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[硕士论文] 杨海朋
生物工程 河北大学 2016(学位年度)
摘要:丙酸是化工产业的重要中间体,并且在农药、食品、塑料等的生产中均有广泛应用,丙酸及其盐类(主要是钠盐和钙盐)是国内外近年来发展起来的一种新型的食品防腐添加剂,已经广泛受到人们的关注。费氏丙酸杆菌是丙酸杆菌属中生产丙酸的一种,同时也会产生一定量的VB12。这种特性使得丙酸和VB12的联产成为可能。
  费氏丙酸杆菌在发酵生产丙酸的同时,也会伴随有乳酸、乙酸、丁二酸等有机杂酸的产生,不但影响后续丙酸的分离提纯,同样消耗营养物质降低了糖酸转化率,通过应用高效液相色谱的方法研究了丙酸发酵过程中四种有机酸的检测方法,分别研究了在流动相种类、流动相pH、流动相配比、柱温、流速等洗脱条件下的分离情况,并得到了期望的结果,使得在发酵过程中对四种有机酸简单方便的实时监测成为可能。研究了应用树脂原位分离的方式分离丙酸并耦合VB12发酵方式的可行性,从8种对丙酸吸附效果较好的树脂中筛选出了在中性条件下吸附丙酸最好的ZGA302树脂,并进行了原位分离实验的研究。在此基础上,又研究了应用树脂原位分离技术的半连续发酵方式的可行性,并根据实际操作中出现的问题,重新调整了发酵方案,本论文的主要研究成果如下:
  (1)通过优化流动相组成及配比、pH值、流速和温度等条件,建立了一种基于HPLC的快速测定丙酸发酵液中丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸的方法。色谱柱条件为 COSMOSIL5C18-PAQ(4.6 mm×250 mm),检测器为紫外检测器,紫外检测波长为210 nm,流动相为K2HPO4缓冲液(0.02 mol/L)和乙腈(0~1%梯度洗脱),流速1.0 mL/min,柱温25℃,进样量10μL,采用外标法定量。在该条件下各物质线性回归方程相关系数均大于0.999,加样回收率均在95~105%之间,相对标准偏差均小于5.0%,该方法具有准确度高、精密度好等优点,适用于丙酸发酵液中四种有机酸的测定,可为丙酸发酵过程中四种有机酸的监控及发酵调控提供了参考。
  (2)采用树脂原位分离的方法进行费氏丙酸杆菌发酵生产丙酸和VB12的研究,首先进行了树脂的筛选,从对丙酸吸附量较大的8种树脂中筛选出了在中性条件下对丙酸吸附量最大的ZGA302树脂,并发现树脂灭菌前后吸附效果相同。随后进行了树脂原位分离丙酸耦合VB12的发酵,发酵过程中时刻监测丙酸浓度,当丙酸浓度高于20 g/L时即向发酵罐中加入灭菌后的100 g ZGA302树脂,解除丙酸对菌体的抑制作用,并在发酵到84 h时进行VB12的转化实验,发现整个发酵过程中实验组和对照组的糖消耗、OD600值和菌体湿重变化趋势相近,最终结果证明应用树脂原位分离丙酸耦合VB12的发酵方式使得丙酸增产17.1%,VB12增产24.4%。
  在前面实验的基础上进行了树脂原位分离丙酸耦合VB12发酵的半连续发酵实验的尝试,整个发酵过程分为两个批次,两批次的发酵方式相同,均应用原位分离的发酵方式,第一批次发酵结束后预留10%的发酵液作为第二批次发酵种子培养基,结果表明应用树脂原位分离丙酸耦合VB12的半连续发酵方式较正常发酵在丙酸和VB12产量上均有提高,为后期实验的放大提供了思路。
  前期实验过程中仍存在一定的问题,在发酵过程中因树脂的大量加入导致混匀效果逐渐变差及其他的问题,我们重新设计了一种发酵方式,在将树脂加入发酵罐后将发酵液倒流过一个层析柱,通过层析柱内的40目筛网将树脂截流住,最终经过计算后发现在丙酸产量上实验组要高出对照组26.5%,糖酸转化率方面实验组要高出对照组23.5%。
[硕士论文] 徐巧玉
微生物与生化药学 南京大学 2009(学位年度)
摘要:天然活性物质在工业生产和医药行业有着广泛的应用,微生物作为活性物质的来源,因为繁殖速度快,生产成本低,产量大等优点备受人们关注。本研究主要针对微生物产单宁酶和药用成分石杉碱甲进行探索。包括高效产单宁酶和石杉碱甲微生物菌种的筛选,从发酵液中提取分离活性物质及其产量测定,优化发酵条件。
   单宁酶,全称单宁酰基水解酶是一种细胞膜结合酶,它能水解单宁酸的酯键和缩酚酸键产生没食子酸和葡萄糖,用途非常广泛,在酒品,饮料,茶的生产工程中起到调节风味的作用,近年来伴随着茶饮料工业的迅猛发展而得到深入地研究。另外在制革业也有乳化皮革的应作用,是制革的关键步骤。产物中的没食子酸可作为医药中间体,又是食品、化妆品及饲料的抗氧化剂,近年来还用作感光树脂的原料等,已成为市场上需求量较大的一种重要医药、化工原材料。要开展微生物酶法生产单宁酶和没食子酸新工艺的研究,筛选高活性单宁酶产生菌是基础工作.
   本研究在紫金山土壤中分离了75株真菌,用含有单宁的筛选培养基筛选出11株产单宁酶的真菌。又经过摇瓶培养,利用紫外分光光度计检测发酵液及菌丝体中的粗酶液的酶活,筛选出一株高效产单宁酶的菌株,经过形态和分子方法鉴定为Aspergillus awamori,测得酶活为18.2 U/ml,产酶最适pH为4.0,培养时间为96h。实验采用不同的碳,氮源对菌株进行发酵培养,发现碳源对产酶有明显的促进作用,氮源表现为抑制作用。水解类单宁及其衍生物对菌株产单宁酶具有促进作用,缩合单宁没有影响,没食子酸具有抑制作用。
   石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)是一种倍半萜生物碱,为高效、高选择性、可逆性的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂,具有提高学习记忆力和改善老年人记忆功能的效果,对治疗重症肌无力和早老性痴呆有显著疗效.石杉碱甲制剂(哈伯因),现已应用于临床,用于治疗老年人记忆减退和早期老年性痴呆症.近年研究还证明Hup A有神经保护和预防化学武器的潜力。但是石杉碱甲的构造复杂,人工合成十分困难,且合成产物有副作用,因此石杉碱甲的主要来源还是少数石杉科植物的提取,而该类植物都是古老的蕨类植物,大多已经灭绝,现存植物对生长环境要求苛刻,生产缓慢,可利用野生资源极其有限。开发新的石杉碱甲来源例如产石杉碱甲微生物的筛选是很有意义的。
   本研究测定了三种湖南产石杉属植物的石山碱甲产量,采用严格的外植体灭菌方法对蛇足石杉的内生真菌进行分离,并对真菌能否产石杉碱甲作了初步研究,分离得到的9株内生真菌中,来自蛇足石杉茎部的6株,来自叶片的3株。经过高效液相色谱检测,有1株来自茎部的内生真菌产石杉碱甲。
[硕士论文] 吕高原
生物化工 河南大学 2015(学位年度)
摘要:烟酰胺作为B族维生素的重要成员,参与了机体内两种重要辅酶的形成。烟酰胺作为重要的营养性添加剂被广泛应用于应用于饲料生产行业,其在医药、食品、化妆品行业的应用前景也非常广阔。在工业生产方面,人们主要利用化学法和微生物法进行烟酰胺生产。烟酰胺的微生物生产法有着化学法无法比拟的优越性,此方法对环境几乎不造成污染,且生产成本低,工艺简便。
  本研究主要内容包括:⑴以实验室现有菌种HD1220为出发菌株,分别使用ARTP诱变、微波诱变、EMS诱变三种单因子诱变以及在各因子最佳诱变条件下的复合诱变,确定了复合诱变的最佳条件为:ARTP诱变时间240 s;微波诱变强度60%,微波照射时间90 s,;EMS浓度0.8%。诱变完成后,筛选出一株能够稳定遗传且酶活高达1764 U/mL的高腈水合酶活性菌株,与出发菌株相比,诱变后菌株酶活提高了33.13%,并将该菌株暂时命名为NHD-1。⑵利用HPLC对烟酰胺进行检测,通过对HPLC检测的紫外检测波长、流动相流量、流动相比例三个条件进行的单因素优化实验,最终确定HPLC检测烟酰胺的各个最优条件为:紫外检测波长为220 nm,流动相的流量为0.4 mL/min,流动相中甲醇:水=1:3。在以上条件下,烟酰胺出峰时间为5.306 min,与条件优化前相比,烟酰胺出峰时间明显缩短。⑶对腈水合酶参与烟酰胺生产过程中酶催化反应条件进行单因素优化实验,我们得出各因素的最佳条件为:菌体浓度1.8%,菌龄48 h,底物浓度100 g/L,温度29℃,pH7,反应时间180 min,在实际发酵后期应该对产物烟酰胺进行及时分离。通过Plackett-Burman实验设计我们分析出底物浓度、温度和pH这三个因素对腈水合酶的酶活有及其显著的影响;通过对这三个因素进行响应面优化设计,我们得出了这三个因素的最佳条件组合为底物浓度98.88 g/L,反应温度29.10℃,pH值7.14。在此条件下酶活响应值为1784 U/mL。对SAS软件统计分析结果进行三次验证实验,得到腈水合酶的实际酶活为1775U/mL,与多元回归分析所得理论值吻合,说明利用响应面法能够很好的优化酶催化反应条件。
[硕士论文] 乔淦
轻工技术与工程 青岛科技大学 2016(学位年度)
摘要:本研究结合分子生物学、微生物学及发酵工程技术与理论,构建文蛤原肌球蛋白原核表达工程菌及使用亲和层析的方法得到了目的蛋白。
  方法:根据基因工程技术结合原肌球蛋白相关基因信息,由其基因的特点设计出两段PCR引物,扩增基因得到目的基因,测序分析克隆结果。使用T载体快速扩增克隆目的基因,连接目的基因与表达载体。然后通过大肠杆菌诱导表达得到目的产物,使用亲和层析技术纯化目的蛋白。结果:文蛤原肌球蛋白多肽(MMTM)是一种抗癌多肽,分子大小约为32kDa。从蛋白特性分析结果中,蛋白理论上pI值为4.5。基因测序结果与基因文库中文蛤原肌球蛋白序列有十几个碱基差异,而翻译为蛋白后目的蛋白的结果和目的基因一致,这种差异的原因可能是原核表达载体大肠杆菌的密码子偏好性和真核生物不同。最终由IPTG诱导发酵表达目的蛋白,凝胶分析可以看到在32kDa左右有一深色条带,使用蛋白测序分析这种蛋白即为目的产物。
  发酵过程中发现目的产物的产量没有达到预计要求,为了后续的药理学实验研究所以设计了优化培养以提高目的蛋白的产量。方法:单因素实验确定几个因素最适条件,并筛选培养基的主要因素,选用五种培养基LB、LB+M9、M9、SOB、2*TY的摇瓶发酵,再根据结果设计培养基优化实验。首先使用PB设计确定发酵的主要因素及水平,然后由 PB实验筛选因素中的最大影响因素设计交互实验结果得到各个因素最佳组合水平。结果:验证了适合发酵培养的因素有:有机碳源如葡萄糖、酵母粉及胰蛋白胨等,氮源如氯化铵、酵母粉及胰蛋白胨,无机盐成分等。这些因素都会影响发酵的进行,但环境因素如pH及溶氧量等因素也是制约的因素,而由于条件的限制实验未能进行。从五种培养基的筛选得出LB+M9混合培养基是大肠杆菌培养的合适选择,摇瓶发酵中菌体量达到50g/L,说明充足的营养可以提高生物利用。PB设计结果说明葡萄糖、酵母粉及硫酸镁是影响目的蛋白产量的主要因素,然后利用中心点实验设计验证这三种因素的相互作用及结果,结果显示整模型统计学有效,设计符合发酵实验要求,其中葡萄糖和酵母粉对实验结果具有交互影响,通过实验优化验证目的产物得率提高了56%。
  通过体外抑制实验验证了目的产物对癌细胞抑制作用。利用MTT方法评价目的蛋白的细胞活性,DAPI染色方法说明了目的蛋白对癌细胞核形态及变化的作用,从而评价药物的作用。方法:研究通过体外细胞培养技术及MTT细胞抑制率实验评价了MMTM蛋白的癌细胞抑制活性。使用DAPI染色观察到MMTM细胞形态有显著变化。结果:细胞抑制实验表明 MMTM对细胞有很好的抑制作用,在高浓度情况下可以很好的诱导细胞的凋亡,细胞形态表现为细胞固缩破碎,细胞质释放细胞死亡。DAPI染色结果表明加MMTM后细胞染色质颜色较亮,细胞核明显固缩,表现出不同程度的核碎片。由低到高目的蛋白浓度对细胞呈现为一定的浓度梯度,对肺及胰腺癌都呈现一定的浓度梯度活性,说明蛋白具有很好的的抗癌活性。
[硕士论文] 王哲理
发酵工程 齐鲁工业大学 2013(学位年度)
摘要:本文开展了在体外用法尼基转移酶催化人工合成的寡肽与法尼基焦磷酸(FPP)的合成研究,即合成我们需要的寡肽接头分子。接头分子是一个连接酵母细胞和抗体的一个桥梁,合成出的接头分子是酵母细胞流式阵列的一个重要元件,为以后的酵母流式阵列的构建打下基础。这项研究内容包括对需要的寡肽的合成设计、反应体系的优化及寡肽接头分子的分离。在寡肽的合成设计过程中,主要考虑法尼基转移酶对催化的底物的结构要求、流式阵列中酵母细胞必须具备的结合抗体的能力要求(寡肽需含有游离的羧基)以及在制作寡肽标准曲线中便于检测的原则来设计。对反应体系的优化实验中,主要进行了两部分实验:一是单因素实验部分,首先确定温度、pH对法尼基转移酶活性的影响,确定适宜的反应温度和反应体系的pH;另外一部分是通过做三因素三水平正交试验,在寡肽浓度饱和的条件下研究另一个底物 FPP浓度、加入的法尼基转移酶的浓度、反应时间对合成我们需要的寡肽接头分子的量的影响,以确定最优反应体系。合成出寡肽接头分子后,通过凝胶层析法除去反应体系中的法尼基转移酶,得到需要的寡肽接头分子,通过真空冷冻干燥,低温保存待用。
[硕士论文] 潘淼
生物化工 东华大学 2015(学位年度)
摘要:丙酸杆菌产生的抑菌性代谢物是一种具有潜力的天然食品防腐剂。目前,丙酸杆菌抑菌性代谢物研究和发酵制备时所用的培养基价格较高,影响了其工业化生产和应用。本文对产抑菌性代谢物的薛氏丙酸杆菌的发酵培养基进行了优化,分析了抑菌性代谢物的性质,并对抑菌物质进行了初步分离纯化。
  实验利用单因子实验和响应面实验设计对薛氏丙酸杆菌产抑菌性代谢物的发酵培养基组成进行了优化,以降低培养基成本和提高代谢物抑菌活性。实验结果表明,玉米浆和大豆蛋白胨可以代替原始培养基中的酵母提取物和胰蛋白胨,通过Box-Behnken实验设计和响应面分析法优化得到了薛氏丙酸杆菌产抑菌性代谢物的发酵培养基组成为葡萄糖8.2g/L、大豆蛋白胨5.1g/L、玉米浆12.7g/L,在此条件下,代谢物抑菌活性的理论值为29.5AU/mL,实际测定值为29.4AU/mL。优化后,薛氏丙酸杆菌代谢物抑菌性提高了57.8%,培养基成本大大降低。
  实验选用两种乳清粉、三种脱脂奶粉以及一种浓缩型乳清蛋白为培养基主要成分,开发一种以乳品原料为主要成分的发酵培养基。结果表明,乳清粉用作培养基主要成分时,薛氏丙酸杆菌产生的代谢物抑菌活性较高。乳清粉A的添加量在80g/L时,抑菌活性最高,达29.4AU/mL。
  实验对薛氏丙酸杆菌抑菌代谢物的特性进行了初步分析。薛氏丙酸杆菌代谢物具有很好的热稳定性,121℃处理20min后仍具有良好的抑菌活性。pH值对薛氏丙酸杆菌代谢物的抑菌效果有较大影响,在pH值5.5左右抑菌效果显著,而在pH值偏中性或者碱性时,抑菌效果会大大降低甚至消失。丙酸杆菌代谢物经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,其抑菌圈显著变小,代谢物失去部分活性。薛氏丙酸杆菌代谢物对恶臭假单胞菌,酸土脂环酸芽孢杆菌,马克思克鲁维酵母菌三种指示菌均有抑菌效果,抑菌效果从强到弱依次为:恶臭假单胞菌,酸土脂环酸芽孢杆菌,马克思克鲁维酵母。
  对丙酸杆菌代谢物进行了初步分离纯化,对其结构特性进行了初步分析。薛氏丙酸杆菌发酵液依次经过离心、浓缩、微滤、超滤、层析脱盐、凝胶层析纯化得到初步纯化产品,通过抑菌活性分析、TLC层析、MALDI-TOF质谱分析以及傅里叶变换红外光谱分析对初步纯化代谢物的抑菌活性、相对分子量、物质类型、官能团结构等进行了分析。薛氏丙酸杆菌抑菌代谢物含有至少一种具有较强抑菌活性的多肽类物质,该物质分子量为701.5,并且极性较大,其分子结构中含有羰基等不饱和双键。经过分离纯化,丙酸杆菌代谢物的抑菌活性可达分离前的3倍以上。
[硕士论文] 王亚星
制药工程 天津大学 2014(学位年度)
摘要:相比生物乙醇,丁醇具有更好的理化性质,是一种极具发展潜力的新一代生物能源。近些年的研究表明可以利用光合蓝细菌作为细胞工厂直接从 CO2生产生物丁醇,但是蓝细菌对丁醇的耐受性很低,严重限制了丁醇生产的经济可行性。因此提高其对丁醇的耐受性对利用蓝细菌生产生物燃料有着重大的意义。
  最近,基于实验室的微生物适应性驯化已经越来越被推崇为一种筛选并富集有利基因以得到高溶剂耐受菌的有效方法。我们以光合蓝细菌的模式生物——集胞藻PCC6803为研究对象,采用适应性驯化的方法对其进行丁醇驯化,以提高其对丁醇的耐受性。经过约600天的连续驯化培养,传代至126代,丁醇耐受浓度由最初的0.20%(v/v)提高到0.65%(v/v),耐受能力增强了225%。
  为了探究逐步提高的丁醇耐受性在细胞代谢水平上的影响,我们结合利用了LC-MS和GC-MS技术对野生株和不同阶段的驯化株进行了代谢物组的研究,考察了驯化过程中代谢物的变化。通过主成分分析(PCA)我们发现在驯化过程中集胞藻PCC6803的代谢物组逐渐的发生偏移,并初步找到了一些可能的丁醇处理生物标记物,主要包括不稳定的3-磷酸甘油酸(3PG)、6-磷酸果糖(F6P)、6-磷酸葡萄糖(G6P)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、5-磷酸核糖(R5P)和 DHAP;另外,通过加权关联网络分析(WGCNA),我们找到了9个与丁醇耐受性高度相关的代谢模块以及3个关键代谢物(甘油、硬脂酸和L-丝氨酸),可能在细胞对抗丁醇的过程中发挥一定的保护作用。
  本文第一次从时间维度上探索了驯化过程中丁醇耐受性在集胞藻PCC6803代谢水平的应答情况,找到了一些可能的丁醇处理生物标记物,为进一步研究丁醇抗性、构建高丁醇耐受性菌株提供可能的靶点。
[硕士论文] 陈进聪
生物化学与分子生物学 南昌大学 2015(学位年度)
摘要:L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)是合成细胞浆蛋白、核蛋白和肌酸的重要前体,同时也是人和动物体内一种半必需碱性氨基酸。随着对L-Arg功能研究的不断深入,L-Arg已经被广泛应用到食品、医药和化妆品领域,因此其市场需求量在不断增加。微生物发酵是L-Arg生产的主要来源,为适应市场发展需要,近年来对L-Arg高产菌株的研究渐渐成为热点。
  本文以钝齿棒杆菌诱变菌为试验菌株,首先采用摇瓶发酵的方式,研究了培养基组分(碳源、有机氮源、无机氮源及无机盐离子)及发酵培养条件(温度、接种量、初始pH及发酵液体积)对菌种产L-Arg产量的影响。结果表明,该菌产L-Arg发酵培养基的最佳组分为:葡萄糖12%、硫酸铵4.5%、玉米浆2.5%、KH2PO40.005%、MgSO4·7H2O0.01%、FeCl3·6H2O0.01%、MnSO4·H2O0.05%及碳酸钙3%;最佳发酵条件是:培养温度为30℃、接种量为10%、初始pH为7.0及装液量为15mL/250mL。该菌以最优条件发酵,L-Arg的产量较基础培养基提高27.7%,达到了11.23g/L。
  其次,采用无痕敲除技术敲除了编码丝氨酸生物合成支路的serB基因(编码磷酸丝氨酸磷酸酶)。发酵实验结果表明,无论有无添加丝氨酸,serB缺失型菌株的生长及葡萄糖的利用均严重的下降,且L-Arg产量也受到显著的影响。发酵120h后L-Arg的产量从原始菌株的8.84±0.032g/L分别下降到了1.69±0.120g/L(0mmol L-Ser添加),2.30±0.032g/L(1mmol L-Ser添加),2.48±0.015g/L(10mmol L-Ser添加)。
  此外,为了提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)含量,本研究进一步敲除了编码葡萄糖旁路(Gluconate Bypass,GB)中的关键酶葡萄糖脱氢酶(Glucose Behydrogenase,GDH)的三个同工酶基因Cgl0286,Cgl2134及Cgl2674。实验结果表明,三个编码GDH的同工酶基因的缺失,细胞内NADPH的含量分别提高了27.4%,29.4%及7.80%。为了提高菌株利用NADPH合成L-Arg的能力,本研究同时采用基因取代方法过表达精氨酸生物合成途径中利用NADPH的关键酶基因argC。通过氨基酸自动分析仪分析120h的发酵液中游离氨基酸含量,结果表明双敲除菌株(M4△Cgl213△Cgl2674)、argC过表达的双敲除菌株(M4△Cgl213△Cgl2674::argC)和argC过表达的三敲除菌株(M4Cgl286△Cgl2135△Cgl2674::argC)相比原始菌株,L-Glu、L-Pro,L-Arg含量均有所提高,L-Lys与L-Gly含量有轻微的降低,而L-Cys含量基本没变化;且argC过表达的双敲除菌株(M4△Cgl213△Cgl2674::argC)及三敲菌株(M4△Cgl286△Cgl2135△Cgl2674-::argC)比较双敲除菌株(M4△Cgl213△Cgl2674),发酵液中L-Glu含量均有所降低,而L-Pro、L-Arg含量有所增高。以上结果表明钝齿棒杆菌中argC基因过表达有助于精氨酸合成途径中前体物质L-Glu的利用,并达到提高副产物L-Pro及终产物L-Arg生物合成的效果。
[硕士论文] 李梦悦
发酵工程 齐鲁工业大学 2016(学位年度)
摘要:海藻糖合酶是一种能够一步法转化麦芽糖生成海藻糖的酶制剂,其底物专一性较高,使用该酶生产海藻糖工艺简单,不受底物麦芽糖浓度的影响,是工业生产海藻糖的首选。
  为获得具有生产海藻唐合酶能力的毕赤酵母表面展示载体,以实验室筛选的恶臭假单胞杆菌Pseudomonas putide P06海藻糖合酶基因为模板,PCR扩增得到海澡糖合酶基因(tres,2064 bp),连接至pPICZαA质粒中,获得重组质粒pPICZαA-tres。以来自pEGFP-N1质粒的增强型绿色荧光蛋白的基因(egfp,720bp)为外源展示蛋白编码基因,以来源于酿酒酵母的共价连接酵母细胞壁的Pir系列蛋白的Pir1p成熟肽作为毕赤酵母表面展示的锚定蛋白,利用PCR技术扩增得到pir1p(847bp),连接至重组质粒pPICZαA-tres中,构建成pPICZαA–tres-egfp-pir1p重组质粒。将重组质粒pPICZαA–tres-egfp-pir1p利用电转技术转化进毕赤酵母GS115中,外源蛋白在α-factor信号肽的引导下分泌表达并锚定到细胞壁上,展示在细胞壁表面。经流式细胞仪检测到荧光强度,说明外源蛋白成功展示到毕赤酵母,并以此为判断依据优化出外源蛋白表达量较高的发酵条件。继续将pir1p(847bp)连接至重组质粒pPICZαA-tres中,重新构建重组质粒pPICZαA–tres-pir1p,转化至毕赤酵母GS115,筛选出阳性克隆子,进行发酵试验。发酵产物经离心、破碎并使用昆布多糖酶水解、洗脱,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可见明显融合蛋白条带,说明海藻糖合酶已成功锚定在毕赤酵母表面。将重组毕赤酵母使用pH7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为300g/L的麦芽糖在30℃-60℃水浴条件下作用2h,反应产物藻利用HPLC检测,能够检测到海藻糖合酶学活性300.65U/g。在优化后的酶促反应条件pH7.5,50℃表面展示海藻糖合酶的酶活达到600.65U/g。40℃-50℃之间酶活较稳定,保温60min后残留酶活的相对活力达75%以上;最适的反应pH值为7.5,并在偏碱性环境下稳定。
[硕士论文] 吴祥坤
生物工程 齐鲁工业大学 2016(学位年度)
摘要:透明质酸(hyaluronic acid,HA)是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAC)在β-1,3和β-1,4两种糖苷键的交替连接下而聚合成的一类具有特殊保水作用的直链粘多糖,在食品、日化、医疗、药品等行业均有应用,具有较好的市场前景。
  HA应用研究发现,不同分子量HA的应用性能有较大差异:高分子量HA因具有较好的粘弹性、保湿性而被大量的应用于骨关节炎的治疗、术后防粘连等方面;中等分子量HA在紧致皮肤和保湿性方面具有优势;低子量HA主要应用在抗肿瘤、伤口愈合、血管生成等方面。本论文从菌种的选育、发酵过程优化和分离提取工艺条件入手获得中等分子量HA。主要研究内容和结果如下:
  (1)以实验室保藏的兽疫链球菌(StreptococcuszooepidemicusSL-2)为出发菌,利用等离子体诱变系统,筛选获得一株产中等分子量HA的优良菌株XKW-104。
  (2)根据单因素实验、正交实验,确定了发酵培养基的组成:蛋白胨20g/L、葡萄糖80g/L、酵母粉5g/L、K2HPO4·3H2O2g/L、MgSO4·7H2O1.5g/L;初始pH7.0,装液量100mL、接种量10%(v/v)、摇床转速200r/min、温度37℃,发酵周期为24h。
  (3)根据过程优化实验,在10L全自动发酵罐内研究了菌株XKW-104的发酵特性,通过控制葡萄糖添加量80g/L,采用初始葡萄糖底物浓度为40g/L,发酵6h时一次性补加葡萄糖,使其浓度维持40g/L的方式,HA的产量提高28.5%,达到7.63±0.52g/L,而乳酸的积累量降低7.89%,所得HA产品平均分子量为1.56×106±0.45u。该实验条件在10m3的发酵罐体系中使用,HA最大产量达到了9.66±0.58g/L,发酵速率为0.483±0.42g/(L·h),发酵周期降至20h。
  (4)采取二次醇沉的方式提取HA,一次发酵液粗沉淀最佳酒精度为58%(v/v),最佳静置时间为10h;溶解液脱色时活性炭的最佳添加量为0.8%(m/v);二次精沉淀时最佳酒精度为52%(v/v),最佳静置时间为8h;干燥条件为50℃真空条件下干燥5h。
[硕士论文] 韩斌
生物工程 齐鲁工业大学 2015(学位年度)
摘要:随着人类文明的不断向前发展,人们逐步实现了社会化的协作,建立起了规模化的现代工业体系。现代化、规模化的工业生产,需要消耗大量的水。我国大部分地区水资源储量较为有限,随着现代工业的发展,许多地区都出现了水源匮乏的问题。另外,根据我国目前的情况,大量的工业废水不达标排放,含有农药、化肥的农业废水污染河流,随着城市规模的扩大,日益增加的城市废水都成为了水体被污染的来源。工业、农业生产占用了大量的新鲜水资源,工农业排放的废水造成了水资源的污染,而这些问题都导致了水的需求与供给之间的不平衡在加剧。在以上提及的各类影响因素中,以工业废水的影响最为明显和严重。柠檬酸生产企业是耗水大户,在减少工业废水排放、节约水资源方面承担有更重要的责任。
  本项目以一定的经济和技术基础为前提,采用先进的生产工艺,对现有柠檬酸生产中的发酵工序进行耐高糖浓度菌种发酵工艺改良,对粗提取工序将传统的柠檬酸三钙工艺优化为柠檬酸氢钙法提取工艺,对离交工序新增六个阳离子交换柱,回收阴离交柱冲洗水。通过以上技术改造措施,在降低生产中物料消耗的同时,能够极大地降低生产水耗,实现水资源的效益最大化,将污水的排放量控制在最低。技术改造后,该生产线耗水量由496万m3/a下降为332万m3/a,成品柠檬酸生产水耗由过去的24.8m3/t下降为16.6m3/t。通过加强对生产过程中各个环节的控制,可杜绝水资源的粗放管控和使用,达到综合利用水资源并实现可持续发展。本项目的节水技术方案能够降低单位产品的水耗,能够缓和生产用水紧张的情况,能够改变可回收利用的部分水资源被排放的现状。本项目能够实现水资源的综合、集约化利用,减少水资源的浪费,实现水资源的优化、合理配置。
[硕士论文] 王冬冬
生物化学与分子生物学 河南科技大学 2012(学位年度)
摘要:本文以甘蔗渣、玉米秸秆等为原料,以纤维素酶和木聚糖酶为降解酶,以干酪乳杆菌NE-19为出发菌株,来进行纤维质原料的酶解以及利用酶解液发酵生产L-乳酸的研究。通过对纤维质原料进行预处理试验,确定预处理最佳参数为:化学试剂3%NaOH,加热时间1h,固液比1/20。通过对纤维素原料酶解进行单因素优化试验,得到最佳参数为:酶解时间14h,温度50℃, pH值4.5,纤维素酶的添加量0.3g,木聚糖酶的添加量0.5g,最佳转速100r/min,两种酶的添加方式为同时添加,不同纤维质原料之间不存在交互作用。采用优化得到的最优参数进行纤维质原料的酶解,还原糖产量最高达44.3 g/L,酶解率达到了88%以上。分别采用紫外线、低能离子束、硫酸二乙酯对干酪乳杆菌进行复合诱变筛选,获得一株稳定的L-乳酸高产菌株NE-86,其乳酸产量达到127.2g/L,比出发菌株提高15.1%。通过对发酵培养基进行单因素和响应面优化,得到最佳发酵培养基为(g/L):葡萄糖112.5、蛋白胨16.0、牛肉膏11.4、酵母膏5.6、无水乙酸钠2.25、MgSO4·7H2O0.1、MnSO40.075、吐温-801ml、CaCO360、pH6.8、酶解液1000ml。利用该培养基进行培养,发酵96h后乳酸产量达到137.86±3.7g/L,继续延长发酵时间到120h,乳酸产量达到141g/L,此时残糖量仅为5.6g/L。结果说明,采用优化得到的酶解工艺参数,纤维质原料可以很好地被降解;突变株比出发菌株具有更好的乳酸生产能力及更高的转化率;纤维质原料被酶解后所产生的还原糖等物质能被突变后的干酪乳杆菌很好地利用。
[博士论文] 付晶
生物化工 天津大学 2016(学位年度)
摘要:本文首先对枯草芽孢杆菌进行代谢工程改造,并结合辅因子工程和发酵工程优化的策略,研究了枯草芽孢杆菌分别生产手性D-(-)-和meso-2,3-丁二醇的能力;其次,利用辅因子工程手段,解决了枯草芽孢杆菌生产乙偶姻时还原力过剩的问题,实现了乙偶姻的高产,并达到了较高的生产速率;最后,通过在谷氨酸棒杆菌中引入外源的2,3-丁二醇合成路线,获得了高产D-(-)-2,3-丁二醇的工程菌株。
  首先,通过文献比对和实验数据分析,解释了本实验中B.subtilis168生产单一手性D-(-)-2,3-丁二醇的合理性。为了提高D-(-)-2,3-丁二醇的产量和得率,本文对乙偶姻的合成途径、竞争途径、还原力供给和发酵条件等进行了系统的研究。研究发现,在微氧条件下,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh可以阻断副产物乳酸的生产,同时为菌株提供更多可利用的NADH。通过引入来自大肠杆菌中udhA编码转氢酶,可以将胞内PP途径生产的NADPH部分转化为NADH供乙偶姻还原酶将乙偶姻还原为D-(-)-2,3-丁二醇。通过胞内还原力水平和乙偶姻还原酶活力的测定,以及不同工程菌株乙偶姻和D-(-)-2,3-丁二醇的生产情况,确定对于枯草芽孢杆菌胞内可利用的NADH对2,3-丁二醇的生产有关键作用,而单纯提高乙偶姻还原酶的活性对提高D-(-)-2,3-丁二醇的生产的作用并不显著。最终获得工程菌株BSF30,通过发酵条件优化在分批补料发酵实验中生产了101.2g/L的D-(-)-2,3-丁二醇。通过引入来自肺炎克雷伯氏菌编码meso-2,3-丁二醇脱氢酶的budC基因,并结合代谢工程、辅因子工程和发酵工程策略,构建了高产meso-2,3-丁二醇的工程菌株BSF9G,在分批补料发酵中生产了103.7g/Lmeso-2,3-丁二醇。通过解调阿拉伯糖转运蛋白的表达,并引入来自大肠杆菌的木糖异构酶和木酮糖激酶,实现了葡萄糖木糖和阿拉伯糖的共利用。
  其次,通过辅因子工程策略,确定了使用高溶氧水平的策略,在47℃较高的发酵温度条件下,工程菌株在12h发酵时间内可以生产63.2g/L乙偶姻,得率达到理论最大得率的94.5%,生产速率为5.32g/(L-h)。如果将发酵时间延长至16h,乙偶姻的浓度可以达到67.6g/L。
  最后,通过在谷氨酸棒杆菌中引入来自枯草芽孢杆菌的2,3-丁二醇合成路线,过表达了来自大肠杆菌的转氢酶,并敲除了主要副产物甘油和乙酸的合成途径编码基因,获得了高产D-(-)-2,3-丁二醇的工程菌株。通过发酵条件优化,在分批补料发酵中生产了60.2g/L的D-(-)-2,3-丁二醇。
[硕士论文] 肖俊川
生物工程 华中农业大学 2017(学位年度)
摘要:磷脂酶A2是指一类能够催化磷脂二碳位酰基水解并生成溶血磷脂和脂肪酸的酶类,磷脂酶不仅在生物体内具有很重要的生理作用,而且在工业、农业饲料、医疗和科学研究等方面都有广泛的应用前景。磷脂经过磷脂酶A2催化水解得到的产物称为酶解磷脂,酶解磷脂中有部分磷脂被切掉上C2位的脂肪酸生成了溶血磷脂,从而使酶解磷脂的HLB值增加并形成更稳定的O/W型乳化剂。此外,酶解磷脂在低pH、高温、高离子浓度等环境下的乳化稳定性也远高于普通磷脂,经过磷脂酶A2改性后的磷脂能够拓宽其在医药、食品、饲料、精细化工等方面的应用范围。
  本研究主要内容包括:⑴培养基使用顺序的优化:在前期培养基优化的基础上,进一步对培养基的使用顺序进行了优化,并在50L发酵罐进行了验证,发现在摇瓶培养时,培养基接种顺序为基本培养基-发酵培养基-发酵培养基时,磷脂酶A2酶活最大,达到1400U/mL。在50L发酵罐发酵时,按此接种顺序进行培养,酶活达3,000U/mL,相对于使用基本培养基,酶活提高了36.4%。⑵对浓缩酶复溶和复溶酶液的保存进行了研究:浓缩酶稀释100倍时已完全复溶,稀释倍数越低,比活越高,随着放置时间延长,酶活损失较小,稀释倍数越大放置越久,酶失活越大。⑶对磷脂及酶解磷脂的乳化能力的测定方法进行探究,初步确定了测定方法:100g乳化体系中,磷脂水溶液50g,磷脂浓度为0.1%,1%甲基蓝染液150uL,一级大豆油50g。置于匀浆机中,搅拌速度为10,000rpm,搅拌时间为1min,然后立即倒80mL乳状液于100mL量筒中,室温静置24h观察记录乳状液体积。⑷对乳化影响因素进行了研究,发现:油水比5:5时乳状液体积最大;在乳状液酸性条件下破乳效果明显,pH为2时,油水已经完全分离;硫酸铵在一定范围内具有促进乳化作用,添加足够多时则促进破乳,氯化钙不仅可以破乳,而且还会促使乳状液转相;高温具有破乳作用油水析出较快,4℃时乳状液体积变化较慢;磷脂经酶解后,溶血磷脂乳化能力能显著提高,然而当加酶足够多时,随着静置时间延长,溶血磷脂会被继续水解生成甘油磷脂酰胆碱而破乳。⑸溶血磷脂的含量越高乳化能力越强,溶血磷脂含量为11.0%时,乳化能力提高了29.7%。当溶血磷脂含量为为18.4时,乳化能力提高了54.0%。
[硕士论文] 林彦徐
工程 华中农业大学 2015(学位年度)
摘要:秸秆是主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的一种木质纤维原料。我国有着丰富的秸秆资源,却得不到高效的利用,很多秸秆被焚烧处理以致污染环境。利用微生物降解转化秸秆资源被认为是一种有效的途径。本文研究了Lactobacillus pentosus FL0421以不同预处理玉米秸秆为底物的乳酸发酵特性以及发酵过程中基因表达差异进行了分析。
  本研究主要内容包括:⑴根据基因组测序数据与各种代谢通路数据库比对,描绘出Lb. pentosus FL0421产生乳酸等产物的代谢图,其中以葡萄糖为底物主要经过糖酵解以及磷酸戊糖途径,以木糖为底物时主要通过异型乳酸发酵产生乳酸。⑵以8%碱处理未水洗玉米秸秆为底物进行的乳酸发酵实验,乳酸终浓度只有33 g/L,同时乙酸浓度也高达32g/L。乳酸转化率为0.42 g/g,平均产酸速率为1.1 g/L/h。水洗碱处理玉米秸秆分批补料同步糖化发酵,总乳酸浓度为92.3g/L,转化率为0.66g/g,平均产酸速率1.92g/L/h;与50g/L未水洗碱处理秸秆乳酸发酵相比,乳酸终浓度提高了约3倍,转化率提高57%。⑵未水洗秸秆发酵与水洗秸秆发酵转录组数据相比,发酵过程受到了明显抑制抑制,葡萄糖进入磷酸戊糖途径中的相关酶基因显著下调,而该途径是为细胞生长提供大量的还原力和碳骨架,同时,参与葡萄糖转化成乳酸的途径的基因转录显著下调,也表明碱处理未水洗秸秆乳酸发酵过程受到强烈抑制主要原因是秸秆预处理过程中的甲酸和多酚等抑制物对乳酸菌的生长和代谢造成抑制。水洗秸秆发酵过程中补料发酵高峰期糖酵解途径中几乎所有的酶的基因表达量都显著上调,木糖异型乳酸发酵过程中的关键基因表达量均上调,表明秸秆碳源分解代谢主要流向乳酸和乙酸;水洗秸秆补料发酵后期,糖酵解途径中大量基因表达量均受到显著抑制作用,乳酸脱氢酶基因表达量也显著降低,表明高浓度的产物(乳酸和乙酸)对代谢途径中相关酶的反馈抑制作用非常显著。
[硕士论文] 黄珊
应用化学 贵州大学 2017(学位年度)
摘要:随着全世界经济的迅猛发展和人口的急剧增长,当今社会对化石能源的依赖性逐渐加强,伴随而来的环境污染问题日益严重,人们急需寻求新式的可替代能源。生物质具有来源广、储量丰富、价格低廉等特点,是地球上唯一可再生的有机碳资源。乳酸是一种极具发展力的化学平台小分子,具有众多优良的性质和广泛的应用前景,研究乳酸的制备对开发利用生物质和缓解能源及环境压力有着十分重要的实践价值。在整个催化糖类转化为乳酸的过程中,Lewis酸位点起着至关重要的作用。鉴于MIL-100(Fe)具有低毒、廉价易得、结构稳定、框架中含有大量L酸位点等特点,本文设计合成MIL-100(Fe)并将其作为催化剂催化糖类转化为乳酸。
  本研究主要内容包括:⑴采用水热法以三种不同的铁源制备MIL-100(Fe),并通过一系列表征方法进行分析,结果表明,以铁粉为铁源制备的材料结晶度高,同时具有微孔和介孔结构(1.9 nm、2.2 nm),且形貌规整,比表面积大(1650 m2/g),热稳定性好(330℃)。其作为催化剂催化糖类生成乳酸具有良好的催化活性,通过单因素优化法探讨了不同反应条件对果糖转化为乳酸的产率的影响(0.05 g果糖,0.05 g MIL-100(Fe),10 mL H2O,190℃反应2 h,乳酸产率32%,催化剂可重复使用4次,经简单的再生处理又可恢复活性),且在最佳反应条件下,对反应底物进行了扩展。通过催化剂活性对比发现,MIL-100(Fe)因具有更多的L酸位点,其催化活性优于其他两种常见的Lewis酸性MOFs材料Cu-BTC和MIL-100(Cr),因此可考虑通过增加材料的L酸量进一步提高催化剂的活性。⑵作为乳酸的重要衍生物之一,乳酸甲酯是一类具有广泛用途的羟基酯类化合物,研究其生产和制备同样具有重要意义。于是,本工作将体系中的反应溶剂换成甲醇,研究MIL-100(Fe)催化果糖转化为乳酸甲酯的催化活性。通过单因素优化法探讨了不同反应条件对果糖转化为乳酸甲酯的产率的影响,最佳反应条件为0.05 g果糖,0.05 g催化剂,10 mL MeOH,180℃,28 h,乳酸甲酯的产率为33%。在最佳反应条件下,对反应底物进行了扩展。⑶通过对MIL-100(Fe)进行酸处理以增加材料的L酸位点数进一步提高催化剂的活性。结果表明,使用三氟乙酸处理的材料均表现较好,在反应温度为150 oC和170 oC时,乳酸产率均有提高,且在190 oC时,虽然乳酸的产率不再提高,但产物的总产率提高了12%,果糖转化率提高了13%,说明经过酸处理后能有效提高MIL-100(Fe)的活性。⑷采用层层自组装的方法制备了具有核壳结构的Fe3O4@MIL-100(Fe)磁性材料,并对其催化活性和稳定性进行了探讨,结果表明,当果糖用量为0.05 g,催化剂0.1 g,H2O10 mL,190℃反应2 h后,乳酸的产率为28%,催化剂可实现简单的分离及重复使用。⑸通过在制备过程中加入铬盐制备含有双金属的MIL-100(Fe-M)催化剂,并考察其催化果糖转化为乳酸的催化活性,结果表明,当果糖用量为0.05 g,催化剂用量为0.05 g,H2O10 mL,反应温度为190℃反应时间为2 h,使用MIL-100(Fe-Cr)催化时,乳酸的产率为30%,催化剂可重复使用4次。
[硕士论文] 杨少龙
发酵工程 齐鲁工业大学 2016(学位年度)
摘要:海藻糖是一种重要的非还原性双糖,该糖在生物体内具有抗干旱、抗高温、抗碱和抗渗透压的作用,并广泛应用于食品、农业和生物技术领域。目前常用发酵法、合成法、酶转化法以及基因工程法来生产制备海藻糖。而酶法生产又是研究的热点之一。
  本研究主要内容包括:⑴古菌来源的某些海藻糖代谢酶类具有耐高温、抗酸碱、提高反应速率等优良性质,具有大规模工业生产海藻糖的研究价值。因此继续发掘、利用其他微生物尤其是古菌来源的海藻糖代谢酶类具有重要意义。在本文中,针对嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain7来源的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)与麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)以及古菌Thermoplasma acidophilum来源的海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(TPP)进行克隆表达研究,以期通过对古菌来源的海藻糖合成关键酶类的研究,为酶法工业生产海藻糖提供理论依据。⑵麦芽寡糖基海藻糖合酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶是TreY/TreZ海藻糖合成途径的关键酶。在本研究中,首先从嗜热古菌S. tokodaii strain7中克隆、表达了麦芽寡糖基海藻糖合酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶,然后进一步对麦芽寡糖基海藻糖合酶的酶学性质进行了研究。酶学性质研究表明,该酶的最适温度为75℃,最适pH为5,并且具有很强的热稳定性和pH稳定性。该酶能够对多种金属离子和有机溶剂具有一定的耐受性。底物特异性研究发现该酶能够利用麦芽糊精和麦芽五糖作底物,而不能利用壳寡糖、麦芽糖、β-环糊精。通过以上酶学性质的研究,说明来源于嗜热古菌S. tokodaii strain7的麦芽寡糖基海藻糖合酶在工业生产海藻糖领域具有一定的应用前景。⑶古菌T.acidophilum来源的海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(taTPP)是TPS/TPP途径中参与海藻糖合成的关键酶之一。从古菌T. acidophilum中克隆、表达纯化了海藻糖-6-磷酸磷酸化酶。酶学性质研究表明该酶最适反应温度为50℃,最适pH为9。该酶的温度稳定性 pH稳定性不强。在金属离子方面,Mg2+对酶的活性有强烈的激活作用,而Mn2+、Co2+能轻微激活酶活性。酶促反应动力学研究表明,在以对硝基苯磷酸(p-nitrophenylphosphate, pNPP)为底物时,酶对底物的Vmax=0.048μmol/min,Km=5.4mM。⑷通过对以上古菌来源的海藻糖合成关键酶类的研究,可以为酶法工业生产海藻糖垫定一定的理论基础。
[硕士论文] 牛全凤
发酵工程 齐鲁工业大学 2017(学位年度)
摘要:透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是通过β-1,3和β-1,4糖苷键,反复交替连接β-D-N-乙酰氨基葡萄糖与β-D-葡萄糖醛酸两种单糖而形成的高分子粘多糖。由于HA独特的理化性质与生理功能,被广泛应用于化妆品、保健品和医学等领域。目前,我国HA市场供不应求,发酵法生产HA具有不受原料资源限制、生产成本低、环境友好、操作简便、便于大规模生产等优点。但发酵法生产 HA仍存在技术难题。因此研究发酵法生产HA工艺十分必要,尤其是HA的下游提取工艺与降解研究是发酵法应用于实际工业化生产中的关键。
  本研究主要内容包括:⑴利用单因素与正交实验,研究培养基组分对HA代谢积累的影响,确定最优培养基组分为:葡萄糖80g/L、酵母粉14g/L、蛋白胨10g/L、酵母蛋白胨8g/L、MgSO41.2g/L。重复实验验证,按照优化后的培养基组分条件,摇瓶发酵得到HA产量为0.91g/L,与优化前相比提高了28.17%。⑵采用5L自控发酵罐进行HA发酵控制参数优化及放大实验,通过单因素实验确定了最优培养条件为:pH值7、接种量10%、温度37℃、搅拌转速300 r/min、通气量2 L/min。结合前期优化的培养基组分条件,利用5 L自控发酵罐,发酵周期16 h,得到HA的产量为8.54 g/L,平均分子量为2.55×106Da。⑶对HA预处理、酶解法及硅藻土后处理技术进行了研究,最终确定了HA最佳提取路线:发酵液中添加氯化钠使其浓度为0.4 mol/L,加入2倍体积的95%乙醇进行沉淀,离心后将沉淀复溶于与发酵液等体积的蒸馏水中。利用三氯乙酸调节溶液pH值至4.5,静置1h后用氢氧化钠回调pH值至7.0。选用胰蛋白酶在pH值8.4,酶解温度50℃,酶用量0.174g/g条件下酶解6 h。利用95%乙醇将溶液稀释1倍后使用1cm厚度的硅藻土预敷层进行真空抽滤。最后再经过乙醇沉淀,采用真空冷冻干燥得到HA成品:HA得率83.86%、葡萄糖醛酸含量43.28%、蛋白质含量0.21%、蛋白去除率98.95%、分子量2.15×106Da。⑷通过对HA热降解、超声降解和氧化降解方法的研究与比较,确定采用超声-氧化联合降解的方法:HA溶液中添加2mmoL/gHA的抗坏血酸,用盐酸溶液调节pH值至4,再加入4mmoL/gHA的过氧化氢后,利用超声破碎仪进行200w超声降解20min。降解得到了低分子量HA,分子量为12.16kDa。
[硕士论文] 高剑锋
生物化学与分子生物学 中南民族大学 2012(学位年度)
摘要:纤维素酶是一类使纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一个酶系的总称,在能源,食品,造纸纺织等领域有重要的应用价值,其市场前景非常广阔。
  本研究从土壤中筛选出13株具有纤维素酶活力的菌株,其中的XW-13菌株具有较高酶活力,其CMC酶活力为62.50U/mL,滤纸酶活力为63.43U/mL。
  对产酶条件进行了单因素实验和正交设计优化实验。研究结果表明:较佳碳源是CMC-Na,较佳氮源是酵母粉。CMC-Na作为底物的条件下,较佳发酵培养基4.5%CMC-Na,5.0%酵母粉,0.5%KH2PO4,0.035%MgSO4。较佳发酵条件为在40℃,pH7.0条件下培养24h,接种量5%。以滤纸为底物条件下测定其酶活力,较佳发酵培养基4.5% CMC-Na,5.0%酵母粉,0.5% KH2PO4,0.035%MgSO4。较佳发酵条件为在40℃,pH7.0条件下培养24h,接种量5%。
  对XW-13菌株产纤维素酶的酶学性质进行初步研究表明:该酶的较适反应pH为7.0,在pH值为5.0-9.0之间有较好的稳定性,酶活力保持60%以上。该酶在温度低于20℃时基本稳定,保温2小时仍有80%以上的活力。在金属离子浓度为0.2mg/mL的条件下,NH4+、Na+、Fe2+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和Li+对酶活力有增进作用,Hg+和Cu2+对酶活力有抑制作用。
[硕士论文] 金晶
食品科学 南京财经大学 2011(学位年度)
摘要:菜籽ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽是指将菜籽蛋白水解成为3-6个氨基酸的小肽,它可以通过抑制ACE的活性来实现降血压作用,相比于合成的ACE抑制剂药物具有安全性高,副作用少,易吸收的特点,是目前国内外生物活性肽研究的热点。利用食品级的枯草芽孢杆菌直接水解菜籽蛋白,可以降低菜籽ACE抑制肽的生产成本,加速菜籽ACE抑制肽的产业化进程。因此,枯草芽孢杆菌生产菜籽ACE抑制肽是一种具有广泛应用前景的方法,此方法在国内外尚未有相关报道。本文进行了以下四方面的研究:液态发酵法制备菜籽ACE抑制肽菌种的筛选;液态发酵的培养基条件优化;液态发酵的发酵条件优化;菜籽ACE抑制肽的分离纯化。研究结果如下:
   ⑴采用枯草芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌,黑曲霉,白地霉,产朊假丝酵母,宇佐美曲霉、雅致放射毛霉对菜籽粕进行液态发酵,以氮溶解指数、SN-TCA,氨基酸态氮、肽得率和ACE抑制活性为评价指标,对液态发酵生产菜籽ACE抑制肽的菌种进行筛选。结果表明:在上述菌种中枯草芽孢杆菌液态发酵所得肽得率最高,并且具有最高的ACE抑制活性,菌种优势明显,是液态发酵菜籽粕生产ACE抑制肽的优势菌种。
   ⑵以菜籽粕为原料,通过枯草芽孢杆菌液态发酵生产菜籽ACE抑制肽。先以肽得率、ACE抑制率为指标通过单因素试验得到液态发酵的培养基条件,再以响应面分析法,优化枯草芽孢杆菌液态发酵培养基中的3种成分,确定枯草芽孢杆菌发酵生产菜籽肽的最佳培养基工艺条件为:磷酸二氢钾0.45%、葡萄糖0.8%、料液比1:23,初始pH7。优化后的ACE抑制率理论值可达69.3%。
   ⑶在培养基条件优化的基础上,对液态发酵的工艺条件进行了进一步的优化。先以肽得率、ACE抑制率为指标通过单因素试验得到液态发酵的发酵条件,再以响应面法分析法,优化了枯草芽孢杆菌液态发酵的工艺条件,确定枯草芽孢杆菌液态发酵生产菜籽ACE抑制肽的最佳发酵工艺条件为发酵时间,发酵温度和接种量,最佳工艺条件分别为20 h、38 ℃和1×108个/mL。优化后的菜籽ACE抑制肽抑制率达到70.95%。
   ⑷将制备得到的菜籽多肽液进行超滤膜分离,凝胶色谱分离,离子交换色谱分离和反向高效液相色谱分离,结果表明:发酵菜籽肽经截留分子量3KD的超滤后,具有较高的ACE抑制性,超滤菜籽肽分别经凝胶过滤色谱分离后,得到5个主要峰,其中R-D(300da)的ACE抑制活性最高,达到73.5%,将R-D使用离子交换色谱分离,得到3个主要峰,其中R-D-B的ACE抑制活性最高,为78.2%,将R-D-B经过反相液相色谱分离后得到纯度较高的ACE抑制肽R-D-B-B,其ACE抑制活性达到88.9%,为较纯肽段。
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