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[硕士论文] 赵志峰
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:近年来,干细胞治疗在相关疾病中已经进入临床试验阶段,但免疫排斥现象如影随从,是干细胞治疗技术的绊脚石。半乳糖凝集素1(Galectin-1,GAL-1)在大多数间充质干细胞、多数肿瘤及鹿茸干细胞中被发现高表达,而相应的这些细胞中均出现免疫抑制现象。GAL-1作为免疫调控因子,推测其很可能参与了干细胞的免疫调控。
  鹿茸是唯一能够在失去后还能完全再生的哺乳动物器官。研究表明,鹿茸再生是一个基于干细胞的过程,鹿茸干细胞中高表达GAL-1基因,推测其是鹿茸再生中的一个重要调控因子。为研究GAL-1在鹿茸干细胞中的表达及可能的生物学功能,本论文以东北梅花鹿鹿茸的干细胞组织,即生茸区骨膜和角柄骨膜(致敏角柄骨膜与休眠角柄骨膜)以及对照组织面部骨膜为研究材料,克隆了梅花鹿的GAL-1基因CDS区序列,利用软件或网站,对GAL-1蛋白进行生物信息学分析;利于Western-blot及Q-PCR技术检测了GAL-1在鹿茸干细胞中的相对表达量。结果显示:梅花鹿GAL-1ORF全长为408bp,编码134个氨基酸;相对分子质量为14.69KDa,氨基酸序列与牛羊高度接近(95%>);主要定位于细胞外,无跨膜区,无糖基化位点,可能有两个磷酸化位点,二级结构主要为β-折叠与无规卷曲;三级结构与牛的结构相似;GAL-1在面部骨膜中表达量更高。本研究预测了梅花鹿GAL-1蛋白的结构特点,检测了GAL-1蛋白在鹿茸干细胞中的表达情况,为进一步研究鹿茸再生提供数据支持。
  鹿茸生茸区骨膜干细胞被归类为一种间充质干细胞,是鹿茸发生的基础。GAL-1蛋白在生茸区骨膜干细胞中发生异常表达。为探究GAL-1基因在干细胞中的具体功能,本实验采取了RNAi技术,经Q-PCR,Western-blot测定干扰效率约为62%。通过PI法与CCK8法分别检查细胞周期和增殖;Q-PCR检测IL-6和CMYC的表达量;与CFSE染色的外周血淋巴细胞共培养4d后,显微镜下观察并用流式细胞仪检测。结果干扰后的细胞S期占比上升,G1期占比下降;细胞增殖速度加快;IL-6被上调约1倍,CMYC被上调约5倍;淋巴细胞分裂速度加快。这表明干扰后,细胞中GAL-1含量降低,导致大部分细胞进入分裂期,分裂速度加快。IL-6和CMYC等免疫相关因子被上调,刺激免疫细胞活化增殖。推测GAL-1是鹿茸再生过程中细胞增殖与免疫调控的关键抑制因子。
[硕士论文] 郝丽媛
养殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:本研究向新生犊牛日粮中添加氧化锌或蛋氨酸锌,探究不同锌源对新生犊牛生长性能、腹泻情况、免疫功能、血液指标、锌代谢及直肠微生物的影响。为低剂量锌在犊牛生产中合理应用提供理论依据。具体内容如下
  试验一 探究不同剂量氧化锌对新生犊牛生长性能、腹泻情况、血清和粪便中锌含量的影响,筛选最佳剂量。试验选取30头新生荷斯坦母犊牛,随机分成5组,每组6头牛。每组每头牛每天分别添加0、26、52、104和156mg氧化锌(分别相当于0、20、40、80和120mg锌)。试验进行至犊牛出生后14天结束。结果表明.(1)日粮添加锌对犊牛生长性能没有显著影响,舔加80mg/d锌显著降低了犊牛腹泻率(P<005)。(2)日粮添加80mg/d锌时,犊牛血清中锌含量最高。(3)日粮补锌导致犊牛粪便中锌含量呈线性升高(P<001)。
  试验二 探究氧化锌和蛋氨酸锌对犊牛生长性能、腹泻情况、血液激素和免疫功能的影响。试验选取36头新生荷斯坦母犊牛,随机分成3组,每组12头。处理一无舔加(对照组),处理二每头每日添加457mg蛋氨酸锌(相当于80mg锌),处理三每头每日添加104mg氧化锌(相当于80mg锌),试验进行至犊牛出生后14天结束。结果表明(1)与对照组相比,添加蛋氨酸锌显著提高了犊牛平均日增重(P<005),同时降低了腹泻率(P<005)。(2)不同锌源均可显著降低血清中胰岛素的含量(P<005)。(3)与氧化锌组相比,蛋氨酸锌组犊牛血清中类胰岛素生长因子-1含量有升高趋势(005≤P<01)。(4)氧化锌组犊牛血清中IgG和IgM含量显著高于对照组(P<005)。
  试验三 探究犊牛日粮中添加氧化锌或蛋氨酸锌对锌代谢情况的影响。试验设计同试验二,采集14日龄犊牛的粪便和血液样品,采用电感耦合等离子体质谱法测定其锌及其他矿物元素的含量,并测定血清中锌代谢相关酶含量。结果表明(1)日粮中添加不同锌源可以显著增加犊牛血清中锌含量(P<001),氧化锌组犊牛血清锌含量介于蛋氨酸锌组和对照组之间。(2)日粮添加不同锌源对粪便锌含量没有显著影响(P>005)。(3)犊牛日粮中添加不同锌源对血清中锌代谢相关酶均没有显著影响(P>005)。
  试验四 探究日粮不同锌源对新生犊牛直肠微生物的影响。试验设计同试验二,在犊牛出生后1、3、7和14日龄时采集直肠内容物样品,采用高通量测序技术测定直肠微生物多样性。结果表明(1)不同日龄犊牛直肠微生物群落结构差异显著(P<005)。不同锌源对直肠微生物群落结构没有显著影响(P>005)。(2)不同锌源对犊牛代谢功能没有显著影响(P>005),而犊牛代谢功能随日龄发生了显著变化(P<005)。
  综上所述日粮添加蛋氨酸锌可以提高犊牛生长性能,添加氧化锌可以增强犊牛免疫功能。添加不同锌源均可增加锌吸收。犊牛直肠微生物随日龄发生着显著的变化,且不受日粮加锌所影响。
[硕士论文] 李梓芃
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:为探究影响水牛奶中体细胞数(SCC)的因素和外源褪黑素对杂交水牛卵泡发育及奶中体细胞数降低的作用,本研究根据DHI记录,分析月份和胎次对水牛奶中体细胞的影响,并对乳中体细胞数较高的杂交水牛用不同浓度的褪黑素处理,分析血液中各种生理生化指标和乳中体细胞数,检测卵泡发育情况等,旨在为开发降低夏季水牛奶中体细胞数、提高杂交奶水牛繁殖性能的新技术奠定基础。
  1.月份和胎次对水牛奶中体细胞数的影响
  收集2012~2017年奶水牛的DHI数据,分析胎次和泌乳月份对水牛奶中体细胞数的影响。由于体细胞数的分布频率呈偏态性,因此将体细胞数换算成体细胞评分(SCS)进行分析。
  结果表明:泌乳月份对SCS具有显著影响(p<0.05)。SCS值表现为8月份最高、5月份最低。此外,SCC>40万个/mL的牛群占总体样本量的比例,6~8月最多,其次是冬季。乳中SCS值在胎次(1~3胎)间也有显著差异(p<0.05),随着胎次的升高,奶中体细胞数升高。
  2.皮下注射褪黑素对奶中体细胞评分和血中抗氧化及免疫指标的影响
  选择水牛奶中体细胞数高于50万个/mL的泌乳奶水牛20头,随机分为两组(各10头)。低和高剂量组分别连续4天注射4.68mg和20mg褪黑素,并检测奶样中体细胞数和血浆中抗氧化及免疫指标。
  结果表明:皮下注射褪黑素后,高剂量组奶中体细胞评分显著性低于注射前体细胞评分(p<0.05),但是两种剂量组之间没有显著性差异(p>0.05)。此外,通过观察治疗后第11天的治愈奶水牛数,发现高剂量组恢复亚健康(SCC≤50万个/ml)的杂交奶水牛数比低剂量组高10%。褪黑素处理后能够显著提高血液中MT、SOD和IgM含量(p<0.05)。因此,夏季连续4天皮下注射褪黑素能够显著降低奶中体细胞数,作用机制是通过提高血液中SOD和IgM浓度来增强奶水牛免疫和抗氧化能力。
  3.皮下注射褪黑素对奶水牛卵泡发育的影响
  选择30头奶水牛分成3组,每组10头。T1组每天皮下注射60mg/500kg褪黑素,连续注射3天;T2组一次性皮下注射180mg/500kg褪黑素,对照组注射生理盐水。以第1次注射褪黑素当天为第0天,在第4天注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg,第11天注射氯前列腺素(PGF2α)0.5mg,第13天再次注射促性腺激素释放激素(GnRH)200μg,分别于第二次注射GnRH后进行人工授精。一天两次用B超检测记录卵泡发育情况,且于配种后45天进行妊娠诊断。
  结果表明:在注射褪黑素后,处理组血液中SOD、MT和IgM浓度显著高于对照组(p<0.05)。在注射PGF2α以后,皮下注射褪黑素组的优势卵泡半数生存期(有且只有50%的优势卵泡存活的时间)、卵泡平均发育速率(1.Smm/d和0.7mm/d)大卵泡直径显著大于对照组(p<0.05)。此外,单次注射褪黑素组的排卵卵泡直径、排卵率、大卵泡数量以及受胎率都显著性高于其他组(p<0.05)。因此,用褪黑素皮下注射经产水牛后,均能够产生较高的SOD和IgM水平,两组处理方式结合Ovsynch同期发情方案(GPG)均能促进卵泡的发育和排卵,但单次注射组更能显著性增加排卵卵泡的数量和直径,且提高杂交奶水牛在非繁殖季节的发情、排卵和受胎比例。
[硕士论文] 陈文娟
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:清平猪具有妊娠期短和产仔数多等优良繁殖性状,利用标记辅助选择对繁殖、生长和胴体性状进行选育能有效加快清平猪杂交品系的育种进程。本试验选择了9个候选基因:ESR、FSHβ、PRLR、MC4R、GH、IGF1、NR6A1、FUT1和MUC13,分别对清平猪杂交群体(F1和F2)的繁殖、生长和胴体性状进行关联性分析,以期为生产实践中对清平猪杂交品系的选育提供一些理论依据。本试验的研究结果如下:
  1.F1群体和F2群体的平均妊娠期分别为112.89d和113.36d,总产仔数分别为12.42头和9.98头,清平猪的杂交后代(F1和F2)均具有妊娠期短的优良特性。
  2.FSHβ基因、ESR基因、PRLR基因、IGF1基因和MUC13基因与清平猪杂交后代的关联性:
  (1)两个群体中FSHβ不同等位基因的优势均不明显,不同基因型对F1群体的产活仔数以及F2群体的总产仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重等重要繁殖性状均有显著影响(P<0.05),其对繁殖性状的有利基因型为BB型。
  (2)两个群体中ESR的优势基因均为B等位基因,三种基因型对妊娠期的影响趋势均为AB<AA<BB,对F2群体的妊娠期和木乃伊性状有显著影响(P<0.05)。ESR基因的AB型个体可能具有较短的妊娠期,A等位基因可能会增加每胎木乃伊的数量。
  (3)F1和F2群体中PRLR的优势基因均为C等位基因,不同基因型对F1群体的妊娠期和乳头数(左和右)均有极显著影响(P<0.01),对总产仔数、断奶仔猪数、70日龄存活数和70日龄重均有显著影响(P<0.05),对F2群体的弱仔数、初生重、断奶仔猪重和3周龄重均有显著影响(P<0.05),其有利基因为T等位基因。
  (4)F2群体中IGF1-1位点和IGF1-2位点的优势基因分别为G基因和A基因,两个位点对繁殖性状的有利基因型可能均为AA型。
  (5)MUC13基因的G等位基因在F2群体中优势明显,AG和GG型对背膘厚的影响接近显著水平,对妊娠期、断奶仔猪重和3周龄重的影响均显著(P<0.05),其有利基因型为GG型。
  3.MC4R、GH和NR6A1对F2群体生长和胴体性状的影响:
  (1)MC4R的优势基因为G等位基因,不同基因型对背膘厚差异显著(P<0.05),AA型个体的平均日增重与AG型个体差异显著(P<0.05),与GG型个体差异极显著(P<0.01),其有利基因型为GG型。
  (2)GH的G等位基因优势明显,不同基因型对平均日增重的影响接近显著性水平(P≈0.08),对达100kg日龄的影响差异极显著(P<0.01),其有利基因为G等位基因。
  (3)NR6A1的优势基因为A等位基因,不同基因型对背膘厚的影响差异极显著(P<0.01),其对胴体和生长性状的有利基因分别为A和G等位基因。
  4.F2样本中的FUT1基因暂未检测到TT抗性基因型,呈极端单态分布。其对妊娠期、总产仔数、初生重、断奶仔猪数和3周龄重等繁殖性状的影响趋势均为CT>CC,对达100kg日龄的影响接近显著性水平,其有利基因为T等位基因。
[博士论文] 李俊
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:我国水牛种质资源丰富,既有沼泽型,又有河流型,主要用于耕地和产肉。近年来,随着水牛向乳用方向改良,奶水牛产业得到快速发展。水牛奶营养丰富全面、消化吸收率高,将水牛奶深加工成乳制品,如“乳豆腐”、“奶饼”、“双皮奶”等,深受消费者喜爱,具有广阔的市场前景。然而,尽管我国水牛存栏量多,但水牛产奶量和繁殖力低,目前为止还没有专门的乳用型水牛品种,从而影响奶水牛产业的进一步发展。
  水牛的繁殖性状和泌乳性状均是重要的经济性状,为典型的数量性状。由于遗传力低和影响因素多,通过传统方法选育高繁殖力和高产奶量奶水牛进展缓慢。目前,全基因组关联分析和转录组测序对研究数量性状提供了新的方向。因此,本研究利用全基因组关联分析和转录组测序方法对影响水牛繁殖性能和产奶性能的候选基因进行筛选与鉴定。本研究的目的旨在揭示奶水牛泌乳性能和繁殖性能的分子遗传基础,为提高奶水牛的产奶性能和繁殖性能以及遗传改良提供理论基础。
  1水牛繁殖性状候选基因分析
  本试验分为三个部分。首先利用商业化水牛90K基因芯片(Affymetrix Axiom(@))对462头意大利地中海水牛的头胎产犊日龄、第二胎产犊日龄、第三胎产犊日龄、受精所需输精次数、空怀天数、产犊间隔6个繁殖性状进行全基因组关联分析。繁殖性状原始数据来自于意大利水牛育种评估中心。通过GWAS分析寻找影响水牛繁殖性状的SNP、基因组区域和候选基因。其次利用二代测序技术对四个时期(卵泡直径<5mm,5~8mm,8~12mm和>12mm)的水牛有腔卵泡颗粒细胞进行转录组测序,并进行定性和定量分析。根据GO和KEGG富集分析,寻找影响卵泡发育的候选基因。最后通过整合GWAS结果和转录组测序结果,鉴别影响水牛繁殖性能的关键候选基因,并利用RNAi技术对候选基因IGFBP7在水牛颗粒细胞中进行验证。主要结果如下:
  (1)全基因组关联分析鉴别到与繁殖性状相关的40个SNP和28个候选基因。
  (2)单倍型分析发现在5号染色体的2.3~2.7Mb区域存在一个与水牛繁殖性能相关的QTL区,其中多个SNP主要位于TRHDE基因内和附近的序列上。
  (3)对水牛卵泡颗粒细胞的转录组分析鉴别出17700个基因,其中1076个基因在卵泡发育的不同时期差异表达显著,30个基因在卵泡发育的四个时期有差异表达。差异表达基因数最多的是卵泡发育的最后两个时期。
  (4)差异表达基因在卵泡发育末期主要富集在免疫相关信号通路,提示该时期卵泡为排卵做准备。
  (5)整合GWAS分析结果和转录组测序结果,发现与繁殖性状相关的28个候选基因中有25个基因在卵泡发育不同时期有表达,提示这些基因可能直接参与水牛卵泡发育的调控,从而影响水牛繁殖性能。
  (6)IGFBP7基因在卵泡发育的4个阶段均有较高的表达量。水牛颗粒细胞用RNAi敲低IGFBP7后,增值和凋亡以及雌激素和孕激素的分泌均发生显著的变化。
  2水牛泌乳性状候选基因分析
  本试验分为两个部分。首先对1002头水牛的16个体型外貌指标与产奶量进行回归分析,筛选出与产奶量显著相关的体型外貌指标,并用地中海水牛群体对该指标进行验证。其次,根据获得的体型外貌指标,利用90K Affymetrix Axiom(@)Buffalo SNP Array对176头意大利地中海水牛进行基因分型,质控后,分别与关键体型外貌指标进行全基因组关联分析,寻找与体型外貌指标相关的SNP、候选基因和QTL。主要结果如下:
  (1)通过体型外貌指标与泌乳量的分析,发现乳房性状与产奶量显著相关,乳房性状可做为水牛产奶量的直接或间接指标。
  (2)对水牛前乳头长、后乳头长、前乳头间距、后乳头间距和前后乳距5个乳房性状的全基因组关联分析,共获得10个与乳房性状相关的SNP和5个候选基因,分别是PTPN11、ZNF385B、LRP2、COX18和DTHD1。
  (3)单倍型分析发现一个位于候选基因LRP2内的QTL显著影响水牛的乳房性状。对LRP2进行表达谱分析,发现LRP2在乳腺组织中高表达,推测该基因可能参与调控乳腺的发育以及在泌乳调控过程中参与乳蛋白和乳脂肪的重吸收。
[硕士论文] 孙玲玲
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:本研究通过向饲粮中添加蛋氨酸硒羟基类似物(Hydroxy-analogue of selenomethionine,HMSeBA)或酵母硒(Selenium yeast,SY)来探究其对泌乳中期荷斯坦奶牛血清及乳中硒浓度、生产性能及抗氧化能力的影响,为HMSeBA和SY在奶牛生产中的应用提供科学依据。具体研究内容如下:
  试验一:本试验旨在比较HMSeBA和亚硒酸钠(Sodium selenite,SS)对氧化应激条件下泌乳奶牛血清及乳中硒浓度、生产性能及抗氧化能力的影响。八头经产的泌乳奶牛被饲养在环境控制舱中。试验分3个连续的阶段,协变量期(9d),适应期(28d)和热应激期(9d)。在协变量和适应期,所有奶牛均在热中性条件下饲养;在热应激期,所有奶牛都暴露于循环热应激条件下来建立氧化应激模型。共2个试验处理:SS处理(0.3mg Se/kg DM)或HMSeBA处理(0.3mg Se/kgDM)。试验结果表明:(1)HMSeBA组奶牛血清及乳中硒浓度和乳中硒/血中硒的比例均显著高于SS组(P<0.05);(2)HMSeBA组奶牛与SS组相比,产奶量有升高的趋势(P<0.1),乳脂产量显著降低(P<0.05),其它生产性能指标未受硒源的影响(P>0.05);(3)HMSeBA组奶牛血清中谷丙转氨酶的水平显著低于SS组(P<0.05),其它血液生化指标未受硒源的影响(P>0.05);(4)谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活力未受硒源影响(P>0.05),但HMSeBA组总抗氧化能力显著高于SS组(P<0.05),丙二醛、过氧化氢和一氧化氮的浓度显著低于SS组(P<0.05)。
  试验二:本试验旨在探究饲粮中添加不同水平SY对泌乳奶牛血清及乳中硒浓度、生产性能及抗氧化能力的影响。采用完全随机试验设计,选取36头胎次、泌乳日龄及产奶量相近的奶牛,随机分为3组,每组12头,各组硒的添加量分别为0(对照)、0.5mg/kg DM及5mg/kg DM。预试期14d,正试期56d。结果表明:(1)血清及乳中硒浓度均随SY添加水平的提高显著升高,线性及二次均显著(P<0.01,P<0.01),(2)干物质采食量、产奶量及乳成分未受SY添加的影响(P>0.05),但体细胞数随着SY添加水平的提高呈线性降低(P<0.05);(3)胆碱酯酶活性随着SY添加水平的提高呈线性降低(P<0.01),其它血液生化指标未受SY添加的影响(P>005);(4)随SY添加水平的提高,谷胱甘肽过氧化物酶活性(P<0.01)及总抗氧化能力(P=0.01)呈线性升高,丙二醛含量有线性降低的趋势(P<0.1),超氧化物歧化酶活性未受SY添加的影响(P>0.05)。
  综上所述:在奶牛饲粮中添加03mg/kg DM HMSeBA,与同等剂量SS相比,可以更有效地提高血清及乳中硒浓度及奶牛的抗氧化能力,一定程度上改善了氧化应激状态下奶牛的产奶量。泌乳中期奶牛对5mg/kg DM SY有一定的耐受性,且较0、0.5mg/kg DM SY添加水平显著提高奶牛乳中硒浓度及抗氧化能力。
[博士论文] 刘会敬
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:猪是肉类蛋白的主要来源,同时,也可作为研究人类健康问题的重要医学模型。骨骼肌是动物体内最丰富的组织,因此研究猪骨骼肌的生长发育对肉质生产科学和人类医学都具有重大意义。本研究以生长速度和肉质性状存在显著差异的约克夏猪和通城猪作为研究对象,采用RNA-seq技术,探索了妊娠期40,55,63,70和90天两猪种胚胎背最长肌差异表达基因不同的时序性表达规律,推测了两猪种间肌纤维发育差异的时间拐点,在此基础上探究中外猪种在妊娠时期胚胎骨骼肌发育的分子调控机理;使用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术,检测了妊娠期55天两猪种胚胎背最长肌的差异甲基化图谱,分析了两猪种差异DNA甲基化对肌纤维发育的调控;并对转录组测序数据和全基因组重亚硫酸盐测序数据进行了联合分析,分析了DNA甲基化对两猪种肌纤维发育过程中差异表达基因的调控作用,主要研究内容和结果如下;
  1.利用RNA-seq技术获得了通城猪和约克夏猪妊娠5个时期的胚胎背最长肌的转录组表达谱,并利用荧光定量PCR验证了测序结果的可靠性。在通城猪和约克夏猪分别筛选到1317个和691个差异表达基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分别对上述通城猪和约克夏猪的发育依赖的DEGs进行时序性分析,发现了在两个猪种中都显著富集到的表达模式0,39,20和21,表达模式10,11,13和25只在通城猪中显著富集,表达模式14和15只在约克夏猪中显著富集。分别对通城猪和约克夏猪的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,结果发现两猪种共同表达模式39显著富集的GO条目中均发现了多个与肌肉生长发育相关的GO条目;共同表达模式0显著富集的GO条目中均发现了多个与细胞周期相关的GO条目。通路富集分析结果显示,通城猪和约克夏猪差异表达基因富集的前10条通路中有8条是两猪种共同富集到的,但富集程度不同。这些结果说明妊娠时期胚胎的背最长肌的发育机制在两猪种中有相似之处,又存在一定的差异。
  2.对两个猪种分别在5个时期的基因表达进行差异比较分析,总共获得了1677个差异表达基因。5个比较组中,妊娠55天的差异表达基因最多。对两个猪种间的差异基因进行GO和KEGG通路功能注释及富集分析,发现黏着斑(Focal adhesion),细胞外基质受体互作(ECM-receptor interaction),氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8条显著富集的通路。然后,对两猪种间差异表达基因进行蛋白互作网络分析,发现PTEN,EP300,MYO9A,CDK14,IRS1,PPP1CC和一些核糖体蛋白基因可能对揭示两猪种胚胎肌肉发育差异有重要作用。
  3.通过ASprofile软件分析,发现第一个外显子可变剪切(TSS)和最后一个外显子可变剪切(TTS)事件是两猪种中最主要的可变剪切类型。
  4.本研究通过WGBS技术构建了通城猪和约克夏猪在妊娠55天时胚胎背最长肌全基因组DNA甲基化图谱,并揭示了其DNA甲基化特征;CG双核苷酸甲基化是两猪种基因组DNA甲基化的主要方式,只有极少部分DNA甲基化发生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中,CG位点甲基化水平在内含子和3,UTR中的DNA甲基化水平较高,而非CG位点甲基化水平在CGI区域最高。
  5.通过WGBS技术,通城猪和约克夏猪之间获得了211822个差异甲基化区域(DMR),涉及到了12261个差异甲基化基因(DMG),其中在通城猪中差异高甲基化的有36582个DMR,涉及到DMG个数为5301;在约克夏猪中差异高甲基化的DMR为175240个,涉及到DMG为11746个。对两猪种的DMGs进行GO和KEGG通路功能注释和富集分析,发现在CG、CHG、GHH三种不同序列环境下的DMGs都显著富集到多个GO条目;KEGG通路富集分析发现非CG序列环境下的DMGs均显著富集到多条通路,而CG序列环境下的DMGs只显著富集到磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidyhnositol signaling system)。通过WGBS技术,鉴定到启动子区域的DMR为5946个,涉及到DMG为4578个。对启动子区DMGs进行GO和KEGG通路富集分析,发现只有CHH序列背景下的DMGs显著富集到了GO条目,但是在三种序列背景下的DMGs主要富集到的GO条目中有一些与肌肉发育相关GO条目;在三种序列背景下的DMGs都没有显著富集到通路,但主要富集的通路中都有核糖体(Ribosome),这表明核糖体通路中基因启动子甲基化可能会调控肌肉的发育。
  6.对转录组测序数据与全基因组甲基化测序数据进行联合分析,通过在整体水平上分析DNA甲基化水平与基因表达水平的相关性,发现两猪种在基因转录起始位点上游2kb及基因本体靠近转录起始位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈负相关;基因本体靠近转录终止位点区域中DNA甲基化水平与基因表达水平呈正相关。检测到同时是DMG又是DEG的基因个数616个,对其进行通路富集分析发现,主要富集的通路中黏着斑,Wnt信号通路(Wnt signahng pathway),凋亡(Apoptosis-multiple species),细胞外基质受体相互作用和TGF-beta信号通路(TGF-beta signahng pathway)在肌肉生长发育中发挥着重要作用。
  7.构建候选基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并筛选到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫荧光技术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,肌管形态的变化,发现两个干涉组的肌管数目都明显低于对照组,且RPL6干涉组的肌管明显变粗。使用流式细胞术,检测干涉RPL6和TPPP3基因表达后,对C2C12细胞周期进程的影响,发现RPL6基因参与了细胞周期的调节,干涉RPL6后会使滞留于G1期的细胞比例显著高于对照组,滞留于S期和G2期的细胞比例显著低于对照组;发现干涉TPPP3后,细胞周期各阶段的细胞比例与对照组相比皆无明显差异。通过免疫荧光技术鉴定到超表达基因RPL6可以增加细胞中增殖细胞核抗原(PCNA:增殖标志基因)蛋白的表达。
[硕士论文] 牛红丹
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:应激反应导致机体内应激激素大量分泌,其中以皮质醇为主,它是影响肉质的一个较为重要的因素。课题组前期研究表明,在动物日粮饲喂过程中添加皮质醇会导致仔猪背最长肌肌肉组织受损严重,肌纤维间隙增大,凋亡细胞数增多。但目前关于应激激素是如何影响肉质以及通过何种方式导致肉质发生变化的机制并不完全清楚。现今研究表明糖皮质激素(glucocorticoid,GC)主要通过细胞膜与体内糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)结合发挥一系列调控作用。在这些基础上,本课题以GRα为主要研究对象,探究GRα对猪原代骨骼肌细胞(pig skeletal muscle cells,PSC)生长的影响以及在猪劣质肉产生过程中的作用,并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:
  1.地塞米松引起猪肌细胞氧化应激
  地塞米松(dexamethasone,DEX)处理PSC细胞后发现其对肌细胞有明显的毒性,且与对照组相比DEX组细胞内的活性氧自由基大量上升,造成细胞氧化应激;等浓度米非司酮(mifepristone,RU486)处理后细胞内的活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)明显下降。通过MTT法检测DEX对PSC细胞增殖的影响,实验结果表明:DEX抑制PSC细胞增殖。通过qPCR和Western blot检测DEX对细胞应激的影响,结果表明:DEX能促进PSC细胞中HSP90的表达;等浓度RU486处理后能抑制PSC细胞中HSP90的表达。
  2.GRa对PSC细胞功能的影响
  通过构建GRα超表达载体和合成siRNA来超表达和抑制GRα的表达。通过流式细胞仪和MTT法检测GRα对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达GRα可以促进PSC细胞凋亡,抑制PSC细胞增殖。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR检测GRα对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达GRa能促进PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和GPX2的表达;同样,干扰GRα能抑制HSP90、CAST和GPX2的表达。超表达GRα和干扰GRα后检测谷胱甘肽过氧化物酶活性,实验结果表明:超表达GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高,干扰GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。可能是机体应激水平过高,并通过提高谷胱甘肽过氧化物酶活性以维持机体稳定。
  3.GRα靶基因的筛选
  干扰GRα后根据表达差异筛选GRα的靶基因,定量结果显示,干扰GRa后极显著下调Tβ10的表达,下调HSP90和HSP7的表达;且超表达GRα后Tβ10的表达显著升高,上调HSP90和HSP27的表达,且在网站上预测出GRα与Tβ10的结合位点。因此推测Tβ10可能是GRα的靶基因,双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀等试验初步验证,结果表明Tβ10可能是GRα潜在的靶基因。构建Tβ10超表达载体后通过流式细胞仪检测Tβ10对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达Tβ10可以促进PSC细胞凋亡。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR实验检测Tβ10对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达Tβ10能促进PSC细胞中BAX、HSP90、HSP27和CAST的表达。
  4.APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激
  与GRα组相比添加不同浓度的(0.1mg/mL,1mg/mL,10mg/mL和100mg/mL)黄芪多糖(astragalus Polysacharin,APS)后可缓解细胞应激,并通过检测ROS含量找出最适浓度为10mg/mL。添加10mg/mL APS后机体的ROS水平显著降低,且与对照组趋于一致。通过MTT法检测APS对PSC细胞增殖的影响,结果表明:APS可显著缓解超表达GRα后抑制PSC细胞增殖的作用。且添加APS后与GRα组相比谷胱甘肽过氧化物酶活显著降低,从而维持机体稳定。通过QPCR和Western blot检测APS对PSC细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果显示:与GRα组相比添加APS可抑制PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和Tβ10的表达。表明APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激。
[硕士论文] 唐志文
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:围产期奶牛由于大量代谢和生理状态的改变,导致炎症和氧化应激发生率大大增加。炎症和氧化应激严重影响奶牛围产期甚至后续整个泌乳期的健康及生产性能,已经有越来越多的研究者开始研究其缓解措施。目前,中草药由于具有“营养”和“药用”双重功效,已经被逐步用于畜牧生产中。大量研究表明,金银花提取物具有抗炎、抗氧化等功效,然而在奶牛围产期阶段的应用效果还未见报道。因此,本试验的目的在于探究金银花提取物对围产期奶牛炎症和氧化应激的缓解效果。
  1、金银花提取物对瘤胃体外发酵的影响:本试验旨在探究添加添加金银花提取物对瘤胃微生物体外发酵参数的影响。试验选用4头健康、体况相近、安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛用于瘤胃液的采集。试验组分别添加金银花提取物0、05、1、2、4mg/g,每组包含六个重复,试验共进行三个批次。在培养24h后取样,测定培养液pH及瘤胃发酵参数。试验结果表明,添加1、2、4mg/g三个金银花提取物可以使发酵液pH及NH3-N浓度显著低于对照组(P<005),并且使发酵液乳酸、MCP、总酸浓度以及总产气量显著高于对照组(P<005)。因此,在体外培养条件下,添加金银花提取物1、2、4mg/g均可以有效调节瘤胃微生物发酵状态,提高挥发性脂肪酸、微生物蛋白产量,并增加产气量。
  2、金银花提取物对围产期奶牛炎症和氧化应激的缓解效果:本试验旨在探究金银花提取物对围产期奶牛炎症、氧化应激以及生产性能的影向。将24头干奶荷斯坦奶牛根据胎次(2胎)、体况评分(348±007)、体重(759±13kg)、上一泌乳期产奶量以及预产日期分为4组,每组6头牛。所有试验牛饲喂相同的基础日粮。四个试验组的基础日粮中分别添加0(Control)、1g/kg、2g/kg和4g/kg的金银花提取物(干物质基础),从产前21d一直到产后30d。结果显示,与对照组相比,添加金银花提取物1g/kg和2g/kg增加了牛奶干物质采食量(22kg/d和11kg/d),乳产量(480kg/d和196kg/d),乳脂产量(023kg/d和016kg/d),乳蛋白产量(015kg/d和009kg/d),4%FMC(537kg/d和318kg/d),ECM(571kg/d和342kg/d),并降低了乳体细胞数。而且,与对照组相比,添加金银花提取物1g/kg还增加了非乳脂固形物产量。添加金银花提取物1g/kg和2g/kg也降低了一些血液指标的浓度,包括炎症指标(IL-1β、IL-6和触珠蛋白),能量代谢指标(非酯化脂肪酸和β-羟丁酸)以及氧化指标(ROM)。此外,添加金银花提取物1g/kg、2g/kg和4g/kg都增加了血液T-AOC和SOD的浓度。然而,本试验中并没有观察到金银花提取物对瘤胃发酵参数的影响,仅仅是在总挥发性脂肪有一个增加的趋势。总之,本试验研究发现,添加金银花提取物1g/kg或2g/kg可以提高围产期奶牛抗炎及抗氧化能力,并增加干物质采食量,改善能量代谢水平,提高产后泌乳性能。
  综上所述,添加金银花提取物可以缓解围产期奶牛炎症及氧化应激,并且可以改善奶牛能量代谢状态,提高泌乳性能,并且对机体健康及瘤胃发酵无负面影响。
[硕士论文] 李明杨
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:母猪的繁殖力很大程度上决定了猪场的经济效益,而繁殖性状是由微效多基因控制的数量形状,遗传力较低,采用常规育种手段很难在较短时间内得到明显进展。目前国内外育种研究者将分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)与常规育种方法相结合来进行选育,能够促进猪繁殖性状的遗传改良进程。因此鉴定影响繁殖性状的候选基因或分子标记可为猪育种工作提供重要的理论依据。本实验在大白猪群体中,基于GWAS以及基因功能研究结果鉴定了HBEGF、KPNA7、FOXA2和PTGS2等四个候选基因,利用PCR-RFLP和Sequenom质谱等方法进行了SNP检测,并研究了SNP与繁殖性状之间的关联。主要研究结果如下:
  (1)在法系大白猪HBEGF基因第一、三内含子上共发现并验证了三个新SNP,分别为rs81218760、rs81218761和rs333992579。在法系大白经产母猪中,rs81218760位点AC基因型个体的初生窝重显著高于AA型个体(P<0.05),CC基因型个体的弱仔数显著低于AC基因型和AA基因型个体(P<0.05);在法系大白猪初产和经产母猪中,rs81218761位点CC基因型个体的弱仔数均显著低于TT基因型个体(P<0.05);在法系大白初产和经产母猪中,rs333992579位点TC基因型个体的初生窝重均显著高于TT型个体,另外在经产母猪中,TC基因型个体的健仔数显著高于TT基因型个体(P<0.05),而其弱仔数显著低于TT基因型个体(P<0.05)。
  (2)在法系大白猪KPNA7基因第一、三外显子区域,第一、三内含子区域以及5'UTR区域中发现并验证了六个新SNP,分别为rs81308652、rs321312903、rs327848277、rs334590006、rs336259402和rs339249916。在法系大白初产母猪中,rs81308652位点CT基因型个体的总产仔数显著高于TT基因型个体(P<0.05),而在经产母猪中TT基因型个体的弱仔数显著低于CC基因型个体;在法系大白初产母猪中,rs327848277位点GG基因型个体的初生窝重和健仔数均显著高于GT基因型个体(P<0.05),在经产母猪中,GG基因型个体的弱仔数要显著低于GT基因型个体;另外四个位点的多态性与法系大白猪繁殖性状之间的关联性均没有达到显著水平。
  (3)在法系大白猪FOXA2基因3'UTR区域检测到一个新SNP(rs328630446),该位点的GG和CG基因型个体的弱仔数均显著低于CC基因型个体(P<0.05)。
  (4)在美系和法系大白猪PTGS2基因第九外显子上检测到一个新SNP(rs322152513),在美系大白初产母猪中,该位点AA基因型个体显著低于AG基因型个体,而在经产母猪中,AA基因型个体的初生窝重显著高于AG基因型个体(P<0.05);在法系大自初产和经产母猪中,rs322152513位点多态性与繁殖性状之间的关联性并不显著。
  综上所述,本研究发现了HBEGF、KP NA7、FOXA2以及PTGS2基因内部的SNP与猪繁殖性状之间存在关联,为猪繁殖性状的遗传改良提供了理论基础。
[硕士论文] 蔡安乐
动物营养与饲料科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在哺乳动物妊娠期,胎盘是调节宫内环境和保障胎儿发育的重要媒介,其中胎盘的血管网发挥了关键作用。有研究发现提高妊娠期日粮中蛋氨酸水平能够提高仔猪初生窝重和仔猪初生个体重,然而蛋氨酸调控胎盘血管发育的作用及其调控机理尚不清楚。本研究以猪血管内皮细胞为研究对象,构建了猪胎盘滋养层细胞与血管内皮细胞共培养模型,研究了蛋氨酸对猪血管内皮细胞血管生成的调控规律:并进一步从关键基因表达调控角度,研究蛋氨酸调控内皮细胞血管生成关键基因的关键机制。主要研究内容和结果如下:
  1.提高蛋氨酸水平对猪血管内皮细胞血管生成的影响。通过建立猪血管内皮细胞与猪滋养层细胞体外共培养模型,研究在猪血管内皮细胞单独培养和与猪胎盘滋养层细胞共培养条件下,将蛋氨酸从生理浓度(0.05mmol/L)提高到0.2和0.5mmol/L对猪血管内皮细胞血管生成的影响。结果显示,在单独培养或者共培养条件下,提高蛋氨酸的水平都显著促进了内皮细胞的成管(P<0.05),但是蛋氨酸与培养条件不存在交互作用,说明了蛋氨酸促进内皮细胞血管生成不依赖于滋养层细胞。
  2.提高蛋氨酸水平影响猪血管内皮细胞血管生成的主要事件。提高蛋氨酸水平后内皮细胞形成管腔数、总的分支长度和总的节点数显著增加(P<0.05)。通过MTT法和流式细胞术,检测不同浓度蛋氨酸处理对细胞增殖的影响,结果表明,随着蛋氨酸浓度的增加,细胞活力显著增加(P<0.05),但是对细胞周期没有影响。细胞划痕和Transwell小室迁移法检测提高蛋氨酸水平对细胞迁移能力的影响,结果发现随着蛋氨酸浓度增加,细胞的迁移能力显著增加(P<0.05),说明了提高蛋氨酸水平主要影响了内皮细胞血管生成中的细胞迁移事件。
  3.蛋氨酸对内皮细胞血管生成关键基因的调控。对细胞迁移基因和血管生成相关基因mRNA表达变化检测发现,增加蛋氨酸水平(0.05mmol/L Vs0.5mmol/L)对MM2的mRNA表达没有影响,但是显著增加了MMP9、VEGF-A、VEGF120、VEGF164.、VEGFR-1的mRNA水平(P<0.05),血管生成负调节基因sVEGFR-1的表达量也显著增加(P<0.05)。在0.5mmol/L蛋氨酸处理条件下,检测蛋氨酸不同处理时间对猪血管内皮细胞细胞VEGF-A的mRNA表达的变化,结果表明随着蛋氨酸处理时间的增加,VEG F-A的mRNA表达水平逐渐增加,当处理时间达到24h时,显著促进了VEGF-A mRNA的表达(P<0.05)。此外,蛋氨酸不同处理时间或不同浓度蛋氨酸对猪胎盘滋养层细胞VEGF-A的mRNA表达没有影响。
  4.VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。本试验利用VEGF-A抑制剂Bevacizumab对细胞进行处理,研究了VEGF-A在介导提高蛋氨酸水平促进内皮细胞血管生成中的作用。结果表明,与高浓度蛋氨酸处理组相比,添加Bevacizumab处理后的细胞迁移能力显著降低(P<0.05),而与生理浓度蛋氨酸相比没有显著性差异。在血管生成试验中,添加Bevacizumab处理后形成管腔数、总的分支长度和总的节点数与高浓度蛋氨酸处理组相比显著降低(P<0.05);与生理浓度蛋氨酸相比,总的分支长度仍显著增加(P<0.05),总的节点数无显著差异。说明了在猪血管内皮细胞中,VEGF-A在介导蛋氨酸促进内皮细胞的血管生成中发挥了关键作用。
  5.蛋氨酸调控VEGF-A基因表达机制的研究。VEGF-A的mRNA水平增加涉及到转录水平和转录后水平的调控。本试验通过染色质免疫共沉淀技术来探究蛋氨酸对RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因CDS区的结合能力的影响。结果表明,在高蛋氨酸水平下,RNA聚合酶Ⅱ与VEGF-A基因启动子结合没有显著变化。利用放线菌素D进行处理,当处理时间增加到30和60min时,高蛋氨酸处理组VEGF-A的mRNA稳定性显著高于低蛋氨酸处理组(P<0.05)。说明了,提高蛋氨酸不影响VEGF-A转录水平,而是通过提高VEGF-A mRNA转录后的稳定性来调节的。
  综上所述,本研究的结论是:
  1.提高蛋氨酸水平促进了猪血管内皮细胞的迁移和血管生成,但该作用不依赖于滋养层细胞。
  2.蛋氨酸促进猪血管内皮细胞迁移和血管生成是通过提高VEGF-A基因表达来实现的。
  3.蛋氨酸通过影响了VEGF-A mRNA转录后的稳定性提高了VEGF-A的mRNA水平。
[硕士论文] 李仁德
养殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:氨基酸是蛋白质的基本结构单位,饲料中组成与动物机体越接近,其利用价值就越高。低蛋白氨基酸平衡日粮就是利用氨基酸的均衡性来提高营养物质代谢,提高营养物质利用率,降低饲料成本,提高经济效益。本试验通过对低蛋白日粮苏氨酸水平对仔鹿不同时期的生长发育、营养物质消化率和血清生化指标的研究,筛选出低蛋白饲粮苏氨酸的适宜水平,为梅花鹿氨基酸营养研究提供数据支持。
  试验一、二选取梅花鹿仔鹿24只,随机分为4组,每组6只,预饲期15d,正式期30d。试验三、四选取梅花鹿仔鹿20只,随机分为4组,每组5只,预饲期15d,正式期分别为45d、65d。对照组Ⅰ组在离乳期和越冬期分别饲喂16%和15.15%的高蛋白饲粮。试验组在离乳期和越冬期分别饲喂14%和1346%的低蛋白日粮,并分别补充Lys、Met和Thr使各组Lys、Met保持相同,离乳期Thr水平分别为0.54%(Ⅰ组)、0.46%(Ⅱ组)、0.59%(Ⅲ组)、0.72%(Ⅳ组),越冬期Thr水平分别为0.55%(Ⅰ组)、0.47%(Ⅱ组)、0.53%(Ⅲ组)、0.58%(Ⅳ组)。
  试验结果表明
  1、离乳前期仔鹿,Ⅱ组末重低于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),Ⅱ组ADG最低(P<0.01),Ⅰ组ADFI最低(P<0.01),Ⅱ组F/G最高(P<0.01),Ⅰ组高于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.01)。Ⅰ组CP消化率低于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.01),高于Ⅱ组(P<0.01),Ⅰ组饲料能量的消化率低于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.01)),Ⅲ组Ca消化率高于Ⅱ组(P<0.01),Ⅰ组His、Asp、Glu、Gly、Cys消化率高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅰ组Lys、Met、Thr、Arg、Ala、Tyr消化率低于Ⅲ组(P<0.01),Val、Leu、Phe、Ser消化率低于Ⅲ组(P<0.05),Ⅰ组Ala的消化率低于Ⅳ组(P<0.01),Lys、Thr、Val、Ala的消化率显著低于Ⅳ组(P<0.05)。仔鹿血清中.Ⅰ组TP、ALB高于Ⅱ组(P<0.01),GLB高于Ⅳ组(P<0.01),IgG显著高于Ⅱ组(P<0.01),Ⅰ组AST低于Ⅳ组(P<0.01),BUN高于Ⅲ组(P<0.01),ALP高于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.01),CHO高于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05),IGF-1高于Ⅱ、Ⅳ组(P<0.01),GLU高于Ⅱ组(P<0.01)、Ⅳ组(P<0.05),Ⅳ组ALT高于Ⅱ组(P<0.01),Ⅲ组料效果最好,每吨料成本比对照组低4884元。离乳前期仔鹿在14%CP,Thr水平为0.59%时较为适宜。
  2、离乳后期仔鹿,Ⅰ组ADG高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅳ组高于Ⅲ组(P<0.05),Ⅱ组(P<0.01),Ⅱ组ADFI高于其他组(P<0.01);Ⅱ组F/G高于其他组(P<0.01),Ⅲ组高于Ⅰ组和Ⅳ组(P<0.01)。Ⅰ组CP消化率低于Ⅳ组(P<0.01)、低于Ⅲ组(P<0.05),Ⅰ组EE消化率低于Ⅳ组(P<0.05),Ⅰ组能量消化率低于其他组(P<0.05),Ⅱ组P的消化率低于其他组(P<0.05)。仔鹿瘤胃液氨基酸水平中:Ⅱ组Thr、Val、Ile、Leu、Asp、Ser、Glu、Gly、Ala低于Ⅳ组(P<0.01),其中Thr、Ile、Leu、Ser、Ala高于Ⅱ组(P<0.01),Asp高于Ⅱ组(P<0.05)且低于Ⅲ组(P<0.05),Glu低于Ⅲ组(P<0.05),Gly低于Ⅲ组(P<0.01),高于Ⅱ组(P<0.01);Ⅰ组Lys低于Ⅳ组(P<0.05),高于Ⅱ组(P<0.01),Ⅰ组Phe高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅰ组Cys最高(P<0.01),Ⅳ组高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅰ组Pro低于Ⅲ组(P<0.05),高于Ⅱ组(P<0.01)。仔鹿血清氨基酸水平中Ⅰ、Ⅳ组Lys、Tyr均高于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.01),Ⅰ、Ⅱ组Val高于Ⅲ组(P<0.05),Ⅲ组Ile低于Ⅰ组(P<0.01),Ⅳ组高于Ⅲ组(P<0.05),Ⅲ组Leu低于Ⅰ、Ⅳ组(P<0.01),低于Ⅱ组(P<0.05),Ⅰ组Phe水平高于Ⅲ组(P<0.05),Ⅲ组Ser高于Ⅳ组(P<0.05),Ⅲ组Glu低于Ⅰ、Ⅳ组(P<0.01),Ⅱ组(P<0.05),Ⅲ组Gly低于Ⅱ组(P<0.05);Ⅱ组Ala最高(P<0.01),Ⅰ组Cys最高(P<0.01)。Ⅰ组的Lys、Thr、Ile、Leu、Phe、His、Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Pro消化率高于Ⅱ组(P<0.01),其中除Ser、Gly外Ⅲ组和Ⅳ组也均高于Ⅱ组(P<0.01),Ⅲ组和Ⅳ组Ser高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅳ组Gly高于Ⅱ组(P<0.01)。离乳后期仔鹿在14%CP,Thr水平为072%时较为适宜。
  3、越冬前期仔鹿,Ⅰ组和Ⅱ组末重高于Ⅳ组(P<0.05),Ⅳ组仔鹿ADG低于其他组(P<0.01),Ⅳ组F/G最高(P<0.01),Ⅱ组低于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.01),Ⅳ组EE消化率极低于Ⅱ组(P<0.01)、Ⅲ组(P<0.05),Ⅰ组NDF消化率低于Ⅱ组(P<0.05);Ⅰ组能量消化率低于Ⅱ组(P<0.01),Ⅱ组Ca的消化率高于其他组(P<0.01),Ⅳ组低于Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.01),Ⅱ组P的消化率高于Ⅳ组(P<0.01)、Ⅰ组和Ⅲ组(P<0.05),Ⅱ组Met、Thr高于Ⅰ、Ⅳ组(P<0.01)、Ⅲ组(P<0.05)。仔鹿粪中氨基酸消化率如下Ⅱ组Asp高于其他组(P<0.05),Ⅰ组Ser最低(P<0.01),Ⅰ组Glu高于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.01),Ⅰ组Tyr低于Ⅱ组(P<0.01),Ⅰ组Pro低于Ⅱ组(P<0.01)、Ⅲ组(P<0.05)。仔鹿血清氨基酸水平如下Ⅳ组ALB最低(P<0.01),Ⅳ组GLB高于Ⅰ、Ⅲ组(P<0.01)、Ⅱ组(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ组AST高于Ⅰ、Ⅱ组(P<0.01),Ⅲ组ALT高于Ⅰ组(P<0.05),Ⅱ组BUN低于Ⅰ、Ⅳ组(P<0.01)。越冬前期仔鹿在1346%CP,Thr水平为047%时较为适宜。
  4、越冬后期仔鹿,Ⅰ组末重高于Ⅳ组(P<0.05),Ⅱ组高于Ⅳ组(P<0.01),Ⅰ组ADG低于Ⅱ组(P<0.01),高于Ⅳ组(P<0.01),Ⅲ组高于Ⅳ组(P<0.05)。Ⅳ组F/G最高(P<0.01),Ⅲ组高于Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05),Ⅱ组CP消化率高于Ⅳ组(P<0.01)、Ⅰ组(P<0.05)。仔鹿营养物质消化率如下Ⅱ组EE高于Ⅳ组(P<0.01)、Ⅲ组(P<0.05)。Ⅱ组NDF高于Ⅳ组(P<0.01),Ⅰ、Ⅲ组高于Ⅳ组(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ组ADF高于Ⅳ组(P<0.05),Ⅳ组Ca最低(P<0.01),Ⅳ组P最低(P<0.05)。仔鹿血清氨基酸及生化指标水平如下,Ⅳ组Lys最高(P<0.05),Ⅰ组Met低于Ⅳ组(P<0.05),,Ⅰ组Thr低于Ⅲ组(P<0.05)、Ⅳ组(P<0.01);Ⅰ、Ⅱ组Ser低于Ⅲ、Ⅳ组(P<0.01),Ⅰ组Glu低于Ⅳ组(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ组Gly低于Ⅳ组(P<0.01),且Ⅰ组低于Ⅳ组(P<0.01);Ⅳ组Tyr高于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.05);Ⅳ组Pro高于Ⅲ组(P<0.05),Ⅳ组IgG最低(P<0.05),Ⅳ组ALT高于Ⅱ组(P<0.05),Ⅲ组ALP高于I组(P<0.05),Ⅳ组BUN高于Ⅲ组(P<0.05),Ⅳ组CHO低于Ⅰ组(P<0.05);Ⅱ组IGF-1高于Ⅰ、Ⅳ组(P<0.01)、Ⅲ组(P<0.05)。越冬后期仔鹿在1346%CP,Thr水平为047%时较为适宜。
  降低饲粮蛋白水平会降低仔鹿的生长性能,影响仔鹿代谢平衡。在低蛋白饲粮中添加适宜水平苏氨酸会提高仔鹿的生长性能、营养物质消化率,降低料重比,提高饲料转化率,能够节约饲料成本,因而梅花鹿仔鹿低蛋白饲粮添加苏氨酸是可行的。
[硕士论文] 屈文萍
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:骨骼肌卫星细胞是一类位于肌纤维膜表面与基底膜之间的细胞,在肌肉的发育和再生过程中发挥着重要的作用。长非编码RNA(Long non coding RNAs,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt,具有低蛋白编码潜力的RNA分子。lncRNA能够调控基因表达、参与表观遗传修饰,影响细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动的进程。本研究以体外分离的猪骨骼肌卫星细胞为材料,研究一个新的lncRNA-AK394747在细胞增殖和分化过程发挥的功能及可能存在的机制。主要研究结果如下:
  1.利用两步酶消化法成功分离出活性较高、有一定增殖能力的猪原代骨髂肌卫星细胞,经差速贴壁纯化后,用Pax7基因对分离的细胞进行鉴定,免疫荧光结果显示细胞阳性率高达95%。同时,对分离的细胞进行分化诱导培养,能形成肌管,且稳定表达MyoD、MyoG和MyHc这三个成肌标志基因。
  2.通过RACE和测序验证了猪AK394747全长为1586bp,生物信息学分析发现该lncRNA不具有编码蛋白的能力,主要存在于细胞质中,时空表达谱分析表明AK394747在腿肌、背肌等肌肉组织中高表达,且随着猪骨骼肌细胞的分化表达量上升。
  3.在猪骨骼肌细胞中利用干扰和超表达实验研究了AK394747对细胞增殖和分化的影响,EdU、RTCA以及细胞周期检测等实验结果发现该lncRNA对骨骼肌细胞的增殖过程无显著影响,并且增殖相关基因ki67、N-Ras和CDK家族基因表达变化不显著;而干扰AK394747后,利用Q-PCR、Westren Blotting以及免疫荧光技术检测发现肌细胞分化标志基因MyoD、myoG、MyHc等的mRNA和蛋白水平表达显著下降,表明AK394747促进了猪骨骼肌细胞分化。
  4通过生物信息学筛选了4个潜在的与AK394747结合的miRNA—ssc-miR-32,ssc-miR-218,ssc-miR-218-3p,ssc-miR-301。在干扰AK394747后,其中ssc-miR-32及其pri-RNA表达降低。通过在线软件预测发现AK394747基因与NICD蛋白可能相互结合,同时利用Q-PCR技术检测发现干扰AK394747后NICD(Notch1胞内片段)基因的表达显著升高。
  本实验研究了猪lncRNA-AK394747的基本性质,验证了其促进骨骼肌细胞分化的基因功能,初步预测了其可能发挥作用的方式,为研究AK394747在骨骼肌细胞发育过程中的作用机制奠定了基础,同时也为研究猪骨骼肌生长发育调控机制提供了新的思路。
[博士论文] 王晓艳
临床兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:干扰素-τ(Interferon-τ,IFN-τ)是反刍动物在妊娠早期由胚胎滋养层细胞分泌的一类Ⅰ型干扰素,被视作妊娠识别信号,具有抗黄体溶解、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能。其在调节胚胎着床时期子宫容受态和子宫免疫环境等方面的作用对于胚胎的顺利着床尤为重要。IFN-τ在奶牛妊娠早期,即胚胎植入窗口期,通过对牛白细胞Ⅰ类抗原(Bovine leukocyte antigen,BoLA-Ⅰ)及其他妊娠相关分子的调节,提高母体对胎儿的容受性,增加胚胎植入的成功率。BoLA-Ⅰ,是牛的主要组织相容性Ⅰ类(Major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)蛋白,在牛的胚胎滋养层和子宫内膜上皮细胞中均有表达,与妊娠早期母体对胎儿免疫耐受密切相关。IFN-τ也可以调节分离培养的奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达miRNAs。miRNAs普遍存在于真核生物,通过对靶基因的调节,参与机体各种生理和病理过程,在妊娠免疫和重塑子宫内环境等方面也有重要作用。
  本实验室前期的研究表明,IFN-τ在奶牛妊娠早期可上调BoLA-Ⅰ的表达,并可调节奶牛子宫内膜上皮细胞中miRNAs的表达谱。通过高通量测序和分析,发现一些差异表达显著的miRNAs可能与IFN-τ调节奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达BoLA-Ⅰ类蛋白有关。为进一步验证其相关性,也为进一步研究奶牛妊娠免疫和子宫容受性的调节机制提供实验依据,探索IFN-τ在奶牛妊娠早期协助胚胎免疫逃逸,为胚胎植入提供可能的潜在机制,本研究从验证miRNAs/miRNAs靶基因入手,展开了深入的研究,主要研究内容和结果如下:
  (1)从高通量测序的结果中筛选到bta-miR-145和bta-miR-204在IFN-τ作用下的奶牛子宫内膜上皮细胞中的表达明显降低。选取空怀和妊娠早期奶牛子宫内膜组织进行在体验证。RT-qPCR和Western blot检测结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织相较于空怀奶牛而言,其bta-miR-145和bta-miR-204的mRNA水平显著降低,MHC-Ⅰ类相关链(MHC classⅠ-relatedchain,MIC1)基因和Ⅰ类MHC重链(Major histocompatibility complex,classⅠ-A,BoLA)基因的mRNA水平却显著上调,且BoLA-Ⅰ蛋白水平也明显升高。
  (2)分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)进行体外验证,结果显示,在IFN-τ(200ng/mL)作用下,和对照组相比,bEECs中bta-miR-145与bta-miR-204的mRNA水平同样下降明显,MIC1和BoLA的转录水平上升明显,BoLA--Ⅰ蛋白表达水平升高显著。
  (3)利用生物信息学技术对bta-miR-145与MIC13'UTR,bta-miR-204与BoLA3'UTR靶序列的碱基配对情况,结合形成RNA双链的二级结构和自由能等主要生物信息学指标进行了归纳分析,初步确定MIC1为bta-miR-145的靶基因,BoLA为bta-miR-204的靶基因。通过双荧光素酶报告检测分析,发现,bta-miR-145显著抑制MIC13'UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性,而bta-miR-204也能显著抑制BoLA YUTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性。确证MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (4)bta-miR-145、bta-miR-204的过表达和抑制实验表明,在bEECs中转染bta-miR-145模拟物能显著抑制MIC1基因mRNA的表达;而转染bta-miR-145抑制剂后,MIC1基因mRNA的表达则显著上调。而在bEECs中转染bta-miR-204模拟物则能显著抑制BoLA基因mRNA的表达;而转染bta-miR-204抑制剂后,BoLA基因rnRNA的表达则显著上升。在IFN-τ的作用下,bEECs中MIC1和BoLA的mRNA水平显著增加,BoLA-Ⅰ的蛋白表达水平也明显上调。进一步证实了MIC1是bta-miR-145的直接靶基因,而BoLA是bta-miR-204的直接靶基因。结果证明,IFN-τ可以通过对bta-miR-145和bta-miR-204的负调节作用,提高MIC1和BoLA的表达。
  (5)为了验证IFN-τ在胚胎植入期对细胞外基质和免疫微环境的影响,采用RT-qPCR分析了未孕和妊娠早期奶牛子宫内膜组织中崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白10(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10,ADAM10),崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白17(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein17,ADAM17),程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death-ligand1,PD-L1)和程序性细胞死亡配体2(Progammed cell death-ligand2,PD-L2)的mRNA水平。结果表明,妊娠早期奶牛子宫内膜组织中的ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的mRNA水平都有不同程度的升高。而在IFN-τ的作用下,bEECs中ADAM10,ADAM17,PD-L1与PD-L2的mRNA水平都有明显的增加。
  (6)为了验证IFN-τ是否通过对MIC1和BoLA的调节来影响ADAM10,ADAM17,PD-L1及PD-L2的表达,采用siRNA干扰技术在bEECs中进行体外验证。结果表明,siRNA干扰MIC1的表达后,ADAM10和ADAM17mRNA水平明显下降;在bEECs中转染BoLA siRNA后,PD-L1与PD-L2的mRNA水平也显著下调。结果提示,IFN-τ通过bta-miR-145对MIC1的调节影响ADAM10和ADAM17的表达;同时可通过bta-miR-204对BoLA的调节作用,来调节PD-L1与PD-L2的表达,从而对细胞外基质和免疫耐受等多方面的调节来影响胚胎植入。
  (7)进一步验证IFN-τ对胚胎植入的影响,建立了LPS诱导的小鼠胚胎植入障碍模型,进行在体验证。实验结果表明,IFN-τ能提高LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量,同时FN-τ也能抑制LPS诱导的炎性因子IL-1β和TNF-α的表达,并上调抗炎因子IL-10的表达。
  结论:
  (1)MIC1是bta-miR-145的靶基因,BoLA是bta-miR-204的靶基因。
  (2)IFN-τ通过抑制bta-miR-145上调MIC1的表达来增加ADAM10和ADAM17的表达,以影响细胞外基质,促进胚胎黏着、侵袭等过程。
  (3)IFN-τ通过抑制bta-miR-204上调BoLA的表达来提高PD-L1与PD-L2的表达,以此影响母胎界面的免疫微环境,促进胎儿免疫逃逸。
  (4)IFN-τ通过下调bta-miR-145/204的表达来调节BoLA-Ⅰ类相关分子的表达和功能,以增加胚胎植入的成功率。
  (5)IFN-τ通过对免疫平衡的调节来增加LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量。
[硕士论文] 姜晓娜
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎附植期是猪早期妊娠胚胎丢失最敏感时期之一,受很多因子调控,但目前对猪胚胎附植的相关因子研究较少。在本实验室先前的转录组和蛋白的测序数据分析发现ANXA8基因在猪的胚胎附植期差异表达。ANXA8基因是膜联蛋白家族的成员之一,编码抗凝血蛋白参与凝血级联并作为一种间接性的凝血酶特异性复合物。然而,目前在猪的胚胎附植以及猪的子宫内膜细胞中ANXA8基因的功能均未见报道。为了了解ANXA8基因在猪的子宫内膜中以及可能对猪胚胎附植产生的作用,本研究先检测了猪妊娠早期的子宫内膜组织中ANXA8基因的相对表达;然后将构建的真核超表达载体pcDNA3.1(+)-ANXA8和ANXA8基因的干涉片段转染到猪子宫内膜细胞中,通过免疫荧光、实时荧光定量PCR、流式细胞术和western blot等技术研究ANXA8基因在猪子宫内膜细胞中的调控作用;通过小鼠子宫角注射方法确定ANXA8基因对胚胎附植的影响。主要研究结果:
  1.实时荧光定量PCR技术检测猪妊娠9-15d和18d的子宫内膜组织中ANXA8基因的表达情况,发现该基因在妊娠12d的相对表达量最高。通过免疫荧光方法确定了ANXA8蛋白在猪子宫内膜细胞中的表达位置,发现ANXA8蛋白在细胞质中有表达。
  2.实时荧光定量PCR测定表明ANXA8基因显著上调LIF和EGF基因在猪子宫内膜细胞的表达量。
  3.流式细胞术确定ANXA8基因促进猪的子宫内膜细胞的细胞周期的S期细胞增加。免疫荧光技术和western blot技术确定超表达ANXA8基因可以通过促进细胞中增殖标志蛋白PCNA的表达来促进猪子宫内膜细胞的增殖。
  4.Western blot技术确定超表达ANXA8基因在不影响猪子宫内膜细胞中AKT总蛋白的情况下促进细胞中p-AKT蛋白的表达,进而调控细胞中AKT信号通路。免疫荧光技术和western blot检测证实ANXA8基因通过AKT信号通路来调控猪子宫内膜细胞的增殖,其中免疫荧光技术结果发现超表达ANXA8并添加AKT磷酸化抑制剂(Perifosine)后,细胞中PCNA蛋白含量与对照组无显著差别,且其含量低于只超表达ANXA8组中细胞内PCNA蛋白的含量,其次western blot结果发现AKT磷酸化抑制剂对细胞内ANXA8蛋白含量无影响。实时荧光定量PCR技术确定超表达ANXA8可以上调AKT下游mTOR基因在猪子宫内膜细胞中的表达。
  5.在小鼠子宫角注射实验发现注射干涉片段ANXA8的小鼠的胚胎附植数明显少于对照组。
  6.实时荧光定量PCR技术结果发现干涉ANXA8基因可以降低同家族ANXA4基因在子宫内膜细胞中的表达。
  以上主要结果表明ANXA8基因可以通过AKT信号通路促进猪子宫内膜细胞的增殖。此外还发现ANXA8基因也影响猪子宫内膜细胞中胚胎附植标志LIF和EGF基因的表达;ANXA8基因也会影响小鼠的胚胎附植数目。
[硕士论文] 李凤
动物繁殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:哺乳动物的胚胎在体外培养过程中会产生大量的活性氧自由基(ROS),引起胚胎的氧化应激,过量ROS会破坏细胞的氧化还原平衡,导致DNA、蛋白质损伤以及脂质过氧化。添加抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)可以清除胚胎内ROS,从而提高胚胎发育率和囊胚质量。然而GSH是如何发挥其抗氧化作用,并促进胚胎发育的机制并不清楚。本文旨在揭示外源GSH促进胚胎内GSH合成和促进胚胎发育的机制,为提高体外胚胎的生产效率提供切实的理论基础。
  试验一:牛体外受精胚胎分别于3mM GSH、GSX和不含GSH(对照组)的培养液中培养7d,统计两组的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数;采用荧光染色法和LC/MS法检测不同发育阶段受精卵中ROS和GSH含量;在培养液中添加GSX,利用LC/MS对受精卵内GSX含量变化进行跟踪检测。结果表明,外源添加GSH可显著降低胚胎内ROS含量(P<0.05),提高囊胚率和囊胚总细胞数(P<005)。荧光染色法和LC/MS法均检测到各发育阶段的处理组受精卵中GSH的含量显著高于对照组(P<0.05),且两组受精卵中GSH含量均随发育进程而呈现下降趋势。外源添加GSX后,处理组受精卵中GSH的含量显著升高(P<005),而GSX含量较低,仅为GSH含量的1/5;且培养液中GSX的含量随培养时间的延长而持续下降。可见,外源GSH可清除胚胎中部分ROS,提高胚胎发育率和囊胚质量;LC/MS是定量分析GSH及其同位素标记物的可靠方法,可用于外源GSH影响胞内GSH合成和促进胚胎发育的机制研究。
  试验二:牛体外受精卵分别于3mM GSH(处理组)或不含GSH(对照组)的培养液中培养32h,比较两组胚胎间GSH合成相关酶的基因表达水平及酶活性。添加GSH后,GSS、GGT和GCLM基因表达水平显著升高,GGT活性显著升高(P<005)。5-OPase和GCLC基因在精卵共孵育24h的处理组受精卵中表达量均显著低于对照组,其他时间段的处理组和对照组胚胎中没有显著差异(P>0.05)。添加GSH可提高胚胎内γ-谷氨酰循环途径中GSH合成相关酶的基因表达水平和GGT酶活性。
  试验三:GSH合成相关关键酶GCL和GGT的抑制剂BSO和Acivicin活性分别处理对照组和GSX组的胚胎,统计胚胎发育率,并检测不同发育阶段受精卵中的GSX和GSH含量。结果两种抑制剂均显著降低胚胎的卵裂率和囊胚率,抑制剂Acivicin处理后,早期胚胎甚至不能发育至囊胚阶段。另外,受精卵中GSX和GSH含量均显著下降,表明抑制GCL酶和GGT酶的活性会阻碍外源GSH对胞内GSH合成的促进作用。因此,外源GSH通过γ-谷氨酰循环诱导胚胎中GSH的重新合成。
  本文在牛胚胎培养液中添加GSH同位素标记物GSX(GSH-(Glycine-13C215N)),利用LC/MS对胚胎中GSH及GSX水平进行定量和追踪检测,对GSH合成相关酶的基因的表达水平进行分析并检测受精卵中GGT酶活性,以及对关键酶的抑制多方面探究外源GSH对促进胚胎发育的作用途径。
[硕士论文] 李崇阳
动物繁殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:利用流式分选的奶牛性控冻精人为控制犊牛出生后的性别,可实现畜牧生产利润最大化;同时,性控冻精在商业化的体外性控胚胎生产中起重要作用。但性控冻精分选过程会去除富含抗氧酶的精浆,导致内源性抗氧化酶的不足,同时刺激精子氧化应激产生过量的活性氧(ROS),破坏精子内部抗氧化防御体系的平衡,造成精子氧化应激损伤。褪黑素(MT)和白藜芦醇(Res)作为高效的外源性抗氧化剂,可去除ROS,提高常规冻精质量,但在奶牛性控冻精中的研究非常罕见。因此,本研究通过在3头荷斯坦奶牛性控冻精解冻后的洗精液和受精液中添加不同浓度的Res和MT处理,检测了不同浓度抗氧化剂对性控冻精质量和受精能力的影响,探究了这两种抗氧化剂在奶牛性控冻精中的最佳作用浓度,并应用MT受体抑制剂,探究了MT受体对精子受精能力的影响。研究结果如下:
  1.在3头牛性控冻精解冻后,在其洗精液和受精液中分别添加不同浓度的Res(0M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M),经15h孵育后,分析了不同浓度的Res处理对奶牛性控冻精ROS水平、磷脂酰丝氨酸(PS)外翻、线粒体膜电位(△ψm)、ATP和丙二醛(MDA)含量、顶体完整性、以及囊胚率和囊胚质量的影响。结果表明:(1)10-3M和10-4M的Res处理组精子的ROS和MDA水平显著低于对照组(P<005);(2)10-3M和10-4M的Res处理组中未发生凋亡活精子和高△ψm,以及较高ATP含量的精子比例显著高于对照组(P<0.05);(3)10-4M Res处理组顶体完整的活精子比例以及囊胚率和囊胚质量显著高于对照组(P<005)。因此,在性控冻精洗精液和受精液中添加10-4M Res处理可显著降低其ROS水平、PS外翻比例、MDA水平,并保护线粒体功能和顶体完整性,从而提高性控冻精囊胚率和囊胚质量。
  2.在3头牛性控冻精解冻后,在洗精液和受精液中分别添加不同浓度MT(0M、10-3M、10-5M、10-7M、10-9M),经15h孵育后,分析了不同浓度的MT处理对奶牛性控冻精ROS水平、MDA水平、凋亡事件(PS外翻、△ψm)、内源性抗氧化酶(GSH-Px、SOD、CAT)活力水平、顶体膜完整性、获能及获能相关事件(胞内Ca2+水平,[Ca2+]1;环磷酸腺苷水平,cAMP水平);以及IVF能力的影响。结果表明:10-5M MT处理可显著降低性控冻精ROS含量,提高GSH-Px、SOD、CAT酶活力水平,从而抑制精子PS外翻和MDA水平,提高精子△ψm、顶体完整性、获能反应相关变化和受精能力。
  3.通过Western Blot确定奶牛性控精子中MT1和MT2受体的存在,以及根据实验证实10-5MMT可有效提高性控冻精受精能力,10-5M MT处理3头牛的性控冻精时分别添加MT受体抑制剂4-P-POD和Luzindole,检测对性控冻精精子获能相关事件的影响。结果显示:MT通过MT1受体参与奶牛性控冻精精子获能调节。
  综上所述,本研究发现10-4M Res和10-5M MT都可通过清除ROS,抑制凋亡和脂质过氧化反应(LPO),保护精子结构与功能,提高奶牛性控冻精受精能力。此外,本实验还表明,MT除直接抗氧化保护作用外,还可通过精子膜上的MT1受体,参与调节奶牛性控冻精获能相关事件。这些研究成果有助于提高奶牛性控冻精受精能力和探索抗氧化剂相关作用机制。
[硕士论文] 邢义珅
动物遗传育种与繁殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:肉牛的生长速度和胴体重是肉牛品种优劣的重要标准,能够直接影响肉牛经济效益,因此,培育生长速度快,出肉率高的优质肉牛品种是一项有重要的实际意义的工作。牛骨骼肌的发育起始于妊娠早期,骨骼肌的发育经历了间充质干细胞、肌祖细胞、成肌细胞、初级肌纤维、次级肌纤维几个阶段,在多种转录因子的作用下,逐渐在妊娠后期发育成型。为了探索肉牛生长发育性状重要候选基因NCAPG在牛骨骼肌发育中的机理,通过研究NCAPG在体外成肌分化模型中的作用来初步解释其对生长性状的作用机制。主要通过siRNA干扰NCAPG表达的手段,研究NCAPG对牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞有丝分裂和成肌分化的影响,并探究其作用机理。得到主要结果如下:
  1、用胶原酶消化法从三月龄的牛胎儿骨骼肌组织中分离成肌细胞,用马血清培养基诱导分化,成肌细胞分化能力较强,诱导后大量细胞融合形成肌管,随着分化时间的增加,MYH1、MYH2、MYH3和MYH4的表达量上调,MYOD和MYF5表达下调,MYOG表达量基本稳定;
  2、在成肌细胞增殖时期,用siRNA干扰NCAPG表达后,成肌细胞有丝分裂的时间比阴性对照组延长了约25%;
  3、在成肌细胞分化阶段,用siRNA干扰NCAPG的表达后,1.5天时,干扰组成肌分化相关的基因表达量显著高于阴性对照组,4天时,基因表达出现了反转,干扰组成肌分化相关的基因表达量都显著低于阴性对照组;
  4、分离分化阶段的细胞核和细胞质蛋白,可以看到牛胎儿骨骼肌成肌细胞细胞核中也存在着较高量的NCAPG,表明NCAPG可能会直接作用于分化过程中的细胞染色质,影响基因的表达;
  5、用siRNA干扰NCAPG1.5天后,细胞核中染色质压缩相关的组蛋白修饰H4K20me1的量减少了,而H4K16ac的量增加了,表明干扰NCAPG后,染色质的结构变得更加松散了,也可能说明NCAPG和染色质压缩相关的组蛋白修饰存在着直接或者间接的关联;
  6、siRNA干扰NCAPG4天后,阴性对照组成肌细胞分化正常,形成了大量肌管,而干扰组的肌管开始凋亡,到5天时,肌管已经全部凋亡消失。
[硕士论文] 胡凤明
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:本文研究了代乳品中不同来源的植物性油脂——椰子油和棕榈油脂肪粉对哺乳期犊牛生长性能和胃肠道发育的影响,旨在为哺乳期犊牛培育提供科学的理论依据。通过饲养试验、消化代谢试验测定了犊牛生长性能和对营养物质的消化代谢;通过屠宰试验测定了胃肠道发育及组织形态结构;通过高通量测序技术测定了瘤胃微生物区系的变化。具体内容如下:
  内容一:椰子油和棕榈油脂肪粉对哺乳期犊牛生长性能和屠宰性能的影响
  以椰子油或棕榈油脂肪粉替代代乳品中的乳源脂肪,旨在研究不同来源脂肪对哺乳期犊牛生长性能、免疫机能和屠宰性能的影响。试验选取60头初生荷斯坦公犊牛,分成5个处理组,分别饲喂等氮等能但脂肪组成不同的5种代乳品:1)代乳品中脂肪全部来源于乳脂(W100);2)椰子油脂肪粉替代部分全脂奶粉提供50%的脂肪(C50);3)椰子油脂肪粉完全替代全脂奶粉提供100%脂肪(C100);4)棕榈油脂肪粉替代部分全脂奶粉提供50%的脂肪(P50);5)棕榈油脂肪粉替代全部全脂奶粉提供100%的脂肪(P100),试验期56天,其中预试期14天,正试期42天。结果显示:1)与对照组犊牛相比,饲喂椰子油与棕榈油脂肪粉的试验组犊牛的体重、日增重、干物质采食量、饲料转化率无显著差异(P>0.05);2)饲喂椰子油与棕榈油脂肪粉的犊牛,其粪便评分和腹泻天数与对照组无显著差异(P>0.05);3)犊牛体高、胸围、体斜长、腰角宽及其增长量在处理组间差异均不显著(P>0.05);4)P100组血清葡萄糖浓度显著低于其他处理组(氏0.05);5)宰前活重、空体重、胴体重及屠宰率处理组间均差异不显著(P>0.05)。由此可见,使用椰子油和棕榈油脂肪粉替代代乳品中的乳源脂肪对哺乳期犊牛生长性能、血清免疫及抗氧化指标、屠宰性能的影响无显著差异,这表明在代乳品中使用椰子油脂肪粉或棕榈油脂肪粉替代乳源脂肪对哺乳期犊牛生长性能和免疫机能无不良影响。
  内容二:椰子油和棕榈油脂肪粉对哺乳期犊牛营养物质消化代谢和血脂代谢的影响
  以椰子油或棕榈油脂肪粉替代代乳品中的乳源脂肪,旨在研究不同来源脂肪对哺乳期犊牛营养物质消化和血脂代谢的影响。试验设计同内容一,采用全收粪尿法开展消化代谢试验,并在56d采集犊牛血液,测定血清生化指标。试验结果显示:与其他处理组相比,1)P100组犊牛的粗脂肪表观消化率有降低趋势(P=0.063),干物质、粗蛋白质和有机物表观消化率组间差异不显著(P>0.05);2)P100组总能消化率(P=0.067)有降低的趋势,粪能(P=0.084)有升高的趋势;3)P100组血清总胆固醇含量有降低的趋势(P=0.093)。由此可见,使用椰子油和棕榈油脂肪粉替代代乳品中的乳源脂肪对哺乳期犊牛营养物质代谢、能量利用和血脂代谢的影响没有显著差异,但犊牛饲喂高含量棕榈酸和油酸的全棕榈油代乳品,其粗脂肪表观消化率、总能消化利用率和血清胆固醇浓度都有所降低。
  内容三:椰子油和棕榈油脂肪粉对哺乳期犊牛胃肠道发育、瘤胃发酵及微生物的影响
  以椰子油或棕榈油脂肪粉替代代乳品中的乳源脂肪,旨在研究不同来源脂肪对哺乳期犊胃肠道发育、胃肠道组织形态机构、瘤胃发酵、瘤胃和皱胃食糜酶活、瘤胃微生物区系的影响。试验设计同内容一。每组选取6头牛于60日龄进行屠宰,并采集胃肠道组织样品、瘤胃液、瘤胃和皱胃食糜,分别测定胃肠道组织形态结构、瘤胃发酵、瘤胃和皱胃食糜酶活及瘤胃微生物区系。试验结果显示:1)P100组犊牛的空肠重显著降低(P<0.05);P100组空肠鲜重/活体重与W100组相比有降低趋势(P=0.064);2)C100组和P100组皱胃黏膜厚度与C50组相比有降低趋势(P=0.073);3)瘤胃细菌在门水平和科水平上相对丰度组间差异不显著(p0.05),门水平上0~60日龄犊牛瘤胃内优势菌群主要是拟杆菌门(48.41%)、厚壁菌门(35.54%)、变形菌门(11.80%)和放线菌门(1.83%)。由此可见,使用椰子油或棕榈油替代代乳品中的乳源脂肪对哺乳期犊牛胃肠道发育、瘤胃发酵和瘤胃微生物区系没有不良影响,但高含量棕榈酸和油酸的全棕榈油代乳品减缓了哺乳期犊牛胃肠道发育。
  综上所述,使用椰子油和棕榈油脂肪粉替代代乳品中的乳源脂肪,对哺乳期犊牛生长性能和胃肠道发育没有不良影响,这为植物源脂肪在犊牛代乳品中的应用提供理论依据。
[硕士论文] 张宇微
食品加工与安全 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:仔猪健康尤其是仔猪肠道健康对于生猪安全生长至关重要,如何提高仔猪肠道健康水平是我国生猪养殖业亟待解决的一个关键问题。表乳糖(epilactose)是一种稀有二糖型寡糖,由D-半乳糖通过β-1,4糖苷键和D-甘露糖连接而成的。据报道,表乳糖具有益生特性,能显著提高钙、铁离子在大鼠肠道内的吸收,促进大鼠肠道内乳杆菌和双歧杆菌的增殖。乳杆菌(Lactobacillus spp)是断奶前仔猪肠道中的优势益生菌之一,对维护仔猪肠道健康,改善仔猪断奶综合症至关重要,但关于表乳糖影响猪肠道乳杆菌生长方面的研究鲜有报道。本论文旨在评价表乳糖对于仔猪肠道微生物的组成影响,揭示表乳糖促进仔猪肠道乳杆菌增殖的分子调控机理。对减少饲用抗生素促生长剂的使用,改善仔猪肠道健康,推动寡糖替代饲用抗生素产品的开发应用具有重要的科学意义。
  本论文利用分子生物学方法构建以毕赤酵母为宿主的高效表达纤维二糖差向异构酶的工程菌株。诱导工程菌株生产纤维二糖差向异构酶,以乳糖为底物大批量酶法制备表乳糖。采用活性炭层析柱对反应混合物分离纯化,得到后续试验所需的表乳糖。在7~10日龄哺乳期健康仔猪的粪便中筛选早期定殖的乳杆菌,利用表乳糖为唯一碳源的培养基,筛选出可利用表乳糖的乳杆菌。利用薄层层析色谱和电喷雾质谱测定筛选到的乳杆菌在以表乳糖为唯一碳源生长的代谢产物。利用转录组测定与表乳糖代谢相关基因,结合代谢产物鉴定结果和转录组的结果,初步揭示乳杆菌利用表乳糖增殖的分子调控机理和代谢途径。
  结果表明,以毕赤酵母为宿主生产的纤维二糖差向异构酶酶活力为6.29U/mL,比酶活为274U/mg,酶活力是已报道的以大肠杆菌为宿主表达的酶的20倍。以200g乳糖为原料制备得到纯度为90%的表乳糖331g。在7~10日龄仔猪粪便中分离得到9株乳杆菌,通过16S rDNA测序鉴定为淀粉乳杆菌、卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、唾液乳杆菌、猪源乳杆菌、阴道乳杆菌和粘膜乳杆菌。采用碳源利用实验筛选出可利用表乳糖的3株乳杆菌分别为淀粉乳杆菌、卷曲乳杆菌和唾液乳杆菌。选择利用表乳糖为唯一碳源增殖的最快的唾液乳杆菌作为后续实验菌。薄层层析色谱和电喷雾质谱测定结果表明,在唾液乳杆菌细胞外随着培养时间延长表乳糖含量降低,且未检测到代谢产物的产生,在唾液乳杆菌细胞内检测到表乳糖,说明唾液乳杆菌将表乳糖转运到细胞内分解利用。根据转录组数据分析和相关基因功能的鉴定,确定外源表达的ORF1794(lacZ)可将表乳糖分解为半乳糖和甘露糖,并在唾液乳杆菌胞内检测到ORF1794(lacZ)的活性随着唾液乳杆菌生长而升高。初步推测,ORF1794(β-半乳糖苷酶)参与了唾液乳杆菌的表乳糖代谢。表乳糖在唾液乳杆菌的中的代谢过程,具体为表乳糖先被转运到细胞内,被LacZ分解为半乳糖和甘露糖,半乳糖和甘露糖参与后续的代谢反应。
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