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[硕士论文] 刘策
农药学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:微生物除草剂的开发与利用是现今除草剂研究的重点之一,为了取得新颖的除草活性物质,本试验对分离自瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)次级代谢产物的4-羟基-3-甲氧基肉桂酸(阿魏酸)进行了结构改造;以单子叶植物稗草和马唐,双子叶植物反枝苋和油菜为供试植物,97%莠去津原药为对照药剂,通过小杯法和茎叶喷雾法测定化合物的除草活性。主要研究内容如下。
  (1)对4-羟基-3-甲氧基肉桂酸分子进行了羧基的酯化、酰胺化、苯环5位取代等反应,得到27个化合物,利用核磁共振氢谱对其进行结构确定。结果表明,阿魏酸与甲醇、正丙醇、异丙醇、丙三醇等进行酯化反应,得到酯类化合物1、4、5、6、7、8、9、10;以三乙胺作为缚酸剂,DMF作为脱水剂,BOP(卡特缩合剂)为催化剂进行酰胺化反应,得到酰胺类化合物16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27;对苯环5位进行亲电取代反应得到化合物2、11、13;以香草醛和丙酮、丙二酸等为起始物进行缩合反应得到其他类化合物3、12、14、15、17。
  (2)以稗草、马唐、反枝苋和油菜为试验材料,利用小杯法和茎叶喷雾法对上述27个化合物的除草活性进行初步筛选,初步确定了10个具有除草活性的化合物。小杯法结果表明,化合物2、4、5、10、17、27对反枝苋的根具有较好的抑制活性,抑制率分别为68.33%±2.36%、72.00%±9.93%、68.00%±6.38%、80.67%±4.03%、62.02%±1.71%和70.44%±8.37%;化合物26、27对稗草的茎具有抑制作用,抑制率分别为63.46%±7.68%和62.38%±2.17%;化合物7、8对马唐的根具有抑制作用,抑制率为67.33%±3.30%和75.67%±6.13%;化合物16对马唐的茎抑制作用较强,抑制率为67.48%±1.4%;化合物16、18、19对油菜的根抑制效果作用最强,抑制率分别为87.32%±2.29%、88.68%±2.24%和84.24%±0.38%。茎叶喷雾法结果表明,化合物3对油菜地上部表现出较高的抑制作用,抑制率达63.93%±2.33%。化合物16和19对稗草地上部抑制率分别为61.46%±1.74%和60.55%±1.47%。
  (3)将化合物稀释5个浓度梯度,利用小杯法和茎叶喷雾处理法进行了除草活性的复筛。小杯法的结果表明,化合物4、5、6、8、9、10、19、24和27对反枝苋的根生长抑制效果要明显优于对反枝苋的茎生长抑制效果。化合物19对马唐的根IC50为122.39mg/L;化合物19、24和27对油菜的根IC50较低分别为86.42mg/L、103.64mg/L和157.68mg/L。茎叶喷雾法的结果表明,化合物3对反枝苋和油菜地上部有生长抑制作用,同时会使叶片边缘干枯,对上述两种植物的IC50分别为350.86mg/L和364.93mg/L。
  (4)以小麦和玉米为试验材料,利用小杯法测定9个化合物对小麦和玉米的安全性。当化合物浓度为200mg/L时,除化合物8和9外,供试的化合物对玉米和小麦没有明显的抑制作用。
[硕士论文] 李天慧
植物保护 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes,EPN)广泛存在于土壤中,以感染期虫态(infective juvenile,IJs)侵染寄主昆虫,对防治一些隐蔽性的地下害虫及钻蛀类害虫表现出巨大的潜力。但是,作为自然界的一种生物活体,很多不利因素限制其推广应用。为了延长保存期限、提高防治效果,研发合适的昆虫病原线虫商品化剂型显得尤为重要。本实验通过研究2种昆虫病原线虫剂型——胶囊制剂与粉剂,寻找更好地保存昆虫病原线虫的最佳方法。主要研究结果如下:
  1.昆虫病原线虫胶囊剂型的研制:以线虫Steinernema carpocapsae HB310为研究材料,在线虫悬浮液中添加18%甘油、0.075%甲醛、1%海藻酸钠、0.2%黄原胶和0.5%山梨酸钾形成混合液,将该混合液滴在0.5%氯化钙溶液中,最终形成昆虫病原线虫胶囊。胶囊为直径4mm的圆形颗粒,筛选出0.3%柠檬酸钠溶液作为线虫胶囊的溶解剂;在16℃及密封条件下保存4个月后线虫存活率仍保持为86.48%,线虫对大蜡螟致死率为98.61%。实验结果表明该胶囊剂配方不仅适合昆虫病原线虫的长时间保存,线虫还保持较高的存活率和致病力。
  同时,对于昆虫病原线虫胶囊剂的使用方法进行了改进:进一步通过添加不同成分、改良胶囊配方提高4龄小地老虎幼虫对线虫胶囊的取食量,结果显示在24h内小地老虎取食完成添加9%葡萄糖成分的胶囊。盆栽法进一步比较了线虫胶囊溶解液与直接撒施线虫胶囊两种方法对试虫的致病力,结果显示线虫悬浮液、原配方胶囊、9%葡萄糖胶囊对玉米苗的保苗效果分别是64.81%、14.81%和38.89%,对小地老虎的防治效果分别是95.24%、57.14%和90.48%。因此,实验结果说明线虫胶囊可以直接撒施使用,防治地下害虫小地老虎。
  2.昆虫病原线虫粉剂的研制:以线虫S.carpocapsae HB310为供试材料,对基质、保水剂、保护剂进行筛选,测定了不同温度下基质对线虫存活率的影响,最终确定昆虫病原线虫粉剂的配方是:30%白炭黑、0.5%羟丙基甲基纤维素、0.5%黄原胶、18%甘油、0.1%甲醛、0.5%山梨酸钾。在10℃及密封条件下线虫粉剂保存4个月后线虫存活率为78.24%,线虫对大蜡螟致死率为95.83%。并采用盆栽法测定其对4龄小地老虎的致病力,结果显示保苗效果及防治效果分别是43.33%和80.95%。实验结果说明本研究所筛选的昆虫病原线虫粉剂可用于较长时间保存线虫和防治害虫。
[硕士论文] 吴浩
化学工程与技术;应用化学 东北农业大学 2018(学位年度)
摘要:除草剂安全剂是在不影响除草剂使用效果基础上有效的对作物进行保护,降低作物受到除草剂药害的一类农药。本课题基于以往关于磺酰脲类除草剂安全剂的设计理念,以商品化的安全剂R-28725为先导化合物,利用生物电子等排法、结构活性关系和活性亚结构拼接法设计出44种未经报道的新型化合物并成功合成其中41种(Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-5未成功合成)。以期能够获得具有高效性、广谱性并有效针对磺酰脲类除草剂药害的安全剂。
  本课题中合成了三类结构的化合物,分别为(R)-N-(对甲苯磺酰氨基甲酰基)噻唑烷-4-羧酸甲酯类、(R)-N-取代苯甲酰基噻唑烷-4-羧酸甲酯类和(R)-N-二氯乙酰基噻唑烷-4-羧酸甲酯类。(R)-N-(对甲苯磺酰氨基甲酰基)噻唑烷-4-羧酸甲酯类化合物是以L-半胱氨酸甲酯盐酸盐、几种结构对称的酮为原料,在碱性条件下合成噻唑烷类中间体后与对甲苯磺酰异氰酸酯在低温下反应合成,产率为60%-93%。(R)-N-取代苯甲酰基噻唑烷-4-羧酸甲酯类和(R)-N-二氯乙酰基噻唑烷-4-羧酸甲酯类化合物是在敷酸剂存在的条件下,以L-半胱氨酸甲酯盐酸盐、酮和酰氯为原料通过“一锅法”合成,产率为29%-91%。
  本课题所合成的化合物均通过熔点测定、红外光谱分析(IR)、核磁共振谱分析(1H NMR与13C NMR)以及高分辨质谱分析(HRMS)进行表征。在合成的化合物中挑选晶形较好的化合物采用溶剂挥发法培养单晶,得到化合物Ⅱ-3和Ⅱ-9的单晶,并通过X-射线衍射确定其空间构型,确保本实验中同类化合物构型的准确性。
  通过土培法进行41种化合物的生物活性测定以及酶活性测定。初步筛选中确定在除草剂氯嘧磺隆土壤残留浓度为24μg·kg-1时,用于玉米浸种处理的化合物最佳浓度为25mg·kg-1。采用上述条件进行玉米种子处理,将处理后的种子置于培养箱中培养一周后测定玉米的根鲜重、株鲜重、根长、株高、乙酰乳酸合成酶(ALS)活性、谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性和谷胱甘肽(GSH)含量。结果显示大多数化合物对氯嘧磺隆具有不同程度的解毒作用,与商品化安全剂R-28725对比,化合物(R)-4-邻甲氧苯甲酰基-1-硫-4-氮杂螺环[4.5]癸烷-3-羧酸甲酯(XV)对氯嘧磺隆解毒效果最好,超过R-28725。株高、株鲜重、根长和根鲜重恢复率分别为89.08%、98.92%、91.20%和93.70%,GST比活性为2.793μmol·min-1·mg-1protein、GSH含量为8.903μg·g-1、ALS比活性为0.085nmol·h-1·mg-1protein。酶活实验表明安全剂通过增强GST、ALS活性与GSH浓度达到解毒效果。化合物的结构与活性关系表明,螺环化合物的解毒效果优于其它结构的化合物,化合物结构中存在邻甲氧苯甲酰基和对氯苯甲酰基时解毒效果最佳。比较而言,三类化合物的解毒效果排序如下:(R)-N-取代苯甲酰基噻唑烷-4-羧酸甲酯类>(R)-N-(对甲苯磺酰氨基甲酰基)噻唑烷-4-羧酸甲酯类>(R)-N-二氯乙酰基噻唑烷-4-羧酸甲酯类。
[硕士论文] 何桥
农药学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:光甘草定是从植物光果甘草中分离提取得到,它属于异黄烷类化合物。并具有抗氧化、抗炎和抗动脉粥样硬化,作为激素及调节能量代谢等作用。但是光草甘定有限,不可通过分离、提取获得大量光甘草定,有机合成光甘草定步骤长,收率低。因此光甘草定类似物的有机合成和生物活性是目前该领域研究热点。
  前期研究发现光甘草定对植物病原菌具有抑菌作用,光甘草定类似物在植物病原菌方面作用未见报道。本研究以廉价易得的原料,进一步探索合成光甘草定类似物,并且对部分化合物进行了农药活性研究。本论文的探索主要包括以下几个方面:
  1.根据所选择的三条路线(A、B、C)分别进行条件的优化(分别对催化剂、溶剂、温度、碱、进行优化),根据优化结果最终选择路线C再合成光甘草定类似物。
  2.本研究以最优条件对底物进行了扩展,包括不同种类的水杨醇(水杨醇、5-氯水杨醇,5-溴水杨醇),取代的α-溴代苯乙酮(α-溴代苯乙酮、α-溴代对氯苯乙酮、α-溴代对溴苯乙酮),最后我们成功地合成了13个苯并吡喃化合物。
  3.将所得到的化合物挑选部分化合物进行农药活性试验。采用滤纸片法测定对姜瘟病菌的抑菌实验,初步实验结果表明:6-氰基-3-苯基-2H-苯并吡喃(11b)在1mg/mL时对生姜姜瘟病菌有抑制作用。采用生长速率法测定待测样品对植物病原菌(草莓灰霉病菌、马铃薯早疫病菌、烟草赤星病菌、西瓜枯萎病菌)的抑菌实验,初步结果表明:光甘草定类似物对病原真菌有抑制作用且待测样品在400mg/L时6-溴-3-苯基-2H-苯并吡喃(5b)对4种植物病原菌均有抑制作用。
[硕士论文] 王文达
应用化学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:植物源农药为植物体自身代谢产生,具有安全高效、环境友好等特点;我国每年在烟草的采收和生产过程中会产生大量的废弃烟叶,这些烟叶中包含生物碱等农药活性成分且未能合理利用,本文以烤烟、白肋烟和晒黄烟三种废弃烟叶为原料制取植物源农药,并开展了以下两个方面的研究:
  1.为获得包含更多烟草生物碱的烟草提取物,设计了L16(45)正交实验对提取过程进行了优化,得到的最优化的提取工艺参数为:95%乙醇做浸提剂,液固比12∶1,浸提温度60℃,浸提时间5h,萃取剂为氯仿。氯仿可回收利用,单次回收率达85%以上。使用高效液相色谱串联质谱法测定了烟草提取物中四种主要生物碱烟碱、新烟草碱、降烟碱和假木贼碱的含量,并验证了方法的可靠性。三种烟草提取物中四种主要生物碱总含量:烤烟(62.13%)>晒黄烟(58.19%)>白肋烟(50.67%),其中白肋烟提取物中烟碱含量最低,其他三种生物碱含量均最高,特别是降烟碱,远高于其他两种烟草。
  2.考察了烟草提取物对褐飞虱、棉铃虫、甜菜夜蛾、桔小实蝇和蚜虫的杀虫活性,结果表明:烟草提取物对蚜虫、桔小实蝇和褐飞虱有较好的杀虫活性;三种烟草提取物对蚜虫的LC50在3.13~8.33mg/L之间,其中白肋烟提取物对蚜虫的活性最高,与生物碱标准品中活性最高的新烟草碱相当,这说明提取物中四种生物碱的有机组合,产生了增效作用。同时还考察了烟草提取物和植物精油对小麦赤霉等八种植物病原真菌的抑菌活性:在烟草提取物和植物精油对茶树炭疽菌的混配实验中,当白肋烟提取物和丁香酚以IC50浓度5∶1混合时,共毒因子达到55.05,增效效果最佳,此外,烟草提取物对四种植物病害的盆栽实验表明,三种烟草提取物对水稻纹枯病、番茄棒孢叶斑病、茶叶轮斑病三种病菌的盆栽均有不同程度的防效。
  上述研究表明,烟草提取物具有一定的杀虫和抑菌活性,特别适用于粮食、蔬菜、茶叶以及水果等作物的病虫害防治,有进一步研究和利用的潜力。
[硕士论文] 王召
农药学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:采用复合凝聚法以海藻酸钠-壳聚糖为复合载体制备阿维菌素B2包埋颗粒剂,考察各种因素及工艺条件对包埋颗粒剂的影响。对阿维菌素B2包埋颗粒剂进行土壤缓释性能、释放动力学研究,并以番茄根结线虫为防治对象对不同粒径的包埋颗粒剂进行生物学评价。
  通过单因素试验研究乳液中海藻酸钠质量浓度、投药量(阿维菌素B2海藻酸钠)、乳化剂质量浓度、油水相质量比,交联相中壳聚糖质量浓度、氯化钙质量浓度、交联相PH对阿维菌素B2包埋颗粒剂载药量与包埋率的影响,经过SAS软件分析海藻酸钠浓度、乳化剂浓度、油水相质量比、壳聚糖浓度对包埋颗粒剂影响显著(P<005)。将这四项因素作为正交试验因素,通过正交试验及验证试验,获得制备阿维菌素B2包埋颗粒剂的优化工艺海藻酸钠浓度为15g/L,Tween-20质量浓度为75g/L,油水相质量比为120,壳聚糖浓度为10g/L,投药量为m(阿维菌素B2)m(海藻酸钠)=12,氯化钙浓度为10g/L,交联相PH为417。制备的包埋颗粒剂载药量为2238%±025%,包埋率为9526%±061%。
  扫描电镜(SEM)结果表明,粉碎后所得包埋颗粒剂(<150μm)形状不规则,并且在其致密表面附着棒状阿维菌素B2原药晶体。红外光谱仪(FI-IR)、差示热扫描(DSC)、热重(TG)、差热分析(DTG)结果显示包埋颗粒剂载体与阿维菌素B2是物理包裹关系,并未发生化学反应。
  将包埋颗粒剂进行粉碎,得到3种粒径范围的包埋颗粒剂(>300μm、150~300μm、<150μm),粒径150~300μm和>300μm的包埋颗粒剂在土壤中的模拟释放均符合一级动力学方程,粒径150~300μm和<150μm的包埋颗粒剂在土壤中的模拟释放亦符合Higuchi方程。粒径越小的包埋颗粒剂释放越快,温度或湿度越大时,包埋颗粒剂的释放越快。
  以番茄根结线虫为防治对象对阿维菌素B2包埋颗粒剂进行生物学评价,<150μm包埋颗粒剂60d防效为759%。结果表明包埋颗粒剂粒径越小,防效越高,施药剂量6667g ai/hm2与5000g a i/hm2防效差异不显著,与3333gai/hm2防效显著(P<005)。综合对比将包埋颗粒剂(<150μm)5000g a i/hm2作为推荐施药剂量。
[硕士论文] 侯鑫鑫
植物保护 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:苦葛皂苷对福寿螺具有较强的毒杀活性,其主要活性物质为苦葛皂苷A。为了更有效地提取苦葛植物中的杀螺活性成分,本文在建立苦葛皂苷A高效液相色谱分析条件基础上,对苦葛皂苷A的提取工艺进行研究;并进一步研制了苦葛提取物微乳剂,具体实验结果如下:
  高效液相色谱分析结果表明,在以乙腈∶0.1%甲酸(FA)=40%∶60%作为流动相,检测波长为203nm,流速0.8mUmm,柱温30℃,进样量5μL的条件下进行苦葛皂苷A含量分析,该方法准确度高,方法回收率在91%~95%之间。
  研究了样品最佳烘干温度、超声波提取法、热回流提取法的提取工艺。结果表明,苦葛样品最佳烘干温度为80℃。超声波提取研究结果表明,以75%乙醇为提取剂,料液比(质量比)1∶20,提取0.5h,提取效果较好,提取物中苦葛皂苷A含量为8.3%,提取率为1.14%;热回流提取研究结果表明,以75%乙醇为提取剂,料液比为1∶40,温度60℃,提取1.5h,提取效果较好,提取物中苦葛皂苷A含量为8.4%,提取率为1.18%。
  进行了D101型大孔树脂及C18分离纯化工艺优化,确定D101型大孔树脂最佳吸附时间为24h、物料比为1∶16,吸附后最佳洗脱剂为80%乙醇,最佳解析流速为4mL/min;C18纯化最佳洗脱剂为80%甲醇,流速1mL/min。采用优化的大孔树脂及C18柱层析分离条件对苦葛提取物(苦葛皂苷A含量8%)进行分离纯化,制得含量为32.2%的苦葛皂苷A粗物质。
  研制了10%的苦葛皂苷微乳剂,其配比为:1g苦葛提取物,加入甲醇4mL,水6mL,1g吐温80。采用可乳化法加工成10%苦葛皂苷微乳剂,经质量检测,所制得的微乳剂在冷、热贮稳定性及乳液稳定性都符合国家商品农药要求。
  通过浸杀试验和模拟稻田的盆栽药效试验研究结果表明,以60μg/mL10%苦葛皂苷微乳剂溶液,处理后3d对福寿螺的防治效果分别为92.8%和85.7%。
[硕士论文] 徐敏强
化学工艺 苏州科技学院;苏州科技大学 2018(学位年度)
摘要:多杀菌素(Spinosad)是由刺糖多孢菌(Saccharopoly sporaspinosa)产生的次级代谢产物,具有明显的抗虫活性。它是一种大环内酯类抗生素,其最主要的活性成分是多杀菌素A和D。多杀菌素因其对许多昆虫具有毒性而对哺乳动物没有毒性,被广泛应用于蔬菜、水果、观赏植物及粮食储藏的害虫防治。本文以刺糖多孢菌ATCC49460作为研究对象,研究了该菌的复合诱变选育及其培养基优化,5L发酵罐中基于两阶段pH调控补料分批发酵和葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的克隆表达对多杀菌素合成的影响。
  1.以自然筛选获得的S.s1-4为出发菌株,通过紫外(UV)和亚硝基胍(NTG)结合链霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子复合诱变选育,获得了一株遗传性状稳定的多杀菌素高产菌株S.s3-37,其产量为78.26mg/L,比出发菌株提高了45.71%。通过单因素实验对其发酵条件进行优化,得到最优培养条件为:初始pH7.2,接种量12%装液量40mL/250mL。
  2.对S.s3-37突变株进行发酵培养基优化,首先通过单因素实验确定了培养基的最佳碳源和氮源。然后利用Plackett-Burman实验设计对发酵培养基中的7种成分进行筛选,得到葡萄糖、糊精和棉籽蛋白为影响多杀菌素发酵的3个较为显著的因素。然后利用Box-Behnken响应面实验设计对上述三种成分进行优化,获得最优培养基配方为(g/L):葡萄糖54.3、糊精15.5、棉籽蛋白25.7、氯化钠3,磷酸氢二钾1,硫酸亚铁0.05,碳酸钙1。优化后多杀菌素产量达83.00mg/L,提高了6.06%。
  3.在5L发酵罐中考察了pH调控对多杀菌素补料分批发酵的影响,分别维持发酵液pH为7.4、7.2、7.0、6.8和6.6,在恒定pH条件下发现最适菌体生长的pH为7.2,此时菌体浓度为33.08g/L,最适多杀菌素合成的pH为6.8,此时产量为72.28mg/L。结果表明,多杀菌素合成及菌体生长的最适pH不同,由此提出了两阶段pH调控策略,即在发酵起始阶段维持pH7.2,持续一段时间后将pH缓慢调至6.8。
  通过采用这种方法,考察了不同调控时间对多杀菌素发酵的影响,分别将pH7.2维持48h,60h,72h和84h后,将pH调节至6.8,并持续到发酵结束。结果表明pH7.2维持60h后降为6.8有利于产物合成,多杀菌素产量达86.16mg/L,较恒定pH条件提高了19.20%。
  4.基于上述pH调控策略,进行补料分批发酵,根据葡萄糖的消耗速率流加补料成分,使葡萄糖浓度维持在10g/L左右。首先进行间歇补料分批发酵,每隔8h分别流加一定量的葡萄糖、葡萄糖和棉籽蛋白、全料,多杀菌素产量分别达128.87mg/L、135.89mg/L、139.43mg/L,发现间歇流加全料时产量最高,并且其菌体浓度达48.89g/L,产率达15.49mg·L-1·d-1。然后采用连续流加方式进行补全料,结果表明菌体浓度和产量有进一步的提高,分别达52.89g/L和146.83mg/L,较不补料分别提高了62.49%和70.42%,产率达15.73mg·L-1·d-1,较间歇补料提高了1.55%。
  5.通过提高限速步骤中葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的表达量,能解除限制步骤对合成速度的影响。首先在pOJ260质粒中插入permE强启动子,通过PCR扩增得到gdh目的基因,连接pMD19-T载体,导入大肠杆菌DH5α中进行克隆,提取质粒进行酶切,将酶切产物连接到pOJ260质粒强启动子的下游,完成重组表达质粒的构建,转化大肠杆菌S17-1,用接合转移的方法将重组表达质粒导入刺糖多孢菌中,最后挑取转化子进行验证,在摇瓶中进行发酵,其最高产量达89.47mg/L,较出发菌株提高了14.32%。结果表明,gdh基因的过量表达对多杀菌素的合成有较好的促进作用,为后续基因工程菌的构建打下了良好的基础。
[硕士论文] 周恒泰
植物学 四川农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文主要以2-氯甲基吡啶盐酸盐以及4-氯甲基吡啶盐酸盐为原料合成了两个不同结构的氮氧化吡啶膦酸配体,并通过水热法成功合成出了4个系列共计19个不同的稀土膦酸配合物。用X射线单晶衍射对配合物的单晶结构做了解析,并通过元素分析、红外光谱分析、X射线粉末衍射进行了表征,同时对其荧光、磁性以及对植物病原菌的抑制作用做了探究,具体内容如下:
  1.合成了配体2-膦酸甲基-1-氧吡啶,并通过水热合成法得到了3个系列共计16个不同的稀土膦酸配合物,分子式分别为:[Ln(HPAⅠ)((C2O4)0.5)2(H2O)]·3H2O{Ln=Eu(1),Gd(2),Tb(3),Dy(4),Ho(5)}、[Ln2(PAⅠ)(C2O4)2(H2O)3]·H2O{Ln=Er(6),Tm(7),Yb(8),Lu(9)}以及[NaLn2(PAⅠ)(C2O4)2.5(H2O)4]·2H2O{Ln=Sm(10),Eu(11),Gd(12),Tb(13),Ho(14),Er(15),Tm(16)}{H2PAⅠ=2-膦酸甲基-1-氧吡啶}。通过X射线单晶衍射确定了配合物1-16的晶体结构,结果表明配合物1-5同构,6-9同构,10-16同构,17-19同构。配合物1-3以及10-15具有特征发射光谱。配合物2-5具有弱的反铁磁相互作用。
  2.合成了配体4-膦酸甲基-1-氧吡啶,并通过水热合成法得到了1个系列共计3个不同的稀土膦酸配合物,其分子式为:[Ln3(PAⅡ)3(HPAⅡ)3]·4H2O{Ln=Ho(17),Er(18),Lu(19)}{H2PAⅡ=4-膦酸甲基-1-氧吡啶}。X射线单晶衍射表明配合物17-19属于单斜晶系,空间群为P21/c。
  3.对植物病原菌的抑制作用分析:采用纸片扩散法和倍比稀释法测定了配合物1~19分别对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae maculicola)ES4326(革兰氏阴性菌)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)DC3000(革兰氏阴性菌)以及枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)的抑菌圈大小,结果表明19种配合物对三种菌呈现出中等或者弱的抑制效果,且配合物对革兰氏阳性菌的抑制效果好于对革兰氏阴性菌;配合物对细菌的抑制作用强于单独的配体或者稀土离子;重稀土配合物细菌的抑制作用强于轻稀土;同种稀土H2PAⅡ配合物细菌的抑制作用较好。
[硕士论文] 苗利华
生物学;植物学 天津师范大学 2018(学位年度)
摘要:海洋枝顶孢霉(Acrenium sp.)BH0531是一株以松材线虫为靶标线虫从渤海湾天津水域分离筛选出来的具有较高活性的杀线虫真菌,为了进一步提高菌株发酵液的杀线活性,实验以松材线虫为靶标,采用响应面分析法对该菌株的发酵条件进行了优化,并研究了发酵罐培养条件,建立了相关动力学模型,旨在为该菌株进一步开发利用提供实验室工艺参数和理论支撑。研究结果如下:
  1.海洋真菌BH0531的单因素优化研究:以察氏培养基为基础发酵培养基,在优化过程中依次改变发酵条件,得到各因素的最佳取值如下:蔗糖2.5%,NaNO30.3%,蛋白胨0.1%,K2HPO40.2%,KCl0.06%,MgSO40.04%,FeSO40.0015%,pH6,装液量20%,转速120r/min,接种量3%,温度为26℃,发酵时间为120h。逐步优化后经发酵,发酵液的杀线率为65.33%。
  2.海洋真菌BH0531的响应面法优化研究:通过Plackett-Burman法筛选出影响杀线虫活性的3个重要因素,分别为NaNO3、K2HPO4、发酵时间,而后利用Box-Behnken设计和响应面分析法对其进行分析,得到三个因素的最优组合为NaNO30.34%、K2HPO40.15%、发酵时间130h。在此条件下,经摇瓶发酵验证,优化后发酵液的杀线活性为88%,比优化前的65.33%提高了22.77%。最后确定碳源蔗糖2.5%,氮源NaNO30.34%,蛋白胨0.1%,K2HPO40.15%,MgSO40.04%,KCl0.06%,FeSO40.00225%,pH6,装液量20%,转速120r/min,接种量4.5%,温度为26℃,发酵时间130h。
  3.海洋真菌BH0531的10L发酵罐条件研究:在响应面优化条件基础上,进行小规模放大工艺研究,确定了发酵罐条件下的发酵工艺参数:转速为300r/min,通气速率为5L/min,该条件下发酵液杀线活性最高为92.35%,比优化前提高了27.02%。
  4.根据发酵罐培养条件,研究了BH0531菌株发酵过程中菌体生长、产物合成及基质消耗的特性并建立相关动力学模型。模型F检验的相关系数R2分别为0.9889,0.9941,0.9957,模型拟合良好。通过对模型计算值与实验数据进行偏差分析验证模型可靠性,结果表明模型非线性拟合结果较好,可直观反映BH0531菌株分批发酵过程中的动力学特征。可为进一步掌握该菌株的发酵性能和工业化生产调控奠定理论基础。
[硕士论文] 孙陈铖
植物保护 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:功夫菊酯具有高效低毒、杀虫谱广等优点,是目前重要的农用杀虫剂,也被广泛应用于卫生害虫防治。功夫菊酯传统加工剂型存在有机溶剂使用量大,制剂稳定性较差,对皮肤和眼刺激性强等弊端,功夫菊酯原药也容易受到环境影响而快速降解,持效期较短。通过将功夫菊酯微囊化,在一定程度上弥补了传统剂型的不足。溶剂蒸发法制备农药微胶囊,具有工艺流程简单,周期短,节约成本等优点,克服了现有农药微胶囊制备方法的缺点。壁材是影响农药微胶囊理化性能的重要因素,目前相关的研究报道并不多。本研究分别选取乙基纤维素和聚乳酸为壁材,采用溶剂蒸发法制备功夫菊酯微胶囊,将微胶囊的综合评分作为考察指标,运用响应面法优化两种壁材功夫菊酯微胶囊的制备工艺;对最优工艺制备的微胶囊进行理化性能表征,包括微观形貌观察、粒径大小及分布、红外光谱、包封率和载药量的测定;探究对比两种微胶囊在乙腈和水介质中的释放动力学规律;并以德国小蠊为防治对象,研究不同浓度下,两种壁材功夫菊酯微胶囊对靶标生物的防治效果。
  通过响应面实验获得的功夫菊酯乙基纤维微胶囊的最优工艺为:溶剂用量12.99g,壁材用量0.51g,乳化剂用量2.035g。此工艺制备的微胶囊的综合评分为0.6191,对乙基纤维素微胶囊综合评分影响程度从大到小顺序为:溶剂用量>壁材用量>乳化剂用量。微观形貌观察发现,其粒径大小均匀,分布密集,表面光滑且有小孔;红外光谱测定表明功夫菊酯原药被乙基纤维素成功包埋;最优工艺微胶囊的D50为38.12μm,包封率为67.4%,载药量为37.6%。
  通过响应面实验获得的功夫菊酯聚乳酸微胶囊的最优工艺为:溶剂用量6.67g,芯壁比1.12∶1,聚乙烯醇含量0.365g。此工艺制备的微胶囊综合评分为0.1409。对聚乳酸微胶囊综合评分影响程度从大到小顺序为:溶剂用量>聚乙烯醇含量>芯壁比。微观形貌观察发现,其粒径大小均匀,粒径较小,表面光滑圆润,通体呈半透明;红外光谱测定表明功夫菊酯原药被聚乳酸成功包埋;最优工艺微胶囊的D50为2.44μm,包封率为92.0%,载药量为48.0%。
  两种壁材功夫菊酯微胶囊性能研究结果表明:乙腈中释放:聚乳酸微胶囊中功夫菊酯的释放速率比乙基纤维素微胶囊大。乙基纤维素微胶囊符合Makoid-Banakar释放模型,且n<0.45,属于扩散释放,而聚乳酸微胶囊对4种释放模型的拟合度均不高。水中释放:两种壁材微胶囊在水中释放有效成分释出含量不明显。药效试验;在3种施药浓度下,聚乳酸微胶囊的致死效果衰减速率小于乙基纤维微胶囊和水乳剂,持效期也最长,乙基纤维素微胶囊次之,功夫菊酯水乳剂最短,致死效果衰减速率也最快。
[硕士论文] 史晓敏
制药工程 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:产酶溶杆菌属黄单胞科,溶杆菌属,是一种在环境中广泛存在的新型植物病害生防细菌。而HSAF(Heat-Stable Antifungal Factor)是其产生的一种小分子抗菌物质,其能够对多种真菌和卵菌产生抑制作用,在生物防治中发挥着重要作用,是一种结构和作用方式全新的广谱抗真菌、卵菌活性物质。
  生产无农药残留、无病虫危害的农业产品一直是促进人类自身健康和保护生态环境的重要途径,也是生物防治药物研究领域的主要目标。而HSAF作为一种环境友好型杀菌剂,具有开发为新型生物源农药的巨大潜力。然而现阶段HSAF的产量太低,无法实现工业化大规模生产,一定程度上制约了其在病害防治中的广泛应用和推广。因此获得HSAF高产菌株,提高HSAF产量是当前亟需解决的问题。
  本研究以HSAF为研究对象,以产酶溶杆菌OH11为出发菌株,采用三种方法进行HSAF高产菌株的选育。通过紫外诱变、HSAF负调控基因的敲除、HSAF生物合成基因及其正调控基因的启动子改造,构建了多个不同的突变菌株,并对其HSAF产量进行评估。通过紫外诱变,筛选到3株HSAF高产菌株,其HSAF产量与野生型相比分别提高了36%、33%和25%,但是遗传稳定性实验表明,其遗传性状并不稳定。在产酶溶杆菌OH11中,已知第二信使c-di-GMP对HSAF的生物合成具有调控作用,本研究将c-di-GMP代谢蛋白的编码基因le3756和le1974这2个负调控基因进行敲除,获得双突变菌株A3756△1974,其HSAF产量比野生型提高了67%,随后在该菌株的基础上敲除RNA伴侣蛋白的编码基因hfq,获得菌株△3756△1974△hfq,与野生型菌株OH11相比,其HSAF产量提高了1倍;此外,由于c-di-GMP代谢蛋白的编码基因le1632对HSAF的生物合成具有正调控作用,因此在双突变菌株△3756△1974中,将le1632的启动子用强启动子Ptac替换,得到菌株△2-1632-Ptac,与野生型菌株相比,其HSAF产量提高了1.7倍。通过对菌株△3756△1974△hfq和△2-1632-Ptac在10%TSB培养基中的生长曲线进行测定,发现其生长没有受到不良影响,其最大细胞密度基本可以达到野生型水平,且在发酵过程中始终保持着稳定的HSAF高产趋势。
  总之,本研究采用多种方法筛选到2株稳定遗传的HSAF高产菌株,为后续的HSAF高产菌株的选育提供一个参考,为实现其工业化生产奠定基础。
[硕士论文] 张雨晴
生物化工 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:本文探索了谷氨酸脱氢酶PpGluDH及用于辅酶再生的醇脱氢酶TbADH的高效制备工艺及其在双菌双酶制备高效氨基酸类农药L-草铵膦中的应用,进一步构建了包含不同类型氨基酸脱氢酶的酶库,并初步探究了该酶库在合成L-氨基酸方面的应用。
  首先对重组菌生产谷氨酸脱氢酶PpGluDH及醇脱氢酶TbADH的产酶工艺进行优化,为其工业化应用提供参考。采用单因素法与响应面结合的方法对重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-PpGluDH的发酵培养基成分进行优化,将单位体积发酵液的酶活从LB培养基的49.8 U/mL提高至129.1 U/mL,接着对PpGluDH重组菌的诱导条件进行优化,进一步将酶活提高至159.2 U/mL,是LB培养基的3.2倍。同样考察了不同诱导条件对TbADH酶活的影响,最终使其酶活达到12.5U/mL,是LB培养基的10.4倍。
  随后对谷氨酸脱氢酶PpGluDH与醇脱氢酶TbADH双酶偶联催化转化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)制备L-草铵膦的工艺进行研究。结合PpGluDH的酶学性质研究,考察了温度、pH、酶量、双酶比例、NH4+浓度、NADP+浓度等对双菌双酶体系催化效率的影响。结果表明:该体系反应最适温度为45℃,最适pH为7.5。在底物浓度为0.2 mol/L时,最适双酶投入比例为1∶1(PpGluDH10U/mL,TbADH10U/mL),NH4+浓度为0.2 mol/L,辅助底物异丙醇与底物PPO的摩尔比为1.25∶1,辅酶NADP+浓度为0.3 mmol/L。在上述条件下,0.2 mol/L的底物能够在3h达到100%转化,产物的对映体过量值(e.e.)大于99%,光学纯度高,时空产率可达289.6 g·L-1·d-1。
  最后,基于基因组挖掘技术构建了一个氨基酸脱氢酶的酶库,并初步探索了该氨基酸脱氢酶酶库的在L-氨基酸类化合物制备中的应用。该酶库共包含23个氨基酸脱氢酶,其中包含11个亮氨酸脱氢酶,10个丙氨酸脱氢酶,1个谷氨酸脱氢酶及1个苯丙氨酸脱氢酶。测定了这些氨基酸脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)、2-酮基丁酸和2-酮基-3-丁烯酸这三个有价值酮酸底物的催化活力,发现来源于Exiguobacterium acetylicum亮氨酸脱氢酶EacLeuDH1,其催化合成的活力高于文献报道的BceLeuDH,是其活力的1.24倍。在L-2-氨基丁酸制备方面具有一定的应用潜力。
农药科学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:现代农业严重依赖于农药的应用。但在生态系统中释放活性农药可能会破坏生态系统的平衡,扰乱生态系统,这将对包括人类在内的生物造成负面影响。由于农药大多经由喷洒的方式施加到田间,因此,提高喷雾保留性被认为是一种有效的控制农药向环境中释放的方法。农药在靶标植物上的保留是一项被广泛讨论但尚未开发的研究领域。使用表面活性剂是提高农药保留的主要方法之一。
  本研究采用超分子化学研究方法,基于超分子大环主体柱[5]芳烃和长碳链客体分子间的相互作用,制备出一类表面活性剂。其中,水溶性的柱芳烃分子作为表面活性剂的亲水端,而客体分子则为疏水端。
  在第一部分中,设计合成了上下缘带正电荷的水溶性柱[5]芳烃(AP5A),并研究其与5个不同的客分子癸酸、油酸、三乙二醇、聚乙二醇、N-庚基-2-甲基苯甲酰胺(MBA)的络合能力。核磁氢谱和紫外可见光谱研究结果表明,主体分子AP5A与癸酸、油酸和MBA存在相互作用。
  对主体分子和客体分子的表面活性剂性能进行测试,发现癸酸效果最好,与单独癸酸液滴相比,AP5A加入后接触角减小了34%,90秒后接触角减小64%。这有可能使硅界面上的接触角减少至40度,达到亲水状态。水稻叶片表面上的实验也得到相似的结果。所有测试客体分子中,其他客体与柱芳烃组装的表面活性剂活性均不如癸酸。
[硕士论文] 邱静茹
化学工程 宁夏大学 2018(学位年度)
摘要:近几年在宁夏地区的枸杞种植生产中,炭疽病在部分地区发病率较高,给当地枸杞农户带来了严重的经济损失。目前长期使用的抑菌药物,易造成致病菌抗药性增强及产品中农药残留量增加等问题,不利于食品健康,并且会对土壤环境造成很大的破坏。所以研制新型安全、环境友好的抑菌剂是当务之急。
  三唑具有很好的抑菌效果,同时在三唑的两侧分别引入配位能力很强的吡啶基和苯甲酸基,对三唑环上的N起到很好的保护作用,使得其对病原菌发挥更好的抑菌活性。因此,决定选用3-吡啶基-4-苯甲酸基-1,2,4-三唑(3,4-HAPT)做为配体进行实验。
  过渡金属、稀土金属亦具有良好的抑菌性,本论文分别在水热、挥发及扩散条件下以3,4-HAPT为配体制备了14种配合物,包含5种过渡金属配合物和9种稀土金属配合物。得到了4个配合物的单晶,并通过X-射线单晶衍射测定单晶结构,其中有两类不同的结构,配合物1[Co(3,4-APT)2(H2O)4]·8H2O、配合物2[Zn(3,4-APT)2(H2O)4]·8H2O、配合物3[Ni(3,4-APT)2(H2O)4]·8H2O均为0维结构,具有相似的晶胞参数,属于同晶异质体;配合物4[Cu(3,4-APT)2]·2H2O为1维结构,这些配合物在氢键作用下都可以形成3D超分子结构。其余粉末配合物通过紫外光谱、红外光谱、热重分析、元素分析以及摩尔电导率等分析推导出其可能的结构。
  配合物、配体和金属盐的抑菌性能经过抑菌圈法,最小抑菌浓度法(MIC),最小杀菌浓度法(MBC)得以分析比较,发现配合物比配体及金属盐的抑菌性能好,并且抑菌效果随着培养时间及配合物浓度的增加而增强。其中配合物2[Zn(3,4-APT)2(H2O)4]·8H2O的抑菌效果最好,因此抑菌活性中心选定配合物2[Zn(3,4-APT)2(H2O)4]·8H2O。
  以配合物2[Zn(3,4-APT)2(H2O)4]·8H2O为活性中心,研究了抑菌剂的基础配方。首先采取流点法初步确定润湿分散剂种类,进而采用单因素实验法筛选出润湿分散剂、增稠剂、乳化剂以及用量。基础配方如下,原药:[Zn(3,4-APT)2(H2O)4]·8H2O占20%;润湿分散剂:NNO占1.5%,D425占1.5%;稳定剂:羧甲基纤维素占0.3%;防冻剂:乙二醇占5.0%;防腐剂:苯甲酸钠占0.15%;消泡剂:聚二甲基硅氧烷占0.5%;增稠剂:黄原胶占1.5%,乳化剂:农乳1601#占1.5%,加水补足至100%。在此配方下,抑菌圈可达33mm,且有很好的抑菌效果,可作为潜在有利用价值的新型抑菌剂。
[博士论文] 杜鹏强
农药学 华中师范大学 2018(学位年度)
摘要:氟乐灵是二硝基苯胺类选择性芽前除草剂,主要用来防治大豆田和棉花田的单子叶杂草和一年生阔叶杂草。然而氟乐灵在土壤中半衰期比较长,对土壤中的微生物和土壤的N循环可能存在潜在的影响。在本课题中,在室内培养和温室条件下,用荧光定量PCR技术和第二代测序技术相结合的方式,研究了氟乐灵对土壤中细菌和真菌丰度、细菌和真菌群落结构的影响,并且根据铵态氮和硝态氮的含量和与N循环相关的功能基因的变化研究了氟乐灵对N循环的影响。其中室内培养实验,采集了我国两种典型的大豆田土壤,分别是廊坊-粘壤土和建三江-粉砂质粘土。设置了四个水平的氟乐灵处理(0 mg kg-1,CK;0.84 mg kg-1,T1;8.4 mg kg-1,T10;84 mg kg-1,T100),采集了7天、15天、30天、60天和90天的样品。温室实验采用廊坊-粘壤土,设置了三个水平的氟乐灵处理(0 g ha-1,CK,1260 g ha-1,T1;12600 g ha-1,T10;12600g ha-1,T100)和一个对照处理,同样采集了7天、15天、30天、60天和90天的样品。所有样品的检测和分析内容包括:氟乐灵在土壤中的残留,土壤中细菌和真菌的数量,细菌和真菌群落组成和群落结构,土壤中铵态氮和硝态氮含量,以及土壤中跟N循环相关的功能菌群(固氮菌、氨氧化细菌和氨氧化古菌),以评估氟乐灵对土壤微生物和N循环的影响。主要的研究内容如下:
  1、建立了简便快速的氟乐灵在土壤中的残留检测方法。土壤中的氟乐灵经丙酮提取,气相色谱-电子捕获检测器检测。在0.01-10 mg kg-1浓度范围内的相关系数R2为0.996,在0.08,0.8,8和80 mg kg-1四个添加水平上的平均回收率在89.15-101.21%之间,相对标准偏差在1.98-8.21%之间,能够满足氟乐灵残留分析的要求。
  2、在室内培养条件下,氟乐灵在建三江-粉砂质粘土中降解比廊坊-粘壤土中快,其中建三江-粉砂质粘土中的半衰期为46,44和44天,廊坊-粘壤土中的半衰期为69,58和52天。在两种土壤中均是前30天降解的比较快,之后降解速度变慢。在氟乐灵的刺激下,细菌的数量在廊坊-粘壤土中上升了0.92-20.18倍,在建三江-粉砂质粘土中上升了0.091-3.92倍。但是,氟乐灵处理之后的土壤中细菌的群落组成和群落结构发生了明显的变化。在氟乐灵的刺激下,真菌的数量在廊坊-粘壤土中被抑制了12.23-56.93%,在建三江-粉砂质粘土中被抑制了33.13-69.67%。但是,群落组成和群落结构没有发生明显的变化。两种土壤中的铵态氮的含量变化均受到干扰,而硝态氮的含量受到了明显的抑制。N循环相关的功能菌群也受到了影响。固氮菌的丰度在前15天是被刺激的,从30天到60天被抑制,但是90天的时候再次恢复(或者升高)。另外,在两种土壤中固氮菌的丰度跟铵态氮的含量呈现正相关。氟乐灵对氨氧化细菌和氨氧化古菌的抑制效果明显。氨氧化细菌在廊坊-粘壤土中被抑制了25.52-92.64%,在建三江-粉砂质粘土中被抑制了30.15-83.36%。对于氨氧化古菌来说,在廊坊-粘壤土中被抑制了20.21-65.73%(除7天之外),在建三江粉砂质粘土中抑制了17.10-85.21%。
  3、温室培养实验选用的了廊坊-粘壤土,三个水平的氟乐灵在廊坊-粘壤土中的半衰期为15,23和21天。细菌的数量在T1处理中没有受到什么影响,在T10处理中60天之后数量显著增加,T100中数量15天之后增加了0.33-0.67倍。与空白对照相比,真菌被抑制了30.72-42.26%。细菌的群落结构只有15天和60天受到了影响,真菌的在7、15和30天受到了影响。铵态氮和硝态氮没有受到什么影响。固氮菌的数量在15天和90天的时候显著上升。氨氧化细菌没有受到什么影响,而氨氧化古菌被显著的抑制了。
[硕士论文] 彭智超
农药学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:PeaT1蛋白是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中提取的一种蛋白激发子,能诱导多种作物产生系统获得抗性。试验表明PeaT1蛋白制剂对水稻、小麦、白菜、芹菜等都具有明显的促生长、增产、提高果实品质和抗病抗逆的效果。为规模化生产稳定的PeaT1蛋白制剂,对其工厂化生产发酵技术进行了深入研究。根据极细链格孢菌的营养需求,通过正交设计试验对该菌的培养基进行了改进和优化,并进行了500L、5T和20T发酵罐的逐级发酵,获得了理想的蛋白制剂产品。使用高效液相色谱法、电泳法和比色法对制剂中的蛋白进行了定性和定量检测,并进行了蛋白制剂和复配配方的室内生测,具体研究结果如下:
  1.优化了PeaT1蛋白工厂化生产的培养基配方。本文通过对蛋白激发子PeaT1的工厂化生产工艺研究,将极细链格孢菌的实验室级发酵培养进行了进一步优化,通过正交试验确定了配方:木薯粉3.5%、黄豆粉1%、蔗糖0.5%、蛋白胨0.5%、味精0.5%、硫酸铵0.2%、硫酸亚铁0.02%、硫酸镁0.02%。
  2.实现了500L、5000L和20000L发酵罐发酵参数的逐级放大。对500L、5T和20T发酵罐发酵参数进行试验,掌握了其发酵时间分别为40h、26h和20h。对发酵过程中的动态参数进行监控,得到了pH值、溶氧量、温度等指标的动态曲线。
  3.建立了蛋白产品中PeaT1的检测技术。通过HPLC、SDS-PAGE的方法对制剂进行蛋白成分分析,鉴定出产品中PeaT1蛋白成分,为产品有效成分检测提供了鉴定方法。建立基于BrMford法对产品有效成分含量的快速检测技术,为产品含量提供了检测方法,为规模化发酵生产提供了质量控制手段。
  4.通过室内生测对工业设备制得的PeaT1蛋白制剂稳定性进行检测。通过将PeaT1制剂对小麦、玉米种子进行浸种处理,发现各批次较清水对照均有明显提高,各批次间差异不显著,证明工业化生产的制剂稳定可靠。
  5.确定了蛋白激发子PeaT1与井冈霉素复配的最佳配比。将蛋白激发子PeaT1制剂与井冈霉素进行了复配,得到PeaT1∶井冈霉素=3∶4的最优配比,此复配制剂在接种病毒后72h统计时对烟草花叶病毒病的抗性较清水对照提高了73.39%,差异显著。此配方产品正在农业部进行农药临时证的登记工作。
[博士论文] 陈威
生物化工 大连理工大学 2018(学位年度)
摘要:糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)是一类负责催化含糖化合物中糖苷键断裂的酶,在自然界中广泛存在。GH18家族几丁质酶和GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是其中重要的两类,它们都采用了底物辅助保留催化机理。
  GH18家族几丁质酶广泛分布于细菌、真菌、线虫、植物、节肢动物和哺乳动物体内,主要负责水解环境中或生物体自身的几丁质,在细胞营养、病原入侵、胚胎发育、昆虫蜕皮和免疫防御等多种生命活动中都发挥了重要的作用。对昆虫而言,几丁质是其外骨骼、气管和中肠围食膜的重要结构组分,因此几丁质酶对于昆虫的生长发育至关重要。在昆虫众多的几丁质酶中,Ⅱ分支几丁质酶(ChtⅡ)是其中结构域数目最多、分子量最大的一种。鳞翅目昆虫中,ChtⅡ与Ⅰ分支几丁质酶(ChtⅠ)和几丁质酶h(Chi-h)共同参与蜕皮过程中表皮几丁质的水解,虽然ChtⅠ和Chi-h的结构和功能已经得到了很好的研究,但ChtⅡ的结构仍不清楚。目前ChtⅡ的研究集中在基因水平,通过RNA干扰使ChtⅡ基因表达下调会导致昆虫蜕皮障碍并死亡,因此ChtⅡ可以作为一个潜在的杀虫剂靶标,而ChtⅡ抑制剂的研究也有助于新型农药的开发。
  GH84家族O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶是生物体内负责水解O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)翻译后修饰的糖苷水解酶,对于维持细胞内正常的O-GlcNAc水平至关重要。O-GlcNAc是真核生物中一种重要的动态翻译后修饰,参与细胞内包括信号转导、基因转录翻译和细胞循环在内的多种重要生理过程,O-GlcNAc水平的失调与多种疾病密切相关,如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶不仅能通过调控O-GlcNAc水平直接影响相关的生理过程,而且能通过O-GlcNAc与磷酸化修饰的相互作用间接影响更多的信号通路。因此,O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶的抑制剂在研究和治疗O-GlcNAc失调引发的相关疾病方面具有潜在的应用价值。
  本论文以农业害虫亚洲玉米螟来源的GH18家族几丁质酶(OfChfⅡ)和人来源的GH84家族的O-β-N-乙酰葡萄糖胺酶(hOGA)作为研究对象,主要获得以下结果:
  (1)获得了OfChtⅡ的基因和蛋白序列
  根据不同昆虫ChtⅡ的保守序列设计引物,经过同源序列获取从亚洲玉米螟成虫的cDNA中克隆获得了OfChtⅡ的基因序列9077bp,GenBank登录号为MF034108.1。其中编码区为157-8943位核苷酸,编码2929个氨基酸,GenBank登录号为ASO66823.1。序列分析发现OfChtⅡ有5个属于GH18家族的特征结构域以及7个几丁质结合结构域。5个GH18家族特征结构域中有三个结构域的催化残基发生突变,只有靠近C端的第二和第三个GH18结构域有催化活性。
  (2) OfChtⅡ截短体的水解活性和结构特征
  全长的OfChtⅡ不稳定且难以在体外重组表达,因此我们重组表达了四个截短体:OfChtⅡ-C1,OfChtⅡ-C2,OfChtⅡ-C1C2和OfChtⅡ-B4C1。水解活性实验发现,OfChtⅡ截短体对小分子底物的水解活性低,而对高聚底物的活性随着结构域数目的增加而升高,说明OfChtⅡ全长在水解高聚底物时具有很大的潜力。
  通过悬滴蒸汽扩散法获得了OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2蛋白及蛋白-底物的晶体结构,二者的蛋白结构具有很高的结构相似性,都具有一个(β/α)8 TIM桶组成的核心结构域和一个几丁质插入结构域。OfChtⅡ-C1和OfChtⅡ-C2的表面都存在着一条芳香族残基组成的长且深的底物结合裂缝,兼具OfChtⅠ和OfChi-h底物结合裂缝的结构特征。但是,OfChtⅡ的活性口袋外部缺乏有利于晶态几丁质结合的结构元件,不过它的多个几丁质结合域可能会弥补这个缺陷。
  (3) OfChtⅡ小分子抑制剂的筛选和抑制机理研究
  筛选获得了OfChtⅡ的多个小分子抑制剂,通过复合物晶体对部分抑制剂的抑制机理进行了研究。其中壳八糖(GlcN)8占据了底物结合裂缝的-3到+5位点,主要通过糖环与芳香族残基的疏水堆积作用结合;联吡啶并嘧啶类化合物2-8-S2结合在底物结合裂缝的+1和+2位之间,两个2-8-S2分子通过π-π堆积与两个保守的色氨酸形成一种双侧夹心结构。
  (4) hOGA的小分子抑制剂设计和抑制机理研究
  设计合成了一系列具有新型骨架结构的hOGA小分子抑制剂,包括NAG-噻唑啉的2-位衍生物,甘露糖构型的NAM-噻唑啉衍生物和硫苷-萘酰亚胺杂合物分子。测定了化合物对GH20家族和GH84家族糖苷水解酶的活性和选择性,通过结构生物学和分子对接阐述了部分化合物的抑制机理。其中甘露糖构型的NAM-噻唑啉衍生物的结合方式与NAG-噻唑啉类似,噻唑啉环伸向活性口袋内部。GH20家族和GH84家族糖苷水解酶对硫苷-萘酰亚胺杂合物分子表现出不同的结合模式。
[硕士论文] 张俏艳
药学 河北科技大学 2018(学位年度)
摘要:在农作物中,真菌造成的植物病害远远多于其他微生物群。近年来,抗植物真菌病药物发展快速,尤其是琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂,因其独特的作用机制,成为各大公司研究的一大热点。氟吡菌酰胺作为该类型的代表产物具有非常重要的研究意义。氟吡菌酰胺是拜耳公司开发的一种含有吡啶结构的苯甲酰胺类新型杀菌剂,不仅可用于防治多种作物的多种病害,而且具有低毒、高效、低残留及环境友好型等特点。氟吡菌酰胺是一个极具潜力的杀菌剂品种,在我国农业生产中具有广阔的应用前景。
  本文参考相关文献确定了氟吡菌酰胺的合成路线:以2,3-二氯-5-(三氟甲基)吡啶为起始原料,经与氰乙酸乙酯缩合、脱羧、还原、脱保护反应得到关键中间体2-[3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-基]乙胺盐酸盐,再与2-(三氟甲基)苯甲酰氯发生酰胺化反应得到目标产物氟吡菌酰胺。为了提高反应收率与产品质量,本文对反应条件和参数进行了优化。优化后的工艺操作简单、后处理方便,反应总收率为48.1%(以2,3-二氯-5-(三氟甲基)吡啶计)。目标化合物结构经IR、ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR进行结构表征。此合成方法条件温和,收率较高。
[硕士论文] 迟雨
材料物理与化学 中国科学技术大学 2018(学位年度)
摘要:民以食为天,农业不管是是对于国家还是人民都是至关重要的,这点在全世界范围内已经达成了共识,尤其对于中国这样13亿人口的大国,农业更是成为了国家的命脉,人民生活的根基。在农业生产过程中,为了防止病虫害以及杂草对作物影响,人们会在农业生产中使用大量的农药。不仅如此,为了提高粮食的产量,人们也会在种植作物的过程中施用大量的肥料来增加植物吸收的营养。然而大量的农药以及肥料的使用对环境带来了一些不好的影响例如农药的残留会对人畜健康产生危害,大量使用肥料可能会使土壤板结并且提高了农业成产成本。
  本文通过以下两点对农药和肥料进行改进:一是其利用效率,二是其对于环境的破化程度,以凹凸棒土作为载体,利用不同材料对其进行修饰,通过环境中温度的改变达到控制所载物质释放的目的。本论文工作如下:
  1.为了降低草甘膦除草剂对环境的危害并且提高其利用率,该工作基于纳米复合材料包括凹凸棒土、碳酸氢铵、氨基硅油以及聚乙烯醇制备了一种具有核壳结构的温敏型控释农药草甘膦。其中凹凸棒土、碳酸氢铵以及草甘膦混合物是该农药的核结构,而氨基硅油以及聚乙烯醇是该农药的壳结构。凹凸棒土具有一个微纳网络结构因此它可以约束大量的草甘膦分子。碳酸氢铵作为一个制孔剂可以分解出二氧化碳和氨气气泡从而在氨基硅油以及聚乙烯醇组成的壳表面形成孔道,草甘膦利用这些孔道进行释放。这些孔道的数量可以通过温度有效的调节,与此同时壳结构中的聚乙烯醇在高温时也有溶解的现象,因此可以很简单的控制草甘膦的释放。有意义的是,这项技术可以有效降低在降雨环境下草甘膦的损失也就是说可以有效提高对于杂草的作用。除此之外,疏水的氨基硅油又确保了温敏型控释农药草甘膦的稳定性使其可以在水中保持至少三个月的时间。该工作提供了一个很具有前景的控制农药释放以及极少其损失的方法,对解决由于农药利用率低下造成的环境危害问题具有很大的应用价值。
  2.为了提高铁肥的利用效率,该工作利用凹凸棒土、四氧化三铁、硫酸亚铁铵以及普兰尼克F-127和氨基硅油制备了一种核壳结构的可回收型温敏控释铁肥。其中,核结构由凹凸棒土和四氧化三铁以及硫酸亚铁铵组成,壳结构由普兰尼克F-127和氨基硅油构成。具有微纳尺寸的凹凸棒土形成了一种网络结构,并且可以和二价铁离子之间产生静电引力作用从而将二价铁离子束缚在凹凸棒土的表面。在该工作中,硫酸业铁铵作为一种代表铁肥和制孔剂,可以在100℃下生成氨气在氨基硅油利普兰尼克F-127的壳结构上形成大量微纳孔道,这些孔道有利于二价铁离子的释放。F-127是一种热敏型聚合物,可以通过存不同温度下水-凝胶状态的转换达到使孔道打开关闭的目的,从而调节二价铁离子的释放。除此之外,疏水的氨基硅油的存在确保了该温敏控释铁肥能在水中具有很高的稳定性。而磁性的四氧化三铁使得该温敏控释铁肥可以很方便的从水和土壤中收集回来。更重要的是,这项技术可以提高铁肥的利用效率并且促进玉米对二价铁离子的吸收。并且,该温敏控释铁肥也具有较好的重复利用效果,有助于降低生产成本以及在环境中的残留。
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