研究西瓜在低温胁迫下的基因表达模式,鉴定差异表达基因的功能,有助于进一步了解西瓜低温响应及调控机制,为西瓜耐低温遗传改良提供理论支撑和基因资源。WRKY转录因子家族成员数量多且具有重要功能,不仅影响植物生长发育过程,还能够对植物面临的各种胁迫产生响应并发挥调控作用。低温胁迫下的西瓜转录组数据分析结果显示,多个WRKY家族基因的表达模式发生了显著改变,表明WRKY能够响应低温胁迫,但这些基因是否具有调控西瓜耐低温的功能,目前尚不清楚。针对这一问题,本研究在分析西瓜WRKY基因家族特征的基础上,鉴定了2个受低温胁迫诱导显著上调表达的WRKY基因Cla018059和Cla021170的功能,获得了以下研究结果:
  1.西瓜WRKY转录因子家族鉴定和特征分析。利用隐马尔可夫模型,在西瓜基因组上鉴定出57个WRKY转录因子家族成员,根据家族成员在染色体上的位置,依次命名为ClWRKY1~ClWRKY57。蛋白序列比对及系统发生分析表明,57个ClWRKY转录因子中,55个具有保守的7肽WRKYGQK DNA结合结构域,另外2个的WRKY结构域分别为WRKYGKK和KSRKRQV;所有ClWRKY转录因子的锌指结构为C2H2或C2HC类型。根据结构域的数量和锌指结构的类型,ClWRKY家族被分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ族,各有11、39和7个成员。根据蛋白序列的保守性和进化关系,Ⅱ族可进一步分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe族。基因结构分析表明,ClWRKY基因序列长度在0.7kb~7kb之间,主要集中在1kb~3kb。ClWRKY家族成员的外显子含量为2~6个。共线性分析表明,ClWRKY转录因子家族基因中发生了18组复制事件,其中3组是转座复制,15组是片段复制,片段复制是ClWRKY家族基因扩增的主要模式。复制基因的Ka/Ks值均小于1,发生复制的ClWRKY家族基因在进化过程中受到纯化选择。
  2.西瓜ClWRKY转录因子家族基因的表达谱分析。西瓜果实发育转录组数据分析表明,除ClWRKY1外,其余56个ClWRKY基因在果实中均有表达,其中50个在果肉中表达,52个在果皮中表达,54个在种子中表达。低温胁迫处理的西瓜转录组数据分析表明,19个ClWRKY基因受低温胁迫诱导呈现显著差异表达,其中7个下调表达,12个上调表达。显著上调表达的基因中,Cla018059(ClWRKY55)和Cla021170(ClWRKY20)的log2FC值最大,表明其对低温胁迫更敏感。因此本课题对这2个基因进行了进一步的研究。
  3.低温相关西瓜ClWRKY基因的功能鉴定。构建了亚细胞定位表达载体pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY20和pH7LIC5.0-N-eGFP-ClWRKY55并注射到烟草表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜发现ClWRKY20和ClWRKY55均定位于细胞核。构建了ClWRKY20和ClWRKY55的T1代超表达烟草植株OE20和OE55。对转基因植株进行4℃低温处理,通过对表型、冷害指数、相对电导率及丙二醛含量等指标的分析发现,超表达ClWRKY20基因提高了烟草植株的低温耐受性,而超表达ClWRKY55基因增强了烟草植株对低温的敏感性。抗氧化酶系统活性的检测表明,低温胁迫处理后的OE20植株具有更高的SOD、POD和CAT活性,表明ClWRKY20可能是通过提高植株的抗氧化能力来提高低温耐受性。OE55植株的SOD、POD和CAT活性均低于野生型植株,表明ClWRKY55可能通过削弱抗氧化能力来降低植株的低温耐受性。
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