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[硕士论文] 齐祥
耳鼻咽喉头颈外科 广西医科大学 2018(学位年度)
摘要:以往对头颈部癌的预后研究局限于单因素或单基因研究,随着以GEO、GCBI、HPA和TCGA为代表的公共数据库的出现,使得通过生物信息学的方法,高通量筛选出与头颈部癌预后相关的基因并以此为依据对患者进行个体化的治疗成为一种新的手段。
  目的:
  通过整合生物信息学的方法筛选并评价头颈部癌预后的相关分子标记物。
  方法:
  1.通过GEO及GCBI数据库选出符合纳入条件的头颈部癌基因芯片,使用GCBI在线实验室分析多组芯片中头颈部癌共同差异表达的基因。
  2.从TCGA数据库中获取头颈部癌预后相关的基因数据,与GCBI数据库中获得的差异表达基因做对比分析,取交集,筛选出提示预后良好和预后不良的2组共同差异表达基因。
  3.从HPA数据库中下载头颈部癌患者的临床数据,根据临床分期将患者分为早期和晚期两组,筛选出与肿瘤临床分期相关的候选基因。将与肿瘤临床分期相关的候选基因与提示预后良好和预后不良的2组基因取交集,筛选出与头颈部癌分期、预后均相关的基因。
  4.从TCGA数据库中下载关于筛选出的基因在癌组织及癌旁正常组织的表达量数据,通过受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析上述筛选得到的单基因及多基因组合对头颈部癌预后评估的诊断效能。
  结果:
  1.通过GEO及GCBI数据库选出符合纳入条件的三组基因芯片(GSE29330、GSE33205和GSE9844),从中筛选出784个共同差异表达基因,其中包括519个转录上调的基因和265个转录下调的基因。
  2.通过TCGA数据库进一步筛选出提示头颈部癌预后不良的基因50个;提示预后良好的基因29个。
  3.结合HPA数据库,进一步筛选出8个和头颈部癌分期、预后均相关的8个基因。其中ENDOU、NFIA、GIMAP6和GIMAP7的高表达提示预后良好;USP14、P4HA1、PPFIA1和PFDN2的高表达提示预后不良。
  4.采用ROC曲线分析对筛选得到的基因进行评价。发现联合分析可提高诊断效能,其中ENDOU与NFIA双基因联合或ENDOU、NFIA、GIMAP6与GIMAP7四个基因联合分析最具诊断效能,提示预后良好;USP14、P4HA1、PPFIA1与PFDN2四个基因联合诊断最具诊断效能,提示预后不良。
  结论:
  1.ENDOU、NFIA、GIMAP6和GIMAP7在头颈部癌中高表达,提示预后良好;
  2.USP14、P4HA1、PPFIA1和PFDN2在头颈部癌中高表达,提示预后不良;
  3.ENDOU与NFIA双基因联合或ENDOU、NFIA、GIMAP6与GIMAP7四个基因联合分析最具诊断效能,提示预后良好;USP14、P4HA1、PPFIA1与PFDN2四个基因联合诊断最具诊断效能,提示预后不良。
  由此,我们通过整合生物信息学初步建立了头颈部癌预后相关的基因谱。
[硕士论文] 李晓爽
护理学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  调查头颈癌术后置气管套管患者的症状特点并提取症状群,分析病耻感以及心理弹性对症状群的影响,从全新的视角对该群体症状群的干预以及管理提出建议。
  方法:
  采取方便抽样法,选取203名头颈癌术后置气管套管患者为研究对象进行问卷调查。调查工具包括患者的一般情况调查表、安德森症状调查表(头颈)(MDASI-H&N)、病耻感量表和心理弹性量表(CD-RISC10)。采用SPSS22.0软件进行数据的录入整理和分析。主要统计方法包括探索性因子分析、Pearson相关分析及分层回归分析。
  结果:
  1.头颈癌术后置气管套管患者的人口社会学及临床资料:203例头颈癌术后置气管套管患者,年龄范围为41~84岁,平均为(61.66±8.53)岁;其中男性患者为主,占90.6%;初中及以下学历者为多,占55.2%;主要诊断以喉癌(46.8%)及下咽癌(44.3%)为主;疾病分期Ⅰ期占34.5%,Ⅱ期占22.7%,Ⅲ期占27.1%,ⅣV期占15.8%;65.5%的患者同时接受手术和放射治疗;置管时间1个月以内占24.1%,1~3个月占32.5%,3个月以上占43.3%。
  2.头颈癌术后置气管套管患者的症状发生率、严重程度及对日常生活困扰的分析:头颈癌术后置气管套管患者各症状的发生率在17.2%~99.5%之间,对患者日常生活的干扰发生率在15.3%~99.5%之间,其中困扰(苦恼)症状的发生率(99.5%)和严重程度(4.94±1.80)最高,症状对工作干扰的发生率(99.5%)最高。
  3.研究对象症状群的提取:通过探索性因子分析共提取出四个症状群,①头颈癌特异症状群,内含疼痛、困扰(苦恼)、气短、悲伤难过、吞咽困难、呛咳(噎塞)、发声(讲话困难)、味觉异常;②睡眠障碍群,内含疲劳(乏力)、睡眠不安、困倦;③胃肠道症状群,内含恶心、胃口差、便秘;④头颈癌放疗症状群,内含口干、咽喉粘液问题、皮肤瘙痒、口腔酸痛。
  4.头颈癌术后置气管套管患者的症状群影响因素分析
  独立样本t检验和单因素方差分析结果表明,除胃肠道症状群外,头颈癌特异症状群、放疗症状群和睡眠障碍群在一般人口社会学信息(年龄、性别、文化程度、经济状况)和临床资料信息(治疗方式、疾病分期、治疗方式)上存在差异(P<0.05);Pearson相关分析结果显示,除胃肠道症状群外,其他症状群均与病耻感呈正相关(r=0.552~0.751,P<0.01),与心理弹性呈负相关(r=-0.564~-0.805,P<0.01)。
  分别以头颈癌特异症状群、放疗症状群、睡眠障碍群得分为因变量,将人口社会学及临床资料信息通过单因素分析后具有统计学意义的条目作为控制变量纳入第一层,病耻感变量作为第二层,心理弹性变量作为第三层进行分层回归分析,统计分析结果示:病耻感和心理弹性对头颈癌特异症状群的解释量分别为13.4%和7.3%;病耻感和心理弹性对头颈癌放疗症状群的解释量分别为7.7%和5.4%;在睡眠障碍群症状群中,病耻感和心理弹性的解释量分别为9.9%和2.1%。
  结论:
  1.头颈癌术后置气管套管患者中困扰(苦恼)症状的发生率及严重程度最高,对工作干扰的发生率最高。
  2.头颈癌术后置气管套管患者表现出四个症状群:头颈癌特异症状群、睡眠障碍群、胃肠道症状群、头颈癌放疗症状群。
  3.头颈癌术后置气管套管患者症状群除受一般人口社会学信息及临床信息影响外,还受到病耻感以及心理弹性的影响,症状群的发生率及严重程度与病耻感呈现出显著的正相关,与心理弹性水平呈现出显著的负相关,为有效干预患者的症状群提供了新依据。
[硕士论文] 张静秋
肿瘤学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:探讨头颈部腺样囊性癌(ACCHN)经术后辅助放疗的临床疗效及预后因素。
  方法:回顾性分析四川省肿瘤医院从2005年1月至2015年1月收治的接受术后辅助放疗的初治头颈部腺样囊性癌患者的临床资料并进行随访。共64例患者纳入分析,年龄中位数48.5(21-73岁),男性38例,女性26例(男∶女为1.46∶1)。其中发生于大涎腺(包括腮腺、颌下腺、舌下腺)29例(占45.3%),小涎腺(包括口腔、鼻腔及鼻旁窦、喉、泪腺)35例(占54.7%);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、ⅣA、ⅣB期患者分别为3例(4.7%)、21例(32.8%)、11例(17.2%)、22例(34.4%)、7例(10.9%);其中手术R0、R1、R2级分别为32例(50%)、21例(32.8%)、11例(17.2%);放疗中位剂量为62Gy(50-72Gy)。32例(50%)患者行同步辅助化疗。采用Kaplan-Meier法对入组的所有患者进行生存分析,COX比例风险回归模型用于多因素分析。
  结果:全组中位随访时间为68.5个月(38-132个月);15例(23.4%)出现局部区域复发(Local-Regional Reccurence,LRR),28例(43.7%)出现远处转移(Distante Metastasis,DM),13例(20.3%)出现死亡。5年无局部区域复发生存率(LRRFS)、无远处转移生存率(DMFS)、总生存率(OS)分别为77.8%、52.6%、86.2%;单因素分析结果显示,影响OS的因素有T分期、N分期、UICC分期、手术切除级别、骨质破坏、嗜神经浸润和肌肉受浸(P<0.05);影响DMFS的因素有UICC分期、手术切除级别、辅助化疗、骨质破坏和肌肉受浸(P<0.05);影响LRRFS的因素有原发部位、T分期、UICC分期、手术切除级别、嗜神经浸润和肌肉受浸(P<0.05)。R0级切除组中,T分期、放疗剂量和嗜神经浸润(P<0.05)是影响LRRFS的因素。多因素分析结果显示,手术切除级别是影响OS(P=0.004)和DMFS(P=0.011)的重要独立预后因素;T分期(P=0.003)也是影响OS的独立预后因素;辅助化疗(P=0.039)是影响DMFS的重要独立预后因素;嗜神经浸润(P=0.042)和原发部位(P=0.012)是影响LRRFS的独立预后因素。R0级切除组中,嗜神经浸润(P=0.012)和放疗剂量(P=0.035)是影响LRRFS的独立预后因素。发生3级以上急性毒副反应的主要包括骨髓抑制(15.6%)、口腔黏膜炎(7.8%)、皮肤反应(7.8%)。
  结论:头颈部腺样囊性癌(ACCHN)患者经术后辅助放疗后,远处转移仍是治疗失败的主要模式。R0级完整手术切除(即切缘阴性)是预后良好的重要预测因素,是治疗的主要目标。化疗能提高ACCHN患者的无远处转移生存率(DMFS)。对于R0级手术切除者,有嗜神经浸润(Perineural invasion,PNI)高危因素、T分期较晚者应积极予以足量的术后辅助放疗(剂量≥60Gy),以减少局部区域复发;接受术后辅助放疗的患者不良反应较轻、可耐受。
[硕士论文] 郭香
肿瘤学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:目的:分析放疗定位中使用负压真空垫和脚部固定器协同固定下肢肿瘤患者技术应用效果。
  方法:选取我院在2012年6月至2016年9月收治的86例下肢肿瘤患者,将其随机分为A、B两组。放疗过程中,A组患者定位用脚部固定器单独固定,B组用脚部固定器联合负压真空垫协同固定,病人均选择仰卧位,双手十指交叉抱头,全身放松,平稳呼吸,整个过程均将患者摆位于一个比较舒适的位置和状态,并按要求精确定位和精细化扫描。比较两组患者不同固定方式下前后、左右、上下三维方向上的摆位误差、本研究从靶区受照射剂量值,靶区受照射体积,靶区适形度,危及器官受照射剂量值,危及器官受照射体积等方面进行两组差异的比较、以及不良反应等情况。
  结果:在摆位误差方面,两组患者单一方向上摆位误差均<2mm,A组患者摆位误差:前后(0.26±0.192cm)、左右(0.29±0.112cm)、上下(1.22±0.543cm),B组患者摆位误差:前后(0.13±0.093cm)、左右(0.16±0.141cm)、上下(0.67±0.531cm)。B组患者三个方位的摆位误差明显小于A组,比较差异均有统计学意义(P<0.05);且两组患者上下方向的摆位误差明显大于各自前后、左右方向的摆位误差,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
  在靶区受剂量分布和适形指数方面:两组患者D95、D50、Dmean比较无明显差别,比较差异无统计学意义(P>0.05);B组患者V100为(98.65±1.15)%,A组患者V100为(95.43±1.24)%,B组明显高于A组,比较差异具有统计学意义(P<0.05);B组患者适形指数(0.78±0.08)明显优于A组(0.42±0.03),比较差异具有统计学意义(t=27.63,P=0.00)。
  在危及器官受照情况方面:B组患者V30为(6.21±1.18)%,V5为(17.14±3.08)%,A组患者V30为(6.85±1.28)%,V5为(21.20±7.06)%,B组V30、V5均明显低于A组,比较差异均有统计学意义(P<0.05);B组患者D30、D50以及Dmax均明显低于对照组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
  在不良反应方面:B组患者骨组织不良反应总发生率(37.21%)明显低于A组(60.47%),比较差异均有统计学意义(P<0.05);B组患者皮肤不良反应总发生率(34.88%)明显低于A组(58.14%),比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
  结论:放疗定位中使用负压真空垫和脚部固定器固定下肢肿瘤患者均有较为显著的固定作用,两者联用作用更为显著,可有效减小患者下肢肿瘤放疗中前后、左右、上下三维方向上的摆位误差,单一方向上摆位误差均<2mm,明显提高了患者靶区剂量分布同时减少周围正常组织的受照剂量,适形指数更高,危及器官受照剂量明显降低,从而减少周围正常组织的不良反应。放疗定位中使用负压真空垫和脚部固定器协同固定下肢肿瘤患者的技术效果显著,值得在临床上进行推广。
[硕士论文] 谭淑慧
信号与信息处理 山东师范大学 2017(学位年度)
摘要:放射治疗是目前最为流行且有效的肿瘤治疗方法,由于IMRT具有陡峭的剂量跌落梯度,精准的剂量调节,更好的危及器官保护能力,所以广泛应用在头颈部肿瘤放射治疗当中。临床上,癌症患者的治疗周期一般为6-7周,在此期间,癌症病人的体重变化,以及肿瘤体积的变化等因素很可能导致靶区、OARs的解剖结构发生变化。如果继续使用原始计划做放射治疗,就会使靶区剂量降低,危及器官剂量升高,进而促使正常组织受到射线的损伤,增加并发症发生概率,大大降低病人的生活质量。
  基于以上情况,目前临床上采取的措施是在肿瘤患者每次放射治疗前,进行CT或者CBCT扫描来指导摆位,治疗3-4周时修改一次治疗计划。然而仅仅修改一次计划还不能很好的弥补癌症患者靶区、OARs的解剖结构变化对剂量分布造成的严重影响。因此本论文针对目前临床上存在的上述疑难问题,设计四种自适应IMRT调整方案,巧妙运用基于梯度的形变配准方法,解决临床放疗中的难题,主要内容概括为以下两个方面:
  (1)基于梯度的形变配准方法的研究
  本论文针对CBCT图像密度分辨率低,以及CBCT图像与CT图像密度不一致的问题,提出了一种基于梯度的形变配准方法。本部分首先对CT与CBCT图像的成像原理,成像特点展开了论述,并针对以上两种图像的特点,构建空间形变模型,设计高效的形变配准方法,并运用临床病人数据对该方法进行了实验验证分析,为了进一步证明该形变配准方法的有效性及可行性,本论文将基于梯度的配准算法与配准领域内公认的“金标准”Demons形变配准算法进行了对比试验、分析。
  (2)四种头颈部肿瘤自适应IMRT调整方案的对比研究
  本论文,首先选取28例头颈部肿瘤患者进行试验研究,所有肿瘤患者均接受常规分割治疗。在放疗周期内,选取患者各个放疗周第1天扫描获取的CBCT图像(共6周)作为参考图像,计划CT图像作为目标图像,将两者形变配准后的图像定义为“伪CT”图像。其次,设计四种不同频次计划调整方案,无计划调整作为参考方案,定义每种方案的实际剂量与计划调整剂量,并在所得到的6套“伪CT图像”上重新计算剂量,并运用基于密度的形变配准算法进行单周分次剂量的叠加,计算得到每种计划调整方案的累加实际剂量与计划调整剂量。最后,量化评估放疗周期期间肿瘤靶区、OARs体积与剂量的变化,并分别统计分析两者的变化规律,以及两者变化之间的相关性。最终得出结论:再计划可确保靶区足够剂量,使危及器官受量控制在安全范围内,再计划频次越高,实际剂量越接近计划调整剂量,2次再计划方案效率最高。
[硕士论文] 刘颖
肿瘤学(肿瘤放射治疗学) 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  研究发现,AngⅡ主要存在于肿瘤的乏氧区域,并且是由肿瘤细胞通过糜蛋白酶(chymase,CMA)依赖的途径产生,而不是ACE依赖的经典RAS途径。并进一步揭示了糜蛋白酶依赖途径受到糖酵解代谢产物——乳酸水平调节,而且在乏氧肿瘤细胞中AngⅡ水平的增加对于HIF-1α在细胞内的累积起重要作用,并介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗。这不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据,而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。
  方法:
  1.检测头颈部肿瘤中血管紧张素Ⅱ在肿瘤乏氧区域的表达
  运用ELISA实验及细胞免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞株和乳腺癌细胞株在体外不同氧环境(常氧及乏氧)下的血管紧张素Ⅱ表达情况。构建裸鼠皮下移植瘤模型,结合HIF-1α抗体,利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在肿瘤组织中的分布与HIF-1α表达区域的相关性,进而分析AngⅡ与肿瘤乏氧区域的相关性。利用免疫荧光技术分析血管紧张素Ⅱ在人鼻咽癌标本中的分布与HIF-1α表达区的相关性,进而分析AngⅡ与肿瘤乏氧区域的相关性。
  2.检测乏氧情况下肿瘤细胞产生血管紧张素Ⅱ的机制
  利用AGT慢病毒载体构建稳定抑制血管紧张素原表达的鼻咽癌细胞株CNE2和5-8F,并运用ELISA实验检测鼻咽癌细胞培养基中AngⅡ的表达。通过皮下注射上述细胞株建立小鼠移植瘤模型,运用免疫荧光技术分析移植瘤组织内AngⅡ与哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域的相关性。通过荧光定量PCR及Western B1ot技术检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素原(AGT)、肾素(Renin)和血管紧张素转换酶(ACE)的基因及蛋白的表达水平。针对RENIN和ACE各设计3条短干扰RNA片段(siRNA),使用细胞转染技术抑制细胞中RENIN和ACE的表达。然后利用ELISA实验检测不同氧环境(常氧及乏氧)下鼻咽癌细胞株RENIN和ACE沉默后AngⅡ的表达情况。利用基因表达微阵列分析的方法找出显著影响肿瘤细胞AngⅡ形成的糜蛋白酶(chymase,CMA),并使用Western Blot进一步证实。然后通过构建CMA的慢病毒载体抑制其表达,使用ELISA实验检测不同氧环境(常氧及乏氧)下鼻咽癌细胞株CMA沉默后的AngⅡ表达情况。
  3.检测改变培养基pH或加入乳酸是否影响肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的表达
  通过使用1%盐酸(HCl)和5%碳酸氢钠(NaHCO3)将常氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至乏氧条件培养的水平,或者将乏氧条件下肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平,然后使用ELISA实验检测pH调整后肿瘤细胞培基中AngⅡ表达情况。使用乳酸检测试剂盒检测不同氧环境下(常氧及乏氧)鼻咽癌细胞中乳酸的表达情况,并运用ELISA的实验方法检测不同氧环境(常氧及乏氧)的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后鼻咽癌细胞的AngⅡ表达情况。
  4.检测肿瘤细胞产生的乳酸是否影响糜蛋白酶的表达
  5.检测乏氧肿瘤细胞中血管紧张素Ⅱ与HIF-1α表达的关系
  6.检测血管紧张素Ⅱ与头颈部肿瘤细胞辐射敏感性关系
  7.统计分析
  结果:
  1.肿瘤乏氧区域存在局部血管紧张素Ⅱ
  利用ELISA试剂盒检测鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、5-8F及乳腺癌细胞株MDA-MB-231不同氧浓度下的AngⅡ生成情况。结果显示在体外普通培养条件(常氧)下,肿瘤细胞培养基中可检测到少量AngⅡ生成,而在乏氧培养条件下,肿瘤细胞培养基中AngⅡ水平显著升高。运用细胞免疫荧光技术检测发现常氧条件下培养的CNE2及MDA-MB-231仅有极少量的AngⅡ表达在胞浆中,而乏氧条件下培养的肿瘤细胞胞浆中AngⅡ表达明显升高。在裸鼠的CNE2移植瘤模型中的荧光检测发现AngⅡ主要集中在乏氧诱导因子HIF-1α高表达的乏氧区域。另外我们还收集了13例鼻咽癌肿瘤标本,用激光共聚焦显微镜观察到AngⅡ与HIF-1α表达于鼻咽癌肿瘤标本的同一区域。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中,我们通过组织免疫荧光检测发现在哌莫硝唑指示的肿瘤乏氧区域AngⅡ的表达明显下降。这些结果均提示局部RAS存在于肿瘤的乏氧微环境中。
  2.乏氧肿瘤细胞不是通过经典的RAS途径产生血管紧张素Ⅱ
  荧光定量PCR及Western Blot技术检测发现在鼻咽癌CNE2细胞株中只有肾素在乏氧条件下其基因及蛋白水平显著升高,而AGT与ACE在乏氧条件下与常氧相比具有相似的表达水平。在特异性敲除肾素的CNE2和5-8F鼻咽癌细胞株中,通过ELISA检测发现乏氧情况下两细胞株培养基中的AngⅡ水平降低。而特异性敲除血管紧张素转换酶的CNE2和5-8F细胞株中则无此种改变。这些结果提示我们,在乏氧的肿瘤细胞中AngⅡ的产生可能并不依赖典型的RAS途径。
  3.乏氧肿瘤细胞通过糜蛋白酶依赖途径产生血管紧张素Ⅱ
  基因表达微阵列分析结果显示,在乏氧的CNE2细胞中糜蛋白酶转录显著增加,并通过Western Blot进一步得到了证实。我们利用慢病毒载体,构建了稳定敲除CMA的CNE2和5-8F细胞株。ELISA实验结果显示,乏氧培养环境中的鼻咽癌细胞株在CMA沉默后其AngⅡ表达较常氧情况下显著降低。以上研究结果表明,在肿瘤的乏氧微环境中,糜蛋白酶介导AngⅡ的生成途径可能是ACE依赖AngⅡ生成途径的替代通路。
  4.肿瘤来源的乳酸介导了乏氧肿瘤细胞血管紧张素Ⅱ的产生
  运用ELISA检测不同氧环境(常氧及乏氧)中鼻咽癌细胞CNE2及5-8F的培养基中加入乳酸钠提高细胞内乳酸水平或者加入草氨酸钠抑制细胞内乳酸生成后其AngⅡ的表达水平。结果显示,用HC1酸化培养基后并未显著增加培养基中AngⅡ的含量,相反,利用5%碳酸氢钠(NaHCO3)将乏氧条件下培养的肿瘤细胞培基pH调整至常氧条件培养的水平后AngⅡ的含量上升。以上研究结果表明酸性pH并不是影响乏氧肿瘤细胞CMA依赖途径生成AngⅡ的主要因素。而乳酸测定的结果显示,乏氧条件培养的CNE2及5-8F细胞中乳酸水平较常氧条件下显著升高。在CNE2及5-8F细胞的培养基中加入乳酸盐后,ELISA检测发现常氧及乏氧条件下的培养基中AngⅡ水平显著增高,加入草氨酸钠后抑制胞内乳酸生成后AngⅡ水平则降低,而挽救实验可恢复两种培养条件下培养基中的AngⅡ水平。这就说明是乳酸而不是pH的降低引起乏氧肿瘤细胞中AngⅡ水平的增加。
  5.肿瘤产生的乳酸调节肿瘤细胞中糜蛋白酶的表达
  Western Blot检测结果显示,无论常氧还是乏氧培养条件,在CNE2细胞培养基中加入乳酸盐后其糜蛋白酶的表达增加,加入草氨酸钠后则发生抑制。在CNE2细胞培养基中加入碳酸氢钠碱化培养基后,两种培养条件下的糜蛋白酶亦有所增加。此外,乳酸盐及培养基的碱化也使肾素的表达一定程度上升高。这些研究结果表明,乏氧肿瘤细胞中乳酸水平的增加可能是造成糜蛋白酶表达升高的重要因素。
  6.血管紧张素Ⅱ调节乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白的累积
  Western Blot实验显示,AngⅡ处理及乏氧条件下的CNE2细胞中HIF-1α蛋白显著升高,而加入坎地沙坦后可抑制HIF-1α蛋白的升高。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2细胞的动物移植瘤模型中,我们通过组织免疫荧光检测发现AGT沉默后,大大减弱了HIF-1α蛋白在哌莫硝唑标记的肿瘤乏氧区域中的积累。这些实验结果说明在乏氧肿瘤微环境中AngⅡ参与调节HIF1-α蛋白的累积。
  7.局部生成血管紧张素Ⅱ介导了乏氧肿瘤细胞的辐射抵抗
  克隆形成实验显示,乏氧条件下鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的辐射抵抗能力较常氧条件下显著增加,而AT1R特异性拮抗剂坎地沙坦能逆转乏氧条件造成的肿瘤细胞辐射抵抗,显著增加其辐射敏感性。裸鼠的CNE2细胞株皮下成瘤实验发现AT1R拮抗剂坎地沙坦处理组较对照组显著减小了10Gy辐射后的肿瘤体积。在AGT稳定敲除的鼻咽癌CNE2及5-8F细胞的动物移植瘤模型中,AGT沉默组小鼠的移植瘤体积在10Gy辐射后较阴性对照组显著降低。这些结果均表明,肿瘤乏氧微环境中AngⅡ的增加介导了肿瘤的辐射抵抗,使用AT1R拮抗剂坎地沙坦可以特异地在乏氧环境下增加肿瘤细胞的辐射敏感性。
  结论:
  本研究揭示了局部RAS主要存在于肿瘤的乏氧区域,肿瘤细胞可能主要通过糜蛋白酶(chymase,CMA)依赖的途径产生AngⅡ,而不是ACE依赖的途径,并以自分泌或旁分泌的方式发挥作用。肿瘤细胞来源的乳酸,而非乏氧环境的pH降低,通过激活乏氧肿瘤细胞的肾素及糜蛋白酶的表达引起AngⅡ的生成增加。最后,我们发现AngⅡ可使乏氧肿瘤细胞中HIF-1α蛋白增加,从而介导了肿瘤细胞的辐射抵抗,而坎地沙坦可以特异的增加乏氧肿瘤细胞的辐射敏感性。我们的研究结果不仅为深入理解头颈部肿瘤乏氧介导的辐射抵抗机制提供新的理论依据,而且为克服头颈部肿瘤放疗抵抗从而减少放疗后残留及复发提供了新的思路和手段。
[硕士论文] 江汇源
肿瘤学 蚌埠医学院 2017(学位年度)
摘要:研究背景:头颈部肿瘤是世界常见肿瘤之一,每年有543,941的新病例,228,729死亡病例,类型包括唇、口腔、喉和鼻咽部肿瘤。在美国,口腔和咽部肿瘤占所有的恶性肿瘤2.4%,每年约4万9000新病例和9.5万例死亡病例。对于远处转移、复发不适合根治治疗的患者,化疗是主要治疗方法。尽管最近在治疗上的进展,如针对表皮生长因子受体的靶向治疗,头颈部恶性肿瘤晚期患者及复发或转移患者的总体生存率依然很低[1]。PD-1及PD L1靶向药的出现,将会给头颈部肿瘤患者提供全新的治疗选择,极有可能大幅增加头颈部肿瘤患者的存活时间[2]。探索PD L1在头颈部肿瘤表达情况,可以为此类肿瘤免疫治疗提供有价值的参考。
  目的:检测头颈部肿瘤组织中PD-1、PD L1的表达,探讨其在良、恶性肿瘤中表达,与不同病理分级、临床分期的关系,比较其中差异性及相关性,为头颈部恶性肿瘤免疫治疗提供理论和实验基础。
  方法:将2015年1月至2016年6月收治的40例头颈部恶性肿瘤组织及20例头颈部囊肿组织的手术标本经包埋制作成蜡块,再制作成组织芯片,使用免疫组织化学SP二步法检测芯片PD L1蛋白的表达情况,卡方检验PDL1表达水平与患者临床病理参数(年龄、性别、病理分级、临床分期)的关系。
  结果:PD L1在头颈良性肿瘤组织中不表达,在恶性肿瘤组织中阳性表达,阳性率为65%(26/40),差异有统计学意义(P<0.05)。PD L1表达与其表达水平与年龄、性别、病理分级无关(P>0.05),而与患者临床分期密切相关(P<0.05)。
  结论:PD L1在头颈部恶性肿瘤组织中表达显著升高,可为头颈部恶性肿瘤的免疫靶向治疗提供思路。
[硕士论文] 马玉婷
头颈外科学 广西医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:探讨头颈部鳞癌患者手术前后细胞免疫水平及意义。
  方法:该研究回顾性分析了在2015年1月至2017年1月期间收住于广西医科大学附属肿瘤医院头颈外科手术的52例初治头颈部鳞癌患者的临床资料,选择同一时期内在广西医科大学附属肿瘤医院体检的52例健康者作为对照组,应用流式细胞术检测,比较对照组及在病例组手术前3天、手术后第7天、手术后第14天以及手术后第21天组间外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、CD19+细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)水平以及CD4+/CD8+比率的变化。
  结果:
  1.病例组患者CD4+、NK细胞水平均明显低于健康者,而CD19+细胞水平显著升高(P<0.05);
  2.病例组患者术后7d的外周血淋巴细胞CD8+、CD19+显著低于术前(P<0.05),CD3+、CD4+、NK细胞水平以及CD4+/CD8+比率显著高于术前(P<0.05);
  3.病例组患者术后14d外周血淋巴细胞CD3+,CD4+、NK细胞水平以及CD4+/CD8+比率显著高于术前(P<0.05),CD8+、CD19+细胞水平显著低于术前(P<0.05);
  4.术后21d的外周血淋巴细胞CD3+,CD4+、NK细胞水平以及CD4+/CD8+比率显著高于术前(P<0.05),CD8+、CD19+细胞水平显著低于术前(P<0.05);
  5.术后14d的NK细胞水平较术后7d显著性增高(P<0.05),其余组无统计学差异(P>0.05);
  6.术后21d的外周血淋巴细胞CD19+、NK细胞水平显著高于术后7d(P<0.05),CD8+低于术后7d(P<0.05);
  7.病例组头颈部鳞癌患者术后14d与21d外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK细胞水平及CD4+/CD8+比率无统计学差异;
  8.Ⅲ~Ⅳ期患者的外周血淋巴细胞CD3+、CD4+细胞水平低于Ⅰ~Ⅱ期的患者(P<0.05),CD8+细胞水平显著升高(P<0.05);
  9.有淋巴结转移的患者外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比率细胞水平显著降低(P<0.05),CD8+、CD19+细胞水平显著升高(P<0.05)。
  结论:
  1、与健康者比较,头颈部鳞癌患者术前的细胞免疫水平相对较低;
  2、手术切除肿瘤后,头颈部鳞癌患者的细胞免疫水平可逐渐改善;
  3、晚期、有淋巴结转移的头颈部鳞癌患者细胞免疫水平均较低,提示头颈部鳞癌患者的细胞免疫水平与临床分期、有无淋巴结转移相关。
[硕士论文] 蔡昭文
外科学(神经外科) 福建医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:分析腰椎椎管肿瘤的分型,并根据腰椎椎管肿瘤的分型探讨其微通道手术方式的选择。
  方法:回顾性分析福建医科大学附属协和医院神经外科2013年11月-2016年06月收治的31例腰椎椎管肿瘤患者,术后病理示其中神经鞘瘤占有19例,脊膜瘤占有8例,室管膜瘤占有3例,神经纤维瘤占有1例。根据我科微通道手术的经验,结合MRI检杳结果确定其腰椎椎管肿瘤的分型,对于Ⅰa型的腰椎椎管肿瘤(肿瘤在横断面上位于椎管一侧并小于50%椎管面积,未累及椎间孔),采用经皮微通道肌间隙同侧入路显微切除,对于Ⅰb型的腰椎椎管肿瘤(肿瘤在横断面上占据椎管两侧,但未累及椎间孔),采用经皮微通道肌间隙一侧入路显微切除,对于Ⅰb+Ⅱ型或Ⅰa+Ⅱ型或单纯Ⅱ型腰椎椎管肿瘤(Ⅱ型为肿瘤累及椎间孔区),则采用经皮微通道肌间隙对侧(相对于Ⅱ型肿瘤所在位置)入路显微切除,而对于达到Ⅲ型(肿瘤累及椎间孔外区域)的腰椎椎管肿瘤,则采用微通道+开放手术方式。术后分析手术时间、手术中出血量、手术后住院时间;检测并记录术前1d和术后1d、3d、5d肌酸磷酸激酶(CPK-MM)水平;记录术前1d、术后1d、3d、5d和术后6个月日本骨科学会(JOA)评分和疼痛视觉模拟量表(VAS)评分;术后1周行腰椎 CT三维重建;术前、术后1周、术后6个月行MRI平扫加增强。
  结果:本组病例椎管占位完全切除者31例;手术时间120-192min,平均(165.90±18.40)min,手术中出血量24-72ml,平均(45.32±12.70)ml,手术后住院时间7-11d,平均(7.90±1.22)d;术后1d CPK-MM较术前1d比较升高,差异有统计学意义(P<0.05),术后3d CPK-MM较术前1d比较升高,差异有统计学意义(P<0.05),术后5d下降至术前1d相当,差异无统计学意义(P>0.05);随访6个月术后JOA评分及术后VAS评分与术前相比差异有统计学意义(P<0.05);术后CT三维重建可见术中椎板磨除范围,关节突关节未受损伤;MRI平扫加增强检查中,31例腰椎椎管肿瘤全切患者均未见复发。
  结论:将腰椎椎管肿瘤进行合理分型,并根据腰椎椎管肿瘤分型对微通道手术方式进行选择具有明显的临床指导价值。此分型及微通道手术方式的选择既能避免损伤棘突、关节突关节,减少对肌肉和韧带等软组织的损伤,也能达到切除椎管内占位的目的,且创伤小、恢复时间较短。对于指导临床的治疗有一定的意义。
[硕士论文] 杨博
口腔临床医学 南方医科大学 2017(学位年度)
摘要:90%以上的头颈肿瘤为头颈鳞状细胞癌。全球每年约有50多万新发的头颈鳞状细胞癌患者,而每年因头颈鳞状细胞癌死亡的患者有20万左右[1,2]。其中头颈鳞状细胞癌的治疗方式以手术治疗为主,辅以放疗、化疗及分子靶向治疗等[3]。尽管许多的治疗手段在不断的更新和进步,但是头颈鳞状细胞癌患者五年的总生存率并没有得到明显的改善,维持在50%左右。患者如果出现病灶的远处转移,那五年生存率则下降至20%左右[4],严重危害人类的健康和生命。因此,本文利用生物信息学数据库对头颈鳞状细胞癌中基因从分子水平进行研究,为了解头颈鳞状细胞癌的发病机制和临床预防和抑制头颈鳞状细胞癌提供有效措施和方法。
  生物信息学是一个涉及多个领域的交叉学科,其核心内容之一是研究基因表达调控的内在机制,揭示人类疾病的本质规律,为更快速、准确的诊断和有效治疗疾病创造条件。本研究旨在对基因芯片数据进行生物信息学分析找到与头颈鳞状细胞癌发生发展相关的差异基因和其功能。首先我们从GEO(GeneExpression Omnibus)数据库下载基因表达谱GSE6791[5],其包括42个头颈鳞状细胞癌和与正常的癌旁组织。与正常组织相比,结合Bioconductor中的Affy包和根据其注释平台通过Affy芯片探针注释文件对探针水平数据进行预处理后,用R语言中的limma包对预处理过后的表达矩阵进行差异基因寻找(logFC>1,p<0.05)。然后用DAVID数据库对上调和下调的差异基因进行GO功能注释和KEGG通路分析差异基因的生物学功能和涉及的信号通路,然后应用STRING数据库对差异基因(综合分数≥0.8)构建蛋白互作网络图,通过Cytoscape软件将其可视化,利用MCODE插件对蛋白互作网络进行模块分析,并对不同的模块进行GO功能注释和KEGG通路分析。最后,根据网络拓扑分析(节点度)选取蛋白互作网络中重要的核心蛋白,通过TCGA数据库验证这些核心基因的表达水平是否与头颈鳞状细胞癌生存预后有明显的相关性。
  通过上述方法,我们得到811个差异基因,其中有550个是表达上调的,而261个表达下调。GO功能注释和KEGG通路分析显示这些差异基因主要富集在蛋白酶体和ECM-受体相互作用通路中。用STRING数据库将符合标准的差异基因构建成蛋白互作网络后,利用MCODE插件得出三个重要的模块,而它们主要富集在蛋白酶体和ECM-受体相互作用通路中。在蛋白互作网络中,根据节点度的大小,我们得到15个核心蛋白,而这15个核心蛋白大部分处于上述的模块中。另外利用TCGA头颈鳞状细胞癌数据库显示,4个mRNA高表达的核心基因与患者总的生存率有明显的负相关性,如PSMA7,ITGB4,ITGA6和APP。以上研究表明,这4个核心基因可能通过上述通路对头颈鳞状细胞癌发生发展起到重要作用,为我们进一步研究头颈鳞状细胞癌潜在的机制提供了的方向,而且这些核心基因也可能成为头颈鳞状细胞癌诊断和治疗潜在的靶点,当然我们仍然需要通过进一步的实验研究来验证我们的结论。
[硕士论文] 周华群
耳鼻咽喉科学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:从姜黄素和白藜芦醇对凋亡相关蛋白表达的影响的角度探讨其对人头颈部肿瘤细胞系增殖和凋亡的影响机制。
  方法:用姜黄素联合白藜芦醇联合处理Hep2(人喉癌上皮细胞)和Fadu(人下咽鳞癌细胞),采用MTT(噻唑蓝)比色法检测细胞存活率,平板克隆形成实验检测单个细胞集落形成能力,Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况,Westernblot检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,同时应用Real-time PCR法检测Bax和Bcl-2mRNA表达水平。
  结果:
  1.姜黄素和白藜芦醇可抑制Hep2细胞和Fadu细胞的存活率。
  在Hep2细胞和Fadu细胞中,不同浓度的姜黄素和白藜芦醇可使细胞存活率降低,并有剂量效应;当20μM的白藜芦醇与不同浓度姜黄素联合处理时,Hep2细胞和Fadu细胞的存活率显著降低。
  2.姜黄素和白藜芦醇可抑制Hep2细胞和Fadu细胞的集落形成。
  与空白对照相比,10μM的姜黄素和20μM的白藜芦醇均可抑制Hep2和Fadu细胞集落的形成;10μM姜黄素和20μM白藜芦醇联合处理24小时后,Hep-2细胞和Fadu细胞集落形成率显著降低。
  3.姜黄素和白藜芦醇促进Hep2细胞和Fadu细胞的凋亡。
  与空白对照相比,10μM的姜黄素和20μM的白藜芦醇均可促进Hep2细胞和Fadu细胞的凋亡;10μM姜黄素和20μM白藜芦醇联合处理细胞24小时后,Hep2细胞和Fadu细胞的凋亡率明显增加。
  4.姜黄素和白藜芦醇促进Hep2细胞和Fadu细胞中Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。
  10μM的姜黄素和20μM白藜芦醇可以促进Hep2细胞和Fadu细胞中促凋亡蛋白Bax的表达,同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达;10μM姜黄素和20μM白藜芦醇联合处理后,Bax的蛋白表达水平和mRNA表达水平均显著增加,而Bcl-2的蛋白表达水平和mRNA表达水平均显著降低。
  结论:姜黄素与白藜芦醇联合处理可降低Hep2细胞和Fadu细胞的存活率,抑制细胞集落的形成并促进细胞的凋亡。姜黄素与白藜芦醇促进Hep2细胞和Fadu细胞凋亡的作用机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达有关。
[硕士论文] 张思林
耳鼻咽喉头颈外科学 南昌大学;南昌大学医学院 2017(学位年度)
摘要:目的:
  应用Meta分析的方法,评价miRNA-146a rs2910164单核苷酸多态性与中国人群头颈鳞状细胞癌易感性关系。
  方法:
  计算机检索PubMed、Embase、CNKI、web of science和万方数据库,辅以手工检索相关会议论文及相关研究参考文献,全面收集2017年3月10日之前发表的所有国内外文献,文献的内容是miRNA-146a单核苷酸多态性与头颈肿瘤相关。严格制定纳入和排除标准,符合条件的文献由两名研究员单独提取数据资料,采用Newcastle-Ottawa Scale(NOS)进行质量评估,用STATA14对数据进行定量合成分析。评价标准采用比值比( Odds ratio, OR)和95%可信区间(Confidence interval, CI),计算六种遗传模型下miRNA-146a单核苷酸多态性与中国人群头颈鳞状细胞癌易感性的相关性,六种遗传模型分别为:等位模型(C vs. G)、显性模型(GC+CC vs. GG)、隐性模型(CC vs. GG+GC)、纯合模型(CC vs. GG)、杂合模型(GC vs. CC)、加性模型(GG+CC vs. GC)。采用Q检验和I2统计量法统计研究之间的异质性,根据异质性大小选择合并效应量的效应模型,如果P<0.1, I2<50%,合并OR值采用Mantel-Haenszel(M-H)固定模型,否则采用DerSimonian-Laird(D+L)随机模型。如果存在异质性,需要寻找异质性来源,采用亚组分析方法,可对肿瘤发生部位,原始研究的地域、基因型检测方法进行了亚组分析。判断研究间发表偏倚选用Begg检验和Egger线性回归(P<0.05考虑存在发表偏倚),显著性检验P<0.05考虑有统计学意义。最后采用敏感性分析评估结果的稳定性。
  结果:
  本研究共纳入6篇文献,包含8组病例对照研究实验,均为miRNA-146a单核苷酸多态性与头颈鳞癌相关的研究,本次研究的病例组和对照组总样本数为13519例。
  Meta分析结果显示:microRNA-146a多态性等纯合型基因模型(CC vs. GG)及显性基因模型(GC+CC vs. GG)和HNC易感性存在正相关的关系,GC+CC vs. GG:OR=1.13;95%CI=1.003-1.293;CC vs. GG:OR=1.19;95%CI=1.032-1.382,而其他遗传模型无统计学意义。对地理区域、肿瘤发生部位进行亚组分析结果显示:显性模型和纯合型模型具有统计学意义,值得注意的是,基因分型检测方法亚组分析结果提示,PCR检测基因型方法可能更有助于提高基因分型试验的准确性;
  发表偏倚分析显示:Begg和Egger`s检验结果均支持无发表偏倚;
  敏感性分析结果显示:各组基因遗传模型meta分析结果稳定可靠。
  结论:
  1、Meta分析结果提示: microRNA-146a单核苷酸多态性可能与中国人群SSHNC易感性具有相关性。microRNA-146a G>C纯合型基因模型(CC vs. GG:)及显性基因模型(GC+CC vs. GG)有可能增加头颈肿瘤的易感性;
  2、亚组分析结果提示:显性模型和纯合型模型在地理区域、肿瘤发生部位中均具有统计学意义,结果提示:microRNA-146a多态性与肿瘤发生部位有差异,纯合型模型有可能增加鼻咽部和喉部肿瘤风险;显性型模型有可能增加喉部肿瘤风险;值得注意的是,基因分型检测方法亚组分析显示:PCR方法可能更有助于提高基因分型试验的准确性;
  3、因本研究纳入样本量较小,而microRNA-146a G>C位点的各个研究间存在异质性,还有没有充分考虑基因与基因以及基因与环境之间的共同作用影响,所以本研究的结论还需要更多的单病种大样本实验来验证。
[博士论文] 孙姗姗
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:研究目的:
  本研究旨在探究转录因子STAT3-长链非编码RNA HOTAIR信号通路在人头颈部鳞癌生长和药物(顺铂、西妥昔单抗)敏感性的调控机制。
  研究方法:
  MTT实验检测头颈部鳞癌细胞经过处理后的活性。Brdu实验、克隆形成实验用于检测经过处理后的肿瘤细胞增殖能力。蛋白印迹(Western blot)实验、免疫组织化学(IHC)实验用于检测肿瘤细胞和组织中STAT3(pSTAT3),EZH2(pEZH2),MDR1,AKT(pAKT),细胞周期相关蛋白(p16,p21,cyclin-D1),凋亡相关蛋白(Bcl2,Bax,cleaved caspase3),H3K27me3的表达。实时定量PCR实验和荧光原位杂交(FISH)实验检测细胞和组织中非编码RNA HOTAIR的表达情况。流式细胞术用于检测靶向STAT3/HOTAIR后肿瘤细胞周期的变化情况。免疫共沉淀(IP)实验和荧光素酶报告基因实验探究STAT3,HOTAIR和EZH2三者之间的调控关系。构建头颈部鳞癌HOTAIR过表达稳定细胞株后,用原位小鼠模型证明HOTAIR过表达对头颈部鳞癌增殖的意义。
  研究结果:
  头颈部鳞癌细胞中,STAT3,HOTAIR和PIK3CA存在高表达,对顺铂和西妥昔药物敏感性差异。人头颈部鳞癌组织与细胞标本中,STAT3表达水平与PIK3CA表达水平正相关,HOTAIR表达水平与肿瘤大小差异具有统计学意义。Western blot实验结果表明,头颈部鳞癌细胞中,IL-6/STAT3信号通路与长链非编码RNA HOTAIR表达呈正相关。应用WP1066小分子抑制剂抑制STAT3活性后可影响HNSCC克隆形成能力和细胞增殖能力;过表达STAT3或者HOTAIR可使细胞周期S期比率增加。荧光素酶报告基因实验显示STAT3通过与HOTAIR启动子区结合从而调控HOTAIR转录。免疫共沉淀实验证实STAT3与EZH2丝氨酸21位点磷酸化相互结合。WP1066或者敲低HOTAIR使STAT3/HOTAIR信号通路受抑制后,可使HNSCC细胞对顺铂和西妥昔单抗药物的敏感性提高(影响细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡通路相关蛋白表达)。体内实验UM-SCC1裸鼠原位模型证明HOTAIR过表达促进肿瘤生长。
  研究结论:
  研究表明:
  STAT3/HOTAIR,EZH2过表达与头颈部鳞癌药物敏感性相关。头颈部鳞癌细胞中,IL-6/STAT3信号通路与长链非编码RNA HOTAIR表达呈正相关。抑制STAT3/EZH2可影响HNSCC细胞周期和增殖能力。STAT3通过与磷酸化EZH2丝氨酸21位点结合,促进HOTAIR转录。抑制IL-6/STAT3/HOTAIR信号通路可增加HNSCC细胞对顺铂和西妥昔单抗的药物敏感性。体内试验证实,HOTAIR过表达可促进HNSCC增殖。
  综上,IL-6/STAT3信号通路通过与EZH2丝氨酸21位点磷酸化结合从而调控HOTAIR转录,这或将成为头颈部鳞癌治疗的新靶标。
[博士论文] 王宇
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)是人类发病率排行第六位的恶性肿瘤。HNSCC患者的5年生存率不超过50%。超过70%的患者会出现不同程度的术后复发以及淋巴结转移。因此,研究与探索HNSCC有效的治疗方案变得至关重要!
  Signal Transducer and Activator of Transcription3(STAT3)信号通路的异常激活已被证实与头颈部鳞癌的生长和侵袭转移都密切相关。目前,STAT3的研究已取得长足的发展,然而目前尚没有靶向抑制剂上市。因此,急需一种安全有效的STAT3抑制剂来改善当前的困局。HJC0152是一种新型的STAT3靶向抑制剂,为探讨药物 HJC0152在头颈鳞癌中的抗肿瘤效果,以及其抗肿瘤效果的可能机制,本课题研究分为以下四个部分:
  方法
  第一部分:应用蛋白质免疫印迹检测各细胞株中STAT3基础表达情况。MTT法检测HJC0152的半数致死量(IC50)。检测细胞HJC0152处理后STAT3,p-STAT3(Tyr705)表达差异以及定位变化。
  第二部分:MTT实验检测细胞活性的抑制能力;平板克隆实验分析肿瘤细胞增殖能力;流式细胞方法分析头颈鳞癌细胞凋亡、周期变化;蛋白质免疫印迹检测增殖,凋亡相关蛋白。Transwell实验与scratchtest分析肿瘤细胞运动能力;明胶酶谱检测胞外基质金属蛋白酶分泌情况;免疫荧光观察EMT相关指标的定位差异。
  第三部分:qPCR技术,检测药物HJC0152处理后miR-21变化;Western blot技术检测STAT3下游VHL,β-catenin变化情况;免疫荧光检测β-catenin定位变化;Top/Fop荧光素酶报告实验检测β-catenin通路活性。恢复实验验证VHL在HJC0152抗癌机制中的重要作用。
  第四部分:建立裸鼠头颈鳞原位动物模型。小动物成像系统检测肿瘤大小变化;TUNEL实验检测肿瘤凋亡情况;免疫组织化学检测相关蛋白表达变化。
  结果
  1、SCC25以及CAL27细胞系STAT3与p-STAT3明显高于其他细胞系。MTT法检测HJC0152半数致死量,选取SCC25(IC50=2.18μmol/L)和CAL27(IC50=1.05μmol/L)。Western blot检测发现,HJC0152显著抑制p-STAT3磷酸化水平。通过对比转染STAT3 si的HNSCC细胞系,我们发现HJC0152与si-STAT3效果一致。Western blot表明,药物对Akt,Erk1/2通路没有抑制活性,证明药物特异性地抑制STAT3信号通路。应用HJC0152处理HNSCC细胞系,免疫荧光发现p-STAT3发生定位变化,药物有效抑制其入核。且抑制作用具有浓度依赖性与时间依赖性。
  2、我们通过transwell迁移实验和划痕实验,发现HJC0152可浓度依赖地抑制HNSCC细胞株的迁移能力(P<0.05);transwell侵袭实验证明HJC0152可抑制HNSCC细胞株的侵袭能力(P<0.05);明胶酶谱实验证明HJC0152可有效降低基质金属蛋白酶的胞外分泌;免疫荧光与western blot都证明药物可有效抑制EMT相关标志蛋白的表达水平。MTT与克隆形成实验检测在HJC0152处理后,能显著抑制HNSCC细胞株的增殖能力(P<0.05);HNSCC细胞株细胞周期分布明显变化,表现为 G0/G1期阻滞,细胞凋亡比率较对照组升高,并具有浓度依赖性(P<0.05);western blot检测提示Cleaved Caspase-3、BAX、p21蛋白的表达水平升高;而Bcl-2、Cyclin D1的表达水平受到抑制。
  3、药物HJC0152处理HNSCC细胞株后,对比STAT3 si,两者对miR-21的表达水平都有明显的抑制效果(P<0.05)。药物HJC0152处理细胞24h后,有效抑制细胞株中miR-21的表达水平(P<0.05);下游VHL表达升高,β-catenin表达下降。Top/Fop荧光素酶报告实验证实,HJC0152处理细胞后,β-catenin转录活性下调(P<0.05);核浆分离蛋白检测发现,总β-catenin和磷酸化β-catenin表达下调;免疫荧光提示药物有效抑制β-catenin入核转移;western blot检测发现VHL的降表达可抵抗HJC0152的抗肿瘤活性。
  4、HNSCC原位动物模型结果提示,给药组肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05),肿瘤质量明显低于对照组(P<0.05);TUNEL结果显示,HJC0152能够诱导体内肿瘤细胞凋亡;颈部局部解剖发现,HJC0152有效抑制HNSCC局部侵犯与淋巴结转移;IHC结果示,给药组中 p-STAT3(Tyr705)、β-catenin、MMP2/9、Ki-67、CyclinD1、Bcl-2表达水平下降,VHL、Cleaved Caspase-3的表达水平上调。
  结论
  1、在人头颈鳞状细胞癌中,HJC0152可选择性地抑制p-STAT3磷酸化及其核转移进程。
  2、HJC0152有效抑制头颈鳞癌侵袭与转移能力。同时,可明显抑制头颈鳞癌增殖能力,并诱导其凋亡。
  3、HJC0152可通过抑制STAT3磷酸化,调控下游miR-21/β-catenin信号通路。
  4、HJC0152通过STAT3/miR-21/β-catenin生物轴抑制头颈鳞癌原位肿瘤的增殖与侵袭能力。
[硕士论文] 李姚
耳鼻咽喉科学 安徽医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  探讨组织量丰富的胸大肌肌皮瓣在头颈部肿瘤切除术后缺损修复的手术技巧及术后并发症的处理与预防。
  方法:
  筛选2008年1月1日~2014年10月1日期间,于我院耳鼻咽喉头颈外科行头颈恶性肿瘤切除术后使用胸大肌肌皮瓣修复缺损的部分患者(仅包括超重/肥胖男性患者及女性患者),回顾性总结相关手术技巧及相应的术后并发症的处理经验。对于超重/肥胖男性或/和女性患者,其胸大肌肌皮瓣组织量丰富,利用改良的方法设计制备后,可修复头颈部各种缺损。皮岛通常设计在乳晕内下侧的胸大肌表面。皮岛皮肤、皮下组织的切面与胸大肌筋膜表面所形成夹角应不小于45°;于皮岛外侧1cm左右切断胸大肌内侧、下侧及外侧至肋骨骨膜和肋间肌表面,再于其表面向上剥离胸大肌至胸小肌表面;通过透视方法找出胸大肌肌皮瓣的血管蒂;制备好胸大肌肌皮瓣将其拉到缺损处,首先将胸大肌肌皮瓣的肌肉部分固定于术后缺损处,再将皮肤与受区的肌肉或粘膜对缝;修复后胸大肌肌皮瓣周围潜在的腔隙均需要放置负压引流。
  结果:
  本研究共23例,其中1例超重/肥胖患者在制备胸大肌肌皮瓣过程中误伤胸肩峰动脉,术中改为制备另一侧胸大肌肌皮瓣。制备完好的共23例胸大肌肌皮瓣全部成活,其中只有1例远端部分坏死,经换药后二期愈合;共有3例受区感染,形成咽漏,换药治疗后Ⅱ期愈合;1例患者受区皮肤与皮瓣部分裂开,同样经换药处理,Ⅱ期愈合;另有1例患者供区出现皮下积血,及时清理淤血后愈合。
  结论:
  组织量丰富的胸大肌肌皮瓣,不论是超重/肥胖的男性患者还是女性患者,由于血管走向恒定、血供丰富,虽然臃肿,制备和修复时比较困难,但只要确保手术中正确定位,细心识别血管蒂,仔细操作,术后积极密切监测和护理皮瓣及时发现并发症,并给予有效处理,肌皮瓣与创面仍可良好愈合,因此该类皮瓣仍然是头颈部术后缺损修复重建的重要皮瓣。
[硕士论文] 赵明慧
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  每年全球新增头颈部恶性肿瘤病人有50多万。近年来,头颈部恶性肿瘤发病率呈上升趋势,其中90%以上的病理类型为鳞状细胞癌。随着医学科学技术的发展,针对恶性肿瘤的诊断及治疗有了很大的进步,以手术、放疗、化疗为基础的综合治疗日趋完善,但晚期头颈部鳞状细胞癌病人治疗效果仍不佳。复发和转移是头颈部鳞状细胞癌病人预后不良的重要因素。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在恶性肿瘤转移过程中发挥重要作用。因此研究头颈部鳞状细胞癌转移机制,寻找新的治疗靶点成为提高病人预后的重点问题。研究表明,Zeste同源增强子(enhancer ofzeste homologue2,EZH2)在多种恶性肿瘤中过表达,具有调控肿瘤新生血管形成及促进肿瘤细胞迁移、侵袭的能力。EZH2能激活信号转导与转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3),使STAT3的活化形式p-STAT3表达水平上调。STAT3参与肿瘤EMT进程,能够提高血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2,KDR)的表达进而促进肿瘤新生血管形成以及肿瘤转移。有报道称,VEGFR2信号通路能激活STAT3信号通路。然而,关于在头颈部鳞状细胞癌中EZH2/STAT3/VEGFR2轴是否诱导EMT进程及其具体调控机制尚不明确。
  方法:
  本课题选用UM1和CAL27两种头颈部鳞癌细胞系,采用EZH2特异性小分子抑制剂DZNEP下调EZH2的表达,EZH2过表达质粒上调EZH2的表达,另外还使用小干扰RNA分别敲低STAT3及VEGFR2,对 EZH2/STAT3/VEGFR2轴调控头颈鳞癌上皮间质转化的能力进行了体内外实验研究。实验研究分为两部分:
  第一部分:
  Western blot法检测DZNEP、EZH2过表达质粒及siSTAT3、siKDR处理后两种头颈部鳞癌细胞系UM1和CAL27中EZH2、STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGFR2及EMT相关蛋白的表达变化;细胞划痕实验检测DZNEP、siSTAT3及siKDR处理后,两种HNSCC细胞系迁移能力的改变;Transwell体外侵袭实验检测两种HNSCC细胞系迁移、侵袭能力的改变;免疫荧光技术检测DZNEP、siSTAT3及siKDR处理后两种HNSCC细胞系EMT相关指标的变化;细胞骨架染色方法检测两种HNSCC细胞系处理前后细胞骨架的改变。
  第二部分:
  应用头颈鳞癌细胞系CAL27建立免疫缺陷裸鼠皮下荷瘤动物模型,使用DZNEP瘤内注射治疗,每次注射药物前测量肿瘤大小,称量小鼠体重,密切观察肿瘤生长变化,待观察结束,剥离裸鼠荷瘤,采用免疫组织化学方法检测EZH2、STAT3、p-STAT3、VEGF、VEGFR2及EMT相关蛋白表达水平变化情况,通过体内实验,进一步验证体外实验的结果。
  结果:
  与对照组相比,使用EZH2过表达质粒转染细胞后,p-STAT3、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平升高,STAT3表达水平无明显变化。使用DZNEP处理细胞降低EZH2表达后,p-STAT3、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平降低,STAT3表达水平无明显变化, EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示, N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,细胞骨架形成减少,呈现张力型骨架。使用siSTAT3处理细胞降低STAT3表达后,p-STAT3、EZH2、VEGF、VEGFR2表达水平均降低,EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示,N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,骨架形成减少,呈现张力型骨架。使用siKDR处理细胞降低VEGFR2表达后,EZH2、p-STAT3、VEGF表达水平均降低,STAT3表达水平无明显变化,EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;肿瘤细胞迁移、侵袭能力降低;免疫荧光示,N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调;细胞骨染色示,骨架形成减少,呈现张力型骨架。荷CAL27头颈鳞癌裸鼠动物模型结果示:DZNEP药物治疗后,能够显著抑制EZH2、p-STAT3、VEGF、VEGFR2的表达,STAT3表达无明显变化,同时EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平下调,E-cadherin表达水平上调。体内外实验结果一致。
  结论:
  头颈鳞癌细胞系中存在EZH2/STAT3/VEGFR2轴,分别抑制EZH2、STAT3及VEGFR2三者中任何一个的表达能够影响其他两个蛋白的表达,逆转EMT进程,降低头颈鳞癌细胞系的迁移、侵袭能力。
  用DZNEP治疗荷CAL27头颈鳞癌裸鼠后,能下调p-STAT3及VEGFR2的表达,抑制EMT进程;EZH2/STAT3/VEGFR2网络可能成为治疗头颈部鳞状细胞癌新的靶点。
[博士论文] 曲鑫
临床医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC),是威胁人类健康的主要肿瘤之一,已成为全球第六大好发肿瘤。HNSCC患者的5年生存率不足50%,世界范围内致死率排名第五。恶性增殖和化疗抵抗是HNSCC重要的临床表现。因此,探究HNSCC增殖及化疗抵抗的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,将成为改善头颈部鳞癌患者治疗效果的重要突破口。
  EGFR是一种广泛分布于哺乳动物的细胞表面受体,在细胞的分化、生长和增殖等各个生理过程发挥重要作用。在多种恶性肿瘤的细胞中,EGFR的表达均高于正常细胞。在90%以上的头颈鳞癌中,EGFR表达升高。以此为基础,临床上使用针对EGFR的靶向药物,进行靶向治疗。但当EFGR发生突变时,便会导致临床药物的耐药。现已发现许多EGFR突变型,其中最常见的是EGFRvIII型(the type III EGF deletion-mutants receptor)。
  β-catenin作为Wnt的信号传导途径,是其重要的组成成分,主要参与了基因的表达,和介导细胞的黏附。目前的研究表明,β-catenin基因突变及过表达,与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。而作为一种丙酮酸激酶的同工酶,PKM2(Pyruvate kinase isozyme thpe M2)不仅在糖酵解过程中发挥重要功能,还能够影响β-catenin的活性及下游基因的转录。
  本研究对头颈鳞癌中EGFR wt/vIII调控肿瘤细胞生长及化疗抵抗的功能和分子机制进行了以下实验研究。研究共分为三个部分:
  第一部分:我们分别对5个头颈鳞癌细胞系处理并提取蛋白,采用Western blot的方法检测细胞中EGFR的表达水平,并选取了UM1和SCC25两个细胞系,建立了野生型及vIII突变型的两种细胞系,应用克隆形成实验和CCK8细胞增殖实验来检测其细胞的增殖能力;通过流式细胞术及药敏实验,来检测细胞对顺铂的抵抗能力。
  第二部分:对EGFR野生型细胞进行EGF处理后,应用Western blot及免疫荧光检测PKM2入核的水平。然后对EGFR野生型及突变型细胞同时进行EGF处理,通过Western blot检测PKM2入核情况及β-catenin的活性。通过分析GEO数据库,探究头颈鳞癌中PKM2与β-catenin的表达情况及相关性。
  第三部分:根据文献报道,R399/400位点对PKM2入核至关重要,因此,我们建立了PKM2高表达及R399/400A突变型稳定克隆,应用Western blot方法检测 PKM2入核对β-catenin通路、下游基因表达的影响。通过CCK8增殖实验、克隆形成实验、流式细胞术检测头颈部鳞癌细胞中PKM2入核对细胞增殖及顺铂抵抗的影响。
  结果:
  在UM1、SCC25野生型及vIII突变型的两种细胞系中,我们发现,无论有无EGF的刺激,vIII突变型细胞系的生长、增殖速度更快。vIII突变型细胞系的平板克隆形成能力及顺铂抵抗能力也强于野生型细胞系。在UM1、SCC25野生型及vIII突变型的细胞系中,应用β-catenin抑制剂FH535进行处理后发现,两种细胞系的增殖均受到了抑制,但EGFR vIII突变型的细胞系可抵抗β-catenin抑制剂的抑制效果。这表明,在头颈鳞癌中,EGFR vIII突变型细胞系的β-catenin活性更高。因此我们认为,EGFR vIII可能通过调控β-catenin通路介导了头颈鳞癌的增殖和顺铂抵抗。
  通过对HNSCC细胞系的检测和GEO数据库的分析,我们发现在头颈鳞癌中, PKM2和β-catenin均高表达,且二者呈正相关关系。在应用EGF刺激后,EGFR被激活,从而介导PKM2的入核。同时我们发现,相比于野生型细胞系,EGFR vIII能够促进PKM2的入核,并增加β-catenin的磷酸化水平,也再一次证明了EGFR vIII突变型细胞系的β-catenin活性更高。
  在R399/400位点突变后,PKM2的入核受到了抑制,导致β-catenin通路活性降低,且β-catenin下游基因CCND1的表达下调。我们发现PKM2高表达后,头颈鳞癌细胞的细胞增殖能力、克隆形成能力及顺铂抵抗能力显著升高,而R399/400位点突变后,上述功能则与对照组无明显差异。
  结论:
  1.在头颈鳞癌中,EGFR wt/vIII介导细胞的增殖与顺铂抵抗。
  2.在头颈鳞癌中,EGFR wt/vIII型细胞的β-catenin通路活性升高。
  3.在头颈鳞癌中,PKM2与β-catenin呈正相关关系。EGFR wt/vIII可促进PKM2入核,激活β-catenin通路。
  4. PKM2 R399/400对其入核至关重要,从而影响β-catenin通路活性及下游基因的表达,介导头颈鳞癌细胞的增殖与耐药。
[硕士论文] 王礼华
流行病与卫生统计学 南京医科大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部肿瘤(Head and neck carcinoma,HNC)为全球范围内第六大常见肿瘤类型,约占全部恶性肿瘤的6%。每年新发病例超过60万,其中2/3在发展中国家。头颈部肿瘤主要起源于上呼吸道、上消化道黏膜,包括口腔、咽(鼻咽、口咽、喉咽)及喉部,其中约90%的病理类型是鳞状细胞癌(Head and necksquamous cell carcinoma,HNSCC)。除鼻咽癌(与EB病毒感染有关)以外,吸烟、饮酒以及HPV感染等通常被认为是头颈部鳞癌的重要危险因素。
  线粒体中进行的有氧呼吸和氧化磷酸化过程是真核细胞的主要能量来源。通过参与能量和物质代谢等过程,线粒体影响着真核细胞和生物的生长、发育以及功能实现等众多方面。影响线粒体的遗传物质统称为线粒体基因组,包括部分核DNA和线粒体DNA,二者的共同作用才能确保线粒体发挥正常的功能。相对于核DNA,线粒体DNA由于其特殊的结构和高浓度活性氧外环境,更容易发生突变,突变率高出10-200倍。线粒体DNA中的点突变以及拷贝数变异都可能导致线粒体的功能异常。线粒体功能异常会抑制细胞的氧化磷酸化过程,导致机体内ROS大量产生和富集,从而引起机体氧化应激反应和核DNA与线粒体DNA突变与损伤,最终引起和促进肿瘤的发生。正常组织中会因为能量需求的不同,导致组织间线粒体DNA拷贝数的差异,但是同一种组织中拷贝数会相对保持稳定,以维持正常的生理功能。线粒体DNA拷贝数可以受到遗传因素和环境因素两方面共同调控,其变化一定程度上反映了年龄、吸烟、氧化损伤反应等多种影响肿瘤发生发展的因素对细胞、组织以及机体的作用情况。因此线粒体DNA拷贝数有可能成为一种预测肿瘤发生风险的生物标志物。目前,多篇流行病学研究已经对外周血中线粒体DNA拷贝数与不同肿瘤发病风险的关系进行了探讨,但这些研究结论相互之间并不一致。6篇报道线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌以及癌前病变发病风险关联的研究相互之间的结果也不一致。因此,还需要进一步开展大样本研究明确线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌发病风险之间的关系。
  本研究采用病例对照设计研究外周血线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌发病风险的关系。病例为江苏地区医院来源的570例新发头颈部鳞癌病例,对照样本为来源于江苏地区社区慢病筛查人群的597例健康个体。采用定量PCR方法检测线粒体DNA拷贝数,利用特异性引物分别扩增同一个体外周血线粒体DNA中ND1序列的拷贝数和核基因HGB序列拷贝数,通过ND1序列和HGB序列拷贝数的比值相对定量线粒体DNA拷贝数。采用盲法、复孔平行设置和重复检测等质量控制措施以保证线粒体DNA拷贝数检测的准确性。采用Logistic回归模型以及限制性立方样条函数分析线粒体DNA拷贝数与头颈部鳞癌发病风险的关联,计算比值比(OR)和95%可信区间(95%CI)。
  研究结果显示,病例组线粒体DNA拷贝数的中位值为4.33(1.38-29.85),对照组的中位值为3.50(1.93-11.19),前者高于后者,差异有统计学意义(P=0.016)。按照对照组线粒体DNA拷贝数值将研究对象四等分为四组,关联分析结果显示,头颈部鳞癌发病风险与线粒体DNA拷贝数之间呈U型相关。以线粒体DNA拷贝数第二等分位点线粒体DNA拷贝数个体作为对照组,第一等分位点和第四等分位点的个体其头颈部鳞癌发病风险显著增加,OR(95%CI)值分别为1.95(1.37-2.76)和2.16(1.53-3.04)。此外,限制性立方样图的结果发现二者关联成U型相关。
  本研究在中国汉族人群中探讨了线粒体DNA拷贝数变化与头颈部鳞癌发病风险之间的关联,发现线粒体DNA拷贝数过高或者过低都有可能与头颈部鳞癌发病风险升高有关。本次研究的结论为指导头颈部鳞癌高危人群的筛查和早期诊断提供了理论和技术支持,也为进一步研究头颈部鳞癌发病机制提供了一定线索。
[博士论文] Akhileshwar Namani
生物化学与分子生物学 浙江大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  肿瘤的转录组和基因组分析方法如微列阵芯片(microarray),RNA测序(RNA-Seq)和染色体免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing,ChIP-Seq),被广泛用于识别肿瘤中失调的基因和信号通路。特别地,ChIP-Seq是发现新的转录因子结合位点和转录因子在不同肿瘤中调控的信号通路中不可或缺的方法。
  最近,TCGA网站的数据为人们提供了关于多种肿瘤中有价值的高通量测序信息。这些数据使得研究者可以在成千上万病人样本中找到他们感兴趣基因的体细胞突变和拷贝数改变。
  NRF2是正常细胞中的重要转录因子,它可以通过结合在位于它的下游基因启动子区域从而调控细胞内的氧化应激。这个启动子区域被称为抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)。经典的NRF2下游基因包括一相/二相药物代谢酶和细胞保护蛋白。NRF2受到KEAP1的负向调控进而被CUL3介导泛素化蛋白酶体降解。由于KEAP1-NRF2-CUL3轴的突变,导致NRF2信号通路的异常激活,从而在多种癌症中引发肿瘤和耐药。因此,NRF2是癌症中重要的药物靶点,而抑制NRF2的过量表达或许可以抑制肿瘤的发生和耐药。
  在人非小细胞肺癌细胞A549中,我们分别建立了KEAP1过量表达和NRF2降表达的细胞株。为了在A549细胞中寻找新的NRF2下游基因,两个细胞株都进行了mRNA的芯片分析。利用TCGA网站上的RNA测序数据和其他生物信息学分析工具,本研究进行多组学分析方法去寻找两种人类肿瘤,肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和头颈部鳞癌(Head and Neck Squamous Cell Cancer,HNSCC)中NRF2调控的基因、信号通路和潜在的生物标记物。另外,A549细胞中包含有KEAP1功能失活突变,从而引起NRF2的过量表达,本研究在该细胞中也进行了ChIP-Seq的分析。
  目的:
  利用高通量组学分析数据,寻找新的NRF2调控基因和信号通路以及肺腺癌或头颈部鳞癌等癌症中潜在的生物标记物。
  方法:
  1.细胞株构建
  a.将pEGFP-C1和mKeap1-pEGFP的质粒分别转染到A549细胞中。
  b.利用RT-PCR和WB方法分析NRF2及其下游基因HO-1、NQO1的mRNA和蛋白水平。
  c.将两个细胞株中全部的RNA分别与昂飞公司的人类基因表达谱芯片杂交。
  2.非小细胞肺癌的潜在标记物的鉴定
  a.利用Agilent GeneSpring GX软件,分析KEAP1过表达的A549细胞芯片分析数据以及NRF2降表达的A549细胞芯片数据。其中KEAP1过表达的芯片数据来自本实验室的数据和公共数据,而NRF2降表达的芯片数据只来自本实验室。
  b.利用DAVID网站和STRING数据库,对表达上调基因的进行功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析。
  c.利用RSAT工具分析已知或假定的NRF2下游基因启动子区的ARE序列。
  d.对NRF2调控的代谢基因表达数据和TCGA网站中KEAP1蛋白表达失活的肺腺癌病人样本中的RNA表达谱数据进行相关性分析。
  e.利用在线肿瘤生物标记物分析软件SurvExpress,对NRF2调控的代谢基因簇(NRF2regulated metabolic gene signature,NRMGS)进行总生存期分析和Kaplan Meier分析。
  3.对头颈部鳞癌病人样本中NRF2下游基因表达水平的研究方法
  a.利用TCGA网站中头颈部鳞癌病人研究中Version2-level3版本的RNA测序数据,找出其中的279个肿瘤组织样本与37个癌旁组织样本,并将279个肿瘤组织样本分成两组,包括54个KEAP1-NRF2-CUL3突变的肿瘤样本和225个野生型肿瘤样本。
  b.将50个含有KEAP1-NRF2-CUL3突变的肿瘤样本分别与37个癌旁组织样本和225个其他肿瘤样本进行比较分析,并找出两组分析数据中共同含有的基因作为NRF2在头颈部鳞癌中的调控基因。
  c.利用4组独立的头颈部癌症病人的预后数据对该基因簇进行病人预后分析。
  d.分别利用DAVID和STRING数据库对这个基因簇进行功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用分析。
  4.A549细胞中NRF2结合位点的全基因组分析方法
  a.将染色体免疫共沉淀进行测序分析
  b.利用HOMER软件进行峰值定位和de novo基序识别分析
  c.利用DAVID软件进行靶基因功能分析
  d.利用定量PCR对ChIP-Seq数据进行验证
  结果:
  1.成功建立了pEGFP-CI和pEGFP-mKeap1分别过表达的细胞株。在Keap1过表达的细胞株(A549-mKeap1-5p)中,NRF2和其下游基因HO-1、NQO1的mRNA和蛋白水平明显低于对照细胞株。因此,成功构建了稳定表达Keap1的A549细胞模型。
  2.在KEAP1过表达和NRF2降表达的两组A549细胞芯片数据中,发现了214个基因降表达倍数大于1.5倍的重叠基因,其中34个基因涉及小分子代谢过程。对这些基因进行启动子区域的研究发现,27个基因含有ARE可能受到NRF2的直接调控。在这27个基因中的12个基因,与KEAP1突变的肺腺癌RNA-Seq数据中野生型肿瘤样本相比,表达明显上调。因此,这12个基因被定义为NRMGS。7组独立的肺腺癌病人的预后数据都显示,这些基因是肺腺癌的预后标记物。
  3.50个含有KEAP1-NRF2-CUL3突变的肿瘤样本与37个癌旁组织样本的比较分析结果显示,251个基因表达上调。50个肿瘤样本与225个其他肿瘤样本比较分析结果显示,25个基因表达上调。重叠分析的结果显示,17个基因在两组基因中均表达上调。同时,这些基因的表达上调与4组独立的头颈部癌症病人的预后数据中预后较差的病人数据呈现高度相关性。另外,GO,KEGG和PPI的分析显示,这些基因中的大多数都与药物代谢通路或者谷胱甘肽代谢通路相关。
  4.CHIP-Seq的峰值分析鉴定了A549细胞中2395个Nrf2结合高度富集的位点,峰值覆盖的长度为150bp。KEGG信号通路分析的结果发现了肺癌中新的Nrf2调控的信号通路——黏着斑信号通路。ARE序列分析和荧光定量PCR的结果均证实了NRF2对黏着斑信号通路相关基因的调控。
  结论:
  综上所述,本课题发现了在肺腺癌中NRF2调控的代谢基因簇和头颈部鳞癌中KEAP1-NRF2-CUL3轴调控的基因簇。这些基因簇与肿瘤发生和耐药高度相关,并且可以作为多种NRF2信号通路激活的肿瘤中潜在的生物标记物和预后指标。另外,ChIP-Seq的结果揭示了一个新的NRF2调控的信号通路——黏着斑信号通路,它在肿瘤细胞的侵袭、迁移和代谢过程中发挥重要功能。
[硕士论文] 李跃楠
生物工程 郑州大学 2017(学位年度)
摘要:头颈部肿瘤(head and neck cancer,HNC)是世界范围内第六大常见的恶性肿瘤,位居肿瘤相关死亡原因第八位。90%以上的HNC属于由粘膜上皮发展形成的鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC),恶性程度较高,在癌症早期即可浸润转移至远端组织器官。目前,HNC临床治疗以患者发病部位和肿瘤浸润转移分级为基础,大多采用手术、放疗和化疗等治疗策略。虽然近几年,手术、化疗和放疗已取得很大进展,但是临床上HNC患者的生存率和生活质量并没有得到显著改善。因此,急需开发针对HNC新型的治疗方案。
  目前,生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种最有效的肿瘤治疗策略。其中,复制选择性溶肿瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus, RSOA)是肿瘤生物治疗研究中发展较快、极具前景的一种新型抗肿瘤药物。以RSOA为载体的病毒免疫基因治疗不仅可以发挥溶肿瘤病毒自身对肿瘤细胞的裂解、杀伤作用,而且可以通过基因工程技术插入外源免疫调节基因,使其随着病毒的选择性复制,在肿瘤组织局部高表达,从而增强 RSOA抗肿瘤作用。2005年,我国首次批准了世界上第一个溶肿瘤腺病毒药物H101(上海三维公司),在临床上主要用于HNC的治疗。越来越多的研究结果提示RSOA有望成为下一个最具突破性的肿瘤免疫治疗方法。
  白介素-12(Interleukin-12,IL-12)是最具抗肿瘤潜能的细胞因子之一,通过对肿瘤微环境中不同的免疫细胞产生多重效应,成为连接先天性免疫和适应性免疫的桥梁。IL-12持久有效的抗肿瘤反应往往伴随严重的血液学毒性,因此,需要研究有效的策略,降低IL-12系统性表达。基于此,本实验室前期构建了表达非分泌型IL-12(Non-secreting IL-12,nsIL-12)的新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001(Ad-TD-nsIL-12),即以Ad-TD(专利号ZL200910066130.4)为骨架病毒,采用基因工程技术,在腺病毒基因组中插入nsIL-12基因。在前期胰腺癌动物模型中证实BioTTT001具有高效、低毒的抗肿瘤效果。
  免疫缺陷小鼠荷人源移植瘤模型,因为其不能支持人5型腺病毒(Adenovirus5,Ad5)复制,所以无法全面评价溶肿瘤腺病毒的安全性和有效性,而且也无法研究溶肿瘤腺病毒对机体免疫系统的影响。与小鼠类动物模型相比,叙利亚仓鼠支持Ad5复制,因此作为支持腺病毒复制的免疫健全的动物模型广泛应用于溶肿瘤腺病毒的研究中。
  为了研究新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001对HNC的治疗作用,本课题通过一系列体外和体内实验,分析BioTTT001在HNC细胞中的复制、杀伤能力以及在叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤模型中的抗肿瘤效果,初步探讨其抗肿瘤作用机制,该研究为BioTTT001的临床转化奠定基础。
  第1章:新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001体外抗肿瘤能力的研究
  方法:
  1.采用不含抗生素的LB液体细菌培养基,37℃过夜摇菌,检测该课题所用病毒是否存在细菌污染;采用聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR),利用支原体特异性引物,检测病毒是否存在支原体污染。
  2.采用结晶紫染色法、MTS法及流式Annexin V-FITC/PI双染色法,检测新型溶肿瘤腺病毒 BioTTT001对不同肿瘤细胞的杀伤作用以及对细胞凋亡水平的影响。
  3.采用半数组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)和酶联免疫反应方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测BioTTT001在肿瘤细胞中的复制能力及人IL-12(human IL-12,IL-12)表达水平。
  4.统计学处理:实验数据采用Graphpad Prism5.0进行分析处理,对于多个样本的均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)并进行多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test),P<0.05表示具有统计学差异。
  结果:
  1.本课题所用新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001、骨架病毒Ad-TD-Luc及对照病毒dl1520均不存在细菌和支原体污染。
  2.叙利亚仓鼠HNC细胞HCPC I及人鼻咽癌细胞C666-1感染三种病毒后,细胞发生不同程度的病变,HCPC I及C666-1细胞EC50值显著低于SCC7;新型溶肿瘤腺病毒 BioTTT001在多种不同来源的人肿瘤细胞中的 EC50值小于0.5。病毒感染48h,HCPC I细胞及C666-1细胞均发生不同程度的凋亡,而小鼠鳞状细胞癌SCC7则无明显凋亡。
  3.新型溶肿瘤腺病毒 BioTTT001的复制能力与对照病毒 dl1520相似;病毒在C666-1细胞中的复制水平在48h即可达到峰值,而在HCPC I细胞中复制水平较低,随感染时间的延长逐渐升高。hIL-12在HCPC I和C666-1均有表达,表达量随感染时间的延长而逐渐升高。多种不同组织来源的人肿瘤细胞均支持hIL-12表达。
  第2章:新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001体内抗肿瘤效果及机制的研究
  方法:
  1.分别将5.0×106和1.0×107HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,观察并测量皮下肿瘤形成的时间及大小;采用苏木素-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察肿瘤组织内部细胞形态。
  2.将1.0×107HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,当肿瘤体积达到350mm3时,进行分组,分别为PBS、dl1520、Ad-TD-Luc和BioTTT001组,每组7只,进行瘤内治疗;第一个动物实验采用2.0×108PFU病毒,六次连续治疗,即d1、2、3、4、5和6;第二个动物实验采用2.0×108PFU病毒,六次间隔治疗,即d1、3、5、7、9和11;第三个动物实验采用5.0×107PFU病毒,六次间隔治疗,即d1、3、5、7、9和11;每周测量两次肿瘤体积大小,采用Graphpad Prism5.0绘制肿瘤生长曲线。
  3.将1.0×107HCPC I细胞接种于叙利亚仓鼠右侧背部皮下,当肿瘤体积达到350mm3时,分为四组,即PBS、IgG、GK1.5和4F11组,分别腹腔注射PBS、对照抗体IgG、删除抗体4F11(抗CD3抗体)和删除抗体GK1.5(抗CD4抗体);24h后,瘤内注射PBS或BioTTT001(5.0×107PFU病毒,d1、3、5、7、9和11);每周注射两次抗体,至实验结束。
  4.经过BioTTT001治疗后,皮下肿瘤完全清除的叙利亚仓鼠,在其左侧重新接种两倍剂量的HCPC I细胞(2.0×107),同时腹腔注射删除抗体4F11,观察肿瘤细胞二次接种后的成瘤情况。
  5.统计学处理:实验数据采用Graphpad Prism5.0进行分析处理,对于多个样本的均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)并进行多重比较检验(Tukey’s multiple comparison test),P<0.05表示具有统计学差异。
  结果:
  1.皮下接种1.0×107HCPC I细胞成瘤效果优于低剂量5.0×106;HE染色后,肿瘤组织呈现典型的肿瘤结构形态。
  2.在叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤模型治疗中,瘤内间隔治疗,其抗肿瘤效果优于连续治疗;降低病毒治疗剂量后,BioTTT001治疗组肿瘤清除率达到85.7%,抗肿瘤效果显著优于骨架病毒和对照病毒。
  3.删除叙利亚仓鼠体内CD4+T淋巴细胞后,新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001依然具有较强的抗肿瘤作用,而删除CD3+T淋巴细胞后,BioTTT001抗肿瘤作用则显著降低。
  4.新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001治疗后,皮下肿瘤完全清除的叙利亚仓鼠左侧背部皮下再次接种HCPC I细胞,不能再次成瘤;而同时接受腹腔注射4F11抗体的叙利亚仓鼠,则可以再次成瘤,且肿瘤生长迅速。
  结论:
  1.新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001对叙利亚仓鼠HNC细胞HCPC I及人鼻咽癌细胞C666-1敏感程度高于小鼠鳞状细胞癌细胞,且对一系列人源肿瘤细胞有很强的杀伤作用,有望在临床上用于多种不同肿瘤的治疗。
  2.溶肿瘤腺病毒瘤内间隔治疗,其抗肿瘤效果优于连续治疗;新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001能够有效地抑制叙利亚仓鼠HNC皮下移植瘤的生长,且抗肿瘤效果显著优于第一代溶肿瘤腺病毒dl1520。
  3.新型溶肿瘤腺病毒BioTTT001可以引发机体长期的抗肿瘤免疫保护作用,且BioTTT001发挥抗肿瘤作用主要由CD3+T淋巴细胞所介导。
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