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[博士论文] Najeeb Akhter
Marine Pharmacology 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:新药的优越性是显而易见的,尤其是抗生素,而最佳的药物来源仍然是天然产物。海洋环境使人们特别关注从微生物的显著多样性这一新来源中,寻找具有生物活性的天然产物。同样,发现新型次生代谢物最适用的目标是解决耐药病原体的问题。此外,海洋真菌和细菌是善于合成次生代谢物的生产者之一,对于发现新型药物非常重要。据报道,成千上万的生物活性次生代谢产物被合成,而海洋微生物是主要的生产者,这些次生代谢产物表现出一系列的生物活性,包括抗菌、抗真菌,抗癌,抗肿瘤,细胞毒性等等。然而,在生物体合成的化学物质中,只有一部分的基因能在体外正常转录,这涉及微生物菌株的特殊培养方法。而另一方面,许多生物用于合成次生代谢产物的基因仍然不活跃,在现有实验室条件下无法表达,从而严重限制了微生物通过发酵获得的产物多样性。全基因组测序数据揭示了海洋微生物基因组中存在大量的沉默基因簇,这些基因簇可能对次生代谢物进行修饰。与此同时,化学诱导能刺激未表达或表达不强的基因簇的表达,这些基因簇编码海洋微生物(细菌和真菌)中的生物活性代谢物。因此,微生物的化学诱导方法可能会显著地提高现有化合物的产量并积累新型化合物,而这些新型化合物在菌株的常规培养中是被无法检测到的。在本文中,通过研究真菌和细菌等海洋微生物所产生的具有抗菌活性次生代谢物,并阐明其独特化学结构。除此之外,还着重于海洋微生物次生代谢产物的化学诱导。在本研究中,选取了4个菌株NA-ZhouS1,XZ-2,Y-62和NB-ZhouS2,分别取自中国东部舟山海岸的热液喷口和海洋沉积物,并以其从代谢产物中分离得抗生素。
  聚焦海洋生物次级代谢物,本项研究阐释了来自舟山沿海地区Streptomyces pratensis NA-ZhouS1的分离和结构解析,包括新型化学诱导代谢物(Ni2+100μM胁迫)以及已知化合物(1-6)。其中,新抗生素1和2对铜绿假单胞菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯菌和大肠杆菌表现出抑菌活性,平均MIC值为16μg/mL,而抑制枯草芽孢杆菌的MIC值在8-16μg/mL左右。
  此外,取自热液蟹Xenograpsus testudinatus的海洋热液喷口曲霉菌属XZ-2菌株,经常规培养和钴处理培养,并成功从中分离得6个已知化合物,即ergosterol(7),diorcinol(8),(+)-curcutetraol(9),cyclopenol(10),7-methoxycyclopenin(11)和cottoquinazoline A(12)。此外以革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌等3种典型的临床病原菌对已知化合物的抑菌活性进行评价。四环素和甲醇分别作为阳性对照和阴性对照,MIC值均为1μg/mL。已知化合物7-methoxycyclopenin(11)对大肠杆菌有抑制作用,MIC值约为32μg/mL,而cyclopenol(10)没有显示活性。diorcinol(8)表现出对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性,MIC值在16-32μg/mL。
  类似地,一种新型吲哚衍生物,2-(4-hydroxybenzyl)-1,7-dihydroxy-6-(3-methylbut-2-enyl)-1H-indene-1-carboxylate(13)以及已知化合物(14-24),从植物内生真菌Aspergillus flavipes Y-62的乙酸乙酯相中分离的得到,该真菌是从浙江舟山海岸采集的猪尾草茎中分离得到的。已知化合物包括2-O-methylbutyrolactone1(14),5个细胞松弛素衍生物,Z16(15),Z7(16),Z17(17),rosellichalasin(18),Z13(19),Z8(20),Z9(21),1个双肽aspergillazine A(22),1个低分子量化合物flavipin(23)和N-benzoyl-L-phenyalaninol(24)。此外利用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌菌株,对化合物13-22的抗菌活性进行评价。在测试的化合物中,化合物13的结构显示较弱的抑菌活性,相比于阳性对照四环素抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),MIC值为128μg/mL,和抑制肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌,MIC值分别为32μg/mL。
  此外,从浙江舟山沿岸的海洋沉积物中分离出的放线菌NB-ZhouS2的乙酸乙酯相中,共获得9个已知化合物,包括环状四肽和生物碱。这些化合物为cyclo-[Leucyl-prolyl]2(25),N-acetyltyramine(26),cyclo-(L-Pro-L-Val)(27),cyclo-(R-Pro-R-Leu)(28),3-hydroxyacetylindole(29),cyclo-(4-methyl-R-Pro-S-Nva)(30),cyclo-(L-Pro-L-Phe)(31),cyclo-(L-Pro-L-Tyr)(32)and4-methyl-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one(33)。
[博士论文] 李力
中西医结合基础 福建中医药大学 2018(学位年度)
摘要:目的:研究川芎嗪体内外干预对血小板活化的影响,并从microRNA(miRNA)及其靶基因和相关信号转导通路调控探讨川芎嗪抑制血小板活化的作用机制,以期进一步从miRNA及相关通路调控丰富川芎嗪抗血小板活化作用机制,为其临床抗血小板治疗提供实验依据。
  方法:1、体外实验:血小板经不同浓度盐酸川芎嗪(Ligustrazine Hydrochloride,LH;1、2、3mM)预处理后,给予二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP;5.5μM)刺激,通过比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量,酶联免疫吸附试验(EnzymeLinked Immunosorbent Assay,ELISA)检测血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2)含量和Western-blot检测整合素αⅡbβ3的表达及其磷酸化水平;体内实验:Sprague-Dawley(SD)大鼠经盐酸川芎嗪预处理后(80mg/kg/d),通过皮下注射肾上腺素(Adrenaline;1mg/kg)构建血小板过度活化大鼠模型,采用剪尾法检测小鼠出血时间改变,并提取血小板和给予ADP刺激,采用比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量,ELISA检测血清中TXB2和6-酮-前列环素(6-keto-PGF1α)含量。2、采用Western-blot检测不同浓度盐酸川芎嗪(LH;1、2、3mM)体外干预对ADP刺激后血小板中AKT、ERK、p38MAPK的表达及其磷酸化水平和80mg/kg/d的川芎嗪体内干预对AKT表达及磷酸化水平的影响;采用AKT通路激活剂胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor1,IGF-1;300mM)诱导血小板,并通过比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量和ELISA检测血清中TXB2含量。3、采用miRNA TLDA芯片检测川芎嗪干预对SD大鼠血小板中miRNA表达的影响,通过靶基因预测和通路(Pathway)分析川芎嗪干预后被显著富集的差异表达miRNA相关信号转导通路,并通过Western-blot检测AKT通路反向调节因子PTEN、THEM4和PHLPP等基因在蛋白水平的表达。
  结果:1、体外实验:川芎嗪体外干预显著抑制ADP诱导的血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量,降低血小板中整合素αⅡbβ3的磷酸化水平;体内实验:川芎嗪预处理显著延长血小板过度活化SD模型大鼠出血时间,降低血小板Ca2+含量和血清中TXB2的含量,增加血清中6-keto-PGF1α含量。2、川芎嗪干预显著抑制ADP诱导后血小板AKT、ERK和p38MAPK的磷酸化水平;川芎嗪干预显著降低AKT通路激活剂(IGF-1)诱导后的血小板AKT的磷酸化水平,显著抑制血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量。3、川芎嗪预处理显著下调血小板过度活化模型大鼠血小板中39个miRNA的表达,靶基因预测和Pathway分析证实PI3K/AKT通路被显著富集,川芎嗪干预显著下调血小板miR-331-3p、miR-34a-5p及上调二者的共同靶基因、AKT反向调节因子PHLPP的表达。
  结论:川芎嗪体内外干预显著抑制血小板聚集,且通过下调miR-331-3p、miR-34a-5p等miRNA和上调PHLPP等靶基因表达,进而抑制PI3K/AKT等相关信号转导通路可能是其发挥抑制血小板活化的重要机制。
[博士论文] 何飞
中西医结合基础 福建中医药大学 2018(学位年度)
摘要:本文从以下几个方面进行论述:
  第一部分 清眩降压汤治疗新发1级高血压随机交叉对照试验
  目的:评估清眩降压汤治疗1级高血压的临床疗效。
  方法:采用随机交叉对照的临床试验评估。根据2010年中国高血压防治指南诊断标准,纳入新发高血病例80例,随机数字表法均分为两组,分别是A组和B组,分别予以第一阶段用清眩降压汤4周和一般生活方式干预4周,4周后,交叉转换为分别以一般生活方式和清眩降压汤干预4周,患者家庭上下午自测血压方式并填写血压记录和症状体征改变;入组、干预4周和第8周时,分别抽血离心,取血清1ml留待检测AngⅡ、ET-1、TNF-α、CRP、Smad3水平。
  结果:清眩降压汤能够显著降低新发1级高血压患者血压,用药四周后上午收缩压平均降低13mmHg,舒张压平均降低9.1mmHg;下午收缩压和舒张压平均下降6.2mmHg和4.5mmHg。随访4周,血压维持良好。生化结果:清眩降压汤对AngⅡ、ET-1的血清学水平未见显著干预作用;B组TNF-α水平获得显著降低,A组未见显著改变;A组患者CRP水平获得显著下降,B组未见显著改变,Smad3水平恰恰相反。未见严重不良反应。
  结论:清眩降压汤能够降低新发1级高血压患者收缩压和舒张压,停药后4周,血压维持良好;清眩降压汤对高血压炎症状态具有潜在的改善作用。
  第二部分 清眩降压汤对自发性高血压大鼠血压调节的药效作用机制
  目的:探讨清眩降压汤(QXJYD)对自发性高血压大鼠(SHR)血压的调节作用和对胸主动脉血管重构及TGF-β1/Smad信号转导通路活化的影响。
  方法:自发性高血压大鼠(SHR)随机分为清眩降压汤组(SHR-QXJYD)和对照组(SHR-control),并分别给予清眩降压汤和纯净水干预,另设Wistar-Kyoto为正常对照组(WKY),给予等体积纯净水干预,连续灌胃给药8周,每周监测大鼠收缩压、舒张压。实验结束后,麻醉后经腹主动脉取血分离血清,并分离和收集胸主动脉。①HE染色、光学显微镜结合Leica Q Win V3病理图像分析系统测定胸主动脉中膜厚度(media thickness,MT);②ELISA等生化试剂盒检测AngⅡ、ET-1的含量和RPA的活性水平;③采用IHC、Q-PCR和Western blot检测清眩降压汤对不同类型胶原蛋白(CollagenⅠ、CollagenⅢ)、PCNA和TGF-β信号通路活化的影响。
  结果:SHR大鼠在6周龄时血压已开始升高,与WKY空白对照组具有显著差异(P<0.05)。与SHR-control组比较,清眩降压汤组能够显著减缓SHR大鼠收缩压(SBP),舒张压(DBP)和平均动脉压(MBP)的升高,而对大鼠的体重没有显著的影响;与SHR-control组比较,清眩降压汤组能够显著降低SHR大鼠血清中AngⅡ、ET-1的含量和RPA的活性水平;与WKY组比较,SHR组大鼠胸主动脉中膜明显增厚(P<0.05),血管平滑肌细胞(VSMC)排列紊乱,单位面积细胞核数量明显增多,部分出现内膜损伤及外膜炎性细胞浸润现象;弹力膜排列紊乱、松散、厚薄不均甚至断裂。清眩降压汤能够显著改善胸主动脉中膜厚度、改善胸主动脉的病理变化。QXJYD能显著下调动脉血管平滑肌细胞中PCNA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达,对胸主动脉平滑肌细胞TGF-β信号通路活化有显著的抑制作用。
  结论:QXJYD能够抑制SHR大鼠血压升高,对高血压引起的血管重构有一定的改善作用,其机制与QXJYD能够降低血清中AngⅡ、ET-1的含量和RPA的活性水平、抑制血管平滑肌细胞中PCNA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的蛋白表达以及抑制胸主动脉平滑肌细胞TGF-β信号通路活化有关。
[硕士论文] 冯俊
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:胶质母细胞瘤(Gliomablastoma)为最常见的神经系统原发性肿瘤。当前对胶质母细胞瘤的治疗治疗仍以传统手术为主,辅以放、化疗,但由于其呈现的浸润性生长特点,无法与正常脑组织界定,手术无法清除所有肿瘤组织,术后易复发。同时由于胶质母细胞瘤发病部位多样性,对占位处功能区侵袭破坏,致残、致死率均较高于常见脑部疾病,严重影响患者预后。常用的抗胶质母细胞瘤药物主要通过细胞毒做作用,抑制增殖、诱导细胞凋亡等实现对肿瘤的控制,但由于毒副作用较强,对正常脑组织损伤大,且易形成耐药性,严重影响着患者的治疗效果和生存质量。因此,研发新型抗胶质母细胞瘤药物已成为胶质母细胞瘤研究的热点。
  南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb)为卫矛科南蛇藤属落叶木质藤本植物,又名:过山枫、挂廓鞭、过山龙、大南蛇等。味苦、辛,性微温,归肝、脾、大肠经。作为药材,首载于《植物名实图考》,其根、藤具有祛风消肿、活血止痛之功效,可用于治疗跌打损伤、腰腿痛等症。本课题组在前期的体内外实验研究中发现,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(C.orbiculatus ethyl acetate extract,COE)对胶质母细胞瘤细胞的侵袭、转移均具有显著干预作用,但其对胶质母细胞瘤凋亡影响的具体机制尚不完全清楚,因此本课题拟对COE诱导胶质母细胞瘤U251细胞凋亡及相关具体分子机制进行研究。
  本研究通过不同分子生物学方法,研究COE对人胶质母细胞瘤细胞系凋亡的干预作用,阐明其影响的分子机制,为中医药抗脑肿瘤提供机制支持,为开发针对胶质母细胞瘤具有自主产权的中医药提供理论依据。
  本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 南蛇藤提取物对胶质母细胞瘤细胞的影响
  目的:研究不同浓度的COE对人胶质母细胞瘤细胞增殖、凋亡的影响。
  方法:对数生长期人胶质母细胞瘤U251细胞随机分为对照组和治疗组(治疗组分别予质量浓度为10,20,40,80,160,320μg/mL的COE作用),以MTT法分三个时间点(24h,48h,72h)检测细胞活力。根据MTT结果,排除细胞毒作用选择低中高浓度(40,80,120μg/mL)的COE作为后继实验浓度。阴性对照组、阳性对照药物(替莫唑胺,Temozolomide,TMZ,40μM))及COE(40,80,120μg/mL)干预U251细胞24 h后,AnnexinⅤ/FITC-PI双标法流式细胞仪检测细胞凋亡情况,JC-1检测线粒体膜电位变化。
  结果:不同浓度COE作用24、48、72h后,U251细胞的增殖受到不同程度的抑制,并呈时间和浓度依赖性;根据COE对细胞增殖的抑制率,计算COE对U251细胞24 h的IC50为127.06μg/mL。不同浓度COE作用24 h后,随着COE浓度的增加,U251细胞凋亡率逐渐增加,线粒体膜电位逐渐降低,且COE作用效果较TMZ明显。
  结论: COE能够抑制人胶质母细胞瘤U251细胞增殖且呈浓度、时间依赖;COE能够干预线粒体膜电位,进而通过线粒体途径诱导U251细胞的凋亡。
  第二部分 南蛇藤提取物通过线粒体途径及影响微丝骨架重塑促进人胶质母细胞瘤U251细胞凋亡的分子机制
  目的:透射电镜观察COE干预后胶质母细胞瘤U251细胞超微结构变化,探讨COE对U251细胞凋亡相关线粒体途径及微丝骨架重塑的作用。
  方法:透射电镜观察人胶质母细胞瘤U251细胞经对照组及COE(80μg/mL)作用24h后超微结构的改变。不同浓度(40,80,120μg/mL)的COE作用于人胶质母细胞瘤U251细胞24 h后,Western blot检测细胞中线粒体凋亡相关蛋白表达水平的变化。
  免疫荧光染色观察COE干预后胶质母细胞瘤细胞微丝骨架改变;Western blot检测COE干预24 h后U251细胞骨架凋亡相关蛋白表达水平的变化。
  结果:经COE(80μg/mL)作用后U251细胞肿胀,线粒体数目增多,体积变小,线粒体脊减少,管网状结构崩溃;微丝排列紊乱。Western blot实验结果表明,经不同浓度COE作用后Bcl2L12、Bcl-2蛋白表达下调,Bax、Cyt-C、Caspase-3蛋白表达上调,且高浓度COE作用时,变化较TMZ组更为明显。
  免疫荧光实验表明,COE及Lat A作用后细胞微丝分布由细胞中心向四周改变;Western blot实验结果显示,经COE和Lat A作用后微丝骨架凋亡相关PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达下调,Caspase-3蛋白表达增高。上述变化在COE联合LatA组改变更为明显。
  结论:COE能够通过线粒途径能诱导U251细胞凋亡;COE能够引起胶质母细胞瘤细胞微丝骨架重构,进而导致U251细胞凋亡。
  第三部分 南蛇藤提取物对人胶质母细胞瘤异种移植瘤的干预及分子机制
  目的:体内观察COE对荷瘤裸鼠皮下异种移植瘤的抑制作用及相关分子机制。
  方法:取2×106个对数生长期人胶质母细胞瘤U251细胞种植于裸鼠皮下,经三周成瘤后随即分为3组,阴性对照组、COE治疗组和阳性对照组。其中COE治疗组和阳性对照组分别于COE和TMZ40 mg/kg/d灌胃治疗,对照组予等量生理盐水灌胃,每3d称量裸鼠体重和皮下移植瘤长短径,每7d拍摄活体荧光成像,21d后PBS灌注分离皮下荷瘤,瘤体称重拍照;免疫组织化学法检测瘤组织线粒体凋亡相关蛋白及微丝骨架相关蛋白表达的变化。
  结果:COE及TMZ干预组瘤体生长速度及瘤重均小于对照组,且COE的抑瘤作用更为明显。免疫组化结果显示Caspase-3、Bax、p-Akt蛋白表达水平上调,Bcl-2、PI3K、Akt蛋白表达下调。
  结论:COE能明显抑制皮下异种移植胶质母细胞瘤组织增长,且抑制作用较TMZ更为明显。其作用机制可能与线粒体凋亡功能激活及肿瘤细胞微丝骨架重塑有关。
[硕士论文] 顾欣霞
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是以锥体外系功能障碍为主要表现的中枢神经系统退行性疾病,其特征性病理改变为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元渐进性变性死亡,现有的治疗药物尚不能抑制这一病变的进展,因此,寻找能够阻止PD病程的神经保护剂具有重要意义。虫草素(Cordycepin)是蛹虫草(北冬虫夏草)中的活性成分。本实验室前期研究发现,在鱼藤酮诱导的PD动物和细胞模型上,它能够保护DA能神经元,此与改善线粒体功能障碍有关。虫草素的上述作用尚有待在其他模型上进一步证实,同时,有必要对其作用机制作深入研究。
  目的:
  研究虫草素对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元的保护作用,并从内质网应激和神经炎症角度探讨其可能的作用机制。
  方法:
  小鼠分为对照组、模型组和虫草素低剂量(5.0mg/kg)、中剂量(10.0mg/kg)、高剂量(20.0mg/kg)组。腹腔注射MPTP(30mg/kg/d),连续5天,制备PD模型。以旷场实验、爬杆实验和转棒实验测试小鼠行为学变化。应用免疫组织化学方法观察TH免疫阳性神经元数目和DAT变化,以及小胶质细胞和星形胶质细胞的活化状态及Iba-1和GFAP免疫阳性细胞数量。HPLC-EC法检测DA、5-HT及其代谢产物的含量。TUNEL染色法观察细胞凋亡形态和数量变化。分光光度法测定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。应用Western-blot法检测TH、Caspase3、Cleaved-caspase3、GRP78、CHOP、Caspase12、NF-κB p65和iNOS的蛋白表达,同时应用RT-qPCR方法测定GRP78、CHOP、TNF-α和IL-1βmRNA表达水平。ELISA法测定外周血中TNF-α和IL-1β的含量。
  结果:
  1.虫草素对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元的保护作用研究
  与对照组相比,模型组小鼠在旷场内自主活动距离明显减少(P<0.01),爬杆时间显著增多(P<0.01),转棒潜伏期明显缩短(P<0.01)。模型组小鼠SN中TH免疫阳性神经元明显减少(P<0.01),TH蛋白表达显著下调(P<0.01)。Str内DAT水平显著降低(P<0.01),DA及其代谢产物以及5-HT含量显著下降(DA、DOPAC和5-HT,P<0.01;HVA,P<0.05)。
  与模型组相比,10.0mg/kg虫草素处理后能够显著增加小鼠的移动距离和活动时间(P<0.01),5.0、10.0、20.0mg/kg虫草素均能够显著减少爬杆时间(P<0.01),并显著延长转棒潜伏期(5.0mg/kg,P<0.05;10.0和20.0mg/kg,P<0.01)。表明小鼠上述行为学障碍得到改善。5.0和10.0mg/kg虫草素处理后,SN中TH免疫阳性神经元数量(P<0.01)和TH蛋白表达明显增多(5.0mg/kg,P<0.05;10.0mg/kg,P<0.01),Str内DAT水平显著提高(P<0.01)。虫草素三个剂量组均显著增加DA含量(5.0和10.0mg/kg,P<0.01;20.0mg/kg,P<0.05),5.0和10.0mg/kg虫草素显著增加HVA含量(P<0.05),10.0mg/kg虫草素显著增加5-HT的含量(P<0.01)。虫草素的上述作用以10.0mg/kg组最好,20.0mg/kg作用最弱或不显著。结果提示虫草素在一定剂量范围内对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元具有保护作用。
  2.虫草素对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元保护作用机制研究
  (1)对细胞凋亡的影响:模型组小鼠SN中凋亡细胞核固缩,胞体呈圆形或椭圆形。与对照组相比,凋亡细胞的数量显著增加(P<0.01)。同时Caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表达明显上调(P<0.01)。与模型组相比,虫草素处理能够显著减少细胞凋亡数量(5.0和10.0mg/kg,P<0.01;20.0mg/kg,P<0.05),明显下调Cleaved-caspase3蛋白表达(P<0.01),但对Caspase3蛋白表达没有显著影响(P>0.05)。结果表明,虫草素可能通过抑制Caspase3的激活而抑制细胞凋亡。
  (2)对抗氧化酶活性的影响:与对照组相比,模型组小鼠SN中SOD(P<0.01)和GSH-Px(P<0.05)活性显著下降,MDA含量显著增加(P<0.01)。与模型组相比,5.0和10.0mg/kg虫草素处理后,SOD和GSH-Px活性均明显提高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.05)。20.0mg/kg虫草素组上述指标虽有变化,但均无显著性意义(P>0.05)。
  (3)对内质网应激的影响:与对照组相比,模型组的GRP78、CHOP和Caspase12蛋白表达量显著增加(P<0.01),GRP78和CHOP的mRNA水平也显著增加(P<0.01)。与模型组相比,虫草素处理能够显著下调GRP78(10.0mg/kg,P<0.01;5.0和20.0mg/kg,P<0.05)、CHOP(5.0和10.0mg/kg,P<0.01;20.0mg/kg,P<0.05)和Caspase12(10.0mg/kg,P<0.01;5.0mg/kg,P<0.05)蛋白表达。5.0和10.0mg/kg虫草素能显著降低GRP78(5.0mg/kg,P<0.05;10.0mg/kg,P<0.01)和CHOP(P<0.01)的mRNA表达水平。20.0mg/kg虫草素也显著降低CHOP mRNA的表达(P<0.05),GRP78mRNA表达虽有下降,但没有统计学意义(P>0.05)。提示虫草素可抑制MPTP诱导的内质网应激。
  (4)对炎症反应的影响:与对照组比较,模型组小鼠SN中小胶质细胞分支变多、突起缩短,星形胶质细胞突起变粗、呈放射状,Iba-1和GFAP免疫阳性细胞数量均显著增多(P<0.01)。同时,iNOS和NF-κB p65蛋白表达显著增加(P<0.01),TNF-αmRNA和IL-1βmRNA表达水平显著上升(P<0.01),血清中IL-1β(P<0.05)和TNF-α(P<0.01)的含量也显著增加。与模型组相比,虫草素处理后,Iba-1和GFAP免疫阳性细胞数量均显著减少(P<0.01),iNOS和NF-κB p65蛋白表达显著下调(5.0和10.0mg/kg,P<0.01;20.0mg/kg,P<0.05),TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的表达下调(P<0.01),血清中TNF-α(P<0.01)和IL-1β(5.0mg/kg,P<0.05;10.0mg/kg,P<0.01)的含量明显下降。上述作用中,10.0mg/kg虫草素作用最显著。结果提示虫草素能够减轻MPTP诱导的神经炎症和外周炎症。
  结论:
  虫草素在一定剂量范围内对MPTP诱导的PD小鼠DA能神经元具有保护作用,这一作用可能与其提高抗氧化酶活性、抑制内质网应激和炎症反应从而抑制细胞凋亡有关。
[硕士论文] 韩苏乔
中药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄花三宝木Trigonostemon lutescens Y.T.Chang et J.Y.Liang是大戟科三宝木属植物。该植物主产于广西南部,且大多生长于石灰岩山地的灌木林中,为广西特有药用植物。科学研究表明,三宝木属植物化学成分丰富,涵盖了萜类、生物碱类、苯丙素类等众多结构类型,具有抑菌、抗肿瘤、抗炎和抗病毒等多种药理作用。一系列具有良好生物活性的结构新颖的瑞香烷型二萜、降二萜、吲哚生物碱类单体化合物的成功分离,表明此属植物具有很高的研究价值。
  本学位论文首先采用CCK-8法对黄花三宝木的乙醇粗提物,石油醚部位浸膏,乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位进行体外抗肿瘤活性筛选,测试细胞株为人结肠癌细胞株HCT116,人宫颈癌细胞株HELA,人肝癌细胞株HepG2。CCK-8测定结果显示:石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏对肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用,结合浸膏量,最终选择乙酸乙酯部位浸膏作为分离主体。
  本学位论文从黄花三宝木枝叶的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分中,综合利用硅胶柱色谱、MCI柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、中压ODS柱色谱和制备薄层色谱及半制备型高效液相等多种色谱方法,分离纯化得到22个单体化合物;结合理化性质,高分辨质谱、核磁等波谱数据及文献对比的方法对化合物结构进行鉴定,22个化合物分别被鉴定为5-(2"-hydroxy-3"-methylbut-3"-en-1"-yl)-8-hydroxyfurocoumarin(1),花椒毒素(2),佛手柑内酯(3),异茴芹内酯(4),欧前胡素(5),alloisoimperatorin(6),isodemethylfuropinarine(7),auraptenol(8),水合橘皮内酯(9),九里香酮(10),3,4-dihydroxyallylbenzene-4-O-β-D-gluco-pyranoside(11),1-O-β-D-glucopyranosyl-4-allylbenzene(12),3-乙酰氧基-齐墩果酸(13),3-乙酰氧基-12-烯-齐墩果酸甲酯(14),蒲公英赛酮(15),simiarenol(16),spiciflorin(17),豆甾醇(18),β-谷甾醇(19),β-谷甾醇棕榈酸酯(20),棕榈酸(21)和3,3',4-O-三甲基鞣花酸(22)。其中化合物1为新化合物,化合物1-7为首次从三宝木属植物中分离得到呋喃型香豆素类化合物;化合物1-17为首次从三宝木属植物中分离得到,化合物18,22是首次从黄花三宝木中分离得到。
  运用紫外导向靶向分离得到10个香豆素类化合物,并总结出香豆素类化合物的紫外吸收规律,结合液质联用技术和化合物之间可能的生源关系,成功推测出5个该植物中可能含有的微量香豆素,这种基于HPLC-DAD-MS的方法对靶向分离目标化合物具有一定的指导意义。
  采用CCK-8法测定分离得到的22个化合物的体外抗肿瘤细胞活性,初筛结果显示化合物10对HCT116细胞表现出一定的增殖抑制,且呈一定的浓度依赖性,其IC50值为17.11μg/mL;化合物10和22对HELA细胞表现出较强的增殖抑制,且呈一定的浓度依赖性,IC50值分别为9.63和3.72μg/mL.
[硕士论文] 蒋丹
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本文分为以下两个部分进行探讨:
  第一部分 大黄提取物以及大黄素对缺血性脑卒中的神经保护作用及其机制
  目的:探讨大黄提取物(Rhubarb extract,RE)以及大黄素(Emodin)对脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)损伤的神经保护作用及其机制。
  方法:28只雄性ICR小鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、小剂量RE组(100mg/kg)、大剂量RE组(200mg/kg)。线栓法制作小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,药物干预组在模型制作前3d开始大黄提取物灌胃(1次/1d),脑缺血再灌注组予等体积生理盐水。42只雄性ICR小鼠随机分为6组,其中对照组按照术后处死时间分别为假手术组(Sham组)、IR1d组、IR3d组;术前给药组分别为Sham术前给药组、IR1d术前给药组、IR3d术前给药组。线栓法制作小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,术前给药组在模型制作前3天开始大黄素灌胃(1次/1d,200mg/kg),对照组予等体积生理盐水。均采用氯化三苯基四氮唑染色法检测脑梗死体积。分别以神经元特异性核蛋白(Neuron specific nuclear protein,NeuN)、胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、离子钙结合衔接分子1(Ionized calcium binding adapter1,IBA-1)作为标记物,利用免疫组化染色法检测缺血皮质和缺血侧海马CA1区神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞。利用蛋白质印迹法检测缺血皮质超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)-1、SOD-2和过氧化氢酶(Catalase,CAT)表达水平。
  结果:与缺血再灌注组相比,大剂量RE组神经功能评分明显降低,梗死体积显著缩小,缺血皮质区神经细胞数量明显增多,星形胶质细胞和小胶质细胞的活化程度显著降低(P均<0.05),SOD-1、SOD-2和CAT表达水平均显著升高(P均<0.05);相比之下,小剂量RE组与缺血再灌注组均无明显差异。
  与3个对照组相比,其对应的3个大黄素术前给药组神经功能评分明显降低,梗死体积显著缩小(P均<0.05)。缺血侧皮质区和海马CA1区Sham术前给药组神经细胞数量明显减少,而IR1d术前给药组、IR3d术前给药组明显增多。与对照组相比,缺血侧皮质区Sham术前给药组星形胶质细胞和小胶质细胞的活化程度显著升高,海马CA1区无显著差异;而缺血侧皮质区和海马CA1区IR1d术前给药组、IR3d术前给药组的活化程度均显著降低(P均<0.05)。梗死区SOD-1、SOD-2表达水平均显著升高(P均<0.05)。
  结论:大剂量大黄提取物组可通过抗氧化机制对脑缺血再灌注小鼠发挥神经保护作用。同时大黄提取物的有效单体——大黄素可通过抗氧化以及抑制胶质细胞活化对脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。
  第二部分 急性脑梗死患者的临床特征分析
  目的:了解急性脑梗死的临床特征,探讨导致高神经功能评分(NIHSS)的相关危险因素。
  方法:收集2016年8月至2018年1月江苏省扬州市中医院脑病科病房诊断为急性脑梗死的患者180例,其中根据患者入院神经功能评分(NIHSS)将其分组,分为轻度组(6分以下)、非轻度组(6分及以上)。收集人口学、生活习惯、疾病史以及入院神经功能评分(NIHSS)等资料。
  结果:轻度组102例,其中男女比例为1∶1.32,平均年龄48.36±12.58岁;非轻度组78例,其中男女比例为1∶1.52,平均年龄64.47±12.61岁,非轻度组患者年龄明显高于轻度组患者(P<0.05)。非轻度组患者BMI指数明显偏高(P<0.05),尤其偏胖者多于轻度组(P<0.05)。非轻度组更易合并有糖尿病、高血压病、房颤等疾病(P<0.05)。
  结论:年龄、BMI指数以及糖尿病、高血压病、房颤等合并病与急性脑梗死的高NIHSS评分有关联,对临床诊疗有一定指导意义。
[硕士论文] 高垚垚
中药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:人胎盘是一种具有补肾益精、补血益气等功效的传统中药,但猪胎盘的相关研究却鲜有报道。猪为哺乳动物,猪胎盘容易获得,功效与人胎盘应具有相似和可比性。本实验对猪胎盘进行药效物质基础研究,以组织冻融法提取猪胎盘蛋白(Pig Placenta Protein,PPP)并制备其凝胶剂(Pig placenta protein gel,PPPG),考察其基本性质及功效,为猪胎盘的废物利用提供依据。主要研究内容及结果如下:
  1.猪胎盘蛋白的提取及成分研究
  新鲜的猪胎盘组织先用机械粉碎法粉碎,再经冻融、匀浆、过滤得到PPP,冻干保存。测定其总蛋白含量,并采用薄层色谱(TLC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)等分析方法对PPP的组成成分进行分析。结果表明:得到的PPP为浅黄色的透明溶液,冻干粉为乳白色絮状粉末;TLC检测出7个斑点,Rf值分别为0.06、0.08、0.23、0.27、0.34、0.47、0.54;紫外波谱扫描图谱显示其最大吸收波长为260nm;微量元素分析结果为:PPP溶液中含有丰富的Ca、P、K、Mg、Zn、Fe等人体不可缺少的营养元素;红外光谱扫描结果显示其在3400cm-1和1630cm-1附近都有明显的振动峰;SDS-PAGE得到7个电泳条带,经MALDI-TOF MS鉴定,按照分子量从大到小的顺序依次为:葡萄糖调节蛋白78、热休克蛋白8、蛋白质二硫键异构酶A3前体蛋白、脯氨酰4-羟化酶β多肽、β细胞骨架肌动蛋白片段、醛糖还原酶、β血红蛋白亚基。
  2.猪胎盘蛋白对小鼠体内DA含量的影响
  将正常小鼠和D-半乳糖诱导衰老的小鼠按不同剂量的PPP(高浓度:1g·kg-1·d-1,中浓度:0.5g kg-1·d-1,低浓度:0.25g·kg-1·d-1)灌胃给药,给药35天后,通过脑组织和血液同步采样的方法,结合酶联免疫分析(ELISA)法检测各组小鼠脑组织和血液中多巴胺(DA)含量,考察其对体内DA能神经元的影响。
  实验数据表明:正常小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的脑组织内DA水平与正常小鼠空白组比较分别显著增加了58.0%(p<0.01),59.0%(p<0.01),37.6%(p<0.01)和30.2%(p<0.05);衰老小鼠的体内DA含量明显降低,阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的脑组织内DA水平与模型组比较分别显著升高了95.5%(p<0.01),101.3%(p<0.01),79%(p<0.01)和67.1%(p<0.01)。正常小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的血液中DA含量与正常小鼠空白组比较分别增加11.9%(p<0.05),10.5%(p<0.05),6.2%(p>0.05)和3.2%(p>0.05);衰老小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组小鼠的血液中DA含量与模型组比较分别增加了30.1%(p<0.01),15.7%(p<0.05),8.8%(p<0.05)和5.5%(p>0.05)。
  3.猪胎盘蛋白凝胶剂的制备及其功效考察
  将12g盐酸化壳聚糖加到25mL纯化水中,溶胀溶解形成凝胶液;向132g PPP冻干粉中加入25mL纯化水形成溶解液;凝胶液和溶解液合并均质2min,加入6g甘油再均质2min即得PPP凝胶剂。测定PPP凝胶的粘度、pH、总蛋白浓度等指标,扫描电子显微镜(SEM)观察凝胶剂的结构。将PPP凝胶涂抹于D-半乳糖诱导衰老的小鼠和深Ⅱ度烫伤的大鼠皮肤,给药35天后,通过HE染色法考察PPP凝胶对各组动物皮肤组织中表皮形态和厚度的影响,同时采用RT-PCR检测皮肤组织中Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平。
  结果表明:制备的PPP凝胶为均匀、细腻的黄色半固体物质,粘度为(4.5±0.1)Pa·s、pH为6.6~6.9,总蛋白含量为5%,易涂布、易清洗,符合凝胶制剂要求。皮肤组织切片表明PPP凝胶能使衰老和烫伤动物的整体及创伤处皮肤表皮厚度增加;RT-PCR显示PPP凝胶剂组的动物皮肤组织中Ⅰ型前胶原mRNA表达均明显升高(p<0.05)。
  本实验提取和鉴定了猪胎盘中可增强细胞活力和人体免疫功能的蛋白类物质,确认其与猪胎盘提取物明显的抗氧化抗衰老作用相关,显示其在保健和医药领域的应用价值和应用前景,值得借鉴。
[硕士论文] 关倩倩
营养与食品卫生学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:山药是我国传统的药食同源的植物,全国各地均有种植,不同地域由于气候、土壤的原因,山药的品质差异较大。山药由于水分含量高、不易储存,主要的食用方式就是鲜食,加工程度较低。山药粉是以山药为原料加工而成,山药粉的品质对后续深加工产品品质有重要影响。目前,有多种山药粉制备方法,但对于不同制备方法对山药粉特性影响的系统研究与比较却鲜有报道,并且在特殊配方主食的研究上也比较欠缺。山药具有众多的生理功能,其中对糖尿病的研究较多,大多集中在对山药中活性成分山药多糖的研究,对于山药粉整体的降血糖作用研究较少。本研究的内容及主要结论如下:
  1、为对10种山药品种进行品质评价,首先对10种山药品种进行理化检测和消化性分析,利用主成分分析方法对10种山药主栽品种进行品质评价分析,筛选出一种适合糖尿病人食用的山药品种。通过主成分分析法提取了5个主成分,方差贡献率分别为30.54%、24.81%、19.18%、10.23%、8.92%,累积贡献率为93.683%,在分析结果的基础上建立主成分综合得分模型,主成分综合得分最高的是长山细毛山药,为1.175。最终筛选出适合用作糖尿病肾病患者功能食品原料的山药品种为长山细毛山药。
  2、采用热风干燥、微波干燥、冷冻干燥分别结合普通粉碎、超微粉碎这6种方式加工山药粉,进行山药粉理化特性和消化性的分析研究,结果表明:6种方法制备的山药粉的颜色有所差异,冷冻干燥和超微粉碎之后,山药粉白度增加;从偏光十字可以看出,经过超微粉碎之后的淀粉颗粒,淀粉中心的十字结构阴影较大,呈裂开的趋势,淀粉颗粒与普通粉碎相比破碎程度较大。比较不同制备方式山药粉的微观结构,普通粉碎的山药粉中淀粉周围粘附许多其他成分物质,颗粒多为不规则的球状;超微粉碎的山药粉颗粒变小,形貌较完整,表面相对光滑,淀粉颗粒破碎程度较高;山药粉的X-衍射图谱可以看出山药粉属于C型淀粉衍射峰,微波干燥使得山药淀粉的衍射峰有一定程度的削弱;6种方法制备的山药粉快消化淀粉的含量从高到低依次是:MVS>MVO>HAS>FDS>HAO>FDO,抗性淀粉的含量与之相反。山药粉的快慢抗消化淀粉决定了山药粉的消化性,不同加工方法的山药粉的血糖指数顺序为MVS>MVO>HAS>FDS>HAO>FDO。
  3、为了研发适合糖尿病肾病患者的辅助治疗食品,选择热风干燥和超微粉碎的山药粉来进行特殊配方主食的研制,以感官评价和质构为评价标准,采用响应面法优化糖尿病肾病特殊配方主食的主料比、酵母量、加水量、第二次发酵,正交法优化改良剂配方,优化之后的配方为:山药粉小麦粉的比例为19∶21(g/g),37%马铃薯淀粉,5%小麦淀粉,5%马铃薯淀粉,1.5%的泡打粉,0.5%的面包改良剂,酵母添加量为0.8%,加水量60%,第二次发酵时间15min,CMC-Na添加量0.06%、黄原胶0.2%、菊粉0.6%、SSL0.5%。在此条件下制作出的低蛋白山药馒头感官评分约为89,硬度为1377.42g,咀嚼度为1125.75g。
  4、利用链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型,观察山药粉配方饲料对糖尿病大鼠基本指标(摄食、体重、精神状态等)、血糖、血脂、病理的影响,进行山药粉的降糖功效评价。实验结果表明,六组大鼠空腹血糖之间存在显著性差异(P<0.05),三组山药组和阳性对照组的糖尿病大鼠的空腹血糖与造模后相比显著降低(P<0.05);山药组糖化血红蛋白含量都有不同程度的降低,正常对照组与糖尿病模型组之间差异显著(P<0.05),三组山药组和阳性对照组之间无显著性差异(P>0.05);30%山药组和阳性对照组的TC、TG、LDL-C与模型对照组相比都显著降低(P<0.05),HDL-C显著提高(P<0.05);病理观察发现山药组在一定程度上能够改善糖尿病大鼠的肝脏、肾脏、胰腺的病变,特别是30%山药组和阳性对照组。
[硕士论文] 苏雅
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  研究银杏外种皮提取物(Ginkgo biloba exocarp extracts,GBEE)体内外抗B16-F10黑色素瘤转移作用及相关机制。
  方法:
  建立C57BL/6J小鼠B16-F10黑色素瘤肺转移模型,将C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(不接种肿瘤细胞)、模型对照组、阳性对照组、GBEE各治疗组,每组10只。正常对照组和模型对照组灌胃(ig)给予0.1mL/10g生理盐水(NS),每天1次,连续17d;阳性对照组隔日腹腔注射(ip)给予5mg/kg顺铂(DDP),连续7d;GBEE各治疗组分别ig给予GBEE50、100、200mg/kg,每天1次,连续17d。给药结束后第2天,剥瘤称量移植瘤重量,计算抑瘤率;摘取肺组织,于解剖显微镜下观察肺转移灶,计算肺转移率和抗转移率;制备肺组织和移植瘤组织切片,苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化;免疫组织化学法检测移植瘤组织CD34的表达并计算微血管密度(MVD),同时检测HIF-1α、VEGF、MMP-9的表达水平。体外培养B16-F10细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用MTT比色法检测GBEE对B16-F10细胞体外增殖的影响;通过细胞黏附实验观察GBEE对B16-F10细胞与HUVEC异质黏附作用的影响;采用细胞划痕法检测GBEE对B16-F10细胞迁移的影响。采用qRT-PCR法和Western Blot法检测GBEE在体内外对HIF-1α、VEGF、VEGFR2、NF-κB、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表达水平的影响。
  结果:
  体内实验结果显示,GBEE(50、100、200mg/kg)可抑制B16-F10黑色素瘤移植瘤生长和肺转移,使移植瘤组织MMP-9表达减少,并抑制CD34表达、使MVD降低,且效应皆具有剂量依赖性;同时,可抑制B16-F10移植瘤组织HIF-1α、VEGF和VEGFR2mRNA和蛋白表达,且其抑制作用具有量效关系;还可使B16-F10移植瘤组织p-PI3K、p-Akt的蛋白表达水平呈剂量依赖性降低,但对PI3K、Akt总蛋白表达水平无明显影响。体外实验结果表明,在5-320μg/mL浓度范围内,GBEE可显著抑制B16-F10细胞增殖,且随着药物浓度的增加其抑制率呈增长趋势;GBEE(10、20、40μg/mL)呈浓度依赖性抑制B16-F10细胞迁移及B16-F10细胞与HUVEC的异质黏附;在mRNA和蛋白水平,GBEE(10、20、40μg/mL)对B16-F10细胞NF-κB、MMP-9、p-PI3K、p-Akt的表达具有抑制作用,并呈浓度依赖效应,但对PI3K、Akt表达无明显影响。
  结论:
  GBEE抗B16-F10黑色素瘤转移的作用机制可能涉及影响PI3K/Akt/NF-κB/MMP-9信号通路而抑制肿瘤细胞增殖、迁移、异质黏附、细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)降解以及干预PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF信号通路而抑制血管生成。
[硕士论文] 易敏
营养与食品卫生学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黄芪是中国传统的中草药,又是食药两用物品,所含黄芪皂苷具有抑制肿瘤生长、转移、血管生成与调节肿瘤免疫等功能。结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一,其治疗除了常规的外科切除、放疗和化疗手段以外,分子靶向药也是一种有效的治疗方式。PLKs,Polo样激酶(polo-like kinases),是一种高保守丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。哺乳动物PLKs存在2个结构域,N末端蛋白激酶结构域和C末端polo-box结构域,polo-box结构域与底物结合和调节激酶活性有关。PLK2是细胞分裂的有效调节剂,参与细胞周期中心体的成熟、有丝分裂的进入与染色体的分离等过程。
  本文首先探讨黄芪皂苷对结直肠癌细胞的作用效果:经CCK8细胞活性实验、克隆形成实验,显示黄芪皂苷Ⅱ、异黄芪皂苷Ⅱ对结直肠癌细胞的增殖无影响(p>0.05);经transwell迁移实验、细胞划痕实验观察黄芪皂苷对4种结直肠癌细胞系迁移能力的影响,表明黄芪皂苷Ⅱ对结直肠癌细胞DLD1、HCT116、HT29的迁移能力均有抑制作用(p<0.05),对HCT15细胞的迁移能力无影响(p>0.05);异黄芪皂苷Ⅱ仅对HCT116细胞的迁移具有抑制作用(p<0.01),对其他肠癌细胞的迁移能力无影响(p>0.05)。分析表明,相同条件下黄芪皂苷干预各类肠癌细胞会出现不同反应,表明细胞间具有异质性。
  进一步就黄芪皂苷对结直肠癌细胞可能发挥的作用机制进行探讨:经Western Blot实验、qRT-PCR实验表明,黄芪皂苷能够下调表达PLK2,进一步在DLD1细胞系上构建敲降PLK2的慢病毒稳定细胞株DLD1-shPLK2,经细胞增殖实验和细胞迁移实验结果表明,沉默PLK2的表达对DLD1的增殖无影响(p>0.05),而对细胞的迁移能力有影响(p<0.05);验证实验结果与黄芪皂苷处理肠癌细胞的结果相一致。由此推测,黄芪皂苷通过下调PLK2的表达抑制了肠癌细胞的转移,从而为该物质治疗与应用提供了依据。
[硕士论文] 吴玲玲
药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种病因和发病机制尚不明确的神经系统退行性疾病,主要临床表现为进行性记忆力减退、认知功能障碍及人格改变等症状。关于AD的发病机制尚没有统一的说法,普遍接受的观点是β-淀粉样蛋白(Amyloid beta,Aβ)的产生和清除失衡,导致大脑中Aβ过度沉积,促进AD的发病。目前临床使用的药物只能延缓AD病程的发展,缺乏理想的药物预防或治疗AD。因此,AD发病机制研究及其药物筛选成为广大研究者关注的热点。灯盏花素是灯盏细辛的总黄酮有效部位,长期用于治疗中风偏瘫和心绞痛。最新的研究发现其主要成分灯盏乙素可抑制Aβ的体外聚集,而且,对Aβ诱导的神经细胞毒性具有抵抗作用,说明灯盏花素可能有利于AD的治疗。经系统地文献检索,发现有关灯盏花素的神经保护机制的研究较少。本研究采用侧脑室注射Aβ1-42的方法建立AD小鼠模型,于模型建立的第二天给药。假手术组和AD模型组小鼠灌胃生理盐水,灯盏花素给药组小鼠灌胃低(35mg/kg,Bre-L)、中(70mg/kg,Bre-M)和高(140mg/kg,Bre-H)剂量的灯盏花素,阳性药物组小鼠灌胃多奈哌齐溶液(剂量为1mg/kg)。每天灌胃一次,直至实验结束。通过Morris水迷宫实验验证模型,采用HPLC-QTOF-MS代谢组学方法研究灯盏花素干预前后AD小鼠血浆中内源性物质的变化情况,鉴定潜在的生物标志物,从分子水平阐明灯盏花素对AD小鼠的神经保护作用机制。
  在Morris水迷宫实验中,定向航行实验表明,所有组别小鼠的逃避潜伏期随着训练次数的增加均有所减少,与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠找到安全平台需要更长的时间。与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠在第4、6、7和8次训练中的逃避潜伏期显著延长(p<0.01或p<0.05),说明AD小鼠模型建立成功。另外,和AD模型组小鼠比较灯盏花素低、中、高三个剂量给药组小鼠及阳性药物组小鼠的逃避潜伏期都不同程度的缩短,灯盏花素高剂量给药组小鼠在第7次训练中以及阳性药物组小鼠在第8次训练中逃避潜伏期显著缩短(p<0.01)。在空间探索实验中,与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠在目标象限的游泳路程占总路程的百分比显著降低(p<0.01);另外,与AD模型组小鼠比较,灯盏花素中、高剂量给药组和阳性药物组小鼠在目标象限的游泳路程占总路程的百分比显著增加(p<0.05)。与假手术组小鼠比较,AD模型组小鼠在目标象限的持续时间明显缩短(p<0.01)。另外,与AD模型组小鼠比较,灯盏花素高剂量给药组和阳性药物组小鼠在目标象限的持续时间显著延长(p<0.05)。综上,灯盏花素能够剂量依赖性改善AD小鼠的学习记忆能力。
  采用HPLC-QTOF-MS对小鼠血浆进行分析,正离子模式下采集的原始数据直接导入Profile analysis2.0软件,聚类窗口的质量数设定为0.05Da(m/z50-1000),保留时间的范围设定为0.3min(0-30min)。每个图谱中的所有离子进行离子强度的归一化处理,然后根据“80%规则”去除数据中的缺失值。软件自动生成用于多元统计分析的矩阵。该矩阵包含离子的保留时间、质荷比和离子强度信息。采用SIMCA-P13.0软件对数据先进行主成分分析(PCA),然后经Par预处理后进行正交-偏最小二乘投影判别分析(OPLS-DA),筛选出10个潜在生物标志物。进一步用MS/MS对潜在的生物标志物进行分析,通过碰撞诱导解离(CID),碰撞能量分别为20eV和40eV,得到潜在生物标志物的子离子。通过与对照品的保留时间、精确质量和子离子数据比对或者检索在线数据库METLIN和HMDB,坚定了其中8个潜在生物标志物的化学结构。它们分别是3-吲哚丙烯酸、C16二氢神经鞘氨醇、溶血磷脂酰乙醇胺(22∶6)、胆石酸3-O-硫酸酯、溶血磷腊酰胆碱(16∶0)、磷脂酸(22∶1/0∶0)、牛磺脱氧胆酸和磷脂酰胆碱(0∶0/18∶0)。通过对以上8个生物标志物代谢途径的分析,本研究认为灯盏花素可能通过调节脂质代谢、提高机体5-羟色胺水平和降低体内胆固醇含量改善AD小鼠的学习记忆能力,发挥神经保护作用。
[博士论文] 金凤
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本课题共分为四部分研究内容。
  第一部分:南蛇藤提取物通过DJ-1抑制人食管鳞癌细胞迁移、侵袭及肿瘤干样细胞增殖目的:观察COE对人食管鳞癌细胞的侵袭、迁移能力、EMT进程及干细胞转录因子mRNA水平的影响;构建食管鳞癌干细胞模型,筛选COE作用于人食管鳞癌肿瘤干细胞模型的蛋白靶点。
  方法:体外培养人食管鳞癌细胞ECA-109及TE-8细胞,不同浓度(10,20,40,80,160,320μg/mL)的COE对作用于细胞24h、48h、72h后,MTT法检测COE对细胞生长增殖的影响。普通显微镜观察COE对细胞形态的影响。Transwell小室实验、western blot及RT-qPCR分别检测分别检测COE对两株细胞侵袭、迁移能力及细胞中蛋白水平与mRNA表达的影响。通过无血清培养基(serum-free medium,SFM)悬浮培养富集人食管鳞癌干样细胞,并以CD90、CD133及SOX2、Nanog、OCT4的mRNA表达变化及细胞在裸鼠体内成瘤能力来鉴定其干性。
  结果:不同浓度的COE作用ECA-109及TE-8细胞24h、48h、72h后,细胞的生长呈现不同程度的抑制,并呈一定的浓度及时间依赖性(P<0.05);其24h IC50分别为139.17±13.95μg/mL,153.74±10.72μg/mL。20、40、80μg/mL浓度的COE及阳性对照药5-Fu作用ECA-109及TE-8细胞24h后,随着COE浓度的增加,细胞形态呈凋亡状改变。且COE能抑制ECA-109及TE-8细胞迁移及侵袭能力,并呈浓度依赖(P<0.05)。随着COE浓度的升高,E-cadherin表达而逐渐上调,而N-cadherin表达逐渐下调,提示COE可以抑制EMT的发生。RT-qPCR结果提示COE可以降低干细胞转录因子SOX2、Nanog及OCT4的mRNA水平,呈浓度依赖(P<0.05)。成功富集人食管鳞癌干样细胞(ECA-109-S),且富集后第14天细胞内CD90及CD133表达及SOX2、Nanog及OCT4的mRNA水平较正常血清培养中的细胞高(P<0.05)。
  结论:COE可以抑制人食管鳞癌ECA-109及TE-8细胞增殖、侵袭、EMT及ECA-109干样细胞增殖,其作用的蛋白靶点为可能是α-tubulin、SLP-2、Prohibitin、DJ-1、HSP27等靶点蛋白单独或共同参与的结果。
  第二部分:DJ-1通过Wnt/β-catenin信号通路促进人食管鳞癌细胞增殖及转移
  目的:该部分主要探讨DJ-1在人食管鳞癌细胞增殖及转移中的作用,并对其潜在机制进行了探讨。
  方法:通过免疫组织化学检测DJ-1,Vimentin和E-cadherin在84例人食管鳞癌标本中的表达水平,分析各蛋白的表达与临床病例基线资料是否有统计学意义及这三个蛋白之间的相关性。利用TGF-β1建立EMT模型,分析DJ-1的表达水平。利用慢病毒载体构建DJ-1过表达及低表达细胞模型,并用Wnt/β-catenin抑制剂XAV939干预过表达DJ-1的细胞,通过Edu增殖实验、克隆实验、transwell小室实验及western blot分别检测细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力和细胞中各蛋白水平。
  结果:在84例食管鳞癌标本中,DJ-1的表达与淋巴结转移和远处转移密切相关,而Vimentin和E-cadherin与肿瘤细胞分化、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P<0.05)。且DJ-1的表达水平与Vimentin表达呈正相关,r=0.739,P<0.001,而与E-cadherin表达呈负相关,r=-0.770,P<0.001。在TGF-β1诱导的ECA-109细胞EMT模型中,DJ-1表达水平较ECA-109细胞明显增高(P<0.01)。成功构建过表达DJ-1的重组细胞株ECA-109-LV-DJ-1,沉默表达DJ-1的细胞株ECA-109-LV-siRNA-DJ-1及其各自的阴性病毒对照组细胞。ECA-109-LV-DJ-1细胞增殖、克隆、迁移、侵袭能力均强于对照组细胞(P<0.05)。在ECA-109-LV-DJ-1细胞中,E-cadherin表达降低,而N-cadherin和Vimentin表达增加;Wnt/β-catenin信号通路中LRP6、p-LRP6、β-catenin表达水平增高,Axin1表达水平降低(P<0.05)。
  结论:DJ-1通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进人食管鳞癌ECA-109细胞增殖、黏附、迁移、侵袭和EMT进程。
  第三部分:DJ-1通过促进线粒体生成及呼吸维持人食管鳞癌细胞干细胞特性
  目的:该部分主要探讨DJ-1在维持人食管鳞癌细胞干细胞特性中的作用,并对其潜在机制进行了探讨。
  方法:通过免疫组织化学检测DJ-1、SOX2和Nanog在84例人食管鳞癌标本中的表达水平,并分析其相关性。利用无血清培养建立肿瘤干细胞模型、慢病毒载体构建DJ-1过表达及低表达细胞模型。细胞成球实验、流式细胞分析、RT-qPCR分别用于检测细胞成球能力、细胞表面标记CD90、CD133的表达及干细胞转录因子SOX2、Nanog及OCT4的变化。Mito-Tracker Red染色用于分析线粒体质量,荧光观察及流式分析用于线粒体膜电位的测定,透射电镜用于观察各组细胞内的线粒体数目及结构,ATP检测试剂盒用于检测细胞内总ATP产量,流式细胞分析用于检测DCFH-DA标记的细胞内总ROS含量,western blot用于检测细胞中各蛋白水平。
  结果:在84例人ESCC组织标本中,SOX2的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移密切相关,而Nanog的表达与肿瘤细胞的分化、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关。且DJ-1的表达与干细胞转录因子Nanog (r=0.685,P<0.001)和SOX2(r=0.620,P<0.001)的表达正相关。过表达DJ-1后,细胞具有更强的成球能力及体内成瘤能力,及更高水平的CD90、CD133标记及Nanog、OCT4、SOX2 mRNA表达(P<0.05)。而DJ-1表达减弱后,以上能力均减弱。无血清培养后的细胞具有更强的线粒体质量、数量,更高表达的PGC-1αmRNA、ATP产量、线粒体膜电位(P<0.05),而细胞内总ROS含量并无明显变化。此外,线粒体质量、P GC-1αmRNA、ATP产量在过表达DJ-1细胞中增加而在低表达细胞中明显减弱(P<0.05)。过表达DJ-1细胞中线粒体数目增多(P<0.05),低表达DJ-1细胞中线粒体数量没有明显变化,但是线粒体形态出现明显破坏,表现为线粒体的肿胀,嵴排列紊乱并消失。且削减DJ-1表达的细胞中总ROS含量明显增多。同时DJ-1过表达可以增加线粒体相关蛋白PGC-1α、VDAC、Cyt-C的表达,而削减DJ-1表达后,PGC-1α、VDAC、Cyt-C表达明显降低(P<0.05)。
  结论:DJ-1通过促进线粒体生成及呼吸维持人食管鳞癌细胞干细胞特性。
  第四部分:南蛇藤提取物通过DJ-1介导的线粒体生成调控人食管鳞癌干样细胞侵袭转移
  目的:观察COE对人食管鳞癌干样细胞干性能力及侵袭转移的影响,并探索其可能的作用机制。
  方法:细胞分为野生细胞对照组,干样细胞阴性对照组及干样细胞加各浓度药物组。Transwell小室实验分别检测不同浓度COE对细胞侵袭、迁移能力的变化。Western blot及RT-qPCR分别用于检测各组细胞中蛋白及mRNA水平的变化。透射电镜用于观察各组细胞内的线粒体数目及形态结构,Mito-Tracker Red染色用于分析线粒体质量,流式分析用于线粒体膜电位的测定。构建裸鼠腹腔转移瘤模型,将注射ECA-109-S细胞的裸鼠随机分为对照组(含1% DMSO的生理盐水溶液),COE低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40mg/kg)剂量组,替吉奥(10 mg/kg)组,各组裸鼠均灌胃给药,观察各组裸鼠的腹膜种植转移的情况。
  结果:食管鳞癌干样细胞的迁移及侵袭能力明显强于野生细胞,而COE可以抑制食管鳞癌干样细胞的迁移及侵袭能力,并呈浓度依赖,并上调细胞中E-cadherin的表达,下调N-cadherin及Vimentin的表达(P<0.05)。透射电镜结果显示80 μg/mL COE可以减少干样细胞中线粒体的数量(P<0.05),并使线粒体结构发生改变,表现为线粒体肿胀,内膜消失,嵴排列紊乱。Mito-Tracker Red染色结果显示80 μg/mL COE可明显降低线粒体质量(P<0.05)。COE可以降低ECA-109-S细胞中的线粒体膜电位,并减少DJ-1及线粒体相关蛋白PGC-1α、HSP60、VDAC等的表达,呈浓度依赖(P<0.05)。体内实验显示,COE各剂量组中裸鼠的活动及生长状态均明显好于对照组。COE各剂量组中,肿瘤在大网膜、肠系膜、肝脏的转移发生率明显小于对照组(P<0.05)。免疫组化结果表明COE可明显上调移植瘤组织中E-cadherin的表达,下调DJ-1、Nanog及PGC-1α蛋白的表达。
  结论:COE可抑制人食管鳞癌干样细胞侵袭及转移,其作用机制可能与COE调控DJ-1介导的线粒体生成有关。
[硕士论文] 万冰
食品科学与工程 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:本文以宜兴“卷丹百合”为试材,研究采后微加工百合贮藏过程中褐变相关的基本生理变化、细胞活力和超微结构变化、膜脂和能量代谢变化以及褐变底物酚类组成在微加工百合鳞茎褐变过程中的作用,研究了热处理(HT,Heat treatment)和2-氨基茚满-2-膦酸(AIP,2-aminoindan-2-phosphonil acid)处理对微加工百合鳞茎褐变的调控作用,为百合鳞茎褐变机制的研究提供理论依据。
  (1)研究微加工百合鳞茎贮藏期间表观、褐变度、色差、细胞活力、细胞超微结构、细胞膜渗透率、MDA含量、SOD、CAT及LOX活性的变化。并对以上指标与微加工百合鳞茎褐变的相关性进行分析。结果表明:随着贮藏时间的延长,百合鳞茎表观颜色逐渐变为红褐色,褐变度加深,细胞活性减弱,细胞膜渗透性和MDA含量增加,SOD、CAT和LOX活性先增加后下降;不同部位百合鳞片褐变程度表现为:内层>外层>中层;褐变度与L*值、a*值、b*值、细胞膜透性、MDA含量、CAT活性和LOX活性均呈极显著(p<0.01)相关,与SOD活性呈显著相关(p<0.05)。MDA含量与褐变度的相关系数最高(r=0.991),表明百合鳞茎褐变度的增加与细胞膜脂代谢密切相关。
  (2)研究微加工百合鳞茎贮藏期间总酚、PPO、POD、PAL活力以及酚类物质组成的变化及其对褐变的影响。结果表明:总酚、PPO、PAL、POD均与百合鳞茎的褐变呈极显著相关,PPO、PAL、POD三种酶与褐变度的相关系数分别是0.928、0.850、0.497,PPO是引起百合鳞茎褐变的关键酶,其次为PAL和POD;中层百合鳞片总酚含量低于外层和内层,且总酚含量的变化趋势与PPO和PAL活性变化趋势一致;贮藏过程中褐变底物酚类物质种类和含量逐渐增多,其中王百合苷K、王百合苷D、王百合苷B和4,7-二甲氧基葛根素四种单体酚在贮藏期间含量较高。王百合苷F与褐变度相关系数最高(r=0.853)。此外,王百合苷C、王百合苷E、王百合苷A、4,7-二甲氧基葛根素和王百合苷K与百合鳞茎褐变也密切相关。
  (3)研究微加工百合鳞茎贮藏期间能量物质ATP、ADP、AMP含量以及能荷变化;线粒体能量代谢相关指标:SDH、COX、H+K+-ATPase、Ca2+-ATPase酶活性变化;分析能量代谢与微加工百合鳞茎褐变关系。结果表明:百合鳞茎贮藏过程中ATP和ADP含量逐渐降低,AMP含量逐渐升高,整体能荷值下降,百合鳞茎褐变的发生与能荷有密切关系(r=-0.967);线粒体能量代谢相关酶活性逐渐下降,表明线粒体功能受损,百合鳞片组织逐步衰老,而中层鳞片整体能量降低程度缓慢,线粒体相关酶活性显著高于内层;线粒体酶活性与褐变度均呈极显著相关。通过逐步线性回归法建立百合鳞茎褐变预测模型:褐变度=2.056+0.417x5-0.085x13-0.009x12(x5为MDA,x13为ATP,x12为PAL),表明微加工百合鳞茎褐变与MDA、ATP和PAL最密切相关。
  (4)研究HT(50℃,3min)和AIP(0.5mmol/L,5min)单独或复合处理对微加工百合鳞茎贮藏期间褐变相关指标的影响。结果表明:HT和AIP复合处理对百合鳞茎褐变抑制效果较好,表观颜色变化程度轻,总酚含量、PPO、POD、PAL活性显著低于对照,细胞活力较对照强,膜脂过氧化程度显著低于对照,SOD和CAT活性显著高于对照,可有效延缓微加工百合鳞茎褐变进程。褐变度与L*值、a*值、b*值、总酚含量、PPO活性、POD活性、PAL活性、细胞膜透性、MDA含量、CAT活性和LOX活性均呈极显著(p<0.01)相关,与SOD活性呈显著相关(p<0.05)。酚类物质中4,7-二甲氧基葛根素与褐变度相关系数最高(r=0.727)。另外,(-)-表儿茶素没食子酸酯-3"-O-甲基、王百合苷C、王百合苷K、王百合苷F、王百合苷A和金丝桃苷也与褐变度密切相关。
[硕士论文] 许志诚
营养与食品卫生学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:黑果枸杞,俗名黑枸杞,是一种我国独具特色的保健型食品。目前对于其研究的方向主要集中于果实,而相对于黑枸杞叶片的相关实验报道很少,因此对于黑果枸杞叶有待进一步的扩大研究方向,进而深化其在食品领域的深加工研究及理论探索。
  本实验以黑枸杞叶茶为研究对象,测定3种不同产地的黑枸杞叶茶和红枸杞叶茶的常规营养成分以及活性成分;对不同冲泡方式对黑枸杞叶茶的主要活性成分的溶出量进行测定,分析黑枸杞叶茶中主要的活性成分与其冲泡液的体外抗氧化性的相关性;测定了黑枸杞叶茶以及枸杞叶茶提取物的体外抗氧化性并进行了对比;通过高中低三种不同剂量的黑枸杞叶茶提取物对高脂饮食大鼠的膳食干预,测定大鼠血脂、肝脏组织结构及脂肪HSL、肝脏SOD、GSH-PX和CAT的mRNA表达,从分子水平分析和了解黑枸杞叶茶提取物调节血脂的机理。
  主要结论如下:
  (1)综合分析三种不同产地的黑枸杞叶茶和红枸杞叶茶并进行显著性差异比较,可得出实验的四组对照组中,青海产黑枸杞叶茶的活性成分含量更丰富。
  (2)分别对不同保存期的青海产黑枸杞叶茶样品的相关品质成分进行测定以研究不同贮存时间对其的影响。实验结果表明除Vc外,黑枸杞叶茶中的几种主要成分变化幅度较小,实验证实,常温干燥的环境下黑枸杞叶茶在测定时间内贮存品质基本稳定。
  (3)不同的冲泡条件对各成分的溶出以及抗氧化性均有不同程度影响;相关性分析显示冲泡液中总酚、总黄酮、可溶性总糖的溶出量与冲泡液清除DPPH·自由基的能力并不呈现非常紧密的相关性,这说明冲泡液的抗氧化能力并不完全由以上三种溶出成分贡献。
  (4)黑枸杞叶茶与枸杞叶茶提取物都具有良好的抗氧化活性,并且从总体上看,黑枸杞叶茶的抗氧化活性强于红枸杞叶茶提取物。
  (5)高剂量黑枸杞叶茶提取物在降低体重方面具有减脂效果,但中、低剂量效果不佳。
  (6)与对照组相比较,其他各组大鼠肝脏有不同程度的病变,其中高脂组肝脏组织同其他四组作比较,其病变程度显著较高。
  (7)黑枸杞叶茶提取物对于控制大鼠体内脂肪的增长有一定的效果,且较有效地控制了实验大鼠由于高脂饮食引起的血糖、TC、TG、LDL-C的上升,同时还能减轻大鼠体内的氧化应激反应。
  (8)通过大鼠肝组织HE染色切片可以看出,高脂组、黑枸杞叶茶提取物干预组大鼠肝组织细胞均出现了严重程度不一的脂肪化病变,按严重程度依次为:高脂组>高剂量组>中剂量组>低剂量组。这表明黑枸杞叶茶提取物对高脂日粮造成的大鼠肝脏形态结构的损伤有一定的修复作用。
  (9)黑枸杞叶茶提取物对大鼠组织中HSL mRNA、SOD mRNA、GSH-PX mRNA以及CAT mRNA表达的影响实验结果表明,黑枸杞叶茶提取物可不同程度提高大鼠脂肪HSL mRNA,肝脏SOD mRNA、GSH-PX mRNA以及CAT mRNA的表达。HSL mRNA表达升高会导致蛋白表达量增加并提升其活性,进而加强分解脂肪的能力,从而加速脂肪分解代谢,达到调节血脂的目的。SOD mRNA、GSH-PX mRNA以及CAT mRNA的表达升高,可以增加抗氧化酶的活性,加强机体内清除自由基的强度,降低过氧化脂质沉积,缓解脂类代谢紊乱症状,以上可能都是黑枸杞叶茶提取物调节血脂的机制。
[硕士论文] 胡刚
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:临床观察通心痹合剂治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Heart Disese,CHD)心绞痛患者血浆血管性假性血友病因子(Von Willebrand Factor,vWF)、α颗粒膜蛋白140(αgranule membrane protein140,GMP-140)、血清C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)含量变化以及心绞痛症状和心电图等疗效指标的改变,评估通心痹合剂治疗CHD心绞痛的临床疗效,研究其改善内皮细胞损伤、抑制血小板活化、抗炎症反应的作用机制。
  方法:选择60例符合纳入标准的气阴两虚、痰瘀热阻证的CHD心绞痛患者,应用随机数字表法分入治疗组和对照组各30例。治疗组基础治疗加用通心痹合剂口服,对照组在基础治疗上加用心可舒片,每次4片,每日3次。2组均连续服药4周为1个疗程。观察CHD心绞痛患者临床症状、心电图和综合疗效及血浆vWF、GMP-140、CRP、TNF-α、IL-6治疗前后水平变化。
  结果:2组CHD心绞痛患者在CHD的临床症状总有效率和综合疗效方面,治疗组改善更显著,P<0.05;2组患者心电图、心绞痛疗效、发作次数及持续时间均较治疗前改善,P<0.05,治疗后2组比较,P<0.05;治疗后治疗组vWF、GMP-140、CRP、TNF-α、IL-6含量均明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。
  结论:通心痹合剂对CHD心绞痛患者的中医临床症状改善明显,缩短了心绞痛发作持续时间、减少了发作次数,提高了心电图疗效,临床疗效显著;其机理可能改善其内皮细胞损伤、抑制血小板活化、抗动脉炎症反应,从而达到治疗CHD的目的。
[硕士论文] 陈健海
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease,GERD)是消化系统常见疾病,依据内镜下表现可分为反流性食管炎(Reflux esophagitis,RE)、非糜烂性胃食管反流病及Barrett食管三种类型。GERD在全球范围内发病率逐渐上升,治疗仍以质子泵抑制剂(Proton pumpinhibitor,PPI)为主的抗酸治疗为首选,但临床上约有40%-50%的GERD患者对PPI治疗无效,或停药后复发,其中RE复发率高达90%,如何解决RE高复发难题是当前研究的重要任务。目前认为该病的发生主要与下食管括约肌基础压下降、一过性下食管括约肌松弛以及食管动力障碍相关,因此基于恢复下食管括约肌功能的抗反流治疗逐渐得到广泛重视和积极尝试,创立了经口咽胃底折叠术、磁性括约肌扩张、射频消融、食管下括约肌电刺激等一批新的治疗方式,但其有效性、安全性以及远期疗效等尚未形成统一意见。RE可归属于中医“胸痛”、“吐酸”、“胃脘痛”等范畴,辨证大多为本虚标实。我们的前期研究发现,RE复发患者脾虚证占37.6%,治疗主张采用健脾和胃、泻火降逆,方用六君子、左金丸、旋覆代赭石汤等加减,均取得较好疗效。虽然中医中药抗返流效果好,副作用少,但基础研究较薄弱。cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICC)广泛分布于胃肠道,是胃肠慢波的起搏者,在胃肠动力调节方面有着不可或缺的巨大作用,其细胞正常的生理结构功能有赖于SCF/c-kit信号通道的正常表达。前期研究发现ICC也存在于食管下段,这可能成为GERD中医中药治疗潜在靶点,因此本实验旨在通过研究六君子合旋覆代赭汤对RE脾虚证大鼠食管ICC及SCF/c-kit信号通道的影响,揭示传统中药作用新靶点,为中医中药攻克本病高复发率难题开辟新路子。
  本文主要从以下几方面进行论述:
  第一部分 RE大鼠病症结合模型的探讨
  目的:对比研究不同浓度酸化胃蛋白酶持续灌注法、不同幽门结扎方式+前胃结扎法与大黄灌胃相结合建立RE脾虚证大鼠模型,筛选出理想的RE病症结合动物模型造模方法,为后续研究提供理论依据。
  方法:Wistar大鼠随机分六组(A-F),先进行RE造模:A组以0.25mol/L HCl+0.5mg/ml胃蛋白酶混悬液持续灌胃(速度75μl/min,持续30min,共计14天);B组以0.5mol/L HCl+0.5mg/ml胃蛋白酶混悬液持续灌胃;C组为对照组一,以等量生理盐水持续灌胃;D组采用幽门1/4缝合+前胃结扎法;E组采用传统幽门半结扎+前胃结扎法建立RE模型;F组为对照组二,仅开腹,15min后重新缝合;两周后RE造模完成。第15天开始进行脾虚证造模,A、B、D、E四组为模型组,以100%生大黄水煎液灌胃,2ml/只,每天2次,持续7天;C、F为对照组,以等量生理盐水灌胃。统计比较各组大鼠一般情况、死亡率、血清IL-6、IL-1β、IFN-γ含量以及食管下段组织病理表现,从有效性、安全性等方面对各造模方案进行评估。
  结果:1)模型组大鼠活动度减少,少动、懒动、扎堆、弓背、不活跃;精神淡漠、易惊,对外界刺激的反应减弱;被毛为枯黄、蓬乱;饮食量逐渐减少,大便溏或干结;2)模型组大鼠血清IL-6、IL-1β、IFN-γ含量较对照组明显增高;3)病理表现:模型组大鼠食管下段黏膜可见不同程度乳头状增生、鳞状上皮增生、炎症细胞浸润等,可伴有黏膜溃烂;3)有效率与死亡率:A组大鼠有效率42.8%,死亡率30%;B组大鼠有效率60%,死亡率50%;C组为对照组,死亡率10%;D组大鼠有效率75%,死亡率20%;E组大鼠有效率100%,死亡率50%;F组大鼠死亡1只,死亡率14.3%。
  第二部分 六君子合旋覆代赭汤对RE脾虚证大鼠食管ICC以及SCF/c-kit通道的影响
  目的:研究SCF/c-kit信号通道对ICC数目、形态结构以及功能的影响,探寻中药六君子合旋覆代赭汤治疗RE脾虚证的潜在作用靶点。
  方法:采用幽门半结扎+前胃结扎+大黄灌胃的方法建立RE脾虚证大鼠模型,实验动物随机分阴性对照组、阳性对照组、西药组、中药高、中、低剂量组共6组;其中西药组予以雷贝拉唑+莫沙比利混悬液灌胃;中药高、中、低剂量三组分别给予六君子合旋覆代赭汤高、中、低剂量灌胃:连续给药14天,1ml/只,1次/天;阴性对照组以及阳性对照组予以等量生理盐水灌胃。实验结束后取大鼠下段食管,进行:1)透射电镜观察食管下段组织ICC超微结构;2)Western blot法检测食管下段组织c-Kit及SCF蛋白含量;3)RT-PCR法检测大鼠食管下段组织c-Kit和SCF mRNA相对表达水平。
  结果:1)电镜观察:ICC存在于大鼠食管组织,本实验阴性对照组中ICC细胞结构完整,形态清晰,呈纺锤形,核体较大,胞质较少,胞质中含有大量线粒体以及丰富的内质网,有较多胞体突起,与周围细胞之间连接紧密;阳性对照组中ICC细胞数目明显减少,且细胞形态结构模糊,胞质内内质网扩张明显,线粒体空泡化现象严重,胞体未见明显突起,与周围细胞之间空隙较大,连接不紧密;中药低剂量组ICC细胞数目少,结构欠清晰,胞质内线粒体嵴溶解,内质网有扩张,胞体突触少,与周围细胞连接不紧密,中药高、中剂量组ICC细胞数目较阴性对照组有减少,细胞结构基本完整,胞质可见内质网以及线粒体损伤,胞体可见突起,与周围细胞之间缝隙连接较紧密;西药组镜下表现基本同阴性对照组。2)WB:相比于阴性对照组,阳性对照组c-kit、SCF蛋白表达水平明显降低(P<0.01);西药组c-kit、SCF蛋白表达水平较阳性对照组升高(P<0.01);中药高、中、低剂量组c-kit、SCF蛋白表达水平在性对照组与阳性对照组之间,差异具有统计意义(P<0.01);中药高剂量组c-kit、SCF蛋白表达水平稍高于中剂量组(P<0.05)。3)RT-PCR结果:相比于阴性对照组,阳性对照组c-kit、SCF mRNA相对表达水平明显降低(P<0.01);西药组c-kit、SCF mRNA相对表达水平较阳性对照组显著升高(P<0.01);较阴性对照组有升高(P<0.05);中药高、中、低剂量组c-kit、SCF mRNA相对表达水平均较阳性对照组升高(P<0.01);中药高、中剂量组c-kit、SCF mRNA相对表达水平差异不具有统计学意义(P>0.05)。
  结论:1)酸化胃蛋白酶持续灌注法、幽门半结扎+前胃结扎法联合大黄灌胃法均可成功建立RE脾虚证大鼠模型,且幽门半结扎+前胃结扎法效果效果优于酸化胃蛋白酶持续灌注法;2)RE严重程度及动物死亡率与盐酸浓度及幽门结扎方式相关;3)幽门1/4缝合+前胃结扎法虽然RE严重程度不如传统幽门半结扎+前胃结扎法,但其方法简单,且对动物损伤小,术后动物易于存活,若适当延长造模时间,其RE严重程度可与幽门半结扎+前胃结扎无异,更适合于大量造模以及术后药物的干预治疗方面的研究;4)大黄灌胃可成功建立脾虚证大鼠模型;5)大鼠食管组织存在ICC,且RE脾虚证的发生与ICC结构、数目及功能的改变相关;6)c-kit、SCFmRNA及其蛋白表达减少导致SCF/c-kit通道障碍是引起ICC数目减少以及结构功能异常的最直接原因;7)中药六君子合旋覆代赭汤通过促进c-kit、SCF mRNA及其蛋白的表达以维持SCF/c-kit通道的正常功能,使得受损的ICC恢复正常,并进一步通过ENS-ICC-SMC信号网络调节LES功能,从而起到抗反流作用,并减少反流复发。
[硕士论文] 朱光
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,死亡率位居全球第2位。在中国,2015年胃癌的发病率为15.8%,死亡率为17.6%,在癌症发病顺位中排第二。早期胃癌患者预后较好,且根治性手术治疗疗效显著,其术后5年生存率在85-90%之间[2],但胃癌早期检出率较低,中国胃癌患者中超过75%确诊时已进展至中晚期阶段。
  目前临床上胃癌的治疗方法不多,单纯手术治疗患者的总体生存率仅19%左右,疗效不佳。此外,放、化疗虽为治疗恶性肿瘤的一个重要手段,但其副作用较大,多应用于术前或术后的辅助性治疗或姑息性治疗。早期侵袭转移是胃癌患者死亡的重要原因,同时肿瘤的侵袭转移机制十分复杂。这一过程主要包括细胞粘附分子(CAM)、细胞外基质(ECM)的变化、上皮间质转化和肿瘤血管生成等,并受多种多样的因素调控。研究表明,抗增殖蛋白(Prohibitin,PHB)是一种进化上高度保守的蛋白,在调节细胞能量代谢、增殖凋亡、核转录中发挥了重要功能。在多种恶性肿瘤中存在PHB的异常表达,有研究发现PHB与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。
  南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系卫矛科南蛇藤属植物,又名过山风、黄藤等,其藤茎、根、叶、果实、种子均可入药,有祛风除湿、行气活血、消肿止痛、解毒等功效。南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus ethylacetate extract,COE)抗肿瘤活性较强。近年体内、外相关实验研究发现,COE能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞调亡自噬、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力等,进而抑制多种肿瘤细胞的生长及转移。本课题组前期研究发现,COE能够明显抑制胃癌细胞的侵袭、转移和EMT的发生,并通过蛋白质组学技术筛选出其靶点蛋白,PHB为其4个差异蛋白点之一。因此,本研究通过RNAi技术获得人胃癌MGC-803/PHB-细胞株,同时观察PHB低表达及不同浓度的COE作用后肿瘤细胞侵袭迁移能力的改变,并探索其作用机制。结果表明,COE通过调控PHB来抑制胃癌细胞的侵袭转移,其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
  本文主要从以下几方面进行论述:
  (一)南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平的影响
  目的:研究不同浓度南蛇藤提取物(COE)对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平表达水平的影响。
  方法:对数期人胃癌MGC-803细胞,分别设置阴性对照组、不同浓度(10,20,40μg/mL) COE加药组、阳性对照组(5-fu32μg/mL、JLC0.4 mg/mL)。药物处理细胞24 h后,收集并提取细胞的总蛋白,通过蛋白质印迹法测定细胞中PHB蛋白的表达情况。
  结果:COE作用MGC-803细胞24 h后,随药物浓度的增加,PHB表达水平逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
  结论:COE抑制人胃癌MGC-803细胞中PHB的表达水平。
  (二)人胃癌MGC-803/PHB-细胞株的构建及PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响
  目的:构建PHB低表达人胃癌MGC-803细胞株,观察PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响。
  方法:体外培养人胃癌MGC-803细胞至对数期,利用RNAi技术,将LV-PHB-RNAi基因整合入MGC-803细胞DNA,使人胃癌细胞MGC-803中PHB低表达,同时设立野生型细胞组及阴性对照组。转染24h后,倒置荧光显微镜下观察感染后细胞的荧光强度,收集并提取细胞总蛋白,Western blot法检测细胞中PHB蛋白的表达。同时,Transwell细胞侵袭实验测定PHB低表达后,MGC-803细胞侵袭能力的改变。Transwell迁移实验和细胞划痕实验,检测PHB低表达对人胃癌MGC-803迁移能力的影响。同时,Western blot法检测PHB低表达后细胞中侵袭转移相关分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin),基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白的表达水平。
  结果:慢病毒转染24 h后,倒置荧光显微镜下,人胃癌MGC-803细胞发出明显的绿色荧光。Western blot结果发现,对比于野生型细胞Control组及空质粒Vehicle组,转染LV-PHB-RNAi细胞组中PHB蛋白表达水平明显下降。PHB低表达能够降低人胃癌MGC-803细胞侵袭迁移能力。同时,PHB低表达后,间质标志物N-cadherin、Vimentin,基质金属蛋白(MMP2、MMP9)及c-Raf、ERK1/2、p-ERK1/2表达水平降低,上皮标志物E-cadherin表达水平增加。
  结论:成功构建人胃癌MGC-803/PHB细胞株。PHB低表达抑制人胃癌MGC-803细胞的侵袭迁移能力,其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
  (三)南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响
  目的:探讨南蛇藤提取物COE对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响。
  方法:对数期人胃癌MGC-803/PHB-细胞,分为阴性对照组(MGC-803/PHB-细胞,不加药),不同浓度COE组(10,10,20,40,160,320μg/mL)和阳性对照组(5-fu32μg/mL、JLC0.4 mg/mL)。MTT比色法观察药物作用后MGC-803/PHB-细胞增殖抑制的影响,并确定下一步COE药物实验浓度。Transwell细胞侵袭实验观察药物作用对细胞侵袭能力的改变。Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验,观察药物作用后细胞迁移能力的影响。药物作用24 h后,Western blot法检测不同浓度COE作用后,人胃癌MGC-803/PHB-细胞中EMT相关分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin),基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白(c-Raf、 ERK1/2、 p-ERK1/2)的表达变化。
  结果:药物作用细胞24 h、48 h、72 h后,人胃癌MGC-803/PHB-细胞的生长受到不同程度的抑制,且具有一定的时间、剂量的依赖性。同时,确定COE非细胞毒性的浓度梯度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL,进行后续实验。药物作用24 h后,与阴性对照组对比,人胃癌MGC-803/PHB-的侵袭迁移能力下降。同时,COE降低Vimentin、N-cadherin、MMP2、MMP9、c-Raf、 ERK1/2蛋白的表达水平,呈浓度依赖性;随着COE浓度的增加,E-cadherin、p-ERK1/2蛋白的表达水平上升。
  结论:COE抑制人胃癌细胞MGC-803/PHB-细胞的增殖和侵袭迁移能力,其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
[硕士论文] 饶本龙
中药学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察吴茱萸次碱(Rutaecarpine,Rut)对大鼠心室肌细胞的主要离子通道电流(INa、Ito)及其I-V曲线、激活动力学、失活动力学及失活后恢复动力学特征的影响。
  方法:
  采用Langendorff灌流装置,主动脉逆行酶解法分离大鼠心脏得到单个心室肌细胞;用含Rut的细胞外液灌流加药,以全细胞膜片钳技术记录给药前后细胞INa、Ito及其相关的动力学参数。
  结果:
  Ⅰ.Rut对INa通道影响
  1.在单刺激的状态下,抑制率随药物浓度增加而增加,其中101μM,20μM和40μM的10μM、20μM和40μM浓度的Rut使峰值钠电流密度由(-32.53±5.12)pA/pF分别降为(-25.13±2.7)pA/pF、(-18.71±5.2)pA/pF和(-14.71±5.2)pA/pF(P<0.01,n=10),Rut对INa峰值电流的抑制率分别为(22.37±2.42)%、(36.74±6.27)%和(47.67±4.52)%(n=10,P<0.01)。
  2.对电流密度-电压曲线(I-V)影响:浓度大于10μM时,Rut可使INa的I-V曲线明显上移,但I-V曲线的形状、反转电位不改变,
  3.对激活曲线影响:10μM以上浓度Rut可使激活曲线显著右移,即朝着去极化方向移动,激活电压升高,激活难度增加。
  4.对失活曲线影响:Rut能使INa的失活曲线显著左移,即向超极化方向移动,10μM、20μM和40μM Rut使V1/2由给药前的(-78.13±0.34)mV分别降低为(-94.22±1.32mV)、(-101.45±0.51)mV和(-112.56±0.72)mV(n=10,P<0.01),加快失活。
  5.对失活后恢复曲线影响:Rut能使INa的失活后恢复曲线显著右移,τ由给药前的(16.19±0.71)ms变为(25.41±1.11)ms、(32.34±0.76)ms和(37.73±0.27)ms(P<0.01,n=10),失活后恢复时程延长、复极化减慢。
  Ⅱ.Rut对Ito通道影响
  1.在单刺激的状态下,对Ito抑制率随药物浓度增加而增加。其中10μM,20μM和40μM的Rut对Ito峰值电流的抑制率分别为(15.25±3.43)%、(33.45±6.58)%和(57.46±7.72)%(n=10,P<0.01)。
  2.对电流密度-电压曲线(I-V)影响:10μM,20μM和40μM的Rut可使Ito的I-V曲线明显下移,曲线形态保持一致。
  3.而就Ito的激活曲线而言:浓度为20μM和40μM时,激活曲线右移,半数激活电压(V1/2)由给药前的(14.45±0.96)mV分别增加为(27.69±4.35)mV和(28.89±3.74)mV(n=10,P<0.01);给药前后半数激活电压变大,意味着同等条件下,通道更难被激活。
  4.对失活曲线影响:Rut能使失活曲线左移,即向超级化方向移动,给药20μM和40μMRut的半数最大失活电位(V1/2)由给药前的(-36.34±0.76)mV变为(-60.48±0.96)mV和(-75.45±0.78)mV(n=10,P<0.01),失活过程加速。
  5.对于失活后恢复曲线:Rut可使曲线右移,失活后再激活参数τ由给药前的(72.24±1.32)ms增加至(98.85±0.81)ms和(147.3±1.35)ms(n=10,P<0.01),失活后恢复时程延长、复极化减慢。
  结论:
  吴茱萸次碱对大鼠心室肌INa和Ito具有不同程度的阻滞作用。
[硕士论文] 杨婷
中西医结合临床 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:中草药南蛇藤,卫矛科南蛇藤属,药性辛温,有小毒,具有祛风、活血、解毒、消肿等功能。课题组前期研究发现,南蛇藤提取物(CelastrusOrb iculatus extracts,COE)具有较强的抗肿瘤活性,能抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,但其分子机制还未完全明确。
  原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),消化道最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势,致死率在所有癌症中居第三位。目前采取以手术切除为主的综合治疗模式,但是愈后不佳。
  哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)参与多种生理与病理过程,是细胞内许多重要信号转导通路的关键枢纽,其功能失调与肿瘤的发生发展紧密相关。
  为了研究南蛇藤提取物是否靶向mTOR发挥抗肿瘤活性,本文构建了过表达mTOR基因的人肝癌HepG2细胞株(记作HepG2/mTOR+细胞),加入不同浓度的南蛇藤提取物干预后,探讨COE对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响及机制。结果显示,与对照组相比,在一定浓度范围内,COE呈浓度依赖性地减少mTOR的表达,抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,促进人肝癌HepG2细胞凋亡,其分子机制可能与南蛇藤提取物抑制mTOR相关信号转导通路有关。本研究内容共分四部分。
  第一部分 人肝癌HepG2/mTOR+细胞株的构建
  目的:构建过表达mTOR蛋白的人肝癌HepG2细胞株。
  方法:体外培养人肝癌HepG2细胞株至对数期,利用分子生物学技术,将GV238-mTOR重组质粒转染至人肝癌HepG2细胞中,同时设阴性对照组和野生细胞对照组。24 h后,倒置显微镜下观察细胞形态。收集细胞总蛋白,Western blot法检测人肝癌HepG2细胞中mTOR蛋白的表达量。
  结果:转染24 h后,倒置显微镜下观察,野生型细胞贴壁生长,呈梭形,细胞轮廓清晰,细胞壁光滑无突起,折光性良好,核质均匀。与之相比,大部分HepG2/mTOR+细胞形态无显著变化,少量细胞变圆。Western blot结果显示,与对照组相比,HepG2/mTOR+细胞中mTOR蛋白的表达水平显著增加。
  结论:成功构建了人肝癌HepG2/mTOR+细胞株。
  第二部分 南蛇藤提取物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞的影响
  目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2/mTOR+细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。
  方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,加入不同浓度的COE(20,40,80,160,320mg/L),以野生型细胞为阴性对照,2 mg/L DDP为阳性对照。MTT法检测各组药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞增殖能力的影响;倒置显微镜及透射电镜观察形态学改变;流式细胞术检测药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡的影响;细胞划痕法检测药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞爬行能力的影响;Transwell实验研究细胞侵袭迁移的变化。
  结果:与野生型细胞相比,HepG2/mTOR+细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显增强。与未加药组相比,在一定浓度范围内,COE能抑制人肝癌HepG2/mTOR+细胞的增殖、侵袭及迁移,促进其凋亡,并呈明显的浓度依赖性。
  结论:mTOR的表达水平与肿瘤细胞的恶性行为相关。COE能降低mTOR的表达水平,抑制人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭及迁移,并促进肿瘤细胞凋亡。
  第三部分 南蛇藤提取物促进人肝癌HepG2/mTOR+凋亡的分子机制
  目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)对人肝癌HepG2/mTOR细胞mTOR信号通路及凋亡相关蛋白表达水平的影响,初步探讨其分子机制。
  方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,为了避免细胞毒性作用的干扰,根据IC50的结果,加入不同浓度COE(20,40,80 mg/L),同时设立野生细胞对照组和阳性药物对照组(2 mg/L DDP)。作用24 h后,Western blot法检测各组目的蛋白的表达水平。
  结果:COE抑制人肝癌HepG2/mTOR+细胞中mTOR蛋白的表达,呈浓度依赖性。COE能降低凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-2L12的表达,同时增加Bax、Caspase-3的表达量,呈浓度依赖性。随着药物浓度的增加,COE降低mTOR信号转导通路相关蛋白的表达量,尤其是明显降低4E-BP1、p-4E-BP1、P70和p-P70蛋白的表达水平。
  结论:COE促进人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡,其作用机制可能与mTOR信号转导通路及Bcl-2凋亡蛋白家族有关。
  第四部分 南蛇藤提取物与雷帕霉素联合应用的疗效比较
  目的:比较南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus extracts,COE)与mTOR的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)联合应用对人肝癌HepG2/mTOR+细胞的影响。
  方法:对数期人肝癌HepG2/mTOR+细胞,分为COE组(80 mg/L)、RAPA组(100nmol/L)、COE+RAPA组,同时设立野生型细胞对照组和阴性药物对照组。24 h后,倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变;流式细胞术检测各组药物对人肝癌HepG2/mTOR+细胞凋亡的影响;Western blot法检测各组目的蛋白的表达水平。
  结果:与未加药阴性对照组相比,COE或RAPA均能抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。与单独使用COE或RAPA的治疗组相比,COE和RAPA的联合治疗显示出一定的协同效应。
  结论:COE与雷帕霉素联用可进一步促进肿瘤细胞凋亡。
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