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[硕士论文] 赵兴
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:胸腺(thymus)是T细胞发育、分化和成熟的场所,骨髓中淋巴祖细胞在多种趋化因子的作用下进入胸腺,在胸腺微环境内发育分化为成熟的T细胞,进入外周血和淋巴器官中,成为机体健康的卫士。但动物朐腺的增龄性萎缩将导致其功能减退,机体也随之衰老,疾病丛生。因此,掌握动物胸腺发育的基本规律,探索其萎缩的机理和能够增强其功能抑制其退化的有效方法,对疾病的预防和诊断、抵抗免疫衰老具有非常重要的现实意义。目前关于鸡胸腺生长发育过程中的基因表达变化和分子机制的研究鲜有报道。因此,本研究以科宝肉鸡为研究对象,采用HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色、RNA-Seq以及实时荧光定量PCR等方法研究了鸡胸腺生长发育过程中组织结构和基因表达变化规律,主要研究内容和结果如下:
  1.鸡胸腺发育过程中重量和指数的变化规律
  测定了0w、1w、5w、9w、18w和27w鸡(n=6)的体重及胸腺重量,并计算胸腺指数(胸腺重量(g)/体重(kg))。随着周龄的增加,胸腺重量呈现先上升后下降的趋势,18w时胸腺重量达到最大,27w时萎缩严重。0w到1w,胸腺指数呈上升趋势,从1w到27w,胸腺指数呈下降趋势。
  2.鸡胸腺发育过程中组织结构的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织进行石蜡切片,并进行HE染色。结果显示,胸腺分为外周的皮质和内层的髓质,皮质主要由淋巴细胞和少量上皮细胞构成,着色较深;髓质主要由上皮细胞和少量淋巴细胞构成,着色较浅,其中有典型的胸腺小体结构。随着周龄增加,鸡胸腺皮质逐渐变薄,髓质面积增加,皮髓面积比逐渐减小,胸腺中血管和胸腺小体呈增多趋势。
  3.鸡胸腺发育过程中细胞增殖的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行免疫组织化学染色,检测PCNA阳性细胞的分布和发育变化规律。结果显示,PCNA阳性细胞在胸腺皮质和髓质均有分布,随周龄增加,阳性细胞数目逐渐减少。以上结果表明,鸡胸腺中细胞增殖活动随着周龄的增加而减弱。
  4.鸡胸腺发育过程中肥大细胞的变化规律
  对不同周龄鸡胸腺组织切片进行甲苯胺蓝染色,检测肥大细胞的分布和发育变化规律。结果显示,肥大细胞主要位于胸腺髓质和血管周围。肥大细胞数目在1w升高然后下降,在9w又升高以后逐渐减少。
  5.鸡胸腺发育过程中基因表达的变化规律
  采用RNA-Seq技术检测鸡胸腺发育过程中的基因表达变化规律。测序共获得原始数据21723697300bp,经过过滤质控去除低质量读段后,剩余有效数据21708736650bp,有效读段434174733条,平均24120819条有效读段,有效读段率均大于99.8%,与参考基因组比对率均达到了90%。根据基因表达量进行表达趋势分析,共获得显著富集趋势10个。对持续上调趋势Profile39和持续下调趋势Profile8进行GO和KEGG通路富集分析发现,profile39(即上调趋势)GO富集主要与炎症、免疫、信号转导、凋亡等有关;KEGG富集主要与免疫系统、分泌系统、感染性疾病、信号传递、细胞活动和脂质代谢有关;profile8(即下调趋势)GO富集主要与遗传物质相关组成、传递、修复以及能量代谢等有关;KEGG富集主要与细胞生长和死亡、遗传信息传递、能量和碳水化合物代谢、氨基酸和核苷酸代谢有关。
  对下调趋势细胞周期通路中与细胞增殖和遗传信息传递密切相关的几个关键基因PCNA、CDK1、CCNA2、CCNB2进行实时荧光定量PCR检测,发现其变化规律和测序结果一致,随周龄增加表达量持续降低。
  以上研究结果表明,随着周龄增加,细胞增殖减少,胸腺结构完整性被逐渐破坏,微环境发生变化,导致胸腺重量减少。胸腺中遗传物质传递被破坏阻断,胸腺中物质代谢水平降低,脂肪代谢增加,炎症反应和免疫反应增强。
[硕士论文] 景若曦
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:卵巢发育是一个受多因子调控的动态过程。实验证明,哺乳动物和禽类的卵巢发育过程在卵巢雌激素调控方面存在差异。芳香化酶(CYP19A1)是雄激素转化为雌激素所需要的重要限速酶。本研究将围绕鸡卵泡颗粒细胞层以及膜细胞层,通过高通量测序技术检测鸡小黄卵泡中各细胞层转录组情况,利用生物信息学技术分析鸡卵泡颗粒细胞层与膜细胞层基因表达特点;并运用转录组测序数据与牛卵泡颗粒细胞层与膜细胞层转录组数据进行比较,通过基因表达模式筛选出鸡卵泡中可能调控芳香化酶基因的潜在转录因子,并通过双荧光素酶报告系统对候选转录因子进行验证。主要研究结果如下:
  (1)通过对鸡卵泡各时期各细胞层CYP19A1表达谱的结果分析,发现芳香化酶在鸡卵泡膜细胞层中高表达,并且在小黄卵泡时期表达量最高;
  (2)对鸡小黄卵泡膜细胞层以及颗粒细胞层进行转录组测序,通过分析得到膜细胞层特异表达基因179个,膜细胞层偏好表达基因196个,颗粒细胞层特异表达基因18个,颗粒细胞层偏好表达基因39个;
  (3)通过对鸡小黄卵泡阶段与牛卵泡分化及卵泡选择两个阶段分别进行共表达网络的构建、通过对比发现鸡小黄卵泡阶段基因表达模式与牛卵泡分化期更为接近;对鸡共表达网络进一步分析,发现两个与芳香化酶表达高度相关的基因模块;
  (4)通过对牛与鸡相似卵泡发育阶段基因表达模式的比较与筛选,确定ESR2为调节鸡卵泡芳香化酶基因的候选转录因子;
  (5)在细胞水平,通过双荧光素酶报告系统验证ESR2对CYP19A1启动子片段活性有抑制作用。
[硕士论文] 薛佳佳
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:本论文通过四个试验研究了L-蛋氨酸和DL-蛋氨酸及添加水平对北京鸭生长性能、屠宰性能、血浆生化和血常规指标的影响,从而估测L-Met相对于DL-Met的生物学效价,并确定肉鸭蛋氨酸需要量和最大安全限量,并利用RNA-Seq技术研究了过量蛋氨酸对肉鸭肝脏转录组的影响,以期为肉鸭生产中晶体蛋氨酸的合理使用和蛋氨酸对肉鸭毒性作用的分子机制研究提供理论依据。
  试验一采用玉米-花生粕型饲粮比较了生长前期北京鸭饲粮中L-Met和DL-Met的相对生物学效价。本试验采用2×7+1双因子完全随机试验设计,试验设1个基础饲粮对照组(蛋氨酸029%,代谢能1256MJ/Kg,粗蛋白2215%),7个L-Met或DL-Met添加组(003%,006%,010%,014%,019%,024%和029%),共15个处理组。选取720只1日龄健康雄性北京鸭随机分为15个处理,每个处理8个重复,每个重复6只鸭。试验期21d。结果表明:与基础饲粮组相比,饲粮添加适量L-Met和DL-Met均能显著提高北京鸭平均体重(ABG)、日增重(ADG)、日采食量(ADFI)和腿肌率(P<005)。L-Met组,随饲粮蛋氨酸水平升高,肉鸭ABG和ADG呈现先升高后降低的规律,而DL-Met组肉鸭ABG和ADG则先升高而后趋于稳定。采用二次曲线模型,以ADG为评价指标,以L-Met和DL-Met为蛋氨酸源时,获得的1~21日龄北京鸭饲粮蛋氨酸需要量分别为046%和054%,T检验表明以L-Met为蛋氨酸源时肉鸭对蛋氨酸的需要量显著低于以DL-Met为蛋氨酸源。根据饲粮蛋氨酸总水平为029%,032%,035%,039%,043%和048%处理组,以ADG为评价指标,利用线性斜率比法,估测L-Met相对于DL-Met的生物学效价为134%。
  试验二采用玉米-花生粕型饲粮比较了生长后期北京鸭饲粮中L-Met与DL-Met的相对生物学效价。本试验采用2×7+1双因子完全随机试验设计,试验设1个基础饲粮对照组(蛋氨酸022%,代谢能1275MJ/Kg,粗蛋白1818%),7个L-Met或DL-Met添加组(003%,006%,009%,013%,017%,022%和027%),共15个处理组。选取720只15日龄健康北京鸭随机分为15个处理,每个处理6个重复,每个重复8只鸭。试验期21d。结果表明:与基础饲粮组相比,饲粮添加适量L-Met和DL-Met均能显著提高北京鸭生长性能和第四主翼羽长度(P<005),有显著提高胸肌率的趋势(005<P<010)。采用二次曲线模型,以ADG为评价指标,以L-Met和DL-Met为蛋氨酸源时,获得的15~35日龄北京鸭饲粮蛋氨酸需要量分别为041%和037%,但T检验表明二者差异不显著。根据饲粮蛋氨酸总水平为022%,025%,028%,031%,035%和039%处理组,以ADG为评价指标,利用线性斜率比法,估测L-Met相对于DL-Met的生物学效价为125%。
  试验三采用玉米-豆粕型饲粮比较了生长前期北京鸭饲粮中过量的L-Met和DL-Met的相对生物学效价。本试验采用2×5+1双因子完全随机试验设计,试验设1个基础饲粮对照组(蛋氨酸047%,代谢能1203MJ/Kg,粗蛋白1899%),5个L-Met或DL-Met添加组(025%,050%,075%,100%和125%),共11个处理组。选取492只8日龄健康北京鸭随机分为11个处理,每个处理7个重复,每个重复6只鸭。试验期21d。结果表明:与基础饲粮对照组相比,饲粮蛋氨酸过量时会降低北京鸭ABG、ADG、ADFI、料重比、胸肌率和腹脂率(P<005);显著升高鸭血浆中高半胱氨酸、谷丙转氨酶、总胆红素、乳酸脱氢酶、平均红细胞体积和红细胞体积分布宽度(P<005),而显著降低血红蛋白、平均血红蛋白含量和平均红细胞血红蛋白浓度(P<005),并有降低红细胞计数的趋势(005<P<010)。采用折线模型,以日增重为评价指标,以L-Met和DL-Met为蛋氨酸源时,获得的饲粮蛋氨酸最大安全限量分别为086%和089%,T检验表明二者无显著差异。以日增重和日采食量的抑制程度为评价指标,采用线性模型斜率比法,估测L-Met相对于DL-Met的生物学效价分别是100%和102%。
  试验四利用转录组学技术探究过量蛋氨酸对北京鸭产生毒性作用的分子机制。本试验是在试验三的基础上从基础饲粮组(047%)和蛋氨酸过量组(172%)中分别选取试验鸭各3只,提取肝脏总RNA进行转录组测序分析。结果表明,根据|log2Fold Change|≥058且P-value≤005,共筛选出1082个差异表达基因,表达上调基因467个,表达下调基因615个,这些基因主要与脂质代谢、能量代谢和线粒体凋亡有关;GO功能富集分析显示,差异表达基因主要富集在脂质代谢、免疫反应和线粒体凋亡等生物学过程;KEGG Pathway分析显示,差异表达基因主要富集在代谢通路、钙离子信号通路、炎症因子与其受体相互作用和PPAR信号通路等代谢通路。
  综上,饲粮中适量水平的L-Met和DL-Met均能提高生长前期和生长后期北京鸭的生长性能和胴体品质,而过量的L-Met和DL-Met均会抑制动物生长,导致动物肝脏损伤并出现贫血。本试验条件下,当饲粮中总蛋氨酸水平对北京鸭生长有促进作用时,L-Met的生物学利用率高于DL-Met;饲粮中总蛋氨酸水平对北京鸭生长产生抑制作用时,L-Met和DL-Met的生物学利用率相当。本试验条件下,饲粮过量蛋氨酸会引起肝脏中脂质代谢相关基因转录水平发生显著变化,脂质代谢相关的信号通路被激活。
[博士论文] 哈西卜哈利克
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下几个部分进行探讨:
  1.硼对脾的影响
  在研究中检测了硼对脾发育变化之间的关系和硼(以硼酸的形式)对Hsp40/70表达水平的影响。将30羽健康雏鸵鸟随机分为6组:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组,分别饲喂添加0,40,80,160,320,640mg/L硼的基础日粮。通过HE染色对脾组织进行病理学检查;采用IHC和Western blot检测技术分析Hsp40/70的表达水平;并通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测Hsp40/70的mRNA表达水平。为了研究细胞凋亡,分析了所有处理组的TUNEL反应。该部分研究工作的内容和结果如下:
  1.1硼对鸵鸟脾组织结构的影响
  与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组没有显著性差异。与Ⅰ组比较,Ⅲ组和Ⅳ组白髓的数量和体积增多,边缘区细胞密集增厚,边界清晰。试验组Ⅴ和Ⅵ组织病理学变化明显;白髓的数量和体积减少,边界不清晰。
  1.2硼对Hsp40/70在雏鸵鸟脾中分布的影响
  Hsp70主要在脾脏组织中呈弥漫分布。与Ⅰ组的结果相比,Ⅱ组的Hsp70的分布无显著性差异,但Ⅲ组,特别是饲喂添加160mg/L硼的Ⅳ组的Hsp70分布差异显著。然而,高硼处理组的Hsp70阳性信号的分布开始下降,其在Ⅵ下降得犹为明显。此外,与Ⅰ组相比,Ⅱ组中阳性信号IOD略有增加,但无显著性差异;Ⅲ组和Ⅳ组中Hsp70阳性信号的IOD显著性升高。然而,Ⅴ组阳性信号的IOD却略有降低,但无显著性差异,Ⅵ组阳性信号的IOD显著性降低。通过蛋白免疫印迹分析,Hsp70表达量水平与免疫组化结果的趋势相似。随着硼含量的增加,Hsp70s表达量也增加并在Ⅳ组中达到峰值。Hsp40的表达量的趋势与Hsp70的相似;然而,与Hsp70相比,相同组中Hsp40的表达量较少。这表明Hsp40是Hsp70的辅因子,有助于Hsp70的活性。
  1.3硼对鸵鸟脾Hsp40/70mRNA表达量的影响
  Ⅱ组(40mg/L硼)中Hsp40/70的mRNA表达量水平高于Ⅰ组;Ⅲ组mRNA表达量水平显著升高;Ⅳ组mRNA表达量水平达到峰值,之后Hsp40/70的mRNA表达量水平开始下降;Ⅵ组的mRNA表达量水平最低,与Ⅰ组(对照组)相近。mRNA表达量下降,表明Hsp40/70mRNA表达量是呈现剂量依赖性的,最初在较低剂量下诱导表达,然后在较高量的硼处理组中被抑制。
  1.4硼对鸵鸟脾细胞凋亡的影响
  为了检测硼对雏鸵鸟脾细胞凋亡的影响,采用TUNEL法评估细胞凋亡。TUNEL细胞主要是棕色颗粒的细胞。在Ⅱ组,Ⅲ组和Ⅳ组中,TUNEL阳性信号弱于Ⅰ组;但在第Ⅴ组,特别是Ⅵ组(640mg/L硼)TUNEL阳性信号增强。IOD分析显示Ⅱ-Ⅳ组水平较低,Ⅳ组最低;而与Ⅰ组相比,Ⅴ组和Ⅵ组的IOD水平显著升高。
  2.硼在肾脏组织发育中的作用
  在本试验中,研究了硼对雏鸵鸟肾的作用,特别是抗氧化能力。将48羽雏鸵鸟随机分为6组,在饮用水中补充不同浓度的硼。测定相对氧化/抗氧化酶(T-AOC,MDA,GSH-Px,CAT,GR,SOD)和肾细胞凋亡各项指标。通过qPCR测量该通路(Nrf2,HO-1和GCLC)中3个重要基因的表达,并通过免疫组化分析关键调节因子Nrf2的定位。研究的相应内容和结果如下:
  2.1硼对雏鸵鸟肾组织凋亡的影响
  凋亡的细胞分布在肾的各个部位,这些细胞基本上是棕色颗粒的细胞。与对照组相比,Ⅱ组和Ⅲ组凋亡细胞数量较少。饲喂添加160mg/L硼基础日粮处理组凋亡细胞数量略有增加,当添加剂量达到320mg/L时凋亡细胞数明显增加,在640mg/L剂量时达到峰值。此外,IOD分析显示Ⅱ组和Ⅲ组的水平较低,Ⅲ组水平最低,而与对照组相比,Ⅴ组和Ⅵ组IOD水平显著升高。
  2.2硼对雏鸵鸟肾组织抗氧化活性的影响
  与对照组相比,添加40mg/L和80mg/L硼组MDA含量分别显著降低了26.02%和48.12%,然而添加160-320mg/L硼时增加,640mg/L硼组增加了一倍。添加40mg/L硼组雏鸵鸟肾组织T-AOC活性与对照组相比没有差异,添加80mg/L硼组则明显升高。相反,添加640mg/L硼组T-AOC活性显著下降,与同组MDA含量变化相反。雏鸵鸟肾组织的GSH-PX活性在添加40和80mg/L硼组略有增加,但差异不显著。然而,GSH-PX在添加160,320mg/L硼组显著增加了约50%,添加640mg/L硼组增加了一倍。
  2.3硼对雏鸵鸟肾组织Nrf2抗氧化通路的影响
  研究结果表明,在低剂量硼组,Nrf2阳性产物主要分布在肾近端小管,而高剂量组Nrf2阳性产物分布主要位于上皮细胞中。IOD分析显示,低剂量组Nrf2阳性产物的分布较高,而与Ⅰ组相比,高剂量组的Nrf2阳性产物分布较少。抗氧化通路(Nrf2,HO-1,GCLc)中3个重要基因的qPCR分析显示不同组之间相似而强烈的差异。与对照组相比,当添加硼达到160mg/L剂量时能显著提高了雏鸵鸟肾组织中Nrf2的表达水平,添加80mg/L硼组达到峰值。除了添加40mg/L硼组外,其他添加硼组抗氧化通路GCLc表达量水平均显著升高,添加80mg/L硼组达到最大值。此外,与其他抗氧化因子相比,硼对雏鸵鸟肾组织中HO-1表达量水平的影响是最大的。
  3.硼对肝脏功能的影响
  在非洲鸵鸟饮用水中添加硼酸(0mg,40mg,80mg,160mg,320mg和640mg),观察并检测雏鸵鸟肝中由不同剂量硼引起的组织学,细胞凋亡,组织化学和血清生化参数的变化。通过HE染色和PAS染色评估不同组的组织结构变化;通过TUNEL检测细胞凋亡情况;通过分光光度法检测血清生化指标。得到的结果如下:
  3.1硼对肝组织结构的影响
  90羽鸵鸟肝显示出良好的结构,具有丰富的细胞数量和不同形状的肝门管区。在低剂量硼组,进一步发现肝细胞发育良好,肝门管区清晰可见。在高剂量组中观察到肝组织结构发生改变。与硼中毒有关的主要病变包括:肝门管区炎症和肝细胞病变。肝门管区炎症在Ⅵ组最严重。在肝组织的一些肝细胞中观察到轻度症状,添加640mg/L硼剂量组中较多。此外,一些肝细胞还观察到核疱化。同时,还观察到的部分的核固缩和坏死。
  3.2硼对糖原含量的影响
  Ⅱ组糖原含量高于Ⅰ组,Ⅲ组糖原含量最高,有显著性差异。Ⅳ组可能是最佳剂量,之后糖原量开始下降。与Ⅰ组比较,在Ⅴ组和Ⅵ组中糖原含量最少。经IOD分析证实了以上所述各组糖原水平。
  3.3硼对雏鸵鸟肝细胞凋亡的影响
  低剂量组显示较少的细胞凋亡,Ⅱ组中细胞死亡最少。与Ⅰ组相比,高剂量组,特别是添加640mg/L硼组中肝细胞凋亡量较多。IOD的统计学分析与本研究的TUNEL结果相似,表明硼对细胞凋亡具有剂量依赖性作用,并且添加超过160mg的硼剂量会使更多的细胞凋亡。
  3.4硼对血清生化指标的影响
  血清生化指标受硼剂量的影响显著。高剂量组(添加320mg/L,特别是640mg/L硼组)酶活性参数与空白组相比差异显著。同时,参与代谢的血清生化指标在低剂量组(至Ⅳ组)中显示出硼有利的作用。总体结果表明硼在低剂量(80-160mg/L硼酸)对肝酶活性和代谢有正面的影响,高剂量(主要是640mg硼酸/L)则具有相反的作用。
  简言之,总体结果表明适当的膳食硼摄入量(约160mg)可以使雏鸵鸟各组织发育良好,提高抗氧化的能力,减少细胞的凋亡和正向调节各项血清生化指标。然后,高剂量的硼能引起中毒反应并表现出明显的组织学结构病变。此外,长期超量添加硼会导致HSP表达量下降,糖原消耗过多,细胞凋亡增多和酶活性增加,这些都与硼的作用密切相关。
[硕士论文] 龙烁
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:本研究选用相同蛋鸡品种在相同营养水平条件下,评价产蛋鸡对二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的耐受性,分别研究藻油(microalgae oil,MO)和鱼油(Fish oil,FO)对高峰期产蛋鸡生产性能、蛋品质、血液生化指标、氧化还原状态、蛋黄DHA沉积及对机体免疫机能的影响。探讨了不同来源DHA在蛋鸡饲粮中最大耐受剂量,以及对蛋鸡免疫机能的影响,共包含4个试验:
  试验一不同来源DHA对鸡蛋品质和蛋黄脂肪酸沉积的影响
  本试验旨在研究饲粮添加不同来源DHA蛋黄脂肪酸沉积和蛋品质(鲜蛋与储存期)的影响,以期为生产富含DHA的鸡蛋提供依据。选取产蛋率接近、体况良好的31周龄海兰褐蛋鸡630只,随机分为7个处理(每处理6个重复,每重复15只鸡)。对照组饲喂基础饲粮(不额外添加DHA),试验组以MO和FO作为DHA源添加1.35、2.7、5.4mg/g的DHA,MO添加0.25%、0.5%和1%(实测DHA1.1、2.4、4.1mg/g);FO添加1.08%、2.17%和4.34%(实测DHA1.1、2.7和4.5mg/g)。预试期1周,正试期12周。结果表明:1)试验末期各组蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋形指数和哈氏单位均无显著差异(P>0.05);试验4周,1.35mg/k、gDHA组蛋白高度显著高于2.7和5.4mg/g组(P<0.05);试验8周,与对照组相比,DHA组蛋黄颜色均显著升高(P<0.01)。2)储存28天,各组间MDA含量差异不显著(P>0.05);随储存期延长,蛋黄MDA含量显著高。3)储存14天,MO组哈氏单位显著高于FO组(P<0.05);储存14天,DHA源和添加水平的互作效应对蛋白高度影响显著,MO组蛋白高度随剂量升高而升高,FO组随剂量增加呈现先升高后降低趋势;储存7天和28天,FO组蛋黄颜色显著高于MO组(P<0.05)。4)与对照组相比,各处理组蛋黄DHA、ALA、EPA、MUFA、ω-3PUFA均极显著升高(P<0.01),其中FO组极显著高于MO组(P<0.01);极显著降低ω-6PUFA/ω-3PUFA比值(P<0.01)。蛋黄DHA沉积效率随添加剂量增加而显著下降(P<0.01)。(结论)综上,在本试验条件下,相同添加水平下鱼油源DHA更能促进蛋黄DHA的沉积,添加水平为1.35mg/g时,DHA沉积效率最高。
  试验二不同来源DHA对产蛋鸡免疫机能的影响
  本试验旨在研究DHA对蛋鸡体液和细胞免疫机能的影响。试验选用630只31周龄的健康、产蛋率相近海兰褐蛋鸡,随机分为7个处理,每处理6个重复,每重复15只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮,对照组饲喂基础饲粮(不额外添加DHA),试验组以MO和FO作为DHA源添加1.35、2.7、5.4mg/g的DHA,MO添加0.25%、0.5%和1%(实测DHA为1.1、2.4、4.1mg/g);FO添加1.08%、2.17%和4.34%(实测DHA1.1、2.7和4.5mg/g)。预试期1周,正试期12周。结果表明:1)试验末期各组脾脏指数、胸腺指数及血清IgA水平均无显著差异(P>0.05)。2)免疫后7d,MO2.7、MO5.4、FO1.35和FO2.7组H9抗体水平显著高于对照组(P<0.05),免疫后14d和28d,各组抗体水平无显著差异(P>0.05)。随免疫时间的延长抗体水平随时间升高(P<0.01)。免疫后7d MO1.35、MO2.7、MO5.4和FO1.35组NDV抗体滴度显著高于对照组(P<0.05),MO组显著高于FO组(P<0.05);免疫后14d,MO1.35、FO1.35和FO2.7组抗体滴度显著高于对照组(P<0.05),免疫后28d,MO1.35、MO2.7和FO1.35组抗体滴度显著高于对照组(P<0.05)。3)补充1.35和2.7mg/g的DHA显著增加脾脏IL-2基因的相对表达(P<0.05);对IL-6基因表达无显著影响(P>0.05);补充1.35和2.7mg/g的DHA显著提高IL-10和IFN-γ基因的相对表达(P<0.05)。4)饲粮补充DHA未见影响脾脏淋巴细胞刺激指数和凋亡(P>0.05)。由此可见,在本试验条件下,当饲粮中补充低于2.17mg/g的DHA时,在一定程度上能提高蛋鸡机体免疫机能。
  试验三高峰产蛋鸡对不同来源DHA的耐受性评价
  本试验旨在通过观察生产性能、血液指标、组织病理学切片、器官指数和机体抗氧化情况,评估产蛋鸡对藻油源和鱼油源DHA的耐受剂量,为DHA在产蛋鸡的安全应用提供理论依据。
  试验3.1:试验选用产蛋率接近、体况良好的31周龄海兰褐蛋鸡540只,随机分为6个处理,每处理6个重复,每重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮(不额外添加DHA),试验组以MO作为DHA源添加1.35、2.7、5.4、13.5和27mg/g的DHA(添加MO0.25%、0.5%、1%、2.5%和5%)。预试期1周,正试期12周。结果表明:1)13.5和27mg/g DHA组,产蛋率、平均蛋重和产蛋量显著下降,料蛋比显著上升,采食量显著降低;1.35~5.4mg/g DHA组对生产性能无显著影响。2)与对照组相比,13.5和27mg/g DHA组血清AST、ALT和CRE含量显著升高,造成了一定程度的肝脏和肾脏损伤;且TC、TG、LDL-C和HDL-C水平随添加量增多显著降低;1.35~5.4mg/g DHA组血清生化指标无显著差异3)饲粮添加13.5和27mg/g的DHA,肝脏和肾脏指数显著增加;且肝脏组织中存在大量脂滴,肾脏组织存在炎症;4)13.5和27mg/g DHA组,血清、蛋黄和肝脏中MDA含量显著升高,1.35~5.4mg/g DHA组抗氧化指标无显著差异。因此,高峰期海兰褐蛋鸡饲粮添加藻油源DHA最大耐受剂量为13.5mg/g(藻油添加量低于2.5%)。
  试验3.2:试验选用31周龄产蛋率接近、体况良好的海兰褐蛋鸡450只,随机分为5个处理,每处理6个重复,每重复15只鸡。对照组饲喂基础饲粮(不额外添加DHA),试验组以FO作为DHA源添加0.67、1.35、2.7和5.4mg/g的DHA(添加FO0.54%、1.08%、2.17%和4.34%)。预试期1周,正试期12周。结果表明:1)5.4mg/g DHA组料蛋比显著升高,对产蛋率、平均蛋重和产蛋量无影响;其他处理组生产性能无显著影响;2)与对照组相比,饲粮中添加5.4mg/g的DHA,血清TC、TG、HDL-C和LDL-C显著降低,VLDL显著升高,未影响其他血清生化指标;0.67~2.7mg/g组血清生化指标无显著差异;3)5.4mg/g DHA组肝脏指数显著增加,且肝脏组织中存在大量脂滴;4)饲粮添加5.4mg/g的DHA,血清、蛋黄和肝脏的MDA含量显著升高,0.67~2.7mg/g DHA对抗氧化指标无显著影响。因此,高峰期海兰褐蛋鸡饲粮添加鱼油源DHA最大耐受剂量为5.4mg/g(鱼油添加量低于4.34%)。
[硕士论文] 张树敏
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:在本实验室前期系列肉仔鸡磷营养研究成果的基础上,本研究通过进行如下三个试验,研究建立体外原代培养AA肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞吸收模型,并应用此模型研究磷在原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中的吸收规律及其对相关磷转运载体的表达。
  试验一研究不同接种密度及不同培养时间对原代培养AA肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞紧密连接性及细胞活力的影响,最终构建十二指肠上皮细胞原代培养吸收模型。该试验采用单因子完全随机试验设计,设3个细胞接种密度[2.9×106个/mL(一组)、6.2×106个/mL(二组)与8.8×106个/mL(三组)],共3个处理组,每个处理组6个重复,共培养4天。结果表明:1)刚分离的十二指肠上皮细胞团呈球形,且细胞团的大小均一,悬浮于培养液中,贴壁后细胞团开始向外伸展,逐渐铺成片,细胞之间界限清晰、贴壁均匀,呈单层“铺路石样”生长;2)经碱性磷酸酶染色,阳性处理组的十二指肠上皮细胞胞浆被染成了蓝黑色,阴性对照组的十二指肠上皮细胞不着色,本试验所培养的细胞均为十二指肠上皮细胞;3)在细胞培养的48和72h,一组和二组细胞的跨膜电阻(Transepithelial Electrical Resistance,TEER)值(分别为:458、467Ω·cm2(一组),411、380Ω·cm2(二组))均满足大于300Ωcm2的试验要求,酚红透过率(分别为:2.20、1.19%(一组),3.09、1.81%(二组))均满足小于5%的试验要求,并且一组的跨膜电阻TEER值均显著大于其它两组(P<0.03),细胞酚红透过率均显著小于其它两组(P<0.002);4)在细胞培养的24和48h,一组的LDH酶活力较其他两组均维持在较低水平(P<0.0001)。以上结果表明,细胞接种密度为2.9×106个/mL与培养时间为48h时,细胞间界限清晰、生长状态良好、紧密连接性强,细胞活力最佳,即表明原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞物质吸收模型构建成功,为后续磷在十二指肠上皮细胞的吸收规律及其分子机制的研究提供了良好的试验模型。
  试验二研究不同磷孵育时间下原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中的转运吸收规律,根据磷的吸收与孵育时间的曲线关系以确定细胞最佳孵育时间,为在细胞最敏感的状态下研究磷的吸收提供试验依据。该研究采用单因子完全随机试验设计,设8个磷孵育时间点(0、10、20、40、60、80、100和120m in),共8个处理组,每个处理组6个重复。结果表明:在细胞进行磷孵育不同时间点,十二指肠上皮细胞的磷吸收率存在显著差异(P<0.0001)。在孵育时间0-80min之间,细胞磷吸收率随着磷孵育时间的增加而线性增加,在这一线性增加的时间范围内,选择中间位置时间点40min作为研究不同孵育浓度下细胞磷吸收动力学规律的最佳孵育时间;用二次曲线、渐近线、断线三种曲线拟合的方法对磷吸收率数据拟合相应的曲线模型发现,以渐近线法拟合曲线模型的拟合度最好,因此选用渐近线拟合模型求出的磷吸收率达到饱和的时间点为87min,作为研究不同磷孵育浓度下细胞磷吸收相关转运载体表达的分子机制的最佳孵育时间。
  试验三在试验二确定最佳孵育时间的基础上,研究不同磷孵育浓度下磷在原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中的动力学吸收规律及其对相关转运载体基因表达的影响。该研究采用单因子的完全随机试验设计,设计8个磷水平0.0、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0和48.0mmol/L的含磷孵育液,共8个处理组,每个处理组6个重复,在孵育时间40min时研究不同磷孵育浓度下细胞中磷吸收动力学规律,在孵育时间87min时研究不同磷孵育浓度(0.0、6.0和48.0mmol/L)下磷相关转运载体表达的分子机制。结果表明:1)在不同的磷孵育水平下,肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞磷吸收率呈线性或曲线显著增加(P<0.0001),并且原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞对磷的吸收动力学规律最适合饱和载体转运加非饱和扩散模型;2)孵育液中添加磷(6.0mmol/L)显著抑制(P<0.04)肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中NaP-Ⅱb mRNA表达,显著促进(P<0.0001)细胞中PiT-2mRNA表达,而对PiT-1mRNA表达及NaP-Ⅱb、PiT-1、PiT-2蛋白的表达没有显著影响(P>0.15);3)孵育液中添加磷(48.0mmol/L)显著抑制(P<0.04)肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞中NaP-Ⅱb、PiT-1的mRNA和蛋白表达,显著促进(P<0.0001)细胞中PiT-2mRNA的表达,而对PiT-2蛋白的表达没有显著影响(P>0.15)。以上结果表明,原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞对无机磷的吸收符合饱和载体转运加非饱和扩散模型。并且,当孵育液中磷添加过量时,原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞通过降低NaP-Ⅱb和PiT-1的mRNA及蛋白的表达而限制对磷的吸收。
  综上所述,细胞密度约为3×106个/mL,在细胞培养的48h,成功构建原代培养肉鸡鸡胚十二指肠上皮细胞的物质吸收模型;无机磷在原代培养十二指肠上皮细胞中的磷吸收方式以非饱和扩散加饱和载体转运为主;当孵育液中磷添加过量时,细胞通过下调NaP-Ⅱb、PiT-1mRNA和蛋白表达水平及上调PiT-2mRNA的表达,而限制对磷的吸收,这可能是细胞为了避免磷吸收过量而中毒的自我反馈调节机制。
[硕士论文] 厉秀梅
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:饲养密度和热应激是制约肉鸡集约化养殖的两大主要因素,已引起人们的普遍关注。本文研究了密度和偏热温度对肉鸡骨骼和肌肉生长及其主要调节因子的影响,同时观察对氧化、肠道形态的影响,为确定科学合理的密度和舒适温度提供理论依据。论文共包括2个试验,主要内容如下:
  1.适温下饲养密度对笼养肉鸡胫骨和胸肌生长、氧化及空肠形态的影响
  选取144只健康、体重相近的22日龄爱拔益加(AA)肉鸡,随机分为3个组,每组6个重复,分别转入3个温度为21℃,相对湿度(RH)为60%的环境控制舱中适应7d。29日龄时开始正式试验,饲养密度分别为625只/m2(低密度组)、125只/m2(中密度组)、1875只/m2(高密度组),环境温度为21℃,RH为60%,试验共进行14d。结果表明:1)高密度组的平均日采食量(ADFI)显著低于低密度组和中密度组(P<005),高密度组的平均日增重(ADG)显著低于中密度组(P<005),3个组的料重比(F/G)没有显著差异(P<005);2)同低密度组和中密度组相比,高密度组的血清皮质酮含量显著增高(P<005),碱性磷酸酶(AKP)含量显著降低(P>005),高密度组甲状腺素(T4)含量显著低于低密度组(P<005),高密度组的血清胰岛素样生长因子1(IGF-1)含量显著低于中密度组(P<005),同低密度组和中密度组相比,高密度组显著降低胫骨生长板甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)蛋白表达,降低胫骨长、重,显著降低胸肌中IGF-1和肌分化因子(MyoD)mRNA表达水平(P<005),提高肌肉生长抑制素(MSTN)mRNA表达水平(P<005),降低胸肌率(P<005);3)高密度组肉鸡肝脏和血清中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著低于低密度组和中密度组(P<005),高密度组肉鸡肝脏和血清中的丙二醛(MDA)浓度均显著高于低密度组和中密度组(P<005);4)同中、低密度组相比,高密度组显著降低绒毛高度,增加隐窝深度(P<005)。
  2.偏热温度对肉鸡胫骨和胸肌生长、氧化及空肠形态的影响
  选取体重相近、健康的22日龄AA肉仔鸡96只,随机分为2个组,每组6个重复,每个重复8只(公母各半)。转入2个环境控制舱,适应期7d,温湿度为21℃和60%。正式试验期持续14d,从29日龄开始,其中一个环控舱温度变为31℃,作为实验组,另一个作为对照组保持不变。2个舱湿度保持60%不变。结果表明:1)1~14d,31℃组的ADFI显著低于21℃组(P<005),31℃组的ADG显著低于21℃组(P<005),F/G显著高于21℃组(P<005);2)31℃组的血清中IGF-1和AKP含量显著低于21℃组(P<005),31℃组显著降低胫骨生长板PTHrP蛋白表达,降低肉鸡胫骨宽度(P<005),31℃组显著降低胸肌中IGF-1mRNA以及MyoD mRNA表达水平,降低胸肌率(P<005);3)31℃组显著提高了肉鸡肝脏中MDA含量(P<005);4)31℃组显著减短空肠长度,降低绒毛高度,增加隐窝深度(P<005),破坏了肠道结构。
  结论:1)适温下高密度(1875只/m2)导致胫骨生长板PTHrP蛋白表达下降,笼养肉鸡胫骨长度、重量减少;使胸肌中IGF-1mRNA、MyoD mRNA表达下降,MSTN mRNA的表达提高,胸肌率下降;2)31℃偏热温度使胫骨生长板PTHrP蛋白表达下降,胫骨变窄;使胸肌中IGF-1和MyoDmRNA表达下降,胸肌率下降;3)高密度和31℃偏热温度都增加机体氧化应激,损害空肠形态。
[硕士论文] 吴正可
养殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:本文旨在研究建立菜籽粕脱毒固态发酵工艺,提高菜籽粕饲用价值。在筛选出高效降解菜籽粕中硫甙的天然菌株基础上,结合其他菌株,优化建立菜籽粕的多菌种固态发酵工艺,评定其发酵前后的肉鸡表观代谢能及氨基酸回肠消化率,通过肉鸡饲养试验验证其饲喂效果并确定适宜用量。全文共分为五个试验。
  试验一、菜籽粕脱毒菌株的筛选
  以菜籽粕中主要抗营养因子硫甙(Glucosinolate,GS)为唯一碳源,从发酵青贮与土壤混合液中分离出54株在筛选培养基上生长情况良好的菌株进行分离纯化,并通过菜籽粕固态发酵培养基进行单菌发酵试验,得到一株硫甙降解率达23.69%的菌株A9,对菌株A9进行形态学观察和16S rDNA序列测定与分析,确定菌株A9为嗜酸乳杆菌。将其与酿酒酵母、枯草芽孢杆菌进行混菌发酵,发酵后的菜籽粕(干物质基础)硫甙含量由37.48umol/g降低到25.96umol/g,降解率为30.73%;同时蛋白结构发生改变,蛋白质分子质量变小,多肽含量由0.84%提高到2.62%。总酸含量由1.01%提高到3.91%,菜籽粕的营养价值与风味得到了有效的改善。
  试验二、混菌固态发酵菜籽粕工艺优化
  通过正交设计优化菜籽粕混菌固态发酵工艺,提高菜籽粕的饲用价值。采用嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母3株菌种,以硫甙降解率(X%)、总酸增加率(Y%)、多肽增加率(Z%)为评价指标,并采用加权法以M为综合评价指标(其中M=0.7*X+0.15*Y+0.15*Z),以三株菌不同的添加比例为试验因素,设计L9(34)三因素三水平正交设计试验,探究混菌固态发酵菜籽粕最佳混菌比例;以发酵温度、料水比、时间、接种量为试验因素,设计L16(45)四因素四水平正交设计试验,探究混菌固态发酵菜籽粕的最佳工艺。结果表明:1)混菌固态发酵菜籽粕最佳混菌比例为嗜酸乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母=1∶3∶2;2)混菌固态发酵菜籽粕的最佳条件为发酵温度33℃,发酵时间84h,料水比1∶1,接种量6%。
  试验三、发酵菜籽粕对肉鸡表观代谢能的影响
  本试验选用72只成年AA肉公鸡,按初始体重无差异原则随机分为3个处理,每个处理6个重复,每个重复4只鸡。结果显示发酵后菜籽粕的表观消化能显著升高(P<0.05),发酵后菜籽粕表观消化能由7.41MJ/kg升高到851MJ/kg。
  试验四、发酵菜籽粕对肉鸡氨基酸表观回肠消化率和标准回肠消化率的影响
  本试验选用72只成年AA肉公鸡,按初始体重无差异原则随机分为3个处理,每个处理6个重复,每个重复4只鸡。结果显示发酵后菜籽粕各氨基酸消化率均有不同程度的提高,其中精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的表观回肠消化率与标准回肠消化率显著高于未发酵处理组(P<0.05),其他氨基酸消化率无显著差异(P>0.05)。
  试验五、发酵菜籽粕对肉鸡生长和屠宰性能、免疫功能和肠道发育的影响
  本试验选用420只1日龄AA肉仔公鸡,随机分为7个处理,每个处理6个重复,每个重复10只鸡。以玉米-豆粕型基础日粮为对照,发酵菜籽粕和未发酵菜籽粕均设置5%、10%和15%三个添加梯度。结果显示发酵菜籽粕能不同程度的提高肉鸡生产性能,能显著提高肉鸡屠宰率、全净膛率并降低腹脂率(P<0.05),效果优于未发酵菜籽粕各处理组;发酵菜籽粕能显著提高肉鸡脾脏指数(P<0.05),提高肉鸡十二指肠和空肠的V/C值(P>0.05)。发酵菜籽粕能够替代肉鸡日粮中的豆粕,其中15%的发酵菜籽粕与不添加菜籽粕的生产性能与对照组无显著差异(P>0.05),10%的发酵菜籽粕生产性能、免疫指标、肠道发育状况要优于不添加菜籽粕的对照组(P>0.05)。因此本研究建议发酵菜籽粕在肉鸡中的添加比例为10%。
[硕士论文] 张立兰
动物营养与饲料科学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:本文以纯系白来航蛋鸡为动物模型,研究了长期跨代饲喂转maroACC基因玉米和转mCry1Ac基因玉米对子代蛋鸡肠道发育、肠道微生态和肠道黏膜蛋白质组的非预期效应。试验选用72只产蛋母鸡(50周龄)随机分为3种饲粮处理(8个重复/处理,3只鸡/重复),即:同源非转基因玉米饲粮(CT)、转maroACC基因玉米饲粮(CC)和转mCry1Ac基因玉米饲粮(BT),连续饲喂12周后,通过人工授精、孵化得到子代蛋鸡。子代鸡根据亲代的分组随机分为3个饲粮处理组:1)亲代非转基因玉米/子代非转基因玉米(CT-CT),(2)亲代CC玉米/子代CC玉米(CC-CC)(3)亲代BT玉米/子代BT玉米(BT-BT)。子代公鸡(6个重复/处理,6只鸡/重复,饲喂32周)和母鸡(8个重复/处理,3只鸡/重复;饲喂36周)分开饲养。试验结束后,每个重复随机选择一只子代鸡(6只公鸡/处理和8只母鸡/处理)分别屠宰取样。
  1、长期跨代饲喂转maroACC基因玉米和转mCry1Ac基因玉米对子代蛋鸡肠道发育的影响。测定蛋鸡的体重和屠宰后肠段的长度,分析小肠各段的组织结构和形态。两种转基因玉米饲粮对子代蛋鸡小肠、大肠以及肠道总长的体重校正长度没有显著影响;对小肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度等指标也没有显著影响;小肠各段无可见的病理学变化。
  2、长期跨代饲喂转maroACC基因玉米和转mCry1Ac基因玉米对子代蛋鸡盲肠微生态的影响。利用16S rRNA基因测序的方法,对子代蛋鸡盲肠内容物的V3-V4区进行测序分析。在97%相似水平下,3个处理的a多样性、β多样性、OTU组成、COG功能和KEGG代谢通路均没有显著差异。三种主要门水平微生物分别为拟杆菌门,厚壁菌门和变形杆菌门(占96%以上),无显著差异。与CT-CT组相比,CC-CC组和BT-BT组科和属水平丰度变化的微生物并没有引起盲肠微生态失衡。
  3、长期跨代饲喂转maroACC基因玉米和转mCry1Ac基因玉米对子代母鸡盲肠黏膜蛋白质组的影响。基于TMT蛋白质组学分析,本研究在Gallus gallus中共鉴定到5433个蛋白质,按照表达倍数变化12倍以上且P<005筛选差异蛋白质,995%以上的蛋白质表达量没有发生改变。
  综上所述,本试验条件下,长期跨代饲喂转maroA CC基因玉米和转mCry1Ac基因玉米对子代蛋鸡的肠道发育、盲肠微生态和黏膜蛋白质组未发现明显的负面影响。
[博士论文] 白皓
动物遗传育种与繁殖 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:喙是鸟类重要且特有的采食和饮水器官,起到哺乳动物唇和齿的作用。在家禽生产过程中,喙的健康与其生长状况和生产性能密切相关。本研究团队在北京油鸡的家系选育和扩繁过程中发现了喙畸形(交叉喙,主要表现为上下喙错位、咬合不全、呈交叉状态)的个体。喙畸形鸡生长状况差,产蛋量低甚至不产,死亡率很高,给家禽养殖行业造成了一定的经济损失。据调查,北京油鸡群体中喙畸形发生率可达3%;如清远麻鸡、胡须鸡、丝羽乌骨鸡和文昌鸡等其它鸡种中也有不同程度的喙畸形发生。根据前期喙畸形鸡的个体记录和系谱追溯,喙畸形性状的形成受到遗传因素的影响,但具体遗传机制尚不明确。因此,有必要选择合适的方法筛选与喙畸形性状相关的分子标记、功能基因和通路,最终鉴定并剔除喙畸形/致畸基因携带个体,为揭示喙畸形性状发生的分子机制提供理论基础和科学依据,为其他鸟类及哺乳动物相关遗传疾病研究提供参考。
  本研究采用喙畸形公、母鸡进行随机交配,构建喙畸形北京油鸡资源群体,探究喙畸形性状可能的遗传规律,为后续研究工作奠定基础。以资源群体子一代的48只喙畸形和48只正常鸡为试验素材,利用Affymetrix公司设计的鸡600K高密度SNP芯片,针对喙畸形性状进行基于单个SNP和基于生物学通路的全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)及拷贝数变异分析(copy number variation,CNV)。同时,结合前期转录组和蛋白组研究结果,试图找到影响喙畸形性状的关键SNP、CNV以及重要候选基因和通路。主要研究结果如下:
  1、喙畸形北京油鸡资源群体构建及子代喙畸形发生率。采用12只喙畸形公鸡先后与24只喙畸形母鸡进行随机交配,总共获得921个子一代个体,其中喙畸形个体数为72个,群体喙畸形率为7.82%(同批次繁育的正常北京油鸡群体喙畸形率为0.66%);喙畸形鸡的公、母比例约为1∶1;早期(20日龄之前)喙畸形发生率高,占喙畸形个体总数的88.89%。混精配种试验结果显示,后代群体喙畸形率为7.87%,且亲本均为喙畸形的后代喙畸形率更高,约为喙畸形与正常鸡交配后代的1.5-2倍;子一代与亲代回交试验结果显示,当子一代与亲代同为喙畸形个体时,子二代畸形率较高,达到10%左右,约为喙畸形子一代与正常亲代交配的子二代的3倍;交叉喙主要分为下喙左偏和下喙右偏两种类型,两者的比例约为1∶1,下喙平均偏转角度大于20°,上喙角度正常。
  2、利用鸡600K高密度SNP芯片对北京油鸡喙畸形性状进行基于单个SNP的GWAS分析。质量控制后,剩余95个个体和429539个SNP,平均标记密度为2.46Kb/SNP。采用ROADTRIP(V1.2)软件针对case-control试验设计进行分析,结果检测到与喙畸形性状显著关联的SNP位点1个,位于3号染色体;潜在关联的SNP位点7个,分别位于1、3、5、6、6、10以及23号染色体。针对上述关联位点附近的基因进行功能注释,同时结合前期数字基因表达谱(DGE)研究结果发现,LOC421892、TDRD3、RET和STMN14个基因可能是鸡喙畸形性状研究的重要候选基因。利用PLINK(V1.07)线性回归和一般线性模型,针对鸡喙偏转方向和偏转角度进行分析。针对偏转方向分析结果显示,无显著和潜在关联位点;针对所有喙畸形和正常鸡喙偏转角度分析结果显示,无显著关联位点,潜在关联位点22个;只针对喙畸形个体,将下喙左偏定为负值,下喙右偏定为正值,作为连续性状进行关联分析,未发现与偏转角度关联的位点。
  3、利用鸡600K高密度SNP芯片对北京油鸡喙畸形性状进行基于通路的GWAS分析。基于质量控制和信号通路的筛选标准,最终选择149条通路,包含128,072个SNPs,其中12,850个SNPs包含在多个通路内。采用SRT(SNP ratio test)软件进行分析,共发现有6条通路出现显著性关联信号,包括核糖体通路、卵母细胞减数分裂通路、泛酸和辅酶A的生物合成通路、丙酮酸盐代谢通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路以及钙离子信号调控通路。同时与前期鸡喙组织主要化学成分以及蛋白组学(iTRAQ)研究相结合分析,钙离子信号调控通路可能是鸡喙畸形性状研究的关键调控通路。
  4、利用鸡600K高密度SNP芯片,应用PennCNV软件对北京油鸡喙畸形性状进行全基因组CNV检测。质量控制后,首先采用LRR(SD)<0.3的非严格标准筛选。结果显示,喙畸形和正常组中分别检测到33和115个CNV区域(CNVRs),总长度分别为0.75Mb和11.26Mb。为了获得更准确、高置信以及特异性的CNVRs,采用LRR(SD)<0.135的严格标准筛选。结果显示,喙畸形和正常组中分别检测到2和8个CNVRs,总长度分别为0.32Mb和2.45Mb。其中,6个CNVRs的检出率在喙畸形和正常组之间差异极显著(P<0.01),为各组内特异性的CNVRs,可能是鉴定喙畸形性状的重要候选CNVRs。针对上述10个CNVRs进行qRT-PCR验证,有9个CNVRs与PennCNV软件推测结果一致,验证成功率为90%。针对CNVRs区域内的基因进行基因注释和富集分析,结果发现,LRIG2基因根据其已知功能及与GWAS研究中发现的重要候选基因RET的相关性,可能是鸡喙畸形性状研究的重要候选基因。
  综上所述,本研究推测喙畸形为多基因控制的复杂性状。通过GWAS和CNV的分析,探讨了喙畸形性状形成的遗传机制,与前期研究结果相结合,鉴定出可能与喙畸形性状相关的重要候选基因和调控通路。
[硕士论文] 韩笑
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:据称,内源性反转录病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)是远古反转录病毒感染时留下的痕迹,构成了机体“virome”的重要组成部分。过去对内源性反转录病毒的功能不够了解,曾将其视为“垃圾DNA”(Junk DNA)。但最近有研究表明,某些内源性反转录病毒不仅对早期胚胎发育和胚胎干细胞的多能性具有重要作用,还可能与病毒感染、天然免疫以及抗肿瘤作用有关。本研究选择内源性反转录病毒一鸡内源性白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup E,ALVE)作为研究模型,应用CRISPR/Cas9系统对鸡1号染色体上存在的内源性反转录病毒ALVE1进行去表达以探索其与天然免疫之间的关系,为进一步研究内源性反转录病毒的功能和作用奠定基础。
  本研究通过CRISPR/Cas9技术将转录终止序列(SV40 ployA)敲入内源性反转录病毒ALVE1的启动子区,通过终止其转录从而实现ALVE1的去功能(Loss of function)。本文不仅成功构建了针对家禽内源性反转录病毒去功能研究的新方法,还为今后研究内源性反转录病毒的功能提供了新思路。主要的研究结果如下:
  1、ALVE1的鉴定及转录表达分析:首先,应用反式PCR(Inverse PCR)与cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,成功鉴定了ALVE1在鸡1号染色体的具体位置信息,获得了完整的ALVE1序列。然后,将ALVE1序列分成三部分,分别设计引物进行PCR扩增,结果显示:在鸡巨噬细胞系HD11中含有完整的ALVE1序列,而在鸡成纤维细胞系DF-1中缺乏ALVE1序列。最后,通过PCR鉴定ALVE1在HD11中的转录情况。结果表明: ALVE1的四个区域(即LTR、gag、pol和env)在鸡巨噬细胞系HD11中均能转录表达。
  2、转录终止元件的筛选:为了筛选高效的转录终止序列,本研究构建了含有转录终止序列以及绿色荧光蛋白GFP的载体,通过对GFP荧光的观察以及荧光定量PCR检测,分别比较SV40 polyA、4×SV40 polyA、β-globin和β-globin△5-7四个转录终止序列的终止效率。结果显示:四个转录终止序列都有较高的终止活性,其终止效率均高于90%。在四个终止序列中,由于SV40 polyA的序列最短,本文最终选定SV40 polyA作为本研究的终止元件。在此基础上,本文还继续探索了正向与反向SV40 polyA的终止效率,结果表明:正向与反向的SV40 polyA均有转录终止活性,但是反向序列的终止活性远低于正向序列。
  3、CRISPR/Cas9介导的ALVE1转录终止及其功能初探:为了实现ALVE1去功能以研究其与天然免疫之间的关系,本文构建了含有转录终止序列的同源重组载体,利用CRISPR/Cas9系统将其敲入ALVE1的启动子区,然后通过嘌呤霉素(Puromycin)和新霉素(Neomycin)双筛选,最终获得了ALVE1被终止转录的鸡巨噬细胞系(命名为:HD11-ALVE1-Knowdown)。在此研究的基础上,进一步探索了ALVE1终止表达对细胞天然免疫的影响,通过RT-qPCR检测发现:与正常HD11细胞相比,天然免疫基因TLR3和IFN-β的表达在ALVE1终止表达的细胞中显著下调(P<0.05)。这说明ALVE1与天然免疫密切相关,同时也暗示禽内源性白血病病毒可能与宿主抗病性能有关。
[博士论文] 李东
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:生殖细胞可以把生物的遗传信息传递给下一代,维持生命的传递,对生殖细胞分化研究具有重要意义。原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是所有生殖细胞的始祖细胞,能够在性腺中分化为精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)或卵原干细胞(Ovary stem cells,OSCs),进而进一步发育分化为精子或卵子。PGCs的发生受到许多内源性调控因子和细胞外基质等外源因素的调控,这些因子通过不同的信号通路,构成复杂的调控网络,直接或间接地调控PGCs的形成。目前,研究者们通过体外分离培养、体外诱导、构建转基因细胞等方多种方式对PGCs的生长和分化进行了大量的研究,然而关于调控PGCs发生过程的具体调控网络分子机制却知之甚少,因此PGCs发生过程机制的探究成为近年来备受关注的焦点。
  随着PGCs研究的深入,研究者们已经探究发现存在一些关键性的基因、信号通路、生长因子以及表观遗传修饰因素在此过程中起到重要的调控作用,随着这些因素对于PGCs发生起到了一定的促进作用,但是并没有真正从意义上提供提高PGCs生成效率,进而无法满足相关的科研需求,因此亟需对从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性地探究,深入了解和认识PGCs的产生过程,从而获取大量的PGCs。
  为了进一步探究调控PGCs发生及分化的作用机制,从根本上解决PGCs生成效率低下的问题,本研究基于本实验室前期对鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)、PGCs和SSCs的RNA-Seq测序结果中筛选到PGCs特异表达的新基因LOC418414(Genbank登录号:XM_416629.3)的基础上,根据其表达位置命名为C1EIP,对其在鸡ESCs向PGCs分化过程中从体内和体外两个水平上进行系统的功能和机制验证,深入了解家鸡ESCs向PGCs分化过程的调控机制,为有效提高ESCs向PGCs诱导分化效率提供理论依据和参考,并且为鸡ESCs向PGCs分化其他类似关键功能基因的功能及机制研究提供理论基础。
  研究结果如下:
  1.为了有效确定候选特异基因C1EIP在的生物功能以及其真核细胞中的定位,为后期功能及机制研究奠定基础,对C1EIP进行生物信息学分析显示,C1EIP主要与鸟类同源性较高,但同源蛋白为未知蛋白,未发现特异的结构域。我们结合NCBI数据库提供的C1EIP编码序列,利用RT-PCR扩增C1EIP编码区,分别构建重组表达载体pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP。以pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP转染DF1细胞,确定C1EIP的定位,并以RT-PCR和Western Blot检测C1EIP在真核细胞中转录和翻译的情况;同时以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP载体,肌肉注射小鼠后采血制备抗小鼠血清,以IFA和Western Blot检测抗体效价。酶切及测序结果均显示pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP载体构建成功。pEGFP-C1EIP转染DF1细胞后,C1EIP表达于细胞质中,说明C1EIP定位于细胞质中,且能够启动转录和翻译;以1μg∶1.5μg的比例将PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP产物注射小鼠肌肉制备抗小鼠血清,IFA检测最佳效价为1∶25,并以此效价进行Westen Blot检测显示能够识别到C1EIP蛋白。
  2.为了探究C1EIP在鸡PGCs生成过程中生物学功能探究,我们针对C1EIP编码区设计3个shRNA靶位点和1个阴性对照位点,构建慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包裹,以qRT-PCR检测慢病毒干扰载体的干扰效率。在体外,以慢病毒干扰载体和过表达载体分别转染2代ESCs细胞,结合RA诱导剂诱导,观察ESCs形态变化,并以qRT-PCR、细胞免疫化学和流式细胞分析检测PGCs生成效率;在体内,以慢病毒RNA干扰载体侵染鸡胚,摸索出最佳的侵染效率,侵染后的鸡胚以qRT-PCR、PAS切片染色、免疫组化以及流式细胞分析等方法检测PGCs生成效率。结果显示成功构建慢病毒干扰载体C1EIP-sh1、C1EIP-sh2和C1EIP-sh3,干扰效率分别为80.39%、87.80%和38.36%。在体外,正常RA诱导在第2d出现小类胚体(Embryoid Body,EB),在第4d时类胚体增多、变大,第6d类胚体的边缘开始出现裂口,并且伴随有少量的细胞从类胚体内部释放,第8d时类胚体严重破裂,大量细胞释放,在第10-12d类胚体基本上裂解完全,出现类精原干细胞(Spermatogonial stem cells-like,SSCs-like),并聚团成葡萄串状克隆;过表达组中,在第2d出现大的类胚体,第4d类胚体边缘开始出现小缺口,第6d类胚体大部分破裂并释放大量内部细胞,第8d出现类SSCs细胞,第10-12d出现典型的呈葡萄串状的SSCs克隆;在敲低中,第2-6d细胞未出现类胚体,第8d开始出现小的类胚体,然而培养至12d类胚体的数量、大小以及形态并未出现明显的变化;qRT-PCR结果显示过表达C1EIP后,全能性基因sox2表达量总体上由1.00±0.04持续降低至0.14±0.01,而cvh、c-kit、Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表达量自始至终都逐步上升至2.14±0.03、2.79±0.05、2.26±0.06、2.73±0.03和2.59±0.05,目的基因C1EIP表达量在第4d上升至3.99±0.06,在第12d时由下降至2.87±0.07;敲低C1EIP后,sox2表达量在第0-12d中没有显著的变化,cvh、c-kit和C1EIP表达量分别由1.00±0.02、1.00±0.01和1.00±0.02稳定持续下降至0.55±0.01、0.70±0.01和2.87±0.07,Stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1表达量由1.00±0.04、1.00±0.04、1.00±0.03和1.00±0.04分别先下降至0.53±0.04、0.45±0.05、0.86±0.03和0.76±0.02,然后再略微上升至0.59±0.01、0.80±0.04、0.88±0.04、0.93±0.08;细胞免疫化学结果显示相对于RA诱导组,过表达组显著增加CVH和C-KIT的表达,而敲低组抑制CVH和C-KIT的表达。流式细胞分析结果显示,RA诱导组中CVH+细胞比例为3.4%,在过表达C1EIP后,CVH+细胞比例显著上调至4.6%,然而敲低C1EIP使得CVH+细胞降低至2.9%。在体内,鸡胚注射慢病毒载体的最佳条件为钝端注射10μL106TU/mL慢病毒干扰载体+90μL DMEM,注射后能够稳定表达egfp且鸡胚能够激发绿色荧光。qRT-PCR结果显示各个基因的表达量在Blank组和sh-Ctrl组之间没有显著的变化,而在敲低C1EIP后,全能性基因sox2的表达量下降趋势相对于其他分组有所减缓,而cvh、c-kit、stra8、Dazl、integrinα6和integrinβ1等生殖相关基因以及目的基因C1EIP的大幅度下降到0.20±0.07、0.43±0.08、0.45±0.06、0.51±0.07、0.35±0.07、0.46±0.04和0.22±0.03; PAS结果显示敲低C1EIP能够显著降低PGCs的产生。免疫组织化学结果显示空白组和阴性对照组中生殖嵴中高度表达CVH和C-KIT,且表达部位几乎充满整个生殖嵴中,然而在敲低组中,CVH和C-KIT蛋白表达明显降低,并且表达的部位仅仅局限于生殖嵴的边缘部分。流式细胞分选结果显示,相对于空白组和对照组(4.6%和4.3%),敲低C1EIP使得CVH标记的PGCs比例明显下调至3.1%。
  3.为了系统有效地阐明C1EIP表达的转录水平调控机制,我们结合NCBI和UCSC数据库中查询C1EIP转录起始位点上游启动子2000bp左右的序列,扩增C1EIP启动子长片段,克隆至pEGFP-N1载体中,置换CMV启动子,构建重组表达载体pC1 EIP-EGFP,转染至DF1细胞中检测C1EIP启动子长片段的启动活性;通过缺失片段克隆技术,构建C1EIP启动子不同缺失片段载体PGL3-P1~PGL3-P10,转染DF1细胞后以双荧光素酶报告系统检测各个缺失片段的启动子活性,筛查出C1EIP启动子核心调控区域;在此区域以生物信息学预测关键转录因子结合位点,并对各个转录因子结合位点分别进行定点缺失,构建缺失载体,同样以双荧光素酶报告系统检测转录因子结合位点缺失对启动子活性的影响;最后分别10μmol/L、1μmol/L和4mmol/L的5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Azadc)、Trichostatin A(TSA)和valproic acid(VPA)处理,检测DNA甲基化和组蛋白乙酰化对C1EIP启动子活性以及C1EIP在ESCs、PGCs和SSCs中表达变化的影响。酶切及测序结果均表明pC1EIP-EGFP构建正确,转染DF1细胞后能够激发绿色荧光,定性地说明扩增的C1EIP启动子长片段具有启动活性;同时启动子各个缺失片段载体酶切和测序结果也表明载体构建成功,双荧光素酶检测启动子活性结果显示P4-P6间,即-1025~-912bp为C1EIP启动子的核心活性区域;在此区域内关键的转录因子结合位点包括MEIS1、MAFG∷NFE2L1、STAT3、HLTF和Hand1∷Tcf3,其中只有STAT3起到正向调控作用;最后发现在DNA甲基化抑制5-Azadc以及组蛋白乙酰化抑制剂TSA和VPA处理后,C1EIP启动子活性由10.82±0.54上升至18.49±0.72、33.27±0.83和38.11±0.53,同时5-Azadc、 TSA和VPA处理后,C1EIP在鸡ESCs、PGCs和SSCs中表达量分别由1.00±0.23、5.73±0.54、0.94±0.23变化为1.43±0.42、10.60±0.26、2.83±0.18和2.64±0.23、9.89±0.37、3.25±0.16以及2.99±0.43、8.33±0.56、2.94±0.29。
  4.为了探究C1EIP调控PGCs生成的机制,我们通过构建C1EIP原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中表达,以GST pull-down挖掘C1EIP互作蛋白,构建融合表达载体pcDNA3.0-ENO1-HA,以体外免疫共沉淀技术验证ENO-HA和C1EIP-EGFP间互作关系。结合在线数据库,以生物信息学分析技术探究互作基因ENO1的关联基因,以qRT-PCR验证其在PGCs生成过程中的表达变化情况。通过构建Myc启动子的双荧光素酶报告载体PGL3-Myc-pro以及重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1,同时为了消除同源家族基因的干扰,我们还构建了ENO2的重组表达载体pcDNA3.0-ENO2,结合之前构建完成的pcDNA3.0-ENO1-HA载体,共转染DF1细胞,以双荧光素酶报告系统检测Myc启动子活性变化情况,并根据所得结果和查找相关文献,绘制出C1EIP和ENO1/MBP-1互作介导Notch信号通路调控PGCs生成的模式图。GST pull-down结果显示C1EIP与ENO1之间存在互作,且体外免疫共沉淀验证C1EIP之与ENO1间的互作关系。通过Uniport和PSORTⅡ数据库以及共表达网络分析发现ENO1定位于细胞质中,与Myc相互关联,Myc下游基因为Notch1。qRT-PCR结果显示C1EIP和ENO1在鸡ESCs向SSCs分化过程中表达趋势保持一致,并且与Myc和Notch1表达趋势相反。酶切和测序结果显示双荧光素酶报告载体PGL3-Myc-pro以及重组表达载体pcDNA3.0-MBP-1和pcDNA3.0-ENO2均构建成功,且双荧光素酶检测结果显示MBP-1对Myc启动子活性存在抑制作用,而ENO1和ENO2对其没有影响。最后根据以上结果和相关文献报道绘制C1EIP和MBP-1互作介导Notch信号通路调控PGCs生成的模式图,结果显示C1EIP可能作为锚定蛋白将ENO1蛋白固定于细胞质中,当ENO1发生磷酸化或去磷酸化后,C1EIP将其释放,并易位入核,在易位过程中丢失前面96个氨基酸残基,形成MBP-1蛋白,从而结合至Myc启动子,抑制其转录,进而阻断Notch信号通路的信号传导,最终反向促进鸡ESCs向PGCs方向分化。
[硕士论文] 李富原
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:鹅肥肝既是重要的水禽产品,也是独特的非酒精性脂肪肝研究模型。发现与鹅肥肝形成相关的关键候选基因,揭示它们与鹅肥肝形成的关系,不仅可以促进鹅肥肝形成机制的阐明,而且有助于肝用鹅的分子育种。当一个基因的表达量或其核酸多态性标记(如SNP)与肥肝鹅的生产性能存在关联时,该基因或可用作辅助选择标记来提高肥肝鹅的育种效率,克服目前肥肝鹅育种存在的问题。本研究对IGFBP家族基因和一个长非编码RNA基因(LOC106047490)的表达量进行测定,并对这些基因所含SNP位点与肥肝鹅的生产性能进行关联分析。具体的研究方法和结果如下:
  1.利用荧光定量PCR检测填饲19天朗德鹅和对照鹅肝脏中IGFBP家族基因的表达。数据表明,相对于正常肝脏,鹅肥肝中IGFBP1、IGFBP2和IGFBP5的表达受到明显抑制。该结果提示这三个基因与鹅肥肝的形成密切相关,它们的表达量或可用于肥肝鹅生产性能的预测。
  2.对IGFBP1、IGFBP2和IGFBP5基因及上游DNA区域(起始密码子上游2kb)进行引物设计,检测这些基因SNP位点,并分析SNP位点与填饲鹅生产性能指标(如肝重、腹脂重和胴体重等)的关联。对于SNP位点的筛查,首先利用10只朗德鹅和10只扬州鹅查找品种间的SNP位点,然后扩大样本量检测朗德鹅特有的SNP位点。结果显示:①对于IGFBP1基因,扬州鹅品种内有7个SNP,朗德鹅品种内未发现SNP,而朗德鹅和扬州鹅品种间共有12个SNP;②对于IGFBP2基因,扬州鹅品种内有13个SNP,朗德鹅品种内有1个SNP,而两个品种间共存在49个SNP。统计分析表明朗德鹅品种内的SNP位点与腹脂重呈显著相关(p<0.01);③对于IGFBP5,扬州鹅品种内有10个SNP,朗德鹅品种内特有3个SNP,而朗德鹅和扬州鹅品种间共存在19个SNP。统计分析表明朗德鹅品种内的两个SNP位点与肥肝重呈显著相关(p<0.01)。这些发现从关联分析的角度进一步证实了这些基因作为肝用鹅育种辅助选择标记的应用价值。
  3.NCBI数据库中IGFBP2基因上游距离起始密码子1602bp处存在部分序列未知,本研究通过基因特异性PCR扩增获得了这段367bp长的序列。
  4.利用荧光定量PCR检测lncRNA基因(LOC106047490)在鹅不同填饲期(7天、14天及19天)肝脏、腹脂和胸肌中的表达量。结果表明,填饲可以抑制该基因在三个组织中的表达,且随着填饲时间的延长,该基因在肝脏和胸肌中的表达量下调更加明显,这可能与组织中脂肪的沉积量有关。该发现提示该长非编码RNA基因的表达量或可预测肥肝鹅组织中的脂肪沉积量。
  5.为进一步明确该基因与鹅肥肝形成的关系,本研究利用荧光定量PCR检测了lncRNA基因(LOC106047490)在不同脂肪肝形成相关因子(葡萄糖、胰岛素、棕榈酸、油酸和亚油酸)处理下鹅原代肝细胞中的表达情况。结果发现,除棕榈酸外,其他因子均能诱导该基因的表达,且这种诱导具有一定的剂量效应。这种诱导与鹅肥肝中的表达抑制不一致,提示鹅肥肝形成中还存在着其他更重要的因子调控该基因的表达。
  6.为进一步探讨该基因作为辅助选择标记的应用价值,本研究分析了该基因表达的组织特异性,利用荧光定量PCR对该基因在23日胚龄和89日龄鹅的不同组织中表达量进行测定。结果发现,在鹅胚胎期LOC106047490基因在肝脏和腿肌中表达量较低,而在心、胸肌、肠和肌胃中的表达量较高;而在89日龄鹅,该基因在腹脂中的表达量最高。此外,通过不同时期同类组织中该基因表达量的比较,可以发现该基因的表达模式受鹅生长时间的影响。这些结果为该基因用于鹅育种中的辅助选择提供了参考信息。
  7.对朗德鹅和扬州鹅LOC106047490基因的外显子区进行SNP分析,在扬州鹅品种内发现12个SNP位点,而在朗德鹅品种内未发现SNP位点。
  综上所述,本研究发现IGFBP家族基因和长非编码RNA基因(LOC106047490)均与鹅肥肝的形成密切关联,是肥肝鹅辅助选择标记的重要候选基因。进一步开发利用这些基因,将有助于肥肝鹅育种中现有问题的解决。
[博士论文] 唐现文
兽医 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:本研究以江苏农牧科技职业学院培育的黑羽番鸭为试验素材,开展了黑羽番鸭血液生化指标与产肉性能的关联分析;以黑素皮质素受体1(melanocortin-1 receptor,MC1R)和黑素皮质素受体4(melanocortin-4 receptor, MC4R)为候选基因,采用PCR-SSCP分析和直接测序法,开展了分子遗传多样性分析;利用RT-PCR技术和Western Blot方法分析了MC4R基因在黑羽番鸭不同生长时期胸肌、腿肌组织中mRNA和蛋白表达差异,初步揭示MC4R基因在黑羽番鸭不同时期肌肉中的遗传规律。主要研究结果如下:
  1.对13周龄黑羽番鸭生产性能指标进行检测,公母黑羽番鸭的7个体尺指标均存在显著差异(P<0.05);宰前活重和全净膛率公番鸭(3.2 Kg,79.6%)显著高于母番鸭(1.9 Kg,76.2%)(P<0.05);常规肉品质指标在公母间差异不显著(P>0.05);风味氨基酸含量测定中母番鸭丙氨酸含量显著高于公番鸭(P<0.05)。
  2.高产期笼养组和平养组黑羽番鸭公母鸭血清生化指标检测结果表明,母鸭天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)活性和肌酐含量笼养组显著低于平养组(P<0.05),碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性笼养组显著高于平养组(P<0.05);公鸭平养组血清中AST、UA、SOD活性显著高于笼养组(P<0.05),ALP显著低于笼养组(P<0.05),睾酮(TES)含量极显著低于笼养组(P<0.01)。表明不同饲养方式对黑羽番鸭血清生化指标有一定影响。
  3.黑羽番鸭公鸭产肉性能、肉品质以及血液生化指标进行关联分析,产肉性状与肉品质性状间的相关系数达显著水平(P<0.05),占两组性状间总相关信息的35.4%;产肉性状与血清生化性状间的相关系数达极显著水平(P<0.01),占两组性状间总相关信息的48.6%;肉品质性状与血清生化性状相关系数达显著水平(P<0.05),占两组性状间总相关信息的20.3%。表明产肉性状、肉品质性状、血液生化性状间,起主要作用的性状为半净膛重、全净膛重、pH、失水率和碱性磷酸酶。
  4.黑羽番鸭MC4R基因编码区发现C645T、G672A突变;公番鸭在初生、10周龄、13周龄时TTGG型和CTAG型的体重显著性高于CCAG型体重(P<0.05),CCGG型仅在13周龄时体重显著低于TTGG型(P<0.05),其他基因型之间体重无显著性差异(P>0.05)。公番鸭TTGG型宰前活重显著性高于CCAG型、CCGG型(P<0.05);半净膛重、全净膛重显著性高于CCGG型(P<0.05)。CCAG型和TTGG型胸肌重显著性高于CCGG型、CTAG型和CTGG型(P<0.05);CCGG型胸肌率显著低于其他基因型(P<0.05)。母鸭体重、屠宰性能指标在不同基因型间均无显著性差异(P>0.05)。表明MC4R基因对黑羽番鸭公鸭早期体重和屠宰性能有明显的影响作用。
  5.黑羽番鸭MC1R基因编码区发现G274A、G279A和C485A突变,在第279处的G-A突变中白羽番鸭仅有GG型,而全黑番鸭群体都以GA、AA型存在;全白番鸭与其他3个番鸭群体之间卡方值最大,推测此位点对番鸭的羽色影响较大。
  6.对0-13周龄黑羽番鸭胸肌和腿肌MC4R基因mRNA动态表达水平进行检测,初生黑羽番鸭的mRNA含量显著高于其他各周龄(P<0.05),同一性别、同一肌肉组织样中mRNA含量均存在显著差异(P<0.05),且总体上mRNA含量是先下降后趋于平稳;Westernblot检测结果表明,13周龄公番鸭胸肌组织MC4R基因蛋白表达显著低于腿肌(P<0.05),母番鸭胸肌组织MC4R基因蛋白表达高于于腿肌(P<0.05);公番鸭胸肌MC4R基因蛋白表达总体上要低于母番鸭。蛋白表达与mRNA表达结果有差异,MC4R基因表达规律不明显。
[硕士论文] 宋亚东
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:冬闲田种草养鹅是利用稻田休耕期复种牧草或绿肥,牧草养鹅,鹅粪肥田,绿肥还田,这不仅是一种养殖业和种植业有机结合的理想模式,还可有效改善农田生态环境,使草地畜牧业得到可持续发展,增加农民收入。冬闲田种草养鹅作为一种新的生态养殖方式,还存在多处问题需要进一步完善,如在冬闲田种草养鹅模式下,在规定时间内能否达到上市体重?人们虽普遍认为草饲型肉产品更天然、更健康,但是在该模式肌肉中究竟哪些指标发生改变?针对这些问题,本文将体重大小基本一致的28日龄扬州鹅随机分为4组(A组:全程放牧;B组:全程放牧+后期补饲1周;C组:全程放牧+全程补饲,D组:全程舍饲),每组设置3个重复,每个重复30只。通过比较冬闲田种草养鹅与舍内饲养下肉鹅生长性能及肉品质研究,探讨冬闲田种草养鹅模式的可行性,以期为该模式的推广应用提供理论依据,同时也为农牧结合生态养殖提供新的种养方式。主要研究结果如下:
  1.不同饲养方式下扬州鹅生长性能和屠宰性能结果表明,采用全程放牧+全程补饲方式可取得与全程舍饲生长发育(体重和体尺)相当的效果(P>0.05),70日龄体重可达3647.10g,同时能提高饲料转化率(仅为2.42∶1)。无论是全程放牧、全程放牧+后期补饲或者全程放牧+补饲的腿肌重均大于全程舍饲组(P>0.05),腿肌率显著大于全程舍饲组(P<0.05)。
  2.不同饲养方式下的70日龄鹅肉品质测定结果表明,与全程舍饲组相比,全程放牧+全程补饲的肉鹅肌肉蛋白和胶原蛋白含量都显著或极显著提高(胸肌中含量分别为22.53%和1.50%;腿肌中含量分别为23.08%和1.20%)(P<0.01),而肌内脂肪含量极显著下降(胸肌中含量为2.24%;腿肌中含量为3.51%)(P<0.01),但对肌肉的pH值未产生明显影响(P>0.05),全程放牧组与全程放牧+后期补饲组系水力显著高于全程舍饲组(P<0.05)。
  3.不同饲养方式下的肌肉金属元素含量测定结果表明,在放牧+补饲饲养模式下可提高鹅胸肌镁含量和铜含量,其含量分别为284μg/g和7.57μg/g,但对腿肌金属元素含量影响不大(P>0.05)。不同饲养方式下的肌肉脂肪酸测定结果表明,与全程舍饲组相比,全程放牧组、全程放牧+全程补饲组胸肌中硬脂酸、亚麻酸、花生酸等指标均显著提高(P<0.05);腿肌中亚油酸、亚麻酸均显著提高(P<0.05);而棕榈酸、油酸、DHA含量显著下降(P<0.05)。不同饲养方式下的肌肉胆固醇含量测定结果表明,全程放牧+补饲组与全程舍饲组相比,全程放牧组胸肌中胆固醇含量显著上升(66.58 mg/100g),而腿肌胆固醇含量差异不显著(P>0.05)。
  4.为了探讨不同饲养模式下鹅肌肉DNA甲基化和肉品质的关系,对各饲养模式下的肌肉基因组DNA甲基化进行测定,结果表明,在全程放牧情况下可以显著降低腿肌的DNA甲基化程度(P<0.05)。相关性分析结果表明,鹅腿肌基因组整体DNA甲基化水平与肌肉蛋白含量和不饱和脂肪酸含量呈显著相关(P<0.05)。
  5.为了完善冬闲田种草养鹅模式,进一步对载畜量、轮牧方案、补饲量等技术参数进行研究,根据不同阶段鹅的采食量、草的生长情况提出了冬闲田种草养鹅的最佳方案,即15只/亩,3~4天/轮;并制定了放牧+补饲饲养方式下配合饲料建议补饲量:29~35日龄,每天每只补饲量以80~100 g为宜;36~42日龄,每天每只补饲量以120~140 g为宜;43~49日龄,每天每只补饲量以150~170 g为宜;50~70日龄,每天每只补饲量以180~200 g为宜。
  综上所述,在冬闲田放牧条件下,采用全程放牧+全程补饲方式可取得理想的肥育效果,并在一定程度上提高其肉品质,降低其饲料转化率,因此,冬闲田种草养鹅模式是可行的。
[硕士论文] 任立辰
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:在我国优质肉鸭的培育研究中,对于快大型肉鸭与我国地方鸭品种之间杂交研究甚少,杂交模式与经济效益也鲜有研究。本试验采用人工授精技术将樱桃谷鸭与我国优良蛋鸭品种(金定鸭、攸县麻鸭、莆田黑鸭、绍兴鸭)进行杂交,通过杂交亲本的筛选、组合模式以及杂交后代生产性能比较,为我国优质肉鸭的培育和生产模式研发提供参考资料。
  1.杂交父本的筛选。引入三种候选父本:樱桃谷鸭(快大型、白羽)、广东肉麻鸭(快大型、麻羽)及重庆白鸭(中型、白羽)。同样条件下饲养至相同出栏体重(1.9kg左右),比较发现,樱桃谷鸭生长至出栏体重需要29d,料肉比1.66;广东肉麻鸭需要35d,料肉比1.98;重庆白鸭需要53d,料肉比2.70;在屠宰性能方面,广东肉麻鸭与重庆白鸭差异不显著(P>0.05),均显著高于樱桃谷鸭(P<0.05)。综合分析表明,樱桃谷鸭早期生长速度快,饲料报酬高,养殖经济效益好,符合杂交父本所需特点,因此,选择樱桃谷鸭为杂交父本。
  2.杂交母本的筛选。对杂交母本(金定鸭、攸县麻鸭、莆田黑鸭、绍兴鸭)的生长及生产性能进行测定后发现,金定鸭体重增长速度最快,初生重、105d体重及300d体重均极显著大于其它蛋鸭品种(P<0.01),攸县麻鸭体重最小,300d体重极显著小于其它蛋鸭品种(P<0.01)。在产蛋性能方面,攸县麻鸭见蛋、50%开产日龄最早,产蛋高峰期产蛋率表现为:攸县麻鸭>金定鸭>莆田黑鸭与绍兴鸭,且差异极显著(P<0.01);产蛋高峰期料蛋比:攸县麻鸭与金定鸭差异不显著(P>0.05),均极显著小于绍兴鸭与莆田黑鸭(P<0.01)。攸县麻鸭产蛋性能最佳,金定鸭产蛋性能略低于攸县麻鸭,但其所产鸭蛋蛋重极显著大于其它蛋鸭品种(P<0.01),且青壳比例最高。
  3.通过人工授精技术解决樱桃谷鸭与蛋鸭品种之间体型差异导致交配困难的问题。成功通过母禽诱情法采集樱桃谷父母代公鸭精液,平均采精量为0.62士0.28 ml。对各蛋鸭品种母鸭进行翻肛输精,每隔4天输精一次,种蛋受精率可达70%~80%,可应用于实际生产;种蛋受精率在输精后第一天最高,之后逐天下降;输精第一天后,攸县麻鸭种蛋受精率最高,为86.24%,显著高于莆田黑鸭71.63%(P<0.05)。采用人工授精模式,公母配比达到1∶27,樱桃谷公鸭利用率比自然交配模式提高了五倍。
  4.对不同杂交组合后代生长、屠宰性能及肉品质测定后发现:各杂交组合后代生长速度介于亲本之间,相较于杂交母本均有大幅提升;不同杂交组合后代饲养至45d,体重可达2.3~2.4kg,料肉比2.7~2.8,成活率均高于樱桃谷鸭;除樱莆鸭后代外,其他杂交后代的屠宰性能均优于樱桃谷鸭。各组杂交后代饲养至70d体重增加趋于平缓,其肌肉脂肪含量与嫩度均极显著优于樱桃谷鸭(P<0.01),且胸肌蛋白含量高于樱桃谷鸭,肉品质较好。
  5.在不同杂交组合中,樱桃谷鸭与金定鸭杂交后代的45d成活率最高、活重最大、料肉比最低且全净膛率最高;同时其受精蛋出雏率最高,杂交母本金定鸭产蛋性能优良,所产青壳鸭蛋更受市场欢迎。综上所述,确定樱桃谷鸭与金定鸭为最优杂交组合。
[硕士论文] 吴宁昭
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:microRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA,短单链,长度约22 bp,且在进化过程中高度保守。miRNAs在单细胞和多细胞生物中广泛存在,在转录后水平对基因表达进行调控。现有研究表明miRNA-1和miRNA-133来源于同一对双顺反子(Bicistronic pairs),并对骨骼肌的发生发育有重要的调控作用,而关于鸭miRNA-1和miRNA-133对骨骼肌发育的研究还尚未见有报道。本实验以体型大小不同的樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)作为实验对象,通过实时荧光定量技术构建鸭miRNA-1和miRNA-133的组织表达谱和发育性表达谱;并通过转染miRNA的模拟物或抑制物,采用双荧光素酶报告基因系统对鸭miRNA-1和miRNA-133的功能进行初步探讨,以了解其在鸭骨骼肌发育中的调控作用。主要研究结果如下:
  1.为探明樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的肌肉生长发育与肌纤维发育规律,分别对38、42、45、49、56等不同日龄胸肌重、腿肌重、肌纤维面积等表型进行了测定。结果显示,樱桃谷鸭42日龄胸肌重达205 g,腿肌重达238 g,其肌纤维面积分别是5835μm2和12406μm2,而莆田黑鸭(白羽系)42日龄胸肌重仅为129 g,腿肌重175 g,其肌纤维面积分别是926μm2和4089μm2,表明樱桃谷鸭与莆田黑鸭(白羽系)在胸肌、腿肌发育和肌纤维发育等方面差异显著。
  2.为构建鸭miRNA-1和miRNA-133的组织表达谱和发育性表达谱,本文通过实时荧光定量检测樱桃谷鸭和莆田黑鸭(白羽系)的miRNA-1和miRNA-133表达量。检测结果显示,miRNA-1和miRNA-133在心肌、胸肌和腿肌等肌肉中呈特异性表达。同时检测胚胎期和早期生长发育过程中的肌肉组织miRNA的表达量,发现鸭胸肌和腿肌miRNA-1和miRNA-133的表达呈现出类似的变化趋势,即在胚胎期后期miRNA表达急剧上升,而在整个生长发育期miRNA的表达基本恒定。樱桃谷鸭中表达量分别在胚胎期28天和生长期42天达到峰值,且在这两个时间点,樱桃谷鸭的表达量显著高于莆田黑鸭(P<0.05)。
  3.为探明鸭miRNA-1和miRNA-133对骨骼肌发育的作用,将miRNA-1 mimic或inhibitor和miRNA-133mimic或inhibitor转染至鸭成肌细胞,实时荧光定量检测结果显示,miRNA mimic或inhibitor可有效促进或抑制其表达;且过表达miRNA-1可促进相邻成肌细胞相互融合,而过表达miRNA-133细胞融合现象很少;CCK-8细胞增殖检测结果表明,降低miRNA-1表达可促进成肌细胞增殖,而降低miRNA-133则可抑制成肌细胞增殖;成肌细胞分化标记标志基因表达检测结果显示,转染miRNA-1 mimic,分化标记标志基因MEF2d、Myod表达量显著地上升,而转染miRNA-133 inhibitor,MEF2d、Myod基因的表达量显著地上升。以上结果充分说明miRNA-1可促进鸭成肌细胞分化,miRNA-133可促进成肌细胞增殖。
  4.为进一步阐明miRNA-1和miRNA-133在鸭骨骼肌发育中的作用机制,通过文献检索和生物信息学预测,确定miRNA-1和miRNA-133的候选靶基因。实时荧光定量检测转染miRNA的模拟物和抑制物之后候选靶基因的表达量,结果显示miRNA-1可显著降低其候选靶基因HDAC4的表达(P<0.01),miRNA-133也可降低其候选靶基因SRF、TGFBR1的表达(P<0.01)。双荧光素酶报告系统进一步检测结果表明,miRNA-1可抑制pGL-Basic-HDAC4荧光素酶报告基因活性;而miRNA-133并未降低pGL-Basic-SRF,pGL-Basic-TGFBR1荧光表达强度。因此,鸭miRNA-1可通过靶向HDA C4促进鸭成肌细胞分化;而miRNA-133可影响SRF、TGFBR1的表达,并促进鸭成肌细胞增殖。
[硕士论文] 王飞
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是动物体内重要的成体干细胞,能够将遗传物质传递给下一代,它既有胚胎干细胞的发育特性又能发育成单倍体生殖细胞。现今有大量研究表明精原干细胞可在体外被诱导为具有不同功能的细胞系,用于遗传修饰、疾病治疗和转基因动物制备等,因此对精原干细胞体外操作的研究尤为重要。其中将SSCs诱导形成精子一直是科学家们研究的热门话题,但如何大量获得SSCs并使其产生具有功能性的精子就成为科学家们亟需解决的科学问题。
  通过本课题组前期已完成的鸡雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的转录组测序(RNA-Seq)的实验结果,分析得到了鸡雄性生殖细胞发生过程中基因动态表达的水平变化,有助于对该过程中重要作用的未知基因的发现。本实验研究的目的基因CPED1在SSCs的转录组测序中特异高表达并功能未知,因此有可能对SSCs分化具有重要作用,因此本实验同时利用基因过表达技术和CRISPR/Cas9技术实现对测序过程中发现的精原干细胞高表达基因CPED1功能的研究,为阐明生殖细胞发生及分化机制提供高效方法。
  本研究的主要内容如下:
  (1)基于本实验室前期RNA-Seq技术发现CPED1在ESCs向SSCs分化过程中存在显著差异表达。通过qPCR克隆如皋黄鸡CPED1编码序列,同时构建过表达载体pcDNA3.0-CPED1和敲除载体Cas9/gRNA。通过Fugene转染Cas9/gRNA载体,利用T7E1酶切、SSA活性检测、TA克隆测序和脱靶效率检测Cas9/gRNA载体敲除活性及脱靶情况。在DF-1细胞中通过T7E1酶切检测Cas9/gRNA载体的活性,酶切结果表明,通过条带灰度值估计Cas9/gRNA1载体、Cas9/gRNA2载体和Cas9/gRNA3载体活性分别为37%、20%和30%,Cas9/gRNA1载体敲除活性最佳;SSA活性检测结果表明gRNA1的荧光活性值与对照组相比增加了2倍左右,活性最佳;TA克隆测序结果表明测序的8菌液样中有2管菌液样发生了突变,初步估计基因敲除率为25%左右;脱靶效率检测结果表明在DF-1细胞中无脱靶现象。同时实现了在ESCs中CPED1的定点敲除,敲除效率为25%。这一结果表明CRISPR/Cas9技术能稳定的在鸡DF-1细胞和ESCs上实现CPED1敲除。
  (2)分别将Cas9/gRNA1载体和pcDNA3.0-CPED1过表达载体通过Fugene转染ESCs,转染48小时候换RA诱导培养基培养12d。采用细胞形态学观察、间接免疫荧光检测、流式细胞分析和qRT-PCR等方法检测CPED1于敲除与过表达对ESCs向SSCs分化的影响,结果表明敲除CPED1的ESCs与正常RA诱导组相比,类胚体形成时间延长且停止向雄性生殖细胞分化;第12d RA诱导组与过表达组均能形成类SSCs,敲除组则无类SSCs形成。间接免疫荧光检测结果表明敲除CPED1导致体外诱导10d的ESCs分化生成的integrinα6和integrinβ1双阳性类SSCs数量显著低于过表达组和RA诱导组。流式细胞分析结果表明RA诱导组、过表达组和敲除组中integrinα6阳性类SSCs数量比例分别为1.5%±0.163、1.8%%±0.294和0.9%±0.216,敲除组中阳性细胞率明显低于其它两组。12d qRT-PCR结果表明RA诱导组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的最高表达量分别为1.72,1.62,1.74,2.01,2.36,2.42;过表达组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的最高表达量分别为2.68,1.71,1.95,2.46,2.67,2.78;敲除组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的最高表达量分别为0.42,1.12,1.03,0.87,1.41,1.53;
  RA诱导组和过表达组中CPED1的表达量具有显著差异,敲除组中CPED1以及生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrinα6和integrinβ1的表达量与RA诱导组和过表达组相比呈显著下调。在RA诱导ESCs向SSCs分化过程中,敲除CPED1抑制类SSCs形成,证明CPED1在调控家禽ESCs向SSCs分化过程中起重要作用。
  (3)取新鲜的受精鸡胚,利用PEI包裹Cas9/gRNA1载体和pcDNA3.0-CPED1过表达载体分别进行鸡胚注射,并设立正常孵化组与对照组。分别收集正常孵化至4.5d鸡胚生殖嵴样和18.5d睾丸样,采用石蜡切片及PAS染色、qRT-PCR和流式细胞分析等方法检测CPED1敲除和过表达对鸡雄性生殖细胞体内动态变化的影响。qRT-PCR检测结果显示4.5d的过表达组中生殖相关基因Cvh、Stra8和integrinα6的表达量分别为2.12,1.37,1.20,显著高于敲除组,CPED1表达量(1.07)极显著高于敲除组;18d的过表达组中的Nanog的表达量(0.32)显著低于对照组,integrinα6基因表达量(1.89)显著高于敲除组,CPED1表达量(2.09)极显著高于敲除组。4.5d鸡胚石蜡切片结果表明对照组中PGCs数量为(45±2.236)个,过表达组中PGCs数量为(41±1.699)个,敲除组中PGCs数量为(18±0.745)个,敲除组中含有的PGCs数量低于对照组和过表达组。同时对18d睾丸分离培养的SSCs进行流式细胞分析检测,结果表明对照组、过表达组和敲除组中integrinα6阳性细胞率分别为1.3%±0.141、1.6%±0.356和0.8%±0.245,敲除组中SSCs数量显著减少,对照组和过表达组中却无显著差异。结果证明CPED1对鸡胚干细胞向精原干细胞分化具有促进作用。
[硕士论文] 王苗苗
养殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:不同鹅品种间经济杂交已成为当前鹅业生产的主要手段之一,我们前期研究发现,不同鹅品种间杂交表现出较高的杂种优势,但种蛋受精率要明显低于纯种生产。不同品种间是否存在交配障碍(选择性交配、竞争交配等),从而引起受精率下降,目前尚未有报道。基于此,本研究采用观察记录法,以浙东白鹅、四川白鹅和卡洛斯鹅为研究对象,组建浙东白鹅♂×四川白鹅♀(ZC)、四川白鹅♂×浙东白鹅♀(CZ)、浙东白鹅♂×浙东白鹅♀(ZZ)、四川白鹅♂×四川白鹅♀(CC)、卡洛斯鹅♂×四川白鹅♀(KC)、四川白鹅♂×卡洛斯鹅♀(CK)、卡洛斯鹅♂×卡洛斯鹅♀(KK)、四川白鹅♂×四川白鹅♀(CC)多父本家系。采用视频自动采集系统,观察比较不同组合求偶交配行为,揭示不同品种间求偶交配行为差异及其对种蛋受精率的影响,为科学选配、完善饲养管理制度、提高水禽生产力和经济效益提供一定的理论依据。主要研究结果如下:
  1.为揭示不同鹅品种间求偶交配行为差异,经观察,鹅求偶方式包括公鹅主动求偶、母鹅主动求偶、公母鹅互相求偶,公鹅主动求偶为主要求偶方式。浙东白鹅与四川白鹅存在连续交配、固定交配、交配(竞争)干扰、母鹅爬跨等特殊行为。卡洛斯公鹅存在一对一交配、优胜等级序列与明显的交配(竞争)干扰行为,因此建议在卡洛斯鹅保种过程中剔除此类公鹅,以维持群体的遗传多样性。同时还发现浙东白鹅公母鹅均存在明显选择性交配。卡洛斯鹅与四川白鹅间也存在明显选择性交配,母鹅配合度低,种间亲和性差。
  浙东白鹅与四川白鹅杂交,从总体来看,杂交组公鹅主动求偶频次低于纯繁组,但求偶用时高于纯繁组。其中,四川白鹅♂×浙东白鹅♀组公鹅主动求偶频次和时长(11.93次/天,17.34s)与四川白鹅纯繁组(16.00次/天,14.15s)存在显著差异(P<0.05),说明不同品种间杂交会导致求偶频次降低。浙东白鹅母鹅主动求偶与追逐公鹅的频次高于四川白鹅母鹅,其中,四川白鹅♂×浙东白鹅♀组显著高于其他组(P<0.05),说明浙东白鹅母鹅求偶能力强于四川白鹅母鹅。不同品种杂交还会降低母鹅配合交配的频次,四川白鹅♂×浙东白鹅♀组母鹅配合交配频次为15.71次/天,显著低于四川白鹅纯繁组(20.43次/天)(P<0.05)。根据求偶交配行为频次判断各组最佳合群时间为11-15天,这为开展不同品种杂交确定种蛋收集时间提供了一定的依据。
  卡洛斯鹅与四川白鹅杂交,从总体来看,不同品种间杂交对求偶交配行为影响显著,杂交组公鹅求偶、爬跨、交尾、成功交配与母鹅配合交配的频次均低于纯繁组。尤其是四川白鹅纯繁组上述各种行为频次均显著高于其他组(P<0.05)。说明,四川白鹅求偶交配能力强于卡洛斯鹅,结果提示在今后开展不同种(中国鹅与欧洲鹅)杂交利用时,要调整好公母比例以确保合理的公鹅求偶交配次数。
  2.为揭示不同交配强度的公鹅(浙东白鹅)、母鹅(四川白鹅)血清性激素水平,酶联免疫吸附测定结果表明,成功交配40次以上的公鹅睾酮水平为111.42 ng/L,显著高于交配低于30次的公鹅(81.48 ng/L)(P<0.05);主动求偶与爬跨的母鹅雌二醇水平分别为47.52 ng/L、57.65 ng/L,均显著高于不愿交配的母鹅(13.57 ng/L)(P<0.05),该结果表明性激素在一定程度上影响求偶交配行为。
  3.为阐明求偶交配行为与种蛋受精率的关系,统计分析表明,浙东白鹅与四川白鹅各组合中,种蛋受精率与公鹅成功交配次数显著正相关(rp=0.992*,P<0.05),与三种求偶行为次数不相关。卡洛斯鹅与四川白鹅各组合中,种蛋受精率与公鹅成功交配次数、总交配行为次数显著正相关(rp=0.975*,P<0.05;rp=0.980*,P<0.05),与三种求偶行为次数均不相关。该结果提示在生产中可以通过提高成功交配次数来提高种蛋受精率。
  本研究揭示了中、欧不同鹅品种交配行为差异,并发现各组合种蛋受精率与公鹅成功交配频次呈显著相关,在一定交配次数范围内,公鹅成功交配次数越多,种蛋受精率越高。
[硕士论文] 张向前
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:京海黄鸡拥有小型、优质、早熟、抗逆性强四大特点。从生产记录中发现其群体中存在300日龄产蛋数高和低的特殊个体。产蛋数作为数量性状,其不仅易受环境的影响,同时受到微效多基因的控制。本文着眼于这两点,选择了可能对京海黄鸡产蛋数具有影响的4个基因(ZP2基因、Stat5b基因、AMH基因、MDH1基因),采用qRT-PCR的方法研究了四个基因在300日龄京海黄鸡个体组织里的表达规律,重点剖析了卵巢组织里的表达状况,并通过双荧光素酶基因报告系统对ZP2基因核心启动子区域进行了研究,本文还采用BSP(Bisulfite Sequencing PCR)测序的方法,对卵巢组织中ZP2基因启动子区CpG岛的甲基化进行了定量检测,同时分析了重要甲基化位点对基因mRNA表达量的调控作用,结合启动子区潜在的转录因子结合位点的预测,分析甲基化位点所在区域,进一步探讨ZP2基因的分子调控机制。主要实验结果如下:
  1.通过实时荧光定量检测4个基因在300日龄京海黄鸡9个组织中的mRNA的表达量发现,ZP2基因在卵巢中的表达丰度最高,其次是肾脏;Stat5b基因在腿肌中的表达丰度最高,其次是胸肌,在卵巢中的表达量较低;AMH基因在卵巢中的表达丰度最高,其它组织中的表达量较低;MDH1基因在心脏中的表达丰度最高,其次是腿肌,在卵巢中表达量较低。ZP2基因在高产组中的表达量极显著高于低产组(P<0.01),Stat5b基因和AMH基因在高产组的表达量低于低产组,但没有明显差异,MDH1基因在两组间的表达量几乎相同。以上结果说明,ZP2基因表达上调对京海黄鸡的产蛋数有一定影响,Stat5b基因和MDH1基因对京海黄鸡的产蛋数可能没有直接影响,AMH基因在卵巢中具有较高的表达量,但高低产组的表达差异不显著,其在京海黄鸡卵巢中发挥的作用还需进一步研究。
  2.京海黄鸡ZP2基因启动子系列缺失片段在DF-1细胞中具有不同的启动子活性,重组质粒pGL3-P6的活性最高,pGL3-P5的活性明显下降,说明ZP2基因启动子的核心区域在-1552~-1348之间,与Neural Network PromoterPredietion在线网站预测的结果一致。
  3.通过软件预测发现ZP2基因启动子区共有4个CpG岛,利用BSP技术检测启动子区CpG岛的甲基化状态。ZP2-1扩增片段总体甲基化程度与mRNA表达量有一定程度的负相关(R=-0.197,P=0.672),所有单个位点的甲基化程度与mRNA表达量的相关性都没有达到显著水平;ZP2-2扩增片段总体的甲基化程度与mRNA的表达量也有一定程度的负相关(R=-0.264,P=0.567),其中mC-9位点的甲基化程度与mRNA存在极显著的负相关(P<0.01),但其并没有位于转录因子结合位点内,mC-20和mC-21位点的甲基化程度与mRNA存在显著的负相关(P<0.05),且都位于Sp1转录因子结合位点上,推测上述位点可能是调控转录的主要位点,且可能通过抑制Sp1和DNA的结合,从而抑制ZP2基因的转录。
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