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[博士论文] 孟丽峰
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:尽管蜜蜂大脑存在明显的解剖学和功能分区,但是对各分区行使功能的分子机理还不清楚。蛋白质是生命活动的体现者,最能反映特定器官的功能特性。磷酸化是大脑行使功能的重要调控方式。因此,我们选取两种具有代表性的、行为和生理差异较大的蜜蜂:中华蜜蜂(中蜂)和意大利蜜蜂(意蜂)的采集蜂,利用鸟枪法、非标定量蛋白质组学对大脑的主要功能区蘑菇体、触角神经叶和视神经叶的蛋白质组进行研究。利用Ti4+-IMAC法对磷酸化蛋白质进行富集,然后利用生物信息学的方法对三个主要分区的磷酸化蛋白质组的位点,功能和关键通路以及上游激酶进行分析,以期阐明蜜蜂大脑主要分区调控和行驶功能的分子机理,以及中蜂和意蜂行为差异的神经生物学机理。这将对深入研究蜜蜂大脑不同分区行使功能的神经生物学机理以及其它昆虫大脑分区神经生物学功能研究提供重要的参考依据。
  通过对两种蜜蜂大脑不同分区蛋白质组的比较发现蘑菇体、触角神经叶和视神经叶三个分区的功能特异性也体现在蛋白质组的差异上。两个蜂种的蘑菇体和视神经叶在蛋白质组水平上利用相似的生物学通路来实现各自的功能。蘑菇体中蛋白质的动态变化对突触的塑造和长期记忆的形成具有重要作用。视神经叶上核糖核酸作为受体和第二信使在视觉传导中起重要作用。然而,两种蜜蜂触角神经叶的蛋白质功能存在显著差异,意蜂触角神经叶中与神经传导相关的氢离子和氢离子跨膜转运功能加强,中蜂触角神经叶中与突触塑造和神经递质长距离传输的微管骨架蛋白功能加强,说明两种蜜蜂在长期的进化过程中形成了与特定生存环境相关的嗅觉机制。同时,蛋白质合成和信号转导等与学习记忆相关的功能在中蜂的触角神经叶中加强,说明中蜂在长期的进化过程中形成了更强的嗅觉功能,以适应山区复杂的地貌和采集零星蜜源。进一步研究发现中蜂触角神经叶和蘑菇体中PKA和PKC等与学习记忆相关的激酶活性,以及一些与学习记忆相关的蛋白在Westen-Blot和免疫组化等水平上较意蜂高,证明了中蜂具有较强的嗅觉学习和记忆的能力。
  蛋白质磷酸化对其功能调节至关重要,尤其在大脑信号转导过程中。中蜂和意蜂大脑的三个主要功能区磷酸化蛋白表达谱和位点已经发生了变化,甚至一些执行基本功能的蛋白质的磷酸化位点也发生了变化。意蜂大脑各分区上调的磷酸化位点和蛋白数目远大于中蜂。在蘑菇体中,磷酸化蛋白质的主要作用是调控胞内信号转导,主要参与的通路是磷脂酰肌醇信号途径。触角叶中,两个蜂种的磷酸化蛋白质功能存在显著差异,中蜂触角叶中磷酸化加强了mTOR信号通路、染色质重塑、剪接体等功能,可能与中蜂复杂的生存环境和善于采集零星蜜源有关。而意蜂触角神经叶中蛋白质的磷酸化作用加强了蛋白质的磷酸化,可能与意蜂个体大,代谢旺盛有关。在视神经叶,两种蜜蜂的磷酸化蛋白质的主要功能是参与物质转运和蛋白质运输,上游的激酶主要是STE/STE20。
[硕士论文] 李爽
养殖 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜜蜂工蜂上颚腺是位于头部的一对外分泌腺体,主要生物学功能是分泌脂肪酸作为蜂王浆的主要成分为蜂群提供营养和参与报警外激素的合成,其中上颚腺分泌的10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)是蜂王浆的重要脂肪酸成分和质量指标。蜂王浆高产蜜蜂(简称浆蜂)是我国从意大利蜜蜂(意蜂)中培育的新品系,产量较意蜂提高10倍以上,随着产量提高,其中的10-HDA出现一定程度下降,然而浆蜂和意蜂上颚腺在磷酸化蛋白质组水平上如何调控它们上颚腺的发育和功能的机理尚未开展研究。
  本研究基于液相色谱与二级质谱连用的磷酸化蛋白质组学和生物信息学等方法,通过比较二者工蜂出房蜂、哺育蜂、采集蜂发育阶段上颚腺磷酸化蛋白质组的差异,揭示磷酸化蛋白质组调控上颚腺的发育机制。
  浆蜂3时期分别鉴定到509、554、460个磷酸化蛋白,意蜂分别鉴定到483、499、387个磷酸化蛋白,浆蜂的磷酸化蛋白数目显著高于意蜂,表明浆蜂上颚腺的磷酸化调控网络较意蜂复杂。结果显示浆蜂和意蜂幼蜂、哺育和采集3个时期的磷酸化蛋白表达谱均相似,说明浆蜂和意蜂3时期表达的磷酸化蛋白质执行类似的生物学功能来保障腺体的发育和分泌活动。对每个时期磷酸化蛋白质组比较发现,浆蜂和意蜂上颚腺3个发育时期的磷酸化蛋白质组均存在显著差异。在各时期,意蜂的磷酸化作用通过加强蛋白质合成和加工、糖代谢等过程为腺体各项生命活动提供支持和能量。出房蜂时期,浆蜂磷酸化蛋白主要通过以剪接体为主的RNA加工、细胞骨架蛋白等相关过程的调控用于支持腺体基础发育,为哺育蜂时期产浆行为提供物质基础;经过蜂王浆高产选育,浆蜂哺育蜂时期与意蜂上颚腺磷酸化蛋白质组差异最大,浆蜂磷酸化的调控作用更为复杂,主要参与丙酮酸脱氢酶相关的能量代谢途径、脂肪酸合成、细胞内各类信号转导等过程,浆蜂已具有不同于意蜂的磷酸化蛋白质组,以维持其蜂王浆高产时10-HDA含量的提高及能量供应,保证蜂王浆的营养功能及自身代谢所需;采集蜂时期,磷酸化作用主要通过参与包括应激蛋白等新蛋白的合成适应腺体功能的转变,有助于采集蜂腺体分泌功能及形态变化,加强转运蛋白的合成促进报警激素的释放,适应外界环境,加强泛素化相关蛋白的合成以调控细胞凋亡等适应机体的衰老过程。
  浆蜂和意蜂在3个时期均通过加强不同的磷酸化蛋白质组来支撑上颚腺的发育及功能,其中最显著的差异在哺育蜂时期,浆蜂哺育蜂显著提高了脂肪酸合成力,保障其蜂王浆的基本功能。这在蛋白质修饰的水平上深入探究了浆蜂蜂王浆高产的产浆生物学机理。
[博士论文] Zewdu Ararso Hora
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜜蜂在进化中形成了一套由化学通讯组成的精准系统用以调节他们复杂的社会活动。触角是蜜蜂最重要的嗅觉器官,对于各类化学信号非常敏感,如信息素和各类气味,在调节蜜蜂哺育和采集行为中扮演重要角色。虽然蜜蜂的嗅觉系统对于哺育和采集行为至关重要,但其在蜜蜂随日龄变化的劳动分工职能转变中的分子机理,以及不同蜂种间的差异还不明确。在哺育过程中,蜜蜂的哺育行为能够促进蜜蜂对幼虫信息素的识别,增强蜜蜂的采粉行为,从而提高工蜂王浆的分泌。因此,为了深入探究触角在促进蜂王浆高产中的分子机理,我们对不同日龄意蜂(ITBs)和浆蜂(RJBs)触角蛋白质组进行了比较。浆蜂是从意蜂中选育出的高产王浆的一个品系。两个蜂种中共鉴定到了5692个触角蛋白,是目前在触角中鉴定到的最多的蛋白质。在成年工蜂中,两蜂工蜂的触角蛋白质组主要功能是支持促进与生理和日龄相关的行为发育的各项基础功能。然而,为了适应不同的生理行为,不同日龄的工蜂嗅觉蛋白质组已发生变化。在幼蜂中,触角蛋白质组主要功能是刺激触角神经细胞的发育和分化,以支持嗅觉系统发育成熟。在哺育蜂(NBs)中,触角蛋白质组加强了触角的敏感性,以利于幼虫信息素的识别并促进蜜蜂的哺育行为。在采集蜂(FBs)中,触角蛋白质组扮演着重要角色,主要包括促进各类信号刺激的集中响应和处理,采集期间提供合成蛋白和代谢的原料以调节细胞的动态平衡等。经过数十年的选育,浆蜂触角蛋白质组较意蜂同日龄的触角蛋白质组发生了显著的变化,浆蜂触角蛋白质组主要功能是促进哺育和采集行为,以支持蜂王浆高产的需求。在浆蜂哺育蜂中,主要富集到大量与能量代谢和细胞动态平衡相关的功能类别,上调蛋白均富集到与能量代谢相关的通路,表明浆蜂的触角蛋白质组经过选育已经形成不同的嗅觉系统,以适应大量分泌蜂王浆这一行为。在浆蜂采集蜂中,主要富集到与能量代谢相关的功能类别和代谢通路,例如脂肪酸降解、丙酮酸代谢和包含碱基的化合物代谢加工、吡啶核苷酸代谢加工和乙醛酸、二甲酸代谢,这表明其触角蛋白质组增强了嗅觉系统,为强化花粉等采集行为做准备。本研究为阐明嗅觉在日龄相关的社会劳动分工的分子机理研究方面提供实验数据,并为探究浆蜂蜂王浆高产的分子机理提供新视角。
[硕士论文] 吴鹏杰
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:囊状幼虫病(Sacbrood Disease,SBD)是中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称为中蜂)幼虫期最主要的病毒性病害,可导致幼虫死亡,进而蜂群数量急剧减少。中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese Sacbrood Virus,CSBV)是引起中华蜜蜂囊状幼虫病的病原,已成为近几年来在蜜蜂中分布最为广泛的病毒之一。本文在调查中华蜜蜂囊状幼虫病毒流行分布规律的基础上,对CSBV结构蛋白VP1的分子生物学特性进行了研究,并对响应CSBV感染的两个免疫相关基因SRP9和GABARAP进行了分子克隆、生物信息分析和原核表达研究。
  主要结果如下:
  1、中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测及流行规律调查。采用RT-PCR方法,病毒检测发现,CSBV感染率高达94.59%,其次为黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV),检出率达77.03%。说明CSBV是中华蜜蜂中发病率最高的病毒。在我国东北、华北、华中、华南、西南、东部均能检测到CSBV病毒,发生的地点与我国主要的流蜜期路线相吻合,且存在广泛的混合感染问题。全年发生情况一直较为严重,春繁时期最易感染,呈现1-4月份逐步升高的趋势,6-9月份有所缓和,但10-11月份后又开始上升。
  2、中华蜜蜂囊状幼虫病毒纯化及电镜观察。采用超高速离心和蔗糖密度梯度离心的方法,获得了CSBV-BJ和CSBV-SX两个纯化CSBV病毒。实验观察到CSBV-BJ和CSBV-SX病毒粒子,病毒粒子的形状接近圆形(直径约30nm),接近二十面体的球形。
  3、中华蜜蜂囊状幼虫病毒VP1蛋白单克隆抗体制备。对CSBV-BJ-VP1进行克隆,获得有效序列长945bp,编码315个氨基酸,Nbp/3。该基因的预测分子量和等电点分别约为35.59kDa和9.38。对VP1进行原核表达,构建pET-32a-CSBV-BJ-VP1质粒,优化原核表达条件,在37℃培养,菌株OD600=1.0,IPTG浓度为1.0mM时,获得重组蛋白。将该蛋白免疫小鼠,成功制备了2株VP1单克隆抗体腹水,单抗的亚类均为IgG2a,轻链为κ链。
  4、中华蜜蜂SRP9基因克隆、生物信息分析及原核表达。采用RT-PCR方法,扩增有效序列长为237bp,编码78个氨基酸,(Nbp-3)/3,相对分子量为9.36kDa,等电点为9.17。系统进化树分析表明,中华蜜蜂SRP9与西方蜜蜂Apis mellifera和小蜜蜂Apis florea的SRP9聚成一支。蛋白质二级结构预测发现其含有2个α-螺旋区和3个β-折叠区。同源建模获得蛋白质的三维结构。原核表达后发现该重组蛋白表达在包涵体中,经洗包涵体方法纯化,获得了带有GST标签的重组蛋白。采用荧光定量PCR方法,研究了SRP9基因的表达特性,结果表明,在接种CSBV后,中蜂幼虫体内SRP9基因表达量显著提高。
  5、中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息分析及原核表达。采用RT-PCR方法,扩增获得有效序列354bp,编码117个氨基酸,(Nbp-3)/3,预测分子量为13.99kDa,等电点为9.48。系统进化树分析表明,中华蜜蜂GABARAP与同西方蜜蜂Apis mellifera、小蜜蜂Apis florea、大蜜蜂Apis dorsata、欧洲熊蜂Bombus terrestris、东方熊蜂Bombus impatiens的GABARAP蛋白处于同一个簇中。蛋白质二级结构预测发现其含有3个α螺旋和4个β折叠结构。同源建模获得蛋白质的三维结构。原核表达后发现该重组蛋白表达在包涵体中,经His标签蛋白纯化试剂盒,获得了带有His标签的重组蛋白。采用荧光定量PCR方法,研究了GABARAP基因的表达特性,结果表明,在接种CSBV后,中蜂幼虫体内GABARAP基因表达量显著提高。
[硕士论文] 张元元
食品加工与安全 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:蜂蜜作为天然甜味食品,因具有良好营养价值和保健功能深受人们喜爱。但是近年来,在我国南方部分省市,陆续报道爆发了多起因食用蜂蜜而中毒的事件,使人们对蜂蜜的安全性产生了一定的担忧。本研究通过对疑似有毒蜂蜜样本的分析,发现这些样本含有一定浓度的雷公藤甲素。雷公藤甲素是雷公藤属植物中特有的成分,具有较强的生理活性及毒性,鉴于此,可以将雷公藤甲素作为有毒蜂蜜潜在的特征标志物之一,用于鉴别有毒蜂蜜并可作为快速诊断有毒蜂蜜中毒患者的依据。建立蜂蜜中雷公藤甲素的高灵敏度和特异性检测方法,是开展疑似有毒蜂蜜鉴别及其风险评估的技术保障。目前蜂蜜中雷公藤甲素检测方法相对匮乏,为此,本论文通过优化不同的样品前处理过程,利用超高效液相色谱串联质谱法进行测定,建立了两种不同蜂蜜中雷公藤甲素的检测方法,并基于建立的检测方法考察了蜂蜜中雷公藤甲素在不同贮藏温度下的降解情况。主要研究结果为以下三部分。
  1.通过优化仪器参数(如流动相、色谱柱等参数,以及质谱的碰撞电压、离子对等参数)建立雷公藤甲素的仪器条件。优化样品前处理过程(提取溶剂、净化剂等)建立蜂蜜中雷公藤甲素定量分析的前处理方法。最终选取乙酸乙酯为提取剂,采用两步提取合并提取液的提取方法从蜂蜜中提取出雷公藤甲素,利用自配的净化剂组合包(C18、PSA、中性氧化铝)进行净化,并上机分析测定。结果表明:雷公藤甲素在5.0~1000.0μg/L范围内的线性关系良好,相关系数大于0.999。在5.0,10.0,50.0,100.0μg/kg四个浓度水平下进行添加回收率试验,雷公藤甲素的基质回收率在80%~102%范围内,日内RSD小于8%,日间RSD不超过13%,方法的定量限为5.0μg/kg,检出限为2.0μg/kg。这表明本章所建立的方法可用于蜂蜜中雷公藤甲素的定性和定量分析,且方法具有定性和定量准确、稳定,操作简便的特点。
  2.建立柱前衍生/超高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中雷公藤甲素的定量分析方法。本部分主要是基于改进QuEChERS的前处理方法,对雷公藤甲素的衍生化条件(衍生剂、衍生温度、衍生时间、衍生剂浓度等)进行优化,最终确定样品前处理过程。并对雷公藤甲素衍生物的仪器方法进行优化。结果表明:雷公藤甲素衍生物添加入蜂蜜空白基质中而绘制成的基质标准曲线在1.0-100.0μg/mL范围内线性关系良好。加标回收试验通过基质标准曲线定量发现,在三个浓度1.0,10.0,100.0μg/mL添加水平下,蜂蜜中雷公藤甲素的回收率范围在79%~94%之间,精密度为2.9%~5.8%,准确度为6.9%~10.3%,定量限1.0μg/kg,检出限0.3μg/kg。因此本方法不仅定量限低,而且稳定可靠,可用于准确定性和定量分析蜂蜜中的雷公藤甲素。
  3.研究了雷公藤甲素以及其在蜂蜜贮藏过程中的降解规律,试验表明不管是否有蜂蜜基质的存在,雷公藤甲素的降解规律和温度有密切关系,其降解速度随温度的升高而加快。在日常生活中,蜂蜜往往是放置于35℃、20℃、4℃这三种温度条件下的,通过试验,我们发现蜂蜜中的雷公藤甲素在35℃条件下放置了六个月,其浓度降解了约50%;20℃条件下浓度降解约10%;4℃条件下不发生降解。由此可知通过放置并不能在短期内完全降低蜂蜜中雷公藤甲素的含量。
[硕士论文] 袁晓龙
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:熊蜂是设施作物重要的传粉昆虫。随着设施农业的快速发展,以欧洲地熊蜂Bombus terrestris为主的商品化熊蜂被推广至世界各地,在创造巨大经济价值的同时在很多地区也造成了生物入侵现象。中国是全球熊蜂资源最丰富的国家,但是本土商品化熊蜂的研究相对滞后,长期依赖进口欧洲地熊蜂以满足设施作物授粉需求。但是欧洲地熊蜂对中国的入侵风险尚缺乏研究。本文从交尾与花粉采集两个方面评估了欧洲地熊蜂对中国本土熊蜂的潜在威胁,取得主要结果如下:
  (1)欧洲地熊蜂与我国本土熊蜂的雄性蜂头部分泌物比较采用四级杆飞行时间-气质联用系统(gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry,GC-Q-TOF/MS)测定了欧洲地熊蜂和我国本土9种熊蜂的雄性蜂头部分泌物,并进行聚类分析。结果显示:雄性蜂头部分泌物的物质组成在同一熊蜂种内高度相似,但在不同熊蜂种间差异明显;红光熊蜂B.ignitus、兰州熊蜂B.lantschouensis与欧洲地熊蜂的雄性蜂头部分泌物相似度较高,分别为58.49%与49.23%。
  (2)欧洲地熊蜂雄性蜂对我国兰州熊蜂交尾的影响在人工控制环境下,按照蜂王和雄性蜂为1∶8的比例设置兰州熊蜂交尾组,在此基础上,分别增加与兰州熊蜂雄性蜂比为1/4、1/2和1/1的欧洲地熊蜂雄性蜂,统计分析欧洲地熊蜂雄性蜂对兰州熊蜂交尾的影响。结果显示:在人工条件下,欧洲地熊蜂雄性蜂可以与兰州熊蜂蜂王杂交,并且随着欧洲地熊蜂雄性蜂密度的增加,兰州熊蜂的交尾成功率极显著降低(P<0.01)。
  (3)欧洲地熊蜂与我国本土熊蜂采集花粉比较在我国红光熊蜂和兰州熊蜂等自然分布区放置欧洲地熊蜂蜂群与本土熊蜂蜂群,收集工蜂归巢时携带的花粉,通过双索引高通量条形码技术对花粉进行鉴定,分析欧洲地熊蜂和本土熊蜂采集的花粉种类与花粉构成的重叠率。结果显示:在相同的植被环境中,欧洲地熊蜂与本土熊蜂采集花粉的种类与构成重叠率都在50%~100%之间。欧洲地熊蜂采集的花粉是本土熊蜂采集花粉的关键组成成分。
  本研究结果表明,欧洲地熊蜂与我国兰州熊蜂、红光熊蜂的雄性蜂头部分泌物相似度较高,欧洲地熊蜂雄性蜂的头部分泌物中极可能包含吸引兰州熊蜂和红光熊蜂蜂王的性信息素物质;在人工条件下,欧洲地熊蜂可以和兰州熊蜂杂交并能显著降低后者的交尾成功率。在相同的植被环境中,欧洲地熊蜂与兰州熊蜂、红光熊蜂、密林熊蜂采集花粉的组成类似。说明,欧洲地熊蜂一旦在我国自然界营巢,极有可能对我国本土熊蜂造成生殖干扰,竞争食物资源。本研究从生殖干扰和食物竞争的角度分析了欧洲地熊蜂对我国本土熊蜂的潜在威胁,为外来物种管理及我国本土熊蜂资源保护政策的制定提供了重要的参考依据。
[博士论文] 韩宾
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂具有丰富的社会行为,大脑作为信息处理的最高中枢在蜜蜂行为的调控中发挥至关重要的作用。神经肽是在大脑神经信息传递过程中具有作用的活性生物多肽,通过在神经元、神经回路、组织器官水平上整合神经系统和其他系统的功能,最终在生长发育、代谢、生殖、求偶、觅食行为等方面发挥重要的调节功能。与此同时,大脑主要利用电信号和化学信号传输信息,多种类型的膜蛋白,如受体蛋白、通道蛋白、转运蛋白等在信号传导中发挥不可或缺的作用,而膜蛋白的磷酸化修饰在蛋白功能和信号传导中发挥广泛而且精细的调控作用。然而,关于大脑神经肽组、膜蛋白质组和膜磷酸化蛋白质组在工蜂行为调控中的研究还未见报道。本研究针对蜜蜂成年工蜂中存在的与日龄相关的劳动分工现象,以工蜂不同发育时期的大脑为研究对象并选取了意大利蜜蜂(原意)和蜂王浆高产蜜蜂(浆蜂)两个品系,利用非标记蛋白质组学定量、膜蛋白提取、磷酸化富集、生物信息学分析等手段开展了工蜂大脑神经肽和膜蛋白在行为调控中的研究。
  在工蜂大脑发现的22种神经肽前体蛋白中鉴定到158条非冗余的神经肽,其中77条为首次鉴定,显著提高了蜜蜂神经肽组的覆盖率。在工蜂不同发育时期,14类神经肽家族动态调节工蜂生理以适应不同阶段劳动分工的需要,尤其是在采集蜂时期加强了代谢、运动、生物节律等方面生理调控以适应巢外采集工作。对原意和浆蜂大脑神经肽组的定量比较发现,浆蜂的神经肽组发生了重构,以适应蜂王浆高产的需要,其中利尿激素(DH)和外周神经激肽(PVK)通过加强浆蜂哺育蜂水分和离子平衡的调控为蜂王浆分泌量提高提供了有力的支撑;速激肽(TK)在嗅觉识别调控中发挥重要的负调控作用,其在浆蜂中的低表达有利于浆蜂对幼虫的识别,同时加强了对花粉的采集,保障了蜂王浆分泌对蛋白质的需求,从而促进了蜂王浆分泌量提高。
  膜蛋白作为信号传递的受体在蜜蜂大脑调控行为中具有重要功能,我们在不同发育阶段的蜜蜂大脑中鉴定到1079种膜蛋白,它们主要参与氧化磷酸化、内质网蛋白质加工、溶酶体等十个重要通路,其中氧化磷酸化途径主要为大脑神经元功能提供能量保障,而内质网蛋白质加工通路能够为各种酶、神经肽、突触以及囊泡的膜蛋白组件的合成和加工提供分子基础。为了满足工蜂不同发育阶段大脑生理功能的需要,大脑膜蛋白质组处于动态变化之中。在成年工蜂发育早期,碳水化合物、核甘酸和脂类代谢相关的膜蛋白上调表达为神经元的增殖、迁移等提供物质和能量支持,促进大脑结构和功能的完善;采集蜂在巢外从事采集工作面对多变的外部环境,其大脑需要处理复杂的视觉、嗅觉、以及触觉信息,此时上调表达的膜蛋白种类最多,且主要是通过增强神经元之间的信号传导加强行为调控并帮助采集蜂更高效的处理信息。通过对原意和浆蜂膜蛋质组的比较发现,浆蜂大脑膜蛋白加强了对哺育和采集行为的调控,进而支持蜂王浆高产的需要。在哺育蜂阶段,浆蜂大脑中的磷脂酰肌醇信号通路和花生四烯酸信号通路的功能得到加强,有利于提高对幼虫信息素的识别,进而提高台基接受率,这是蜂王浆高产的前提;在采集蜂阶段,浆蜂大脑中与神经信号传导相关的通路功能得到加强,如:SNARE在囊泡运输中的互作,wnt信号通路,TGF-beta信号通路等,增强了采集蜂对花粉的采集力,为蜂群提供充足的蛋白质食物以满足哺育蜂分泌蜂王浆对蛋白质的需求。
  通过对工蜂大脑膜蛋白磷酸化修饰的鉴定和分析发现,其磷酸化修饰主要在MAPKs,CDKs和CK2这几类激酶的催化下完成。在工蜂大脑发育不同时期,磷酸化参与调控的重点也有所不同,幼蜂期主要促进神经元的发育和突触功能的成熟,成蜂期主要加强哺育蜂和采集蜂大脑神经元离子传输和信号传导。原意和浆蜂大脑的膜磷酸化蛋白质组的比较发现,浆蜂中上调表达的磷酸化蛋白数目更多说明磷酸化在浆蜂大脑功能中的调控作用更加活跃。尤其是在哺育蜂和采集蜂时期,转运蛋白磷酸化水平显著提升表明神经元信号传导能力在浆蜂中得到加强,从而更有利于对哺育和采集行为的调控,为蜂王浆分泌量的提升提供保障。
  本研究通过对工蜂大脑神经肽组、膜蛋白质组和膜磷酸化蛋白质组的分析,深入解析了蜜蜂行为的神经调控和蜂王浆高产分子基础。在多维组学水平上全面阐释了神经肽、膜蛋白、膜磷酸化蛋白调节蜜蜂劳动分工行为和浆蜂蜂王浆高产的神经生物学机理。这不仅是对蜜蜂神经生物学的理论创新,同时也为其它昆虫在该领域的研究提供了借鉴。
[硕士论文] 李帅
食品工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:全氟烷基化合物(Perfluorinated alkyl substances,PFASs)是人工合成的一类新型持久性有机污染物,由亲水基末端和不同长度的疏水烷基碳链组成的,疏水烷基碳链上的氢原子全部被氟原子替代,形成含有极高化学能的C-F键(约为110 kcal/mol),其稳定性极强,具有化学惰性和耐热性等优良性能。在20世纪50年代就广泛被用作杀虫剂、表面活性剂、润滑剂、催化剂、以及合成药物、氟橡胶、树脂的中间体。PFASs难以被新陈代谢、水解、光解、生物降解,在生物体内随着时间的推移可不断富集,PFASs在生物体内的蓄积浓度远高于已知的二噁英和有机氯等持久性环境污染物。大量研究发现,全氟辛酸(PFOA)与全氟辛烷磺酸(PFOS)具有生殖毒性、心血管毒性、肝脏毒性、甲状腺毒性和神经毒性。目前,国内外学者相继在水产品、动物肝脏、蛋、奶、母乳中检测出了PFASs,而通过膳食摄入PFASs已成为人体内PFASs的来源之一。本文采用高效液相色谱-串联质谱技术结合QuEChERS方法对蜂蜜中的PFASs残留检测方法进行了研究。主要研究内容如下:
  采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术结合改进QuEChERS预处理方法建立了同时蜂蜜中20种全氟烷基化合物(全氟丁酸、全氟戊酸、全氟丁烷磺酸、全氟己酸、全氟戊烷磺酸钠、全氟庚酸、全氟己烷磺酸、全氟庚烷磺酸钠、全氟辛酸、全氟辛烷磺酸钠、全氟壬酸、全氟壬烷磺酸钠、全氟癸酸、全氟癸烷磺酸钠、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟十三烷酸、全氟十四烷酸、全氟十六烷酸、全氟十八烷酸)的残留检测方法。称取5.0g蜂蜜样品于50 mL聚丙烯(PP)离心管中,加入5μL2μg/mL混合内标标准溶液和5 mL水,然后加入10 mL含1.5%甲酸(v/v)的乙腈,漩涡1 min后,加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸镁,振摇10 min后,以10000 r/min离心10 min。取上层乙腈7 mL转移到装有40 mg PSA、80 mg C18和900mg无水MgSO4的15 mL离心管中,振摇10 min后,以10000 r/min离心10 min,最后取4 mL(相当于2 g试样提取液)上清液于玻璃氮吹管中,40℃水浴氮吹至干,以1 mL甲醇定容后,过0.22μm滤膜,HPLC-MS/MS分析。Atlantis T3 C18色谱柱分离,以含5 mmol/L乙酸铵的甲醇溶液和5 mmol/L乙酸铵溶液溶液为流动相进行梯度洗脱。电喷雾离子(ESI)源负离子模式下以多反应监测(MRM)扫描,采用同位素内标法进行定量分析。
  实验结果表明,20种PFASs在0.2~10μg/L浓度范围内线性相关系数均大于0.995;检出限范围为0.04~0.1μg/kg;定量限范围为0.1~0.2μg/kg。在0.1、0.5、1和2μg/kg添加浓度下(n=6),20种PFASs加标回收率范围为72.56%~112.98%,相对标准偏差(RSD)范围为0.73%~15.73%。结果表明,该方法快速、高效、准确,适用于蜂蜜样品中20种PFASs的同时分析检测。
[硕士论文] 王丽
动物营养与饲料科学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:昆虫的多型性现象是基因和环境共同作用的结果,其中一种典型的表现形式就是蜜蜂的级型分化。蜜蜂级型分化的机理一直以来都是蜜蜂发育生物学中备受争议的问题。有研究表明,DNA甲基化对蜜蜂的级型分化有重要的作用。蛋氨酸作为一种重要的食源性甲基供体,在蜜蜂级型分化中的作用仍无人探究。
  本研究拟将蛋氨酸作为意大利蜜蜂幼虫甲基供体的食物来源展开研究,探索蛋氨酸源甲基供体对意大利蜜蜂级型分化的影响。分三个试验进行:首先,确定蜂王与工蜂幼虫体内甲基供体S-腺苷蛋氨酸(SAM)合成与代谢的差异,为探索DNA甲基化与蜜蜂级型分化的关系提供理论依据;在此基础上,利用蛋氨酸及去甲基化试剂,从正、反两个方向具体验证蛋氨酸源甲基供体对DNA甲基化的影响;DNA甲基化的进行需要能量三磷酸腺苷(ATP)的参与,而ATP主要由单糖通过三羧酸循环提供,所以最后,研究蛋氨酸与单糖协同对意大利蜜蜂级型分化的影响,最终确定蛋氨酸作为一种食源性甲基供体与单糖协同对意大利蜜蜂级型分化的影响。主要研究内容和结果如下:
  试验一.蜂王与工蜂幼虫体内甲基供体SAM合成与代谢的差异研究。试验选用分别来自5群姐妹蜂王群新出房的1 d意大利蜜蜂幼虫890只,分为两组,每组5个重复,每个重复89只。其中第1组组织人工育王,第2组自然发育成工蜂。取3d、4d和5d的蜂王与工蜂的幼虫,测定其体内SAM合成与代谢关键酶基因的表达及其酶活的差异。
  结果表明:
  (1)蜂王幼虫的SAM含量随日龄的增加变化不显著(P>0.05)而工蜂幼虫的随日龄增而升高(P<0.05)。
  (2)蜂王幼虫SAMS表达量随日龄增加而下降(P<0.01),而工蜂幼虫SAMS表达量随日龄变化不显著(P>0.05);
  (3)蜂王幼虫的Dnmt1a表达量随日龄增加无显著变化(P>0.05),但其酶活随日龄增加而下降(P<0.05);工蜂幼虫Dnmt1a表达量随日龄增加而下降(P>0.05),但其酶活随日龄增加而上升(P<0.01);
  (4)蜂王幼虫Dnmt3表达量随日龄增加而下降(P<0.05),而工蜂幼虫变化不显著;工蜂幼虫Dnmt3酶活性随日龄变化显著(P<0.05),而蜂王幼虫变化不显著(P>0.05)。本试验表明:3—5日龄意大利蜜蜂蜂王幼虫与工蜂幼虫体内的活性甲基供体SAM的合成与代谢存在差异,4日龄前SAM参与DNA维持甲基化的代谢过程,蜂王幼虫比工蜂活跃,4日龄后工蜂幼虫比蜂王幼虫活跃;在3—5日龄期间,蜂王幼虫SAM参与DNA从头甲基化的代谢过程逐渐减弱,工蜂幼虫维持不变,但该代谢过程在蜂王幼虫体内始终不低于工蜂幼虫。
  试验二.蛋氨酸源甲基供体对意大利蜜蜂级型分化的影响。试验选用1d意大利蜜蜂幼虫360只,平均分为3组,每组5个重复,每个重复24只。试验中第1组:幼虫阶段全部饲喂基础日粮;第2组:1d-2d饲喂基础日粮,2d以后饲喂添加了蛋氨酸的日粮;第3组:1d-2d饲喂基础日粮,2d-3d饲喂添加了蛋氨酸的日粮,3d及以后饲喂添加了去甲基化试剂5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)的日粮。
  结果表明:
  (1)饲粮中单纯添加了蛋氨酸之后,幼虫化蛹率和羽化率都会升高,且差异显著(P<0.05),而添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后幼虫的化蛹率和羽化率都会降低,且差异显著(P<0.05)。
  (2)饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,幼虫化蛹出房后的成蜂卵巢小管数显著增加(P<0.0001),成蜂体长也是同样趋势(P<0.01)。
  (3)取5日龄幼虫测定生理生化指标:饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,幼虫体内SAMS表达量显著低于其他组(P<0.05);饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,幼虫体内Dnmt1酶活显著下降(P<0.0001);幼虫体内Dnmt3表达量显著低于其他两组;添加了蛋氨酸之后Dnmt3表达量高于对照组(P<0.01);饲粮中添加了5-氮杂胞嘧啶核苷(5-Azacytidine)之后,Dnmt3酶活显著高于对照组和蛋氨酸组(P<0.01)。本试验说明,蛋氨酸源甲基供体会影响幼虫化蛹羽化出房后成蜂的卵巢小管的数量和幼虫体内与甲基化有关的活性甲基供体SAM的合成与代谢,进而影响蜜蜂的级型分化,使得蜜蜂幼虫朝着工蜂方向发育。
  试验三.蛋氨酸源甲基供体与单糖协同对意大利蜜蜂级型分化的影响。试验选用1d意大利蜜蜂幼虫1480只,平均分为6组,每组5个重复。第1组饲喂基础日粮,第2-6组分别饲喂固定蛋氨酸量为3mg/g,而葡萄糖:果糖分别为为2:3、1:1、4:3、5:3和2:1的日粮。
  研究结果表明:
  (1)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后,葡萄糖:果糖为4:3和5:3时幼虫化蛹率最高(P<0.01);葡萄糖:果糖为1:1时,幼虫羽化率最高,在葡萄糖:果糖为2:3时,幼虫羽化率和化蛹率都是最低(P<0.0001)。
  (2)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后,葡萄糖:果糖为2:3时幼虫化蛹羽化出房后卵巢小管数最少,继续升高葡萄糖的量到葡萄糖:果糖为12:6时,卵巢小管数不断增多,且卵巢小管数在50-80条及>90条之间的的成蜂数量所占总的羽化出房的成蜂数量比例升高(P<0.0001);葡萄糖:果糖为2:3时幼虫化蛹羽化出房后成蜂体长最短,葡萄糖:果糖为2:1时,成蜂的体长最长(P<0.0001)。
  (3)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后影响SAM的合成,3日龄时,葡萄糖:果糖为8:6时,SAM含量最多(P<0.01),4日龄时,在基础日粮和葡萄糖:果糖为4:6时幼虫体内SAM含量最多(P<0.01);4日龄时,基础日粮组和葡萄糖:果糖为12:6时,SAMS表达量最多(P<0.05),5日龄时,葡萄糖:果糖为10:6时幼虫体内SAMS表达量最多(P<0.05);
  (4)饲粮中固定蛋氨酸改变葡萄糖的量之后影响ATP的合成:4日龄时,葡萄糖:果糖为2:3时,ATP含量最少,葡萄糖:果糖为1:1和4:3时,幼虫体内ATP含量最多(P<0.05);3日龄时,饲喂基础日粮时,幼虫体内柠檬酸合酶(CS)基因表达量最小,葡萄糖:果糖为4:6时和12:6时,幼虫体内CS表达量高于其他组(P<0.05),4日龄时,随葡萄糖量的增多,柠檬酸合酶(CS)基因表达量差异显著(P<0.05)。本试验研究表明,蛋氨酸源甲基供体与单糖协同作用会影响幼虫羽化出房后成蜂卵巢小管的数量及幼虫体内DNA甲基化代谢相关酶活与基因表达量,进而影响蜜蜂的级型分化,即饲粮中添加蛋氨酸及多的单糖,会使得蜜蜂幼虫朝着蜂王方向发育。
  综上研究表明,蛋氨酸能够通过调节意大利蜜蜂幼虫的相关的生理生化指标,影响幼虫生长发育,进而以食源性甲基供体的作用影响蜜蜂的级型分化。
[硕士论文] 刘春蕾
养殖 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:在我国北方地区,冬季气候寒冷,外界无蜜源,蜜蜂越冬期间无法从外界获取食物,只能消耗越冬前贮备的食物。因此,越冬饲料的质量好坏直接影响着蜂群的健康。自然状态下蜜蜂越冬期的糖饲料是蜜源季节储存的蜂蜜,但是,蜂农为了追求蜂产品产量和利润,往往会在蜜源季取竭蜂群内的储蜜,转而选择廉价的白砂糖作为越冬饲料,更有蜂农甚至会使用更廉价的果葡糖浆替代白砂糖作为越冬饲料。越冬期不同糖源类型对蜜蜂的饲养价值并不清楚,因此,本研究选择蔗糖、蜂蜜、果葡糖浆为蜜蜂越冬期糖源饲料,通过检测越冬期蜜蜂中肠理化指标、组织形态和肠道菌群区系等指标,探索糖源对越冬蜜蜂肠道健康的影响,从而为养蜂生产中越冬饲料的选择提供参考。
  在秋末(10月底)选取群势相当的本地意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)越冬蜂群(群内无储备越冬饲料脾)9群,随机分为3个试验组(3群/组),从11月2号开始分别以蜂蜜、白砂糖和果葡糖浆为糖源进行饲喂,至11月下旬喂足越冬饲料,蜂群进入越冬期。分别于越冬前(11月初)、越冬中期(1月初)和越冬后(3月初)采集蜜蜂中肠,测定中肠消化酶(淀粉酶、蔗糖酶和蛋白酶)活性;在越冬中期采集蜜蜂中肠用于中肠组织形态和抗氧化酶基因(Sod1、Sod2和CAT)表达水平等指标的检测;在越冬前(11初)和越冬中期(1月初)采集蜜蜂的中肠和直肠,利用16S rDNA技术测定蜜蜂肠道菌群的种类和丰富度。结果表明:1、不同糖源饲料对越冬蜜蜂中肠消化酶及抗氧化酶基因表达的影响:(1)在越冬中期,果葡糖浆组和蜂蜜组的蜜蜂中肠内淀粉酶活性显著高于蔗糖组(P<0.05)。(2)不同糖源饲料对蜜蜂中肠内蔗糖酶活性的影响差异不显著(P>0.05)。(3)在越冬中期,果葡糖浆组的蜜蜂中肠内蛋白酶活性显著高于蔗糖组和蜂蜜组(P<0.05)。(4)在越冬中期,蔗糖组的蜜蜂中肠Sod1基因的相对表达量显著高于蜂蜜组和果葡糖浆组(P<0.05)。2、不同糖源饲料对越冬蜜蜂中肠组织结构的影响:蜂蜜组和蔗糖组的蜜蜂中肠肠壁厚度显著大于果葡糖浆组(P<0.01),而且蜂蜜组和蔗糖组的蜜蜂中肠隐窝深度比果葡糖浆组中肠隐窝深度深(P<0.01)。3、不同糖源饲料对越冬蜜蜂肠道菌群的种类和丰富度的影响:(1)在门水平,越冬蜜蜂的肠道菌群主要为变形菌门(Proteobacteria,63.17%)、厚壁菌门(Firmicutes,17.61%)、放线菌门(Actinobacteria,4.06%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,1.72%)。在属水平,Lactobacillus(15.91%)和Bifidobacterium(3.24%)为主要优势菌属。(2)白砂糖能够提高越冬蜜蜂肠道中放线菌门(Actinobacteria)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和根瘤菌目(Rhizobiales)的丰富度,蜂蜜能够提高蜜蜂肠道中γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和巴斯德氏菌目(Pasteurellales)的丰富度,而果葡糖浆可以增加蜜蜂肠道中β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)的丰富度。
  本试验表明,不同糖源饲料能够改变越冬蜜蜂肠道菌群的结构,蜂蜜和白砂糖能够提高越冬蜜蜂肠道中有益菌的相对丰度;蜂蜜能够提高越冬蜜蜂中肠消化酶活性,蜂蜜和白砂糖有利于越冬蜜蜂中肠组织的发育,而且白砂糖能够提高越冬蜜蜂中肠抗氧化基因的表达。因此,蜂蜜和白砂糖比果葡糖浆更适合作为蜜蜂越冬的糖源饲料。
[硕士论文] 雷春红
动物营养与饲料科学 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:在蜜粉源缺乏的季节代用花粉的使用日趋广泛,科学合理配置营养均衡的蜜蜂饲粮是亟待解决的问题。蜜蜂的天然饲粮中含有丰富的泛酸,故推测泛酸可能是蜜蜂饲粮中不可或缺的组成成分。本研究以不同泛酸水平的饲粮人工饲养工蜂幼虫和工蜂成蜂,探讨不同泛酸添加水平对蜜蜂生长发育、生理生化、及脂质代谢的影响,获得幼虫和成蜂人工饲粮中泛酸的适宜添加水平,从而为配制营养均衡的蜜蜂饲粮提供依据。
  试验一:
  蜜蜂幼虫阶段饲粮中泛酸的适宜水平研究。试验选取1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫1800只,随机分为5组,每组3个重复,每个重复120只。5组工蜂幼虫分别饲喂泛酸水平为0.92 mg/g(对照)、1.22 mg/g、1.52 mg/g、1.82 mg/g、2.12 mg/g的5种试验饲粮,饲喂至化蛹。分别取5日龄(d)和7日龄(d)幼虫,测定体重(干重及鲜重)、体成分(粗蛋白及粗脂肪)、血淋巴生化指标(TP、TG、TCHO、HDL、LDL)、抗氧化指标(MDA、SOD、T-AOC)、CoA合成相关酶基因的mRNA相对表达量(BCoAS、PANK4、PPCDC、PPCS),并计算幼虫的化蛹率和羽化率。
  结果表明:
  1)饲粮中泛酸的添加可显著提高蜜蜂羽化率(P<0.05);随饲粮中泛酸水平的升高,5日龄和7日龄幼虫的鲜重和干重均呈现先升高后降低的趋势(P<0.05),在1.82 mg/g均达到最高;蜂体粗脂肪含量显著升高(P<0.05);
  2)随饲粮中泛酸水平的升高,5日龄工蜂幼虫血淋巴中TP(总蛋白)、TCHO(总胆固醇)、HDL(高密度脂蛋白胆固醇)、LDL(低密度脂蛋白胆固醇)含量均呈现先降低后升高(P<0.05);
  3)5日龄和7日龄虫体T-AOC以及5日龄虫体SOD活性随饲粮泛酸水平的升高而显著升高(P<0.05);
  4)饲粮泛酸水平显著影响5日龄幼虫泛酸激酶4基因(PANK4)和磷酸泛酰-半胱氨酸脱羧酶(PPCDC)基因的mRNA相对表达量(P<0.05),且均在泛酸水平为1.82 mg/g时mRNA相对表达量最高。分别以饲粮泛酸水平与5日龄虫体的干重和羽化率作拟合曲线,获得意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中适宜的泛酸水平为1.85 mg/g~2.01 mg/g。
  试验二:
  意大利蜜蜂工蜂成蜂饲粮中泛酸的适宜水平研究。移取新出房的幼蜂于蜂盒,随机分为7组,每组3个重复,分别饲喂泛酸添加水平为0 mg/kg,9.8 mg/kg,19.6 mg/kg,39.2 mg/kg,78.4 mg/kg,147.0 mg/kg,261.3 mg/kg的人工饲粮。分别于3日龄、6日龄和9日龄时取样,测定蜜蜂的采食量、体成分、血淋巴生化指标、抗氧化指标、中肠脂肪酸代谢酶的活性及基因的mRNA表达量、蜂体的脂肪酸组成。
  结果表明:
  1)饲粮中泛酸的添加可显著影响蜂体的粗脂肪含量(P<0.05),且随泛酸添加水平的升高,蜂体粗脂肪含量有降低的趋势;
  2)与对照组相比,泛酸添加组6日龄和9日龄蜂体的SOD和AOC显著增加(P<0.05),9日龄蜂体MDA显著降低(P<0.05);
  3)饲粮中泛酸的添加对6日龄和9日龄血淋巴中TCHO含量有显著影响(P<0.05),显著降低3日龄、6日龄和9日龄血淋巴中TG的含量(P<0.05);6日龄血淋巴中LDL含量呈现先降低后升高的趋势。
  4)与空白对照组相比,饲粮中泛酸的补充可显著影响3日龄蜜蜂蜂体的单不饱和脂肪酸含量(P<0.05),泛酸添加组可显著降低9日龄蜂体的多不饱和脂肪酸(P<0.05)。
  5)随泛酸添加水平的升高,3日龄、6日龄和9日龄中肠脂肪酶活性均呈现先升高后降低的趋势(P<0.05),分别在39.20 mg/g、9.80 mg/g和39.20 mg/g时达到最高。
  6)与空白对照组相比,6日龄中肠39.20 mg/kg组的ACC基因mRNA表达量显著降低(P<0.05),且与其他添加组间没有显著差异(P>0.05);3日龄中肠FAS的基因的mRNA表达量随泛酸添加水平的升高呈现先降低后升高的趋势(P<0.05)。通过对饲粮中泛酸添加水平与蜂体抗氧化指标做拟合曲线,可得成蜂饲粮中泛酸的适宜添加水平为84 mg/kg~123 mg/kg。
  以上研究表明,饲粮中泛酸的添加可促进蜜蜂的生长发育,增强机体抗氧化能力。幼虫饲粮中泛酸适宜添加水平1.85 mg/g~2.01 mg/g,成蜂饲粮中泛酸的适宜添加水平为84 mg/kg~123 mg/kg。
[硕士论文] 郑天祥
森林保护学 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:黄粉虫Tenebrio molitor Linneeus又名面包虫、黄粉甲等,现在主要人工饲养,由于其含有丰富的蛋白质和脂肪酸等营养成分,脂肪酸占其幼虫干重的30%以上,且不饱和脂肪酸含量又占黄粉虫脂肪酸比例的70%以上,不但可作为家养鸟类及宠物的饲料,也是一种食用昆虫,因而明确其脂肪酸合成途径及关键基因对于食品安全和食品成分的进一步加工非常重要。此外,在昆虫中脂肪酸的衍生物包括鞘脂类,甘油酯类、脂肪醇、蜡酯及烃类,对于信息素合成、表皮形成、能量提供、昆虫耐寒性等具有重要作用,通路上的关键酶有可能成为新农药靶标位点,用于害虫防治。基于上述原因,本研究以黄粉虫为研究对象,对其不同发育阶段转录组进行测序,分析了脂肪酸合成通路关键基因在发育阶段的表达。同时,基于转录组数据,扩增和克隆了超长链脂肪酸延伸酶(ELO),对黄粉虫卵和老熟幼虫进行RNA干扰,观察表型的变化;并对ELO进行异源表达,验证功能。主要研究结果如下:
  1.对黄粉虫7个发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雄成虫、雌成虫进行了转录组测序。获得104937个unigenes,获得有注释信息的unigenes32806条。其中,脂肪酸合成通路关键基因乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC)14个,脂肪酸合成酶基因(FAS)75个,超长链脂肪酸延伸酶基因(ELO)83个,脂酰辅酶 A还原酶基因(FAR)101个,脂肪酸脱氢酶基因(FAD)75个,5种关键基因分别选择1个,对不同龄期表达量进行聚类分析和qRT-PCR验证,趋势重合达87.7%;ACC,FAS在雄成虫期高表达,其它阶段低,FAD基因在雌成虫期表达,其它阶段极低,FAR在各阶段表达。通过与KEGG数据库进行比对,共有44586条基因被分配到331条通路中,其中有113条contigs与脂肪酸合成途径相关,119条contigs与饱和脂肪酸合成途径相关,49条contigs与脂肪酸延伸途径相关,对这所有contigs进行聚类分析。另外,分析了黄粉虫老熟幼虫脂肪酸组成,不饱和脂肪酸含量高达73%。
  2.扩增得到3条TmELO cDNA(1005bp、972bp和936bp)全长,有HXXHH等ELO具有的特征模体,预测定位于内质网,具有跨膜结构。qRT-PCR显示,三个TmELO在卵、1龄幼虫、2龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫、雄成虫阶段都有表达, TmELO1在卵期表达量低而TmELO2在卵期表达量高,TmELO3在卵期表达量高。
  3.通过注射dsRNA,干扰黄粉虫老熟幼虫和卵的转录水平表达,发现卵和老熟幼虫在一段时间内mRNA水平被大幅度抑制。卵的TmELO3基因被干扰后,其孵化率大幅度降低;老熟幼虫TmELO1和TmELO3基因被干扰后,死亡率上升。在INVSc1酿酒酵母菌株中表达了黄粉虫TmELO1、TmELO2和TmELO3,发现表达TmELO1能产生C20:0脂肪酸并延伸至C24:0,TmELO2主要在酵母中使脂肪酸C16:0和C16:1占比增加;TmELO3表达后,酵母脂肪酸组分未变化。
[硕士论文] 彭勇
农业昆虫与害虫防治 河北农业大学 2017(学位年度)
摘要:昆虫是动物世界中最多元化的类群,拥有多种多样的生命形态,几乎能够适应各种生态环境。为此它们进化出了高度敏感的化学感受器官,这是他们与环境相互作用和个体之间交流的核心。在昆虫中,表达在嗅觉器官中的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)起着化学信号的检测与运输作用,介导昆虫的觅食、择偶、寄主定位等生理行为,它们对于昆虫适应环境和维持种群结构具有非常重要的生物学意义。因此,不管是基础研究还是生产应用,了解昆虫的嗅觉分子基础都显得非常重要。中红侧沟茧蜂Microplitis mediator(Haliday)是一种独居性内寄生蜂,寄主广泛,在农业生产中,广泛用于棉铃虫等棉田害虫的生物防治。通过分子生物学的手段研究中红侧沟茧蜂的嗅觉分子机制,可为害虫防治和天敌利用提供新的策略和方法,为生物防治提供新的靶标位点。本文通过筛选中红侧沟茧蜂触角转录组数据,鉴定出大量在触角中特异表达的OBPs基因和CSPs基因,并对CSP2和CSP3蛋白在中红侧沟茧蜂触角感器的表达及气味结合功能进行了研究。本文主要研究结果如下:
  1.通过筛选中红侧沟茧蜂触角转录组数据,共鉴定10个新的OBPs基因(MmedOBP11~20)和2个新的CSPs基因(MmedCSP2~3)。MmedOBPs和MmedCSPs的序列比对发现,中红侧沟茧蜂的OBPs和CSPs的都属于“Classical”半胱氨酸模式。Motif分析表明中红侧沟茧蜂的CSPs比OBPs更加保守。系统进化分析结果表明MmedOBPs和MmedCSPs在进化过程中具有明显的分化现象。
  2.利用Real-time Quantitative PCR分析了上述基因在中红侧沟茧蜂成虫不同组织的表达特征。结果显示MmedOBP14,MmedOBP18,MmedCSP2和MmedCSP3在触角中特异或高表达,表明它们可能参与了中红侧沟茧蜂的嗅觉识别过程。而其余的基因具有广泛的表达特征,推测其可能具有非嗅觉功能。
  3.免疫组织化学对MmedCSP2和MmedCSP3蛋白在触角感器中的表达分布进行研究。结果显示,MmedCSP2特异表达在腔锥形感器中,而MmedCSP3在锥形感器中表达,表明这两个蛋白分别参与了不同化学感器的化学识别过程。
  4.荧光竞争结合实验研究了MmedCSP2和MmedCSP3重组蛋白与102种潜在配体的结合特异性。实验结果显示,MmedCSP2结合反-2-己烯醛、柠檬醛、3,4-二甲基苯甲醛、苯甲醛、水杨酸甲酯、戊醛、B-紫罗兰酮、3-己酮和茉莉酸甲酯;MmedCSP3蛋白结合TMTT、DMNT、丁酸乙酯、水杨酸甲酯、油酸和棕榈酸,此外MmedCSP3与3种夜蛾科昆虫性信息素(Z11-16:OH,Z11-16:Ald,E11-14:Ac)有很强的亲和能力,这表明MmedCSP2与MmedCSP3可能在中红侧沟茧蜂检测植物挥发物方面发挥重要作用,MmedCSP3可能是中红侧沟茧蜂利用昆虫挥发物来定位寄主或配偶的关键蛋白。
  5.同源模建对MmedCSP2和MmedCSP3的三维结构模型进行分析。结果表明MmedCSP2蛋白具有一个由7个α-螺旋构成的疏水性结合腔,和两对二硫键,分子对接实验预测Ser12,Tyr15,Leu50和Asn53可能是MmedCSP2与配体结合的关键位点。MmedCSP3蛋白具有较大的疏水结合腔,由5个α-螺旋构成,同样有两对二硫键来稳定蛋白结构,推测Ala22、Arg25、Gln26、Glu40、Asp41、Trp45和Tyr75可能是MmedCSP3结合配体的关键位点。
[硕士论文] 李贝贝
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂是维持农业平衡的授粉昆虫之一,具有重要的生态价值。然而,近年来发生的蜜蜂大量死亡事件,引起全球重视。一方面,环境中的化学农药残留会影响蜜蜂的生理和行为;另一方面,病毒作为主要病原体之一会在蜜蜂免疫力低下时趁机侵入并大量增殖,很可能是导致蜜蜂大量死亡的原因。许多研究证实农药或者病原体均可直接导致蜂群群势减弱,但是目前关于威胁蜜蜂健康的不同致病因子之间相互作用的研究还比较少,可能也是导致蜂群大量损失的原因之一。
  本研究调查了蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)等8种常见病毒在10个省份中的流行情况;通过克隆和测序获得了CBPV北京株的全基因组序列,并获得GeneBank号,分别为KX168412和KX168413;通过RT-qPCR检测蜜蜂不同组织内的CBPV负义链表达情况;基于吡虫啉对意大利蜜蜂的毒力曲线初步研究了吡虫啉对CBPV含量的影响。
  主要试验结果包括1、意蜂检测到除急性麻痹病毒(Acute bee paralysis virus,ABPV)外的7种常见病毒;中蜂检测到除ABPV、CBPV和瓦螨病毒(Varroa destructor virus-1,VDV-1)外的5种常见病毒。在意蜂中病毒检出省份占比最高的病毒是黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)和以色列急性蜜蜂麻痹病毒(Israeli acute bee paralysis virus,IAPV),分别为100%和90%,其次是CBPV,为60%。在中蜂中病毒检出省份占比最高的是病毒是中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbroodvirus, CSBV)为80%。其次是IAPV和BQCV,都为70%。在意蜂中感染率最高的是BQCV,为64.64%,在中蜂中感染率最高的是IAPV,为48.89%。CBPV分布较广能够在河南、辽宁、北京、甘肃、青海和安徽6个省份意蜂样品中检测到,感染率为45.56%;未在中蜂中检测到CBPV。2、目前NCBI中关于CBPV中国株基因组序列信息较少,因此本研究通过克隆和测序获得CBPVRNA1和CBPV RNA2的基因组序列,补充了中国地区CBPV基因组序列信息。由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)和预测结构蛋白(predicted structural protein,pSP)序列进化分析可知其与中国和日本的其他序列亲缘关系较近。3、使用荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)确定CBPV负义链的存在,证明CBPV能够在不同组织有效复制,尤其是头部和胸部,危害蜜蜂健康。4、通过吡虫啉检测试剂盒确定出现大量死亡蜂群的蜜蜂体内存在吡虫啉,含量在17μg/L-33μg/L之间,可能是导致蜜蜂死亡的原因。5、通过饲喂法获得吡虫啉对意大利蜜蜂的毒力回归方程为y=2.566x+2.839,计算得出LC25=0.816 mg/L,LC5=1.350 mg/L,LC10=2.027 mg/L。首先饲喂健康蜜蜂CBPV粗毒,之后再饲喂蜜蜂吡虫啉,定量蜜蜂体内CBPV含量。饲喂CBPV+LC5的吡虫啉组在48h时CBPV含量即显著高于对照组,72h时三个饲喂农药组蜜蜂CBPV含量都显著高于对照组,96h时LC10组显著高于其它组。结论:不同浓度吡虫啉会增加CBPV增殖水平,但是CBPV含量并不随时间和吡虫啉浓度不同有明显的变化趋势。从试验数据可以看出这两者之间相互作用的复杂性,但本研究仅是初步探索这两个因素之间的关系,未来还需要更深入研究探索。
[博士论文] 房宇
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:在蜜蜂社会里,工蜂和雄蜂是对蜂群社会组织和种群繁衍具有重要贡献的两个缀型。工蜂和雄蜂分别是二倍体和单倍体,二者在遗传上的差异决定了其生理发育和社会行为存在诸多生物学不同。胚胎发育期是蜜蜂生命周期中的关键时期,成年蜂的各种器官雏形都在胚胎期形成。虽然利用基于双向电泳(2-DE)的蛋白质组学技术对工蜂和雄蜂胚胎期发育的分子基础进行初步探索,但只鉴定到105个蛋白质,仅覆盖了7%的蜜蜂蛋白质组(15323个蛋白质),这在一定程度上限制了对胚胎发育分子基础的客观认识。随着质谱分辨率、灵敏度和精确度技术的快速发展,其蛋白质鉴定能力至少是2-DE蛋白质组的20倍以上。蛋白质组覆盖深度对全面深入解析蜜蜂胚胎发育分子基础至关重要。磷酸化是最为重要的蛋白质翻译后修饰之一,对蛋白质功能具有重要调节作用,已被广泛应用到生命科学研究的各个领域。但利用基于高分辨质谱的蛋白质组和磷酸化蛋白质组技术对工蜂和雄蜂胚胎发育分子基础的研究还尚未进行。本研究利用基于高分辨质谱为主的shotgun蛋白质组学研究方法、非标定量技术、IMAC(固相金属离子亲和色谱)和TiO2磷酸化蛋白富集等技术以及蛋白质相互作用、激酶预测等生物信息学分析手段,对意大利蜜蜂(意蜂)工蜂和雄蜂的胚胎期蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行系统分析,以期探明调控蜜蜂胚胎发育的关键代谢通路、蛋白质和激酶,为蜜蜂胚胎发育生物学和对胚胎发育机理的进一步研究提供了理论和实践依据。
  在意蜂工蜂和雄蜂胚胎期,共鉴定3443个蛋白质,与2-DE的胚胎蛋白质相比,鉴定蛋白质的覆盖率提高了30倍以上。尽管蜜蜂胚胎在3个发育阶段的蛋白质表达特点差异很大,但是一个核心蛋白质组主要参与蛋白质合成、能量代谢、发育和转运相关的代谢通路对胚胎发育发挥基本的保障功能。1日龄是胚胎发育的准备阶段,主要功能是提供营养和子核分裂,因此胚胎表达和上调表达的蛋白质主要与营养储存和核酸代谢相关,从而保证胚胎细胞对营养的需求和细胞增殖对核酸的需求;2-3日龄是器官形成的关键时期,器官系统在46hr以后逐步形成的,此时高表达及上调表达的蛋白主要参与细胞周期、抗氧化、细胞骨架以及组织形态发生等活动,为胚胎组织和器官雏形构建提供的细胞代谢保障和分子材料。工蜂和雄蜂胚胎发育基本都在3天完成,但雄蜂为了应对自身体型大的发育需求,形成了不同于工蜂胚胎发育的策略。雄蜂的胚胎器官形成相关的代谢通路较工蜂启动早且持续时间长,以积累足够的构建器官雏形的分子材料。另外,雄蜂的细胞骨架系统、抗氧化系统功能的加强以满足胚胎发育的生理需求。为了探索对胚胎的基因改造,RNAi的初步结果表明在胚胎发育的前48小时对基因进行沉默的效果较好。
  应用IMAC和TiO2两种技术优点互补的磷酸化肽段的富集方法,对工蜂和雄蜂胚胎发育进行的磷酸化蛋白质组分析和激酶预测,鉴定到的2438个胚胎蛋白质的6342个肽段上的6577个位点发生了磷酸化修饰,预测了91个激酶,这是迄今覆盖度最深的蜜蜂胚胎磷酸化蛋白质组研究。在蜜蜂胚胎发育过程中,磷酸化对转录、组织形态发生、细胞周期调控/凋亡、细胞骨架和信号转导相关通路具有重要调控作用,相应CDK、MAPK、RSK激酶的持续表达促进了细胞分裂、蛋白质合成、组织分化等生命活动的进行。工蜂和雄蜂胚胎发育早期通过一系列PKA激酶调控能量代谢、信号传导和组织分化,为细胞增殖和胚盘形成提供物质和能量。胚胎发育中后期DYRK和CDK亚家族的激酶调控基因转录、蛋白质合成和胚层分化等代谢活动,foxO和wnt等通路的激活对细胞抗氧化应激、胚层分化、器官形成和背索闭合等过程的完成起决定性作用。磷酸化修饰对工蜂和雄蜂胚胎发育调控也存在显著差异。胚胎发育早期,工蜂mnb激酶对细胞增殖的负调控以及MAPK3激酶磷酸化的T564位点对基因转录和细胞骨架进程的抑制作用,使工蜂胚胎发育未被激活,处于初级发育阶段。而此时雄蜂胚胎CDK12激酶的充分激活促进了转录进程,进而被激活的RNA转运通路送至核糖体进行翻译,雄蜂已开始大量合成蛋白质。胚胎发育中期,工蜂胚胎CDK1激酶在Y15位点上的磷酸化造成激酶失活,制约了有丝分裂等细胞周期的进行,raf激酶的高度磷酸化限制了与胚胎体轴形成、原肠胚及成虫盘相关信号通路的激活,而雄蜂DCAMKL激酶的高活性和wnt信号通路的激活全面推进了大脑等组织器官的形成。胚胎发育后期,工蜂胚胎激活的foxO通路为胚胎提供能量和抗氧化保护,notch、hippo、wnt和hedgehog通路的激活以及CDK9、CDK12和mnb的活性增加和SLK的高磷酸化,推动了细胞生长、转录、翻译和各种器官构建等生命活动的进行。而雄蜂Abl上S637的磷酸化对细胞骨架组织、表皮神经分化、细胞迁移和细胞周期的负调控作用,以及与高活性myo3激酶相关的胚动和背索闭合活动,表明雄蜂胚胎的器官雏形基本完成,处于胚胎的完善阶段。
  本研究不仅对工蜂和雄蜂胚胎发育期的分子基础有了全新的认识和理解,而且还阐明了二者胚胎发育分子基础的差异。研究发现调控胚胎发育的关键代谢通路、蛋白和激酶、蛋白质亚细胞器和染色体定位信息不仅对蜜蜂胚胎发育生物学,而且为进一步研究胚胎发育机理提供了理论和实践依据。
[硕士论文] 张雨豪
食品加工与安全 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:蜂胶是蜜蜂从自然界的植物组织上采集的天然产物,其含有丰富的多酚类化合物,这些物质构成其生物活性和药理功能的多样性。近年发现蜂胶具有显著的抗氧化、抗炎症、抗微生物、抗肿瘤、抗糖尿病、调控脂代谢和免疫调节等生物活性。目前由于脂代谢紊乱引起的肥胖、糖尿病、心脑血管疾病等引起了人们高调重视,大量的研究发现天然产物是控制和预防疾病的有效药物来源。以往的实验表明,蜂胶的提取物和其中一些成分如高良姜素、槲皮素、p-香豆酸和咖啡酸苯乙酯等具有调控脂肪代谢的生物活性,但鲜有研究进一步报道蜂胶中其他化合物,特别是酚酸和酚酸酯能够参与调控,以及化合物的作用机制。因此本文旨在研究中国蜂胶中的主要酚酸和酚酸酯成分对脂代谢紊乱的调控,明确有效成分和探究相关作用机制。
  本文对中国蜂胶中主要的八种酚酸(咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸和亚桂皮乙酸),八种酚酸酯(咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯、咖啡酸苄酯、p-香豆酸肉桂酯、p-香豆酸苄酯、阿魏酸苄酯、肉桂酸肉桂酯和4-甲氧基肉桂酸肉桂酯)和3,4-二羟基苯甲醛进行研究。用MTT法检测了这些成分对人肝细胞L02和小鼠前脂肪细胞3T3-L1的细胞活力影响,确定了药物治疗的作用浓度。先建立L02肝细胞脂质累积模型,用油红O染色法筛选出蜂胶的酚酸和酚酸酯中降脂效果最佳的成分,然后研究最佳成分对细胞内内质网应激和氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)蛋白表达的影响;最后建立3T3-L1脂肪细胞脂肪因子分泌紊乱模型,检测这17种成分作用后脂肪因子和炎性因子的胞外分泌。
  本研究发现蜂胶酚酸中的p-香豆酸和异阿魏酸,芳香醛3,4-二羟基苯甲醛,还有酚酸酯中的p-香豆酸苄酯、p-香豆酸肉桂酯、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸苄酯和咖啡酸肉桂酯能够有效降低游离脂肪酸诱导的L02细胞的脂质累积。其中咖啡酸肉桂酯是唯一一个在四个给药浓度(5、10、50、100μmol/L)下都具有明显降脂作用的化合物,且是蜂胶中含量较多,以往的研究也很少关注的成分。通过蛋白质免疫印迹技术检测L02细胞内质网应激蛋白和调控过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)蛋白的表达水平,咖啡酸肉桂酯能够有效降低内质网应激中标志蛋白CHOP和ATF-6的水平,上调PPAR-α和下调PPAR-γ的表达,改善细胞内脂质代谢紊乱。
  多因子检测试剂盒检测了蜂胶中17个酚酸类成分对与脂肪细胞炎症相关的七个细胞因子的表达,即三个脂肪因子脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)和抵抗素(Resistin),两种炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维蛋白溶酶原激活物抑制蛋白(PAI)。蜂胶中17个酚酸类成分都能不同程度调控脂肪因子的分泌异常,同一种化合物能够作用的细胞因子范围不一样。
  从蜂胶中17种酚酸和酚酸酯筛选出的成分能够调控两种类型脂代谢紊乱,明确了作用靶点,也为进一步研究蜂胶在治疗相关疾病的应用提供了先期实验依据。
[硕士论文] 梁霞丽
食品加工与安全 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:糖尿病的发病率呈逐年上升趋势,寻找能治疗和预防2型糖尿病胰岛素抵抗的天然产物很有必要。蜂胶中含有丰富的黄酮等生物活性成分,具有抗菌、消炎、提高免疫等功能活性。探究蜂胶中含量较高的4种黄酮单体(高良姜素、短叶松素、松属素、柯因)对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用,为蜂胶产品的深度开发提供理论参考。本论文通过建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,评价短叶松素、松属素、柯因、高良姜素对IR-HepG2细胞糖代谢的影响,以IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量、糖原、己糖激酶、丙酮酸激酶为指标;运用多因子检测技术,检测胰岛素信号通路上的关键蛋白AktSer473,GSK3αSer21,GSK3βSer9,InsRTyr1162/Tyr1163,IRS1Ser312,mTORSer2448,p70S6KThr412,PTENSer380,RPS6Ser235/Ser236和TSC2Ser939的相对磷酸化表达变化情况。本论文主要研究结果如下:
  (1)诱导胰岛素抵抗HepG2细胞所用的胰岛素模型最佳作用浓度为5×10-6 mol/L,最佳作用时间为36h,此模型在36 h内稳定。
  (2)筛选出4种黄酮中的高良姜素和松属素均能不同程度地增加细胞的葡萄糖消耗,而柯因和短叶松素处理组作用效果不显著。高良姜素处理组,随其浓度的增加,葡萄糖消耗量和糖原含量分别增加。在浓度为80μmol/L时,葡萄糖消耗量和糖原含量分别是胰岛素抵抗模型组的4.64倍和1.43倍;己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)在80μmol/L时分别增加了21.94%和27.52%,显著高于模型组。松属素处理组,在浓度为4μmol/L时,葡萄糖消耗量和糖原含量分别是胰岛素抵抗模型组的1.42倍和1.49倍;己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)酶活性在4μmol/L时分别增加了11.26%和17.94%,显著高于模型组。
  (3)初步阐明了高良姜素和松属素影响胰岛素抵抗HepG2细胞AKT/mTOR信号通路的作用机制。结果显示,高良姜素处理组,显著上调p-InsRTyr1162/Tyr1163,p-AktSer473和p-mTORSer2448,下调p-IRS-1ser636,p-RPS6 ser235/236、 p-GSK3αSer21和p-GSK3βSer9蛋白的磷酸化相对表达量;松属素处理组,显著上调p-Akt Ser473的表达量,下调p-IRS-1 ser636、p-GSK3βSer9和p-p70S6 Kinase Thr412的蛋白磷酸化相对表达量。
  综上所述,本论文初步筛选出蜂胶中的高良姜素和松属素可以提高IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量;通过增强己糖激酶和丙酮酸激酶的活性,提高糖原合成的途径而调节糖代谢;高良姜素和松属素可通过调节AKT/mTOR信号通路关键蛋白,改善HepG2细胞的胰岛素抵抗程度。这个结果也表明,蜂胶改善胰岛素抵抗是多组分多靶点协同作用的结果。
[硕士论文] 张迎迎
特种经济动物饲养 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂工蜂的纳氏信息素(Nasonov pheromone)作为蜜蜂的化学信息素之一,在蜂群的群体及个体协调过程中,具有重要的作用。目前对蜜蜂工蜂纳氏腺的研究主要集中在西方蜜蜂(Apis mellifera)上,其分泌物的化学成分主要为(反)-柠檬醛、(顺)-柠檬醛、橙花醇、香叶醇、橙花酸、香叶酸和(反,反)-法呢醇这7种萜烯类物质,而对于东方蜜蜂(Apis cerana)纳氏腺分泌物的成分研究并不透彻,有文献报导其中仅含有香叶醇、(反)-柠檬醛和极微量的(顺)-柠檬醛。在对纳氏腺功能的研究发现,西方蜜蜂的纳氏信息素参与了认巢、定向、采食、分蜂、婚飞等过程。但对于东方蜜蜂纳氏信息素的功能的研究还不尽完善。此外,东方蜜蜂和西方蜜蜂在生物学上有较多的差异,为此,探究东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素的成分、功能及行为活性差异均有很大的研究意义。
  本研究以东方蜜蜂和西方蜜蜂的纳氏腺为材料,摸索最优的纳氏信息素提取方法,对纳氏信息素的化学成分进行定性和定量分析。并用单组分与混合组分的纳氏信息素对蜜蜂进行生物活性测定,为进一步研究东方蜜蜂和西方蜜蜂的纳氏信息素差异甚至不同种蜜蜂之间的进化差异提供依据。通过研究获得的主要结论总结如下:
  1.利用气相色谱(gas chromatography,GC)分析蜜蜂纳氏腺的成分,设计相应的检测方案。发现西方蜜蜂的纳氏信息素除了已被报道的萜烯类物质外,还有一些脂肪酸类物质,并且这些有机酸类物质在东方蜜蜂的纳氏腺提取物中也检测到,然而在东方蜜蜂纳氏信息素中并没有检测到萜烯类物质。
  2.运用固相微萃取技术(solid-phase microextraction,SPME)可以大大简化蜜蜂纳氏信息素的提取。通过与标准的溶液提取方式比对,设计并优化了SPME提取步骤,使得提取纳氏信息素的种类与数量和溶液提取方式基本一致。
  3.对东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素有机酸类成分进行了鉴定,主要含有:正辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、(顺)-9-十六烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸这10种物质。
  4.对东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素每一活性组分进行了定量分析,结果表明:东方蜜蜂纳氏信息素的正辛酸和癸酸含量比西方蜜蜂高,而肉豆蔻酸、棕榈酸、(顺)-9-十六烯酸和油酸的含量比西方蜜蜂低。在这些脂肪酸成分中,正辛酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、(顺)9-十六烯酸和油酸呈现极显著差异(T-test,sig=p<0.01)。
  5.利用气相色谱和触角电位仪联用技术(gas chromatography coupled with electroantennographic detector,GC-EAD)分析了两组分的电生理活性,结果表明:萜烯类的香叶醇、香叶酸和(反,反)-法呢醇均能引起工蜂明显的触角电位反应,而脂肪酸中仅正辛酸能引起工蜂的触角电位反应。
  6.对纳氏信息素的生物活性测定分析表明:无论是全组分还是单成分的脂肪酸,对东方蜜蜂和西方蜜蜂的行为均未起到明显的诱导或疏散作用。
  7.由于东方蜜蜂和西方蜜蜂纳氏信息素成分的差异性,单独对脂肪酸在其他功能上的实验发现,死亡工蜂的尸体会释放出脂肪酸,并且不同时间段各成分释放的量也不同,因此这些脂肪酸可能在作为蜜蜂的尸体识别信号(necronome pheromone)参与群体的清理行为。
  综上所述,东方蜜蜂和西方蜜蜂的纳氏信息素在组分上存在很大的差异,西方蜜蜂纳氏信息素参与的已报道的各种行为多是萜烯类成分主要介导的,而东方蜜蜂不含有此类物质,却仍有类似的行为,可能是其他腺体或者行为起作用。目前实验表明,有机酸类物质对蜜蜂并不起作用可能与蜜蜂的进化有关,在进化中西方蜜蜂含有较多的萜烯类物质,而东方蜜蜂纳氏腺的功能逐渐退化。这为东方蜜蜂比西方蜜蜂更古老的假说提供了一定的依据,也为今后纳氏腺及相关的有机酸类功能研究提供了参考。
[博士论文] 董捷
特种经济动物饲养 中国农业科学院 2017(学位年度)
摘要:兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)以其群势大、易饲养和授粉性能优良等优点成为我国重点繁育和推广的本土熊蜂。蜂王产卵对于整个蜂群的建立和发展起决定性的作用,关系到熊蜂繁育的成败,然而,生产中往往出现蜂王不明原因的不产卵现象。因此,本文详细阐述了影响熊蜂雌性蜂产卵的因素,并利用蛋白质组学的方法,分析兰州熊蜂产卵与未产卵雌性蜂血淋巴蛋白质的差异;通过高通量测序技术对产卵与未产卵蜂王卵巢MicroRNA进行预测和差异分析,最后,对两个主要候选蛋白进行了基因克隆与表达分析,主要取得如下结果:
  1.兰州熊蜂雌性蜂血淋巴蛋白质组研究
  本研究采用凝胶电泳技术(2-DE)和GeLC-MS/MS两种蛋白质组学研究策略,对兰州熊蜂产卵与未产卵蜂王和工蜂血淋巴进行分析,结果显示:血淋巴总蛋白浓度可以作为判断雌性蜂产卵的标志;获得兰州熊蜂雌性蜂产卵与未产卵状态血淋巴蛋白质的表达谱。通过LC-MS/MS鉴定蛋白未产卵蜂王275个,产卵蜂王314个,未产卵工蜂783个和产卵工蜂463个;其中,雌性蜂共同表达的蛋白数量为128个,差异表达蛋白数量为44个;通过GO分析,发现产卵前后蜂王和工蜂的血淋巴蛋白质功能组成发生了明显的改变,雌性蜂产卵后,富集于生殖过程、行为以及一些分子功能及细胞组成的蛋白增多,富集于应对刺激反应和一些细胞代谢氧化功能的蛋白减少。
  2.兰州熊蜂蜂王卵巢microRNA研究
  利用rnirDeep2对兰州熊蜂蜂王卵巢组织进行miRNA预测,共获得329个已知miRNA,其中有75个是蜜蜂已知的成熟miRNA;利用地熊蜂基因组进行比对和预测,共获得255个新的兰州熊蜂成熟miRNA。通过miRNA表达差异性分析,发现所有表达差异显著的miRNA中,表达趋势均是产卵后下调。利用4种算法筛选适合兰州熊蜂蜂王miRNA表达分析的内参基因,结果表明:miR275是兰州熊蜂蜂王不同生殖状态下头部和卵巢组织中表达水平最稳定的基因;在不同组织中,miR277是卵巢中表达最稳定的内参基因,而miR275是头部中表达最稳定的内参基因。
  3.兰州熊蜂IRP30基因克隆及表达分析
  通过RACE和降落PCR技术克隆了兰州熊蜂IRP30基因的cDNA全长,结果表明:兰州熊蜂IRP30基因共有一个转录本,其全长为1082bp,编码区序列(CDS)长度为825bp,共编码275个氨基酸,N端具有信号肽序列。通过保守结构域分析表明,IRP30在35-180个氨基酸之间具有多个富亮氨酸重复区。通过荧光定量的方法分析表明,IRP30在Pb(棕眼)和Pb1(棕眼体表浅着色)蛹期时,表达量极显著高于其他时期(p<0.01); IRP30表达量变化规律,在三型蜂之间为:工蜂>蜂王>雄性蜂,在不同组织间为:胸部>头部>腹部,其中,在头、肌肉和脂肪体中的相对表达量较高。通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术分析表明,与未产卵状态相比,雌性蜂产卵后IRP30的转录和蛋白表达均极显著上调(p<0.01),推测该蛋白参与雌性蜂生殖转变过程。
  4.兰州熊蜂PEBP基因克隆及表达分析
  利用RACE技术克隆了兰州熊蜂PEBP基因的cDNA全长,结果表明:PEBP基因全长为1217bp,共有2个转录本PEBPX1和PEBPX2,其全长分别为1005 bp和915 bp,编码区序列(CDS)长度分别为627 bp和549 bp,共编码208和182个氨基酸,其中,PEBPX1的N端具有信号肽序列,PEBPX2不含信号肽序列。通过采用绝对荧光定量PCR分析表明,在卵、Pb1和Pbd蛹期,PEBP两个转录本的表达量均极显著高于其他时期(p<0.01),除Pha(预成虫)期外,PEBPX2的表达量均显著高于PEBPX1(p<0.05),表明熊蜂不同发育时期对PEBPX2的偏好性更强。通过绝对荧光定量和蛋白免疫印迹分析表明,兰州熊蜂蜂王和工蜂由未产卵状态转变为产卵状态后,PEBP的mRNA表达量极显著升高(p<0.01),且PEBPX2的表达量高于PEBPX1,在蛋白水平也具有相同的趋势,推测该蛋白参与熊蜂雌性蜂的生殖过程。
  综上所述,本研究明确了兰州熊蜂产卵与未产卵蜂雌性蜂血淋巴蛋白质在数量、种类和功能三个方面的差异情况,并预测了不同生殖状态蜂王卵巢miRNA的种类和数量,并获得表达差异的miRNA,同时筛选出评估兰州熊蜂蜂王miRNA表达量的最适内参基因,最后明确了候选蛋白IRP30和PEBP在兰州熊蜂中的表达特性。本研究为开展熊蜂分子生物学和生殖生理研究奠定重要理论基础,也为熊蜂的工厂化繁育和大规模应用提供科学依据。
[硕士论文] 齐磊
动物遗传育种与繁殖 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:蜜蜂作为真社会性昆虫,是人们探究动物复杂行为的最好的模式生物之一。而化学感受蛋白(chemonsensory protein,CSPs)是一种小的可溶性蛋白,广泛存在于昆虫的触角等化学感受器中,在昆虫的化学感受系统中发挥着重要的作用。目前为止在蜜蜂中一共发现了6种化学感受蛋白,而其在蜜蜂中的具体功能尚不完善。本次研究旨在探究化学感受蛋白在意大利蜜蜂虫蛹期及成年工蜂中的时空表达水平及功能。本次研究中,首先通过荧光定量PCR技术检测了6种化学感受蛋白基因(Amel-CSP1、Amel-CSP2、Amel-CSP3、Amel-CSP4、AmeLCSP5和Amel-CSP6)在不同日龄工蜂(16、12、18、28日龄)触角中CSPs的表达情况进行检测,来确定CSPs在意大利蜜蜂工蜂发育过程中的是否具有时间特异性;然后再对6种化学感受蛋白基因在虫蛹期的表达水平,以及哺育蜂和采集蜂的触角、头部、胸部、腹部和腿的表达水平进行检测,以确定CSPs在意大利蜜蜂中的空间分布情况。本次研究的主要结果如下:
  1、Amel-CSP1~Amel-CSP6在意大利蜜蜂中的时间表达水平
  化学感受蛋白基因Amel-CSP1在28日龄工蜂触角中的表达水平最高,显著高于其在其他日龄工蜂中的表达水平(P<0.05),Amel-CSP1在工蜂触角中的表达水平随工蜂日龄的增长而提高,在1日龄工蜂触角中含量最低。Amel-CSP2在1日龄工蜂触角的表达量最高,而随着日龄增长显下降趋势,在28日龄工蜂触角中的表达水平最低。Amel-CSP3其在28日龄工蜂触角中的表达水平最高,极显著的高于其他日龄(P<0.01);Amel-CSP4在工蜂触角中表达水平随着工蜂日龄的增长而逐渐下降。Amel-CSP5在不同日龄工蜂触角中的表达水平相对稳定,没有时间特异性(P>0.05);Amel-CSP6在工蜂触角中的表达水平随着日龄的增加而降低,28日龄时最低。
  2、Amel-CSP1~Amel-CSP6在意大利蜜蜂中的空间表达水平
  Amel-CSP1在工蜂的触角和头部有较高的表达水平,而在幼虫,蛹,胸部,腹部,腿部的表达水平较低,其在工蜂触角中的表达水平显著高于其他部位(P<0.05)。Amel-CSP2在触角中有所表达,在其他部位的表达量较低。Amel-CSP3在幼虫,蛹,哺育蜂和采集蜂各部位均具有较高的表达水平。Amel-CSP4仅在工蜂触角表达,其他部位的表达水平很低,甚至不表达。Amel-CSP5在幼虫、蛹及工蜂所有部位中的表达量都很低。Amel-CSP6与Amel-CSP3相似,在幼虫,蛹,哺育蜂和采集蜂中都有较高的表达水平。
  除Amel-CSP5在工蜂中的表达没有明显的时间特异性外,其他5种CSPs均具有明显的时空表达特异性,这对整个CSPs家族对意大利蜜蜂生长发育的功能具有一定的生物学意义。
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