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[博士论文] 聂荣祖
食品科学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本文以柿单宁主要特征结构单元表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及其A型连接的二聚体(A型EGCG二聚体)为研究对象,旨在阐明A型EGCG二聚体具备较强抗淀粉样聚集活性的原因。首先,我们通过Thioflavin T(ThT)荧光、1-anilinonaphthalene-8-sulfonic(ANS)荧光、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色光谱和透射电子显微镜等手段系统证实了A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更强的抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成及解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的效果,并探究了A型EGCG二聚体发挥抑制作用的关键阶段。进一步通过构建PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维神经细胞毒性的抑制作用和调节机制。在此基础上,以Aβ40淀粉样多肽为模型,通过ESI-MS、核磁共振、分子对接等研究手段探索EGCG和A型EGCG二聚体与Aβ40淀粉样多肽的结合方式和相互作用位点。主要研究结果如下:
  1.EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维形成抑制作用的比较研究
  ThT荧光实验结果表明,牛胰岛素蛋白在pH2.0的含20%乙酸溶液中孵育8h可形成成熟的牛胰岛素淀粉样纤维。加入EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维的形成均可发挥显著的抑制作用,且抑制作用随着多酚浓度增大而增强。相较于EGCG单体,A型EGCG二聚体效果更好,当其浓度达到0.35mM时,可完全阻止牛胰岛素淀粉样纤维的形成。透射电子显微镜观察结果与ThT荧光实验结果相符。加入0.70mM的A型EGCG二聚体后,在透射电子显微镜中观察不到淀粉样纤维状结构,但有部分无定型聚集体形成。此外,采用动态光散射检测发现A型EGCG二聚体可保护一部分牛胰岛素蛋白继续以单体形式存在,同时生成了粒径约为295nm的无定型聚集体。ANS荧光、FTIR和圆二色光谱的研究结果表明,A型EGCG二聚体可较好地保护牛胰岛素蛋白的原始构象,阻止蛋白二级结构的改变及内部疏水性氨基酸的暴露。因此,我们推测与牛胰岛素蛋白单体结合并抑制蛋白结构改变是A型EGCG二聚体发挥抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成作用的机制之一。为了研究A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键时期,在牛胰岛素蛋白孵育过程的不同时期加入0.70mM的A型EGCG二聚体,从结果中可以看出,在0h和2h时加入0.70mMA型EGCG二聚体可完全抑制牛胰岛素蛋白疏水性氨基酸的暴露及牛胰岛素淀粉样纤维化聚集进程,并阻止原纤维的形成,促进无定型聚集体的形成,这表明A型EGCG二聚体不仅能够与牛胰岛素蛋白单体结合,还可与成核寡聚体结合,并破坏其原有结构,从而达到使其丧失继续形成原纤维的能力。然而,在4h时加入A型EGCG二聚体仅能部分抑制牛胰岛素淀粉样纤维的形成。因此,以上研究结果证实,牛胰岛素淀粉样纤维形成过程中的延滞期是A型EGCG二聚体抑制牛胰岛素淀粉样纤维形成的关键阶段。
  2.EGCG和A型EGCG二聚体对成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚作用的比较研究
  ThT荧光和ANS荧光检测结果表明A型EGCG二聚体可显著减少牛胰岛素淀粉样纤维疏水性氨基酸的暴露,且A型EGCG二聚体的解聚效果强于EGCG单体。透射电子显微镜的观察结果可进一步证实A型EGCG二聚体具有更强的解聚成熟牛胰岛素淀粉样纤维的能力。通过SDS-PAGE电泳和Bradford法分别分析成熟牛胰岛素淀粉样纤维解聚产物分子量分布和上清液中可溶性蛋白含量变化,可以看到牛胰岛素淀粉样纤维解聚后形成了大量的分子量为10kDa到250kDa的聚集体,且A型EGCG二聚体加入后生成的可溶性蛋白浓度为加入EGCG时的3.68倍,这表明A型EGCG二聚体不仅对已形成的牛胰岛素淀粉样纤维具有更好的解聚效果,还能促进可溶性牛胰岛素寡聚体的大量形成。
  3.EGCG和A型EGCG二聚体对由牛胰岛素淀粉样纤维诱导形成的神经细胞毒性的抑制作用及机制
  选用PC12细胞模型研究了EGCG和A型EGCG二聚体对牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性的抑制作用。MTT实验结果表明EGCG和A型EGCG二聚体可显著抑制牛胰岛素淀粉样纤维诱导产生的细胞毒性。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维引起的损伤。实验结果表明,相较于EGCG,A型EGCG二聚体可更好地保护PC12细胞膜完整性,降低由牛胰岛素淀粉样纤维诱导的胞内过量Ca2+、活性氧(ROS)和一氧化氮(N0)浓度,阻止线粒体膜电位下降,提高胞内过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化防御酶活性,抑制细胞内凋亡诱导因子(AIF)和核酸内切酶G(Endo G)等凋亡相关蛋白的过量表达。因此,根据以上结果,我们推测清除细胞内过量的活性氧,并提高抗氧化防御酶活性是A型EGCG二聚体较好地保护PC12细胞免受牛胰岛素淀粉样纤维细胞毒性损伤的分子机制。
  4.以Aβ40淀粉样多肽为模型研究A型EGCG二聚体较强的淀粉样聚集抑制作用机理
  ThT荧光实验结果表明A型EGCG二聚体具有比EGCG单体更显著的抑制Aβ40淀粉样纤维形成的能力。30μM的A型EGCG二聚体可完全抑制Aβ40淀粉样多肽疏水性氨基酸残基的暴露和Aβ40淀粉样纤维化聚集进程。透射电子显微镜的观察结果可证实上述结论,30μMA型EGCG二聚体可促使无定型聚集体的形成,同时完全阻止Aβ40淀粉样纤维形成。未修饰蛋白光催化交联法和MTT法的检测结果均证实A型EGCG二聚体可较好地抑制Aβ40寡聚体的形成及其诱导的神经细胞毒性。随后,我们采用荧光淬灭、ESI-MS、核磁共振和分子对接等研究手段检测多酚与Aβ40多肽之间的相互作用机制,结果表明EGCG与A型EGCG二聚体均可与Aβ40多肽主要通过疏水相互作用结合形成非共价复合物。相较于EGCG,A型EGCG二聚体可与更多具有强烈聚集倾向的氨基酸残基结合,并与Aβ40多肽之间形成更多的非共价相互作用。最后,构效关系的研究结果表明多酚化学结构中的没食子酰基基团重要性强于羟基。
[硕士论文] 杨倩
药用植物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本课题从蕲春蕲艾(Artemisia argyi)根茎部分离纯化得到一株内生真菌命名为HCH285,之后进行菌种鉴定、bostrycin方法学构建,同时对该HCH285内生菌代谢产物和bostrycin进行安全性和活性分析,主要结果如下:
  1.HCH285菌种鉴定。利用微生物学与分子生物学两种方法对HCH285内生真菌进行鉴定。微生物形态学观察发现菌落呈圆形,生长初期为白色绒状毛且生长蓬松,后期逐渐成红色且菌落背面的红色产物也清晰可见。HCH285菌丝体为无色有隔菌丝。它产单个、球形或椭圆形、黑色光滑的分生孢子。此外通过分子生物学技术对其ITS序列测定确定该菌株属于黑孢霉属球黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)。
  2.HCH285内生菌产bostrycin分离制备方法建立。利用多种化学试剂对HCH285内生菌代谢产物提取,确定乙酸乙酯为最佳萃取试剂,以半制备液相进行化合物分离,优化卷线孢菌素bostrycin的HPLC制备方法,使用高效分析型液相检测分离纯度,其分离制备方法为:柱温∶30℃,进样体积∶700μL,流速∶3mL/min,流动相比例:甲醇∶0.3%甲酸=50∶50(v/v),检测时间∶30min,紫外检测∶02nm;采用400MHz核磁共振波谱仪进行结构鉴定确定为卷线孢菌素bostrycin。
  3.Bostrycin活性分析。Bostrycin抗氧化活性分析证明,对三种自由基抗性顺序由大到小为O2->DPPH->OH-。它的抗菌活性表明有较好的抗菌作用,对革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌较好。CCK-8法体外抗癌活性研究表明对U251,B10F16癌细胞的半致死浓度分别为4.30μM和6.05μM。
  4.Bostrycin及HCH285菌代谢色素的安全性分析。引入秀丽隐杆线虫(C.elegans)为生测材料,以食品级红曲红色素为对照,研究对C.elegans各生理指标的影响。试验表明HCH285菌产色素对C.elegans的急性与慢性毒性、摄食与运动能力、生长发育状态、卵块孵化率,均没有明显抑制作用且与食品级红曲红色素作用效果一致,综合各指标显示500μg/mL内为安全剂量。以相同方法和指标,分析bostrycin对C.elegans作用,确定剂量在10μg/mL内无毒副作用。
[硕士论文] 程仕强
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:随着健康观念变化和医学模式转变,中医药越来越显示出其独特的优势和不可替代的作用。红景天作为中医药应用历史悠久,被人们称为“雪域人参”。红景天苷是红景天根部的主要活性成分,具有多种药理功能,其在抵抗炎症和脂肪代谢中发挥重要作用,但其中机制尚不明确。巨噬细胞是机体重要的免疫细胞,可通过极化发挥抗炎或促炎的作用,同时巨噬细胞内的脂肪代谢与巨噬细胞的功能有着紧密的联系。已有研究证明,脂肪量和肥胖相关基因(FTO)能够抑制促炎细胞因子表达。为了更好了解巨噬细胞的功能和探索红景天苷的潜在药用功能,本研究探讨了红景天苷对巨噬细胞极化以及巨噬细胞内脂肪代谢重要调节分子的影响。
  本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究模型,用红景天苷(100μM)预处理1h后,以LPS(1μg/mL)或IL-4(20ng/mL)诱导巨噬细胞分别向M1与M2方向极化,通过RT-qPCR方法检测M1型极化标志基因iNOS、IL-6、IL-1β和M2型极化的标志基因ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平。结果显示iNOS、IL-6、IL-1βmRNA相对表达水平较LPS单独处理组显著下调,而ARG1、MRC、MGL的mRNA相对表达水平与IL-4单独处理组相比发生上调,说明红景天苷能够抑制巨噬细胞M1型极化和促进巨噬细胞M2型极化。通过Western blot方法检测Akt蛋白S473位点磷酸化水平,红景天苷能够抑制LPS诱导Akt S473位点的磷酸化水平,红景天苷可以通过影响巨噬细胞的Akt信号通路来调控巨噬细胞极化。使用红景天苷预处理后检测Poly(I:C)(5μg/mL)刺激巨噬细胞诱导的炎症关键基因iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,结果表明:iNOS、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平显著降低,说明红景天苷可能对病毒感染引起的炎症也具有保护作用。在巨噬细胞中超表达FTO,红景天苷预处理后,加入LPS刺激,检测促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平。结果显示IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相对表达水平显著降低,说明超表达FTO能够抑制LPS引起的炎症因子的表达进而影响巨噬细胞的抗炎作用。为了更进一步研究红景天苷对巨噬细胞脂质代谢的影响,红景天苷预处理细胞,再加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO的mRNA表达水平。结果显示,FTO的mRNA表达水平降低,红景天苷对巨噬细胞炎症中的FTO有调控作用。使用红景天苷预处理,加入LPS或Poly(I:C)刺激,检测FTO/SREBP1c/CIDEc信号通路中脂肪合成的重要调节因子SREBP1c和促进脂滴合成的关键蛋白CIDEc的mRNA表达水平。结果显示,红景天苷能够抑制脂肪积累过程中关键基因SREBP1c和CIDEc的mRNA水平的表达,从而可能降低巨噬细胞中的脂质积累。
  总之,我们结果表明红景天苷可以调控巨噬细胞极化以及影响巨噬细胞内脂质代谢相关重要调节分子的表达,从而调控机体的炎症反应。
[硕士论文] 赵文龙
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:我国是世界上银杏叶的最大产地,银杏资源十分丰富。银杏叶中的银杏黄酮具有抗衰老、防止血管堵塞、降血压等功效,因此被广泛利用到药品、保健品等领域。目前市场产品主要是银杏黄酮含量为24%的银杏叶提取物,市场竞争激烈;为了提高产品的附加值,满足高端市场的需求,重要措施之一是通过优化提取精制工艺,增大提取物中银杏黄酮的含量。本文从原料银杏叶出发,研究提取精制银杏黄酮的方法,主要研究内容如下:
  1)本文建立了分光光度法和高效液相色谱法两种方法来测定提取物中银杏黄酮的含量。通过单因素实验对银杏黄酮提取过程的影响因素进行分析,考察了热回流提取法、超声辅助提取及水析过程对其提取率的影响,并通过正交实验得到了银杏黄酮提取过程最优的工艺参数为温度70℃、乙醇浓度70%、料液比为1∶15、提取时间30min、水析比为1∶5,此时提取率为95.3%,水析之后,银杏黄酮含量为4.5%,两个过程的总收率为92.7%。
  2)本文分别对AB-8大孔吸附树脂和聚酰胺树脂精制银杏黄酮过程进行了研究,采用静态实验考察了树脂的吸附特性,绘制了吸附动力学曲线及吸附等温线并进行了拟合;采用树脂的梯度洗脱实验确定了精制过程的工艺参数,并考察了上样浓度、上样流速的影响,绘制了渗透曲线和解吸曲线。AB-8大孔吸附树脂精制银杏黄酮的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于AB-8大孔吸附树脂柱,先用浓度为20%的乙醇洗脱后再用80%的乙醇洗脱,即可得到含量为35.1%的银杏黄酮提取物,其收率为82.7%;聚酰胺树脂的最佳工艺参数为:银杏黄酮提取液上样于聚酰胺树脂柱,先用10%的乙醇洗脱后再用60%的乙醇洗脱,即可得到含量为56.8%的银杏黄酮提取物,其收率为79.7%。
  3)本文对大孔吸附树脂与聚酰胺树脂联用纯化银杏黄酮进行了研究,考察了树脂联用顺序对产品的影响,使用正交实验确定了最佳工艺参数,并对树脂的重复使用稳定性进行了研究。树脂联用纯化银杏黄酮的最佳工艺参数为:使用乙醇水溶液作为洗脱液,先经AB-8树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为15%,第二次洗脱浓度为70%;后经聚酰胺树脂两梯度洗脱,第一次洗脱的洗脱液浓度为10%,第二次洗脱浓度为60%,即可得到含量为73.6%的银杏黄酮提取物,收率为64.0%。
[硕士论文] 付三
中药学 湖北中医药大学 2018(学位年度)
摘要:背景:灯盏花素是传统中药灯盏细辛黄酮类有效部位,收载于2015年版《中国药典》一部,其主要成分为灯盏乙素,含量高于90%,由其制作的中成药制剂广泛应用于临床治疗心脑血管疾病,疗效显著,国内外市场十分畅销。目前药典收录的灯盏花素提取纯化工艺采用了大量酸碱处理,会对生态环境造成严重污染。因此对灯盏花素提取纯化工艺进行改革研究,控制其产业化制备对生态环境造成的污染具有重要意义。此外,灯盏乙素能通过调节小胶质细胞的活化发挥抗炎作用,但其作用机制未阐明。因此探讨灯盏乙素抑制小胶质细胞活化的作用机制,可为脑缺血再灌注后损伤治疗策略提供理论依据。
  目的:改革灯盏花素提取纯化工艺,减少酸碱用量,减轻环境污染;探讨其抑制小胶质细胞活化的机制,为其在脑血管方面疾病的治疗作用提供理论基础。
  方法:取灯盏细辛粗粉,按照2015版《中国药典》所示方法,乙醇回流提取,提取液浓缩至1g/mL的含药量。用2mol/L NaOH调节浓缩药液pH至7.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;用5%HCl调节上清液pH至4.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;将上清液稀释至0.42g/mL的含药量,通过D101大孔树脂柱,2BV去离子水洗脱除杂,继续用3BV40%乙醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液回收乙醇并浓缩至3g/mL的含药量,用5%HCl调pH至2.5,静置,离心。沉淀用适量无水乙醇、去离子水、丙酮反复洗涤,干燥、粉碎后得到粗品。粗品经适量乙醇重结晶,丙酮洗涤,烘干,即得到灯盏花素提取物。使用液相质谱联用仪对所得样品分析鉴定。
  将灯盏乙素作用于LPS诱导活化的BV-2细胞,采用CCK-8法检测灯盏乙素对BV-2细胞存活率的影响。灯盏乙素(10-40μg/mL)预处理BV-2细胞1h,然后加入LPS(1μg/mL)诱导细胞活化。分别采用ELISA法和Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO释放量的影响。提取总RNA,采用实时荧光定量PCR检测灯盏乙素对LPS诱导BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS及COX-2mRNA表达的影响。采用原位免疫荧光染色法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB核转移的影响。采用Western blot技术检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB、MAPK、PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。
  结果:所得灯盏花素提取物经液质联用仪(HPLC-MS)分析,分别鉴定为:灯盏乙素,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷,野黄芩素。其中灯盏乙素含量为94.28%,其转移率为15.6%。
  CCK-8结果表明灯盏乙素(10-40μg/mL)对正常或者LPS诱导的BV-2细胞活力无明显抑制作用。ELISA、NO试剂盒及实时荧光定量PCR检测结果显示:LPS组与对照组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著升高;灯盏乙素(10-40μg/mL)组与LPS组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著降低。免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,LPS组可观察到NF-κB由细胞质向细胞核的转移,灯盏乙素组与LPS组相比,NF-κB由细胞质向细胞核的转移能明显被抑制。Western blot结果显示:LPS组与对照组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、PI3K、AKT、p38、JNK及ERK蛋白的磷酸化水平显著升高,总蛋白水平无明显变化,IκB总蛋白水平显著下降;灯盏乙素组与LPS组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、AKT、p38、JNK蛋白的磷酸化水平及Ikkβ总蛋白水平显著下降,IκB总蛋白水平显著升高,p65、Ikkα、p38、JNK、ERK、PI3K总蛋白水平及PI3K、ERK蛋白的磷酸化水平无明显变化。
  结论:本研究在《中国药典》收载灯盏花素制备工艺的基础上,对其进行了提取纯化工艺改革研究,取得可靠的技术参数,为其产业化制备工艺改革避免大量酸碱使用提供了实验依据,对于保护生态环境具有重要意义。此外其抑制神经炎症作用机制研究表明,灯盏乙素能通过抑制NF-κB通路的激活,抑制AKT,p38,JNK蛋白的磷酸化来调控相关mRNA的表达,抑制炎症因子的释放,从而抑制小胶质细胞的激活,起到神经保护作用。
[硕士论文] 赵树琪
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察褐藻多酚Eckol的抗肿瘤作用,并探讨其可能的作用机制,为Eckol在肿瘤防治中的应用提供实验依据。
  方法:
  1、Eckol的抗肿瘤作用研究:分别建立移植型S180腹水瘤及肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给予生理盐水或Eckol(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)7天。S180腹水瘤小鼠模型造模后继续给药15天,每天记录小鼠活动状态,记录小鼠生存天数。S180肉瘤荷瘤小鼠模型造模后继续给药10天,每天记录小鼠体重,记录小鼠生长曲线,最后一次给药1h后,处死小鼠,分离脾脏和胸腺,计算脾指数和胸腺指数;剥取肉瘤组织,称重;HE染色观察肿瘤组织病理变化;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡;以Western blot法测定瘤组织EGFR、Bcl-2、Caspase-3的表达水平。
  2、Eckol对S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能的影响:建立移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给药7天,造模后继续给药10天。取小鼠外周血血清,ELISA法检测IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平;以碳粒廓清法了解小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能;取外周血,流式细胞术测定小鼠外周血T细胞亚群分布;分离小鼠脾脏,磨碎后过滤、种板,ConA诱导脾细胞转化,MTT法检测Eckol对脾细胞转化的影响;免疫组化法测定CD11c阳性细胞在肿瘤组织中的分布,了解肿瘤组织树突状细胞浸润情况;从小鼠骨髓中获得小鼠骨髓来源的单核细胞,用含IL-4和GM-CSF20ng/ml的RPMI1640培养基培养7天,诱导分化为树突状细胞。收集细胞,流式三标法(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)检测髓源性树突状细胞表型。
  3、Eckol对Reg3A诱导人胰腺癌SW1990细胞过度增殖的影响:体外培养SW1990细胞,Eckol(0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml)处理细胞48h,加入50ng/ml的外源性Reg3A蛋白共处理24h后,MTT法检测细胞存活率。选取Eckol(5、10、20μg/ml)三个浓度组,Eckol处理细胞48h后,50ng/ml外源性Reg3A蛋白共处理24h,流式细胞术测定细胞周期;软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Real Time PCR法检测JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA表达;Western blot法检测JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、NF-κB、Cyclin D1蛋白水平表达。
  结果:
  1、Eckol的抗肿瘤效应:Eckol体内干预可延长移植型S180腹水瘤荷瘤小鼠生存天数;移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型中,Eckol呈剂量依赖性地降低肉瘤重量,升高脾指数,且不明显改变动物生存曲线。肿瘤组织HE染色结果显示,Eckol处理组中,肉瘤组织微血管减少,坏死增加,核固缩明显,癌巢周围发现单核细胞浸润。TUNEL染色结果显示,Eckol处理组肿瘤细胞凋亡增加。肿瘤组织内凋亡蛋白Caspase-3表达上升,抑凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白EGFR表达下降。提示Eckol体内抗肿瘤效应明显。
  2、Eckol对移植型S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能具有显著调节作用:ELISA结果显示,Eckol处理组S180肉瘤荷瘤小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ显著升高,提示Eckol能够调节Th1/Th2平衡,促进Th1介导的细胞免疫;此外,Eckol提高荷瘤小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能,促进脾淋巴细胞转化,调节外周血T细胞亚群比例。免疫组化及流式结果显示,Eckol能够促进肿瘤组织树突状细胞的浸润,且影响树突状细胞表型,促进髓源性树突状细胞成熟。提示,Eckol体内抗肿瘤效应极可能与其对荷瘤小鼠的免疫功能的调节作用相关。
  3、Eckol对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖的抑制作用:MTT法显示,5-20μg/ml Eckol对SW1990细胞增殖没有明显的体外抑制作用,但Eckol+Reg3A与Reg3A单独作用相比,细胞存活率下降。细胞周期检测发现,与Reg3A单独作用相比,Eckol+Reg3A组S期和G2/M期细胞减少,G0/G1期细胞增多。软琼脂克隆形成实验结果显示,Eckol+Reg3A组的克隆数比Reg3A组克隆数明显减少。Real Time PCR和Western blot结果发现,Reg3A可以上调JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达水平,而Eckol可浓度依赖性地抑制这些上调作用。提示,Eckol体外对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖具有抑制作用,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
  结论:
  1、Eckol具有显著抗肿瘤效应,其体内抗肿瘤效应的发挥可能与其调节荷瘤小鼠免疫功能密切相关。
  2、Eckol体外可抑制胰腺炎症相关介质Reg3A蛋白诱导的胰腺癌SW1990细胞过度增殖,提示Eckol对伴随炎症的胰腺癌的恶性进展具有潜在的抑制效应,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
[硕士论文] 干正
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:观察自制的辟秽防感中药香囊干预海军航空兵部队官兵感冒的临床疗效和安全性,为该香囊在全军的推广应用提供可靠依据。
  方法:采用前瞻性随机对照研究方法,选择海军航空兵部队官兵354例,应用随机数字表将其随机分为2组。干预组随身佩戴及室内悬挂辟秽防感中药香囊,对照组为空白对照,两组人员工作、生活如常。观察时间为3个月,通过观察感冒发病率、中医证型、平均病程、临床疗效、症状体征评分、中医证型与疗效关系、实验室检查、安全性指标,探究辟秽防感中药香囊的干预感冒的临床疗效。运用《中医体质调查量表》调查该部队官兵的体质分布情况以及感冒患者的体质分布情况。
  结果:从2017年2月-2017年5月,共有332例官兵纳入研究,其中干预组168例,对照组164例。(1)干预组感冒发病率为17.26%;对照组感冒发病率为32.31%,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。(2)在干预组感冒患者中,风寒型占34.48%、风热型占37.93%、体虚型占27.85%;对照组感冒患者中,风寒型占35.18%、风热型占38.89%、体虚型占25.93%,两组患者的证型分布差异无统计学意义(P>0.05)。(3)经过15天的观察,与对照组相比,干预组的血IgA和IgG水平显著升高,有统计学意义(P<0.05)。(4)干预组的平均病程为3.42±2.17天;对照组的平均病程为5.58±2.86天。两组间平均病程的差异有统计学意义(P<0.05)。(5)干预组的总有效率为75.86%;对照组的总有效率为64.81%。两组间临床疗效差异有统计学意义(P<0.05)。(6)经过3天治疗发现,与对照组相比,干预组的症状总评分明显降低,在改善鼻塞、咽痛、流涕、头痛、咳嗽方面效果明显(P<0.05)。(7)在干预组中,风寒型患者的总有效率为70.00%,风热型患者的总有效率为72.72%,体虚型患者的总有效率为87.50%,三者疗效差异有统计学意义(P<0.05)。(8)与对照组相比,干预组患者血常规中淋巴细胞百分比和中性粒细胞百分比变化有统计学意义(P<0.05)。(9)在接受调查的332名官兵中,平和质占58.43%例、气虚质占5.27%、阳虚质占11.74%、阴虚质占5.12%、痰湿质占5.12%、湿热质占7.23%、血瘀质占2.71%、气郁质占1.81%、特禀质占2.12%。(10)在83例感冒患者中,平和质占22.89%、气虚质占19.28%、阳虚质占27.71%、阴虚质占6.02%、痰湿质占9.64%、湿热质占7.23%、血瘀质占3.61%、气郁质占1.20%,特禀质占2.41%。
  结论:辟秽防感中药香囊能降低感冒发病率,提高血免疫球蛋白水平,有一定预防感冒的作用;能缩短感冒病程,改善感冒症状,提高总有效率,有一定治疗感冒的作用,特别是对体虚型感冒效果更加明显;并且安全性较高、使用方便、价格低廉,适合在部队推广应用。
[硕士论文] 果卉
药物分析学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:栀子豉汤为张仲景《伤寒论》中的经典复方方剂,由中药材栀子和淡豆豉组成,其临床上可用于治疗失眠、抑郁症、神经性衰弱等心理性亚健康疾病。复方中的栀子为茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis.的干燥果实,淡豆豉为豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的成熟种子经青蒿、桑叶等中药闷至发酵而成的加工制品,作为常用性中药材,在历版中国药典中均有详细记载。目前国内外多以栀子或淡豆豉单味药材的化学成分以及药理药效为基础展开研究,关于栀子豉汤复方药材的化学成分、药效物质以及配伍意义的研究报道甚少。
  首先本课题在细胞层面上对栀子豉汤复方的药理作用进行了研究,考察了不同浓度谷氨酸对于PC12细胞损伤模型存活率的影响,采用MTT法测定细胞存活率,确定了当谷氨酸浓度为3mmol/L时,细胞损伤率达52%,为PC12细胞损伤模型的造模条件。随后考察了系列不同浓度的栀子豉汤对于模型组细胞的保护作用,确定了0.25、0.5和1mg/mL浓度的栀子豉汤对于PC12细胞损伤模型具有明显的保护作用。根据对正常组细胞、谷氨酸模型组细胞以及栀子豉汤给药组细胞分别进行乳酸脱氢酶释放、谷胱甘肽还原酶水平、总超氧化物歧化酶活性、以及活性氧的检测,说明谷氨酸模型组可以增加乳酸脱氢酶的释放量、显著性降低谷胱甘肽还原酶和总超氧化物歧化酶的活力,并增强了细胞内活性氧的水平。而系列浓度栀子豉汤给药组则可以显著性降低乳酸脱氢酶释放量、增加细胞内谷胱甘肽含量、增强细胞内总超氧化物歧化酶活力并明显降低活性氧水平,从而抑制细胞损伤。由此说明栀子豉汤复方对于谷氨酸致PC12细胞的损伤模型具有明显的保护作用,为后续深入的研究栀子豉汤复方的化学成分分析及阐明配伍意义提供有力的实验数据。
  为充分研究栀子豉汤复方中的指标性成分,基于前期工作对栀子的活性成分进行了充分的探讨,因此本课题采用指纹图谱结合化学统计学的方法建立一种淡豆豉药材质量控制的方法,并对淡豆豉中特征性成分进行定性和定量分析。根据淡豆豉药材指纹图谱中相似度评价结果并结合聚类分析确定指纹图谱的色谱峰中对于淡豆豉质量具有明显干预作用的成分,采用离子阱-飞行时间质谱对21种化学成分进行定性分析。通过主成分分析和正交校正的偏最小二乘分析的统计学方法甄别出定性的色谱峰中对淡豆豉质量具有统计学影响意义的化学成分进行定量分析,共定量11种化合物,分别为黄豆苷,黄豆黄苷,染料木苷,大豆苷元,丙二酰黄豆黄苷,乙酰化黄豆苷,乙酰化黄豆黄苷,丙二酰染料木苷,乙酰化染料木苷,染料木素和黄豆黄素。
  为进一步探讨栀子豉汤化学物质基础研究,本课题又比较了栀子豉汤配伍前后化学成分的变化,采用离子阱-飞行时间质谱法分别对栀子豉汤复方以及栀子、淡豆豉两种单味药材进行定性鉴别分析和比较,发现栀子豉汤中缺少西红花苷Ⅲ、京尼平、3,5-二-O-咖啡酰基-4-O-(3-羟基-3甲基)戊二酰基奎宁酸化学成分,同时淡豆豉中含量较少的化学成分包括香豆酸、丙二酰黄豆苷、丙二酰黄豆黄素、丙二酰染料木苷、乙酰化染料木苷也未在栀子豉汤中检测出来,但是复方中定性出Jasminoside A和Jasminoside I,以及未知化合物m/z611.1643和m/z663.3227,并未在单味药材中鉴别得到。此外,考察了栀子豉汤配伍比例对主要活性成分溶出变化的影响,分别对不同配伍条件的栀子豉汤复方中17种特征化学成分进行含量测定。确定栀子与淡豆豉比例为1∶1时,为最佳配伍条件,该条件下栀子豉汤复方中环烯醚萜类、异黄酮类等活性成分溶出为最佳。
[硕士论文] 陈祥慧
生药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:番红花是鸢尾科番红花属球茎类草本植物,具有良好的活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效,现代多用于治疗心脑血管疾病和抑郁症。其特有的以藏红花苦素、藏花醛、西红花酸及其糖苷衍生物西红花总苷为代表的类胡萝卜素类化合物是发挥药效的主要成分。番红花柱头是西红花苷等成分合成和积累的场所,柱头作为药用部位其生物量较小而导致产量稀少。整合分析多重组学数据,发掘西红花柱头发育或糖苷合成相关基因,利用分子生物学手段,开展番红花有效成分生源途径解析,并验证影响柱头发育基因的生物学功能。在此基础上,培育高产优质番红花品系,能有效缓解西红花市场的供需矛盾。
  为了发现潜在的关键酶基因及分子调控基础,本课题针对不同发育时期的番红花柱头同步进行了转录组和代谢组分析,特别监控与西红花苷合成途径相关的代谢流。从转录组中共组装得到269,943条Unigenes,根据差异基因的表达趋势可将所有的差异基因分为7种表达模式,共注释出181条可能参与西红花苷合成的酶基因,筛选出63个可能调控西红花苷合成的转录因子。而代谢组分析指认出15个西红花苷合成途径中的化合物,其含量变化趋势可分为4种模式。为了深入挖掘基因和化合物间的相关性,本研究整合两个组学数据,构建了“转录因子-基因-化合物”共表达网络,切实将候选基因的范围缩小到32条酶基因及28条编码转录因子的转录本。更重要的是,共表达网络筛分别筛选到7、4和4条目前在西红花苷合成途径中未被具体研究的关键酶基因β-GS、ADH和UGT。酿酒酵母的代谢工程研究显示筛选的CsADH酶可催化合成西红花酸,亦证实共表达网络筛选目标基因方法的可靠性。
  综合“基因-化合物”共表达网络分析及荧光定量PCR结果,指认AGL6b基因的表达与西红花酸随柱头发育的含量变化正相关。而AGL6基因属于MADS-box调控因子家族,该家族在多种模式植物中都表现出调控花发育的功能,由此推测:番红花AGL6b基因与西红花苷合成途径中的次生代谢产物积累有密切联系,可能是通过调控番红花花器官的发育,引起柱头生物量的改变而导致次生代谢物含量变化。因而对来自西红花转录组数据库中的17条MADS-box转录因子进行了系统的生物信息学分析,解读核苷酸序列,及对其编码的氨基酸序列的组成成分、理化性质、信号肽、导肽、跨膜结构域、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质的二级、三级结构及功能域进行预测分析,并将番红花和其他植物的MADS-box蛋白进行同源比对,同时构建了番红花和模式植物拟南芥MADS-box蛋白家族的系统进化树,其结果为今后进一步深入研究番红花MADS-box蛋白的生物学功能提供可靠的参考依据。
  整合共表达网络及番红花转录组,获得5条在番红花柱头中特异性高表达的MADS-box基因,命名为SCR(Stigma and Crocins Regulator)。为了验证此类基因对于番红花柱头发育或糖苷合成的调控作用,对所得序列进行克隆和分析,初步开展亚细胞定位及拟南芥过表达的实验。CsSCR基因编码的氨基酸分子量在25.0kDa左右,等电点在9.15左右,均为碱性蛋白。同时结构域分析发现5个蛋白都含有60个氨基酸组成的MADS结构域,以及其后都接有93个氨基酸大小的K-BOX结构域,证明5条蛋白都属于MADS转录因子家族。亚细胞定位实验结果证实5条番红花SCR蛋白的转录因子特性,其定位于细胞核中发挥转录调控作用;而拟南芥过表达实验发现,CsSCR3和CsSCR5可调控拟南芥花发育,导致早花现象出现。
  综上所述,本研究整合多重组学数据,报道了多个参与西红花苷合成途径的候选基因,为后续开展番红花有效成分生源途径解析奠定了基础,并提供了一个从柱头发育角度提高西红花苷含量的新型代谢工程研究视角。在此基础上培育高产优质番红花品系,切实提升番红花这一重要药用资源的品质,为做强做大番红花产业提供坚实的上游支撑。
[博士论文] 刘德芳
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性风湿免疫疾病,主要表现为反复的滑膜炎,导致多关节肿痛、变形、活动受限,往往演变成残疾,是致残率最高的关节疾病,严重影响了生活质量,是一种终身性疾病。目前RA的具体病因尚不明确。本课题根据湿性重浊粘滞,久湿形成毒,湿毒郁久化热致瘀,阻滞经脉筋肉,结合西方病因学说“体液论”,提出“湿毒入络”可能导致RA的病因学理论。湿毒入络,体液的流动或迁移可能刺激水通道蛋白(AQPs)的异常表达;RA的活动期炎性渗出,滑膜充血水肿,也可能伴随水的异常代谢。已有报道,AQPs在RA的发展过程中发挥着一定的作用,可介导其病理变化过程中的细胞迁移。另外,临床上尚无根治RA的办法,大多只停留在对症治疗,缺乏对因治疗。本课题针对RA的病因病机“湿毒入络”,拟方三黄一龙汤(SYD)联合甲氨蝶呤(MTX)治疗RA湿热痹阻证,从临床和动物实验两方面对RA发病机制和三黄一龙汤或联合MTX的作用机理进行了研究。
  方法:
  本课题的第一部分以RA湿热痹阻证患者的外周血和滑膜液作为研究对象,从细胞因子、AQPs及JAK-STAT通路的信号因子等的表达及调控方面进行了初步研究,主要采用ELISA法检测相关指标。第二部分复制出RA湿毒入络动物模型,以大鼠的外周血、骨关节、肺、脾、肾脏等作为研究对象,从炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK-STAT通路的信号因子及关节病理组织学的变化及调控进行了深入研究,采用了ELISA法、RT-PCR法及病理组织学等检测方法。
  结果:
  一、RA湿热痹阻证患者炎性因子、AQPs及JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿热痹阻证患者炎性因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者活动期关节肿胀指数、压痛指数以及ESR、CRP、DAS28明显升高;采用SYD联合MTX治疗,其关节肿胀指数、压痛指数及ESR、CRP、DAS28能较快较好地改善。(2)RA湿热痹阻证患者外周血TNF-α、IFN-γ较健康对照组显著升高,滑膜液TNF-α、IFN-γ较外周血明显升高。(3)采用SYD联合MTX治疗后TNF-α、IFN-γ显著下降。
  2、RA湿热痹阻证患者AQPs的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者外周血和滑膜液中AQP1、AQP2和AQP3的表达水平较健康者明显降低。(2)外周血中AQP1、AQP2、AQP3表达略高于滑膜液,以AQP1表达最多,AQP3次之,AQP2表达最少。(3)SYD联合MTX可以使RA湿热痹阻证患者低表达的AQP1、AQP2和AQP3上调。
  3、RA湿热痹阻证患者JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿热痹阻证患者STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1、SOCS-3的表达水平较健康者都降低,其中STAT1表达高于STAT3,PIAS1表达高于PIAS3,SOCS-1与SOCS-3表达相当。(2)RA外周血中STAT1、PIAS1、PIAS3、SOCS-1的表达高于滑膜液,而外周血中STAT3、SOCS-3与滑膜液中基本相当。(3)经SYD联合MTX治疗,RA湿热痹阻证患者外周血STAT1、STAT3、PIAS1、PIAS3、SOCS-1都下调,SOCS-3无明显变化。
  二、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子、AQPs、Na+,K+-ATPase、JAK-STAT通路信号因子及关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的调控作用及机制
  1、RA湿毒入络模型大鼠炎性因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠显示血小板数、中性粒细胞比率和单核细胞比率较正常组明显升高,淋巴细胞比率较正常组明显降低。SYD及SYD联合MTX能较好地降低中性粒细胞和单核细胞比率,上调淋巴细胞比率。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中IL-6和TNF-α表达水平较正常组都明显降低;骨关节中IL-6和TNF-α表达较正常组都明显升高。SYD及SYD联合MTX都能使外周血低下的IL-6和TNF-α上调,使骨关节中升高的IL-6和TNF-α下调。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血中VEGF表达较正常组无差异,而其骨关节中VEGF表达较正常组明显增多。SYD及SYD联合MTX均能使骨关节中增多的VEGF减少。(4)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组无差异;而其炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的含量较正常组明显减少。SYD联合MTX可促进炎性关节周围软组织中TGF-β1mRNA的表达。
  2、RA湿毒入络模型大鼠AQPs、Na+,K+-ATP酶的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3表达较正常组均明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠外周血中以AQP2表达最高,其次是AQP3;骨关节中以AQP3表达水平最高,其次是AQP2。(3)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中AQP1mRNA的含量较正常组明显减少,其肾组织AQP1mRNA的含量较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性较正常组明显减退。(5)SYD及SYD联合MTX都能较好地促进RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中AQP1、AQP2、AQP3的表达,SYD联合MTX还能显著地增强肺组织AQP1mRNA的表达。(6)SYD及SYD联合MTX能显著地提高RA湿毒入络模型大鼠脾脏组织Na+,K+-ATP酶的活性。
  3、RA湿毒入络模型大鼠JAK-STAT通路信号因子的变化及三黄一龙汤或联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3表达较正常组明显降低;骨关节中JAK1、JAK3表达较正常组明显升高;JAK2表达较正常组明显降低。(2)RA湿毒入络模型大鼠肺组织中JAK3mRNA的含量较正常组无差异;肾组织中JAK3mRNA的含量较正常组明显增多。(3)RA湿毒入络模型大鼠外周血和骨关节中STAT1表达较正常组无差异。(4)RA湿毒入络模型大鼠外周血中STAT3表达较正常组明显降低;骨关节中STAT3表达较正常组无差异。(5)SYD及SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠外周血中JAK1、JAK2、JAK3及骨关节中JAK2的表达上调。(6)SYD联合MTX可使RA湿毒入络模型大鼠骨关节中升高的JAK1、JAK3表达下调。(7)SYD及SYD联合MTX能上调外周血STAT3的表达。(8)SYD及SYD联合MTX能抑制肾组织中JAK3mRNA的表达。
  4、RA湿毒入络模型大鼠关节病理组织学的变化及三黄一龙汤联合MTX的影响
  (1)RA湿毒入络证模型大鼠关节组织病理学表现为巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。(2)SYD联合MTX能抑制RA湿毒入络模型大鼠关节纤维组织的增生和淋巴细胞的浸润。
  结论:
  本研究证实了湿毒入络是RA的基本病机。湿毒入络诱导RA发病与AQPs、Na+,K+-ATP酶、JAK等密切相关,表现出外周血、骨关节及肺脾肾脏等组织器官中AQP的亚型AQP1、AQP2、AQP3及AQP1mRNA表达减少,Na+,K+-ATP酶活性减退,骨关节促炎性细胞因子IL-6、TNF-α和血管内皮生长因子(VEGF)产生增多,软组织TGF-β1mRNA减少,信号因子JAK1、JAK3及JAK3mRNA异常表达,关节巨噬细胞浸润伴纤维组织增生。印证了肺主通调水道、脾主运化功能参与了RA湿毒入络的发生发展过程。证明了三黄一龙汤及三黄一龙汤联合MTX能较好地降低RA的关节肿胀、压痛指数,降低ESR、CRP、DAS28等炎症指标,抑制外周血和骨关节炎性细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ和血管内皮生长因子(VEGF)产生,促进TGF-β1mRNA分泌,增强外周血和骨关节AQP1、AQP2、AQP3及肺脏AQP1mRNA的表达,提高脾脏Na+,K+-ATP酶的活性,调控信号因子JAK1、JAK2、JAK3及STAT3等的表达。可作用于多组织器官,多靶点进行调节,增强组织细胞的代谢,缓解关节滑膜炎症,抑制滑膜组织血管新生。这为临床推广应用提供了理论依据。
[硕士论文] 刘世钰
药物分析 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目前,抑郁症作为21世纪全球第4大疾患,全世界一共有3.4亿人患病,发病率高达11%,严重的威胁人类健康、给社会造成了严重经济负担。抑郁症主要表现为情绪低落、思维迟缓、心境低落、认知活动减退并伴有严重的躯体症状。抑郁症不仅严重的影响了患者的生存状态,生活质量,而且也对患者的家庭造成了巨大的经济负担。虽然近年来对抑郁症的发病机制、诊断和治疗的研究从未间断,但是研究现状并不乐观,对于抑郁者的病理机制了解还不够透彻,诊断方法和手段还有待从主观臆断向客观证实转变。抑郁症的治疗效果也很不理想,有效率低,复发率高。因此,研究抑郁症的发病机制、阐述药物作用机理对于抑郁症的诊断和治疗具有重要的意义。
  养心氏片是一种由淫羊藿、党参、黄芪、丹参、地黄、葛根、山楂、当归、延胡索(炙)、黄连、灵芝、甘草(炙)、人参这13味中药组成的中药复方制剂。在临床上养心氏片被主要用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心力衰竭及合并高血脂、高血糖等疾病。根据祖国医学的“双心理论”以及血管性抑郁发展的前后因果关系,发现临床上养心氏片不仅可以用于治疗心血管疾病,而且还应该可以治疗继发于心脑血管疾病的抑郁症。
  本课题采用双侧颈总动脉结扎的全脑缺血(GCI)方法来建立血管性抑郁小鼠动物模型并进行了验证,对养心氏片治疗血管性抑郁进行了药效作用评价,根据养心氏片组、假手术组、模型组、氟西汀组的对比,从小鼠的旷场实验、悬尾实验两种行为学评价以及血清中相关因子NA、DA、5-HT、TNF-α、IL-1β、IL-6含量变化可以得出养心氏片确实有类似于阳性药氟西汀的抗抑郁作用。
  为了进一步研究养心氏片治疗血管性抑郁的药理作用机制,本研究利用液-质联用质谱分析平台进行ITRAQ标记的蛋白组学分析和代谢组学分析,一共筛查到400个差异蛋白质和38个差异代谢物。运用软件DAVID6.8进行GO和KEGG-PATHWAY蛋白组学分析,并对蛋白组学结果进行了qPCR验证。根据筛查的蛋白质以及其下游的差异代谢物,并查阅大量文献,进行了蛋白组学-代谢组学整合分析,通过不同层次的生物分子之间的关联研究,发现养心氏片治疗抑郁症影响了Ca2+相关信号通路传递、兴奋性神经递质的转运和释放、神经可塑性调节,氨基酸、能量的代谢等过程,并改善了神经细胞营养和功能。
[硕士论文] 余嘉惠
中医学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究目的:课题组前期发现lncRNA-ncRuPAR在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,且与胃癌的浸润程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤的大小及TNM分期密切相关,临床有效方药“滋阴化痰方”可抑制胃癌细胞增殖。本课题旨在通过一系列体内外实验探究ncRuPAR与胃癌增殖、侵袭、转移、凋亡的关系及其可能的作用机制,并验证“滋阴化痰方”是否通过干预ncRuPAR发挥其对胃癌的治疗作用,以期深化对胃癌发病分子机制的认识,并为阐释滋阴化痰方可能的作用机制提供数据支持。
  研究方法:(1)通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qPCR)技术检测AGS,HGC27,MKN45,MGC8034株胃癌细胞中ncRuPAR的表达水平。(2)重组慢病毒LV-NCRUPAR(15034-1)和LV-NCRUPAR-CON分别感染HGC27细胞,构建HGC27过表达细胞株HGC27-ncRuPAR及对照细胞株HGC27-Empty Vector;重组慢病毒LV-NCRUPAR-RNAi和LV-NCRUPAR-RNAi-CON分别感染MGC803细胞构建MGC803干扰细胞株MGC803-ncRuPAR-RNAi及对照细胞株MGC803-Empty Vector,嘌呤霉素2μg/mL筛选72h后形成慢病毒感染表达稳定株,qPCR检测各稳株中ncRuPAR的表达量。(3)CCK-8法检测ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803增殖的影响;流式细胞计数仪分析ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;细胞划痕实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803迁移能力的影响;Transwell实验观察ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803侵袭能力的影响。(4)将HGC27-ncRuPAR,HGC27-Empty Vector及HGC27-Control细胞株分别在裸鼠皮下接种造HGC27皮下移植瘤模型,观察各组裸鼠一般情况及比较瘤体体积和质量,比较ncRuPAR对HGC27皮下移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。(5)Affymetrix基因表达谱芯片技术筛选HGC27-ncRuPAR细胞株和HGC27-Empty Vector细胞株之间差异表达基因,并将芯片分析的差异基因结果进行IPA(Ingenuity Pathway Anaylsis,IPA)分析,推测ncRuPAR影响胃癌细胞增殖凋亡的可能通路;Western blot实验检测ncRuPAR对HGC27和MGC803细胞中PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响。(6)中药“滋阴化痰方”干预HGC27和MGC803细胞株,CCK-8法检测细胞增殖变化,观察滋阴化痰方对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞计数仪分析滋阴化痰方对胃癌细胞HGC27和MGC803周期和凋亡的影响;qPCR检测滋阴化痰方对胃癌细胞ncRuPAR表达的影响,观察滋阴化痰方是否对ncRuPAR的表达存在调控作用;Western blot验证滋阴化痰方对PAR-1蛋白及PI3K/Akt信号通路及其下游蛋白CyclinD1和Bcl-2表达的影响,探究滋阴化痰方可能的作用机制。
  研究结果:(1)qPCR结果显示:ncRuPAR在HGC27细胞中低表达,在MGC803细胞中高表达。(2)选择HGC27细胞构建ncRuPAR过表达稳定株,选用MGC803细胞构建ncRuPAR干扰稳定株,qPCR验证ncRuPAR过表达及干扰稳株构建成功。(3)CCK-8和流式细胞周期结果显示:过表达ncRuPAR可抑制HGC27细胞的增殖,使细胞周期阻滞于G1期,并促进其凋亡,而干扰ncRuPAR表达则抑制MGC803细胞增殖、减少细胞凋亡。划痕实验和transwells实验结果显示:ncRuPAR对胃癌细胞HGC27和MGC803的迁移及侵袭能力影响不显著。(4)体内实验中,HGC27-ncRuPAR组与对照组相比,实验组裸鼠成瘤减慢,瘤体减小。(5)Western blot结果显示:过表达ncRuPAR使HGC27细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达下降;而干扰ncRuPAR则可使MGC803细胞中PAR-1、PI3K、p-Akt、CyclinD1蛋白的表达升高。(6)中药“滋阴化痰方”作用于胃癌HGC27和MGC803细胞,CCK-8和流式细胞周期结果显示:中药“滋阴化痰方”可以抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡;qPCR结果显示滋阴化痰方可以增加胃癌细胞中ncRuPAR的表达;Western blot结果显示滋阴化痰方可以抑制PI3K、p-Akt、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表达。
  研究结论:ncRuPAR可通过下调PAR-1的表达和抑制PI3K/Akt通路发挥其抑制胃癌细胞增殖及促凋亡作用。上调ncRuPAR的表达和抑制PI3K/Akt通路是中药“滋阴化痰方”抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的可能分子机制之一。
[硕士论文] 樊逸夫
中西医结合临床 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  长期以来,中医药一直是治疗肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要力量。在国内,中医药被广泛应用于肝癌预防和治疗的全过程,尤其在晚期肝癌中的应用更为常见。多年的中西医结合研究为临床提供了为数不少的成药、验方,其疗效也逐步得到认可。2011年中国卫生部颁布的《原发性肝癌诊疗规范》明确将中医药列入晚期肝癌的系统治疗,并指出中医药“可以改善癌症相关症状和生活质量,可能延长生存期,可以作为肝癌治疗的重要辅助手段”。
  中药解毒颗粒是我科开发的院内制剂,在我科的日常肝癌防治中应用广泛,经过十几年的临床验证,疗效确切。但其作用机制尚不明确。众所周知,中药复方成分复杂,需要煎煮后,经患者口服,并通过肠道吸收代谢后发挥疗效,这就使其有效成分、及后续作用机制的研究变得相当复杂。近年来,肠道菌群与肿瘤相关联的研究备受关注,肠道也是中药吸收代谢的必经之地,因此,本课题想从肠道菌群的角度去探讨口服解毒颗粒所产生的影响。
  此外,免疫治疗是近年来治疗晚期肝癌的重要手段之一。其中,免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade)是当下研究的热门。细胞毒T淋巴细胞抗原-4(lymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)及程序性细胞死亡受体1(programmed cell death protein1,PD-1)是常见的阻断靶点;阻断CTLA-4及PD-1,可以通过影响T细胞功能发挥抗肿瘤作用。有文献报道,肠道菌群可增强上述靶点的抑制剂的作用。因此,本课题以免疫检查点阻断为切入点,探讨解毒颗粒对CTLA-4及PD-1的调节作用。
  目的:
  1、观察解毒颗粒对晚期肝癌患者肠道菌群的影响。2、研究解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4与PD-1表达的调节作用。
  方法:
  1、选取年龄≥18岁、巴塞罗那临床肝癌分期为C期(BCLC-C)的HCC患者,随机分为解毒颗粒组和对照组,每组各10例。解毒颗粒组每日冲服解毒颗粒,早晚各一次;解毒颗粒组服药前留取一次粪便,服解毒颗粒后一个月与两个月各留取一次粪便,共三次。对照组不服用解毒颗粒,共留取三次粪便,每次间隔一个月。解毒颗粒组服药前留取一次静脉血,两个月后再留取一次静脉血,共两次。对照组共留取两次静脉血,间隔两个月。
  2、采用16S多样性测序分析对收集的粪便标本分别进行DNA提取、质量检测、测序,通过各菌属丰度产生的变化,观察解毒颗粒对肠道菌群所产生的影响,并通过SPSS21.0(IBM Corp)软件对数据进行统计学分析。两组细菌丰度治疗前后的变化趋势使用重复测量的多因素方差分析(ANOVA of repeated measurement data);菌属OTU水平的差异分析使用Kruskal-Wallis检验法(Kruskal-Wallistest)。
  3、采用流式细胞术探讨解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4及PD-1表达的影响。
  结果:
  1、解毒颗粒组的患者在服药前所具有的与肠癌、肝癌发病相关的梭菌属Ⅺ(ClostridiumⅪ)及消化链球菌科细菌(Peptostreptococcaceae)在服用解毒颗粒后一个月与两个月均消失不见,而在对照组中,上述两菌治疗前后无明显变化。2、对照组中,可以增强肝癌免疫抑制剂疗效的拟杆菌属细菌(Bacteroides)的占比随时间变化呈明显减少趋势,在各个时间点拟杆菌属细菌的占比差异具有统计学意义(P<0.001)且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.032)。而解毒颗粒组中拟杆菌属细菌的占比随时间变化并不明显。3、在解毒颗粒组中,可产生丁酸从而起到抗结肠癌作用的有益菌罗氏菌属细菌(Roseburia)随着时间变化,其占比呈增加趋势;而在对照组中,罗氏菌属细菌的占比随着时间变化呈减少趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.029)。4、在解毒颗粒组中,与结直肠癌相关的普氏菌属细菌(Prevotella)的占比随时间变化呈减少趋势;而在对照组中,普氏菌属细菌的占比随时间变化呈增加趋势。虽然普氏菌属细菌的占比在两组中的变化趋势比较明显,两组在时间、时间与分组的因素上的差异并无统计学意义。5、在解毒颗粒组中,与结直肠疾病相关的毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae)的占比随时间呈轻微减少趋势;而在对照组中,毛螺旋菌科细菌的占比随时间变化呈增加趋势,且时间与分组存在交互作用,时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.044)。6、随着时间的变化,解毒颗粒组的物种比起对照组更为相似。7、对照组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度呈增长趋势;而在解毒颗粒组中,晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度较前变化不大或呈减少趋势。两组患者外周血CD4+和CD8+的细胞中PD-1的阳性率及平均荧光强度变化趋势均不明显。
  结论:
  通过观察中药解毒颗粒对BCLC-C肝癌患者肠道菌群的影响,发现解毒颗粒对有益菌拟杆菌属及罗氏菌属细菌有良性促进作用,对有害菌梭菌Ⅺ及消化链球菌科细菌可能有抑制作用,其中拟杆菌属与肝癌的免疫治疗疗效密切有关。还发现解毒颗粒对患者外周血CD4+和CD8+细胞中的免疫抑制蛋白CTLA-4的表达具有一定的抑制作用,该结论有待进一步的大样本实验进行验证。
[硕士论文] 李云海
生物化学与分子生物学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:地球的两极具有独特的气候及地理特征,赋予了极地微生物特殊的生物学特性。极地微生物资源的开发和应用日益受到国内外科研人员的广泛关注。有关极地微生物的药用资源开发与活性化学成分研究,也引起了当下天然产物研究者的广泛兴趣。
  在前期研究中,本课题组从多株极地微生物样品中筛选了两株具有多种细胞毒活性的极地海洋真菌Aspergillus sp.S-3-62和Geomyces sp.3-1。基于此背景,本文展开了对这两株真菌的发酵产物的化学成分研究。首先对菌株Aspergillus sp.S-3-62进行了发酵培养基的初步优化。采用OSMAC策略,在相同的培养条件下,选取5种不同培养基,通过比较发酵终点pH值、菌丝体干重、发酵液的总提物重量、总提物组分分布(TLC和HPLC-UV)得出最佳发酵条件为:采用改良察氏液体培养基,温度24℃,接种量10%,转速120r/min,振荡培养8d。
  菌株Aspergillus sp.S-3-62按优化后的条件规模发酵350L,发酵结束后将发酵液高速离心,分别获得菌丝体和菌液,菌液部分用等体积乙酸丁酯萃取3次,40℃减压浓缩后获得42g浸膏;将菌丝体部分以1∶5的比例浸泡于无水乙醇中,超声提取(40min/次,共两次),过滤,得上清液进行减压蒸馏,除去有机溶剂,加蒸馏水混悬,再用乙酸乙酯(体积比1∶1)萃取3次,获得浸膏8g。合并两部分浸膏,共获得粗提物浸膏约50g。菌株Geomyces sp.3-1通过分批摇瓶发酵共获得发酵液42L,采用同上方法分别将菌液和菌体用有机溶剂提取后再合并,共得到粗提物浸膏9.3g。
  采用正相硅胶柱层析、C18反相硅胶柱层析、LH-20凝胶柱层析和高效液相HPLC等色谱技术,从两株极地真菌中获得单体化合物30余个。通过现代波谱分析手段,采用包括一维核磁共振(1D-NMR)、二维核磁共振(2D-NMR)以及高分辨质谱(HR-ESI-MS)等方法,并结合相关的文献数据报道,共鉴定了两株菌种共18个化合物的结构,他们分别为:β-carboline(1),N-(2-Hydroxypropanoyl)-2-aminobenzoic acid amide(2),Cyclo-(Pro-8-hydroxy-Ile)(3),Cyclo-(Pro-Ile)(4),2-Acetyl-4(3H)-quinazolinone(5),4-Hydroxybenzaldehyde(6),Benzeneacetic acid,2-hydroxy-1-methylpropyl ester(7),PalitantinA(8),Palitantin B(9),Palitantin(10),Paulownin(11),Demethylincisterol A3(12),Ergosta-7,22-dienen-3,6-dione(13),Citreoanthrasteroid B(14),19-Norergosta-5,7,9,22-tetraene-3β-ol(15),(22E)-5α,8α-Epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol(16),(3β,5α,6β,22E)-6-Methoxyergosta-7,22-diene-3,5-diol(17)和Ergosta-7,22-dien-3β-ol(18)。其中化合物8(Palitantin A)和9(Palitantin B)为新化合物,化合物7为首次从天然产物中分离得到,化合物12-17是首次报道的极地来源的地丝霉属真菌代谢产物。
  对这些化合物进行了一系列的生物学活性评价,其中包括肿瘤细胞毒活性、蛋白酪氨酸磷酸1B酶(Protein Tyrosine Phosphatase-1B,PTP-1B)抑制活性和抗菌活性研究。
  结果表明:化合物10、11和12有较强的PTP-1B抑制活性,IC50分别为23.74±0.43μM、34.32±0.28μM和17.24±0.28μ,M,稍弱于阳性对照(齐墩果酸的IC50为8.31±0.31μM)。化合物12有一定的抑制人胃癌细胞SGC-7901和人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用,IC50为13.94±0.33μM和11.40±0.41μM(紫杉醇的IC50分别为1.59±0.25μM和0.36±0.10μM);抗菌实验结果表明,化合物12对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli),均有较强的抑制作用,最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)分别为9.97μM、7.79μM和7.79μM;而其余化合物,则活性不强。
[硕士论文] 李安
药学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:研究背景:
  海蛇中富含具有药用价值的抗炎活性分子,其作用机理和作用靶点尚不明晰。青环海蛇(Hydrophis cyanocinctus)是分布于中国东南沿海的一种优势蛇种,自古以来就在中国被用作食材和药材,也是被收录入《本草纲目》的17种蛇中的其中一种,其蛇毒毒素中含有许多生物活性蛋白质和多肽,在缓解类风湿关节炎、关节痹痛和自身免疫性炎症疾病中有着良好的功效。由于蛇毒中抗炎活性组分的理化性质比较接近,且有些成分丰度很低,通过传统的色谱技术难以分离获得单一组分的蛇毒来进行结构、功能和机制方面的研究。本课题组前期利用噬菌体展示文库技术,建立了以人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(TNFR1)为靶点淘选海蛇蛇毒抗炎活性成分的方法,获得了22氨基酸的抗炎活性肽Hydrostatin-SN1,通过同源建模、肽链截短并利用细胞模型及LPS诱导的小鼠急性休克模型筛选截短肽,得到了靶点特异性更强的十肽Hydrostatin-SN10。在胶原诱导关节炎(CIA)动物模型和炎症性肠病(IBD)动物模型中,Hydrostatin-SN10都具有显著的抗炎效应,有望研发成为治疗TNF-α受体(TNFRs)相关炎症性疾病的新型靶向特异性海洋多肽类药物。
  TNF-α与两型TNF受体(TNFR1和TNFR2)的相互作用及下游信号通路的异常激活是类风湿关节炎、溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病发生发展的重要因素。先导肽Hydrostatin-SN1与TNFR1、TNFR2均有一定的结合能力,并能拮抗TNF-α与TNFR1/TNFR2的相互作用,而Hydrostatin-SN10与TNFR1的亲和力更强,且在细胞水平实验中能够在一定浓度范围内抑制TNFR1介导的下游NF-κB及MAPKs信号通路。但Hydro statin-SN10的靶点专一选择性尚无明确验证,即是否与TNFR2结合、能否竞争性抑制TNF-α与TNFRs的相互作用尚没有进行验证。同时,TNFR1与Hydrostatin-SN10的结合部位、结合模式和相互作用氨基酸亦不明确。因此,验证Hydrostatin-SN10的受体选择性,并探究Hydrostatin-SN1/SN10同TNFR1结合的复合物构象,将为阐明Hydrostatin-SN10特异性拮抗TNFR1发挥抗炎作用的分子机制打下重要的基础。
  研究目的:
  确证Hydrostatin-SN10对靶点TNFR1拮抗作用的专一性,利用结构生物学的方法测定TNFR1-SN10复合物的三维结构,找到多肽与受体的结合位点和关键作用氨基酸,进一步揭示Hydrostatin-SN10选择性拮抗TNFR1的分子机制,为多肽的结构改造以及新型TNFR1选择性抑制剂的研发奠定生物学基础。
  研究方法:
  1、利用多种生物分子相互作用测定技术检测Hydrostatin-SN10分别与TNFR1、TNFR2和TNF-α的相互作用,获得亲和力常数、结合动力学参数和热动力学参数等数据,分析结合方式与性质,并以竞争性结合的方法观察Hydrostatin-SN10是否可以阻断或抑制TNF-α与TNFR1/TNFR2的相互作用。
  2、通过不依赖连接酶的克隆(Ligation-Independent Cloning,LIC)构建人TNFR1胞外区(sTNFR1)蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中表达sTNFR1,摸索合适的诱导表达条件;经过亲和层析、离子交换层析和分子筛层析对目的蛋白进行精细纯化,获得高纯度的sTNFR1蛋白。
  3、等温滴定量热法(ITC)鉴定体外表达的sTNFR1与TNF-α结合的生物学活性;微量差示扫描荧光技术(nanoDSF)筛选目的蛋白稳定性最高的缓冲液条件。
  4、将sTNFR1与多肽Hydrostatin-SN1/SN10共孵育,采用悬滴法进行sTNFR1-SN10复合物共结晶和sTNFR1单晶生长的大规模条件初筛,对部分较好的结晶条件进行优化,培养高质量的蛋白晶体。
  5、使用同位素标记的氮源和碳源在M9培养基中表达和纯化15N、13C标记的sTNFR1蛋白;构建麦芽糖结合蛋白(MBP)和Hydro statin-SN10的融合表达载体,表达纯化15N、13C标记的重组多肽Hydrostatin-SN10。
  6、运用核磁共振技术(NMR)分别测定15N-sTNFR1和15N-SN10的2D1H-15N HSQC波谱,然后加入相应的未标记配体进行二维滴定,分析化学位移情况,验证sTNFR1与Hydrostatin-SN10结合的热点区域(hot spots)氨基酸;将15N、13C双标记的蛋白和多肽孵育,收集NMR波谱数据,解析复合物的溶液三维结构。
  研究结果:
  1、利用表面等离子共振(SPR)、微量热泳动(MST)、和等温滴定量热法(ITC)验证Hydrostatin-SN10的靶点专一性。SPR实验表明,Hydrostatin-SN10能特异性结合TNFR1,而和TNFR2、TNF-α没有特异性结合;Hydrostatin-SN10能够竞争性抑制TNF-α与TNFR1的相互作用,而对TNF-α与TNFR2的结合没有影响。MST结果显示,Hydrostatin-SN10与TNFR1有特异性结合,亲和力KD值(平衡解离常数)为2.83μM;Hydrostatin-SN10与TNFR2和TNF-α没有相互作用。ITC结果表明,Hydrostatin-SN10与TNFR1存在相互作用,亲和力约为2.29μM,与TNFR2、TNF-α没有结合。
  2、成功构建人TNFR1胞外区蛋白的原核表达载体pMCSG7-sTNFR1-161、pMCSG7-sTNFR1-190、pMCSG7-sumo-sTNFR1-161和pMCSG7-sumo-sTNFR1-190。使用LB培养基在大肠杆菌BL21中表达,优化了诱导表达温度、诱导时间和诱导剂浓度。确立了目的蛋白的变性、复性缓冲液体系,通过镍柱亲和层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化获得了高纯度(>97%)的sTNFR1蛋白,其产量约为7.3mg每升菌液。
  3、ITC验证结果表明,体外表达的重组sTNFR1-161、sTNFR1-190蛋白与TNF-α有良好的结合能力,KD值分别为154.8nM和190.1nM,与文献报道水平数量级一致。
  4、nanoDSF确定了目的蛋白用于结晶实验的缓冲液条件:20mM Tris-HCl pH7.5,150mM NaCl,在这个溶液中sTNFR1的Tm值为77.67±0.05℃。使用96孔悬滴板进行结晶条件初步筛选,找到了sTNFR1和TNFR1-SN10复合物的多个结晶条件,对生长较好的条件进行优化,获得了sTNFR1蛋白的高质量晶体(0.2mm×0.2mm×0.1mm)。目前TNFR1-SN10复合物的晶体正在继续优化中。
  5、收集sTNFR1晶体的X射线衍射数据,通过分子置换法解析数据,得到sTNFR1的高分辨率(1.69(A))三维结构,与已报道的TNFR1胞外区晶体结构(PDB编号:1NCF)进行叠合比对后显示二者构象基本一致。
  6、使用M9培养基和15N-NH4Cl、13C-葡萄糖对sTNFR1进行同位素标记并成功表达纯化出了15N-13C-sTNFR1蛋白(纯度>98%);构建了MBP-多肽的融合表达载体pMCSG9-SN10,体外表达纯化得到了15N、13C标记的重组多肽SN10,用于NMR实验。
  研究结论:
  本研究一方面证明了青环海蛇蛇毒多肽Hydrostatin-SN10能够专一性结合TNFR1,不与TNFR2或TNF-α结合,并且SN10能够选择性地阻碍TNF-α与TNFR1的相互作用;另一方面获得了多肽SN10与TNFR1复合物的初筛晶体,以及同位素标记的重组蛋白sTNFR1和重组多肽SN10,为进一步的结构生物学探索和SN10抗炎机理的揭示奠定了基础。
[硕士论文] 张艳达
内科学(心血管病) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:在急性心肌梗死患者中,其冠脉微血管系统常由于缺血再灌而发生不可逆损伤,最终导致缺血心肌血流供应再度减少,加重损害。相对于大血管,微循环约占机体脉管系统的20%,其在心肌组织中与心肌细胞的比例接近1∶1,但其作用尤其在冠脉血管疾病中的作用长久以来一直被人们所忽视。随着研究的深入,临床医生越来越认识到冠脉微循环障碍的重要性。由于相关的机制不清,当前尚缺乏有效手段来直接干预冠脉微循环障碍。因此,探究冠脉微循环障碍的发病机制及探寻行之有效的治疗举措便显得尤为重要。麝香通心滴丸已在临床上被证实具有明确的改善冠脉慢血流患者症状的作用,但是其是否通过直接作用于微循环,以及具体的作用的机制尚不清楚。本课题将探究麝香通心滴丸对模型小鼠的外周微循环障碍的改善作用及其可能作用的机制?
  目的:
  明确麝香通心滴丸溶液对急性心肌梗死联合腹腔脂多糖注射诱导的小鼠外周微循环障碍的改善作用并探讨其相关机制。
  方法:
  1、诱导小鼠外周微循环障碍模型:选用6周至8周C57雄性小鼠(20±2g)50只,随机分为假手术对照组(Control组)、微循环障碍模型组(急性心梗联合脂多糖诱导(MI+LPS)组)、模型联合麝香通心滴丸干预(SXTXDW)组、模型联合麝香通心滴丸及炔丙基甘氨酸干预(SXTXDW+PAG)组、模型联合硫氢化钠干预(NaHS)组。假手术对照组小鼠在异氟烷麻醉下行开胸但冠状动脉不结扎处理,而后四组小鼠在气麻下行冠脉前降支结扎手术,以标准Ⅱ导心电图ST段抬高作为判定标准。心梗手术1周后予以假手术对照组小鼠腹腔注射200ul生理盐水,而MI+LPS组、SXTXDW组、SXTXDW+PAG组和NaHS组小鼠腹腔注射脂多糖溶液(2mg/kg)。采用Evan Blue合并TTC染色、小动物心电图评估小鼠心肌梗死情况,小动物超声评估小鼠心功能。
  2、麝香通心滴丸改善模型小鼠外周微循环的作用:腹腔注射LPS24小时后给予不同组的小鼠相对应的干预措施。采集图像并分析提睾肌微循环血流速度和白细胞粘附数。运用激光多普勒测定小鼠肠管血流灌注情况。通过流式细胞仪检测小鼠白细胞表面CD11b和CD62L表达改变。实验终点,处死小鼠,留取提睾肌、心肌、白细胞和主动脉标本,检测以上标本CSE相对表达量。
  3、麝香通心滴丸改善模型小鼠外周微循环的可能分子机制:通过DAPI染色评估不同干预组小鼠白细胞体外粘附水平,并对可能参与调解的FOXO1相对表达量及其线粒体DNA相对拷贝数进行分析。
  结果:
  1、与Control组相比,MI+LPS组小鼠心功能、提睾肌微血管血流速度和肠管血流灌注量明显降低(p<0.05)。提示:急性心梗手术合并腹腔注射脂多糖可诱导小鼠外周微循环障碍。
  2、与Control组相比,MI+LPS组小鼠及SXTXDW+PAG组小鼠微循环血流速度和肠管血流灌注显著降低,同时伴有微循环中白细胞粘附数目增加,白细胞表面CD11b表达异常增高,CD62L表达下调。无论是SXTXDW还是NaHS都可显著提高小鼠提睾肌微循环血流速度和肠管血流灌注,降低白细胞粘附,以及白细胞表面CD11b的表达,上调CD62L的表达(p<0.05)。与Control组相比,MI+LPS组小鼠提睾肌、心肌和白细胞CSE表达减弱,而SXTXDW干预则可上调提睾肌、心肌和白细胞CSE的表达(p<0.05)。提示:麝香通心滴丸可显著改善小鼠外周微循环障碍,其机制可能涉及硫化氢相关通路。
  3、与Control组相比,MI+LPS组小鼠白细胞体外粘附数目增多,白细胞FOXO1表达增强,白细胞线粒体DNA相对拷贝数显著减少(p<0.05)。而SXTXDW干预则可降低白细胞体外粘附数目减少,下调白细胞FOXO1表达,提高白细胞线粒体DNA相对拷贝数(p<0.05)。提示:麝香通心滴丸可以显著降低体外白细胞粘附数,并可提高线粒体活力。
  结论:
  麝香通心滴丸通过促进内源性硫化氢合成,下调白细胞FOXO1表达,从而改善白细胞CD11b表达以及白细胞线粒体活力,进而发挥改善微循环的作用。
[硕士论文] 于宗民
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  基于甘草酸与HMGB1的对接研究结果,及HMGB1与抑郁行为发生的研究进展,本课题选择与蛋白HMGB1相互作用的核心骨架甘草次酸(甘草酸的苷元部分)为先导结构进行优化修饰并考察衍生物的抗抑郁活性。在保留甘草次酸五环三萜母核结构,主要药效基团11位羰基及30位羧基的前提下,重点对甘草次酸A环展开结构修饰。借鉴已有报道中关于三萜酸A环与杂环稠合可提高抗炎活性的研究,尝试将不同杂环结构与甘草次酸A环稠合进而考察这些衍生物的抗抑郁活性。期望A环特定稠合杂环结构及侧链结构的引入能够增强目标化合物与HMGB1的相互作用,同时通过调节目标化合物的脂水分配系数,改善其透过血脑屏障的能力进而更利于其发挥抗抑郁活性,为寻找新型抗抑郁先导化合物提供新的证据。
  方法与结果:
  1、甘草次酸衍生物的设计与合成。通过酯化、氧化、亲核取代、环合及水解反应在甘草次酸A环引入吡唑环、取代吡唑环、吲哚环、取代吲哚环及异噁唑环,得到16个甘草次酸衍生物。以甘草酸、甘草次酸及甘珀酸为阳性对照,在RAW264.7细胞上通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测目标化合物抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β释放的能力,同时检测了目标化合物对NO释放能力的影响。结果表明,N-苯基取代吡唑稠合类衍生物在30μM和10μM浓度条件下表现出较好的抗炎活性。根据这一结果,进一步选择“N-苯基取代吡唑”作为优选结构进行修饰,通过在苯基上引入不同性质的取代基,共合成得到了21个全新结构的N-苯基取代吡唑A环稠合甘草次酸衍生物。所有关键中间体及目标化合物结构均经核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱确证。
  2、甘草次酸衍生物的体外活性研究。将合成得到的衍生物及阳性对照药共计39个化合物在RAW264.7细胞和BV2细胞上进行抗炎活性测试。采用流式细胞技术检测目标化合物抑制RAW264.7细胞释放炎性因子TNF-α、IL-6的能力。结果表明,在30μM和10μM浓度条件下,GA-21T、GA-25T、GA-51T等20个N-苯基取代吡唑稠合类衍生物表现出较强抗炎活性,其中衍生物GA-21T、GA-51T在10μM浓度以下仍能表现出一定的抗炎活性。进一步将抗炎活性较好的20个衍生物在BV2细胞上通过ELISA检测其抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放的能力。结果表明,衍生物GA-25T在BV2细胞上表现出较好的抗炎活性,特别是在10μM浓度条件下,其抗炎效果和氟西汀相当。综合两种细胞的筛选结果,最终确定衍生物GA-21T、GA-25T、GA-51T为优选化合物(三个优选化合物与HMGB1的结合实验正在进行中)。
  3、优选化合物的体内抗抑郁活性评价。采用LPS造模后脑内直接给药以及rHMGB1造模后腹腔给药两种方式来评价优选化合物的体内抗抑郁活性。LPS造模后脑内直接给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以明显改善LPS诱导的抑郁样行为。rHMGB1造模后腹腔给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以明显改善rHMGB1诱导的抑郁样行为。进一步体内实验研究正在进行中。
  4、优选化合物的计算机模拟分子对接研究。通过计算机模拟分子对接技术将优选化合物GA-21T与HMGB1进行模拟对接研究。从分子对接角度阐述优选化合物与HMGB1的结合模式,结果表明优选化合物GA-21T与HMGB1之间有氢键作用,且与甘草酸和甘草次酸的结合模式相似。进一步对接研究正在进行中。
  结论:
  综上所述,本研究以甘草次酸为先导化合物,通过对其A环进行杂环稠合修饰及引入侧链结构,共合成得到了36个甘草次酸衍生物。体外抗炎活性测试表明部分目标化合物具有显著抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放的能力。进一步体内抗抑郁活性评价显示,优选化合物GA-21T可以明显改善LPS及rHMGB1诱导的抑郁样行为。本论文的研究内容具有重要的参考价值,研究结果为寻找新型基于活性天然产物HMGB1抑制剂型抗抑郁先导化合物提供了新的证据。进一步体内抗抑郁活性验证及优选化合物与HMGB1结合活性测试实验正在进行中。
[硕士论文] 吴然
药物化学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:中药复方化学成分的分析和鉴定有助于揭示复方的药效物质基础,从而进一步阐明其多成分、多靶点、多途径的作用特点。但由于复方中体外化学成分结构的多样性,体内活性成分复杂的基质效应以及代谢产物的微量性等特点,如何全面、高效地分析和鉴定中药复方的体内外化学成分是中医药现代化研究的关键问题。
  芪精升白颗粒(Qi-Jing-Sheng-Bai granule,QJSB)是治疗放化疗之后白细胞减少症的中药升白剂,该方由黄芪、鹿角胶、西洋参、淫羊藿、当归、黄精、墨旱莲、枸杞子、补骨脂、鸡血藤十味药材按照6∶1∶2∶3∶2∶2∶3∶2∶2∶6的比例配伍而成,临床效果显著。由于芪精升白颗粒体内外主要化学成分研究不明确,限制了其作用机制的科学阐释,更阻碍了芪精升白颗粒的产业化与国际化。
  本课题以芪精升白颗粒为研究对象,综合运用各种指导理论及先进技术,从芪精升白颗粒体外成分、入血原型成分及其代谢产物等多个方面阐明其潜在的活性物质。具体研究内容如下:
  采用超高效液相串联高分辨质谱的数据采集技术结合UNIFI数据处理平台对芪精升白颗粒的体外化学成分进行鉴定。首先,建立芪精升白颗粒的in-house数据库平台:通过对十味组方药材化学成分进行文献调研,共检索出1501个化合物,并对各化合物的结构式、分子量、分子式等具体信息汇总;其次,对已知化学成分进行表征:利用UNIFI软件对in-house数据库与复方提取液的质谱数据进行匹配分析,通过总结不同结构类型化合物的质谱裂解规律结合对比标准品和参考文献的方法,共从芪精升白颗粒中鉴定出138个化学成分,其中包括6对同分异构体;最后,对未知化学成分进行解析:基于已知成分的裂解规律,利用中性丢失检索和特征碎片检索等数据挖掘技术对未知化学成分分析,共从复方中鉴定5个环黄芪醇型皂苷类化合物。综上所述,利用以上分析策略共从芪精升白颗粒复方提取液中鉴定出143个成分,包括5个未知化学成分,以上化合物按照结构可分为黄酮类(56个)、皂苷类(51个)、香豆素类(5个)、木脂素类(3个)、酚酸类(6个)、生物碱类(3个)、氨基酸类(2个),并将化合物归属到单味药材与相应色谱峰中。
  在体外化学成分研究的基础上,以血清药物化学为指导理论,对芪精升白颗粒入血原型成分及其代谢产物进行详细分析。通过多元统计分析软件对给药大鼠血清和空白大鼠血清进行差异性分析,两组的差异变量即为原型入血成分和代谢产物。首先,鉴定原型入血成分:通过扣除空白大鼠血清中基质峰,给药大鼠血清与芪精升白颗粒提取液的共有色谱峰即为原型入血成分,结合体外化学成分in-house数据库以及标准品对比的方法,在给药大鼠血清中共鉴定出24个原型入血成分,包括黄酮类(13个)、酚酸类(2个)、皂苷类(6个)、香豆素类(1个)、氨基酸类(2个)化合物。其次,建立芪精升白颗粒代谢产物数据库:利用软件MetaboLynx对入血原型成分在体内的代谢反应进行预测,共得到382个潜在代谢成分,从而建立芪精升白颗粒代谢产物库;最后,鉴定代谢产物:通过扣除芪精升白颗粒提取液中的共有色谱峰,给药大鼠血清与空白血清中的差异性色谱峰即为代谢产物,结合代谢产物数据库与中性碎片丢失检索以及提取离子流等数据挖掘技术,在给药大鼠血清中共鉴定18个代谢产物,包括异黄酮类(6个),异戊烯基黄酮类(6个),酚酸类(2个),二氢黄酮类(2个),皂苷类(2个)化合物,主要涉及的体内生化反应为水解反应、氧化反应、羟基化反应、葡萄糖醛酸化反应和磺酸化反应等。
  综上所述,本课题对芪精升白颗粒体内外化学成分进行全面系统的分析,从而为其质量控制以及作用机制研究提供科学的数据支持。此外,本研究所建立的整体分析策略为其他中药复方等复杂系统的成分分析提供了借鉴意义。
[硕士论文] 杨文军
遗传学 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:随着核能技术的不断探索与开发,电离辐射的应用已经广泛深入到生活中的各个方面。这也不可避免的引起公众对电离辐射对身体健康的潜在不利影响的关注。增殖分化旺盛的细胞对电离辐射的敏感程度比较高,比如男性生殖细胞,其作为电离辐射的敏感细胞之一,较容易受到电离辐射引起的损伤,从而对男性的生育能力造成影响。因此迫切需要探索相关可以增强机体抗电离辐射能力的药物来保护工作环境长期处于电离辐射人群的生殖健康。
  姜黄素是一种从姜黄的根茎中分离出来的酚类化合物,具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等生物学作用。研究证实氧化应激在电离辐射诱导的生殖系统损伤中发挥了关键作用,但是姜黄素是否能在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用尚未报道。本课题主要探究了姜黄素在电离辐射致男性生殖系统损伤中的防护作用以及可能的作用机制。
  本课题使用BALB/c雄性小鼠作为动物模型,探究姜黄素对电离辐射损伤男性生殖系统的保护作用。实验结果表明不同剂量的单次电离辐射导致了小鼠的生殖系统损伤。与未辐射的正常小鼠相比,经电离辐射处理后的小鼠睾丸重量以及附睾尾部精子的浓度出现显著降低,HE染色显示电离辐射破坏小鼠睾丸组织正常的生理结构;用TUNEL法检测睾丸组织内的凋亡情况,结果发现电离辐射显著增加了睾丸组织内的凋亡。同样在细胞水平上检测了电离辐射对小鼠精母细胞的影响。结果表明电离辐射处理后细胞的活力出现显著下降,细胞凋亡率明显升高。4Gy的单次辐射剂量破坏了精母细胞正常的线粒体膜电位。辐射后小鼠睾丸以及精母细胞内caspase-3的蛋白水平均升高。接着探究是否姜黄素能够减弱电离辐射对生殖系统造成的损伤。口服姜黄素可显著提高辐射后小鼠睾丸附睾尾部精子浓度,降低睾丸组织内生精细胞的凋亡情况。细胞实验同样发现姜黄素预处理可以显著降低电离辐射引起的细胞活力下降以及细胞凋亡,改善线粒体膜电位。上述实验结果表明姜黄素对电离辐射后的生殖系统具有保护作用。4Gy的单次电离辐射破坏了小鼠以及精母细胞的氧化应激系统之间的平衡。电离辐射处理后,小鼠睾丸内SOD、Total GSH表达水平出现显著降低,MDA和ROS水平显著上升。姜黄素预处理可以明显增加SOD、Total GSH的活性,降低MDA和ROS水平。
  在明确姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用的基础上,进一步探索其发挥保护作用的具体机制。Nrf-2/HO-1信号通路是机体内重要的抗氧化通路,前面的实验结果表明姜黄素预处理可以显著改善小鼠以及细胞内的氧化应激状态。基于这个实验结果,设想Nrf-2/HO-1信号通路参与姜黄素在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤的保护过程。实验结果显示姜黄素预处理可以显著增加精母细胞以及小鼠睾丸组织内Nrf2的蛋白水平,促进Nrf2蛋白从胞浆向胞核内的转移。在精母细胞内对Nrf2基因进行干扰后显著降低了姜黄素对精母细胞的保护作用。
  总而言之,本研究首次报道了姜黄素能够在电离辐射诱导的男性生殖系统损伤过程中发挥保护作用。其发挥保护作用的机制可能与通过调控Nrf-2/HO-1抗氧化信号通路维持机体氧化应激状态平衡有关。姜黄素作为祖国传统中草药,其具有副作用小,原料易获取等优点,有可能开发成为一种新的抗辐射损伤防护剂。
[博士论文] 邹玉明
外科学(骨外) 中国人民解放军海军军医大学;海军军医大学 2018(学位年度)
摘要:背景:
  类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性、自身免疫性疾病,以滑膜过度增殖和炎症细胞浸润为特点,导致关节的慢性炎症以及继发软骨和骨的侵蚀。类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)是炎性滑膜的重要组成部分,是类风湿关节炎发病过程中相关病理损伤的关键参与者。
  传统的改变病情抗风湿药(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs),如甲氨蝶呤,病人的长期使用会产生耐药性,在一部分病人的应用过程中逐渐失去效果。近年来生物制剂的大力发展和应用极大革新了RA的治疗,临床上常常将生物制剂与DMARDs联合应用于RA患者,更好的控制和缓解了病情。尽管生物制剂改善了对传统DMARDs不敏感病人的治疗,但是生物制剂价格昂贵、需要胃肠外给药、增加感染和癌症的风险是其缺点。因此继续发展和筛选治疗RA的临床新药物具有重要意义。
  苦参碱是从一类传统中草药苦参等植物中提取出的生物活性碱,它有一系列的药理学活性,如有抗肿瘤、抗炎与免疫调节、抗病毒、抗纤维化、抗寄生虫、心血管保护、抗骨质疏松等。但是目前为止,苦参碱还没有发展为应用于临床的药物,这与其给药剂量大,药物活性低有关。在苦参碱结构基础上研发的苦参碱衍生物MASM[(6aS,10S,11aR,11bR,11cS)210-Methylamino-dodecahydro-3a,7a-diaza-benzo(de)anthracene-8-thione]表现出比苦参碱更好的药理学活性。已有文献报道苦参碱衍生物MASM具有抗炎、免疫调节、抗肝纤维化、放射保护等作用,但是还没有研究评估其对RA的治疗是否具有治疗作用。本研究从行膝关节置换的RA病人身上获取炎性滑膜组织,体外分离培养获取人源性原代RA-FLSs,在体外建立RA细胞模型,以及建立胶原诱导的小鼠关节炎模型,通过体外和体内实验评估苦参碱衍生物MASM对RA治疗的潜在药用价值。
  方法:
  1.胶原酶消化法体外分离培养出入源性原代RA-FLSs,并在传代培养的第三代对细胞进行流式鉴定;
  2.用CCK8实验探究苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs体外增殖的影响;
  3.实时荧光定量RCR实验探究苦参碱衍生物MASM对IL-1β激活的RA-FLSs炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8以及基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3、MMP-13基因表达的影响;
  4.AnnexinⅤ-FITC/PI双染后用流式细胞仪检测MASM对RA-FLSs细胞凋亡的影响;
  5.用苦参碱衍生物MASM预处理后,IL-1β激活RA-FLSs细胞48小时后:JC-1染色,流式细胞仪检测RA-FLSs细胞线粒体膜电位的下降;提取蛋白(cytochrome c提取胞浆蛋白检测),Western blot检测凋亡的线粒体通路相关蛋白Bcl-2、Bax、cytochrome c、cleaved caspase9、pro-caspase3、cleaved caspase3、Cleaved PARP;Caspase3活性试剂盒检测RA-FLSs细胞中capsase3活性;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光及westemblot检测RA-FLSs自噬相关标记物p62、Beclin-1、LC3的表达变化;
  7.利用自噬抑制剂CQ抑制自噬后,观察苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡诱导作用的影响;
  8.苦参碱衍生物MASM预处理后,继续用IL-1β激活RA-FLSs,蛋白收样后Western blot检测磷酸化Akt及总Akt蛋白表达水平;
  9.MAPKs和NF-κB信号通路与RA发病密切相关。用苦参碱衍生物MASM预处理RA-FLSs后,IL-1β短时间处理激活RA-FLSs中MAPKs和NF-κB信号通路。总蛋白抽提后,Western blot检测MAPKs信号通路中的磷酸化Erk1/2、磷酸化JNK、磷酸化p38以及相应总蛋白的表达水平;核蛋白抽提试剂盒分离胞浆蛋白和核蛋白,分别检测核蛋白中NF-κB/p65入核水平以及胞浆蛋白中IκBα的表达变化;将DBA/1小鼠分为正常组、阳性CIA对照组、低剂量(苦参碱衍生物MASM10mg/kg组)和高剂量组(苦参碱衍生物MASM30mg/kg组)。
  10.用Ⅱ型胶原诱导小鼠建立RA动物模型——胶原诱导的关节炎模型。实验组灌胃给药,对照组给生理盐水1次/天;关节炎炎症指数评分对关节红肿的临床表现进行评分,诱导28天后每两天统计一次;
  11.收集小鼠组织样本,固定、脱钙、切片后HE染色观察小鼠足踝部关节组织病理改变,并对滑膜炎症进行评分;
  12.收集小鼠组织样本,固定后行Micro-CT扫描,三维重建后观察小鼠足爪部整体骨损伤并进行评分;
  13.眼眶取血,室温凝固后离心收集血清,ELISA检测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;
  14.切片样本进行TNF-α免疫组化染色,观察各组间关节局部TNF-α表达水平。
  结果:
  1.胶原酶消化培养法从可以从滑膜组织中培养出RA-FLSs,经过细胞换液和传代可以获得细胞成分较为均一、形态类似成纤维细胞的细胞成分。经CD90标定后流式鉴定,CD90阳性细胞>90%,表明获取细胞大部分为RA-FLSs,可以用于后续实验;
  2.CCK8实验表明苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs的增殖,且体现出剂量和时间依赖性;
  3.IL-1β可以激活RA-FLSs,诱导其炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8)以及MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-13)的表达明显升高,苦参碱衍生物MASM可以抑制RA-FLSs上述炎症因子和MMPs的表达,且随着给药浓度的升高,抑制作用增强;
  4.MASM预处理1小时后,IL-1β继续刺激RA-FLSs48小时,流式细胞仪检测AnnexinⅤ-FITC/PI双染,结果显示5~20μM苦参碱衍生物MASM可以明显诱导RA-FLSs细胞凋亡,呈剂量依赖性;
  5.Jc-1染色后流式检测RA-FLSs线粒体膜电位的下降,随着MASM浓度的增加,线粒体膜电位的下降呈递增趋势;Western-blot检测凋亡的线粒体途径相关蛋白,结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理后,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降、促凋亡蛋白Bax的表达升高、胞浆内细胞色素c蛋白水平升高、下游的cleaved caspase9表达升高,pro-caspase3表达下降而cleaved caspase3表达升高,凋亡标志物Cleaved PARP的表达升高,且所有蛋白的表达水平均与苦参碱衍生物MASM的给药剂量相关;可以明显提高caspase3的活性,且呈剂量依赖性,与蛋白表达结果相符;
  6.相应处理后,细胞免疫荧光结果显示苦参碱衍生物MASM可诱导RA-FLSs中LC3的点状聚集;Western blot检测自噬相关蛋白标志物p62、Beclin-1、LC3的结果显示,5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以导致p62的表达下降,而Beclin-1、LC3B-Ⅱ的表达升高;
  7.用CQ阻断细胞自噬后,苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs的凋亡促进作用得到进一步加强;
  8.Western blot检测相应处理后RA-FLSs细胞内磷酸化Akt和Akt总蛋白表达结果显示,苦参碱衍生物MASM的处理可以抑制Akt的磷酸化,但是对Akt总蛋白的表达影响不大;
  9.Western blot检测MAPKs和NF-κB信号通路蛋白结果显示,IL-1β2ng/ml处理30分钟可以激活RA-FLSs,明显诱导Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,5~20μM苦参碱衍生物MASM可以抑制Erk1/2、JNK和p38的磷酸化,且在20μM时抑制作用最明显,但对Erk1/2、JNK和p38总蛋白的表达影响不大;IL-1β2ng/ml处理RA-FLSs30mins可以明显减小胞浆中IκBα的表达水平,诱导NF-κB/p65入核,而5~20μM苦参碱衍生物MASM处理可以剂量依赖性扭转这一趋势。
  结论:
  苦参碱衍生物MASM可以抑制RA发病过程中的关键细胞RA-FLSs炎症因子以及MMPs的表达,抑制RA-FLSs细胞增殖,通过线粒体途径促进RA-FLSs凋亡,并且可以明显上调RA-FLSs中细胞自噬的水平。此外,通过自噬抑制剂CQ抑制RA-FLSs中的细胞自噬,可以进一步增强苦参碱衍生物MASM对RA-FLSs凋亡诱导作用。此外,苦参碱衍生物MASM可以明显抑制RA-FLSs中与RA发病密切相关的MAPKs以及NF-κB信号通路的信号转导。在体内实验部分发现,苦参碱衍生物MASM可以缓解CIA小鼠动物模型中的关节局部和全身的炎症水平以及关节的组织破坏。综上所述,苦参碱衍生物MASM是治疗RA的潜在药物,具有进一步研发的价值。联合应用苦参碱衍生物MASM以及自噬抑制剂CQ或HCQ,有可能进一步增强其对RA的治疗效果,但仍需进一步研究进行评估。
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