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[硕士论文] 曾虎
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上产量最高的可再生物质,而木质纤维乙醇被认为是理想的生物燃料。尽管木糖在木质纤维素中含量仅次于葡萄糖,但其高效转化为乙醇是目前生物质利用的难题之一。虽然已有工程酵母利用木糖发酵产醇的报道,但有关将转基因酿酒酵母与作物秸秆和酶解发酵工艺相结合的报道比较少见。
  本实验室前期利用遗传工程,已在工业酿酒酵母中超表达外源木糖还原酶,木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶,并获得转基因酿酒酵母SF4和E4菌系。本研究利用优质芒草和小麦秸秆材料和温和预处理酶解技术,分别测定了转基因酿酒酵母SF4和E4菌系利用葡萄糖和木糖共发酵产醇的效率,其主要实验结果如下:
  1.与原始菌株相比,转基因酿酒酵母SF4和E4能利用木糖为单一碳源而正常生长;在葡萄糖木糖混合培养基中,原始菌株与转基因酵母生长情况相似。
  2.利用芒草材料Msi07,比较了1%H2SO4和2%NaOH预处理下产醇效率。其中原始菌株乙醇产率由6.27%(1%H2SO4)提高至8.38%(2%NaOH);转基因酿酒酵母SF4乙醇产率由6.76%提高至8.80%;而转基因酿酒酵母E4乙醇产率由6.29%可提高至9.23%;此外,利用芒草材料Ⅵ-A-3,原始菌株乙醇产率由5.78%提高至8.54%,SF4乙醇产率由5.87%提高至9.26%,E4乙醇产率由5.96%提高至9.36%。
  3.利用4%NaOH预处理芒草材料(Ⅶ-C-14)并酶解产糖发酵,转基因酵母E4比原始菌株乙醇产率提高25.69%。
  4.1%NaOH预处理汽爆芒草和小麦材料,转基因酵母E4在芒草的最高乙醇产率为20.61%,转基因酵母SF4在小麦的最高乙醇产率为20.32%,分别创历史记录新高。
[硕士论文] 肖陈
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:本文以含11wt%的α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-La)和52wt%的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)的乳清浓缩蛋白(whey protein concentrate,WPC100)为原料,采用选择性沉淀法,以α-La分离效果作为研究目标,通过单因素试验法,分别对提出的蛋白分离流程各单元(预分离、粗分离和纯化)的分离温度、溶液pH值、处理时间以及其他影响因素进行了考查,在较优工艺参数下,α-La制备品纯度为96wt%,α-La总收率达到78%,其理化性质满足婴儿配方奶粉要求。
  建立反相高效液相色谱测定α-La和β-Lg定量分析方法。选用C8色谱柱,柱温约为25℃;流动相A和B分别为0.1%三氟乙酸(TFA)溶液和0.1%TFA-乙腈溶液;流速为1.0mL/min;检测波长为215nm;进样量为20μL;采用梯度洗脱时,α-La保留时间和峰面积标准方差分别为0.02%和0.2%,β-Lg的分别为0.2%和0.1%,说明该测试方法重复性和精确性均较好。
  在预分离过程中,利用等电点沉淀原理,选择柠檬酸钠为螯合剂,考察了以醋酸、柠檬酸和磷酸作为pH调节剂时α-La的沉淀效果,结果表明柠檬酸分离效果最好。在柠檬酸钠浓度为0.1mol/L,pH为3.9,45℃下沉淀1h,获得含β-Lg的α-La粗产品中α-La收率可达91%。
  在粗分离过程中,利用盐析原理考察了NaCl浓度、温度、时间、固液比和盐洗次数对β-Lg萃取率的影响。发现,在45℃下,当选用7wt%NaCl溶液并以1∶5的固液比清洗粗产品两次且每次60min时,可除去89%的β-Lg,α-La损失率最小。
  在纯化单元,利用复溶法对α-La进行提纯。考察了CaCl2浓度、pH、温度、时间和固液比对α-La复溶率影响,结果显示,pH为7.5时,用0.2mol/L CaCl2溶液以1∶3的固液比在50℃下搅拌90min复溶效果较优,α-La复溶率达88%。
  采用多种先进测试设备对α-La制品进行质量检测,发现本研究分离得到的α-La制备品满足婴儿配方奶粉添加剂要求。圆二色谱和红外光谱鉴定结果表明,α-La制备品未发生变性;DSC结果显示α-La制备品变性温度约为67.5℃,表现为制品较好的热稳定性;SDS-PAGE测试结果显示α-La为单一条带,液相色谱测得其纯度为96wt%;ICP测得α-La制备品中Ca2+和Na+含量分别为5.74mg/100gα-La和40mg/100gα-La,复合婴儿奶粉添加剂要求;紫外光谱测试表明α-La制备品中色氨酸含量较高,具有高营养价值的优点。
[硕士论文] 张艳丽
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC1.1.3.4,GOD)是一种需氧脱氢酶,在有氧条件下,能够以分子氧为电子受体,将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛用于食品及饲料添加剂、防腐剂、生物传感器及葡萄糖酸生产等。但目前商品GOD产量低且热稳定性差,限制了GOD大规模的工业应用。
  本研究从重组表达Penicillium notatum F4葡萄糖氧化酶基因godp的毕赤酵母菌株PP-GOD出发,利用基因工程手段对重组GOD毕赤酵母菌株进行改良,提高其分泌表达GOD的能力;另一方面,利用计算机辅助理性设计对GOD蛋白进行分子改良,以提高其热稳定性。主要研究结果如下:
  1.在重组GOD毕赤酵母菌株中,共表达来源于Pichia pastoris的SEC61复合体编码基因SEC61、未折叠蛋白响应机制(UPR)转录激活因子Hac1p的编码基因HAC1以及来源于Saccharomycescerevisiae的折叠酶PDI、ERO1基因,研究各种辅助因子对GOD分泌表达的影响。结果表明,共表达SEC61对GOD表达影响最为显著,培养基中GOD活力为原始菌株PP-GOD的3.24倍。共表达PDI、ERO1均有助于提高GOD的表达量,培养基中GOD活力分别为原始菌株PP-GOD的1.95倍和1.32倍。共表达HAC1也有效提高了GOD的表达量,培养基中GOD活力为原始菌株PP-GOD的1.38倍。
  2.通过同源建模和分子动力学模拟构建了P.notatum F4来源GODp的蛋白三维结构模型,从稳定蛋白质结构入手理性选择9个氨基酸位点,以期提高蛋白热稳定性。对选定的9个突变位点构建毕赤酵母饱和突变体库。筛选结果表明,其中7个突变体D408W、D408T、D408K、D408C、E476T、E476K和S100A的热稳定性得到提高。其中S100A和D408W的热稳定性有明显的提高,相比野生型,两个突变体在55℃的半衰期分别提高了5.13倍和4.41倍,Tm值分别提高了4.4℃和1.2℃。
  本研究从葡萄糖氧化酶应用领域最突出的问题入手,提高了葡萄糖氧化酶的热稳定性和分泌表达效率,进而有效降低了酶制剂的生产和使用成本,这种新型葡萄糖氧化酶制剂将进一步扩大该酶在食品以及饲料行业的应用,具有良好的理论和实际应用前景。
[硕士论文] 李函彤
食品加工与安全 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:葡萄糖耐量因子(GTF)作为酵母富集Cr(Ⅲ)生成的产物,可以增强胰岛素的功能,促进糖、脂代谢,逆转葡萄糖耐受不良,提高糖耐量;保护胰岛素β细胞,并且增加胰岛素受体数量,提高亲和力等功能。由于酵母铬具有产量大,安全性高等优点而备受国内外科学家关注。但是,酵母富集Cr(Ⅲ)的机理却一直未被阐明。因此,本文以本实验室保藏的高产GTF酵母菌株YSI-37为研究对象,从酵母中铬的分布、酵母表面基团对酵母富铬的影响、酵母富铬过程中基因的表达以及酵母细胞生理过程中氧化应激指标的变化等方面进行了探究。在一定程度上阐明酵母富集Cr(Ⅲ)形成GTF机理,为GTF的工业化生产提供理论基础。主要结论如下:
  1.Cr3+浓度为500μg/mL时,YSI-37酵母细胞吸附的总铬(1803.87μg/g dcw)和有机铬(113391μg/g dcw)含量最高。通过EDTA螯合洗脱和酶解洗脱对酵母细胞组分进行分离,印证分析了铬在不同细胞部位的分布。细胞壁上富集的铬基本为无机铬,占菌体富集总铬的1443%;原生质体中的铬占酵母富集总铬的8557%,其中7329%主要为有机铬。利用EDS能谱扫描及TOF-SIMS对酵母菌体进行横截面和深度剖析铬含量的分析表明铬在酵母细胞中呈均匀分布。
  2.对酵母细胞表面不同基团(氨基、羧基、磷酸基、酯基)分别进行化学屏蔽,结果表明酵母表面氨基、羧基和磷酸基团对酵母富铬量有较大影响。红外光谱分析结果也印证了上述结果。
  3.利用转录组学分析技术对空白酵母和富铬酵母菌体进行分析,分析RNA-Seq测序结果表明,空白组酵母和500μg/mL Cr3+培养的富铬酵母中共鉴定出共鉴定5987个基因,其中5796个基因在两组酵母中均被检测出来,2333个具有显著差异表达的基因。其中,有1273个基因表达上调,1060个基因下调。根据KEGG数据库进行注释归类,98条代谢途径发生了改变,其中对核糖体代谢、硫代谢、氧化压力代谢相关、碳代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢等途径影响最大。根据GO数据库注释归类,分别为生物途径(778条途径)、细胞组分(173条途径)、分子功能(594条途径)三类;其中表达差异比较显著的基因主要有GSH2,SPE4,MET16,CYC1,MSN4等。
  4.铬浓度升高导致酵母细胞膜脂过氧化程度加重。在较低浓度(0~500μg/mL)的Cr3+作用下,酵母通过增加总抗氧化能力(T-AOC),还原型谷胱甘肽(GSH)、巯基含量和谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)活力等防御Cr3+的氧化胁迫。而细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)活力在此过程中变化不明显。1mmol/L Na2SO3可增加酵母细胞巯基、GSH、T-AOC含量,从而缓解铬对于酵母的胁迫作用,提高酵母的生物量和酵母细胞中有机铬和总铬的含量。
[硕士论文] 吴俊
化学工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:氨基酸是一种含氨基和羧基的有机化合物,在食品、畜牧业、农业和医疗健康等领域均有广泛应用,目前工业上生产氨基酸最主要的方法是微生物发酵法。氨基酸发酵液的成分一般比较复杂,要得到清洁的氨基酸需要对发酵液进行分离纯化,本文主要研究电渗析技术对苏氨酸发酵液进行脱盐。我们使用不同的操作电压,变化不同的膜类型,改变发酵液初始的料液浓度和pH值,并结合离子交换过程,对经过预处理的苏氨酸发酵液进行脱盐过程的研究。在直流电场作用下,发酵液中的阴阳离子发生迁移,而氨基酸因其独特的性质,仍保留在发酵液中。电渗析法不仅可以得到较高的脱盐率,而且脱盐速度较快,可满足工业过程对效率和速度的需求。全文共由五个部分组成,各部分内容如下:
  第一章为绪论部分,简要介绍了苏氨酸在现今诸多领域的应用。苏氨酸的生产方法主要是微生物发酵法,这一方法使得发酵液成分复杂,为得到纯度高的苏氨酸产品需要进行脱盐处理。介绍了目前发酵液的几种处理方法,并对每种过程的原理和目前的应用领域等进行了详细论述,同时对苏氨酸发酵液脱盐的可行性进行了讨论。
  第二章利用电渗析(ED)来脱除苏氨酸发酵液中的无机盐离子。发酵液成分复杂,在ED脱盐前需经过微滤和活性炭脱色进行预处理,脱除86.8%的蛋白质和88.6%色素。预处理后的发酵液进行ED实验,考察了工作电压、离子交换膜类型、初始发酵液pH和浓度等因素对ED结果的影响,同时对膜污染进行了研究。将实验室自制的有机-无机杂化膜CEM-412和AM-QP-3装入ED膜堆,当工作电压从10V增至50V,脱盐时间缩短,水渗透现象更明显,过程能耗也增大,苏氨酸回收率降低。对不同类型膜的研究则表明,30V恒压运行下,杂化膜可以获得比商业膜更短的脱盐时间(132min)和更低的过程能耗(2.996kWh/kg),这与杂化膜含有亲水性的PVA-OH基团有关。
  第三章是利用离子交换法(Ⅸ)对发酵液中硫酸盐进行吸附,使用的是经过顸处理的大孔聚苯乙烯氯型阴离子交换树脂。结果表明,随着吸附时间延长,该树脂对发酵液SO42-吸附容量先快速上升,后达到吸附饱和趋于平缓;树脂使用量为1.0g时更适合SO42-脱除;随着发酵液初始SO42-含量升高(280-1100mg/L),平衡吸附量逐渐增大(12.44-32.72mg/g),SO42-吸附率下降(88.92%-58.95%)。
  离子交换树脂吸附SO42-的过程符合准二级动力学模型,该树脂吸附SO42-的过程是以化学吸附作用为主。对SO42-的等温吸附过程符合Freundlich吸附等温模型,树脂对硫酸盐的吸附脱附过程可自发进行。从氯型树腊吸附硫酸盐前后的红外谱图中可以看出,吸附后树脂中-N+(CH3)3Cl-的N-C1键吸收峰明显减弱,树脂与发酵液中的SO42-完成了离子交换过程。
  第四章是利用电去离子技术(EDI)处理苏氨酸发酵液,即将电渗析和离子交换耦合过程,以进一步优化实验条件,并解决单独ED过程存在的不足。结果表明,ED膜堆中加入Na、Cl型和H、OH型离子交换树脂,可以明显提高整体膜堆的导电性能,这也降低了ED过程中产生极化现象的可能性,比单纯ED过程的脱盐时间更短,脱盐效率更高。同时,改变Na、Cl型和H、OH型离子交换树脂的用量时,发现脱盐效率与树脂用量成正比。改变加入淡室中离子交换树脂的类型时,使用5mLNa型和5mL Cl型树脂能够得到最优化的脱盐时间(123min)和水回收率(85.12%)。可见,电去离子技术应用于苏氨酸发酵液的脱盐有良好的效果,并且稳定性优越。
  第五章为全文的总结。综合各章的研究,ED、IX和EDI技术对苏氨酸发酵液脱盐具有可行性,实验室的研究取得了很好的分离效果,可以为发酵液的工业生产和苏氨酸产品进一步的提纯提供理论的指导。
[硕士论文] 单小娥
环境工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文以新鲜巢湖水华蓝藻和钝顶螺旋藻为对比研究对象,以别藻蓝蛋白(APC)的纯度和回收率为指标,研究对比了不同盐析方式对两种藻中别藻蓝蛋白的提纯效果和最优条件,试验探索了羟基磷灰石(HA)柱层析法提纯别藻蓝蛋白的条件,探索了常见因素对别藻蓝蛋白稳定性的影响,并运用紫外-可见吸收光谱法,分析了试剂级别藻蓝蛋白提取纯化工艺组合的纯化机理。具体研究内容与结果有:
  (1)粗提纯条件的优化实验。分别研究单步高浓度盐析、分段两步盐析对巢湖蓝藻、钝顶螺旋藻中别藻蓝蛋白的纯化效果,探索不同硫酸铵浓度对提取纯化别藻蓝蛋白的影响。结果表明:分段两步盐析比单步高浓度盐析的纯化效果更好,螺旋藻的最佳硫酸铵浓度为1.6mol/L、2.2mol/L,纯度由0.34提升至1.24,巢湖蓝藻的最佳硫酸铵浓度为1.4mol/L、2.0mol/L,纯度由0.15上升至0.85。
  (2)柱层析条件的优化实验。通过纯度比较及光谱分析,研究羟基磷灰石柱层析在不同淋洗梯度条件对别藻蓝蛋白洗脱效果的影响,并采用优选出的最佳方案应用于螺旋藻和巢湖蓝藻中别藻蓝蛋白的分离提纯。结果表明:选择50、100、200mmol/L的浓度梯度对APC洗脱为最佳。经分段两步盐析联合HA柱层析的工艺后,螺旋藻纯度最高达5.52,回收率3.85%,巢湖蓝藻纯度最高达4.19,回收率11.52%,都达到试剂级的要求。
  (3)紫外-可见光谱分析。采用紫外-可见吸收光谱法对各工艺阶段的样品溶液扫描形成光谱扫描图。结果表明:一步低浓度盐析可以去除少量粗提时未完全去除的细胞壁残渣、少量核酸类、维生素类等物质,二步高浓度盐析通过沉淀方式去除了大量的核酸、维生素类物质,羟基磷灰石柱层析的主要作用在于将别藻蓝蛋白和藻蓝蛋白分离开,先出组分为藻蓝蛋白,后出组分为别藻蓝蛋白。经分段两步盐析联合羟基磷灰石柱层析的纯化工艺后,在紫外区的吸收谱带中,最大吸收峰逐渐红移至280nm,在可见光区最大吸收峰逐渐红移至650nm,别藻蓝蛋白纯度逐步上升。
  (4)别藻蓝蛋白稳定性的实验研究。考察了光照、时间、环境温度及酸碱度对别藻蓝蛋白稳定性的影响。结果表明:别藻蓝蛋白在避光、30℃以下、pH为中性条件下保持稳定,超出此范围其稳定性下降。
[硕士论文] 苏雨
环境工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,巢湖水体富营养化仍然严重,蓝藻时有爆发,如何将水华爆发产生的蓝藻资源化利用是一个重要课题。因为蓝藻本身含有很多有用物质,如叶绿素,类胡萝卜素、胞外多糖和藻蛋白等物质。从蓝藻中提取藻蛋白尤其是藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白是研究热点,因为很多研究表明藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白抗氧化、抗炎性、抗癌性、抗衰老性、抑菌、增强机体免疫力、免疫荧光性等生理活性,并且被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。因此,本论文以巢湖蓝藻为材料,首先通过优化二步盐析法提取得到藻蓝液体,然后优化柱层析法条件纯化获得高纯度的藻胆蛋白。主要研究内容摘要如下:
  1.两步盐析结合凝胶层析提取与纯化藻蓝蛋白。针对凝胶柱层析填料的类型、洗脱液的种类、洗脱液pH、加样流速等条件分别作了探究,经实验研究,最优条件为:洗脱液为磷酸盐洗脱液、洗脱液的pH为7.0和流速为1.5cm/min。
  2.两步盐析结合离子交换层析提取与纯化藻蓝蛋白。针对离子交换柱层析填料的类型、洗脱液pH、加样浓度、加样速度、洗脱液中盐浓度等条件分别作了探究,经实验研究,最优条件为:选取填料为纤维素A-500、洗脱液pH为7.0、加样浓度为1-2mg/L、加样速度为2cm/mm和洗脱液NaCl浓度为0.25mol/L。
  3.两步盐析结合亲和层析提取与纯化藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。针对亲和柱层析填料的类型、洗脱液pH、加样浓度、加样速度、洗脱液的浓度分别作了探究,经实验研究,最优条件为:选取的填料为羟基磷灰石,洗脱液pH为6.5、加样浓度为1.6-2.0mg/L、加样速度为2cm/mm和洗脱液PBS浓度为40mmol/L和60mol/L。
[硕士论文] 张晓萌
环境工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来从蓝藻中提取蛋白质、氨基酸和天然色素等己成为生物学、食品工程学、生命保健学等学科研究和开发的一个热点。由蓝藻细胞中提取的藻蓝蛋白运用十分广泛,它可作为荧光分子探针,也可作为食物和化妆品的营养成分和天然色素等。本研究以巢湖新鲜蓝藻藻泥为原料,通过冻融破壁的方法破碎藻细胞,获得藻蓝蛋白粗提液,然后用粉末活性炭吸附法粗提藻蓝蛋白,并在此基础上分别通过羟基磷灰石柱层析法和超滤法纯化藻蓝蛋白,以优化高纯度藻蓝蛋白的提取纯化工艺组合。
  在粉末活性炭吸附法粗提藻蓝蛋白的试验研究中,首先对适合用于藻蓝蛋白纯化的粉末活性炭进行了种类、粒径的筛选,接着对粉末活性炭的粒径、添加量、PC浓度、吸附时间等条件进行了研究,最终确定了粉末活性炭吸附法粗提藻蓝蛋白的最佳处理条件,即煤质粉末活性炭,400~500目,藻蓝蛋白浓度1.0mg/mL,添加量100g/L,吸附时间15mm。
  在超滤法纯化藻蓝蛋白的试验研究中,以粉末活性炭吸附法处理后的藻蓝蛋白溶液为原料,研究了不同截留分子量对藻蓝蛋白的纯化效果,接着对PC浓度、离心时间、离心转速等条件进行了研究,最终确定了超滤法提纯藻蓝蛋白的最佳条件,即截留分子量为10KDa、藻蓝蛋白浓度为045mg/mL、离心转速为4000g、离心时间为30mm。藻蓝蛋白的纯度可达到医药级标准(A620/A280>3.0)。
  在柱层析法纯化藻蓝蛋白的试验研究中,以粉末活性炭吸附法处理后的藻蓝蛋白溶液为原料,利用羟基磷灰石柱层析法纯化藻蓝蛋白,优选了洗脱液pH、洗脱液浓度作为单因素试验的因素,最终确定了羟基磷灰石柱层析法提纯藻蓝蛋白的最佳条件,即洗脱液pH值为7.0,洗脱液浓度为25mmol/L。藻蓝蛋白纯度可达到试剂级标准(A620/A280≥40)。
[硕士论文] 刘言炜
环境工程 合肥工业大学 2018(学位年度)
摘要:对巢湖中打捞上来的新鲜蓝藻实现高附加值利用是巢湖水华蓝藻资源化利用研究的热点。巢湖水华蓝藻中一般含有20%以上的多糖成分,多糖是一类具有生理生化活性的大分子物质,且具有抗肿瘤、抗炎症、提高机体免疫力和降低血糖等生物活性,在食品、医药等行业应用较广。研究巢湖水华蓝藻多糖的提取方法与基本性质,既可对多糖的深度研究奠定基础同时也实现了水华蓝藻的无害化与资源化,具有双重的意义。
  本文研究了巢湖蓝藻粗多糖的提取方法及条件优化、粗多糖的纯化方法及条件优化和多糖的基本应用性质。通过单因素试验和响应面分析研究并优化了超声波辅助冻融法提取多糖;比较选择出了最优脱蛋白方法为三氯乙酸(TCA)+酶法;通过单因素试验与响应面分析研究并优化了最佳脱蛋白条件;并比较选择出了最优脱色素方法为过氧化氢法;通过单因素试验与响应面分析研究并优化了最佳脱色条件;通过透析去除小分子杂质,冷冻干燥获得蓝藻多糖样品,对样品进行了部分理化性质分析并研究了其溶解性、稳定性及体外抗氧化活性。主要结果如下:
  采用超声波辅助冻融法提取巢湖蓝藻粗多糖的最佳条件为:超声波功率480W、超声温度65℃、液料比25∶1,。在此提取条件下,粗多糖提取率为6.168%,与预测值较为接近,优化效果明显。粗多糖提取率相对于普通冻融提取法提高43.44%。
  采用TCA+酶法来对粗多糖进行脱蛋白处理的的最佳条件为:酶浓度1.5%、TCA用量1倍、TCA浓度7%、脱蛋白次数2次,此时综合得分为87.96,去蛋白效果及多糖保留情况均良好。
  采用过氧化氢法来对粗多糖进行脱色的最佳条件为:过氧化氢用量19.5%、脱色时间2h、脱色温度51℃,此时综合得分为84.21,去色素效果及多糖保留情况均良好。
  制备得到的蓝藻多糖溶于水,不溶于乙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂,不含蛋白质;溶解性受温度影响较大,酸性条件促进蓝藻多糖溶解,碱性条件不利于蓝藻多糖溶解;蓝藻多糖在低温条件下较稳定,在较高温度可能有部分分解或转化,光照对蓝藻多糖的稳定性有一定的影响;蓝藻多糖在pH6-8较稳定,而在强酸、强碱溶液中不稳定;Al3+、Zn2+、Fe3+、Cu2+这四种金属离子能影响巢湖蓝藻多糖的稳定性。蓝藻多糖具有一定的还原力并且对·OH、DPPH·、O2-·这三种自由基均有一定的清除效果。
[博士论文] 杨鹏
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,NeuAc)及其衍生物参与许多生理和病理过程,在食品、药品和保健品行业都有极大的应用潜力。传统的天然产物提取法过程繁琐、效率低下,难以满足市场需求。现阶段,酶法合成和全细胞生物催化是生产NeuAc的主要途径。但这两种方法都需要添加丙酮酸和GlcNAc作为前体物,价格比较昂贵。
  利用葡萄糖或其它廉价碳源直接发酵生产NeuAc十分具有吸引力,因为该过程可以一步合成NeuAc而不需要添加任何直接前体物。前期实验中,在大肠杆菌中构建了一条葡萄糖起始的NeuAc合成途径(DN5/pNnsGM)。菌株发酵时中间产物GlcNAc大量积累,ManNAc和丙酮酸也有一定量积累。通过在发酵过程中外源添加丙酮酸,NeuAc产量提高了104.6%,这说明相对于ManNAc来说,丙酮酸是不足的。于是本论文在一株实验室已有的丙酮酸高产菌株中表达了NeuAc合成途径,但未能实现NeuAc积累;本论文尝试在DN5中过表达glk增加丙酮酸供给,结果影响不大。
  接下来,本论文以大肠杆菌K1来源的NeuAc合酶neuB替换掉pNnsGM中的nanA,希望通过最后一步反应的单向性增加产物合成。DN5/pB发酵积累1.75g/L NeuAc,较DN5/pNnsGM提高了1.55倍,中间产物GlcNAc和ManNAc浓度提高了一倍多,而丙酮酸的浓度降低。为降低乙酸积累,本论文在DN5基础上敲除了磷酸乙酰转移酶基因pta得到DN6菌株,发酵DN6/pB时,乙酸积累由4.62g/L减少到1.55g/L。
  为提高细胞内PEP的水平,本论文在DN6基础上敲除了葡萄糖专一性的磷酸转移酶系统中膜整合蛋白ⅡCBGlc编码基因(ptsG)构建了DN7菌株以阻断PTS系统,减少PEP消耗。DN7/pB发酵48h积累1.48g/L NeuAc,较DN5/pB缓慢;中间产物ManNAc浓度稍高(2.63vs.1.17g/L),没有检测到丙酮酸。
  随后本论文敲除了编码PEP羧化酶的ppc基因,得到重组菌株DN8。DN8/pB发酵70h积累2.0g/L NeuAc,葡萄糖消耗速率仅为0.26g/L/h,生物量积累明显受到影响。这可能是因为ppc编码的PEP羧化酶是大肠杆菌C4回补途径的重要一环,它不可逆地催化PEP与二氧化碳反应生成草酰乙酸,回补TCA循环。因此该基因的缺失一定程度上影响了菌体生理,使得糖耗减慢。
  本论文在1L罐上对DN8/pB进行了发酵优化,最终在37℃、高溶氧条件下(4vvm),发酵52h积累NeuAc4.15g/L。但在5L罐发酵时菌株生长很差、产量很低,说明发酵条件需要进一步优化。
  微生物利用简单底物生产小分子化合物的能力是十分惊人的,但是由于生理代谢的复杂性,理性改造常常收效甚微。从这个意义上,随机突变加高通量筛选策略有其独特优势。但是,突变体的表征却成为新的限制性因素,因为合成的大多数小分子不会赋予生产菌株易于筛选的表型。生物传感器的应用在很大程度上解决了这一问题。它们能够感应胞内代谢物的浓度变化,并通过报告基因以荧光、酶活或者偶联细胞生长的方式起到高通量筛选的作用,对微生物代谢途径改造和菌株进化研究意义重大。2013年,Cho等人利用SELEX方法筛选到了NeuAc特异性的RNA适配子,为NeuAc生物传感器的开发奠定了基础。
  通过将该适配体酶与组成型强启动子PJ23106、缓冲序列、报告基因相连,本论文构建了NeuAc特异性的RNA传感器。当胞内NeuAc结合在RNA适配子之后引起整个开关的构象变化,导致锤头型核酶发生自剪切,产生一个缺口,暴露出新的5’羟基并在大肠杆菌内源RNase J1核酸酶的作用下,由5’→3’方向对mRNA进行剪切,从而降低下游报告基因的丰度。
  以sfgfp为报告基因时,12mM的外源NeuAc造成高达11.8倍的荧光抑制,证明外源添加NeuAc的量可以与报告基因gfp的表达偶联。之后本论文用tetA代替gfp建立了基于Ni2+的高通量筛选系统。TetA编码一个四环素/H+转运蛋白并且可以用作双向筛选标记。TetA的表达赋予细胞四环素抗性,同时使细胞对毒性金属离子如NiCl2更敏感。细胞内NeuAc浓度的增加将激活适配体酶的自剪切进而降低TetA的表达,减少Ni2+的泵入,因此具有更高胞内NeuAc浓度的细胞在NiCl2条件下更具有生长优势。
  为了使培养基的干扰最小化,本论文采用了成分较为简单的M9B基本培养基。在预实验中,本论文确定了该培养基中Ni2+的最佳筛选浓度为50μM,在该浓度下,TetA过表达造成的生长抑制最明显。在0-86.4±5.1mg/g cdw胞内NeuAc范围内,50μM Ni2+条件下,细菌生长与胞内NeuAc浓度成正比。本论文还发现,构建的NeuAc传感器在乳酸菌中同样有活性,在0-25.6mM外源NeuAc范围内,传感器工作良好,这也说明在不同的物种间核酶的工作机制十分相似,暗示基于RNA的传感器可能具有更好的种间适应性。
  随后本论文进行了模拟筛选以验证筛选系统的可用性。本论文构建了NeuAc高产菌株DN5/pB与原始菌株DN5/pNnsGM(1∶100)混合的模型文库。在筛选压力下,仅通过一轮筛选,DN5/pB富集超过16倍,证明了该系统可以用于菌株进化。本论文尝试在质粒pB的基础上通过优化NeuAc合成途径中四个基因的表达来提高NeuAc生产。本论文设计了两种RBS文库,分别包含497,664和65,536种突变体,经过初步表征,来自文库一的菌株积累NeuAc能力更强,所以在接下来的实验中采用了文库一。
  将文库在筛选培养基中培养,当细胞达到指数后期时,将培养物按1%转接到新鲜的筛选培养基中。在三次连续传代(称为一个富集循环)后,提取质粒并重新转化新鲜亲本菌株以防止细胞产生对镍离子的适应性突变。通过3轮筛选进化,富集到3个高产质粒p1e、p2、p3e,富集率超过40%。富集质粒中,neuB、slr1975、GNA1三个基因的表达强度较pB高(除了p2e-GNA1),但glmS强度较低。其中产量最高的DN5/p2e较原始菌株NeuAc产量提高了34%,达到2.12g/L。在此基础上本论文对NeuAc合酶NeuB进行了随机突变,经过4轮筛选进化,富集了B1、B3两个突变体,富集率分别为56.5%和45%。DN5/pB1产量为2.24g/L,DN5/pB3产量为2.61g/L(相比DN5/p2e提高了23%)。本论文将NeuB突变体进行了蛋白表达纯化并对其酶活进行了测定,B3较野生型提高了27%,B1较野生型提高了9.4%。
  为探究单个氨基酸突变及组合的氨基酸突变对酶活及NeuAc生产的影响,本论文构建了C1,C2和C3突变体。但遗憾的是,未能进一步提高NeuAc产量。为衡量DN5/pB3生产NeuAc的能力,本论文采用无机盐培养基进行了双阶段发酵。在该策略中,要求产物生产与细胞生长不存在偶联。第一阶段是生物量积累阶段,第二阶段是将积累的细胞重悬到适当的缓冲液中进行产物生产。经44h发酵,菌株积累8.31g/L NeuAc。副产物方面,丙酮酸和GlcNAc积累量较多,其余如ManNAc、甲酸、乙酸、乙醇较少。通过对发酵初始生物量的优化,NeuAc产量进一步提高到12.52g/L。
  本论文采用不可逆的NeuAc合酶进行葡萄糖起始的NeuAc发酵生产,并对宿主菌进行了相应的积累PEP的改造,一定程度上提高了NeuAc的产量和产率。通过偶联细胞生长的NeuAc高产菌株高通量筛选系统的建立,本论文利用随机突变对NeuAc生产途径进行了表达强度优化并对关键酶NeuAc合酶进行了突变筛选,进一步提高了菌株的生产能力。该筛选系统还可以应用于NeuAc途径其它酶的筛选,同时也为其它RNA传感器的构建和应用提供了思路。
[博士论文] 王心凝
微生物学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:木质纤维素是地球上储量丰富的可再生资源,以其为原料的生物炼制技术成为近年来的研究热点。木质纤维素原料需要经过预处理以获得可发酵的糖类,而预处理环节不可避免地产生对微生物生长不利的抑制物,主要有有机弱酸、呋喃醛类和酚类化合物。因此,提高微生物的耐受性是木质纤维素生物炼制技术的瓶颈问题之一。存在于木质纤维素水解液中的酚类化合物种类繁多,对微生物的危害也强于其他两类抑制物,且相关研究较少。香草醛是木质纤维素水解液中的一种主要酚类化合物。
  酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统乙醇生产菌,具有良好的生产性能,广泛用于生物炼制底盘细胞改造,以生产第二代燃料乙醇及其他生物基化学品。本实验室前期工作对一株发酵性能良好的二倍体工业菌株NAN-27进行EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理,得到一株木质纤维素水解液耐受性有所提高的菌株EM-13,继而对其在木质纤维素水解液中进行长期适应性驯化后,得到了一株香草醛高耐受性菌株EMV-8,且该菌株具有较高的还原香草醛为低毒性的香草醇的能力。进一步对EMV-8和NAN-27进行了转录组差异表达分析。基于此,本研究通过转录组学和基因组学技术,发掘EMV-8中香草醛耐受性相关元件(基因)。
  本文主要研究进展:
  1.介导香草醛高耐受性氧化还原酶的鉴定与机制研究
  酿酒酵母菌株自身能够通过内源氧化还原酶将香草醛还原成低毒的香草醇,这一能力与菌株的香草醛耐受性密切相关。有报道称醇脱氢酶Adh6p参与酿酒酵母中香草醛的还原,但与出发菌株NAN-27相比,EMV-8中ADH6转录水平没有明显变化。因此,本文的第一项工作是分析鉴定在EMV-8中与香草醛还原过程相关的氧化还原酶。我们首先聚焦的是在EMV-8中转录水平上调2倍以上的67个氧化还原酶基因(与NAN-27相比),结合对这些基因的功能解读,确定16个备选基因,连同ADH6一起进行后续研究。由于二倍体工业酵母的基因操作较不便,我们在易于基因操作且发酵性能良好的单倍体实验室菌株CEN.PK102-3A中超表达备选基因。在香草醛胁迫下,对超表达氧化还原酶的重组菌株进行摇瓶发酵,结果显示,其中5个基因对酿酒酵母的香草醛高耐受性有积极作用,即:ADH6——醇脱氢酶Adh6p基因,ALD6——乙醛脱氢酶Ald6p基因,ZWF1—葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf1p基因,以及只有系统名的YNL134C——ALD6、YNL134C和YJR096W促进酿酒酵母最大比生长速率分别提高了177%、25%、15%和18%。而超表达ADH6和ZWF1,使酿酒酵母的香草醛比消耗速率分别提高了800%和26%。
  进一步测定上述5个氧化还原酶的粗酶液以香草醛为底物的还原酶活性。结果显示,与只表达空载体的对照菌株相比,Adh6p以NADPH为辅酶的香草醛还原酶活性提高了350%,YNL134C编码的还原酶以NADH为辅酶的香草醛还原酶活性提高了153%,YJR096W编码的还原酶以NADPH和NADH为辅酶的香草醛还原酶活性分别提高了69%和45%。进一步分析超表达这5个氧化还原酶对细胞内还原型/氧化型辅酶比例的影响,结果显示,超表达ALD6或ZWF1分别使细胞内的NADPH/NADP+的比例提高了96%和55%,而超表达其他基因没有改变辅酶还原型/氧化型的比例。
  该研究结果丰富了提高酿酒酵母香草醛耐受性的氧化还原酶,并解析了这些氧化还原酶对香草醛的可能解毒机制:Adh6p及YJR096W和YNL134C编码的还原酶直接还原香草醛;Ald6p和Zwflp提供更多的还原型辅酶(主要是NADPH)。
  2.香草醛高耐受性菌株EMV-8的基因组突变研究
  本文进一步对亲本菌株NAN-27、过渡菌株EM-13和香草醛高耐受性菌株EMV-8进行基因组测序,以挖掘EMV-8中香草醛耐受性相关的DNA突变。突变发生可以发生在编码区和非编码区,本文主要关注编码区的突变。EM-13和EMV-8的编码区序列分别与出发菌株NAN-27编码区序列进行对比,进一步排除两株菌株共同突变的基因,得到仅在EMV-8中发生的突变基因:275个非同义SNP(单核苷酸多态性)突变基因和11个InDel(插入或缺失)突变的基因。鉴于只有EMV-8的香草醛耐受性显著提高,因而我们主要关注这些只在EMV-8中发生突变的基因。为排除基因组测序的误差,对突变位点进行PCR及Sanger测序验证,在已验证的59个非同义SNP突变的基因中,有14个基因被证实发生突变。11个InDel突变基因中,有7个基因被证实发生InDel突变。对非同义SNP突变的基因验证工作还在进行中,因此本文主要对InDel突变基因进行功能验证。
  一般地,InDel突变主要是引起相关蛋白的功能丧失,因而,我们在单倍体实验室菌株BY4741(未选用第一部分工作所用CEN.PK102-3A菌株,是由于有组学数据显示该菌株缺少了部分突变基因)中分别敲除7个InDel突变基因(MFG1、YNL195C、PAU17、YVH1、PPM2、YRR1和RBG1),产生的缺失突变体在含香草醛的平板上进行菌体梯度定量生长实验。结果显示,YRR1缺失突变体BY4741(yrr1Δ)表现出良好的香草醛耐受性。同时,液体发酵结果显示,在香草醛胁迫条件下,BY4741(yrr1Δ)的最大比生长速率和香草醛的比消耗速率分别比出发菌株BY4741提高了142%和50%。进一步,在缺失菌株BY4741(yrr1Δ),通过质粒回补该基因时,菌株香草醛耐受性则明显下降,证实了其编码蛋白Yrr1p对香草醛耐受性的不利作用。
  YRR1编码具有锌指结构的转录因子Yrr1p,能够激活多药抗性相关基因的表达。此前相关研究报道均显示Yrr1p对细胞的药物(4-硝基喹啉-N-氧化物、水杨酸、戴森锰锌等)耐受性具有积极作用。本文首次观察到Yrr1p对香草醛耐受性具有负面作用。
  3.转录因子基因YRR1缺失提高香草醛耐受性机制的研究
  鉴于YRR1编码蛋白Yrr1p是药物耐受性相关转录因子,本文利用RNA-Seq技术,在有或无香草醛胁迫条件下对BY4741和BY4741(yrr1Δ)进行基因差异表达分析。结果显示,在无香草醛胁迫的条件下,YRR1缺失引起的基因差异表达并不显著。在香草醛胁迫的条件下,BY4741和BY4741(yrr1Δ)间共有217个基因的转录水平发生明显变化。对这217个差异表达基因进行功能聚类分析,这些基因的功能主要涉及氧化还原酶、物质转运、rRNA加工和核糖体合成等生物学过程。根据差异表达显著程度,并主要结合对相关基因的功能解读,本文选定醇脱氢酶编码基因ADH7,ABC转运蛋白相关基因PDR5和SNQ2,及rRNA加工和核糖体合成相关基因NMD3、SSF1、NSR1、DBP2、DBP9、HAS1、PRP43、MTR4为目标进一步研究。
  YRR1缺失提高了菌株还原香草醛的能力。在香草醛胁迫下,已报道能有效催化香草醛还原的醇脱氢酶基因ADH7在菌株BY4741(yrr1Δ)中的表达水平是野生型对照菌株中的7倍。为此,在该胁迫条件下,分别测定BY4741和BY4741(yrr1Δ)的细胞粗酶液以香草醛为底物的还原酶活性。结果表明,BY4741(yrr1Δ)的粗酶液以NADPH为辅酶的香草醛还原酶活性较出发菌株BY4741高出95%。结合BY4741(yrr1Δ)的香草醛比消耗速率较BY4741提高的现象,表明,提高菌株还原香草醛的能力是YRR1缺失提高香草醛耐受性的机制之一。在BY4741(yrr1Δ)菌株中进一步敲除ADH7,BY4741(yrr1Δadh7Δ)依然表现出良好的香草醛耐受性,这说明BY4741(yrr1Δ)中还有其他基因对香草醛耐受性起作用。
  YRR1缺失强化了ABC转运蛋白的功能。在香草醛胁迫条件下,与出发菌株BY4741相比,BY4741(yrr1Δ)中ABC转运蛋白相关基因PDR5和SNQ2表达水平升高。ABC转运蛋白能够外排毒性物质。因此,在BY4741菌株中超表达了PDR5和SNQ2。结果显示,超表达这些ABC转运蛋白在无香草醛胁迫时抑制细胞生长。但在香草醛胁迫下,超表达PDR5和SNQ2加快了菌体生长,菌株延滞期缩短。因此,ABC转运蛋白表达量提高是YRR1缺失提高菌株对香草醛的耐受性的机制之一。
  YRR1缺失促进了核糖体合成及rRNA加工过程,其中提高RNA解旋酶基因DBP2的表达水平对菌株香草醛耐受性有积极作用。香草醛严重抑制野生型菌株BY4741的核糖体合成途径和rRNA加工过程。与之形成对比的是,在香草醛存在条件下,缺失YRR1解除了这种抑制,大约12%的核糖体合成相关的基因在BY4741(yrr1Δ)响应香草醛时发生上调。其中4个基因(SSF1、NMD3、NSR1和DBP2),在BY4741(yrr1Δ)响应香草醛时(与无抑制物条件比较)表达上调,而在BY4741响应香草醛时(与无抑制物条件比较)表达下调,呈现相反的变化。这一相反变化可能是YRR1缺失引起的。在BY4741中分别超表达这4个基因,并在香草醛的胁迫下,进行液体发酵实验。结果显示,超表达RNA解旋酶基因DBP2能够显著提高菌株的香草醛耐受性,菌株的最大比生长速率和香草醛比消耗速率分别提高了7%和59%。其他基因对菌株的香草醛耐受性没有影响。
  RNA解旋酶能够参与细胞内一切RNA相关的活动,包括核糖体大小亚基(60S和40S)的合成。Dbp2p参与核糖体大亚基合成。香草醛被报道可以抑制核糖体大亚基合成,因此推测Dbp2p在香草醛耐受性中起到了加强核糖体大亚基合成的作用。同时,本文也关注了在BY4741(yrr1Δ)中表达上调的其它RNA解旋酶基因。按照它们参与的生物学过程,对参与大亚基合成的MTR4、DBP9,同时参与大小亚基合成的PRP43、HAS1,以及只参与小亚基合成的DBP4进行功能验证,遗憾的是这些基因的超表达并没有提高菌株的香草醛耐受性。
  综上所述,本文通过转录组学和基因组学,在综合分析大数据的基础上,结合遗传学及分子生物学技术,挖掘出酿酒酵母提高香草醛耐受性的新元件:氧化还原酶Ald6p、Zwf1p以及YNL134C和YJR096W编码的蛋白,转录因子Yrr1p,RNA解旋酶Dbp2p,ABC转运蛋白Pdr5p和Snq2p。首次证实转录因子Yrr1p对香草醛耐受性的具有负面作用,并证实一些ABC转运蛋白、参与核糖体合成及rRNA加工过程的RNA解旋酶Dbp2p对提高菌株的香草醛耐受性有积极作用。同时,明确了不同氧化还原酶通过直接还原香草醛和(或)提供更多的还原型辅酶(主要是NADPH)两种方式提高菌株对香草醛的耐受性。研究结果对其他抑制物耐受性的研究有很好的借鉴意义,更重要的是对构建适于木质纤维生物质转化的酿酒酵母菌株具有重要的积极意义。
[硕士论文] 王文博
生物工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:石油资源日趋匮乏促进了生物能源的快速发展,其中生物丁醇具有与汽油能量密度相当、饱和蒸汽压低、腐蚀性小等特点,可以完全不做处理替代汽油燃料。因此,利用生物质发酵产丁醇是一种具有良好发展前景的解决能源短缺的途径。然而我国对粮食价格进行调控,导致目前粮食价格相对较高,因此以粮食为原料生产丁醇价格偏高,经济性较小,不具有市场竞争力。寻找成本低廉的非粮作物作为发酵原料,是解决发酵法制丁醇的核心技术。本论文以木薯作为发酵原料,通过优化发酵工艺,获得丁醇产率高、生产成本低的发酵条件和参数。具体研究内容如下:
  首先通过氮量筛选试验,解决纯木薯原料发酵结果总溶剂和丁醇产量不高的问题,获得最佳的氮量和最佳的配比浓度,降低发酵成本,实验结果表明:木薯原料中添加0.5%-1.5%的氮元素,可以达到正常发酵水平,为了获得成本较低的氮源,在木薯培养基中分别添加氨水、尿素、硝酸铵、硫酸铵、麸皮、豆粕、米糠等氮源,进行不同的含氮物质添加实验,获得最佳的无机氮源是尿素,最佳的有机氮源是麸皮。
  其次,进行50L发酵罐的放大试验,考察了溶氧、种龄、接种量、温度、初始pH值、麸皮添加量、柔性原料等对发酵的影响,获得最佳放大发酵参数,试验表明:菌种为厌氧菌,最佳接种种龄为36h,接种量为10%,温度控制为37℃,初始pH为5~8,麸皮添加量为0.4%;柔性原料添加量玉米为50%、小麦为30%时,达到最佳发酵水平。
  最后,进行乙醇蒸馏糟液回用发酵试验,利用乙醇蒸馏糟液中的残余糖分,添加适量木薯原料进行丁醇发酵,通过优化原料配比,获得较好的发酵结果,节约发酵所需的淀粉原料,为生物丁醇生产的产业化做好技术攻关。
[硕士论文] 朱海良
生物工程 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:我国是啤酒产销量第一大国,不过整个啤酒行业存在着生产方式粗放、经济效益不高的问题,有必要提升啤酒行业技术含量,以新技术改造现有生产工艺和生产设备,获得更高的产品质量,从而提升啤酒品质,实现可持续发展。糖浆中含有丰富的糖分,可以被啤酒酵母利用,本文拟采用糖浆替代价格不断上涨的大麦以及其它辅料,从而达到节约成本、提高经济效益的目的。
  首先,辅料的选择及添加比例优化。通过对比不同辅料,发现糖浆是性价比最高的辅料,糖浆酿造啤酒的色度、浸出率、α-氨基氮等指标均满足啤酒生产的要求。在麦汁中添加了不同比例的糖浆进行啤酒酿造,结果发现糖浆添加比例为50%,在发酵过程中糖度下降快、酵母细胞沉降速度快、双乙酰含量低,满足啤酒质量要求。对于成品啤酒而言,色度、泡持性等指标均符合国标标准,而且高级醇含量适中,成品啤酒的口感、外观均较佳。
  其次,糖浆啤酒发酵工艺优化。结果表明,糖浆啤酒的最佳生产工艺为主发酵温度13℃、初始糖度为12°P、接种量为10%、糖浆添加量50%、初始α-氨基氮含量为190 mg/L,在此条件下发酵第8天糖度为3,双乙酰含量为0.2 mg/L,酵母细胞数为5.8×108个/mL,高级醇含量为52.5 mg/L,糖浆啤酒的优质期比普通啤酒多一个月,外观、口感、理化指标均能够满足清爽型啤酒生产需要。
  最后,产品泡持性的优化。比较五种常用增泡剂,经过单因素分析和方差分析,获得最佳复合增泡剂的添加比例为:蛋白酶A抑制剂50 mg/L、阿拉伯胶200 mg/L、大豆蛋白800 mg/L,产品的泡持性为523 S。
  论文研究表明,使用糖浆作为辅料酿造啤酒是可行的,生产成本得到了大幅下降,经济效益明显。
[博士论文] 朱永强
化学工程与技术 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:辅酶Q10广泛存在于生物细胞内,是呼吸链中的电子传递体,其结构由醌环和聚异戊二烯侧链组成。辅酶Q10具有增强呼吸链,加大能量供给的作用,被广泛应用于各种疾病的治疗和预防,如:心脏病、高血压和帕金森等。除此之外,由于辅酶Q10还具有良好的抗氧化能力,所以在食品和化妆品市场的需求量也与日俱增。本文对影响类球红细菌合成辅酶Q10的相关因素进行分析,并在此基础上对其生物合成途径进行综合代谢调控以构建辅酶Q10高产菌株。
  目前关于辅酶Q10工程菌的构建思路主要集中于对其生物合成途径基因的过表达。虽然这些调控策略取得了很好的效果,但在代谢网络中还有很多其他途径会对辅酶Q10的积累产生影响。如,能够和辅酶Q10竞争前体物醌环和萜类物质的代谢途径;与呼吸链功能相关的代谢途径等等。在本研究中,主要对这些非辅酶Q10合成途径进行调控,然后将其与辅酶Q10合成途径相结合进行综合调控。
  在类球红细菌中,类胡萝卜素缺失会对细胞生长造成非常不利的影响。但是类胡萝卜素又与辅酶Q10合成途径竞争前体物质香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。为了减少类胡萝卜素途径对GGPP的竞争,同时维持类球红细菌细胞的正常生长,本研究通过过表达光氧调控因子ppsR抑制crt系列基因的表达强度,使类胡萝卜素的合成受到适度抑制,从而使辅酶Q10的产量提高了28%左右。由于PpsR对光合基因具有普遍的抑制作用,GGPP合成关键酶crtE的表达强度也被抑制到只有野生型的一半。本研究将crtE和ppsR串联用tac启动子表达,从而解除了PpsR对crtE表达的抑制,达到了进一步提高辅酶Q10产量的目的。最终辅酶Q10的产量达到73.2 mg/L,比野生型提高了47%。
  作为细胞呼吸链的递氢体,辅酶Q10的主要功能是将NADH上的电子转移到呼吸链。所以辅酶Q10的功能与胞内NADH/NAD+比例有着紧密的联系。在本研究中,通过过表达gapA-1使RspgapA中NADH/NAD+比例较对照组提高了2倍,同时辅酶Q10的产量也提高了29%。这一现象证明了类球红细菌胞内的NADH/NAD+比值与辅酶Q10的积累存在着正相关的关系。但是在这一过程中RspgapA的生物量却下降了。为了提高类球红细菌的生物量,本研究在类球红细菌中表达了外源的vgb基因来提高菌体的摄氧率,通过协同调控氧化还原电位和摄氧率来进一步提高辅酶Q10的产量。最终RspGV的辅酶Q10产量达到了83.24mg/L,与野生型相比提高了71%。对gapA-1的两个同工酶gapB2和gapB3分别进行过表达也提高了NADH/NAD+比例,同时增强了类球红细菌辅酶Q10的合成能力。该现象进一步确认了加强甘油醛-3-磷酸脱氢酶的表达可以提高NADH/NAD+比例,进而提高辅酶Q10的产量。
  结合上述两种调控策略,对类胡萝卜素合成途径和氧化还原电势及摄氧率进行协同调控,构建了RspPEGV菌株。该菌株的类胡萝卜素合成途径被显著地抑制,但是由于生物量出现大幅的下滑,导致最终的辅酶Q10产量只有62.71 mg/L,低于单独调控时的产量。
  由于两个非辅酶Q10合成途径结合调控的效果不理想,所以将上述两个非辅酶Q10合成途径分别结合辅酶Q10合成途径进行综合调控。首先协同调控类胡萝卜素合成途径和辅酶Q10合成途径,构建RspMQPE菌株。该菌株的类胡萝卜素合成途径同样受到显著的抑制。虽然辅酶Q10的产率高于单独调控类胡萝卜素的策略,但是仍然低于RspMQd菌株(综合调整MEP途径和醌环修饰途径的类球红细菌,本实验室构建),最终的辅酶Q10产量并没有得到提高。然后协同调控氧化还原电势及摄氧率和辅酶Q10合成途径,构建了RspMQGV菌株。RspMQGV的生物量和NADH/NAD+比例与RspMQd相比都得到了提高。最终RspMQGV的辅酶Q10产量比RspMQd提高了19%,与野生型相比提高了2.36倍。
  本研究还考察了供氧条件对辅酶Q10合成的影响,发现在发酵前期充分供氧,发酵中后期适当限制氧供给有利于辅酶Q10的积累。最后通过高密度发酵实验进一步考察RspMQGV菌株的辅酶Q10生产水平。经过96h的发酵,辅酶Q10的产量达到600 mg/L,为目前报道的以类球红细菌工程菌生产辅酶Q10的最高产量。
[博士论文] 司振军
化学工程与技术 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)和β-聚苹果酸[poly(β-L-malic acid),PMLA]是两种具有多种不同用途的生物化学品,在食品、医药、化工等领域有广泛的应用。本文从多个角度较系统地开展了这二种重要生物化学品的高效合成机制研究及新工艺开发。
  论文首先对三种PQQ测定方法进行比较研究,明确了不同PQQ检测方法的特点和适用范围。利用GDH酶法检测高灵敏度特点,制备高效筛选PQQ产生菌的活性检测试纸,建立了从土壤中筛选PQQ高产菌的高通量筛选方法。在此基础上,筛选到了一株能以甲醇为唯一碳源生长的PQQ高产菌(Methylobacillussp.zju323),并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),编号为M2016079,摇瓶培养结果表明PQQ产量达到25.8 mg/L。
  然后利用Plackett-Burman实验进行培养基优化研究。结合响应面、人工神经网络分析以及遗传算法优化,得到关键培养基组分和最佳浓度:CoC12·6H2O、PABA和MgSO4·7H2O,优化后浓度分别为3.2 mg/L、418.7μg/L和1.5 g/I。建立了pH双阶段控制发酵策略,即发酵48 h前控制pH为6.8,之后pH为5.8,在补料发酵中前期补加甲醇,后期补加酵母粉。最后利用等离子体(ARTP)诱变和亚硝基胍(NTG)诱变以及两者复合诱变育种后,利用优化后的培养基和发酵工艺补料发酵,PQQ浓度接近450.0 mg/L。
  利用本实验室早期筛选的聚苹果酸生产菌Aurobasidium pullulans ZD-3d(CGMCC4605),开展了高产聚苹果酸新策略的研究。首先比较了葡萄糖与木薯淀粉水解液对PMLA合成的影响,结果发现生木薯淀粉水解液更有利于PMLA合成。同时研究了膜微滤和离心分离回收细胞循环发酵技术,当离心分离回收细胞循环发酵时细胞活力提高,循环发酵次数增加至5次,聚苹果酸浓度为76.2~39.6 g/L,产率0.98~1.76 g L-1 h-1,得率0.78~0.86 g/g,均高于膜微滤回收细胞循环发酵。利用蛋白质组学技术研究了钙离子对聚苹果酸合成的影响。结果发现钙离子组中有458种差异蛋白,对照组中含有726种差异蛋白。对差异蛋白GO富集分析发现钙离子组中有104种膜转运蛋白,这有利于苹果酸和聚苹果酸的胞内运输和胞外分泌。
  本论文一方面建立了高通量筛选高产PQQ菌的方法、优化了培养条件与发酵工艺、利用诱变育种技术提高了PQQ产量,另一方面,发展了回收细胞循环发酵合成聚苹果酸工艺技术并通过蛋白质组学技术进一步研究了聚苹果酸的合成机理,本研究对这两类化合物的高效生物合成提供了指导意义。
[硕士论文] 徐晟
兽医学 扬州大学 2017(学位年度)
摘要:乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种铁结合性糖蛋白,因其生物活性功能广泛,已被应用于医药开发、食品加工、保健品生产等领域。目前,国内外市场上销售的乳铁蛋白及其相关产品主要从牛乳中分离纯化所得。因其来源的限制,天然乳铁蛋白的产量已经无法满足人们日益增长的需求。因此,利用转基因技术生产重组人乳铁蛋白(Recombinent HumanLactoferrin,rhLF)作为天然乳铁蛋白的替代品,已经成为研究和开发乳铁蛋白的主要途径。
  本研究中,使用本实验室保存的乳腺特异性表达重组人乳铁蛋白载体菌株,通过扩增后获得乳腺特异性表达载体(PCL25/hLF),双酶切并切胶回收目的基因片段(zpz-1);利用细胞显微注射技术,将zpz-1注射入雌性奶山羊胎儿成纤维细胞(N31);通过G418筛选,获得16株胎儿成纤维细胞单克隆细胞株。经PCR检测,其中7株整合PCL25/hLF基因。以其中1株(N31zpz-1-13)作为供核细胞,使用核移植、电融合等技术获得重构胚140枚,移植136枚,共移植9只受体,其中2只受体于移植后第22周分娩,获得2只雌性奶山羊,分别编号为zp-71和zp-72,只有zp-71健康成长至体成熟。经PCR检测,zp-71整合PCL25/hLF基因。待zp-71体成熟后发情时进行人工配种,于配种后第22周分娩,连续收集30天羊乳。ELISA检测zp-71羊乳清中rhLF的表达水平;使用AKATA蛋白纯化系统,运用阳离子交换层析技术分离纯化rhLF;以青链霉素、人初乳浓缩乳清为阳性对照,以正常羊乳浓缩乳清为阴性对照,以纯化的rhLF(1mg)、转基因奶山羊zp-71的浓缩乳清为实验组,制备药敏纸片,进行抑菌试验。
  ELISA检测zp-71乳清中rhLF的结果显示:转基因奶山羊zp-71分娩后连续30天的乳清中均含有rhLF。对比天然乳铁蛋白的表达特点,本验室保存的PCL25/hLF表达载体(含β-casin与CMV复合启动子)能在转基因羊乳腺中有效稳定地表达。离子交换层析的结果显示:以0.5M NaCl-HAC-Tris作为洗脱液进行洗脱,得到两个洗脱峰。SDS-PAGE电泳结果及凝胶成像结果显示:洗脱峰Ⅰ中含有多条带,洗脱峰Ⅱ为单一条带;Western Blotting结果显示:洗脱峰Ⅱ中的产物为rhLF。抑菌试验结果显示:转基因奶山羊zp-71的乳清及其纯化产物均具有抑菌活性,4h的抑菌圈分别为1.70cm和1.30cm。
  本研究表明:应用实验室前期构建的PCL25/hLF乳腺特异性表达载体制备的转基因山羊具有乳腺特异表达rhLF功能;并且,重组人乳铁蛋白表达产物可以从转基因羊乳汁中提取;提取获得的rhLF和浓缩的转基因乳清抑菌试验显示均有抑菌活性。由此证明:人乳铁蛋白基因转基因山羊乳腺中表达的重组人乳铁蛋白在乳汁中单独存在,而且具有与天然人乳铁蛋白相似的抗菌活性。研究也表明:运用以HAC-Tris-NaCl为缓冲体系进行洗脱的阳离子交换层析技术可有效提取转基因羊乳中的rhLF,这一结果在国内外尚未见报道。同时此方法的建立也为转基因奶山羊乳中重组人乳铁蛋白的提取建立了技术基础,为今后工业化大规模分离纯化rhLF提供参考。
[硕士论文] 李秀康
发酵工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:乳酸,学名为α-羟基丙酸,在食品、化工、农业、环保以及医药等领域应用广泛。乳酸分子结构中含有一个不对称的碳原子,具有光学异构现象。根据乳酸的构型及旋光性的不同,可以将乳酸分为D(-)-乳酸、L(+)-乳酸和外消旋型乳酸三种类型。其中L-乳酸为左旋型乳酸,是人体唯一可以代谢利用的乳酸类型,生产光学纯度和产量较高的L-乳酸是目前L-乳酸发酵研究的焦点。本课题以产L-乳酸光学纯度为99.3%的粪肠球菌HY-U36为研究菌株,研究了培养基和发酵条件对L-乳酸得率的影响,优化了发酵条件以及发酵液菌体絮凝及脱色工艺。主要研究结果、结论如下:
  通过单因素试验考察了温度、碳酸钙添加量、种龄、接种量、装液量、摇床转速对L-乳酸产量的影响,确定了最佳的摇瓶发酵条件:温度37℃,碳酸钙添加量60g/L,种龄12h,接种量5%,装液量60ml,摇床转速100r/min。
  通过单因素试验和响应面试验优化了对粪肠球菌HY-U36发酵培养基,确定了粪肠球菌HY-U36发酵产L-乳酸的最适培养条件:葡萄糖148g/L,酵母膏12.4g/L,碳酸钙80g/L,乙酸钠5.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,硫酸镁1.2g/L,硫酸锰0.04g/L。在温度37℃,种龄12h,接种量5%,装液量60ml,摇床转速100r/min,发酵培养72h,L-乳酸产量达到134.7g/L,比优化前提高了24.3%。
  研究了利用絮凝剂来除菌的方法,确认了壳聚糖是理想的絮凝剂,当壳聚糖添加量为15mg/L,pH为6.0,温度为50℃,搅拌速度为140r/min,搅拌时间为10min时,此时的除菌效果最好,菌体去除率达到96.3%且L-乳酸的损失率仅为1.2%。
  对比粉末和颗粒两种活性炭对发酵液脱色率和L-乳酸损失率的影响,确定使用颗粒活性炭进行脱色。通过单因素试验和正交试验考察了颗粒活性炭添加量、温度、pH值、搅拌速度、脱色时间五个因素对发酵液脱色率的影响,当颗粒活性炭添加量为3%,温度为60℃,pH为5.0,搅拌速度为100r/min,搅拌时间为60min时,发酵液的脱色率为89.7%,L-乳酸损失率为3.74%。
[硕士论文] 崔浩
食品工程 山东农业大学 2017(学位年度)
摘要:胶原蛋白肽是以动物胶原为原料通过酶法、酸碱法或热降解法制备而成的小分子多肽混合物,在功能食品、美容护肤品、药物控释材料和诊断辅料等领域应用广泛。胶原蛋白肽有着抗氧化、防治骨质疏松和抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性等许多优秀的生物活性,因此胶原蛋白肽的制备成为近年的研究热点,具有重要的意义。对于传统的胶原蛋白制备技术而言,其存在分子量范围宽、工艺条件不完善和降解过程不可控等缺点存在。本研究以胶原蛋白的不同蛋白酶的传统酶解反应过程研究为基础,考察了基于超滤膜分离技术对于胶原蛋白肽的提取工艺,采用酶解-膜分离集成工艺提取分子量均一可控的的胶原蛋白肽,并采用高效凝胶色谱对制备的胶原蛋白肽分子量范围进行检测,以牛明胶为原料探索了分子量均一多肽的制备方法。具体内容如下:
  1.酶解工艺研究:实验采用牛明胶为原料,利用不同蛋白酶对其进行酶解,探究其酶解动力学,对酶解速率及酶解程度进行探索,经实验所得,经酶解60min后10kDa以下的小分子多肽所占比例分别为:碱性蛋白酶44.7%、胰蛋白酶39.8%、木瓜蛋白酶35.7%和中性蛋白酶15.3%。
  2.胶原多肽膜分离研究:膜分离过程中多肽的透膜行为是进行酶解-膜分离集成工艺的基础,实验研究了明胶酶解产物超滤处理过程中溶液体积、循环流量等对不同分子量多肽跨膜行为的影响。实验对1.2L、600mL、300mL的明胶溶液进行比较,60min内3kDa左右的多肽组分变化量分别为分别为7.84%、16.99%、21.05%。
  3.酶解-膜分离集成过程研究:酶解膜分离集成过程采用连续酶解反应,在酶解的过程中通过中空纤维膜进行多肽过滤。实验采用了碱性蛋白酶酶解,使用300mL明胶溶液进行循环反应。在特定条件下经3kDa中空纤维膜的酶解-膜分离集成反应60min后,相对比传统酶解反应酶解速率提高了15%,所得多肽组分分子量集中在1700与600Da左右。
[硕士论文] 张凯
化学工程 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:基于热力学约束的代谢通量分析能获得热力学可行的通量分布,提高预测的准确度,成为目前基因组规模代谢网络的研究热点。本文以1,3-丙二醇(1,3-propanediol,简称1,3-PD)为目标产物,对克雷伯氏杆菌基因组尺度代谢网络模型iYL1228添加了热力学约束,并对其进行了代谢通量分析,着重考察了还原当量对最优路径冗余性的影响,并对代谢网络进行还原型辅因子特异性优化分析。
  首先,针对甘油生物转化为1,3-PD代谢系统,采用代谢网络分析软件COBRA对基因组尺度克雷伯氏杆菌代谢网络进行了热力学约束的通量平衡分析。探究了厌氧和有氧条件下副产物、还原当量以及节点通量分配对目标产物1,3-PD生产的影响。结果显示,厌氧条件下,当比生长速率较大且甲酸和乙醇的合成速率较小时,无1,3-PD生成;有氧条件下,无论是较大比生长速率还是较小比生长速率,乙醇对目标产物的生成是不利的,而乙酸和甲酸在通量值较小时对目标产物的生成是有利的。1,3-PD的通量值与NADH/NADPH的比值成正相关,还原当量比值越大,目标产物通量值越大。对节点处通量分析可知,厌氧条件下比生长速率小于0.26 h-1,有氧条件下比生长速率小于1.05 h-1时更有利于目标产物的生成。
  其次,应用基于热力学约束的通量可变性分析对代谢路径进行冗余性分析。先对iYL1228添加热力学约束进行通量平衡分析(ll-FBA),确定底物甘油单位生产率达到最大时的最优路径以及依赖还原当量NADH的可调控反应;然后应用添加热力学约束的通量可变性分析(ll-FVA)研究了最优路径中依赖NADH的可调控反应对路径冗余性的影响。结果表明:在最优路径中,依赖还原当量的可替代反应乙醛脱氢酶ACALD、谷氨酸脱氢酶GLUDx和转氢酶NADTRHD对路径冗余性影响较大,其反应通量越大,路径冗余性越差;而依赖还原当量的必需反应甘油脱氢酶GLYCDx和苹果酸脱氢酶MDH对路径冗余性影响较小,可用于后期的辅因子特异性优化分析。
  最后,应用OptSwap算法对代谢网络进行还原型辅因子特异性优化分析。有氧条件下改变甘油-3-磷酸脱氢酶反应G3PD2、甘油脱氢酶反应GLYCDx、苹果酸脱氢酶反应MDH的辅因子特异性并敲除丙酮酸甲酸裂解酶反应PFL;厌氧条件下改变甘油脱氢酶反应GLYCDx、甘油-3-磷酸脱氢酶反应G3PD2的辅因子特异性并敲除氧气输送反应O2tex及谷氨酸-1-半醛转氨酶G1SAT,菌体生长和目标产物生成的耦合性都显著提高,最小BPCY(即底物单位生产率,表示耦合强度)值在有氧条件下达到0.53 mmol product/(mmol substract·h),厌氧条件下达到0.163 mmol product/(mmol substract·h)。此外,着重分析了目标反应(即1,3-PD脱氢酶反应13PPDH)辅因子特异性的改变对菌体生长与目标产物生成耦合性的影响。有氧条件下,BPCY值比辅因子特异性改变之前提高了19.98%,而厌氧条件下,BPCY的值比改变之前下降了11.66%。因此,有氧条件下目标反应应以NADPH作为辅因子,而厌氧条件下目标反应应以NADH作为还原当量。
[硕士论文] 翟秋倩
微生物应用工程 青岛科技大学 2017(学位年度)
摘要:槐糖脂是一种比较重要的糖脂类生物表面活性剂,它具有良好的增溶性、乳化活性、发泡性、热稳定性、低表/界面张力等性能,在食品、石油工业、环境治理、日化及医药等领域应用比较广泛,具有巨大的研究价值及经济效益。但是槐糖脂的产量低且价格比较高,因此,降低槐糖脂生物表面活性剂的生产成本和提高槐糖脂产量具有较大的研究意义。本论文针对脂溶性碳源转化率低的问题,采用优化发酵工艺及分子生物学手段增加菌体胞内氧气传递和溶解速率,解决槐糖脂产量低的问题。
  球拟酵母(Starmerella bombicola O-13-1)分别以转基因大豆油、非转基因大豆油、玉米油1号、玉米胚芽油为脂溶性碳源用摇瓶和5L发酵罐发酵生产槐糖脂,结果显示,转基因大豆油是生产槐糖脂适宜的脂溶性碳源,产量分别达到58.59g/L和197.96g/L。对4种脂溶性碳源进行了甲酯化,通过GC-MS进行了结构分析;对4种脂溶性碳源所产槐糖脂进行了分离和纯化,采用HPLC-MS进行了结构分析。结果显示,4种油脂的脂肪酸组成分别为C16:0、C18:0、C18:1、C18:2,差异为玉米油1号与玉米胚芽油的脂肪酸中不含有C18:0;所产槐糖脂的脂肪酸组成差别也不大,脂肪酸组分及含量分别为:转基因大豆油C18:0(15%)、C18:1(53.9%)、C18:2(20.7%),非转基因大豆油的C18:0(15%)、C18:1(53.9%)、C18:2(20.7%),玉米胚芽油C18:0(8.7%)、C18:1(58.2%)、C18:2(21.7%),玉米油1号C18:0(12.9%)、C18:1(53.5%)、C18:2(21.9%),并且所有槐糖脂中内脂型槐糖脂的含量是最高的,都在70%以上。
  以转基因大豆油为脂溶性碳源,利用摇瓶发酵生产槐糖脂,pH为6时的产量最高,达到59.39g/L;从发酵动力学曲线得知,菌体生长到30h时达到稳定期,开始分泌槐糖脂,发酵至96h左右时,到达产槐糖脂的指数中期,108h槐糖脂产量达到最高,为结束发酵的最佳时间;采用单次单因子实验优化槐糖脂发酵工艺,结果显示,恒定pH为3.5时,连续流加转基因大豆油,槐糖脂产量为139.06g/L;转速450r/min时,槐糖脂产量为186.55g/L;通气量为1.5VVM时,槐糖脂产量为197.96g/L;溶氧量为50%时,槐糖脂产量为192.37g/L;发酵前64h温度控制在30℃,之后控温在25℃,槐糖脂产量为216.37g/L。
  发酵结束,去除槐糖脂沉淀之后的发酵液,亦表现出优良的表面活性,具有低的临界胶束浓度(CMC),为192 mg/L。且有很好的耐盐(3-24%)、耐强酸碱(pH2-8)、耐高温(沸水浴120 min)的性能;对正己烷和正十六烷的乳化指数分别达到了57.5%和67.5%,且强酸、强碱、高温、高盐度等条件对其乳化作用没有太大的影响。
  利用现代分子生物学基因重组技术,构建球拟酵母表达载体,以期获得稳定、高产槐糖脂的重组工程菌株。
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